CN109912393B - 从怀山药茎叶中提取化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从怀山药茎叶中提取化合物2',3,5‑三羟基‑4‑甲氧基联苄的方法及应用，有效解决从山药茎叶中提取新二苯乙烷，实现新二苯乙烷在制备治疗杀死A375人黑色毒瘤细胞药物中的应用问题，怀山药干燥茎叶粉碎，丙酮提取，滤液浓缩成浸膏，浸膏溶水，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别浓缩干燥；将二氯甲烷部位用甲醇溶解，硅胶拌样，装柱，以石油醚︰乙酸乙酯以及乙酸乙酯︰甲醇为流动相梯度洗脱，合并石油醚︰乙酸乙酯=2︰1的流份，硅胶拌样，装柱，以石油醚︰乙酸乙酯为流动相梯度洗脱，收集石油醚︰乙酸乙酯4︰1的流份，甲醇溶解，过Sephadex LH‑20柱色谱，纯甲醇洗脱，合并210‑240ml的流份，半制备HPLC分离，收集保留时间tR=16.9~18.0min的流份，浓缩干燥。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是从怀山药茎叶中提取新二苯乙烷类化合物的一种从怀山药茎叶中提取化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的方法及应用。
背景技术
山药为薯蓣科薯蓣(Dioscorea opposita Thunb.)的根茎，怀山药是主产于河南省焦作市温县、武陟等沿沁河一带(古怀庆府)的道地药材，是著名的“四大怀药”之一。具有“主治伤中，补虚赢，除寒热邪气，补中益气力，久服耳目聪明，轻身不饥延年”等功效，是我国传统的药食同源食物之一。但传统药用部位为根茎，而怀山药的地上藤茎、叶片大部分作为非药用部位弃去，造成资源的浪费。随着中药现代化的发展，加强解决怀山药非药用部位的综合开发利用，提高怀山药经济价值是一项十分重要和迫切的任务。
为了明确怀山药茎叶的药效物质基础，本研究采用50％含水丙酮组织破碎对其进行提取。从怀山药茎叶的二氯甲烷部位中分离并鉴定了一个新二苯乙烷类化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄，实验结果显示2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄(S1)能显著性杀死A375人黑色毒瘤细胞且对RAW264.7巨噬细胞无影响，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从怀山药茎叶中提取化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的方法及应用，可有效解决从山药茎叶中提取新二苯乙烷，实现新二苯乙烷在制备治疗杀死A375人黑色毒瘤细胞药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种从怀山药茎叶中提取化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的方法及应用，所述的2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄分子结构式见图1，其制备方法是：
取40kg怀山药的干燥茎叶粉碎，用体积浓度50％丙酮室温浸渍24h，并用闪式提取器组织破碎提取2次，每次40s，过滤，合并滤液后减压浓缩得浸膏，浸膏用8L水溶解，并依次分别用8L石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次后得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，将各部位分别浓缩干燥；将二氯甲烷部位用甲醇溶解，100-200目硅胶拌样，样品与硅胶用量为1:1，用200-300目硅胶装柱，以石油醚︰乙酸乙酯以及乙酸乙酯︰甲醇为流动相梯度洗脱，流速10ml/min，所用梯度比依次为石油醚︰乙酸乙酯＝100︰0、20︰1、10︰1、5︰1、2︰1、0︰1及乙酸乙酯︰甲醇＝4︰1、0︰1，每200ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，2d洗脱完毕，合并石油醚：乙酸乙酯＝2:1的流份，为组分B4；组分B4甲醇溶解，继续上硅胶柱，100-200目硅胶拌样，组分B4与硅胶用量为1:1，200-300目硅胶装柱，以石油醚︰乙酸乙酯为流动相梯度洗脱，流速5ml/min，梯度比例依次为16:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1，茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并石油醚︰乙酸乙酯＝4︰1的流份，为组分C4；组分C4用甲醇溶解，通过Sephadex LH-20柱色谱，用纯甲醇洗脱，流速0.8ml/min，流动相用量为300mL，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并210-240ml的流份，为组分F4；组分F4用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为甲醇︰三氟乙酸水溶液＝57:43，所述的三氟乙酸水溶液的质量浓度为万分之三，流速3mL/min，收集保留时间tR＝16.9～18.0min的流份，浓缩干燥，即得化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄(S1)；
该化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄能显著性杀死A375人黑色毒瘤细胞且对RAW264.7巨噬细胞无影响，实现化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄在制备治疗A375人黑色毒瘤药物中的应用。
本发明制备方法易操作，科学合理，能有效从怀山药茎叶中提取新二苯乙烷类化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄，该化合物能显著性杀死A375人黑色毒瘤细胞且对RAW264.7巨噬细胞无影响，开拓了山药茎叶的新用途，节约资源，提高了山药的商业价值和使用价值，同时开拓了治疗因A375人黑色毒瘤细胞引起的肿瘤(癌症)药物的新途径，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明化合物的分子结构式图。
图2为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的1H NMR谱(500MHz,CD3OD)图。
图3为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的13C NMR谱(125MHz,CD3OD)图。
图4为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的DEPT135谱图。
图5为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的1H-1H COSY谱图。
图6为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的HSQC谱图。
图7为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的HMBC谱图。
图8为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的HR-ESI-MS图。
图9为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的紫外图谱图。
图10为本发明2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的红外图谱图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
本发在具体实施中，取40kg怀山药的干燥茎叶粉碎，用体积浓度50％丙酮室温浸渍24h，并用闪式提取器组织破碎提取2次，每次40s，过滤，合并滤液后减压浓缩得浸膏5.8kg，浸膏用8L水溶解，并依次用8L石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次后得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；将各部位浓缩干燥后，取二氯甲烷部位29.3g甲醇溶解，100-200目硅胶拌样，样品与硅胶用量为1:1，用200-300目硅胶装柱，以石油醚︰乙酸乙酯以及乙酸乙酯︰甲醇为流动相梯度洗脱，流速10ml/min，所用比例依次为石油醚︰乙酸乙酯＝100︰0、20︰1、10︰1、5︰1、2︰1、0︰1以及乙酸乙酯︰甲醇＝4︰1、0︰1，每200ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，2d洗脱完毕，合并石油醚︰乙酸乙酯＝2︰1的流份，为组分B4；组分B4甲醇溶解后，继续上硅胶柱，100-200目硅胶拌样，样品与硅胶用量为1:1，200-300目硅胶装柱，以石油醚︰乙酸乙酯为流动相梯度洗脱，流速5ml/min，所用比例依次为16:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1，茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并石油醚︰乙酸乙酯＝4:1的流份，为组分C4；组分C4用甲醇溶解，通过Sephadex LH-20柱色谱，用纯甲醇洗脱，流速0.8ml/min，流动相用量为300ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并210-240ml的流份标为F4。组分F4用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为甲醇︰三氟乙酸水溶液＝57︰43，流速3mL/min，收集保留时间tR＝16.9～18.0min的流份，浓缩干燥，得化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄(S1)。
按上述方法对不同重量的干燥山药茎叶进行制备提取，均得到了相同或相近似的结果，表明本发明方法稳定可靠，这里不一一列举，并对提取物进行了对特征结构的测定和活性成分的活性试验，均取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：
1、仪器与试药
核磁共振用Bruker AVANCEⅢ500核磁共振仪(TMS内标)(Bruker)，红外光谱用Nicolet is 10Microscope Spectrometer(Thermo Scientific,USA)，高分辨质谱用Bruker maxis HD mass spectrometer，紫外光谱用Shimadzu UV-2401PC apparatus，高效液相色谱用Waters Alliance系列2695高效液相系统，配备2998型二极管阵列检测器，Empower3色谱数据工作站，LC50型高压制备液相色谱仪，UV200型紫外检测器[赛谱锐思(北京)科技有限公司]，YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×10mm.D.S-5mm,12mm)(YMC有限公司)，其余有N-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，A-1000S型水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)，N-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)，FDU-2110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)，DFZ-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，AB204-N万分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)，iMARK型酶标仪(美国BIO-RAD)，二氧化碳培养箱(上海STIK)，超净工作台(苏净集团)，Arium 611VF超级组合型超纯水器(SARTORIUS)，倒置显微镜(Nikon)，PB-10酸度计(德国赛多利斯集团)。
柱层析填料Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20(日本三菱化学公司)，Toyopearl HW-40(日本TOSOH公司)，Sephadex LH-20(Parmacia Biotech公司)，柱层析所用硅胶H(100-200目、200-300目)为青岛海洋化工厂生产，培养皿、96孔培养板、细胞冻存管(Corning公司)，所用色谱纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产，所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化学试剂厂生产。DMEM高糖培养液(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Gibco)，DMSO(Solarbio)；MTT(Biosharp)，水为超纯水，PBS缓冲液。山药茎叶于2017年11月采自河南焦作，经权威鉴定为薯蓣科植物薯蓣(Dioscorea opposita Thunb.)的干燥茎叶。
2结构特征鉴定
采用上述给出的仪器和设备，对提取物进行鉴定，本发明提取物为：棕色油状(CH3OH)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 261.1121[M+H]+,(calcd.ForC15H16O4H261.1121)，确定其分子式为C15H16O4；UV(MeOH)λmax:203,275nm；IR(KBr)νmaxcm-1：3363,2940,1674,1592,1455,1192,1040cm-1，分子结构式为：
命名为新二苯乙烷类化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄，简称为2’,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄化合物，具体数据结构见表1：
表1 化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的NMR数据(in CD3OD)
3活性试验
3.1 A375细胞增殖实验
A375细胞经含胎牛血清(10％)的DMEM培养基培养1周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入DMEM培养基吹打均匀，以5×104个/mL的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为100μL。培养24h待细胞贴壁后，换为含2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的培养液(25,50μM)继续培养。37℃、5％CO2培养24h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入100μLDMSO，震荡5-10min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪双波长在570-630nm下测定各孔吸光度值(A)，计算平均A值和细胞活力。实验平行重复三次。
细胞活力＝各组OD值/正常组OD值。表2显示，2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄(25uM,50uM)可以显著性抑制A375人黑色素瘤细胞增殖P<0.001。
表2 化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄对A375细胞增殖的影响(
n＝6)
注:与正常组比较，***表示P<0.001。
3.2 RAW264.7细胞增殖实验
RAW264.7细胞经含胎牛血清(10％)的DMEM培养基培养1周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入DMEM培养基吹打均匀，以5×104个/mL的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为100μL。培养24h待细胞贴壁后，换为含2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的培养液(25,50μM)继续培养。继续培养24h后MTT法检测细胞活力(同4.1)。表3显示，2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄对RAW264.7细胞无影响。
表3 化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄对RAW264.7细胞增殖的影响(
n＝6)
总之，本发明采用50％含水丙酮组织破碎对怀山药茎叶进行提取。从怀山药茎叶的二氯甲烷部位中分离并鉴定了一个新的二苯乙烷类化合物，为2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄。实验结果显示2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄能显著性杀死A375人黑色毒瘤细胞且对RAW264.7巨噬细胞无影响，提示2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄能特异性杀伤A375细胞，作为唯一活性成分能成为抗肿瘤新药，实现化合物2′,3,5-三羟基-4-甲氧基联苄在制备治疗A375人黑色毒瘤细胞药物中的应用，有效解决了地上的山药茎叶传统弃去，造成资源的浪费问题，节约资源，提高了山药的种植价值和使用价值，开拓了山药的商业价值和经济价值，有巨大的经济和社会效益。
Claims (2)
1.一种从怀山药茎叶中提取化合物2',3,5-三羟基-4-甲氧基联苄的方法，其特征在于，所述的化合物2',3,5-三羟基-4-甲氧基联苄分子结构式为：
其制备方法是，取40kg怀山药的干燥茎叶粉碎，用体积浓度50％丙酮室温浸渍24h，并用闪式提取器组织破碎提取2次，每次40s，过滤，合并滤液后减压浓缩得浸膏，浸膏用8L水溶解，并依次分别用8L石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次后得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，将各部位分别浓缩干燥；将二氯甲烷部位用甲醇溶解，100-200目硅胶拌样，样品与硅胶用量为1:1，用200-300目硅胶装柱，以石油醚︰乙酸乙酯以及乙酸乙酯︰甲醇为流动相梯度洗脱，流速10ml/min，所用梯度比依次为石油醚︰乙酸乙酯＝100︰0、20︰1、10︰1、5︰1、2︰1、0︰1及乙酸乙酯︰甲醇＝4︰1、0︰1，每200ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，2d洗脱完毕，合并石油醚：乙酸乙酯＝2:1的流份，为组分B4；组分B4甲醇溶解，继续上硅胶柱，100-200目硅胶拌样，组分B4与硅胶用量为1:1，200-300目硅胶装柱，以石油醚︰乙酸乙酯为流动相梯度洗脱，流速5ml/min，梯度比例依次为16:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1，茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并石油醚︰乙酸乙酯＝4︰1的流份，为组分C4；组分C4用甲醇溶解，通过Sephadex LH-20柱色谱，用纯甲醇洗脱，流速0.8ml/min，流动相用量为300mL，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并210-240ml的流份，为组分F4；组分F4用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为甲醇︰三氟乙酸水溶液＝57:43，所述的三氟乙酸水溶液的质量浓度为万分之三，流速3mL/min，收集保留时间tR＝16.9～18.0min的流份，浓缩干燥，即得化合物2',3,5-三羟基-4-甲氧基联苄。
2.权利要求1所述方法制备的化合物2',3,5-三羟基-4-甲氧基联苄作为唯一活性成分在制备治疗A375人黑色毒瘤药物中的应用。
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