CN106176827A - 降低癌细胞抗药性的樟芝菌丝体萃取物及其活性物质和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降低癌细胞抗药性的樟芝菌丝体萃取物及其活性物质和组合物。该樟芝菌丝体萃取物由取牛樟芝菌丝体经有机溶剂萃取和胶体管柱层析纯化后得到,其中樟芝菌丝体萃取物在20μg/ml浓度下能降低癌细胞中多重抗药性蛋白(MDR1蛋白)表达量,进一步纯化的活性物质中的化合物Antroquinonol能显著抑制癌细胞MDR1蛋白表达量;因此本发明的樟芝菌丝体活性物质具降低癌细胞中多重抗药性蛋白表达以达到辅助化疗药物杀死癌细胞的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种樟芝菌丝体萃取物,特别是涉及一种降低癌细胞抗药性的樟芝菌丝体萃取物及其活性物质和组合物。
背景技术
癌症是现代人常见的疾病之一,每年都高居十大死因首位,大约每四个人就有一人会罹患癌症,癌症的预防和治疗已成为现代人不可漠视的问题。我们的身体是由无数细胞所组成的,细胞会经由有丝分裂制造新细胞,从而令我们生长、取代旧细胞、或修补因受伤而损坏的细胞。这样的机制由基因负责控制,要是基因调控上出现问题就容易导致细胞病变,进而产生不正常增生的细胞而导致癌症。这些细胞病变在我们接收外在环境的压力时逐渐累积,也有部分的人遗传到已损毁的基因。正常的细胞会随基因调控有秩序地进行分裂和复制,当失去控制时,就会不停地复制,在身体里累积成块状,成为肿瘤。肿瘤可分为良性(benign)和恶性(malignant)两种,恶性的肿瘤又称为癌,良性肿瘤的细胞不会扩散到身体其他部分,而恶性肿瘤因为有癌细胞,所以具有转移的能力。它最初形成的时候,会守在原部位上,故称为“原位癌”。但随着情况恶化,它就会破坏周围的组织并扩散至其他器官去,变成侵袭性的癌症。当肿瘤由原来位置扩散到身体其他部位时,这叫做继发性癌症(secondary cancer)或转移性癌症(metastasis)。
癌症的治疗方式取决于癌症的种类、发生的部位以及是否扩散到身体其他部位。常见的治疗方式包括外科手术、化学治疗、放射治疗等等;有时候也会结合使用来达到更好的治疗效果。利用口服或静脉注射抗癌药物来消灭癌细胞或抑制癌细胞的生长一直是化学药物治疗的主流,使用的对象经常是已经转移或是无法手术根除的恶性肿瘤。
在早期发现的癌症可以外科手术切除来治疗,但当癌症晚期时会经由血液跟淋巴转移到其他器官,此时单靠局部治疗已经无法完全控制住癌细胞,单靠 局部治疗通常无法完全控制住癌细胞便需要采用全身性的治疗,例如化学治疗,荷尔蒙治疗或新一代的标靶治疗等方式。目前常使用的化疗药物有紫杉醇类如paclitaxol(太平洋紫杉醇)和docetaxel(欧洲紫杉醇)、purine(嘌呤)类似物如gemcitabine(2,2-二氟脱氧胞嘧啶核苷)、topoisomerase II inhibitor(拓朴异构酶第二型抑制剂)如campto(CPT-11)(喜树碱)、第三代白金类衍生物如oxaliplatin(奥沙利铂)、脂质体的结合物如liposomal adriamycin(阿霉素脂质体),在提升化疗的效果和减轻副作用上都有显著进展。化学治疗使用的目的除了能杀死癌细胞外,也能减小肿瘤的体积,末期病人使用化疗能减少患者痛苦,与手术及放射治疗结合使用,减低复发风险。
1970年代发现临床上癌症病人经化学治疗后,对于多种化疗药物的敏感度降低,称为癌症多重抗药性(multidrug resistance;MDR),是造成化学治疗失败的重要原因。癌细胞转变成具有抗药性的过程,有许多的机制参与其中,目前已知的机制包括:增加药物排出细胞外、改变药物代谢途径或产物、细胞周期调控点(checkpoint)改变、细胞凋亡途径(cell apoptosis)调控失调及基因修补(gene repair)机制改变等。具有多重抗药性的癌细胞,会大量表达一种穿膜转运蛋白,称为P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),P-gp蛋白为ATP-dependent efflux pump(ATP依赖的外排泵),大量表达在肠道上皮细胞及肝脏。许多不同结构的药物会经由P-gp蛋白携带而从细胞内被排出,因而降低细胞内药物的浓度。在癌细胞中,当化疗药物刺激癌细胞时,癌细胞便会大量表达P-gp蛋白来将药物排出,使化疗药物失效。P-gp蛋白在癌细胞表现多重抗药性的角色虽已经被大量研究,显示与化疗药物造成的多重抗药性有重要关联,而其他造成癌细胞多重抗药性的机制也陆续被发现,但是仍无法解决临床上因多重抗药性导致化学治疗失败的问题。多数的抗癌药物的治疗指数(therapeutic index)都很狭窄,一旦癌细胞对于抗癌药物的敏感度稍微降低,临床上碍于毒性的考量,又不能提高剂量,因此造成治疗中断。
樟芝的型态棒芝又名牛樟菇、樟菰、樟窟内菰,台湾又称阴阳对口菇。樟芝子实体属多年生,具有强烈冲鼻的樟树香气,此与一般灵芝类有很大的差异,其外型呈板状或钟状。板状型态者,面为橘红(黄)色,整面全有菌孔,板底层 有浅黄白色的木栓质,藉此木栓质附着在牛樟树中空心材内壁上生长。钟状型态者,子实层(钟面)亦呈橘(黄)色,充满菌孔(4-5个菌孔/毫米),内有孢子味,极苦,新鲜时为橘红色,之后会成为橘褐色或褐色,钟体则呈暗绿褐色的皮壳。以显微镜观察其担孢子,其型态为平滑无色的透明微弯柱形。
野生的樟芝是生长在牛樟树干中空内壁上,因为这个特性,造成很多牛樟树倒伏。文献记载,樟芝是在牛樟树上目前唯一发现的木材腐杉菌,病征为褐色腐朽,故为褐腐菌。但是樟芝的病原性并不强,因此牛樟树很少因此死亡。虽然樟芝对牛樟树而言是病原菌,但因樟芝价格昂贵,超过牛樟树的经济价值,因此是不是牛樟树的病原菌已经不重要了。
樟芝的培养,人工栽培的技术仍有待努力。所以,目前仍是以深山采集的方式来获得。但是采集樟芝不是件容易的事,因为首先要寻找牛樟树的产地。常有的困难是牛樟树与冇樟,两者极为相似,不易分辨。目前最直接的方法已由藤田安二提出,冇樟干油是以黄樟油与十五烧醛(pantadecylaldehyde)为主,因而有沙士中黄樟素(Safrole)的味道,牛樟干油则以松油醇(d-terpinenol)为主,而有樟脑油的味道,藉此即可区别牛樟与冇樟;第二个困难是要从大片树林中找到有中空洞的树干才行,此相当不易。空洞中若有樟芝,则可定期采集。
樟芝子实体在过去一直被认为对解毒、高血压、止痒、腹泻、过敏、肝癌的治疗有效。因牛樟芝富含三萜类化合物(triterpenoids)、超氧歧化酶(superoxide dismutase:SOD)、腺苷(adenosine)、多糖体(polysaccharides)、β-D-葡聚糖(β-D-glucan)、维生素,其中丰富的三萜类化合物及多糖体成份被认为可以一定程度地抑制癌细胞增生,且具有杀死癌细胞的能力,特别是对于肝癌、胃癌、乳癌、子宫颈癌有不错的保健功效。目前很多研究发现三萜类具有抗炎、镇痛、毒杀肿瘤细胞及诱导肿瘤细胞调亡、抗缺氧等作用;而且还具有提高免疫力的作用。而β-D-葡聚糖能通过刺激巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及自然杀手细胞等,增强免疫功能进而达到抗肿瘤的效果。
而癌症为为十大死因之首,且化疗过程常因癌细胞产生抗药性使化疗的成效不佳,解决癌症的化疗抗药性成为一个亟需解决的问题。
发明内容
针对上述问题,本发明目的在于提供一种用于降低癌症抗药性的樟芝菌丝体萃取物及其活性物质和组合物,包含有效剂量的樟芝菌丝体萃取物或樟芝菌丝体的活性物质,降低癌细胞对化疗药物的抗药性。
本发明的目的在于提供一种樟芝菌丝体萃取物,所述樟芝菌丝体萃取物是由以下步骤制备得到:
步骤1:取牛樟芝菌丝体,以有机溶剂经超声波震荡,再经过振摇后,得到牛樟芝菌丝体萃取液;
步骤2:以减压浓缩去除所述牛樟芝菌丝体萃取液中的有机溶剂,再以乙酸乙酯和水进行分层,取乙酸乙酯层,去除乙酸乙酯,得牛樟芝菌丝体粗萃取物;
步骤3:将步骤2所得的牛樟芝菌丝体粗萃取物以胶体管柱层析纯化,并以正己烷-乙酸乙酯洗脱,得樟芝菌丝体萃取物。
在其中一个实施例中,步骤1中,所述有机溶剂为甲醇,所述牛樟芝菌丝体与所述有机溶剂的体积比为1:5-20。
在其中一个实施例中,步骤3中,所述胶体管柱为硅胶或Sephadex LH-20胶体管柱,,所述正己烷-乙酸乙酯的体积比为95:5至0:100。
本发明还提供一种降低癌细胞抗药性的组合物,包含有效剂量的上述樟芝菌丝体萃取物。
在其中一个实施例中,所述癌细胞包括子宫颈癌细胞或肝癌细胞。
在其中一个实施例中,所述癌细胞抗药性是通过检测多重抗药蛋白MDR1的表达量体现。
在其中一个实施例中,所述樟芝菌丝体萃取物与化疗药物并用。该方式可降低癌细胞的抗药性。
在其中一个实施例中,所述化疗药物为太平洋紫杉醇(即Paclitaxel)。
在其中一个实施例中,所述组合物包含有效剂量的樟芝菌丝体萃取物,和至少一种医药上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供一种降低癌细胞抗药性的活性物质,所述降低癌细胞抗药性的活性物质是由樟芝萃取而得,包含活性化合物:4-Acetyl antroquinonol、 Antrodin或Antroquinonol。
在其中一个实施例中,所述降低癌细胞抗药性的活性物质,包含有效剂量的所述活性化合物,和至少一种医药上可接受载剂、稀释剂或赋形剂。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本案发明人经过长久的构思与研究,提供一种利用液态培养樟芝菌丝体萃取得到的樟芝菌丝体萃取物,且证明了该樟芝菌丝体萃取物具有抑制癌细胞的多重抗药性蛋白MDR1的作用,从而达到减少癌细胞抗药性的功效。并且与化学合成药物相比,该樟芝菌丝体萃取物还具有更高的安全性。
本发明的降低癌细胞抗药性的活性物质,是由樟芝萃取而得,其中包含4-Acetyl antroquinonol、Antrodin或Antroquinonol等活性化合物,上述活性物质具有抑制癌细胞的多重抗药性蛋白MDR1的作用,从而达到减少癌细胞抗药性的功效。并且与化学合成药物相比,该活性物质还具有更高的安全性。
附图说明
图1为樟芝菌丝体萃取物对MDR1表达量影响示意图;
图2为樟芝菌丝体活性物质对MDR1表达量影响示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明,但并不对本发明造成任何限制。本说明书中所述的所有技术性及科学术语,除非另外有定义,皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
菌株来源:
本发明所使用的菌株A.camphorata CCRC-35396是购买自财团法人食品工业发展研究所,且此菌株寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为:中国,北京,中关村;保藏编号为CGMCC NO.0575;保藏日期为:2001年5月9日;分类命名为:樟芝Antrodia camphorata。
实施例1
樟芝菌丝体的发酵
将CCRC-35396菌株接种至2升Hinton锥形瓶,该锥形瓶内含有1升培养基,该培养基成份为1.0%葡萄糖、0.5%黄豆粉、0.5%蛋白胨、0.01%硫酸镁(MgSO4)、0.01%消泡剂(KM-72 antifoam),调整pH值至pH4.0,于28℃下振荡培养10天。培养出的菌丝体于无菌室中转移至200升发酵槽,该发酵槽内含有120升上述培养基,在28℃下发酵培养12天。
实施例2
樟芝菌丝体萃取
将发酵所得的樟芝菌丝体发酵液进行冷冻干燥,以10倍体积的浓度为100%的甲醇于15-25℃超声波震荡1小时,可重复萃取数次再以120rpm振摇过夜萃取,将上述所得萃取液经减压浓缩除去甲醇,残余的甲醇萃取物以乙酸乙酯与水进行分层,将乙酸乙酯层抽取液减压浓缩除去溶剂后,以硅胶管柱层析作初步分离,依序以正己烷─乙酸乙酯(95:5→0:100)洗脱得樟芝菌丝体萃取物,共得12个部份。依照极性由小到大分别标示为ACME(A~K),回溶后保存于4℃。
实施例3
樟芝菌丝体活性物质的纯化
将樟芝菌丝体萃取物ACME-G与ACME-H混和,以硅胶及Sephadex LH-20管柱层析进一步分离,得到化合物4-Acetyl antroquinonol B、Antrodin C、Antroquinonol,回溶后保存于4℃。得到的纯化合物经HPLC与标准品对照以确认。
实施例4
人类癌细胞株培养
于6孔平底细胞培养皿的每一孔加入1毫升培养基,其内含有5×104个细胞,于5%二氧化碳与37℃环境中培养24小时,使细胞贴覆于培养皿上;用以检测樟芝菌丝体萃取物对人类子宫颈HeLa细胞及樟芝中的活性物质对人类 肝癌HepG2细胞MDR1表达量的影响。
樟芝菌丝体萃取物或活性物质溶解于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中,检测时DMSO的浓度不超过0.1%以避免其毒性影响细胞生长;细胞以樟芝菌丝体萃取物或活性物质处理24小时,进行蛋白质萃取;实验组为樟芝菌丝体萃取物或活性物质合并加入化疗药物paclitaxel。
实施例5
MDR1蛋白检测
蛋白质萃取步骤:所有步骤于冰上进行,移除细胞的培养基,以磷酸缓冲溶液清洗,加入含有蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的细胞溶解液(lysis buffer)以打破细胞并且避免蛋白质水解,用刮勺将细胞轻轻刮下,使用微量吸管重复抽吸以打破细胞,将打破的细胞液收集至离心管,12000-13000rpm、4℃离心20分钟,抽取上清液,作蛋白质定量后以蛋白质印迹法(western blot)检测MDR1表达量。
蛋白质定量步骤:样品加入Bradford试剂,以酶标仪(ELISA READER)检测595nm的吸光值;以胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)做标准曲线,以回推计算样品中的蛋白质浓度。
蛋白质印迹法步骤:将定量的蛋白质样本以6%十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行电泳分离,MDR1蛋白的分子量为141KD;转印后以MDR1的一级抗体辨识,压片分析MDR1表达量,以β-actin表达量作内部定量控制以校正MDR1的表达量。
实施例6
樟芝菌丝体萃取物对MDR1表达量的影响
检测樟芝菌丝体萃取物处理对人类子宫颈癌Hela细胞MDR1表达量的影响,以樟芝菌丝体萃取物处理Hela细胞24小时,再以paclitaxel处理细胞48小时,如图1所示,低浓度(0.1μM)paclitaxel处理使HeLa细胞的MDR1表达量 增加11.3%,高浓度(0.5μM)paclitaxel处理使HeLa细胞的MDR1表达量增加44.6%(p<0.01);樟芝菌丝体萃取物处理(未合并使用paclitaxel)的HeLa细胞中,实施例2中得到的樟芝菌丝体萃取物中标示为ACME-F的部分使MDR1表达量增加但没有显著差异,ACME-G跟ACME-H使HeLa细胞MDR1表达量降低,ACME-H使HeLa细胞MDR1表达量降低29%(p<0.05);ACME-F、ACME-G、ACME-H合并使用paclitaxel处理使HeLa细胞的MDR1表达量显著降低(p<0.01),其中以ACME-G的抑制效果最为显著,MDR1表达量由144.61%降低至10.43%(p<0.001)。
实施例7
检测樟芝菌丝体活性物质处理对人类肝癌HepG2细胞MDR1表达量的影响,以樟芝菌丝体活性物质Antroquinonol(即图2中C)处理HepG2细胞24小时,如图2所示,能有效减少MDR1表达量,再以化疗药物paclitaxel处理人类肝癌HepG2细胞48小时,低浓度paclitaxel(0.1μM)使Hep G2细胞中MDR1表达增加8.7%,而在高浓度paclitaxel(0.5μM)使Hep G2细胞中MDR1表达增加34.2%;以樟芝菌丝体活性物质处理人类肝癌HepG2细胞,4-Acetyl antroquinonol B(即图2中A)使MDR1表达量增加45.8%(p<0.05),Antrodin C(即图2中B)跟Antroquinonol(即图2中C)使MDR1表达量显著减少(p<0.001);以樟芝菌丝体活性物质合并使用paclitaxel,三种樟芝中的纯化合物都使MDR1表现显著降低(p<0.01),其中以Antroquinonol的效果最显著,MDR1表达量由134.16%降至9.34%(p<0.001)。
本发明的樟芝菌丝体萃取物和活性物质,是以天然药用真菌发酵而得,相较于化学合成药物,除更具安全性,还具有减少癌细胞抗药性之功效。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细, 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种樟芝菌丝体萃取物,其特征在于,所述樟芝菌丝体萃取物是由以下步骤制备得到:
步骤1:取牛樟芝菌丝体,以有机溶剂经超声波震荡,再经过振摇后,得到牛樟芝菌丝体萃取液;
步骤2:以减压浓缩去除所述牛樟芝菌丝体萃取液中的有机溶剂,再以乙酸乙酯和水进行分层,取乙酸乙酯层,去除乙酸乙酯,得牛樟芝菌丝体粗萃取物;
步骤3:将步骤2所得的牛樟芝菌丝体粗萃取物以胶体管柱层析纯化,并以正己烷-乙酸乙酯洗脱,得樟芝菌丝体萃取物。
2.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体萃取物,其特征在于,步骤1中,所述有机溶剂为甲醇,所述牛樟芝菌丝体与所述有机溶剂的体积比为1:5-20。
3.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体萃取物,其特征在于,步骤3中,所述胶体管柱为硅胶或Sephadex LH-20胶体管柱,所述正己烷-乙酸乙酯的体积比为95:5至0:100。
4.一种降低癌细胞抗药性的组合物,其特征在于:包含有效剂量的权利要求1-3任一项所述的樟芝菌丝体萃取物。
5.根据权利要求4所述的降低癌细胞抗药性的组合物,其特征在于:所述癌细胞包括子宫颈癌细胞或肝癌细胞。
6.根据权利要求4所述的降低癌细胞抗药性的组合物,其特征在于:所述樟芝菌丝体萃取物与化疗药物并用。
7.根据权利要求4所述的降低癌细胞抗药性的组合物,其特征在于:所述化疗药物为太平洋紫杉醇。
8.根据权利要求4所述的降低癌细胞抗药性的组合物,其特征在于:所述组合物包含有效剂量的樟芝菌丝体萃取物,和至少一种医药上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
9.一种降低癌细胞抗药性的活性物质,其特征在于:所述降低癌细胞抗药性的活性物质是由樟芝萃取而得,包含活性化合物:4-Acetyl antroquinonol、Antrodin或Antroquinonol。
10.根据权利要求9所述的降低癌细胞抗药性的活性物质,其特征在于:包含有效剂量的所述活性化合物,和至少一种医药上可接受载剂、稀释剂或赋形剂。
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