TW201434472A - 用於治療肺癌之牛樟芝萃取物及其製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種牛樟芝萃取物及其製備方法。本發明亦關於本發明之牛樟芝萃取物用於治療或預防肺癌之用途。

Description

用於治療肺癌之牛樟芝萃取物及其製備方法

本發明係關於一種牛樟芝萃取物及其製備方法。本發明亦關於本發明之牛樟芝萃取物用於治療或預防肺癌之用途。

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)為台灣特有種菇菌類，目前研究結果顯示牛樟芝具有抗腫瘤、增強免疫力、抗病毒、抗發炎、抗氧化效果和保肝效果等多種功能。其中抗肺癌相關研究與專利多集中於直接使用牛樟芝子實體或菌絲體粉體或不同溶劑之抽取物或單一化合物於肺癌細胞上的毒殺效果(IC₅₀)，未有使用管柱進行活性分萃物並於動物模式中得到抗肺癌藥效確認者。

肺癌是全世界盛行率與致死率最高的癌症之一，手術切除是肺癌的主要治療手段，但利用外科手術切除法往往會加速癌細胞的轉移，進而造成癌症患者主要死亡原因；此外，據統計確診時約70%~80%患者已失去手術切除機會，對於已無手術機會的患者，放療與化療是重要的局部治療手段。 放療法雖然可以成功殺死癌細胞，但卻會沒有選擇性地一併殺死正常細胞，通常會對病人發炎性肺炎致嚴重肺損傷。鑑於傳統癌症治療法有副作用太大之缺點，有必要尋求新的替代療法來改善副作用的問題。

本發明所使用之牛樟芝子實體酒萃物之活性管柱分萃物DCB-AC301於動物模式證實除可有效抑制肺癌結節率與改善肺腫脹外，亦可明顯改善化療組體重下降現象。DCB-AC301於肺癌細胞(HCC827、H1975、A549及CL1-5)模式結果顯示IC₅₀明顯優於同一HPLC化學分析極性區之已發表之單一化合物安卓奎諾爾(Antroquiononol)、去氫硫色多孔菌酸(Dehydrosulphurenic acid，馬階一號)、樟芝酸A(Antcin A)與樟芝酸B(Antcin B)等化合物。此外，本發明於LLC/C57B6動物模式證實牛樟芝活性分萃物DCB-AC301抑肺癌結節率達80.8%，優於化療藥物(Gemzar)之78.1%及先前技術常使用之單純牛樟芝子實體酒精萃出物(AC-E)17.9%，改善疾病組肺重量60.6%，優於化療藥物組56.5%及先前技術常使用之單純牛樟芝子實體酒精萃出物8.7%。

除非本文另外界定，否則本發明所用之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。該等術語之含義及範疇應為清晰的；然而，在任何潛在歧義之情況下，本文所提供之定義優於任何辭典或外在定義。

除非另外指出，否則如本揭示內容所用之以下術語應理解為具有以下 含義。

如本文所用之術語「大孔吸附樹脂」或「大孔樹脂」(彼此可互換使用)意指一種吸附樹脂，由聚合單體和交聯劑、致孔劑、分散劑等添加劑經聚合反應製備而成。大孔吸附樹脂在乾燥狀態下其內部具有較高的孔隙率，且孔徑較大，在約50nm至2000nm之間。

如本文所用之術語「大孔吸附樹脂管柱」意指主要利用「大孔吸附樹脂」或「大孔樹脂」來進行層析之管柱，例如(包括但不限於)Diaion® HP-10、Diaion® HP-20、Diaion® HP-30、Diaion® HP-40、Diaion® HP-50、Amberlite® XAD-4、Amberlite® XAD-6、Amberlite® XAD-7、Amberlite® XAD-16、Amberlite® XAD-1180或Amberlite® XAD-1600。

如本文所用之術語「萃取物」意指針對一物質進行萃取所得之產物，通常是藉由將所欲萃取的物質浸泡或混合於溶劑中而獲得的溶液或濃縮製劑。典型地，萃取物係製備自新鮮植物或經研磨或乾燥之植物樣本。此領域已知有各種萃取方法，包括但不限於浸漬、滲濾、再滲濾、消解、逆流萃取、渦輪萃取、擠壓/壓擠/壓榨或超臨界流體二氧化碳萃取。適當的溶劑包括但不限於水、乙醇、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、正丁醇、異丁醇、丙酮、己烷、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或其他溶劑。可視需要地選擇試劑之種類或調配溶劑之濃度，以達適當極性而進行萃取，例如，低極性溶劑包括但不限於石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇；高極性溶劑包括但不限於水、50% 或以下的乙醇、甲醇、丁醇、異丁醇、80%或以下的丙酮。溶劑與待萃取物質之比例可為約1：1至約1：100(w/v(g/ml))、(較佳為約1：1至約1：50(w/v(g/ml))、更佳為約1：1至約1：20、(w/v(g/ml))，還要更佳為約1：15或1：10(w/v(g/ml))。萃取可在適當溫度進行，例如，在約5℃至約100℃、約10℃至約100℃、約20℃至約100℃、約40℃至約100℃、約60℃至約100℃，較佳為室溫25℃或100℃煮沸。不同階段的萃取物可相互合併，亦可於後續再進行濃縮步驟，例如，蒸發，或純化或分離步驟，例如，過濾、離心和色層分析。在一實例中，將新鮮植物或乾燥的植物樣本之全部或部分(視需要地經切碎或磨碎)與適當的溶劑混合或浸泡於其中並攪拌達一段足夠的時間，例如，4小時或以上、6小時或以上、8小時或以上、10小時或以上、12小時或以上、14小時或以上、或16小時或以上，在室溫進行或加熱進行，經由過濾移除固體殘留物(濾渣)，然後收集所獲得的汁液(萃取液)；視需要重複浸泡或混合步驟，合併所得汁液，進一步予以濃縮、純化或分離。

如本文所用之術語「肺癌」係指肺部組織內細胞生長失去控制的疾病。這種細胞生長可能會造成轉移，就是侵入相鄰的組織和滲透到肺部以外。

如本文所用之術語「預防」係指遲延罹患疾病個體之症狀發作或減少疾病出現。

如本文所用之術語「治療」表示緩解或改善感病個體之症狀。

如本文所用之術語「個體」表示動物，尤其哺乳動物。在一較佳實施 例中，術語「個體」表示「人類」。

如本文所用之術語「治療有效劑量」係指單獨或與其他治療/藥物組合使用以治療肺癌顯示治療功效之活性成份的量。

術語「載劑」或「醫藥學上可接受之載劑」係指一般熟習此項技術者所熟知之用以製備醫藥組合物之稀釋劑、賦形劑、接受劑或類似物。

除非本文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

本發明提供各種態樣之牛樟芝萃取物之製備方法。在一態樣中，本發明之牛樟芝萃取物係由一方法製備而得，該方法包含：(a)以低極性的溶劑萃取牛樟芝以取得萃取液，其中該低極性的溶劑係選自由石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇及其任意組合所組成之群組；以及(b)以大孔吸附樹脂分離該萃取液，以獲得低極性分離液。

較佳地，所使用的低極性溶劑係95%乙醇。此外，具體而言，以大孔吸附樹脂分離該萃取液時，可將該萃取液通入大孔吸附樹脂管柱，依次使用水：乙醇的體積比為1：0至0：1(較佳為3：2~1：4)之溶液及70-100%乙醇(較佳為95%乙醇)依序洗脫，最後收取使用該乙醇而獲得的洗脫液。又特定而言，依此方法所製備的牛樟芝萃取物經以乙腈(0.05%三氟乙酸) 及水(0.05%三氟乙酸)之梯度沖脫而進行之高效液相色層分析顯示具有滯留時間分別為62.5、63.6、73.8、74.0及84.3的波峰。

在一較佳實施例中，該步驟b)所使用之大孔吸附樹脂係選自由Diaion® HP-10、Diaion® HP-20、Diaion® HP-30、Diaion® HP-40、Diaion® HP-50、Amberlite® XAD-4、Amberlite® XAD-6、Amberlite® XAD-7、Amberlite® XAD-16、Amberlite® XAD-1180、Amberlite® XAD-1600所組成之群組。更佳地，該步驟b)所使用之大孔吸附樹脂係Diaion® HP-20。

本發明亦提供一種藉由如上述之方法製備之牛樟芝萃取物。在一較佳實施例中，該牛樟芝萃取物含有樟芝酸A、樟芝酸B及去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)。在一更佳實施例中，該牛樟芝萃取物具有如圖6所示之化學指紋圖譜。

本發明又提供一種醫藥組合物，其包含治療有效劑量之如上所述之牛樟芝萃取物及視情況醫藥學上可接受之載劑。

在另一實施例中，該醫藥組合物另外包含一或多種其他治療肺癌之藥劑。

本發明更提供一種上述醫藥組合物之用途，其係用於製備用以預防或治療肺癌之醫藥品。

在一較佳實施例中，該醫藥品係用於投予每公斤體重約1至1000毫克之牛樟芝萃取物。在一更佳實施例中，該醫藥品係用於投予每公斤體重約 75至300毫克之牛樟芝萃取物。

在一較佳實施例中，該醫藥品之功效包含但不限於抑制肺部腫瘤結節產生、改善肺腫脹之現象及/或毒殺肺癌細胞。

圖1說明不同牛樟芝分離物對LLC/C57B6肺癌動物模式體重之影響。

圖2說明不同牛樟芝分離物對LLC/C57B6肺癌動物模式肺癌結節數與外觀等抗癌功效試測。

圖3說明不同牛樟芝分離物降低LLC/C57B6肺癌動物模式腫瘤之結節

數比較(***p<0.001 vs.癌症組；*p<0.01 vs.癌症組)。

圖4說明不同牛樟芝分離物在LLC/C57B6肺癌動物模式測試中對肺臟重量之影響(^### p<0.001 vs.正常組；***p<0.001 vs.癌症組；*p<0.01 vs.癌症組)。

圖5說明牛樟芝子實體分萃物DCB-AC301之分離流程。

圖6說明牛樟芝子實體分萃物DCB-AC301之化學指紋圖譜。

本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。

實施例1：DCB-AC301對LLC/C57B6肺癌動物模式功效試驗

使用動物為公小鼠C57B/6，購自國家動物中心。飼養在有12小時光照週期(AM 7：00-PM 7：00)，並有適當溫度及濕度控管，充份供應飼料與飲水。所使用之癌細胞株為小鼠肺癌細胞LLC(Lewis Lung Carcinoma)。於尾靜脈注射1×10⁶細胞/100 μL的LLC小鼠肺癌細胞，小鼠以5-8隻為一組，隨機分籠，共分8組。腫瘤誘發1週後開始以口服(p.o.)方式，評估DCB-AC301(不同劑量)配合不同濃度之肺癌臨床一線化療用藥健擇(Gemcitabin)之增效減毒效果，每天觀察並記錄小鼠存活、食量變化及其他生理狀況。連續給藥3周後停止實驗，取出各器官後稱重、拍照記錄並進行病理分析，病理分析評估項目包括病組織分析。利用病理組織切片染色觀察肺部形態變化的情形，並以蘇木紫與伊紅染色法(Hematoxylin and Eosin stains,H & E stain)並透過顯微鏡觀察器官型態之變化和完整性。另外，並利用西方墨點法(Western blot)進行轉移相關生物標的物之表達(MMP-2、MMP-1/2、E-cadherin)，方法如下：取適量之肺部組織(30~50 mg)置於1.5 mL微量離心管(Eppendorf)中，並加入600 μL~1 mL的裂解緩衝液(Lysis buffer)使用超音波震碎器將組織震碎及細胞膜打破。接著以4℃、10000 rpm離心5分鐘，抽取上清液置於新的1.5 mL微量離心管中，保存於-80℃冰箱。蛋白定量 濃度並跑SDS-PAGE，使用1°抗溶於1% BSA和0.1% Tween-20於4℃整夜，隔夜後再給予2°抗，並使用ECL呈色壓片定量，結果展示於表1、表2、圖1、圖2、圖3及圖4。結果顯示在連續三個星期的餵食後；發現給予牛樟芝組別(AC-E、AC-S-M3及DCB-AC301)小鼠產生肺臟腫瘤結節的數量明顯較少：AC-E 300 mg/kg(以下簡稱mpk)組平均約為39.4顆、AC-M3組為32.3顆、AC-301 75 mpk組為24.5顆、AC-301 150 mpk組為14.2顆，其中又以AC-301 300 mpk劑量組效果最為顯著，其肺臟腫瘤結節數量為9.23顆，而控制組(Cancer alone)為48顆，具有極明顯的統計差異(p<0.0001)。此外，AC-301 300 mpk與正對照組(Gemzar)組別相較，均具有約80%抑制肺轉移之效果。對照測量肺臟重量結果，AC-E組約為0.42 g、AC-M3組為0.33 g、DCB-AC301 75 mpk組為0.28 g、DCB-AC301 150 mpk組為0.21 g，其中又以DCB-AC301 300 mpk組0.18 g與控制組0.46 g相較，最具顯著統計差異，並與肺臟腫瘤結節實驗結果達到一致性。最終小鼠體重，控制組(Cancer alone)小鼠平均體重為23.3 g，實驗組小鼠體重為24.1 g，顯示測試藥物無明顯毒性。

實施例2：DCB-AC301對不同肺癌細胞之細胞毒性試驗

以細胞毒殺試驗(MTT test)測試DCB-AC301及已發表之單一化合物安卓奎諾爾(Antroquiononol)、去氫硫色多孔菌酸(Dehydrosulphurenic acid，馬階一號)、樟芝酸A(Antcin A)與樟芝酸B(Antcin B)等化合物對肺癌細胞HCC827、H1975及A549之IC₅₀。測試方法如下：將細胞種至96孔盤，細胞數每孔為1×10⁴個細胞，待細胞生長形成單層後，倒掉舊培養液，加入新鮮之培養液及不同濃度之待測藥物，而不含檢測物但含溶媒(DMSO)之培養液為負對照組(Negative control)，置於培養箱中48小時後，倒掉舊培養液，以200 μL PBS清洗細胞，倒掉上清液，加入90 μL培養液和10 mL MTT標記試劑，在37℃二氧化碳培養箱下培養4小時，使形成紫色結晶；吸掉上清液50 mL，再加入200 μL含0.04N鹽酸之異丙醇將結晶溶解，最後以微ELISA光譜儀(MicroELISA spectrophotometer)在波長570 nm下測其吸光度(O.D.值)。結果展示於下表3。

實施例3：樟芝子實體前處理

新鮮牛樟芝子實體樣品適當剪碎後，於50℃烘箱中通氣烘乾16h後，秤乾重並計算乾重率%，計算公式：乾重率%=(樣品乾重/樣品濕重)*100%，再以粉碎機(佑崎，DM-6，台灣)進行磨粉加工製成牛樟芝子實體粉末。批次樣品乾重率計算結果如下面表4：

實施例4：牛樟芝子實體乙醇萃取物(AC-E)製備方式

牛樟芝子實體乾燥粉末以10倍體積95%酒精(w：v=1：10)浸泡攪拌16小時，抽氣過濾，收集第1次濾液。過濾出之粉末再次以10倍體積95%酒精(w：v =1：10)浸泡攪拌16小時，抽氣過濾，收集第2次濾液。過濾出之粉末再以10倍體積95%酒精(w：v=1：10)浸泡攪拌16小時，抽氣過濾，收集第3次濾液。三次濾液合併經減壓濃縮後得牛樟芝子實體酒精萃取物(AC-E)，濃縮乾燥後秤重量並計算萃出率。萃出率計算公式：萃出率%=(萃出物乾重/粉末乾重)*100%，批次樣品萃出率計算結果如下面表5：

實施例5：牛樟芝子實體酒精分萃物(AC-S-M3)製備方式

牛樟芝子實體粉末酒精萃取物(AC-E)濃縮乾燥後秤重，以5倍體積95%酒精(w：v=1：5)回溶，超聲波震盪10分鐘後靜置30分鐘。高速離心10分鐘(5000 rpm)，取上清液。稱取與上清液1.5倍體積之大孔吸附樹脂，進行吸附，靜置隔夜後進行洗脫。大孔吸附樹脂預處理，以酒精浸泡活化，以酒精濕法裝柱(10 cm×120 cm)，用酒精洗脫，檢測流出的酒精液，當流出的酒精與水(2：1)混合不呈白色混濁時即可，再用水反覆洗脫，至洗脫液無酒精味，並且樹脂柱不再下降時即可。牛樟芝子實體粉末酒精萃取物上 清液經大孔樹脂吸附隔夜後，上樣，進行洗脫，流速控制為0.5BV/H。然後依次用水：95%酒精(6：4)、水：95%酒精(4：6)、95%酒精、丙酮混合溶液梯度洗脫，控制流速為2 BV/H左右，每個濃度洗脫3-4個柱體積。牛樟芝子實體粉末之95%酒精萃取物抑制肺癌活性成分主要集中在95%酒精洗脫液中(因此該丙酮混合溶液洗脫步驟可視情況省略)，收集、濃縮乾燥後秤重量。

實施例6：牛樟芝子實體酒精分萃物(DCB-AC301)製備方式

牛樟芝子實體粉末酒精萃取物(AC-E)濃縮乾燥後秤重，以5倍體積95%酒精(w：v=1：5)回溶，超聲波震盪10分鐘後靜置30分鐘。高速離心10分鐘(5000 rpm)，取上清液。稱取與上清液1.5倍體積之大孔吸附樹脂，進行吸附，靜置隔夜後進行洗脫。大孔吸附樹脂預處理，以酒精浸泡活化，以酒精濕法裝柱(10 cm×120 cm)，用酒精洗脫，檢測流出的酒精液，當流出的酒精與水(2：1)混合不呈白色混濁時即可，再用水反覆洗脫，至洗脫液無酒精味，並且樹脂柱不再下降時即可。牛樟芝子實體粉末酒精萃取物上清液經大孔樹脂吸附隔夜後，上樣，進行洗脫，流速控制為0.5 BV/H。然後依次用水：95%酒精(6：4)、水：95%酒精(4：6)、水：95%酒精(2：8)、95%酒精、丙酮混合溶液梯度洗脫，控制流速為2 BV/H左右，每個濃度洗脫3-4個柱體積。牛樟芝子實體粉末之95%酒精萃取物抑制肺癌活性成分主要集中在95%酒精洗脫液中(因此該丙酮混合溶液洗脫步驟可視情況省略)，收集、 濃縮乾燥後秤重量。萃取流程參見圖5。有效抑制肺癌活性之牛樟芝萃取物之化學指紋圖譜參見圖6。

實施例7：牛樟芝子實體分萃物(DCB-AC301)之高效液相層析分析

以高效液相色層析分析儀分析牛樟芝子實體分萃物(DCB-AC301)之成分，高效液相層析的條件如下：

儀器與設備如下：

高效液相層析儀幫浦為Spectra SYSTEM P1000；自動取樣器為Spectra SYSTEM AS3000；偵測器為Surveyor PDA Plus；高效液相層析管柱為Thermo,BDS HYPERSIL C18,4.6*250 mm；移動相中的溶劑A為乙腈(0.05%三氟乙酸)、溶劑B為H₂O(0.05%三氟乙酸)；流速為1.0 mL/min；管柱溫度為室溫；偵測波長為UV_254nm及UV_270nm。

溶媒系統條件如下：

移動相包括溶劑A及B、線性梯度為0~40分鐘(30%A~50%A)、40~60分鐘(50%A~50%A)、60~80分鐘(50%A~100%A)、80~120分鐘(100%A~100%A)。流速及管柱溫度如上所述。

參閱圖7及表6為牛樟芝子實體分萃物(DCB-AC301)於高效液相層析後之各種成分的面積及高度比較。

一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之組合物及其製造程序與方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。

本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。

說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。

在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

Claims (10)

1. 一種製備牛樟芝萃取物的方法，其包含：(a)以低極性的溶劑萃取牛樟芝以取得萃取液，其中該低極性的溶劑係選自由石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇及其任意組合所組成之群組；以及(b)以大孔吸附樹脂分離該萃取液，以獲得低極性分離液。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該低極性的溶劑係95%乙醇。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟b)係將該萃取液通入大孔吸附樹脂管柱，並依次使用水：乙醇的體積比為1：0至0：1之溶液及70-100%乙醇依序洗脫，最後收取使用該乙醇而獲得的洗脫液。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟b)係將該萃取液通入大孔吸附樹脂管柱，並依次使用水：乙醇的體積比為3：2至1：4之溶液及95%乙醇依序洗脫，最後收取使用該乙醇而獲得的洗脫液。
5. 一種藉由如申請專利範圍第1項所述之方法製備之牛樟芝萃取物。
6. 如申請專利範圍第5項所述之牛樟芝萃取物，其中含有樟芝酸A、樟芝酸B及去氫齒孔酸(Dehydroeburicoic acid)。
7. 如申請專利範圍第5項所述之牛樟芝萃取物，其經以乙腈(0.05%三氟 乙酸)及水(0.05%三氟乙酸)之梯度沖脫而進行之高效液相色層分析顯示具有滯留時間分別為62.5、63.6、73.8、74.0及84.3的波峰。
8. 如申請專利範圍第5項所述之牛樟芝萃取物，其具有如圖6所示之化學指紋圖譜。
9. 一種醫藥組合物，其包含治療有效劑量之如申請專利範圍第5項所述之牛樟芝萃取物及視情況醫藥學上可接受之載劑。
10. 一種如申請專利範圍第8項所述之醫藥組合物之用途，其係用於製備用以預防或治療肺癌之醫藥品。