CN109810158B

CN109810158B - 香叶木素-7-o-葡萄糖醛酸苷的制备方法

Info

Publication number: CN109810158B
Application number: CN201910157148.9A
Authority: CN
Inventors: 邢建国; 谭梅娥; 何承辉; 于宁; 郑瑞芳; 王云飞
Original assignee: XINJIANG INSTITUTE OF MATERIA MEDICA
Current assignee: XINJIANG INSTITUTE OF MATERIA MEDICA
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2039-03-01
Also published as: CN109810158A

Abstract

本发明涉及香叶木素‑7‑O‑葡萄糖醛酸苷制备技术领域，是一种香叶木素‑7‑O‑葡萄糖醛酸苷的制备方法，将所需量香青兰干燥的地上部分，用乙醇溶液回流提取并减压浓缩，将浓缩液使用大孔树脂层析得到洗脱液，蒸馏、烘干，得到浸膏粉；将浸膏粉用甲醇溶液溶解后，采用Sephadex LH‑20柱层析，收集洗脱液、减压蒸干，得到粗品；将粗品用乙腈溶液溶解，使用ODS柱层析，收集洗脱液、减压蒸干，得到香叶木素‑7‑O‑葡萄糖醛酸苷。本发明采用Sephadex LH‑20和ODS柱色谱联合分离的方法，制备过程简单，步骤简短，工艺稳定，得到的香叶木素‑7‑O‑葡萄糖醛酸苷纯度可以达到98%以上。

Description

香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法

技术领域

本发明涉及香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷制备技术领域，是一种香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法。

背景技术

香青兰是新疆地产民族药，前期药效研究表明其有效部位具有抗心肌缺血及动脉粥样硬化等药理作用。香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷是香青兰有效部位里的主要成分之一。香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷是一种化学物质，其结构式如图1所示。目前无市售的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷纯品，其药理活性尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一种香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能简便、快速的从香青兰中提取分离得到高纯度的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将所需量香青兰干燥的地上部分，用体积百分含量为30%至50%乙醇溶液回流提取3h至6h得到香青兰提取液，将香青兰提取液过滤1次至3次，得到滤液合并后并减压浓缩，得到0.8 g/mL至1.0 g/mL的香青兰浓缩液；第二步，将香青兰浓缩液使用大孔树脂层析，收集香青兰浓缩液在乙醇溶液体积百分含量为70%时洗涤得到的洗脱物，得到第一洗脱液，蒸馏第一洗脱液除去第一洗脱液中的乙醇，得到的稠浸膏液在50℃至60℃条件下烘干，得到浸膏粉；第三步，将浸膏粉用体积百分含量为50%甲醇溶液溶解后，采用Sephadex LH-20柱层析，收集浸膏粉在甲醇溶液体积百分含量为30%至50%时洗涤得到的洗脱物，得到第二洗脱液，并将第二洗脱液减压蒸干，得到粗品；第四步，将粗品用10%至15%乙腈溶液溶解，使用ODS柱层析，收集粗品在乙腈溶液体积百分含量为15%至20%时洗涤得到的洗脱物，得到第三洗脱液，并将第三洗脱液减压蒸干，得到香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述第一步中，乙醇溶液重量为香青兰重量的40倍至60倍。

上述第一步中，提取液过滤时使用孔径为0.1mm至10 mm的网筛。

上述第二步中，大孔树脂层析时的洗脱剂为纯水、体积百分含量为20%乙醇溶液和体积百分含量为70%乙醇溶液。

上述第二步中，蒸馏洗脱液的压力为0.08MPa至0.1 MPa，温度为30℃至50℃；第三步和第四步中，减压蒸干的压力为0.08MPa至0.1 MPa，温度为30℃至50℃。

上述粗品为纯度60%至70%香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

上述第三步中，Sephadex LH-20柱层析的洗脱剂为体积百分含量为20%至100%甲醇溶液，其中，甲醇溶液体积百分含量呈递增。

上述ODS柱层析的洗脱剂为体积百分含量为10%至50%乙腈溶液，其中，乙腈溶液体积百分含量呈递增。

本发明采用Sephadex LH-20和ODS柱色谱联合分离的方法，制备过程简单，步骤简短，工艺稳定，得到的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷纯度可以达到98%以上。

附图说明

附图1为本发明中香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的结构式。

附图2为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的氢谱。

附图3为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的碳谱。

附图4为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的DEPT图。

附图5为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的COSY图。

附图6为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的HSQC图。

附图7为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的HMBC图。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：该香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将所需量香青兰干燥的地上部分，用体积百分含量为30%至50%乙醇溶液回流提取3h至6h得到香青兰提取液，将香青兰提取液过滤1次至3次，得到滤液合并后并减压浓缩，得到0.8 g/mL至1.0 g/mL的香青兰浓缩液；第二步，将香青兰浓缩液使用大孔树脂层析，收集香青兰浓缩液在乙醇溶液体积百分含量为70%时洗涤得到的洗脱物，得到第一洗脱液，蒸馏第一洗脱液除去第一洗脱液中的乙醇，得到的稠浸膏液在50℃至60℃条件下烘干，得到浸膏粉；第三步，将浸膏粉用体积百分含量为50%甲醇溶液溶解后，采用Sephadex LH-20柱层析，收集浸膏粉在甲醇溶液体积百分含量为30%至50%时洗涤得到的洗脱物，得到第二洗脱液，并将第二洗脱液减压蒸干，得到粗品；第四步，将粗品用10%至15%乙腈溶液溶解，使用ODS柱层析，收集粗品在乙腈溶液体积百分含量为15%至20%时洗涤得到的洗脱物，得到第三洗脱液，并将第三洗脱液减压蒸干，得到香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

实施例2：该香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将所需量香青兰干燥的地上部分，用体积百分含量为30%或50%乙醇溶液回流提取3h或6h得到香青兰提取液，将香青兰提取液过滤1次或3次，得到滤液合并后并减压浓缩，得到0.8 g/mL或1.0 g/mL的香青兰浓缩液；第二步，将香青兰浓缩液使用大孔树脂层析，收集香青兰浓缩液在乙醇溶液体积百分含量为70%时洗涤得到的洗脱物，得到第一洗脱液，蒸馏第一洗脱液除去第一洗脱液中的乙醇，得到的稠浸膏液在50℃或60℃条件下烘干，得到浸膏粉；第三步，将浸膏粉用体积百分含量为50%甲醇溶液溶解后，采用Sephadex LH-20柱层析，收集浸膏粉在甲醇溶液体积百分含量为30%或50%时洗涤得到的洗脱物，得到第二洗脱液，并将第二洗脱液减压蒸干，得到粗品；第四步，将粗品用10%或15%乙腈溶液溶解，使用ODS柱层析，收集粗品在乙腈溶液体积百分含量为15%或20%时洗涤得到的洗脱物，得到第三洗脱液，并将第三洗脱液减压蒸干，得到香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

实施例3：作为上述实施例的优化，第一步中，乙醇溶液重量为香青兰重量的40倍至60倍。

实施例4：作为上述实施例的优化，第二步中，大孔树脂层析时的洗脱剂为纯水、体积百分含量为20%乙醇溶液和体积百分含量为70%乙醇溶液。

实施例5：作为上述实施例的优化，第二步中，蒸馏洗脱液的压力为0.08MPa至0.1MPa，温度为30℃至50℃；第三步和第四步中，减压蒸干的压力为0.08MPa至0.1 MPa，温度为30℃至50℃。

实施例6：作为上述实施例的优化，粗品为纯度60%至70%香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

实施例7：作为上述实施例的优化，第三步中，Sephadex LH-20柱层析的洗脱剂为体积百分含量为20%至100%甲醇溶液，其中，甲醇溶液体积百分含量呈递增。

实施例8：作为上述实施例的优化，ODS柱层析的洗脱剂为体积百分含量为10%至50%乙腈溶液，其中，乙腈溶液体积百分含量呈递增。

实施例9：作为上述实施例的优化，第一步中，提取液过滤时使用孔径为0.1mm至10mm的网筛。

实施例10：香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将2 kg香青兰干燥的地上部分，用100kg体积百分含量为50%的乙醇溶液回流提取3h得到提取液，将提取液使用孔径为0.1mm的网筛过滤3次后得到滤液并减压浓缩，得到0.8 g/mL的浓缩液；第二步，将香青兰浓缩液使用大孔树脂层析，收集香青兰浓缩液在乙醇溶液体积百分含量为70%时洗涤得到的洗脱物，得到第一洗脱液，在压力为0.1 MPa、温度为40℃的条件下蒸馏第一洗脱液，除去第一洗脱液中的乙醇，得到的稠浸膏液在60℃条件下烘干，得到140g浸膏粉；第三步，将浸膏粉用体积百分含量为50%甲醇溶液溶解后，采用Sephadex LH-20柱层析，收集浸膏粉在甲醇溶液体积百分含量为30%至50%时洗涤得到的洗脱物，得到第二洗脱液，并将第二洗脱液在压力为0.1 MPa、温度为40℃的条件下减压蒸干，得到粗品；第四步，将粗品用10%乙腈溶液溶解，使用ODS柱层析，收集粗品在乙腈溶液体积百分含量为15%至20%时洗涤得到的洗脱物，得到第三洗脱液，并将第三洗脱液在压力为0.1 MPa、温度为40℃的条件下减压蒸干，得到香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

实施例11：香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将3 kg香青兰干燥的地上部分，用135kg体积百分含量为40%的乙醇溶液回流提取5h得到提取液，将提取液使用孔径为1mm的网筛过滤3次后得到滤液并减压浓缩，得到1.0g/mL的浓缩液；第二步，将香青兰浓缩液使用大孔树脂层析，收集香青兰浓缩液在乙醇溶液体积百分含量为70%时洗涤得到的洗脱物，得到第一洗脱液，在压力为0.08 MPa、温度为35℃的条件下蒸馏第一洗脱液，除去第一洗脱液中的乙醇，得到的稠浸膏液在60℃条件下烘干，得到240g浸膏粉；第三步，将浸膏粉用体积百分含量为50%甲醇溶液溶解后，采用Sephadex LH-20柱层析，收集体积百分含量为50%至70%的甲醇溶液的洗脱物，得到第二洗脱液，并将第二洗脱液在压力为0.08 MPa、温度为35℃的条件下减压蒸干，得到粗品；第四步，将粗品用15%乙腈溶液溶解，使用ODS柱层析，收集体积百分含量为20%的乙腈溶液的洗脱物，得到第三洗脱液，并将第三洗脱液在压力为0.08 MPa、温度为35℃的条件下减压蒸干，得到香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

实施例12：香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将5 kg香青兰干燥的地上部分，用200kg体积百分含量为40%的乙醇溶液回流提取6h得到香青兰提取液，将提取液使用孔径为0.5mm的网筛过滤2次后得到滤液并减压浓缩，得到0.9g/mL的浓缩液；第二步，将香青兰浓缩液使用大孔树脂层析，收集香青兰浓缩液在乙醇溶液体积百分含量为70%时洗涤得到的洗脱物，得到第一洗脱液，在压力为0.09 MPa、温度为40℃的条件下蒸馏第一洗脱液，除去第一洗脱液中的乙醇，得到的稠浸膏液在50℃条件下烘干，得到350g浸膏粉；第三步，将浸膏粉用体积百分含量为45%的甲醇溶液溶解后，采用Sephadex LH-20柱层析，收集浸膏粉在甲醇溶液体积百分含量为30%至50%时洗涤得到的洗脱物，得到第二洗脱液，并将第二洗脱液在压力为0.09 MPa、温度为40℃的条件下减压蒸干，得到粗品；第四步，将粗品用10%乙腈溶液溶解，使用ODS柱层析，收集粗品在乙腈溶液体积百分含量为15%至20%时洗涤得到的洗脱物，得到第三洗脱液，并将第三洗脱液在压力为0.09 MPa、温度为40℃的条件下减压蒸干，得到香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

根据实施例10、实施例11、实施例12得到的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷，使用¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT及2D核磁对其结构进行鉴定，图2为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的氢谱，图3为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的碳谱，图4为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的DEPT图，图5为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的COSY图，图6为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的HSQC图，图7为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的HMBC图。

分析香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的核磁图谱，得出其¹H-NMR（600 MHz，D2O）具有明显的黄酮类化合物的氢谱特征，通过耦合常熟和化学位移值对其进行归属，δ：5.88(s，H-3)，6.04(s，H-6)，6.16 (s，H-8)，6.42 (s，H-2′)，6.24 (d，J=7.2，H-5′)，6.60(d，J=6.6，H-6′)，5.03(d，J=7.2，H-1′′) ，3.63 (m，3′′)，3.71( t，J=9.0，H-4″)，3.94 (d，J=9.6，H-5″)；13C-NMR（150 MHz，D2O）图谱中具有22个碳信号，包括1个CH3，11个CH，8个季碳，δ：164.12(C-2)，102.80(C-3)，182.40 (C-4)，159.83 (C-5)，100.08 (C-6)，162.52 (C-7)，95.61 (C-8)，156.81 (C-9)，105.98 (C-10)，121.42 (C-1′)，111.87 (C-2′)，150.98 (C-3′)，145.05 (C-4′)，111.20 (C-5′)，119.76 (C-6′)，99.65 (C-1′′)，73.29 (C-2′′)，77.15 (C-3′′)，72.53 (C-4′′)，75.88 (C-5′′)，175.88 (C-6′′)，55.86 (OCH3)。通过图2、图3、图4、图5、图6、图7，确定该物质为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

根据实施例10得到的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷，使用色谱柱为C18柱、流动相为30%乙腈-水溶液、流速为2 mL/min、进样量为200的制备液相对其进行制备，得到淡黄色结晶50.81 mg。

根据实施例11得到的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷，使用色谱柱为C18柱、流动相为45%甲醇-水溶液、流速为3 mL/min、进样量为500的制备液相对其进行制备，得到淡黄色结晶46.90 mg。

根据实施例12得到的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷，使用色谱柱为C18柱、流动相为15%乙腈-水溶液、流速为2.5mL/min、进样量为300的制备液相对其进行制备，得到淡黄色结晶52.06 mg。

分别对实施例10、实施例11、实施例12得到的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷进行结构鉴定和纯度鉴定

一、结构鉴定：将实施例10、实施例11、实施例12得到的样品使用核磁共振对其进行分析，并解谱归属，确定实施例10、实施例11、实施例12得到的物质为香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

二、纯度鉴定：熔点（mp）测定：265℃至267℃。

将实施例10、实施例11、实施例12得到的样品进行薄层色谱检测：

采用三种展开体系进行检测。展开剂A为二氯-甲醇（体积比为5:1），RfA为0.51；展开剂B为乙酸乙酯-乙醇-水（体积比为6:2:1），RfA为0.39。紫外254 nm下见蓝色斑点，无杂志点。

将实施例10得到的样品进行HPLC检测：

用外标法测定其含量，选定254 nm和330 nm为检测波长。流动相为乙腈-0.5%甲酸水（20:80，V/V）。精密称取实施例10制备的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷粉末1.02 mg于10mL容量瓶中，用蒸馏水溶解，定容。使用Agilent 1260型高效液相色谱对其进行测定，并计算纯度为99.26%，香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷得率为35.13%。

将实施例11得到的样品进行HPLC检测：

用外标法测定其含量，选定254 nm和330 nm为检测波长。流动相为乙腈-0.5%甲酸水（20:80，V/V）。精密称取实施例11制备的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷粉末2.50 mg于10mL容量瓶中，用蒸馏水溶解，定容。使用Agilent 1260型高效液相色谱对其进行测定，并计算纯度为98.81%，香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷得率为42.89%。

将实施例12得到的样品进行HPLC检测：

用外标法测定其含量，选定254 nm和330 nm为检测波长。流动相为乙腈-0.5%甲酸水（20:80，V/V）。精密称取实施例12制备的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷粉末1.54 mg于10mL容量瓶中，用蒸馏水溶解，定容。使用Agilent 1260型高效液相色谱对其进行测定，并计算纯度为99.16%，香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷得率为38.07%。

因此，本发明得到的的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的纯度均在98%以上，香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷得率在35%以上。

综上所述，本发明制备过程简单，步骤简短，工艺稳定，得到的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷纯度可以达到98%以上。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

Claims

1.一种香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：第一步，将所需量香青兰干燥的地上部分，用体积百分含量为30％至50％乙醇溶液回流提取3h至6h得到香青兰提取液，将香青兰提取液过滤1次至3次，得到滤液合并后并减压浓缩，得到0.8g/mL至1.0g/mL的香青兰浓缩液；第二步，将香青兰浓缩液使用大孔树脂层析，收集香青兰浓缩液在乙醇溶液体积百分含量为70％时洗涤得到的洗脱物，得到第一洗脱液，蒸馏第一洗脱液除去第一洗脱液中的乙醇，得到的稠浸膏液在50℃至60℃条件下烘干，得到浸膏粉；第三步，将浸膏粉用体积百分含量为50％甲醇溶液溶解后，采用Sephadex LH-20柱层析，收集浸膏粉在甲醇溶液体积百分含量为30％至50％时洗涤得到的洗脱物，得到第二洗脱液，并将第二洗脱液减压蒸干，得到粗品；第四步，将粗品用10％至15％乙腈溶液溶解，使用ODS柱层析，收集粗品在乙腈溶液体积百分含量为15％至20％时洗涤得到的洗脱物，得到第三洗脱液，并将第三洗脱液减压蒸干，得到香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷；

所述第二步中大孔树脂层析时，香青兰浓缩液的洗脱剂依次为纯水、体积百分含量为20％乙醇溶液和体积百分含量为70％乙醇溶液。

2.根据权利要求1所述的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于第一步中，乙醇溶液重量为香青兰重量的40倍至60倍。

3.根据权利要求1或2所述的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于第一步中，提取液过滤时使用孔径为0.1mm至10mm的网筛。

4.根据权利要求1或2所述的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于第二步中，蒸馏第一洗脱液的压力为0.08MPa至0.1MPa，温度为30℃至50℃；第三步中，第二脱液减压蒸干的压力为0.08MPa至0.1MPa，温度为30℃至50℃；第四步中，第三洗脱液减压蒸干的压力为0.08MPa至0.1MPa，温度为30℃至50℃。

5.根据权利要求1或2所述的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于粗品为纯度60％至70％香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

6.根据权利要求1或2所述的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于第三步中，Sephadex LH-20柱层析的洗脱剂为体积百分含量为20％至100％甲醇溶液，其中，甲醇溶液体积百分含量呈递增。

7.根据权利要求1或2所述的香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于ODS柱层析的洗脱剂为体积百分含量为10％至50％乙腈溶液，其中，乙腈溶液体积百分含量呈递增。