CN104027362A - 用于治疗肺癌的牛樟芝萃取物及其制备方法 - Google Patents
用于治疗肺癌的牛樟芝萃取物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种牛樟芝萃取物及其制备方法，所述方法包括：（a）以低极性的溶剂萃取牛樟芝（Antrodia cinnamomea）以取得萃取液，其中所述低极性的溶剂是选自由石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇及其任意组合所组成的群组；以及（b）以大孔吸附树脂分离所述萃取液，以获得低极性分离液。本发明还涉及本发明的牛樟芝萃取物在治疗或预防肺癌中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛樟芝萃取物及其制备方法。本发明还涉及本发明的牛樟芝萃取物在治疗或预防肺癌中的用途。
背景技术
牛樟芝（Antrodia cinnamomea）为台湾特有种菇菌类，目前研究结果显示牛樟芝具有抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒、抗发炎、抗氧化效果和保肝效果等多种功能。其中抗肺癌相关研究与专利多集中于直接使用牛樟芝子实体或菌丝体粉体或不同溶剂的抽取物或单一化合物在肺癌细胞上的毒杀效果（IC50），未有人使用管柱将牛樟芝乙醇萃取物再进行分级(fraction)，并将得到的活性物级分应用于动物模型以证实该活性级分具有抗肺癌的效果。
肺癌是全世界盛行率与致死率最高的癌症之一，手术切除是肺癌的主要治疗手段，但利用外科手术切除法往往会加速癌细胞的转移，进而造成癌症患者主要死亡原因；此外，据统计确诊时约70%～80%患者已失去手术切除机会，对于已无手术机会的患者，放疗与化疗是重要的局部治疗手段。放疗法虽然可以成功杀死癌细胞，但却会没有选择性地一并杀死正常细胞，通常会引起病人发炎性肺炎并导致严重肺损伤。鉴于传统癌症治疗法有副作用太大的缺点，有必要寻求新的替代疗法来改善副作用的问题。
发明内容
本发明所使用的牛樟芝子实体乙醇萃取物的活性级分(active fraction)DCB-AC301于动物模型证实除可有效抑制肺癌结节率与改善肺肿胀外，亦可明显改善化疗组体重下降现象。DCB-AC301对肺癌细胞（HCC827、H1975、A549及CL1-5）模型结果显示IC50明显优于同一HPLC化学分析极性区的已发表的单一化合物安卓奎诺尔（Antroquiononol）、去氢硫色多孔菌酸（Dehydrosulphurenic acid，马阶一号）、樟芝酸A（Antcin A）与樟芝酸B（Antcin B）等化合物。此外，本发明在LLC/C57B6动物模型中证实牛樟芝活性级分DCB-AC301抑肺癌结节率达80.8%，优于化疗药物（Gemzar）的78.1%及先前技术常使用的单纯牛樟芝子实体乙醇萃取物（AC-E）17.9%，改善疾病组肺重量60.6%，优于化疗药物组56.5%及先前技术常使用的单纯牛樟芝子实体乙醇萃取物8.7%。
除非本文另外界定，否则本发明所用的科学及技术术语应具有一般熟习此项技术者通常所理解的含义。该等术语的含义及范畴应为清晰的；然而，在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优于任何辞典或外在定义。
除非另外指出，否则如本揭示内容所用的以下术语应理解为具有以下含义。
如本文所用的术语“大孔吸附树脂”或“大孔树脂”（彼此可互换使用）意指一种吸附树脂，由聚合单体和交联剂、致孔剂(porogen)、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。大孔吸附树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在约50nm至2000nm之间。
如本文所用的术语“大孔吸附树脂管柱”意指主要利用“大孔吸附树脂”或“大孔树脂”来进行层析的管柱，例如（包括但不限于） 或
如本文所用的术语“萃取物”意指针对一物质进行萃取所得的产物，通常是通过将所欲萃取的物质浸泡或混合于溶剂中而获得的溶液或浓缩制剂。典型地，萃取物系制备自新鲜植物或经研磨或干燥的植物样本。此领域已知有各种萃取方法，包括但不限于浸渍、渗滤、再渗滤、消解、逆流萃取、涡轮萃取、挤压/压挤/压榨或超临界流体二氧化碳萃取。适当的溶剂包括但不限于水、乙醇、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或其它溶剂。可根据需要选择试剂的种类或调配溶剂的浓度，以达适当极性而进行萃取，例如，低极性溶剂包括但不限于石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇；高极性溶剂包括但不限于水、50%或以下的乙醇、甲醇、丁醇、异丁醇、80%或以下的丙酮。溶剂与待萃取物质的比例可为约1:1至约1:100（w/v（g/ml））、（优选约1:1至约1:50（w/v（g/ml））、更优选约1:1至约1:20、（w/v（g/ml）），更优选约1:15或1:10（w/v（g/ml））。萃取可在适当温度进行，例如，在约5℃至约100℃、约10℃至约100℃、约20℃至约100℃、约40℃至约100℃、约60℃至约100℃，优选室温25℃或100℃煮沸。不同阶段的萃取物可相互合并，亦可于后续再进行浓缩步骤，例如，蒸发，或纯化或分离步骤，例如，过滤、离心和色谱分析。在一实例中，将新鲜植物或干燥的植物样本的全部或部分（视需要地经切碎或磨碎）与适当的溶剂混合或浸泡于其中并搅拌达一段足够的时间，例如，4小时或以上、6小时或以上、8小时或以上、10小时或以上、12小时或以上、14小时或以上、或16小时或以上，在室温进行或加热进行，经由过滤移除固体残留物（滤渣），然后收集所获得的汁液（萃取液）；视需要重复浸泡或混合步骤，合并所得汁液，进一步予以浓缩、纯化或分离。
如本文所用的术语“肺癌“是指肺部组织内细胞生长失去控制的疾病。这种细胞生长可能会造成转移，就是侵入相邻的组织和渗透到肺部以外。
如本文所用的术语“预防”是指迟延罹患疾病个体的症状发作或减少疾病出现。
如本文所用的术语“治疗”表示缓解或改善感病个体的症状。
如本文所用的术语“个体”表示动物，尤其哺乳动物。在一较佳实施例中，术语“个体”表示“人类”。
如本文所用的术语“治疗有效剂量”是指单独或与其它治疗/药物组合使用以治疗肺癌显示治疗功效的活性成份的量。
术语“载剂”或“医药学上可接受的载剂”是指一般熟习此项技术者所熟知的用以制备医药组合物的稀释剂、赋形剂、接受剂(receptor)或类似物。
除非本文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
本发明提供各种态样的牛樟芝萃取物的制备方法。在一态样中，本发明的牛樟芝萃取物是由一方法制备而得，该方法包含：
（a）以低极性的溶剂萃取牛樟芝以取得萃取液，其中该低极性的溶剂是选自由石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇及其任意组合所组成的群组；以及
（b）以大孔吸附树脂分离该萃取液，以获得低极性分离液。
较佳地，所使用的低极性溶剂是95%乙醇。此外，具体而言，以大孔吸附树脂分离该萃取液时，可将该萃取液通入大孔吸附树脂管柱，依次使用水：乙醇的体积比为1：0至0：1（优选3:2～1：4）的溶液及70-100%乙醇（优选95%乙醇）依序洗脱，最后收取使用该乙醇而获得的洗脱液。又特定而言，依此方法所制备的牛樟芝萃取物经以乙腈（0.05%三氟乙酸）及水（0.05%三氟乙酸）的梯度洗脱而进行的高效液相色层分析显示具有保留时间分别为62.5、63.6、73.8、74.0及84.3的波峰。
在一较佳实施例中，该步骤b)所使用的大孔吸附树脂是选自由 所组成的群组。更佳地，该步骤b)所使用的大孔吸附树脂是
本发明亦提供一种通过如上述的方法制备的牛樟芝萃取物。在一较佳实施例中，该牛樟芝萃取物含有樟芝酸A、樟芝酸B及去氢齿孔酸（dehydroeburicoic acid）。在一更佳实施例中，该牛樟芝萃取物具有如图6所示的化学指纹图谱。
本发明又提供一种医药组合物，其包含治疗有效剂量的如上所述的牛樟芝萃取物及可选地医药学上可接受的载剂。
在另一实施例中，该医药组合物另外包含一或多种其它治疗肺癌的药剂。
本发明更提供一种上述医药组合物的用途，其是用于制备用以预防或治疗肺癌的医药品。
在一较佳实施例中，该医药品是用于给予每公斤体重约1至1000毫克的牛樟芝萃取物。在一更佳实施例中，该医药品是用于给予每公斤体重约75至300毫克的牛樟芝萃取物。
在一较佳实施例中，该医药品的功效包含但不限于抑制肺部肿瘤结节产生、改善肺肿胀的现象及/或毒杀肺癌细胞。
附图说明
图1说明不同牛樟芝分离物对LLC/C57B6肺癌动物模型体重的影响。
图2说明不同牛樟芝分离物对LLC/C57B6肺癌动物模型肺癌结节数与外观等抗癌功效试测。
图3说明不同牛樟芝分离物降低LLC/C57B6肺癌动物模型肿瘤的结节数比较（***p<0.001对比癌症组；*p<0.01对比癌症组）。
图4说明不同牛樟芝分离物在LLC/C57B6肺癌动物模型测试中对肺脏重量的影响（###p<0.001对比正常组；***p<0.001对比癌症组；*p<0.01对比癌症组）。
图5说明牛樟芝子实体级分DCB-AC301的分离流程。
图6说明牛樟芝子实体级分DCB-AC301的化学指纹图谱。
具体实施方式
本发明可能以不同的形式来实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
实施例1：DCB-AC301对LLC/C57B6肺癌动物模型功效试验
使用动物为雄性小鼠C57B/6，购自国家动物中心。饲养在有12小时光照周期（AM7:00-PM7:00），并有适当温度及湿度控制，充分供应饲料与饮水。所使用的癌细胞株为小鼠肺癌细胞LLC（Lewis Lung Carcinoma）。于尾静脉注射1×106细胞/100μＬ的LLC小鼠肺癌细胞，小鼠以5-8只为一组，随机分笼，共分8组。肿瘤诱发1周后开始以口服（p.o.）方式，评估DCB-AC301（不同剂量）配合不同浓度的肺癌临床一线化疗用药吉西他滨（Gemcitabin）的增效减毒效果，每天观察并记录小鼠存活、食量变化及其它生理状况。连续给药3周后停止实验，取出各器官后称重、拍照记录并进行病理分析，病理分析评估项目包括病组织分析。利用病理组织切片染色观察肺部形态变化的情形，并以苏木紫与伊红染色法（Hematoxylin andEosin stains,H&E stain）并透过显微镜观察器官型态的变化和完整性。另外，并利用蛋白印迹（Western blot）分析转移相关生物标的物的表达（MMP-2、MMP-1/2、E-cadherin），方法如下：取适量的肺部组织（30～50mg）置于1.5mL微量离心管（Eppendorf）中，并加入600μL～1mL的裂解缓冲液（Lysis buffer），使用超声波震碎器将组织震碎及细胞膜打破。接着以4℃、10000rpm离心5分钟，抽取上清液置于新的1.5mL微量离心管中，保存于-80℃冰箱。定量蛋白浓度并进行SDS-PAGE，使用1抗溶于1%BSA和0.1%Tween-20于4℃过夜，隔夜后再给予2抗，并使用ECL显色压片定量，结果示于表1、表2、图1、图2、图3及图4。结果显示在连续三个星期的喂食后；发现给予牛樟芝组别（AC-E、AC-S-M3及DCB-AC301）小鼠产生肺脏肿瘤结节的数量明显较少：AC-E300mg/kg(以下简称mpk)组平均约为39.4颗、AC-M3组为32.3颗、AC-30175mpk组为24.5颗、AC-301150mpk组为14.2颗，其中又以AC-301300mpk剂量组效果最为显著，其肺脏肿瘤结节数量为9.23颗，而对照组（Cancer alone）为48颗，具有极明显的统计差异（p＜0.0001）。此外，AC-301300mpk与正对照组（Gemzar）组别相较，均具有约80％抑制肺转移的效果。对照测量肺脏重量结果，AC-E组约为0.42g、AC-M3组为0.33g、DCB-AC30175mpk组为0.28g、DCB-AC301150mpk组为0.21g，其中又以DCB-AC301300mpk组0.18g与对照组0.46g相较，最具显著统计差异，并与肺脏肿瘤结节实验结果达到一致性。最终小鼠体重，对照组小鼠平均体重为23.3g，实验组小鼠体重为24.1g，显示测试药物无明显毒性。
表1:不同牛樟芝萃取物样品降低LLC/C57B6肺癌动物模型肿瘤结节数试验
#结节抑制率=(疾病组-试验组)/疾病组*100%
表2:不同牛樟芝分离物对LLC/C57B6肺癌动物模型肺脏重量的影响
实施例2：DCB-AC301对不同肺癌细胞的细胞毒性试验
以细胞毒杀试验（MTT test）测试DCB-AC301及已发表的单一化合物安卓奎诺尔、去氢硫色多孔菌酸、樟芝酸A与樟芝酸B等化合物对肺癌细胞HCC827、H1975及A549的IC50。测试方法如下：将细胞接种至96孔板，细胞数每孔为1×104个细胞，待细胞生长形成单层后，倒掉旧培养液，加入新鲜的培养液及不同浓度的待测药物，而不含检测物但含溶剂（DMSO）的培养液为负对照组（Negative control），置于培养箱中48小时后，倒掉旧培养液，以200μL PBS清洗细胞，倒掉上清液，加入90μL培养液和10mL MTT标记试剂，在37℃二氧化碳培养箱下培养4小时，使形成紫色结晶；吸掉上清液50mL，再加入200μL含0.04N盐酸的异丙醇将结晶溶解，最后以微ELISA光谱仪（MicroELISA spectrophotometer）在波长570nm下测其吸光度（O.D.值）。结果示于下表3。
表3:不同试验物质对肺癌细胞株HCC827、H1975及A549的毒杀测试24H的IC50值
实施例3：樟芝子实体前处理
新鲜牛樟芝子实体样品适当剪碎后，于50℃烘箱中通气烘干16h后，秤干重并计算干重率%，计算公式：干重率％=（样品干重/样品湿重）*100%，再以粉碎机（佑崎，DM-6，台湾）进行磨粉加工制成牛樟芝子实体粉末。批次样品干重率计算结果如下面表4：
表4.不同批次样品干重率
实施例4：牛樟芝子实体乙醇萃取物（AC-E）制备方式
牛樟芝子实体干燥粉末以10倍体积95%乙醇（w:v=1:10）浸泡搅拌16小时，抽气过滤，收集第1次滤液。过滤出的粉末再次以10倍体积95%乙醇（w:v=1:10）浸泡搅拌16小时，抽气过滤，收集第2次滤液。过滤出的粉末再以10倍体积95%乙醇（w:v=1:10）浸泡搅拌16小时，抽气过滤，收集第3次滤液。三次滤液合并经减压浓缩后得牛樟芝子实体乙醇萃取物（AC-E），浓缩干燥后秤重量并计算萃出率。萃出率计算公式：萃出率％=（萃出物干重/粉末干重）*100%，批次样品萃出率计算结果如下面表5：
表5.不同批次样品乙醇萃出率
实施例5：牛樟芝子实体乙醇级分（AC-S-M3）制备方式
牛樟芝子实体粉末乙醇萃取物（AC-E）浓缩干燥后秤重，以5倍体积95%乙醇（w:v=1:5）复溶，超声波震荡10分钟后静置30分钟。高速离心10分钟（5000rpm），取上清液。称取上清液1.5倍体积的大孔吸附树脂，进行吸附，静置隔夜后进行洗脱。大孔吸附树脂预处理，以乙醇浸泡活化，以乙醇湿法装柱（10cm×120cm），用乙醇洗脱，检测流出的乙醇液，当流出的乙醇与水（2︰1）混合不呈白色混浊时即可，再用水反复洗脱，至洗脱液无乙醇味，并且树脂柱不再下降时即可。牛樟芝子实体粉末乙醇萃取物上清液经大孔树脂吸附隔夜后，上样，进行洗脱，流速控制为0.5BV/H。然后依次用水：95%乙醇（6:4）、水：95%乙醇（4:6）、95%乙醇、丙酮混合溶液梯度洗脱，控制流速为2BV/H左右，每个浓度洗脱3-4个柱体积。牛樟芝子实体粉末的95%乙醇萃取物抑制肺癌活性成分主要集中在95%乙醇洗脱液中（因此该丙酮混合溶液洗脱步骤可视情况省略），收集、浓缩干燥后秤重量。
实施例6：牛樟芝子实体乙醇级分（DCB-AC301）制备方式
牛樟芝子实体粉末乙醇萃取物（AC-E）浓缩干燥后秤重，以5倍体积95%乙醇（w:v=1:5）复溶，超声波震荡10分钟后静置30分钟。高速离心10分钟（5000rpm），取上清液。称取与上清液1.5倍体积的大孔吸附树脂，进行吸附，静置隔夜后进行洗脱。大孔吸附树脂预处理，以乙醇浸泡活化，以乙醇湿法装柱（10cm×120cm），用乙醇洗脱，检测流出的乙醇液，当流出的乙醇与水（2︰1）混合不呈白色混浊时即可，再用水反复洗脱，至洗脱液无乙醇味，并且树脂柱不再下降时即可。牛樟芝子实体粉末乙醇萃取物上清液经大孔树脂吸附隔夜后，上样，进行洗脱，流速控制为0.5BV/H。然后依次用水：95%乙醇（6:4）、水：95%乙醇（4:6）、水：95%乙醇（2:8）、95%乙醇、丙酮混合溶液梯度洗脱，控制流速为2BV/H左右，每个浓度洗脱3-4个柱体积。牛樟芝子实体粉末的95%乙醇萃取物抑制肺癌活性成分主要集中在95%乙醇洗脱液中（因此该丙酮混合溶液洗脱步骤可视情况省略），收集、浓缩干燥后秤重量。萃取流程参见图5。有效抑制肺癌活性的牛樟芝萃取物的化学指纹图谱参见图6。
实施例7：牛樟芝子实体级分（DCB-AC301）的高效液相层析分析
以高效液相色层析分析仪分析牛樟芝子实体级分（DCB-AC301）的成分，高效液相层析的条件如下：
仪器与设备如下：
高效液相层析仪泵为Spectra SYSTEM P1000；自动取样器为SpectraSYSTEM AS3000；检测器为Surveyor PDA Plus；高效液相层析管柱为Thermo,BDS HYPERSIL C18,4.6*250mm；移动相中的溶剂A为乙腈（0.05%三氟乙酸）、溶剂B为H2O（0.05%三氟乙酸）；流速为1.0mL/min；管柱温度为室温；检测波长为UV254nm及UV270nm。
溶剂系统条件如下：
移动相包括溶剂A及B、线性梯度为0～40分钟（30%A～50%A）、40～60分钟（50%A～50%A）、60～80分钟（50%A～100%A）、80～120分钟（100%A～100%A）。流速及管柱温度如上所述。
参阅图7及表6为牛樟芝子实体级分（DCB-AC301）于高效液相层析后的各种成分的面积及高度比较。
表6.牛樟芝子实体级分（DCB-AC301）于254nm进行高效液相层析后的各种成分的面积及高度比较
一个熟知此领域技艺者能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中的组合物及其制造程序与方法乃较佳实施例的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。熟知此技艺者将会想到其中可修改的处及其它用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在申请专利范围中界定。
本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使任何熟习此技艺者能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步的处，仍应视为不脱离本发明的精神及范围。
说明书中提及的所有专利及出版品，都以和发明有关领域的一般技艺为准。所有专利和出版品都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个个别出版品都被具体且个别地指出纳入参考。
在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明的特点或其部份的名词及表达，但需认清的是，在本发明的专利申请范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是熟知此技艺者仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明的申请专利范围内。
Claims (13)
1.一种制备牛樟芝萃取物的方法，其包括：
（a）以低极性的溶剂萃取牛樟芝（Antrodia cinnamomea）以取得萃取液，其中所述低极性的溶剂是选自由石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇及其任意组合所组成的群组；以及
（b）以大孔吸附树脂分离所述萃取液，以获得低极性分离液。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述低极性的溶剂是95%乙醇。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤b)是将所述萃取液通入大孔吸附树脂管柱，并依次使用水：乙醇的体积比为1：0至0：1的溶液及70-100%乙醇依序洗脱，最后收集使用所述乙醇而获得的洗脱液。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤b)是将所述萃取液通入大孔吸附树脂管柱，并依次使用水：乙醇的体积比为3：2至1：4的溶液及95%乙醇依序洗脱，最后收集使用所述乙醇而获得的洗脱液。
5.一种通过如权利要求1所述的方法制备的牛樟芝萃取物。
6.如权利要求5所述的牛樟芝萃取物，其含有樟芝酸A、樟芝酸B及去氢齿孔酸。
7.如权利要求5所述的牛樟芝萃取物，其经以乙腈（0.05%三氟乙酸）及水（0.05%三氟乙酸）的梯度洗脱而进行的高效液相色层分析显示具有保留时间分别为62.5、63.6、73.8、74.0及84.3的波峰。
8.如权利要求5所述的牛樟芝萃取物，其具有如图6所示的化学指纹图谱。
9.一种医药组合物，其包含治疗有效剂量的如权利要求5所述的牛樟芝萃取物及任选存在的医药学上可接受的载剂。
10.一种如权利要求9项所述的医药组合物的用途，其是用于制备用以预防或治疗肺癌的医药品。
11.一种牛樟芝萃取物，其具有如图6所示的化学指纹图谱。
12.一种医药组合物，其包含有效剂量的如权利要求11项所述的牛樟芝萃取物及任选存在的医药学上可接受的载剂。
13.一种如权利要求12所述的医药组合物在制备用以预防或治疗肺癌的医药品中的用途。
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