CN112111066A - 一种基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法及其应用 - Google Patents

一种基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法,包括制备高交联度的疏水性聚合物核且粒径为2～10微米、在疏水性聚合物核表面形成一薄层亲水聚合物、形成多孔的亲水聚合物凝胶壳层且厚度为0.1～5微米。各层之间均以共价键的方式连接，通过表面接枝共聚或表面引发的活性聚合以及通过表面环氧开环键合或含卤素功能团的取代反应等方式来实现。制备的核壳结构聚合物微球粒径均一、耐高压、耐酸碱且表面可修饰从而制备含各种表面功能团的聚合物微球。上述合成的核壳结构含各种表面功能团的聚合物微球可以应用于色谱分离分析生物分子，尤其是蛋白质分子。

Description

一种基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方 法及其应用
技术领域
本发明涉及高分子材料领域，涉及一种核壳结构的聚合物微球，具体来说是一种具有粒径均匀、适合于蛋白质色谱分离分析的核壳结构聚合物微球的制备方法及其应用。
背景技术
高效液相色谱(HPLC)用于分离分析生物分子，尤其是蛋白质分子，在生物医药和临床诊断领域以及生命科学的研究中发挥着越来越大的作用。色谱填料是HPLC技术的核心和基础。一般来说，色谱填料可以分为无机基质和有机基质。无机基质如硅胶，其具有刚性好、结构稳定、表面易修饰等优点，在HPLC中应用广泛。有机基质如聚合物微球或聚多糖微球，惰性好、耐酸碱、可修饰性强，特别适合于生物分子如蛋白质的分离分析，但常用的聚合物微球的刚性仍然不能满足HPLC高速分离的需要；而常用的琼脂糖微球耐压性更低，只能用于低压或中压液相色谱领域。聚苯乙烯类或聚丙烯酸酯类聚合物微球可以通过交联提高其刚性；直接用交联剂来制备聚合物微球以及后续的表面修饰也有一些报道，但其表面结构和性质并不能满足HPLC分离蛋白质的需要。
发明内容
针对现有色谱填料中的上述一些问题，本发明提供了一种核壳结构的聚合物微球的制备方法及其应用，所述的这种核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球主要解决现有色谱填料的耐压性差、分离效率低、以及颗粒不均一等问题。
一种基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，包括如下步骤：
1)利用自由基聚合的方法，以AIBN作为引发剂，在乙腈溶剂中50℃～100℃聚合二乙烯苯，在5～10小时后形成粒径在2um～10um之间的疏水性聚合物微球；
2)步骤1)的聚合反应完成80％～95％的时候加入甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙基酯、乙酸乙烯酯中的一种，其用量是步骤1)中二乙烯苯用量的5％～20％；
3)步骤2)形成的聚合物复合微球进行化学处理，然后通过表面接枝共聚或表面引发的活性聚合以及通过表面环氧开环键合或含卤素功能团的取代反应等方式形成多孔的亲水聚合物凝胶壳层。
优选的，所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，步骤3)中制备的多孔的亲水聚合物凝胶壳层的厚度在0.1um～5um之间，所述亲水聚合物凝胶壳层组成可以是一般亲水性聚合物，也可以是葡聚糖或琼脂糖等聚多糖类生物材料。
优选的，所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法,步骤3)中所述化学处理包括在酸碱溶液中的水解，键合可以引发进一步键合或聚合反应的特征分子。
优选的，所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法,步骤3)中所述表面接枝共聚或表面引发的活性聚合包括原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)。
优选的，所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法,步骤3)中所述表面环氧开环键合或含卤素功能团的取代反应在碱性条件下进行的，其pH范围是9～14。
优选的，所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法,所得到的核壳结构的聚合物微球表面可以进一步修饰接上各种化学功能团或和生物分子：如离子交换基团羧基、硫酸根、磷酸根、叔胺、或季铵盐等，烷基链如丁基，辛基、或苯基等，金属离子螯合物，混合功能团，亲和配体、链霉亲和素，抗原或抗体等。
上述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球应用,所述的方法获得的核壳结构的聚合物微球可通过HPLC高效分离分析蛋白质、多肽以及核酸分子。
上述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的应用,所述的方法获得的核壳结构的聚合物微球可通过HPLC高效分离分析糖化血红蛋白或糖化白蛋白用于糖尿病的检测。
将聚合物微球的刚性进一步提高作为新型聚合物微球的核，再结合聚多糖水溶胶的优点将其作为新型聚合物微球的壳，就可以得到理想的蛋白质分离分析用色谱填料。本发明正是遵循上述设想，找到一种工艺可控、易规模化的核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法。
本发明和已有技术相比，其技术效果是显著的。本发明突出的创新点就是使用了一种可控的、核壳结构方式来制备蛋白质分离分析用聚合物微球。既利用了高度交联的疏水性聚合物刚性好的特点，又利用了聚多糖高分子的惰性和可修饰性，把二者有机地组合在一起，对蛋白质的分离分析显示出了良好的应用前景。所合成的核壳结构的聚合物微球可以进一步表面修饰应用于分离纯化各种生物分子，包括糖尿病检查中糖化血红蛋白或糖化白蛋白。
附图说明：
下面结合附图对具体实施方式作进一步的说明，其中：
图1是本发明涉及的方法制备的核壳结构的聚合物微球SEM图片；
图2是血液中糖化血红蛋白的HPLC色谱图。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
具体实施案例1：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请权利要求书的保护范围。
实施例1
取新蒸馏的二乙烯苯10毫升，加入到200毫升乙腈中，在氮气保护下搅拌30分钟，然后加入0.2克的偶氮二异丁腈(AIBN)，升温至70℃，反应5个小时，然后加入3毫升的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，继续聚合反应1小时。得到的聚合物微球用乙腈充分洗涤。
将上述微球分散到100毫升0.1M(0.1mol/L)的稀硫酸中，90℃搅拌反应2小时。得到的微球水洗、晾干。将晾干的微球分散于0.4M(0.1mol/L)的NaOH中，加入10毫升环氧氯丙烷，在50℃搅拌反应6小时。得到的微球用乙醇和水充分洗涤。
将上述微球分散在2％的葡聚糖溶液中，pH调至12.5，室温反应8小时。然后水洗微球至中性。
重复上述环氧氯丙烷反应和葡聚糖键合反应，直至得到满意厚度的核壳结构的聚合物微球。
将最后得到的核壳结构的聚合物微球再一次进行上述环氧氯丙烷反应，然后将得到的环氧化微球与亚硫酸钠在pH＝8.0的水溶液中室温反应6个小时。得到含硫酸根的核壳结构的聚合物微球。
具体实施案例2：
将实例1得到的含硫酸根的核壳结构的阳离子交换聚合物微球分散于水中，然后填装于4.6X30mm的色谱柱进行蛋白质分离分析测试。典型的血液中糖化血红蛋白的HPLC色谱图如图2所示。
具体实施案例3：
甲基丙烯酸缩水甘油酯的用量是交联剂用量的8％或10％或15％，其他与具体实施案例1相同。
从以上实例不难看出，通过本发明方法制备的核壳结构的聚合物微球可以衍生出一系列在生物医药和临床诊断领域以及生命科学研究中有潜力的分离分析用色谱柱填料。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)在溶剂中，利用自由基聚合的方法在50℃～100℃直接聚合含两个或两个以上不饱和键的交联剂，形成粒径均匀分布的疏水性聚合物微球；
2)步骤1)中聚合反应完成85％～95％时，加入另一单体，所述单体在形成的疏水性聚合物微球表面继续生成一薄层亲水性聚合物。
3)步骤2)形成的聚合物微球表面通过共价键结合的方式再形成多孔的亲水聚合物凝胶壳层，即得到核壳结构的聚合物微球。
2.根据权利要求1所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述交联剂为二乙烯苯，所述溶剂为乙腈，制备得到的所述疏水性聚合物微球的粒径在2um～10um之间。
3.根据权利要求1所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙基酯、或乙酸乙烯酯，所述单体的用量是步骤1)中所述交联剂用量的5％～20％。
4.根据权利要求1所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述共价键结合的方式包括通过表面接枝共聚或表面引发的活性聚合以及通过表面环氧开环键合或含卤素功能团的取代反应形成多孔的亲水聚合物凝胶壳层。
5.根据权利要求1所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，其特征在于：多孔的亲水聚合物凝胶壳层的厚度在0.1um～5um之间，其组成是葡聚糖或琼脂糖类聚多糖生物材料。
6.根据权利要求1所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，其特征在于：步骤1)中自由基聚合的引发剂为偶氮二异丁腈即AIBN或过氧化苯甲酰即BPO，其含量为单体的0.05％～5％。
7.根据权利要求1所述基于核壳结构的蛋白质分离分析用聚合物微球的制备方法，其特征在于：得到的多孔的亲水聚合物凝胶壳层即核壳结构的聚合物微球表面修饰连接有多种化学功能团或/和生物分子。
8.根据权利要求1～7中任一所述制备方法获得的核壳结构的聚合物微球用于生物分子分离纯化领域。
9.根据权利要求1～7中任一所述制备方法获得的核壳结构的聚合物微球用于蛋白质的分离分析。
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