CN111579773A - 肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法 - Google Patents

肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法，涉及生物技术领域。该方法包被的肺炎支原体膜蛋白抗原为天然肺炎支原体蛋白，该方法包括先使用还原剂处理肺炎支原体膜蛋白抗原，再将肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠偶联。该方法缓解了天然肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠效率低的技术问题。

Description

肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，Mp)是微小的原核致病微生物，缺乏细胞壁，对作用于细胞壁的抗菌药物(如青霉素与头孢菌素类)天然耐药，是儿童呼吸道感染的常见病原。Mp主要经飞沫传播，在体内的潜伏期是2-3周，潜伏期至症状缓解数周均有传染性。Mp感染还可以造成肺外各系统改变，严重的也会导致死亡。因此，及时有效的进行Mp感染的检测意义重大。
目前国内外采用的Mp感染诊断法包括经典的培养法、血清学抗体检测法、抗原检测法和核酸检测法。其中，血清抗体检测操作简便、受干扰的因素少、特异性强、灵敏度高，是临床上最常用的检测方法。Mp血清学实验的靶抗原主要有Mp灭活菌体抗原、Mp糖脂抗原、Mp膜蛋白抗原和重组Mp抗原(P1、P30、P116等)。天然培养的Mp中提取的Mp膜蛋白抗原含有病原体天然的蛋白结构，包含的抗原表位更多，能更好的被特异性抗体所识别，在血清学检测中表现出优良的灵敏度，可用于制备抗体检测试剂盒。
在现有技术中，CN103834668A公开了一种重组肺炎支原体蛋白以及该重组肺炎支原体蛋白在制备检测试剂盒中的应用。但其所述的为重组肺炎支原体蛋白，且主要用于制备胶体金法的检测试剂，并未涉及体外诊断试剂领域化学发光免疫测定法中磁珠的包被，对于化学发光免疫测定中包被磁珠的效果未知。
CN110672837A公开了一种磁珠包被蛋白的工艺方法，该方法采用的为羧基磁珠，适用包被蛋白为TSH抗体、AFP抗体和TG抗原，不包括肺炎支原体膜蛋白抗原，并且该方法旨在提高蛋白的包被效率，对于磁珠包被蛋白后稳定性并未涉及。
CN110045116A公开了一种能有效提升病毒抗原包被效率的包被促进剂，但该方法主要是在抗原包被过程中加入还原剂、蛋白变性剂、非离子表面活性剂和有机还原剂，释放抗原抗体结合位点以提高纯化病毒抗原包被效率，该方法针对的为重组病毒抗原，非病毒抗原，特别是天然肺炎支原体膜蛋白抗原的应用并未提及，且该方法包被载体为微孔板而不是磁珠。
天然培养的肺炎支原体中提取的肺炎支原体膜蛋白抗原中蛋白成分复杂，使肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的效率很低。因此在使用肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠时，需要一种提高包被效率和包被后磁珠稳定性的方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法，缓解了天然肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠效率低的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种采用上述方法制备得到的肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠。
本发明的第三目的在于提供含有上述肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法，所述肺炎支原体膜蛋白抗原为天然肺炎支原体蛋白；
所述方法包括先使用还原剂处理所述肺炎支原体膜蛋白抗原，再将所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠偶联。
优选地，所述还原剂包括二代苏硫醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦和半胱氨酸中的至少一种；
优选地，所述还原剂包括二代苏硫醇和/或三(2-羧乙基)膦；
优选地，所述还原剂包括二代苏硫醇。
优选地，所述还原剂的浓度为10～50mM，优选为10～30mM，更优选为15mM；
优选地，所述还原剂的处理时间为5～120min，优选为60～90min，更优选为60min。
优选地，所述还原剂的处理温度为4～37℃，优选为4℃。
优选地，所述磁珠包括甲苯磺酰基磁珠。
优选地，所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠的偶联时间为1～10h，优选为2～8h，更优选为2h；
优选地，所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠的偶联温度为4～37℃，更优选为37℃。
优选地，所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠偶联后，经封闭处理后至少洗涤一次，每次洗涤时间为10～60min；
优选地，洗涤次数为3次；
优选地，每次洗涤时间为30～60min，共洗涤3次；
更优选地，每次洗涤时间为30min，共洗涤3次。
优选地，所述肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的量为10～20μg/mg磁珠。
优选地，所述肺炎支原体膜蛋白抗原偶联的磁珠为甲苯磺酰基磁珠，所述方法包括如下步骤：
(A)使用终浓度为10～50mM的还原剂处理所述肺炎支原体膜蛋白抗原，处理温度为4～37℃，并在旋转混匀仪上混合5～120min；
(B)将步骤(A)混合后的溶液置于透析袋中，然后置于缓冲液中透析多次；
(C)将CB缓冲液、所述肺炎支原体膜蛋白抗原、洗涤后的甲苯磺酰基磁珠和硫酸铵混合，在4～37℃的条件下置于旋转混匀仪偶联1～10h；
(D)洗涤偶联后的磁珠，然后加入磁珠封闭液封闭；
(E)使用洗涤缓冲液洗涤至少一次，每次洗涤10～60min，洗涤后置于含有BSA的缓冲液中保存。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了采用所述肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法制备得到的肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有所述肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法通过在肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠前先使用还原剂处理膜蛋白抗原，能够打开膜蛋白抗原中的二硫键，缓解由于存在二硫键导致的蛋白质分子发生凝集、沉淀和活性降低，从而缓解了肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠时因抗原沉淀、聚集从而影响包被效率的问题，在提高包被效率的同时，也提高了抗原包被后的稳定性，实现了热加速稳定性偏差不超过10％的技术效果。同时本发明提供的方法独特的适用于来源于天然肺炎支原体蛋白的肺炎支原体膜蛋白抗原，而不适用于包被重组抗原。
采用上述方法制备得到的肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠具有稳定性好的优点。并且该磁珠包被的抗原来自天然肺炎支原体蛋白，含有病原体天然的蛋白结构以及更多的抗原表位，能更好的被特异性抗体所识别，可以提高检测的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同还原剂处理Mp膜蛋白抗原后，Mp膜蛋白抗原偶联磁珠和不同样本结合后的信噪比；
图2为不同浓度还原剂处理Mp膜蛋白抗原后，Mp膜蛋白抗原偶联磁珠和不同样本结合后的信噪比；
图3为还原剂4℃处理不同时间的Mp膜蛋白抗原后，Mp膜蛋白抗原偶联磁珠和不同样本结合后的信噪比；
图4为还原剂37℃处理不同时间的Mp膜蛋白抗原后，Mp膜蛋白抗原偶联磁珠和不同样本结合后的信噪比；
图5为4℃环境中偶联不同时间得到的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠和不同样本结合后的信噪比；
图6为37℃环境中偶联不同时间得到的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠和不同样本结合后的信噪比。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法，该方法中磁珠包被的肺炎支原体膜蛋白抗原(或简称Mp膜蛋白抗原)为天然肺炎支原体蛋白，即Mp膜蛋白抗原分离自肺炎支原体，而非经基因工程改造的重组蛋白，或使用工程菌或工程细胞生产的蛋白。本发明提供的方法包括先使用还原剂处理Mp膜蛋白抗原，再将Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联。
在Mp膜蛋白抗原偶联磁珠前先使用还原剂处理Mp膜蛋白抗原，能够打开Mp膜蛋白抗原中的二硫键，缓解由于存在二硫键导致的蛋白质分子发生凝集、沉淀和活性降低，从而缓解了Mp膜蛋白抗原包被磁珠时因抗原沉淀、聚集从而影响包被效率的问题，在提高包被效率的同时，也提高了包被后的稳定性，实现了热加速稳定性偏差不超过10％的技术效果。
Mp膜蛋白抗原包被的磁珠优选包括甲苯磺酰基(Tosyl)磁珠，甲苯磺酰基磁珠是一种超顺磁预活化功能磁性微球，具有良好的分散性、极低的非特异性吸附和预活化的反应位点，具有长亲水性间隔臂以及温和的反应条件，适用于和生物活性大分子偶联。
可以理解的是，本发明提供的Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的方法除去在偶联前需要先使用还原剂处理Mp膜蛋白抗原外，其余工艺步骤、工艺参数和试剂选择可参考本领域可接受的常规操作方法，例如偶联、清洗和封闭等的工艺步骤和工艺参数，以及各步骤中的缓冲液、洗涤液和封闭液的选择，均可以参考本领域的常规方法，例如实验操作手册、试剂盒说明书或已公开文献的记载等。
在一些可选的实施方式中，本发明对Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法和工艺参数也进行了优化，以进一步提高Mp膜蛋白抗原包被磁珠的效率以及包被后磁珠的稳定性，使包被后的Mp膜蛋白抗原具有良好的特异性，能满足临床需要，并且过程简单易于操作和重复，优化的参数可选地包括如下几个方面：
在一些优选的实施方式中，所述还原剂包括二代苏硫醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦和半胱氨酸中的至少一种。通过实验发现，采用不同的还原剂制备得到的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫原性不同，其中分别以二代苏硫醇和三(2-羧乙基)膦作为还原剂制备得到的磁珠免疫原性更佳，而其中又以二代苏硫醇作为还原剂效果最佳，因此还原剂优选包括二代苏硫醇和/或三(2-羧乙基)膦，更优选包括二代苏硫醇。
在一些优选的实施方式中，还原剂处理Mp膜蛋白抗原的浓度为10～50mM，例如可以为但不限于为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM，优选为10～30mM，更优选为15mM。合适浓度范围的还原剂能打开二硫键并且不影响抗原的结构，防止蛋白质被氧化而失活。
在一些优选的实施方式中，还原剂处理Mp膜蛋白抗原的时间为5～120min，优选为5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min或120min。实验发现使用还原剂处理60～90min可以获得更好的免疫活性，其中以处理60min最优。
在一些优选的实施方式中，还原剂处理Mp膜蛋白抗原的温度为4～37℃，例如可以为但不限于为4℃、8℃、10℃、12℃、15℃、20℃、25℃、30℃、34℃或37℃，优选为4℃。由于还原剂容易被空气氧化，因此还原剂的稳定性较差，低温环境中还原利于保持还原剂的稳定。
在一些优选的实施方式中，Mp膜蛋白抗原与磁珠的偶联时间为1～10h，例如可以为但不限于为1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h。通过实验发现在较低的温度下偶联，Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫原活性随着偶联时间的延长而增加，在较高的温度下在较短的时间条件下偶联也可以获得较好的免疫原性，因此优选在较高的温度条件下偶联2～8h，更优选为2h，以提高效率。
在一些优选的实施方式中，Mp膜蛋白抗原与磁珠的偶联温度为4～37℃，例如可以为但不限于为4℃、8℃、10℃、12℃、15℃、20℃、25℃、30℃、34℃或37℃，优选为37℃。包被时的温度，影响包被的效率，37℃短时间包被效率高，并且不影响抗原的稳定性，因此优选37℃包被。
在一些优选的实施方式中，所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠偶联后，经封闭处理后至少洗涤一次，例如可以为但不限于为1次、2次、3次、4次或5次等，优选洗涤3次；每次洗涤时间为10～60min，例如可以为但不限于为10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。洗涤方式例如可以为但不限于为10min×3次，20min×3次，30min×3次或60min×3次，优选洗涤方式为30～60min×3次，更优选为30min×3次。提取的天然Mp膜蛋白抗原中蛋白含量丰富，含多种抗原成分，长时间的洗涤能减少蛋白的非特异性吸附，提高包被磁珠的稳定性。
在一些优选的实施方式中，肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的量为10～20μg/mg磁珠，例如可以为但不限于为10μg/mg磁珠、11μg/mg磁珠、12μg/mg磁珠、13μg/mg磁珠、14μg/mg磁珠、15μg/mg磁珠、16μg/mg磁珠、17μg/mg磁珠、18μg/mg磁珠、19μg/mg磁珠或20μg/mg磁珠。
在一些具体的实施方式中，以Mp膜蛋白抗原包被甲苯磺酰基磁珠为例，所述肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法包括如下步骤：
(A)使用终浓度为10～50mM的还原剂处理Mp膜蛋白抗原，处理温度为4～37℃，并在旋转混匀仪上混合5～120min；
(B)将步骤(A)混合后的溶液置于透析袋中，然后置于缓冲液中透析多次；
(C)将CB缓冲液、Mp膜蛋白抗原和洗涤后的甲苯磺酰基磁珠和硫酸铵混合，在4～37℃的条件下置于旋转混匀仪偶联1～10h；
(D)洗涤偶联后的磁珠，然后加入磁珠封闭液封闭；
(E)使用洗涤缓冲液洗涤至少一次，每次洗涤10～60min，洗涤后置于含有BSA的缓冲液中保存。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了采用所述肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法制备得到的肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠。采用上述方法制备得到的肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠具有稳定性好的优点。并且该磁珠包被的抗原来自天然肺炎支原体蛋白，含有病原体天然的蛋白结构以及更多的抗原表位，能更好的被特异性抗体所识别，可以提高检测的灵敏度。
可以理解的是本发明不限制肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠的检测方法，因此该磁珠上还可以进一步标记有用于检测的标记物，包括但不限于为发光基团、同位素、受体和其配体其中之一，抗原和其抗体其中之一，或者，酶和其底物其中之一。在一个具体的实施例中，该肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠可以作为化学发光磁珠，使用全自动化学发光酶免疫分析系统检测。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含所述肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠。所述试剂盒中还可以包含其他本领域可接受的常规试剂、耗材或检测仪器等，具体的实例包括但不限于缓冲液、对照品、用于标记肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠的标记物或用于检测标记物的成套试剂等。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实验材料：
甲苯磺酰基磁珠：JSR Life Sciences；
Mp膜蛋白抗原：Meridian Life Science；
Mp重组P30抗原：珠海丽禾医疗诊断产品有限公司；
Mp重组P1抗原：珠海丽禾医疗诊断产品有限公司；
Mp重组P116抗原：珠海丽禾医疗诊断产品有限公司。
实施例1
(a)先配置1M二代苏硫醇，pH7.4的磷酸缓冲液，50M CB缓冲液，1M硫酸铵，备用。
(b)Mp膜蛋白抗原中加入二代苏硫醇，使终浓度为15mM，置于4℃环境中，旋转混匀仪上以20rpm的转速旋转60min，使其混匀。
(c)将上述溶液装入处理后的透析袋中，袋口扎好后放入装有pH7.4的磷酸缓冲液的烧杯中透析，隔3小时更换新的缓冲液，重复3次。
(d)用1mL的磷酸缓冲液洗涤Tosyl磁珠三次后磁吸弃上清。
(e)加入200μL CB缓冲液、Mp膜蛋白抗原(15μg/mg Tosyl磁珠)和100μL硫酸铵，在37℃环境下，置于旋转混匀仪上以20rpm的转速旋转2小时，使抗原与磁珠偶联。
(f)用1mL的磷酸缓冲液洗涤磁珠三次后磁吸弃上清。
(g)加入磁珠封闭液，在37℃环境下，置于旋转混匀仪上以20rpm的转速旋转8小时。
(h)用含有Tween-20的tris缓冲液洗涤，洗涤时间为30min/次×3次。
(i)磁珠重悬在含BSA的tris缓冲液中，2-8℃保存。
实施例2
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于还原剂为三(2-羧乙基)膦。
实施例3
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于还原剂为β-巯基乙醇。
实施例4
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于还原剂为半胱氨酸。
实施例5
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇的终浓度为10mM。
实施例6
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇的终浓度为30mM。
实施例7
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇的终浓度为50mM。
实施例8
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的时间为5min。
实施例9
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的时间为30min。
实施例10
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的时间为90min。
实施例11
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的时间为120min。
实施例12
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的时间为5min，处理温度为37℃。
实施例13
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的时间为30min，处理温度为37℃。
实施例14
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的温度为37℃。
实施例15
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的时间为90min，处理温度为37℃。
实施例16
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(b)中二代苏硫醇处理Mp膜蛋白抗原的时间为120min，处理温度为37℃。
实施例17
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的时间为1小时，偶联温度为4℃。
实施例18
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联温度为4℃。
实施例19
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的时间为4小时，偶联温度为4℃。
实施例20
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的时间为8小时，偶联温度为4℃。
实施例21
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的时间为10小时，偶联温度为4℃。
实施例22
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的时间为1小时。
实施例23
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的时间为4小时。
实施例24
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的时间为8小时。
实施例25
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(e)中Mp膜蛋白抗原与磁珠偶联的时间为10小时。
实施例26
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(h)中的洗涤条件为10min×3次。
实施例27
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(h)中的洗涤条件为20min×3次。
实施例28
本实施例提供的Mp膜蛋白抗原包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于步骤(h)中的洗涤条件为60min×3次。
对比例1
本对比例按照CN103834668A公开的方法包被抗原，步骤如下：第一步，将Mp膜蛋白抗原放入超滤离心管中，加入pH6.5、15mM的MES，离心机2-8℃，5000g离心3次，回收抗原；第二步，洗涤磁珠，将2mg磁珠与40μg抗原在25℃环境，置于360°混匀仪上预混0.5h；第三步，加入摩尔比为1:2的EDC和NHS，在25℃环境，置于360°混匀仪上活化4h，EDC质量为20μg；第四步，用赖氨酸封闭，集磁去上清，得到磁珠包被抗原。
对比例2
本对比例按照CN110672837A公开的方法包被抗原，步骤如下：将CB缓冲液中加入终浓度为2‰的巯基乙醇、2‰SDS和1‰Tween 20，搅拌0.5h，之后重复实施例1(d)-(i)的步骤。
对比例3
本对比例提供的包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于包被的抗原为Mp重组P30抗原，包被的步骤与工艺参数均与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供的包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于包被的抗原为Mp重组P1抗原，包被的步骤与工艺参数均与实施例1相同。
对比例5
本对比例提供的包被磁珠的方法与实施例1的区别仅在于包被的抗原为Mp重组P116抗原，包被的步骤与工艺参数均与实施例1相同。
效果例1
包被磁珠分别进行4℃6天和37℃6天的热加速稳定性评价，应用富士全自动化学发光酶免疫分析系统(LUMIPULSE G1200)检测不同组的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性结果如表1。其中，1号样本为0.02M PBS，pH7.2溶液；2-6号样本为含不同浓度肺炎支原体特异性抗体的人血清样本，为本实验室收集。实验结果如表1所示：
表1.Mp膜蛋白抗原偶联磁珠在不同包被过程和保存条件下的免疫活性
Figure BDA0002516615730000151
RLU：相对光单位(relative light unit)，表征样品在富士全自动化学发光酶免疫分析系统中光产生量的相对测试值。
由表1可以看出，实施例1中的包被方法的磁珠热加速后的样本发光值下降比例最小，即经37℃6天后活性下降最少，稳定性最好。
效果例2
应用富士全自动化学发光酶免疫分析系统(LUMIPULSE G1200)检测实施例1～4的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性。样本编号对应的各样本同效果例1，实验结果如表2和图1所示：
表2.不同还原剂处理抗原时Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性
Figure BDA0002516615730000152
从表2和图1的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性可知，二代苏硫醇和三(2-羧乙基)膦处理后的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性更佳，其中以二代苏硫醇作为还原剂的实施例1制备得到的磁珠免疫活性最佳。
效果例3
应用富士全自动化学发光酶免疫分析系统(LUMIPULSE G1200)检测实施例1和实施例5～7的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性。样本编号对应的各样本同效果例1，实验结果如表3和图2所示：
表3.不同浓度还原剂的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠免疫活性
Figure BDA0002516615730000161
从表3和图2的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性可知，当还原剂浓度为10～30mM时Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性较好，RLU值找可达到200000，其中15mM缓冲液还原剂浓度最优，可使制备得到的磁珠获得最高的RLU值以及信噪比。
效果例4
应用富士全自动化学发光酶免疫分析系统(LUMIPULSE G1200)检测实施例1和实施例8～16的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性。样本编号对应的各样本同效果例1，实验结果如表4～5和图3～4所示：
表4.4℃处理不同时间的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠免疫活性
Figure BDA0002516615730000162
Figure BDA0002516615730000171
表5.37℃处理不同时间的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠免疫活性
Figure BDA0002516615730000172
由表4～5和图3～4的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性可知，使用还原剂处理Mp膜蛋白相同的时间，在4℃的处理条件下Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性更佳；而在相同的温度条件下，使用还原剂处理60～90min可以获得更好的免疫活性，其中以处理60min最优。结合不同温度下的对比，使用还原剂在4℃的条件下处理60min的技术效果最优。
同时通过对实施例1～实施例16的对比可以看出，使用15mM的二代苏硫醇在4℃环境中处理抗原60min的技术效果最优。
效果例5
应用富士全自动化学发光酶免疫分析系统(LUMIPULSE G1200)检测实施例1和实施例17～25的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性。样本编号对应的各样本同效果例1，实验结果如表6～7和图5～6所示：
表6 4℃环境中偶联不同时间的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠免疫活性
Figure BDA0002516615730000173
Figure BDA0002516615730000181
表7 37℃环境中偶联不同时间的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠免疫活性
Figure BDA0002516615730000182
从表6～7和图5～6的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性可知，将Mp膜蛋白和磁珠采用相同的时间偶联，在37℃的偶联条件下Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性更佳；在4℃的偶联条件下偶联时间越长Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫原活性越好，在37℃的偶联条件下，过长的偶联的时间会造成磁珠免疫原活性下降，37℃的偶联条件下偶联2～8h磁珠的免疫活性较好，其中偶联2h就可以取得很好的免疫原活性，因此Mp膜蛋白抗原和磁珠在37℃中偶联2小时最优。
效果例6
将包被后的磁珠在分别在4℃和37℃环境下放置6天，应用富士全自动化学发光酶免疫分析系统(LUMIPULSE G1200)检测实施例1和实施例26～28的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性及热稳定性。样本编号对应的各样本同效果例1，实验结果如表8所示：
表8.封闭后不同洗涤次数的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的稳定性
Figure BDA0002516615730000191
从表8Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性和热稳定性可知，封闭后使用含Tween-20的洗涤液以30min×3次的方式洗涤效果最佳。
效果例7
将包被后的磁珠在分别在4℃和37℃环境下放置6天，应用富士全自动化学发光酶免疫分析系统(LUMIPULSE G1200)检测对比例3～5的Mp膜蛋白抗原偶联磁珠的免疫活性及热稳定性。样本编号对应的各样本同效果例1，实验结果如表9所示：
表9.不同重组抗原包被Tosyl磁珠的抗原偶联磁珠的稳定性
Figure BDA0002516615730000192
由抗原偶联磁珠的免疫活性和热稳定性可知，该包被方法用于Mp重组P30抗原、Mp重组P1抗原和Mp重组P116抗原包被Tosyl磁珠时，反应性和稳定性均不好，说明本包被方法具有专用性和独特性，只适用于包被来源于天然肺炎支原体蛋白的Mp膜蛋白抗原。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法，其特征在于，所述肺炎支原体膜蛋白抗原为天然肺炎支原体蛋白；
所述方法包括先使用还原剂处理所述肺炎支原体膜蛋白抗原，再将所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠偶联。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原剂包括二代苏硫醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦和半胱氨酸中的至少一种；
优选地，所述还原剂包括二代苏硫醇和/或三(2-羧乙基)膦；
优选地，所述还原剂包括二代苏硫醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原剂的浓度为10～50mM，优选为10～30mM，更优选为15mM；
优选地，所述还原剂的处理时间为5～120min，优选为60～90min，更优选为60min；
优选地，所述还原剂的处理温度为4～37℃，优选为4℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠包括甲苯磺酰基磁珠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠的偶联时间为1～10h，优选为2～8h，更优选为2h；
优选地，所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠的偶联温度为4～37℃，更优选为37℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺炎支原体膜蛋白抗原与磁珠偶联后，经封闭处理后至少洗涤一次，每次洗涤时间为10～60min；
优选地，洗涤次数为3次；
优选地，每次洗涤时间为30～60min，共洗涤3次；
更优选地，每次洗涤时间为30min，共洗涤3次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的量为10～20μg/mg磁珠。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述肺炎支原体膜蛋白抗原偶联的磁珠为甲苯磺酰基磁珠，所述方法包括如下步骤：
(A)使用终浓度为10～50mM的还原剂处理所述肺炎支原体膜蛋白抗原，处理温度为4～37℃，并在旋转混匀仪上混合5～120min；
(B)将步骤(A)混合后的溶液置于透析袋中，然后置于缓冲液中透析多次；
(C)将CB缓冲液、所述肺炎支原体膜蛋白抗原、洗涤后的甲苯磺酰基磁珠和硫酸铵混合，在4～37℃的条件下置于旋转混匀仪偶联1～10h；
(D)洗涤偶联后的磁珠，然后加入磁珠封闭液封闭；
(E)使用洗涤缓冲液洗涤至少一次，每次洗涤10～60min，洗涤后置于含有BSA的缓冲液中保存。
9.采用权利要求1-8任一项所述的肺炎支原体膜蛋白抗原包被磁珠的方法制备得到的肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠。
10.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求9所述的肺炎支原体膜蛋白抗原偶联磁珠。
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