CN113075315A - 一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测动物饲料中七种链格孢霉毒素的方法 - Google Patents

一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测动物饲料中七种链格孢霉毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测动物饲料中七种链格孢霉毒素（细交链格孢菌酮酸、交链孢酚、交链格孢酚单甲醚、交链孢烯、格孢毒素I、腾毒素、AAL Toxin TA1）的超高效液相色谱‑质谱分析方法（UHPLC‑MS）。链格孢霉是饲料霉变的重要病原菌之一，产生的毒素不仅严重危害人类健康和畜禽生产安全，也造成了相应的经济损失。本发明采用简便的液‑液萃取方法，结合UHPLC‑MS分析技术，提供了一种动物饲料中七种链格孢霉毒素同时检测的分析新方法，仪器检出限在0.12~1.40 ng/mL范围内，为今后饲料的生产、储存和使用过程中其质量监管提供了有效手段。

Description

一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测动物饲料中七种 链格孢霉毒素的方法
技术领域
本发明涉及一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测动物饲料中细交链格孢菌酮酸（TEA）、交链孢酚（AOH）、交链格孢酚单甲醚(AME)、交链孢烯(ALT)、格孢毒素 I(ATT-I)、腾毒素(TEN)、AAL Toxin TA1(TA-1)等七种链格孢霉毒素的方法，属于分析技术领域。
背景技术
据联合国粮农组织统计，全球每年由于霉菌污染饲料所造成的经济损失达近千亿元。我国是霉菌毒素污染最严重的国家之一，每年因饲料霉变导致的直接经济损失在100亿元以上。反刍动物每年消耗的数百万吨饲料，包括新鲜牧草、干草、秸秆、饲用谷物、青贮饲料等，均可在收获前或贮藏过程中感染霉菌毒素。链格孢霉是饲料霉变的重要病原菌之一，产生的毒素不仅严重危害人类健康和畜禽生产安全，也造成了相应的经济损失。
链格孢霉毒素主要包括交链格孢毒素（ATX）、交链格孢酚(AOH) 、交链格孢酚单甲醚(AME) 、交链孢烯(ALT) 和细交链格孢菌酮酸(TeA) 等。目前，我国已制定饲料中黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素和伏马毒素的限量标准，但缺乏链格孢霉毒素的限量标准。链格孢霉毒素现用的检测方法有薄层色谱分析、液相色谱法、气相色谱、气相色谱与质谱联用仪，超高效液相色谱-串联质谱法和竞争酶联免疫吸附法等，但是这些方法适用基质不包含饲料，而且检测种类较少。因此，有必要建立饲料中链格孢霉毒素的快速、简便、灵敏分析新技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便、灵敏的动物饲料中细交链格孢菌酮酸（TEA）、交链孢酚（AOH）、交链格孢酚单甲醚(AME)、交链孢烯(ALT)、格孢毒素 I(ATT-I)、腾毒素(TEN)、AAL Toxin TA1(TA-1)等七种链格孢霉毒素的同时检测新方法。
本发明的技术方案：一种基于超高效液相色谱-质谱法实现动物饲料中七种链格孢霉毒素（TEA，AOH，AME，ALT，ATT-I，TEN，TA-1）同时测定的分析方法。饲料中七种链格孢霉毒素用乙腈（含2%乙酸）溶液室温下超声提取，用超高效液相色谱-质谱法测定。
本发明主要包括以下几个步骤：超高效液相色谱-质谱条件；七种链格孢霉毒素（TEA，AOH，AME，ALT，ATT-I，TEN，TA-1）标准溶液的检测；样品的预处理；样品的检测。
一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测动物饲料中七种链格孢霉毒素（TEA，AOH，AME，ALT，ATT-I，TEN，TA-1）的分析方法，其特征在于：主要包括以下几个步骤：
（1）超高效液相色谱-质谱条件
本发明中所使用的仪器是超高效液相色谱-质谱联用仪，包括LC30草高效液相色谱系统（岛津，日本）和Triple TOF 5600+（AB Sciex，美国）质谱仪，色谱条件：色谱条件：色谱柱：Shim-pack GIST C18柱（2.1×75 mm，2.0 μm）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。流动相：A相为含0.1 %甲酸-水，B相为乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1。质谱条件：离子源：ESI源；正离子模式；离子源电压：5500V；气帘气（CUR gas）35 psi；雾化气（GAS 1）50psi；辅助气（GAS 2）50 psi；离子源温度550 ℃；采集方式：选择离子扫描模式，具体条件见表2。
Figure 525093DEST_PATH_IMAGE001
Figure 420368DEST_PATH_IMAGE002
（2）七种链格孢霉毒素（TEA，AOH，AME，ALT，ATT-I，TEN，TA-1）标准溶液的检测
本发明采用外标法进行定，用乙腈配置一系列质量浓度的TEA，AOH，AME，ALT，ATT-I，TEN，TA-1混合标准工作溶液，在上述色谱-质谱条件下进行分析，以峰面积（y）对分析物浓度（x）进行线性回归，得到线性回归方程。TEA、AOH、AME在5-500ng/mL，ALT、ATT-I、TEN和TA-1咋0.5-100ng/mL范围内具有良好的线性关系（R2>0.997），LOD和LOQ分别在0.12-1.40ng/mL和0.39-4.66ng/mL范围内。
（3）样品的前处理
准确称取称取0.2-0.5g样品（食品粉碎机粉碎），加入4mL乙腈（含2%乙酸）溶液，震荡混匀，室温下超声提取30分钟；再加入0.2gNaCl，震荡2分钟；10000 转/分钟离心10分钟；上清液用0.22μm有机相滤膜过滤即得上机溶液。
（4）样品的检测
准确称取0.2-0.5g样品，分别添加三个不同浓度水平的链格孢霉毒素混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行UHPLC-MS分析，计算样品加标回收率。
本发明的有益效果：本发明设计了一种同时检测动物饲料中七种链格孢霉毒素的超高效液相色谱色谱-质谱方法，可简便、快速、灵敏地检测饲料中七种链格孢霉毒素，为今后的饲料的生产、储存和使用过程中其质量监管提供了方便，可满足国内对其安全监管的需要。
附图说明
图1为细交链格孢菌酮酸、交链孢酚、交链格孢酚单甲醚、交链孢烯、格孢毒素 I、腾毒素、AAL Toxin TA1提取离子流色谱图；细交链格孢菌酮酸（TEA）、交链孢酚（AOH）、交链格孢酚单甲醚(AME)：50ng/mL；交链孢烯(ALT)、格孢毒素 I(ATT-I)、腾毒素(TEN)、AALToxin TA1(TA-1):5 ng/mL。
具体实施方式
实施例1：
使用超高效液相色谱-质谱联用仪，包括LC30草高效液相色谱系统（岛津，日本）和Triple TOF 5600+（AB Sciex，美国）质谱仪，色谱条件：色谱条件：色谱柱：Shim-pack GISTC18柱（2.1×75 mm，2.0 μm）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。流动相：A相为含0.1 %甲酸-水，B相为乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1。质谱条件：离子源：ESI源；正离子模式；离子源电压：5500V；气帘气（CUR gas）35 psi；雾化气（GAS 1）50 psi；辅助气（GAS 2）50psi；离子源温度550 ℃；采集方式：选择离子扫描模式，七种目标物质谱检测条件见表2。
Figure 612839DEST_PATH_IMAGE003
Figure 667383DEST_PATH_IMAGE005
实施例2：
用乙腈配置一系列质量浓度的TEA，AOH，AME，ALT，ATT-I，TEN，TA-1混合标准工作溶液，在上述色谱-质谱条件下进行分析，以峰面积（y）对分析物浓度（x）进行线性回归，线性范围、检出限及定量限见表3。
Figure 238173DEST_PATH_IMAGE006
实施例3：
样品的前处理：准确称取称取0.2g牧草样品（用食物粉碎机粉碎后过5号筛），加入4mL乙腈（含2%乙酸）溶液，震荡混匀，室温下超声提取30分钟；再加入0.2gNaCl，震荡2分钟；10000 转/分钟离心10分钟；上清液用0.22μm有机相滤膜过滤即得上机溶液。
实施例4：
准确称取0.2 g牧草和豆粕样品，分别添加两个不同浓度水平的混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行UHPLC-MS分析，计算样品加标回收率和精密度，结果见表4。
Figure 10957DEST_PATH_IMAGE007
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和发明构思，作出相应改变和替代，而且性能或用途相同，都应当视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测动物饲料中七种链格孢霉毒素的分析方法，其特征在于：主要包括以下几个步骤：
（1）超高效液相色谱-质谱条件；
（2）七种链格孢霉毒素（细交链格孢菌酮酸、交链孢酚、交链格孢酚单甲醚、交链孢烯、格孢毒素 I、腾毒素、AAL Toxin TA11）标准溶液的检测；
（3）样品的前处理；
（4）样品的检测。
2.一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测动物饲料中七种链格孢霉毒素的分析法，其特征在于：主要包括以下几个步骤：
（1）超高效液相色谱-质谱条件
本发明中所使用的仪器是超高效液相色谱-质谱联用仪，包括LC30草高效液相色谱系统（岛津，日本）和Triple TOF 5600+（AB Sciex，美国）质谱仪，色谱条件：色谱条件：色谱柱：Shim-pack GIST C18柱（2.1×75 mm，2.0 μm）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；流动相：A相为含0.1 %甲酸-水，B相为乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1；质谱条件：离子源：ESI源；正离子模式；离子源电压：5500V；气帘气（CUR gas）35 psi；雾化气（GAS 1）50 psi；辅助气（GAS 2）50 psi；离子源温度550 ℃；采集方式：选择离子扫描模式，具体条件见表2：
Figure 905407DEST_PATH_IMAGE001
Figure 761237DEST_PATH_IMAGE002
（2）七种链格孢霉毒素标准溶液的检测
本发明采用外标法进行定，用乙腈配置一系列质量浓度的细交链格孢菌酮酸、交链孢酚、交链格孢酚单甲醚、交链孢烯、格孢毒素 I、腾毒素和AAL Toxin TA1混合标准工作溶液，在上述色谱-质谱条件下进行分析，以峰面积（y）对分析物浓度（x）进行线性回归，得到线性回归方程，TEA、AOH、AME在5-500ng/mL，ALT、ATT-I、TEN和TA-1咋0.5-100ng/mL范围内具有良好的线性关系（R2>0.997），LOD和LOQ分别在0.12-1.40ng/mL和0.39-4.66ng/mL范围内；
（3）样品的前处理
准确称取称取0.2-0.5g样品（食品粉碎机粉碎），加入4mL乙腈（含2%乙酸）溶液，震荡混匀，室温下超声提取30分钟；再加入0.2g NaCl，震荡2分钟；10000 转/分钟离心10分钟；上清液用0.22μm有机相滤膜过滤即得上机溶液：
（4）样品的检测
准确称取0.2-0.5g样品，分别添加三个不同浓度水平的链格孢霉毒素混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行UHPLC-MS分析，计算样品加标回收率。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113640435A (zh) * 2021-07-26 2021-11-12 上海市农产品质量安全中心 一种链格孢霉毒素lc-msms快速定量检测方法
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CN115155104A (zh) * 2022-07-05 2022-10-11 山东省海洋资源与环境研究院(山东省海洋环境监测中心、山东省水产品质量检验中心) 一种饲料中真菌毒素的提取方法和检测方法

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