CN102443613A - 牛樟芝抗癌活性物质、制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛樟芝抗癌活性物质，制备方法及其用途，所述牛樟芝抗癌活性物质是将牛樟芝菌丝体经过下列步骤所产生者：(1)将牛樟芝菌丝体以液体酸酵培养；(2)将所得菌丝体经过乙醇萃取，得到乙醇萃取物；(3)将所得乙醇萃取物浓缩后溶于水中，并加入等体积的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；(4)将所得乙酸乙酯萃取物以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液为移动相，得到流洗液片段g；以及(5)将所得流洗液片段g再以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液，取特定流洗液片段，即可制得牛樟芝抗癌活性物质。本发明所提供的牛樟芝抗癌活性物质不仅纯化至单一组成分，并且可以在很低的剂量下达到抑制癌细胞的效果，该单一成分亦可使用化学合成方法制成，以达到抗癌效果。

Description

牛樟芝抗癌活性物质、制备方法及其用途

技术领域

本发明是关于一种牛樟芝抗癌活性物质、制备方法及其用途，特别是指一种可以抑制肝癌细胞增殖，以达到抗肝癌效果的牛樟芝活性物质。

背景技术

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是一种寄生于牛樟树(Cinnamomum kanchiraiHayata，Lauraceae)中空树干内的微生物，原生于台湾。牛樟芝具有多种促进健康的功效，包括抗氧化、抗发炎、抗肿瘤活性等(Chang and Chou，2004；Mau，Huang，Huang，and Chen，2004；Song and Yen，2003；Hseu，Chang，Hseu，Lee，Yech，and Chen，2002；Shen，Chou，Wang，Chen，Chou，and Lu，2004；Ao et al.，2009)。这种真菌在传统上被用于治疗肝脏疾病，但其抗肿瘤活性，特别是抗肝癌活性，已经引起广泛的注意。

牛樟芝子实体所含的数种化合物已被分离出来，并且被辨识出具有抗肿瘤的活性。Lien与其它人自干燥的牛樟芝子实体中分离出4，7-二甲氧基-5-甲基-1，3-亚甲二氧基苯(4，7-dimethoxy-5-methyl-1，3-benzodioxole)，并且发现该化合物可抑制人类结肠细胞的增殖(Lien et al.，2009)。此外，自牛樟芝中分离的24-methylenelanosta-7，9-(11)-diene-3β，15α-diol-21-oic(MMH01)被证实可以抑制人类血癌细胞U937与胰脏癌细胞BxPC3的生长(Chen，Chou，and Chang，2009)。

除了抗肿瘤的活性之外，也有一些被分离出来的牛樟芝活性成分，已被证实具有抗发炎的效果；Yang等人(2009年)从牛樟芝菌丝体中分离出antroquinonol B、4-acetyl-antroquinonol B、2，3-(methylenedioxy)-6-methylbenzene-1，4-diol、2，4-dimethoxy-6-methyl-benzene-1，3-diol、antrodin D这5种成分，并发现这些成分对于抑制一氧化氮的产生具有一定的效果，进而可以达到一定的抗发炎作用。

因为牛樟芝的高医疗价值以及缓慢的生长速度，牛樟的子实体的价格居高不下。为了满足市场上对此一药用真菌庞大的需求量，目前已有使用液体发酵培养牛樟芝菌丝体来进行工业级生产(Shin，Pan，and Heieh，2006)。

虽然牛樟芝的医疗效果已引起人们广泛的注意，但针对牛樟芝菌丝体内抗癌成分的分离与鉴定的研究并不多；Nakamura等人自牛樟芝菌丝体中发现五种苹果酸与琥珀酸的衍生物，这些成分对于LLC肺癌肿瘤细胞株具有细胞毒性效果(cytotoxic effects)，且其半数有效浓度(EC50)的范围在3.6至20μg/mL之间(Nakamure et al.，2004)。Cheng、Huang、Chang、Wang与Lu等人则于2005年证实自牛樟芝分离出来的多醣体可以透过抑制血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGF receptor)讯号传导，而抑制周期素D1(cyclin D1)的表现，导致抑制血管新生。

肝癌是流行于中国、台湾、韩国与撒哈拉沙漠以南的非洲等地区致死率最高的恶性肿瘤之丨(Seow，Liang，Leow，and Chung，2001；Kern，Breuhahn，andSchirmacher，2002)。数篇研究指出，牛樟芝菌丝体可以保护肝脏免于酒精、四氯化碳(CCl4)以及脂多醣(lipopolysaccharide)的伤害(Dai et al.，2003；Lu et al.，2007；Hsiao et al.，2003；Song and Yen，2003；Hattori and Sheu，2006；Ao et al.，2009)。Guo等人发现牛樟芝菌丝体对于由二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)所引起的肝纤维化具有逆转的效果(Guo，2002)。牛樟芝菌丝体甲醇萃取物也被发现于体外试验中可抑制肝癌细胞的增殖，且其对HepG2与Hep3B肝癌细胞株的半数抑制浓度(IC50)分别为49.5与62.7μg/mL(Song，Hsu，and Yen，2005)。Pan等人使用5吨的发酵槽培养牛樟芝，发现牛樟芝菌丝体乙醇萃取物对HepG2肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50)为4.25μg/mL(Pand，Chen，Sheen，andChiang，2008)。虽然已有足够的证据显示牛樟芝菌丝体具有抗肝癌的功能，但其确切的生物活性组成物为何仍不清楚。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种牛樟芝抗癌活性物质，该活性物质具有抑制肝癌细胞增殖进而达到抗肝癌的效果。

本发明的次一目的即在于提供一种牛樟芝抗癌活性物质的制备方法，是以牛樟芝菌丝体做为材料萃取而得该牛樟芝抗癌活性物质。

本发明的另一目的即在于提供一种牛樟芝抗癌活性物质的用途，是将该活性物质用于制备抗癌的药物。

可达成上述发明目的的牛樟芝活性物质，是将牛樟芝菌丝体经过下列步骤所产生者：

步骤1：将牛樟芝菌丝体以液体酸酵培养；

步骤2：将步骤1所得菌丝体经过乙醇萃取，得到乙醇萃取物；

步骤3：将步骤2所得乙醇萃取物浓缩后溶于水中，并加入等体积的乙酸乙酯(ethyl acetate)萃取，得到乙酸乙酯萃取物；

步骤4：将步骤3所得乙酸乙酯萃取物以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液(hexane/ethyl acetate gradient elution)做为流洗液(100％/0％正己烷/乙酸乙酯拉梯度至0％/100％正己烷/乙酸乙酯)，最后再以100％甲醇(methanol)冲洗，每七百毫升收集一瓶；其中以80％正己烷/20％乙酸乙酯至70％正己烷/30％乙酸乙酯流洗可得到片段f、以70％正己烷/30％乙酸乙酯到60％正己烷/40％乙酸乙酯流洗可得到片段g；

步骤5：将步骤4所得流洗液片段g以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液(80％/20％正己烷/乙酸乙酯拉梯度至50％/50％正己烷/乙酸乙酯)做为流洗液，最后再以100％乙酸乙酯冲洗，每五十毫升收集一瓶，即可取得流洗液片段E、F、G、H、I；其中片段E为80％/20％正己烷/乙酸乙酯至75％/25％正己烷/乙酸乙酯流洗所得到，片段F、G为75％/25％正己烷/乙酸乙酯流洗依序分别所得到，片段H为75％/25％正己烷/乙酸乙酯至70％/30％正己烷/乙酸乙酯流洗依序分别所得到，片段I为70％/30％正己烷/乙酸乙酯流洗所得到；

步骤6：于步骤5所得的“流洗液片段E、F、G、H、I”可进一步以适用的纯化分离方法，将该些活性物质进一步纯化分离出4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)；该纯化分离方法包含但不限于胶体管柱层析；

其中该乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、流洗液片段f、流洗液片段g、流洗液片段E、F、G、H、I及4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)即为牛樟芝抗癌活性物质。该些牛樟芝抗癌活性物质除可直接施用、治疗癌症外，亦可作为制备该些抗癌、治疗癌症的医药组合物、或适用用途的物用原料。

本发明所述的“牛樟芝抗癌活性物质”包含乙醇粗萃取液、乙酸乙酯萃取物、流洗液片段f、流洗液片段g、流洗液片段E、F、G、H、I及4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)等经由本发明制备方法所制得的抗癌活性物质。

于一较佳实施例所用的牛樟芝是得自寄存于财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的牛樟芝BCRC35716，但本发明所述的牛樟芝活性物质不限于由此菌种所得。

于一较佳实施例中，该液体酸酵培养步骤为：在含有2％葡萄糖与2％麦芽萃取物的发酵培养液(pH值为4.5～5.5)，以20～25℃、槽压0.5～1vvm、20～100rpm搅拌速率条件下培养四周。

于一较佳实施例中，该乙醇萃取步骤为：将牛樟芝菌丝体干燥后，以90～99％乙醇与该菌丝体混合，该牛樟芝菌丝体与乙醇的比例为1∶10～1∶50(g/ml)，接着以均质机混合12～48小时。

于一较佳实施例中，该步骤4所用的胶体管柱为硅胶管柱(silica gelchromatography)，230-400筛孔，750-75mm。

于一较佳实施例中，该步骤5所用的胶体管柱为硅胶管柱(silica gelchromatography)，230-400筛孔，420-25mm。

于一较佳实施例中，该步骤6所用的胶体管柱为硅胶管柱Luna 5u Silica(2)100A column(4.6×250nm)；其中所用的流洗液为正己烷/乙酸乙酯混合液，其比例为80∶20。

另外，本发明并提供一种抗癌组成物，是包含上述有效量的牛樟芝抗癌活性物质，以及适当的稀释剂、赋形剂或载体；且该抗癌组成物是可抑制癌细胞的增殖。

本发明进一步提供一种用于抗癌的药学组成物，包含一有效量的4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)，以及一载剂；该4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)具有下列化学结构：

本发明另提供一种上述4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)的新颖用途，其是用于制备抗癌的药物，且该抗癌的药物是可抑制癌细胞的增殖。

本发明所提供的牛樟芝抗癌活性物质、制备方法及其用途，与其它现有技术相互比较时，更具有下列的优点：

经试验证明，本发明所提供的牛樟芝抗癌活性物质不仅纯化至单一组成分，并且可以在很低的剂量下(0.1μg/mL作用72小时，或0.08μg/mL作用96小时)达到抑制癌细胞的效果，该单一成分不仅可以由牛樟芝菌丝体发酵培养液纯化而来，由于成份确定，亦可使用化学合成方法制成，以达到抗癌效果，又可解决牛樟芝价格居高不下的问题；相较之下，已知牛樟芝活性物质皆为粗萃取物，组成分不能被确定，仅能以牛樟芝发酵液萃取，在制程上无法简化，生产成本无法大幅降低。此外本发明亦提供牛樟芝抗癌活性物质中4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)的新颖用途，是可用以抑制癌细胞生长、进而治疗癌症。

附图说明

图1为本发明牛樟芝菌丝体以不同溶剂萃取活性物质后，以各萃取物处理HepG2肝癌细胞72及96小时后，抑制该HepG2细胞增殖的效果；具有不同字母标示的平均值，表示这些平均值之间具有显著差异(P＜0.05)；

图2为牛樟芝菌丝体乙酸乙酯萃取物经过两次硅胶管柱层析分离活性物质后，第二次层析的流洗液片段E、F、G、H、I以HPLC分析的图谱，流洗液片段E、F、G、H、I分别对应于图2A至E；箭头表示处为各流洗液片段的同一滞留时间的主要高峰；

图3为牛樟芝菌丝体活性成分4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)抑制HepG2肝癌细胞增殖与产生细胞毒性的效果分析；

图4为牛樟芝菌丝体活性成分4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)抑制大肠癌细胞CT26及摄护腺癌细胞LNCaP的细胞存活率分析；

图5为牛樟芝菌丝体活性成分4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)的化学结构式。

具体实施方式

本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所使用的材料，除有特别指明者，皆为市售易于取得的材料。

实施例1牛樟芝发酵液的制备

1.1牛樟芝来源

本实施例所用的牛樟芝是得自寄存于财团法人食品工业发展研究所(新竹，台湾)生物资源保存及研究中心的牛樟芝BCRC35716(可市售购买)，但本发明所述的牛樟芝活性物质不限于由此菌种所得。

1.2牛樟芝液体发酵培养：

将牛樟芝菌丝体接种于体积5吨含有2％葡萄糖与2％麦芽萃取物的发酵培养液(pH值为5.0)内，置于22℃以每分钟50转(50rpm)的转速，并以每分钟0.5倍单位液体体积(0.5vvm)的通气量培养，培养四周。

1.3牛樟芝液体发酵液的处理：

发酵培养结束后，将牛樟芝发酵液离心，以分离牛樟芝菌丝体与发酵液；将牛樟芝菌丝体沉淀物以无菌水清洗两次，以去除残余的发酵液，然后将该牛樟芝菌丝体沉淀物冻干并储存于4℃；将冻干的牛樟芝菌丝体与95％乙醇以1克菌丝体比20毫升乙醇的比例混合，并以高速均质乳化机(polytron)震荡24小时，以萃取牛樟芝菌丝体中溶于乙醇的成分。将所得的萃取物以减压浓缩器(rotary evaporator)浓缩，并储存于-80℃备用。

实施例2牛樟芝活性物质的制备

将牛樟芝乙醇粗萃取液(857g)回溶于2L的水中，并以等体积乙酸乙酯(ethyl acetate)萃取；再将该水层与水饱和的正丁醇(water-saturated n-butanol)萃取3次。将该粗萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，以及水层分别用来测试其抑制HepG2肝癌细胞株增殖的效果。

将上述最有抗肿瘤活性的萃取物继续以硅胶管柱层析(silica gelchromatography，230-400筛孔，750-75mm)纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液(hexane/ethyl acetate gradient elution，正己烷/乙酸乙酯的比例自100∶0至0∶100)流洗，最后以100％甲醇(Methanol)流洗出最后的残留物。收集每段流洗液(700mL)，并使用薄层层析(thin-layer chromatography，TLC Silica gel 60F254，Merck Co.)以乙酸乙酯/正己烷(50/50；v/v)作为展开液检测其组成物。显示黄色荧光的UV波长254mm灯管则用来将这些萃取片段中具有相似骨架的成分分群；薄层层析的结果显示，所有的流洗物可以被分为13个片段，收集这些片段并且测试其抗肿瘤的活性；请参阅表1所示，其中片段f为80/20至70/30正己烷/乙酸乙酯流洗得之，收集瓶号为36-42，收集体积为4.9公升，片段g为70/30-60/40正己烷/乙酸乙酯流洗所得之，收集瓶号为43-55，收集体积为9.1公升。

表1第一次管柱流洗液比例

瓶号	流洗液(mobile phase)
		1-7	Hexane(100％)
8-13	Hexane：Ethyl acetate(98∶2)
		14-21	Hexane：Ethyl acetate(95∶5)
22-30	Hexane：Ethyl acetate(90∶10)
		31-40	Hexane：Ethyl acetate(80∶20)
41-49	Hexane：Ethyl acetate(70∶30)
		50-58	Hexane：Ethyl acetate(60∶40)
59-68	Hexane：Ethyl acetate(50∶50)
		69-78	Hexane：Ethyl acetate(40∶60)
79-88	Hexane：Ethyl acetate(30∶70)
		89-98	Hexane：Ethyl acetate(20∶80)
99-108	Hexane：Ethyl acetate(10∶90)
		109-120	Ethyl acetate(100％)
121-128	Methanol(MeOH)(100％)

将上述具最高抗肿瘤活性的萃取物续以另一硅胶管柱(silica gel column，230-400筛孔，750-75mm)分离之，其洗涤液为正己烷及乙酸乙酯的混合物(正己烷/乙酸乙酯的比例自80∶20至50∶50)，最后以纯乙酸乙酯流洗出最后的残留物，总共可分别收集得12个片段；收集每段流洗液(50ml)，其中片段E为80/20-75/25正己烷/乙酸乙酯流洗得之，收集瓶号为44-56，收集体积为650毫升；片段F、G为75/25正己烷/乙酸乙酯流洗所得之，收集瓶号分别为57-61、62-69，收集体积分别为为250、400毫升；片段H为75/25-70/30正己烷/乙酸乙酯流洗所得之，收集瓶号为70-73，收集体积为200毫升；片段I为70/30正己烷/乙酸乙酯流洗得之，收集瓶号为74-84，收集体积为550毫升，测试这些片段的抗肿瘤活性，片段中具有最高活性者续进行进一步纯化。

表2第二次管柱流洗液比例

瓶号	流洗液(mobile phase)
		1-47	Hexane：Ethyl acetate(80∶20)
48-71	Hexane：Ethyl acetate(75∶25)
		72-97	Hexane：Ethyl acetate(70∶30)
98-121	Hexane：Ethyl acetate(65∶35)
		122-145	Hexane：Ethyl acetate(60∶40)
146-169	Hexane：Ethyl acetate(55∶45)
		170-191	Hexane：Ethyl acetate(50∶50)
192-230	Hexane：Ethyl acetate(100％)

使用配有一可调式吸收光谱侦测器(tunable absorbance detector，型号：1100系列，Agilent，美国)的Agilent高效液相层析系统(HPLC)来进行HPLC纯化；流洗的条件为：流速为1mL/mim，管柱温度25℃，UV波长254nm。具有最高波峰的片段再以硅胶管柱(4.6×250nm，Luna 5u Silica(2)100A column)配合正己烷/乙酸乙酯(80∶20，v/v)溶剂系统分离，以得到主要抗肿瘤活性成分。并以核磁共振仪(NMR，Bruker AMX-400)鉴定该纯化组成份的结构。

实施例3牛樟芝活性物质抑制肝癌细胞增殖的抑制能力分析

3.1材料

HepG2细胞是自美国标准生物品收藏中心(American Type CultureCollection，ATCC，Rockville，马里兰州，美国)购得；HepG2细胞以WME(Williams medium E)培养基培养，WME培养基含有10mM 4-(2-羟乙基)-1-呱嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，Hepes]、5μg/mL胰岛素(insulin)、2μg/mL胰高血糖激素(glucagon)、0.05μg/mL氢羟肾上腺皮质素(hydrocortisone)以及5％胎牛血清(fetal bovine serum)(Gibco LifeTechnologies，Grand Island，纽约州，美国)。大肠癌细胞CT26、摄护腺癌细胞LNCaP是购自财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的BCRC 60443与BCRC 60088。

3.2方法

于一96孔平底细胞培养盘内，种入每孔2.5×104个HepG2肝癌细胞，以WME培养基于37℃、5％CO2环境下培养4小时后，将培养基置换为含有不同浓度的牛樟芝菌丝体萃取物样本的WME培养基；这些牛樟芝萃取物样本先溶于1％DMSO，再加入WME培养基内形成不同浓度，而DMSO的最终浓度控制在小于1％。对照组的细胞则以仅含有萃取用的溶剂的WME培养基培养；而空白对照组则不含细胞仅含有100μL的WME培养基。各组细胞于37℃、5％CO2环境下经过72及96小时的培养后，以MTS单溶液细胞增殖分析(MTS-based cell titer 96 non-radioactivity cell proliferation assay，Promega，Madison，威斯康星州，美国)判断HepG2肝癌细胞是否增殖，藉此评估各萃取片段的抗肝肿瘤活性。

MTS是一种利用四唑试剂(tetrazolium reagent)进行比色的分析方法。细胞增殖的判断是在490nm波长下，以各处理组细胞的MTS吸收读值比较对照组的吸收读值来进行判断。

半数细胞毒性浓度(CC50)是在24小时内当细胞存活率降至对照组的细胞存活率的50％时的细胞毒性浓度。而半数有效浓度(EC50)则定义为：在处理该癌细胞一段特定的时间后，样本的中间有效剂量(造成50％细胞存活率的样本浓度)。每个牛樟芝萃取物样本至少进行三重复，以确认被处理的肝癌细胞的增殖情形与细胞毒性。对癌细胞的选择性效果则以选择性指标(selective index，SI)值表示。一测试样本的SI值则为该样本的半数细胞毒性浓度(CC50)值对半数有效浓度(EC50)值的比值。

3.3统计分析方法

以变异数分析方法(ANOVA)以及邓肯氏多重范围测试法(Duncan’smultiple-range test，SAS Institute Inc.，Cary，北卡罗莱州，美国)分析数据，以决定各平均值之间是否具有显著差异(P＜0.05)。

3.4结果

(1)牛樟芝菌丝体粗萃取物的抗肿瘤活性分析

从牛樟芝菌丝体的乙醇粗萃取液中所萃取出的乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液及水层萃取液的重量分别为574g、196g、87g。这些萃取物的抗肿瘤活性如图1所示；在处理72小时后，牛樟芝菌丝体的乙醇粗萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液、水层萃取液，对抑制HepG2肝癌细胞增殖的半数有效浓度(EC50)值分别为5.59±0.16μg/mL、2.83±0.06μg/mL、18.26±2.72μg/mL，以及＞100μg/mL；处理96小时后，这些萃取物对抑制HepG2肝癌细胞增殖的半数有效浓度(EC50)值则分别为2.76±0.01μg/mL、1.94±0.13μg/mL、5.3±0.00μg/mL，以及9.35±0.32μg/mL。结果显示牛樟芝菌丝体乙酸乙酯萃取物对HepG2肝癌细胞的增殖具有最高的抑制活性，亦即具有最高的抗肿瘤活性，因此取该萃取物以硅胶管柱进一步进行活性成分的分离。(2)经过第一次硅胶管柱分离的牛樟芝菌丝体萃取物的抗肿瘤活性分析

上述牛樟芝菌丝体乙酸乙酯萃取物进一步以硅胶管柱分离为13个流洗液片段，这13个流洗液片段对抑制HepG2肝癌细胞增殖的半数有效浓度(EC50)值如表3所示。结果显示，流洗液片段f与g具有最高的抗肿瘤活性；然而，流洗液片段f仅回收了2.29克，而流洗液片段g则回收了13.25克，因此流洗液片段g在数量上含有最多活性物质，故以流洗液片段g进行进一步的研究。处理HepG2肝癌细胞72小时与96小时后，流洗液片段g对抑制该癌细胞增殖的半数有效浓度(EC50)值分别为1.33μg/mL与0.82μg/mL。此外，处理HepG2肝癌细胞96小时后，流洗液片段g的选择性指标值(SI)为86。由于薄层层析(TLC)结果显示，流洗液片段g仍含有非活性成分的污染，因此本案发明人以硅胶管柱进一步针对流洗液片段g进行活性成分的分离。

表3牛樟芝菌丝体乙酸乙酯萃取物经过第一次硅胶管柱分离后，各流洗液片段对抑制HepG2肝癌细胞增殖的半数细胞毒性浓度(CC50)值与半数有效浓度(EC50)值

^*选择性指标值(SI)＝CC50/EC50.

a～h具有不同字母标示的平均值，表示这些平均值之间具有显著差异(P＜0.05)。

(3)经过第二次硅胶管柱分离的牛樟芝菌丝体萃取物的抗肿瘤活性分析

上述流洗液片段g再以硅胶管柱分离为12个流洗液片段，这12个流洗液片段对抑制HepG2肝癌细胞增殖的半数有效浓度(EC50)值如表4所示。结果显示，流洗液片段F、G、H具有最高的抗肿瘤活性，在处理该肝癌细胞72小时后，其半数有效浓度(EC50)约为0.5μg/mL。而在处理该肝癌细胞96小时后，流洗液片段E、F、G、H、I的半数有效浓度(EC50)约为0.4μg/mL。

经过第二次硅胶管柱分离的牛樟芝菌丝体萃取物，所有的流洗液片段对抑制HepG2肝癌细胞增殖的半数细胞毒性浓度(CC50)值均大于50μg/mL。这些流洗液片段的选择性指标值(SI)范围在111至119之间，显示这些流洗液片段对肝癌细胞具有良好的选择性。

表4牛樟芝菌丝体乙酸乙酯萃取物经过第二次硅胶管柱分离后，各流洗液片段对抑制

HepG2肝癌细胞增殖的半数细胞毒性浓度(CC50)值与半数有效浓度(EC50)值

^*选择性指标值(SI)＝CC50/EC50.

a～h具有不同字母标示的平均值，表示这些平均值之间具有显著差异(P＜0.05)。

(4)以HPLC分离纯化的牛樟芝菌丝体组成分的抗肿瘤活性分析

上述流洗液片段E、F、G、H、I进一步以HPLC系统分离活性物质，这些片段在同一滞留时间(retention time)都含有一个主要的高峰(如图2A至E所示)，将位于该高峰的流洗物收集，并进行生物分析及鉴定。这个高峰的成分(化合物)的抗肿瘤活性如图3所示；处理HepG2肝癌细胞72小时与96小时后，该成分(化合物)对抑制该癌细胞增殖的半数有效浓度(EC50)值分别为0.1μg/mL与0.08μg/mL。在整个牛樟芝菌丝体活性成分纯化过程中，此一成分具有最高的抗肿瘤活性；该成分(化合物)的抗肿瘤活性高于粗萃取液达约50倍。

另，本发明亦分析该纯化后化合物(4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonolB))对于抑制其它癌细胞生长的能力。请参阅图4所示，该化合物对于大肠癌细胞CT26及摄护腺癌细胞LNCaP的半数抑制浓度(IC50)分别为48.12±5.61、16.841±3.41μg/mL；致使该些癌细胞的细胞存活率皆达50％以下，因此，该化合物亦可用以抑制大肠癌细胞及摄护腺癌细胞的生长，可进一步用以治疗该些癌症。

(5)牛樟芝菌丝体抗肿瘤活性组成分的化学结构

上述牛樟芝抗肿瘤活性成分的化学结构以光谱方法(spectroscopic methods)测定，该方法包含一维核磁共振、二维核磁共振，以及质谱分析；该活性成分的化学结构如图5所示，其化学名称为：4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonolB)。

4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)的质谱分析结果如下：EIMS，m/z485[M+Na]+；1H NMR(500MHz，CD3OD)δ5.73(1H，d，J＝3.0Hz，H-4)，5.28(1H，t，J＝6.9Hz，H-12)，5.14(1H，t，J＝6.7Hz，H-8)，4.69(1H，m，H-15)，3.98(3H，s，H-24)，3.61(3H，s，H-23)，2.74(1H，m，H-17)，2.50(1H，m，H-6)，2.38(1H，dd，J＝7.0，13.8Hz，H-14)，2.28(2H，m，H-7)，2.27(1H，m，H-14)，2.22(2H，m，H-16)，2.17(2H，m，H-11)，2.08(3H，s，-OAc)，2.06(2H，m，H-10)，1.93(1H，m，H-5)，1.66(3H，s，H-21)，1.57(3H，s，H-20)，1.22(3H，d，J＝7.3Hz，H-19)，1.17(3H，d，J＝6.9Hz，H-22)；13C NMR(500MHz，CD3OD)δ199.0(s，C-1)，182.7(s，C-18)，171.4(s，CH3CO-)，160.5(s，C-3)，138.7(s，C9)，138.3(s，C-2)，131.6(s，C-13)，129.2(d，C-12)，122.4(d，C-8)，78.8(d，C-15)，70.4(d，C-4)，61.0(q，C-23)，60.3(q，C-24)，45.8(t，C-14)，44.2(d，C-5)，42.5(d，C-6)，40.5(t，C-10)，35.5(t，C-16)，35.0(d，C-17)，27.9(t，C-7)，27.0(t，C-11)，20.8(CH3CO-)，16.4(q，C-21)，16.2(q，C-20)，15.9(q，C-19)，13.0(q，C-22)。

该活性成分的化学结构与Yang等人于2009年所分离到的5个牛樟芝抗发炎成分中的4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)具有相同的化学结构；然而，Yang等人的研究并未揭露该成分具有抑制肝癌细胞、大肠癌细胞及摄护腺癌细胞的增殖进而达到抗肝癌、大肠癌及摄护腺癌的效果(Yang，Wang，Wang，Lin，Kuo，and Lee，2009)，因此，本发明除了提供各种牛樟芝抗癌活性物质(不同萃取物)外，亦提供该活性物质中4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)的抗肿瘤、抗癌等新颖用途。

上列详细说明是针对本发明的一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

参考文献

Ao，Z.H.，Xu，Z.H.，Lu，Z.M.，Xu，H.Y.，Zhang，X.M.，and Dou，W.F.(2009).Niuchangchih(Antrodia comphorata)and its potential in treating liverdiseases.J.Ethnopharm，121，194-212.

Chang，T.T.，and Chou，W.N.(2004).Antrodia cinnamomea reconsidered andA.salmonea sp.nov.on Cunninghamia konishii in Taiwan.Botanical BulletinAcademia Sinica，45，347-352.

Chen，Y.J.，Chou，C.J.and Chang，T.T.(2009).Compound MMH01possesses toxicity against human leukemia and pancreatic cancer cells.Toxicologyin vitro，23，418-424.

Cheng，J.J.，Huang，N.K.，Chang，T.T.，Wang，D.L.and Lu，M.K.(2005).Study for anti-angiogenic activities of polysaccharides isolated from Antrodiacinnamomea in endothelial cells.Life Science，76，3029-3042.

Dai，Y.Y.，Chuang，C.H.，Tsai，C.C.，Sio，H.M.，Huang，S.C.，Chen，J.C.andHu，M.L.(2003).The protection of Antrodia camphorata against acutehepatotoxicity of alcohol in rats.Journal of Food and Drug Analysis，11，177-185.

Hattori，M.，and Sheu，C.C.(2006).Compounds from Antrodia camphoratahaving anti-inflammatory and anti-tumor activity.US 7109232.

Hseu，Y.C.，Chang，W.C.，Hseu，Y.T.，Lee，C.Y.，Yech，Y.J.，and Chen，P.C.(2002).Protection of oxidative damage by aqueous extract from Antrodiacamphorata mycelia in normal human erythrocytes.Life Science，71，469-482.

Hsiao，G.，Shen，M.Y.，Lin，K.H.，Lan，M.H.，Wu，L.Y.，Chou，D.S.，Lin，C.H.，Su，C.H.，and Sheu，J.R.(2003).Antioxidant and hepatoprotective effective ofAntrodia camphorata extract.Journal of Agriculture and Food Chemistry，51，3302-3308.

Kern，M.A.，Breuhahn，K.，and  Schirmacher，P.(2002).Molecularpathogenesis of human hepatocellular carcinoma.Advances in Cancer Research，86，67-112.

Guo，S.Q.(2002).Ameliorative effects of Antrodia camphorata on liverfibrosis and gastrointestinal functions in rats.Master Thesis.China Medical College，Taiwan.

Lien，H.M.，Lin，H.W.，Wang，Y.J.，Chen，L.C.，Yang，D.Y.，Lai，Y.Y.，andHo，Y.S.(2009).Inhibition of anchorage-independent proliferation and G0/G1cell-cycle regulation in human colorectal carcinoma cells by4，7-dimethoxy-5-methyl-1，3-benzodioxole isolated from the fruiting body ofAntrodia camphorata.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，(In process)

Lu，Z.M.，Tao，W.Y.，Zou，X.L.，Fu，H.Z.，Ao，Z.H.(2007).Protecttiveeffects of mycelia of Antrodia camphorate and Armillariella tabescens in submergedculture against ethanol-induced hepatic toxicity in rats.Journal ofEthnopharmcology，110，160-164.

Mau，J.L.，Huang，P.N.，Huang，S.J.，and Chen，C.C.(2004).Antioxidantproperties of methanolic extracts from two kinds of Antrodia camphorata mycelia.Food Chemistry，86，25-31.

Nakamure，N.，Hirakawa，A.，Gao，J.J.，Kakuda，H.，Shiro，M.，Komatsu，Y.，Sheu，C.C.，and Hattori，M.(2004).Five new maleic and succinic acid derivativesfrom the mycelium of Antrodia camphorata and their cytotoxic effects on LLCtumor cell line.Journal of Natural Products，67，46-48.

Pan，J.H.，Chen，Y.S.，Sheen，L.Y.，and Chiang，B.H.(2008).Large scalesubmerged fermentation of Antrodia cinnamomea for anti-hepatoma activity.Journal of The Science of Food and Agriculture，88，2223-2230

Seow，T.K.，Liang，R.C.，Leow，C.K.，and Chung，M.C.(2001).Hepatocellular carcinoma：from bedside to proteomics.Proteomics，10，1249-1263.

Shen，Y.C.，Chou，C.J.，Wang，Y.H.，Chen，C.F.，Chou，Y.C.，and Lu，M.K.(2004).Anti-inflammatory activity of the extracts from mycelia of Antrodiacamphorata cultured with water-soluble fractions from five different Cinnamomumspecies.FEMS Microbiology Letters，231，137-143.

Shih，I.L.，Pan，K.，and Hsieh，C.(2006).Influence of nutritional componentsand oxygen supply on the mycelial growth and bioactive metabolites production insubmerged culture of Antrodia cinnamomea.Process Biochemistry，41，1129-1135.

Yang，S.S.，Wang，G.J.，Wang，S.Y.，Lin，Y.Y.，Kuo，Y.H.，Lee，T.H.，(2009).New Constituents with iNOS Inhibitory Activity from Mycelium of Antrodiacamphorata.Planta Med 2009，75：1-5.

Song，T.Y.，and Yen，G.C.(2003).Protective Effects of Fermented Filtratefrom Antrodia camphorata in Submerged Culture against CCl4-Induced HepaticToxicity in Rats.Journal of Agriculture and Food Chemistry，51，1571-1577.

Song，T.Y.，Hsu，S.L.，and Yen，G.C.(2005).Induction of apoptosis in humanheptoma cells by mycelium of Antrodia camphorata in submerged culture.Journalof Ethnopharmacology，100，158-167.

Yang，S.S.，Wang，G.J.，Wang，S.J.，Lin，Y.Y.，Kuo，Y.H.，and Lee，T.H.(2009).New constituents with iNOS inhibitory activity from mycelium of Antrodiacamphorata.Planta Medica，75，512-516.

Claims (15)

1.一种牛樟芝抗癌活性物质，是将牛樟芝菌丝体经过下列步骤所产生者：

步骤1：将牛樟芝菌丝体以液体酸酵培养；

步骤2：将步骤1所得菌丝体经过乙醇萃取，得到乙醇萃取物；

步骤3：将步骤2所得乙醇萃取物浓缩后溶于水中，并加入等体积的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；

步骤4：将步骤3所得乙酸乙酯萃取物以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液为流洗液，以80％正己烷/20％乙酸乙酯至70％正己烷/30％乙酸乙酯流洗可得到片段f、以70％正己烷/30％乙酸乙酯到60％正己烷/40％乙酸乙酯流洗可得到片段g；

步骤5：将步骤4所得流洗液片段g以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液，以取得流洗液片段E、F、G、H、I；其中片段E为80％/20％正己烷/乙酸乙酯至75％/25％正己烷/乙酸乙酯流洗所得到，片段F、G为75％/25％正己烷/乙酸乙酯流洗依序分别所得到，片段H为75％/25％正己烷/乙酸乙酯至70％/30％正己烷/乙酸乙酯流洗所得到，片段I为70％/30％正己烷/乙酸乙酯流洗所得到；以及

步骤6：将步骤5所得的流洗液片段E、F、G、H、I，以胶体管柱层析纯化出4-安卓奎诺尔B；

其中该乙酸乙酯萃取物、流洗液片段f、流洗液片段g、流洗液片段E、F、G、H、I及4-安卓奎诺尔B，即为牛樟芝抗癌活性物质。

2.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述菌丝体为寄存于财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的牛樟芝BCRC35716。

3.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述液体酸酵培养步骤为：在含有2％葡萄糖与2％麦芽萃取物的发酵培养液内，以20～25℃、槽压0.5～1vvm、20～100rpm搅拌速率条件下培养。

4.如权利要求3所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述发酵液的pH值为4.5～5.5。

5.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述乙醇萃取步骤为：将牛樟芝菌丝体干燥后，以90～99％乙醇与该菌丝体混合，以均质机混合之。

6.如权利要求5所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述牛樟芝菌丝体与乙醇的比例为1∶10～1∶50(g/ml)。

7.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述步骤4所用的胶体管柱为硅胶管柱，230-400筛孔，750-75mm。

8.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述步骤5所用的胶体管柱为硅胶管柱，230-400筛孔，420-25mm。

9.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述于步骤6的胶体管柱层析所用的胶体管柱为硅胶管柱Luna 5u Silica(2)100A column(4.6×250nm)，且其所用的流洗液为正己烷/乙酸乙酯混合液，其比例为80∶20。

10.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述抗癌活性物质是可抑制肝癌细胞、大肠癌细胞及摄护腺癌细胞的增殖。

11.一种抗癌组成物，其特征是，包含有权利要求1所述的有效量牛樟芝抗癌活性物质，以及适当的稀释剂、赋形剂或载体。

12.如权利要求11所述的抗癌组成物，其特征是，所述抗癌活性物质是可抑制肝癌细胞、大肠癌细胞及摄护腺癌细胞的增殖。

13.一种4-安卓奎诺尔B的用途，其是用于制备抗癌的药物。

14.如权利要求13所述的用途，其特征是，所述4-安卓奎诺尔B具有下列化学结构：

15.如权利要求13所述的用途，其特征是，所述抗癌的药物是可抑制肝癌细胞、大肠癌细胞及摄护腺癌细胞的增殖。

Images