JP2003164300A - 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法 - Google Patents

多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法

Info

Publication number
JP2003164300A
JP2003164300A JP2002300040A JP2002300040A JP2003164300A JP 2003164300 A JP2003164300 A JP 2003164300A JP 2002300040 A JP2002300040 A JP 2002300040A JP 2002300040 A JP2002300040 A JP 2002300040A JP 2003164300 A JP2003164300 A JP 2003164300A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
pkd
nucleic acid
primer
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2002300040A
Other languages
English (en)
Inventor
George Jones Jeffrey
ジェフリー・ジョージ・ジョーンズ
A Garces Jorge
ホルヘ・ア・ガルセス
Wan Jin
ジン・ワン
A Callan John
ジョン・エイ・カラン
Kimberly Allen Susan
スーザン・キンバリー・アレン
Ellen Flynn Kelly
ケリー・エレン・フリン
Noel Hennigan Aidan
エイダン・ノエル・ヘニガン
Normand J Robichaud
ノーマンド・ジェイ・ロビショード
M Paratoucchi Christopher
クリストファー・エム・パラトゥッチ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Athena Diagnostics Inc
Original Assignee
Athena Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Athena Diagnostics Inc filed Critical Athena Diagnostics Inc
Publication of JP2003164300A publication Critical patent/JP2003164300A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 常染色体優性多発性嚢胞腎に関連する遺伝子
の変化またはこのような変化の非存在を同定するための
遺伝子試験方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、DHPLCを使用したPKD
遺伝子変異の検出法に関する。本発明は、以下の態様を
含む。PKD固有部位の同定;PKD特異的プライマー
のデザイン;PKD特異的産物の増幅;およびDHPL
CによるPCR増幅産物の分析。本発明は、さらに、同
定した固有の部位およびPKD特異的プライマーなどの
組成物ならびに本発明の方法を実施するためのキットに
関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、常染色体優性多発
性嚢胞腎に関連する遺伝子の変化またはこのような変化
が存在しないことを同定するための遺伝子試験方法に関
する。
【0002】
【従来の技術】常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPK
D)は、800人の生産児あたり約1人発症する非常に
一般的な遺伝性腎疾患である。この疾患は、進行性で、
多発性嚢胞腎の両側への拡大によって特徴付けられ、典
型的には65歳で末期腎疾患(ESRD)となる。より
一般的な合併症には、高血圧、肉眼的血尿、尿管感染
症、心臓弁の異常、および前腹壁ヘルニアが含まれる。
嚢胞形成は一般的に肝臓でも認められるが、発症は器官
の機能障害に関連していない。あまり報告されていない
が、さらなる腎外発現には、膵嚢胞症、結合組織異常、
および大脳動脈瘤が含まれる。
【0003】典型的な発症年齢は中年であるが、年齢層
は新生児から80歳までである。ADPKDの臨床的兆
候は、家族間および家族内で異なり、この障害の遺伝学
的に異なる性質によって部分的に説明される。ほとんど
全てのADPKDの症例で2つの遺伝子PKD−1およ
びPKD−2の変異が認められる(例えば、概説につい
ては、Arnaout、2001、Annu Rev.
Med.,52,93〜123;Koptides a
nd Deltas、2000、Hum.Gene
t.、107、115〜126を参照のこと)。PKD
−1およびPKD−2は、機能が完全に解明されていな
い内在性膜タンパク質をコードする。ADPKDを担う
主要遺伝子PKD−1は完全に特徴付けられており、細
胞−細胞および細胞−基質相互作用に関連すると考えら
れる内在性膜タンパク質ポリシスチン1をコードするこ
とが示されている。PKD−2遺伝子は、非選択性陽イ
オンチャネル活性を有すると予想される内在性膜タンパ
ク質であるポリシスチン2をコードする。電位活性化カ
ルシウムチャネルのα1サブユニット成分との配列相同
性に基づいて、ポリシスチン2は、イオンチャネリング
の役割を果たし得ると仮定されている。インビトロ結合
アッセイおよび指向性(directed)2ハイブリ
ッド相互作用を使用して、ポリシスチン1およびポリシ
スチン2のC末端細胞質テールは相互作用することが認
められている。PKD−1中のコイルドコイルドメイン
およびPKD−2中のR872付近の領域を介して相互
作用が生じる。ポリシスチン間の相互作用の生物学的関
連性は未だ理解されていないにもかかわらず、PKD−
1およびPKD−2はおそらく共通の経路に沿って機能
すると示唆されている。
【0004】ADPKD1型および2型は、腎臓および
腎外の全発症範囲を共有するが、2型は1型と比較して
発症が遅延するようである。高血圧、血尿、および尿管
感染を含むADPKDで認められる共通の表現型合併症
は、2型患者で臨床的に軽度なようである。死またはE
SRD発症年齢の中央値は、PKD−1を有する個体で
53歳であり、PKD−2を有する個体で69歳と報告
されている。女性は、男性(67歳)より有意に長い生
存期間の中央値(71歳)であると報告されている。P
KD−1では性別の影響は明確ではない。PKD−1遺
伝子の変異は、試験した症例の約85%でADPKDの
病因であり、PKD−2では15%である。ADPKD
家族の部分集合が小さいのでPKD−1またはPKD−
2のいずれかとの遺伝的関連を証明することができない
にもかかわらず、ADPKDの第3の遺伝子の可能性が
生じ、第3の疾患関連遺伝子座の存在が厳密に調査され
ている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】PKD遺伝子の変化と
ADPKDの発症との間の強力な関連性が発見されたに
もかかわらず、日常的な臨床用のADPKD疾病素質に
ついての遺伝子試験法の開発は、いくつかの技術的障害
によって妨げられている。
【0006】ADPKDについてのDNAベースの試験
法の開発における1つの深刻な障害は、PKD転写物に
関連する配列(例えば、PKD−1)は、PKD−1遺
伝子座に隣接する第16染色体上で少なくとも3回重複
されてPKD−1ホモログを形成することである。別の
障害は、PKD−1ゲノム区間もまた他のゲノム領域中
に存在する繰り返しエレメントを含むことである。さら
に、PKD遺伝子の配列は、非常にGCリッチであり、
完全な進化について多数のヌクレオチド(15,816
bp)を分析する必要がある。
【0007】発現したPKD遺伝子に固有であり、重複
した相同配列中に存在しないこれらの配列のセグメント
の同定が必要である。PKD遺伝子の変異分析用の感度
が高く且つ特異的な遺伝子試験の開発も必要である。こ
のような試験法の開発により、ADPKDの診断および
管理が容易になる。
【0008】1つの態様では、本発明は、標的核酸の変
異分析法であって、前記方法は、反応混合物中で前記標
的核酸を含むサンプルを少なくとも1つの第1の核酸お
よび少なくとも1つの第2の核酸の存在下でインキュベ
ートするステップであって、前記第1の核酸は配列番号
1または2の配列の固有の部位にアニーリングするプラ
イマー配列を含み、前記第2の核酸は前記第1の核酸と
逆方向であり、前記インキュベーションにより増幅産物
が産生され、前記増幅産物中で二重鎖を作製するステッ
プと、前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出する
ステップとを含み、前記ヘテロ二重鎖の存在は前記標的
核酸中の潜在的な変異の存在を示し、前記へテロ二重鎖
の非存在は前記標的核酸中の変異の非存在を示す方法を
提供する。
【0009】1つの実施形態では、本方法は、ヘテロ二
重鎖領域の配列を決定するステップと、前記ヘテロ二重
鎖領域の配列と配列番号1または2とを比較するステッ
プとをさらに含み、前記標的核酸によってコードされる
タンパク質の機能変化が予想される配列番号1または2
と比較した前記ヘテロ二重鎖領域の配列の相違は前記標
的核酸の変異の指標となる。
【0010】好ましくは、第1または第2の核酸は、配
列番号3〜49からなる群から選択される配列を含む。
【0011】別の実施形態では、本方法は、テンプレー
トとして前記第1および第2の核酸によって作製された
前記増幅産物を使用してネスト化(nested)増幅
反応を行う工程と、前記ネスト化増幅由来の増幅産物中
で二重鎖を作製する工程とをさらに含む。
【0012】好ましくは、ネスト化増幅反応を、配列番
号3〜49およびその相補配列からなる群から選択され
る少なくとも1つのプライマーを使用して行う。
【0013】好ましい実施形態では、二重鎖由来のヘテ
ロ二重鎖の有無をDHPLCによって同定する。
【0014】好ましい実施形態では、ヘテロ二重鎖領域
の配列をDNA配列決定によって決定する。好ましく
は、本発明の方法の第2の核酸は配列番号1または2の
配列内の固有の部位にアニーリングするプライマー配列
を含む。
【0015】好ましくは、標的テンプレートを含むサン
プルは、ゲノムDNA、cDNA、全RNA、mRN
A、および細胞サンプルからなる群から選択される。
【0016】1つの実施形態では、インキュベーション
工程は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応(L
CR)、および核酸特異性ベースの増幅からなる群から
選択される増幅反応を含む。
【0017】本発明の方法は、1つまたは複数の制限酵
素を使用して増幅産物がPKD特異的産物であるかを確
認する工程をさらに含み得る。
【0018】好ましくは、制限酵素は、PKD特異的産
物を切断してPKDホモログ産物と区別可能な消化パタ
ーンが得られる。
【0019】より好ましくは、制限酵素は、PstI、
StuI、XmaI、MluI、PvuII、BssH
II、FspI、MscI、およびBlnIからなる群
から選択される。
【0020】別の態様では、本発明は、PKD罹患患者
を同定するための診断法であって、前記方法は、(a)
個体からサンプルを得るステップと、(b)反応混合物
中で前記サンプルを少なくとも1つの第1の核酸および
少なくとも1つの第2の核酸の存在下でインキュベート
するステップであって、前記第1の核酸は配列番号1ま
たは2中の固有の部位にアニーリングするプライマー配
列を含み、前記第2の核酸は前記第1の核酸と逆方向で
あり、前記インキュベーションにより増幅産物が産生さ
れ、(c)前記増幅産物中で二重鎖を作製するステップ
と、(d)前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出
するステップと、(e)前記ヘテロ二重鎖領域の配列を
決定するステップとを含み、配列番号1または2と比較
した前記ヘテロ二重鎖領域の存在は、前記個体がPKD
を罹患していることを示す方法を提供する。
【0021】好ましくは、ヘテロ二重鎖の検出をDHP
LCによって行う。
【0022】好ましくは、配列をDNA配列決定によっ
て決定する。
【0023】1つの実施形態では、第2の核酸が配列番
号1または2の配列中の固有の部位にアニーリングする
プライマー配列を含む。
【0024】別の実施形態では、第1または第2の核酸
が配列番号3〜49からなる群から選択されるプライマ
ー配列を含む。
【0025】本発明の診断法は、テンプレートとして前
記第1および第2の核酸によって作製された前記増幅産
物を使用してネスト化増幅反応を行うステップと、前記
ネスト化増幅由来の二重鎖を作製するステップとをさら
に含み得る。
【0026】1つの実施形態では、ネスト化増幅反応
を、配列番号3〜49およびその相補配列からなる群か
ら選択される少なくとも1つのプライマーを使用して行
う。
【0027】好ましくは、診断法におけるサンプルは、
ゲノムDNA、cDNA、全RNA、mRNA、および
細胞からなる群から選択される。
【0028】好ましくは、増幅反応は、ポリメラーゼ連
鎖反応、リガーゼ連鎖反応(LCR)、および核酸特異
性ベースの増幅からなる群から選択される増幅反応を含
む。
【0029】診断方法は、特異的に増幅した産物を1つ
または複数の制限酵素を使用して実証するステップをさ
らに含み得る。
【0030】好ましくは、制限酵素は、PKD特異的産
物を切断してPKDホモログ産物と区別可能な消化パタ
ーンが得られる。
【0031】より好ましくは、制限酵素は、PstI、
StuI、XmaI、MluI、PvuII、BssH
II、FspI、MscI、およびBlnIからなる群
から選択される。
【0032】さらなる態様では、本発明は、各プライマ
ーが配列番号3〜49またはその相補物からなる群から
選択される単離核酸である、1つまたは複数の核酸プラ
イマーを提供する。
【0033】本発明はまた、対の少なくとも1つの核酸
が配列番号3〜49〜なる群から選択される、核酸対を
提供する。
【0034】好ましくは、核酸対は逆方向であり、配列
番号1または2の配列を含むテンプレート核酸のフラグ
メントを増幅する。
【0035】別の態様では、本発明は、第1の核酸が配
列番号3〜49およびその相補的配列からなる群から選
択され、第2の鎖が第1の核酸と逆方向であり、第1お
よび第2の核酸は配列番号1または2の配列を含むテン
プレート核酸のフラグメントを増幅する、少なくとも1
つの単離した第1の核酸および少なくとも1つの単離し
た第2の核酸を含む組成物を提供する。
【0036】1つの実施形態では、本発明の成分は、D
NAポリメラーゼ、テンプレート核酸、制限酵素、1つ
または複数のコントロールオリゴヌクレオチドプライマ
ー、ddNTP、PCR反応緩衝液、およびその組み合
わせからなる群から選択される少なくとも1つの成分を
さらに含む。
【0037】好ましくは、組成物中のテンプレート核酸
は、ゲノムDNAまたはcDNAである。
【0038】さらなる態様では、本発明は、第1の核酸
が配列番号1〜49およびその相補的配列からなる群か
ら選択され、第2の鎖が第1の核酸と逆方向であり、第
1および第2の核酸は配列番号1または2の配列を含む
テンプレート核酸のフラグメントを増幅する、少なくと
も1つの単離した第1の核酸および少なくとも1つの単
離した第2の核酸、ならびにその封入材料を含む、PK
D患者を同定するためのキットを提供する。
【0039】1つの実施形態では、本発明のキットは、
DNAポリメラーゼ、テンプレート核酸、制限酵素、コ
ントロールオリゴヌクレオチドプライマー、ddNT
P、PCR反応緩衝液、およびその組み合わせからなる
群から選択される少なくとも1つの成分をさらに含む。
【0040】好ましくは、キット中のテンプレート核酸
は、ゲノムDNAまたはcDNA分子である。
【0041】本発明の目的および特徴は、以下の詳細な
説明および添付の図面を参照してさらに理解することが
できる。
【0042】
【発明の実施の形態】本発明は、PKD遺伝子内の固有
の部位の同定、PKD特異的プライマーのデザイン、お
よびこれらのPKD特異的プライマーの使用によって増
幅されたPCR産物のDHPLC分析に基づく。
【0043】I.定義 本明細書中で使用される、「ADPKD」は、常染色体
優性多発性嚢胞腎をいう。ADPKDは、非常に一般的
な遺伝性腎疾患であり、腎嚢胞、最終的には腎不全の発
症で特徴付けられ、あるいは、またはそれに加えて肝臓
および腎臓を含む他の器官中の嚢胞ならびに胃腸、心血
管、および骨格筋の異常を含み得る。
【0044】用語「PKD遺伝子」は、染色体部位16
p13.3(すなわち、PKD−1)または染色体部位
4q21−23(すなわち、PKD−2)にマッピング
されるゲノムDNA配列をいい、PKDタンパク質をコ
ードする伝令RNA分子が得られる。PKD−1および
PKD−2遺伝子は、イントロンおよび推定調節配列を
含む配列番号1および配列番号2の配列をそれぞれ含
む。多数の他の遺伝子と同様に、PKD−1およびPK
D−2遺伝子配列は、個体間で比較した場合、配列のば
らつきを示す。サイレントである(すなわち、遺伝子産
物の遺伝子発現または機能に関して)多型を有するこれ
らの遺伝子は、本明細書中では「正常」と定義する。
【0045】「正常な」PKD遺伝子(例えば、PKD
−1またはPKD−2)は、本明細書中ではPKD遺伝
子(配列番号1または2に記載のものなど)と定義し、
サイレント多型を有する任意の遺伝子が含まれる。
【0046】「変異」PKD遺伝子は、本明細書中で
は、その配列が1つまたは複数の置換(トランジショ
ン、トランスバージョン)、欠失(遺伝子座の欠損を含
む)、挿入(重複を含む)、転座、および/または正常
なPKD遺伝子と比較した他の改変を含む変異で改変さ
れているPKD遺伝子(例えば、PKD−1またはPK
D−2)と定義する。変異により、PKD遺伝子産物の
発現または機能が検出可能に変化し、ADPKDの原因
である。変異は、1つから数千個ものヌクレオチドを含
み、それにより、1つまたは複数の種々のPKD発現の
変化(例えば、発現速度の減少または増加)または欠損
RNA転写物またはタンパク質産物の発現が得られる。
変異体PKD遺伝子には、ヒト個体のゲノム中の1つま
たは複数のコピーの存在がADPKDに関連する遺伝子
が含まれる。
【0047】用語「塩基対ミスマッチ」は、配列番号1
または2の配列に相補的ではない任意の核酸配列をい
う。したがって、本発明の塩基対ミスマッチは、正常な
PKD遺伝子の変化もしくは多型または変異PKD遺伝
子中に存在する任意の改変によって生じ得る。「塩基対
ミスマッチ」は、1つのヌクレオチド塩基対ミスマッチ
または2つまたはそれ以上のヌクレオチド(すなわち、
3、4、5、10、20、100、もしくは500以
上、または1000ヌクレオチドまで)の核酸配列を含
み得る。本明細書中で定義のミスマッチの有無は、標的
核酸中の潜在的変異の有無を示す。
【0048】本明細書中で使用される、用語「真の」
は、配列番号1または2のゲノム配列およびこれら由来
の配列を示し、これらの真の配列は「PKDホモログ」
を区別するために使用する(以下を参照のこと)。
【0049】「PKD−1ホモログ」は、PKD−1と
密接に関連しているが、発現したPKD−1遺伝子産物
をコードしない配列である。染色体部位16p13.1
または4q21−23にマッピングされるこのホモログ
のいくつかの例を同定および配列決定した。PKD−1
ホモログは、真のPKD遺伝子と95%を超えて同一の
配列を共有し得る。
【0050】本明細書中で使用される、用語「特異的に
増幅された産物」は、真のPKD遺伝子(例えば、配列
番号1または2)内のフラグメントから増幅されるがP
KDホモログから増幅されない産物である。「非特異的
に増幅された産物」は、増幅反応において完全に相補的
ではないテンプレート配列への核酸プライマーのアニー
リングによるPKDホモログまたは他の配列から増幅さ
れた産物である。
【0051】本明細書中で使用される、「固有の部位」
は、PKDホモログ配列または他の配列中のストレッチ
と異なる少なくとも1つのヌクレオチドを含むPKD遺
伝子中の10〜50塩基対長のストレッチをいう。固有
部位の1つの例は、5’AGGTCCAGGGCGAC
TCGCTGG3’または5’CAGGGCCACAC
GCGCTGGGCG3’またはその相補的配列を含
む。
【0052】本明細書中で使用される、「PKD特異的
プライマー」は、特異的なストリンジェンシー条件下で
PKD遺伝子(イントロンおよびエクソンを含む)中の
配列にアニーリングする核酸配列をいう。本発明のPK
D特異的プライマーは、特異的なストリージェンシー条
件下で真の発現PKD−1遺伝子またはPKD−2遺伝
子中に存在する固有の部位にアニーリングするが、PK
Dホモログまたは他の配列にはアニーリングしない。P
KD特異的プライマーは、PKD遺伝子内の固有の部位
と95%を超える(例えば、96%、96%、97%、
98%、99%を超えるか100%)配列が同一であ
る。「PKD特異的プライマー」は、10〜60ヌクレ
オチド長(例えば、18〜52ヌクレオチド長)であり
得る。
【0053】本明細書中で使用される、用語「特異的ス
トリンジェンシー条件」は、PKD特異的プライマーが
PKD遺伝子内の配列に特異的にアニーリングする増幅
条件をいう。「特異的ストリンジェンシー条件」下で
は、PKD特異的プライマーは、PKDホモログまたは
他の配列にアニーリングしない。例えば、本発明に有用
な1つの特異的ストリンジェンシー条件は、Taq P
recision緩衝液(TaqPlus Preci
sion緩衝液、Stratagene、LaJoll
a、カタログ番号600210)、50nMを超えるd
NTP濃度(例えば、100nM、200nM、または
300nM)を含む。特異的ストリンジェンシー条件に
おけるアニーリング温度は、最も低いプライマーアニー
リング温度(Tm)である5℃を超えても5℃未満でも
5℃でもよい(例えば、Tmよりも1℃、2℃、4℃、
5℃、または10℃高いかTmよりも4℃、3℃、2
℃、または1℃低い)。
【0054】本明細書中で使用される、DNAの「増
幅」は、DNA配列内の特定のDNA配列濃度を増加さ
せるために使用される反応をいう。ポリメラーゼ連鎖反
応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸特異
性ベースの増幅(NSBA)、または当該分野で公知の
任意の他の方法を使用して増幅を行うことができる。
【0055】本明細書中で使用される、「RT−PC
R」は、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応との組み合わせ
をいう。この増幅法は、特異的オリゴヌクレオチド、オ
リゴdTまたはランダムプライマーの混合物を使用して
RNAの一本鎖cDNAへの逆転写を惹起する最初のス
テップを使用し、このcDNAを標準的な増幅技術(例
えば、PCR)を使用して増幅する。
【0056】「テンプレート核酸」または「標的核酸」
(例えば、ゲノムDNAまたはcDNA)は、特定の配
列(例えば、PKD−1またはPKD−2遺伝子配列)
であるかこれを含む正常(例えば、野生型)または変異
核酸である。日常的な組換えDNA操作の一部としてさ
らなるヌクレオチドを開示の配列の5’および/または
3’末端に添加することができることが理解される。さ
らに、保存的DNA置換(すなわち、コードされるアミ
ノ酸配列を変化させないタンパク質コード領域の配列変
化)もまた適合し得る。
【0057】本明細書中で使用される、「核酸プライマ
ー」は、核酸テンプレートをアニーリングして核酸テン
プレートと相補的な伸長産物を産生するための3’末端
を得ることができるDNAまたはRNAをいう。核酸テ
ンプレートは、標的核酸テンプレートに相補的なプライ
マー伸長産物を産生するように触媒する。開始および伸
長条件には、4つの異なるデオキシリボヌクレオシドお
よび重合誘導剤(DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素
など)、適切な緩衝液(「緩衝液」には、pH、イオン
強度などに影響を与える補因子が含まれる)、および適
切な温度が含まれる。本発明のプライマーは、一本鎖で
あても二本鎖であっても良い。プライマーは、最大の増
幅効率のためには一本鎖出あり、プライマーおよびその
相補物は二本鎖核酸を形成する。しかしそれは二本鎖で
あり得る。本発明で有用な「プライマー」は、100ヌ
クレオチド長以下である(例えば、90、80、70、
60、50、40、30、20、もしくは15ヌクレオ
チド長以下、または10ヌクレオチド長)。
【0058】本明細書中で使用される、用語「逆方向」
は、プライマーをいう場合、一方のプライマーが標的核
酸テンプレートのセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列
を含み、他方のプライマーが同一の標的核酸テンプレー
トのアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む
ことを意味する。逆方向プライマーは、相補的な適合核
酸テンプレートからPCR増幅産物を作製することがで
きる。方向の異なる2つのプライマーを、逆方向プライ
マーおよび正方向プライマーということができる。
【0059】本明細書中で使用される、用語「同一の方
向」は、プライマーが標的核酸テンプレートの同一の鎖
に相補的なヌクレオチド配列を含むことを意味する。同
一方向のプライマーでは相補的な適合核酸テンプレート
からPCR増幅産物を作製されない。
【0060】あるいは、本発明のプライマーを、検出可
能な標識(放射性部分または蛍光標識など)で標識する
ことができるか、増幅反応により標識ヌクレオチドを反
応産物に組み込むことができる。したがって、増幅反応
産物を、蛍光または放射性標識での「検出」によって
「検出」することができる。
【0061】本明細書中で使用される、用語「核酸」
は、一般に、非改変RNAもしくはDNAまたは改変R
NAもしくはDNAであり得るポリリボヌクレオチドま
たはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「核酸」に
は、一本鎖および二本鎖核酸が含まれるが、これらに限
定されない。本明細書中で使用される用語「核酸」に
は、1つまたは複数の改変塩基を含む上記のDNAまた
はRNAも含まれる。したがって、安定性または他の理
由のために改変された骨格を有するDNAまたはRNA
は、「核酸」である。本明細書中で使用される、用語
「核酸」には、核酸のこのような化学的、酵素的、また
は代謝的改変形態ならびにウイルスおよび細胞(例え
ば、単純および複雑な細胞を含む)に特徴的な化学的D
NAおよびRNA形態が含まれる。
【0062】本明細書中で使用される、「単離」または
「精製」は、核酸に関して使用する場合、正常な細胞
(例えば、染色体)環境から天然に存在する配列が除去
されているか、非天然の条件下(例えば、人為的に合成
する)で合成されることを意味する。したがって、「単
離」または「精製」配列は、無細胞溶液中に存在するか
異なる細胞環境下で存在し得る。用語「精製」は、ヌク
レオチドのみが存在する配列であることを意図せず、こ
の配列に天然に関連する非ヌクレオチドまたは核酸物質
を本質的に含まず(約90〜95%、99〜100%ま
で)、単離染色体と区別されることを意図する。
【0063】本明細書中で使用される、「ゲノムDN
A」は、RNA転写物からコピーされた相補的DNAに
対するものとしての染色体DNAをいう。本明細書中で
使用される、「ゲノムDNA」は、1つの細胞中に存在
する全てのDNAであっても1つの細胞中のDNAの一
部であってもよい。
【0064】本明細書中で使用される、「相補的」は、
核酸(またはその一部)の一本鎖の逆平行核酸一本鎖の
ヌクレオチド(すなわち、任意の非対合ヌクレオチドに
よって妨害されない)間の連続する塩基対合によって逆
方向核酸鎖(またはその一部)にハイブリッド結合して
相補鎖間に二本鎖核酸を形成する能力をいう。第1の各
核酸が第2の核酸の相補的領域内のヌクレオチドと塩基
対合を形成する場合、第1の核酸は第2の核酸に「相補
的」であるという。第1の核酸の一方のヌクレオチドが
第2の核酸中の対応するヌクレオチドと塩基対を形成し
ない場合、第1の核酸は第2の核酸に完全に相補的では
ない。
【0065】本明細書中で使用される、「サンプル」
は、天然の環境から単離され、標的核酸を含み、精製も
しくは単離核酸からなり得る生体物質をいうか、標的核
酸を含む組織サンプル、生体流動物サンプル、または細
胞サンプルなどの生体サンプルを含み得る。
【0066】本明細書中で使用される、「二本鎖DN
A」は、「二重鎖」ともいう。一方の鎖の塩基配列が他
方の鎖の塩基配列に完全相補的である場合、二重鎖を
「ホモ二重鎖」と呼ぶ。二重鎖が相補的ではない少なく
とも1つの塩基対を含む場合、二重鎖を「ヘテロ二重
鎖」と呼ぶ。本発明では、個体から採取したサンプル由
来の増幅産物を変性および再アニーリングした場合、ヘ
テロ二重鎖の形成は、この個体中の潜在的な変異PKD
遺伝子の存在を示す。
【0067】本明細書中で使用される、「DHPLC」
は、同一のbp長を有するヘテロ二重鎖(変異の存在に
起因する)およびホモ二重鎖の分離によって配列変異を
検出するために使用される「変性高速液体クロマトグラ
フィー」と呼ばれる分離プロセスをいう。この分離は、
ヘテロ二重鎖がホモ二重鎖よりも低い融解温度(Tm)
を有するという事実に基づく。DHPLCは、一定の条
件下で1つの塩基対しか異ならないヘテロ二重鎖を分離
することができる。DHPLCを使用して、異なるbp
長の二重鎖を分離することもできる。
【0068】「ヘテロ二重鎖部位分離温度」、「温度中
心点」、または「Tm」を、本明細書中では、1つまた
は複数の塩基対がヘテロ二重鎖DNAフラグメント中の
塩基対ミスマッチ部位で変性される(すなわち、分離す
る)温度を意味すると定義する。
【0069】II.PKD遺伝子の一般的説明 PKD−1遺伝子(例えば、genBankアクセッシ
ョン番号L398891、配列番号1)は、第16染色
体(16p13.3)上に存在する約54kbのゲノム
DNAであり、14kb mRNAが転写される46個
のエクソンで分割された12,906bpのコード配列
を含む(Mochizukiら、1996、Scien
ce、272、1339〜1342;Hughesら、
1995、Nature Genet.、10、151
〜160)。PKD−1のタンパク質産物ポリシスチン
1は、推定分子量が460kDaの4303個のアミノ
酸からなるタンパク質である。最近まで、第16染色体
(16p13.1)に沿ってPKD−1に隣接してマッ
ピングされる少なくとも3つの相同性の高い遺伝子コピ
ーの存在により、PKD−1遺伝子の分析に影響を受け
なかった。約75%のPKD−1遺伝子が重複してお
り、その相同性コピーと約97%同一である。整復領域
は、第1の33エクソンを含む遺伝子の50kb
(5’)部分を含む。エクソン34〜46を含む遺伝子
のほとんどの3’(5.7kb)のみが、PKD−1に
固有である。PKD−1遺伝子の別の顕著な特徴は、
2.5kb長(ヒトゲノム中で最長)であるイントロン
21中のポリピリミジン領域である。PKD−2遺伝子
(例えば、genbankアクセッション番号AF00
4859−004873、配列番号2)は68kbのゲ
ノムDNAであり、第4染色体(4q21−23)上に
存在する(Mochizukiら、1996、前出)。
PKD−2は15個のエクソンを含み、約110kDa
の968アミノ酸タンパク質産物が作製される5.4k
bの転写物をコードする。PKD−2が1コピーの遺伝
子であるので、PKD−2の変異分析は、PKD−1の
変異分析よりも非常に容易である。PKD遺伝子および
そのタンパク質産物をまとめた表1を参照のこと。
【0070】
【表1】
【0071】正常な対立遺伝子上の体細胞変異の発生を
支持する証拠に基づいて、多数の家族性癌素因症候群の
病因に類似のツーヒットモデルにより、疾患の臨床的な
病巣発現が説明されている(Qianら、1996、C
ell、87、979〜987;Watnickら、1
998、Mol.Cell.、2、247〜251)。
簡単に述べれば、このモデルにより、ADPKDは細胞
レベルで劣性であり、第2の体細胞性変異またはヘテロ
接合PKD欠損バックグラウンドにおける「ヒット」に
より罹患尿細管上皮細胞におけるPKD機能がホモ接合
的に喪失することが示唆される。PKD機能喪失は、固
有細胞分裂に必要なシグナル伝達機構を崩壊する(すな
わち、嚢胞構造での罹患細胞の異常増殖を誘導する)と
仮定される。
【0072】PKD−1遺伝子の直接配列決定により、
正常な個体における多型の存在およびADPKD罹患個
体における多数の異なる配列変化が明らかとなった。表
2は、現在までの文献中に記載のPKD−1配列変化の
概要を示す。
【0073】
【表2】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【表2(つづき)】
【0074】III.PKD遺伝子中の固有部位の同定 70%のPKD−1遺伝子がPKD−1と95%を超え
る配列が同一の非機能的ホモログとして複製されるとい
う事実により、PKD−1固有部位の同定は、遺伝子試
験法の開発に重要である。ヒトゲノム配列解読の成功に
より、PKD遺伝子中の固有の部位を、PKD遺伝子を
含むゲノムDNA配列とPKDホモログを含むゲノムD
NA配列との比較によって同定することができる。有用
なデータベースおよびコンピュータプログラムは当該分
野で公知である(例えば、www.ncbi.nlm.
nih.govのNCBIで利用可能なデータベースお
よびhttp://www.ncbi.nlm.ni
h.gov/BLASTおよびDNAStar、ww
w.dnastar.comで利用可能なコンピュータ
プログラム)。固有部位は、PKDホモログまたは他の
配列と80%以下(例えば、70%、60%、50%、
40%、30%、20%、または10%以下)同一であ
るPKD遺伝子中の配列をいう。
【0075】いくつかの固有部位(例えば、1コピー部
位)は、Rossettiら、2000、A.J.Hu
m.Genet.、68、46〜63(その全体が本明
細書中で参考として援用される)に記載されている。本
出願の出願人は、PKD−1の新規の固有部位(5’A
GGTCCAGGGCGACTCGCTGG3’または
5’CAGGGCCACACGCGCTGGGCG3’
またはその相補的配列)を同定している。他の固有部位
は、例えば、米国特許第6,228,591号および同
第6,031,088号(それぞれ、参照することによ
りその全体を本明細書中に組み込むものとする)に見出
すことができる。
【0076】同定された固有部位を、真のPKD遺伝子
増幅用のPKD特異的プライマーのデザインに使用する
ことができる。固有部位の長さは、数個のヌクレオチド
から数千個のヌクレオチドまで変化することができる。
同定されたほとんどの固有部位は、100個以下のヌク
レオチド(例えば、50個以下のヌクレオチドまたは3
0個以下のヌクレオチド)を含む。PKD特異的プライ
マーを使用した増幅により、増幅反応の特異性が増加
し、PKDホモログから増幅される副産物が減少する。
個体中の対立遺伝子変異(例えば、変異PKD遺伝子)
を同定するための配列決定または他の分析用のクローニ
ングおよび/もしくは発現に特異的に増幅させた真のP
KD遺伝子産物を使用することができる。
【0077】IV.本発明に有用なPKD特異的プライ
マー 変異の有無を分析するためのサンプルは、検出できない
ほど少量の物質を含む場合がある。したがって、第1の
変異検出アッセイステップは、サンプル増幅である。本
発明の好ましい増幅反応はPCRである。PCR増幅
は、プライマーデザイン、DNAポリメラーゼ酵素の選
択、増幅サイクル数、および試薬濃度などのステップを
含む。これらの各工程およびPCRプロセスに関連する
他のステップは、増幅産物の純度に影響を与える。複製
の忠実度および産物の純度に影響を与えるPCRプロセ
スおよび因子がPCR分野で周知であるにもかかわら
ず、以前は本発明の分離法(例えば、DHPLC)を使
用したPKD遺伝子の変異検出に関するこれらの因子に
ついて取り組んでいなかった。
【0078】特異的ストリンジェンシー条件下で真のP
KD遺伝子にアニーリングするがPKDホモログまたは
他の配列にアニーリングしない任意のプライマーは、本
発明の有用なPKD特異的プライマーである。同定した
固有部位配列を、本発明に有用なPKD特異的プライマ
ーのデザインの基本として使用する。本発明のプライマ
ーを、PKD患者同定用の従来のキットに組み込むこと
ができる。
【0079】A.プライマーの選択基準 PKD種特異的プライマーは、PKD遺伝子の固有の部
位中に存在する配列に相補的な配列を含むことが好まし
い。PKD特異的プライマーは、PKDホモログ以外の
真のPKD遺伝子にアニーリングすることが好ましい限
り、正常または変異PKD遺伝子の固有の部位に相補的
であり得る。
【0080】PKD種特異的プライマーを、PKD遺伝
子について同定した固有部位配列の分析によって手動で
選択することができる。PCRで増幅されるDNAフラ
グメント配列が公知である場合、市販のソフトウェアを
使用して全フラグメントまたはフラグメント内の任意の
配列を産生するプライマーを作成することができる。フ
ラグメントの融解マップを、MacMelt(登録商
標)(BioRad Laboratories、He
rcules、Calif.)、MELT(Lerma
nら、Meth.Enzymol.、155、482、
1987)、またはWinMelt(商標)(BioR
ad Laboratories)などのソフトウェア
を使用して構築することができる。
【0081】約18〜25塩基長で50%のG−C含量
のプライマーは約52〜58℃のアニーリング温度で良
好に作用することが当該分野で公知である。本発明のプ
ライマーをデザインする場合、これらの性質は好まし
い。より長いプライマーまたはGC含量がより高いプラ
イマーは、より高い温度でのアニーリングが最適であ
り、同様に、より短いプライマーまたはGC含有量の低
いプライマーはより低い温度でのアニーリングが最適で
ある。プライマー17〜25塩基長の融解温度の概算を
得るための便利且つ単純化した式は以下である。 融解温度(Tm(℃))=4×(G数+C数)+2×
(A数+T数)。
【0082】全デザインプロセスは、広範囲(すなわ
ち、第1ラウンドのPCR)および狭い範囲のプライマ
ー(すなわち、ネスト化PCR)デザインからなる。広
範囲のプライマーデザインでは、質の良いPCR産物を
産生するプライマーをデザインすることが目的である。
「良質」のPCR産物は、本明細書中では、PCR産物
が高収率で産生されることおよびプライマー二量体およ
びPCR誘導変異などの不純物の量が少ないことを意味
すると定義する。良質のPCRは、他の反応パラメータ
(使用酵素、PCRサイクル数、使用緩衝液の濃度およ
び型、サーマルサイクリングの温度、ならびにゲノムテ
ンプレートの質など)にも影響され得る。良質のPCR
産物の作製法は、Eckertら(「PCR:実践アプ
ローチ」、McPherson,Quirke,and
Taylor編、IRL Press、Oxfor
d、第1巻、225〜244、1991)で考察されて
いる。この引例およびこの引例中の引例は、参照するこ
とによってその全体を本明細書中に組み込むものとす
る。
【0083】狭い範囲のプライマーのデザインは、2つ
の要件を満たすべきである。第1に、全ての広範囲プラ
イマーデザイン要件を満たし、良質のPCR産物が得ら
れるべきである。さらに、DHPLC法により増幅フラ
グメント内の変異または多型の位置に関係なく変異また
は多型を検出可能なフラグメントが産生されなければな
らない。例えば、数千塩基対までを有する巨大DNAフ
ラグメントをPCRによって増幅することができる。増
幅の目的が所望フラグメントを増幅することのみである
場合、この目的で使用することができるプライマーデザ
インの許容度は大きい。しかし、PCR増幅の目的がD
HPLCによる変異検出分析用のDNAフラグメントを
作製することである場合、PCR法で作製したフラグメ
ントが検出可能であり且つDHPLで分析した場合にシ
グナルを発生するようにプライマーをデザインしなけれ
ばならない。本発明の好ましい実施形態では、増幅産物
の長さは、150〜600bpである。より好ましい実
施形態では、DHPLC変異検出分析用のフラグメント
長は、150〜400bpである。
【0084】狭い範囲のプライマーのデザインには2つ
の目的が存在する。プライマーデザインの1つの目的
は、「変異分析」試験として使用する場合である。別の
目的は、研究または診断目的(PKD患者の同定)のた
めの分析である。本明細書中では、「変異分析」を、フ
ラグメントが集団中にばらつき(すなわち、変異または
多型)を含むかどうかを同定し、このばらつきを疾患に
関連付けるためのDNAフラグメントの研究または分析
と定義する。本発明の文脈内で、用語「変異」には、疾
患についてサイレントである多型は含まれない(例え
ば、正常)と理解される。DHPLCを変異分析技術と
して使用する場合、本発明の重要な態様は、変異部位が
フラグメント内に存在することに関係なく推定変異を検
出することができるフラグメントを産生するためのプラ
イマーのデザイン法である。それに対して、変異が公知
である場合、分析が至適化される(すなわち、DHPL
Cにおけるホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖ピークが最大
になる)ようにプライマーデザインをさらに改良するこ
とができる。公知の変異の分析分離度の改良によって、
分析を正確にすることができる。変異診断への適用のた
めに分離度の改良が必要である。さらに、改良された分
離度を使用して、変異の正の存在の自動同定を、正常お
よび変異DNAサンプルのピークの重ね合わせおよび比
較測定する適切なソフトウェアおよびアルゴリズムによ
ってより容易に行うことができる。
【0085】変異分析に適用するための別のプライマー
デザイン法は、目的の領域がフラグメント内のより低い
融解ドメインで存在するようにプライマーをデザインす
ることである。この場合、エクソンに向かって移動する
ように分析を行うので、測定されるフラグメントが目的
の領域に重ね合わせるようにプライマーを設計すること
が好ましい。これらの場合、高温融解ドメインと低温融
解ドメインとの間の温度差は、5℃を超えることが好ま
しく、10℃を超えることが最も好ましい。
【0086】一旦目的の変異が同定されると、診断また
は臨床用のプライマーを再デザインすることができる。
これらの場合、末端により近いいずれかの末端の25%
または25塩基内に変異が存在することが好ましい。フ
ラグメントの他方の末端は、変異が存在する低温ドメイ
ンよりも好ましくは5℃、より好ましくは10℃、最も
好ましくは15℃高い高温融解ドメインを含む。プライ
マー選択によりフラグメントの反対側の末端に高温融解
ドメインが得られない場合、所望の末端(例えば、A−
Tリッチな末端)で融解温度を増加させるためにG−C
クランプを適用することができる(Myersら、19
85、Nucleic Acids Res.、13、
3111)。G−Cクランピングは、プライマーの片側
または両側の5’末端上にさらなるG−C塩基を含む技
術である。ポリメラーゼ酵素は、増幅フラグメントに組
み込むこれらのさらなる塩基を超えて伸長させて、変異
周辺の融解温度と比較してフラグメントの末端の融解温
度を上昇させる。例えば、変異が増幅フラグメントの中
央に存在し、長さが100bp未満であり、融解プロフ
ィールの変化がない場合または変異がフラグメントの高
温融解領域に存在し、高温融解領域がG−Cリッチな領
域に存在する場合、G−Cクランプが必要であり得る。
これらの場合、適切なプライマー選択により、変異を検
出することができるフラグメントが得られる。G−Cク
ランプのサイズは、40bpまでであっても、4または
5bpほど小さくても良い。DHPLCによる変異検出
用の最も好ましいG−Cクランプは、10〜20bpで
ある。
【0087】PCR増幅の際に十分にTm内のフラグメ
ント中で一定の融点範囲またはドメインを有するドメイ
ンを産生するプライマーをデザイン不可能である場合、
DHPLCでの首尾の良い変異検出のために目的のドメ
インのTmを下げる必要があり得る。例えば、dGTP
のG−C塩基対の融解温度を有効に低下させることが公
知のアナログ7−デアザ−2’−dGTPとの置換によ
ってこれを行うことができる(Dierickら、19
93、Nucl.Acids Res.、21、442
7)。ドメインのTmを上昇させる必要がある場合、P
CR増幅においてdGTPの代わりに2,6−アミノプ
リンを使用することができる。
【0088】最も好ましい実施形態では、フラグメント
の「低温融解」ドメイン中に変異が存在するようにプラ
イマーを選択する。しかし、高温融解ドメインがフラグ
メント中の他のドメインと非常に異なる融点ではない場
合またはフラグメントの高温融解ドメインを至適化する
より高いカラム温度を使用する場合、フラグメントの高
温融解ドメイン中の変異をDHPLCで検出することも
できる。
【0089】上記の広範囲プライマーデザインを、いく
つかの他の因子が考慮された局所プライマーデザインに
よってさらに改良することができる。例えば、非テンプ
レートテールを有するプライマー(普遍配列決定プライ
マーまたはT7プロモーターなど)を回避する必要があ
り得る。好ましいプライマーのTmは約56℃である。
正方向プライマーと逆方向プライマーとのTm差は、好
ましくは約1℃である。プライマーとテンプレートとの
間のTm差は、好ましくは25℃である。各プライマー
の3’五量体は、好ましくはΔG°=6kcal/mo
lよりも安定している(すなわち、よりネガティブ)。
任意の可能なプライマー二量体は、好ましくは3’五量
体よりも少なくとも5kcal/mol安定ではない
(すなわち、5kcalよりポジティブ)。任意のプラ
イマーの自己アニーリングループのTmは、12℃未満
であることが好ましい。プライマーは、好ましくは不都
合な配列を含まずに純度が高い。分解を回避するため
に、純水を使用したTris−HCl(pH8.0)緩
衝液中で保存することが好ましい。
【0090】いくつかの実施形態では、変異のためには
5kbまで(例えば、4kbまで、3kbまで、2kb
まで、または1kbまで)の長いフラグメント(例え
ば、エクソン)を直接分離することがより都合がよい。
このような長いフラグメントは、一般に、複数の融解温
度のドメインを含む。二本鎖DNAフラグメントは、温
度上昇に反応して変性する温度安定性の異なる、異なる
領域として一連の不連続な工程で溶解した。これらの温
度安定性の異なる領域を「ドメイン」といい、各ドメイ
ンは、約50〜300bp長である。各ドメインは、各
自それぞれのTmを有し、その各Tmに関連する熱力学
的挙動を示す。ドメイン内の塩基ミスマッチの存在によ
り、ドメインが不安定化し、ホモ二重鎖中で見出される
完全な水素結合区画と比較してヘテロ二重鎖中のドメイ
ンのTmは減少する。一般に、塩基ミスマッチの存在に
より、Tmが約1〜2℃低下する。
【0091】好ましい実施形態によれば、18〜51個
の塩基長のプライマーおよび配列番号3〜49のプライ
マーに対するDNA配列を使用して、最適な結果が得ら
れた(表3および表4)。しかし、当業者は、使用する
プライマーの長さを変化させることができることを認識
している。例えば、少なくとも15個、好ましくは17
個の塩基(これらのプライマー(配列番号3〜49)の
ヌクレオチド配列の連続的塩基)を含むより短いプライ
マーが適切であり得ることが想定される。プライマー長
の正確な上限は重要ではない。しかし、典型的には、プ
ライマーは、約60塩基以下、好ましくは50塩基以下
である。さらに、プライマー中に含まれる塩基を、当該
分野では通常の改変(ビオチンまたは蛍光標識などの検
出可能な標識の組み込みが含まれるが、これに限定され
ない)を行うことができる。
【0092】
【表3】
【表3(つづき)】
【表3(つづき)】
【表3(つづき)】
【表3(つづき)】
【表3(つづき)】
【0093】
【表4】
【表4(つづき)】
【0094】B.PKD特異的増幅に有用なプライマー
の組み合わせ。 特異的増幅産物を、1つまたは複数のPKD特異的プラ
イマーの使用によって作製することができる。好ましく
は、1つの増幅産物の作成に使用した両プライマーは、
PKD特異的プライマーである。しかし、1つのPKD
特異的プライマーを、PKD遺伝子の固有部位に相補的
ではない別の非PKD特異的プライマーと組み合わせて
使用することができる。非PKD特異的プライマーを、
PKD特異的プライマーについての上記の同一の基準に
したがってデザインすることが好ましく、PKD遺伝子
中の固有の配列以外の配列に完全に相補的であることが
好ましい。非PKD特異的プライマーを、コントロール
産物を作製するための増幅反応に含まれるコントロール
プライマーとして使用することもできる。
【0095】表4および表5に列挙した1つの正方向お
よび1つの逆方向プライマーの使用によって最適な結果
を得ることができるが、他の組み合わせを使用すること
もできる。好ましい実施形態では、増幅産物の長さが1
50〜600bpであるように、プライマー対を選択す
る。好ましい実施形態では、DHPLC変異検出分析用
の増幅フラグメント長が150〜400bpであるよう
にプライマー対を選択する。
【0096】C.プライマー合成 プライマー合成法は、当該分野で利用可能である。本発
明のオリゴヌクレオチドプライマーを、任意の従来のD
NA合成法(Narangら(1979、Meth.E
nzymolo.、68、90)またはItakura
(米国特許第4,356,270号)に記載のリン酸ト
リエステル法、Brownら(1979、Meth.E
nzymol.、68、109)に記載のリン酸ジエス
テル法、またはMullisら(米国特許第4,68
3,202号)に記載のその自動化実施形態など)を使
用して調製することができる。特に、Sambrook
ら、1989、「分子クローニング:実験マニュア
ル」、第2版、Cold Spring Harbor
Laboratory、Plainview、N.
Y.(本明細書中で参考として援用される)もまた参照
のこと。
【0097】V.増幅反応用のテンプレートの調製 配列番号1または2またはその変異体(例えば、多型形
態または変異形態)の全部または一部を含む核酸を含む
任意のサンプルを、本発明の増幅反応のテンプレートと
して使用することができる。本発明の有用なテンプレー
トには、ゲノムDNA調製物、全RNA調製物、粗細胞
溶解物、および組織サンプルが含まれるが、これらに限
定されない。
【0098】本発明のPKD特異的増幅用のテンプレー
トとしてゲノムDNAを使用することが好ましい。粗細
胞溶解物または組織サンプルを使用することができると
想定されるが、当業者は、サンプル中に存在する任意の
非DNA物質がポリメラーゼ反応またはその後の分析を
妨害し得ると認識する。
【0099】組織サンプルまたは細胞からゲノムDNA
を単離することができる。好ましくは、本発明でテンプ
レートとして使用されるゲノムDNAを、分解および汚
染を回避する条件下で単離する。DNアーゼ活性がほと
んどないか全くなくなるように組織サンプルまたは細胞
をプロテアーゼで消化することができる。消化物をDN
A溶媒で抽出する。抽出ゲノムDNAを、例えば透析ま
たはクロマトグラフィーによって精製することができ
る。適切なゲノムDNA単離技術は、例えば、「現代の
分子生物学プロトコール」、Ausugel編、Joh
n Weley& Sons,Inc.,1997に記
載のように当該分野で公知である。
【0100】好ましくは、ゲノムDNAまたはcDNA
を個体から採取した組織サンプルの細胞溶解物から抽出
し、PKD増幅のテンプレートとして使用する。組織サ
ンプルの回収はまた、個体組織由来の培養ヒト細胞のイ
ンビトロ採取または、例えば採血、脊椎穿刺、組織塗抹
標本、または組織生検による被験体からの直接インビボ
サンプリング手段を含む。任意選択的に、組織サンプル
を、分析前に、分析可能な条件下でサンプルの核酸を保
管する周知の保存手段(急速凍結、凍結制御レジメ(c
ontrolled freezing regim
e)、凍結防止剤(例えば、ジメチルスルホキシド(D
MSO)、グリセロール、プロパンジオール−スクロー
ス)の存在下など)によって保存する。組織サンプル
を、分析のための増幅の保存の前後にプールすることも
できる。いくつかの実施形態では、サンプルは、2人ま
たはそれ以上の個体由来のDNA、組織、または細胞を
含む。
【0101】本発明の方法の実施のために、核酸を含む
任意のヒト組織をサンプリングおよび採取することがで
きる。採取に最も好ましく且つ都合の良い組織は血液で
ある。患者は、採血前に準備する必要はない。投薬がサ
ンプル採取または試験を妨害することは知られていな
い。有用な無菌技術および汚染の回避が必要である。
【0102】好ましくは、採血日に血液からDNAを抽
出する。使用前に血液を室温(72°Fまたは25℃)
で保存することが好ましい。しかし、全血を短期間4℃
で保存することができるが、室温が推奨される。全血試
料は、48時間安定であり得る。その後の溶血はDNA
回収および完全性に支障をきたす。PCRアッセイ用の
DNA抽出に至適な血液量は、5mlを超える(例え
ば、10.0mlを超える)ことが好ましい。
【0103】VI.PKD特異的プライマーを使用した
PCR増幅 本発明は、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応での標的核
酸を含むサンプル由来のDNAの増幅および特異的増幅
産物における標的核酸中の変異の有無の検出による、配
列番号1または2またはその変異体を含む標的核酸の変
異分析法を提供する。
【0104】当該分野で周知の手段(例えば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)、転写ベースの増幅(逆転
写)、鎖置換増幅)によって増幅を行うことができる
(「現代の分子生物学プロトコール」を参照のこと)。
好ましくは、Mullis(米国特許第4,683,2
02号)(その内容が本明細書中で参考として援用され
る)に記載のようなPCRによって増幅を行う。
【0105】PCRにより、「プライマー」と呼ばれる
小さなDNA鎖を「テンプレート」に沿って伸長させる
ためにDNAポリメラーゼと呼ばれる選択性の高い酵素
の利用によって、小さなDNAサンプルまたは任意の塩
基対の長さ(サイズ)の他の核酸の増幅(複製)が可能
である。小さなDNAサンプルを、テンプレートとして
使用する。PCRは、テンプレートまたはその任意の選
択部分中に存在するデオキシヌクレオチド三リン酸(d
NTP)の相補配列を再生する。PCRは、一般に、例
えば、検出限界未満の濃度のDNAサンプルをPCR法
によって増幅し、その後このようにして得られた大量の
サンプルを分析する診断技術と組み合わせて使用する。
【0106】PCR増幅装置(例えば、Air The
rmo Cycler(IdahoTechnolog
ies))および試薬は、多数の業者から市販されてい
る(例えば、Perkin−Elmerカタログ「PC
Rシステム、試薬、および消耗品」、Perkin−E
lmer Applied Biosystems、F
oster City、Calif.)。
【0107】典型的には、PCRはpH5〜8の緩衝液
中で行う。緩衝液は、増幅すべき二本鎖DNAサンプ
ル、正方向プライマー、逆方向プライマー、マグネシウ
ム(例えば、MgCl)、および一般に「dNTP」
と呼ばれる4つのデオキシヌクレオチド三リン酸(dA
TP、dTTP、dCTP、およびdGTP)(DNA
の構築ブロック)を含む。反応混合物を、DNAサンプ
ルの変性に十分な温度(例えば、>90℃)に加熱し、
それにより2つの相補核酸鎖が分離する。あるいは、周
囲温度でヘリカーゼ酵素を使用して、DNAを酵素的に
変性することができる。変性が熱に影響を受け、且つ熱
安定性DNAポリメラーゼを使用する場合、反応開始前
にDNAポリメラーゼを添加する。他の変性条件は当業
者に周知であり、米国特許第5,698,400号に記
載されている。DNAポリメラーゼは種々の業者から市
販されている(例えば、Perkin−Elmer A
pplied Biosystems、Foster
City、Calif.およびStratagene
(La Jolla、Calif.))。
【0108】PCRで複製すべき変性DNA鎖の同定部
分に相補的になるように、プライマー配列をデザインす
る。反応物の適切なアニーリング温度への冷却の際、各
プライマーを複製すべき変性DNAサンプルの各鎖中の
相補塩基配列にアニーリングする。DNAポリメラー
ゼ、4つのdNTP、およびMg2+の存在下で約70
℃に加熱し、複製により相補dNTPの添加によりその
3’末端から鎖の長さに沿ってプライマーが伸長する。
dNTPは種々の業者から市販されている(例えば、P
harmacia(Piscataway、N.
J.))。このプロセスの多数の反復により、本プロセ
スの初期段階で所望のDNA鎖数が相乗的に増加する
か、反応液中に十分に過剰な試薬が存在する限り増加す
る。したがって、元のDNAサンプル量が増加する。
【0109】ポリメラーゼ量は、所定の増幅サイクル数
を通してDNA合成の促進に十分でなければならない。
実際のポリメラーゼ量に関するガイドラインは、一般
に、PCR試薬の供給者が提供しており、あるいは当業
者によって容易に決定可能である。好ましくは、校正活
性(proofreading activity)を
有するDNAポリメラーゼを使用する。
【0110】各プライマーの量は、実質的に過剰量の増
幅すべき標的DNA量でなければならない。当業者は、
反応混合物に必要なプライマー量を、反応の終了後に最
終的な所望の増幅フラグメント数に関して評価すること
ができる。
【0111】偽陽性の結果を回避するために、当業者
は、当該分野で従来のようにアッセイはネガティブコン
トロールを含むべきであることを認識する。例えば、適
切なネガティブコントロールは、プライマーおよびDN
Aを含まない(すなわち、「水コントロール」)。偽陰
性の結果を回避するために、コントロールプライマーに
よってポジティブコントロールを得る(以下を参照のこ
と)。
【0112】A.PCR条件の至適化 首尾の良い特異的増幅(例えば、本発明による最大量の
特異的増幅産物を産生し、且つ最小量の非特異的増幅産
物を産生する増幅)は、対応する適合テンプレートへの
PKD特異的プライマーに非常に依存する。プライマー
が反応混合物中の多数の異なる配列に非特異的にアニー
リングする場合、増幅プロセスは特異的ではない。ほと
んどの実施形態で非特異的アニーリングまたは非特異的
増幅が回避される可能性が低いにもかかわらず、非特異
的増幅が減少する一方で特異的増幅が増加するようにP
CR増幅反応条件を至適化することが望ましい。
【0113】さらに、非相補塩基をテンプレートに添加
するPCR誘導変異が、サンプル増幅中に形成される場
合がある。検出された変異がサンプル中に存在するかP
CRプロセス中に産生されたかは明白ではないので、こ
のようなPCR誘導変異は変異検出結果をあいまいにす
る。出願人は、PCR誘導変異の形成を最小にし、推定
上の変異含有サンプルの正確且つ明白な分析を確実にす
るためのPCRサンプル増幅至適化の重要性を認識して
いた。
【0114】B.PKD特異的プライマーのPKD特異
的アニーリングの特異性の制御 PCRによるDNAフラグメント複製の忠実度は、当該
分野で長く認識されている多数の要因に依存する。これ
らの要因のいくつかは、1つの要因の量または濃度の増
減によって生じるPCR産物プロフィールの変化を相殺
し得るか異なる要因の変化によって逆になるという意味
で相関関係がある。例えば、酵素濃度の増加により複製
忠実度が減少し得る一方で、反応温度の低下により複製
忠実度が増大し得る。マグネシウムイオン濃度またはd
NTP濃度の増加により、PCR忠実度の減少に影響を
与え得る反応速度が増加し得る。PCR忠実度に寄与す
る要因の詳細な考察は、Eckertら(「PCR:実
践アプローチ」、1991、McPherson,Qu
irke,and Taylor編、IRL Pres
s、Oxford、第1巻、225〜244)、And
reら(1977、「ゲノム研究」、Cold Spr
ing Harbor Laboratory Pre
ss、843〜852)に示されている。これらの引例
およびこの引例中の引例は、その全体が本明細書中で参
考として援用される。したがって、PCRプロセスの産
物プロフィールの利用可能性により、PCR条件を非常
に有効な様式が得られるように改良することができる。
【0115】PCR増幅では、アニーリングの特異性
は、第1の数サイクルで最も重要である。残りのサイク
ルは、最初の数サイクルで増幅されたテンプレートのプ
ールを拡大するためだけに使用される。テンプレートへ
のプライマーアニーリングの特異性を、緩衝液のイオン
強度(主に、K濃度)、Mg2+濃度(dNTPに結
合するのでdNTP量の影響を受ける)、および各複製
サイクルのアニーリング温度によって制御する。好まし
い実施形態では、dNTP濃度は、50nM、好ましく
は100nM、より好ましくは200nMである。
【0116】特定のテンプレート標的へのプライマーの
特異的アニーリング条件を、通常、アニーリング温度の
幾らかの上昇の変化およびアガロースゲル電気泳動によ
る増幅プロセスの特異性および感度の比較によって経験
的に決定しなければならない(「現代の分子生物学プロ
トコール」、前出を参照のこと)。
【0117】PKD特異的プライマーに相補的な固有領
域はホモログ配列と数個のヌクレオチドのみ(1つのヌ
クレオチドのみの場合もある)が異なり得るので、増幅
反応の特異性は反応で使用した各PKD特異的プライマ
ーについて試験する必要がある。
【0118】上記のプライマーアニーリング温度の計算
式は、大まかな指針であり、その後の異なるアニーリン
グ温度での試験は、PKD特異的増幅反応におけるこの
重要なパラメータを至適化する有用な方法である。特定
のプライマー−温度対の異なるアニーリング温度の同時
試験に装置を利用することができ、これは最適なアニー
リング温度を迅速且つ確実に決定することができる(例
えば、ロボサイクラー・グラジエント・テンペラチャー
・サイクラー、カタログ番号400864、Strat
agene;エッペンドルフマスターサイクラーグラジ
エント、カタログ番号5331 000.045、Br
inkmann Instruments,Inc.、
Westbury、NY)。
【0119】いくつかの実施形態では、プライマー対の
Tmよりも1℃〜10℃高いアニーリングおよび伸長温
度で標的配列を増幅する。この温度での増幅は不十分で
あるにもかかわらず、得られた任意のプライマー伸長物
は標的特異的である。したがって、高温サイクル中、サ
ンプルは特定の標的配列が富化し、任意のサイクル数
(すなわち、1〜15サイクル)で産物特異性が向上す
る。次いで、アニーリング温度を低下させて増幅効率を
上げ、検出可能な量のPCR産物を得ることができる。
テンプレートとして第1のPCR反応物由来の増幅産物
を使用してネスト化(nested)増幅反応を行うこ
ともできる(以下を参照のこと)。
【0120】あるいは、最少量の非特異的産物を含む高
収率の特異的産物を得るための至適条件を定義するため
に、一定の温度であるがKClまたはMgCl濃度が
異なるか、種々の量のホルムアミド(例えば、0、2、
4、6%)、DMSO(1〜10%)などの変性剤を添
加する反応を同時に行うことができる。
【0121】1つの実施形態では、配列番号3〜49か
らなる群から選択される少なくとも1つを含むプライマ
ー対を、増幅反応混合物で使用する。1つまたは複数の
特異的に増幅する産物が作製されるように、2つのプラ
イマーは逆方向である。
【0122】いくつかの実施形態では、PKD特異的増
幅で使用するプライマーが配列番号3〜49から選択さ
れる場合、GeneAmp PCR緩衝液IIおよびM
gCl溶液を含むAmpliTaq Gold DN
Aポリメラーゼ、Perkin ElmerのrTth
DNAポリメラーゼXL&XL緩衝液IIパック、お
よびStratageneのTaqPlus精密PCR
システムを使用した。PFUTurbo(商標)は、S
tratageneから提供されているより高い校正を
有する別の忠実度の高いDNAポリメラーゼである。
【0123】他の実施形態では、配列番号3〜49から
選択されるプライマーを使用したPKD特異的増幅に6
5℃を超えるアニーリング温度(例えば、68〜72
℃)を使用する。
【0124】一般に、プライマーおよびテンプレートを
添加後にDNAポリメラーゼを増幅反応混合物に添加す
ることが好ましいが必須ではない。あるいは、例えば、
酵素およびプライマーを最後に添加するか、反応緩衝液
またはテンプレート+緩衝液を最後に添加する。一般
に、重合に不可欠な少なくとも1つの成分がプライマー
およびテンプレートが共に存在するときまで存在せず、
酵素が所望のプライマー/テンプレート基質に結合およ
び伸長することができることが望ましい。「ホットスタ
ート」と呼ばれるこの方法は、「プライマー−二量体」
の形成を最少にし、増幅特異性を改良する。
【0125】DNAポリメラーゼの特異性の程度は、使
用した反応条件および使用酵素の型で変化する。完全に
エラーのないプライマー伸長が得られる酵素は存在しな
い。したがって、非相補塩基を随時移入することができ
る。このような酵素関連エラーにより、元のDNAサン
プルの正確なコピーではないがPCR誘導変異を含む二
本鎖DNA産物が得られる。他のPCRプロセスの特徴
(反応温度、プライマーアニーリング温度、酵素濃度、
dNTP濃度、Mg2+濃度、およびその組み合わせな
ど)は全て本明細書中に記載のPCRプロセスによるD
NA複製の精度または忠実度の低下させる可能性があ
る。
【0126】C.PKD特異的増幅感度 本発明のPKD特異的増幅感度は、増幅反応で使用した
テンプレートおよびプライマーならびに増幅の各サイク
ルのイオン強度およびアニーリング温度に依存する。
【0127】テンプレートとしてゲノムDNAを使用す
る場合、反応条件が至適化されている場合に首尾の良い
PCR増幅には1つまたは2つほどのテンプレートコピ
ー(約3〜5pg)を使用することができる。しかし、
より高いテンプレート濃度により増幅の特異性および効
率を増大することができることが当該分野で公知であ
る。
【0128】長いフラグメントよりも短いフラグメント
のほうが増幅効率が高い。好ましくは、1kb未満、よ
り好ましくは600bp長未満、または450bp長未
満の増幅産物を作製するプライマーを使用して、増幅ア
ッセイの感度を上げる。
【0129】好ましくは、増幅アッセイの感度は、10
0ngゲノムDNAテンプレート未満である。より好ま
しくは、アッセイ感度は10ngゲノムDNAテンプレ
ート未満である。より好ましくは、アッセイ感度は1n
gゲノムDNAテンプレート未満である。より好ましく
は、アッセイ感度は0.1ngゲノムDNAテンプレー
ト未満である。さらにより好ましくは、アッセイ感度は
0.01ngゲノムDNAテンプレート未満である。
【0130】D.ネスト化増幅 本発明のいくつかの実施形態では、テンプレートとして
最初の増幅反応の増幅産物を使用してネスト化増幅を行
う。好ましくは、ネスト化増幅反応は、テンプレートと
して最初のPCR反応由来のPCR増幅産物を使用した
ネスト化PCRである。プライマーのアニーリング温度
の至適化に加えて、「ネスト化」増幅を使用して、PK
D特異的増幅アッセイの特異性および感度を上げること
ができる。
【0131】例えば、ネスト化PCRを含む方法は、2
つの連続するPCR反応を含む。少なくとも1つのPK
D特異的プライマーを含む第1のプライマー対(例え
ば、PKD特異的プライマーおよびコントロールプライ
マーまたは2つのPKD特異的プライマー)を使用した
多サイクルのPCR後(例えば、10〜40、10〜3
0、または10〜20サイクル)、少量のアリコートの
第1の反応物(例えば、50μlの反応物のうち1μ
l)を、第1の対の内部または第1の対の間に存在する
配列にアニーリングする少なくとも1つのPKD特異的
プライマーを含む新規のプライマー組(例えば、PKD
特異的プライマーおよびコントロールプライマーまたは
2つのPKD特異的プライマー)を使用した第2の多サ
イクル(例えば、10〜40、10〜30、または10
〜20サイクル)PCR反応用のテンプレートとして使
用する。
【0132】ネスト化プライマーのデザインおおびネス
ト化PCR法は、当該分野で公知である(現代の分子生
物学プロトコール、前出を参照のこと)。上記のプライ
マーの一般的な選択基準もまた、ネスト化プライマーの
デザインに適用する。両ネスト化プライマーは第1のプ
ライマー対の内部(例えば、プライマー内)の配列およ
び少なくとも1つのネスト化プライマーにアニーリング
する必要があるが、本発明によれば、PKD特異的であ
ることが必要である。
【0133】ネスト化PCR法を使用して、PKD特異
性が2倍の首尾よく増幅したテンプレートを選択する。
1つのプライマー対のみでは失敗する場合、ネスト化P
CRの使用により、種特異的産物の収率も非常に増大
し、アッセイ感度を挙げることができる。
【0134】ゲノムDNAまたはcDNAを含むサンプ
ルを使用して、増幅反応用のDNAテンプレートを得る
ことができる。好ましくは、テンプレートとしてゲノム
DNAを使用する。ゲノムDNAを含むサンプルを反応
混合物で使用する場合、配列番号〜49からなる群から
選択される少なくとも1つを含むプライマー対により、
少なくとも2つの特異的増幅産物(ゲノムDNAテンプ
レート中の各PKD対立遺伝子由来の産物)が作製され
る。
【0135】E.増幅コントロール コントロールプライマーを、PKD特異的増幅のポジテ
ィブコントロールとして使用することができる。コント
ロールプライマーを、PKD特異性増幅用の同一の反応
混合物に添加するか、同一のパラメーター下の同一のP
CR装置で運転するコントロール反応に添加することが
できる。コントロールプライマーは、PKD遺伝子とP
KDホモログとの間の任意の同一の配列に相補的な配列
を含み得る。好ましくは、コントロールプライマーによ
りそのサイズが少なくとも1つのPKD特異的プライマ
ーを含むプライマー対によって増幅されたサイズと区別
することができる1つの増幅産物が作製される。コント
ロールプライマーによる増幅産物のサイズは、少なくと
も1つのPKD特異的プライマーを含むプライマー対に
よって作製した増幅産物のサイズより大きくても小さく
ても良い。好ましくは、少なくとも1つのPKD特異的
プライマーを含むプライマー対によって同一の増幅反応
で作製した増幅産物と比較して少なくとも100bp、
より好ましくは少なくとも500bp、より好ましくは
少なくとも1000bpサイズが異なるコントロール産
物が作製されるようにコントロールプライマーを選択す
る。
【0136】PKD特異的プライマーがアニーリングす
る位置で欠失したPKD対立遺伝子を分析する場合、コ
ントロール増幅は特に重要である。増幅コントロール産
物の存在下での特異的増幅の欠損は、PKD遺伝子の特
定の位置での欠失を示し得る。いくつかの実施形態で
は、反応混合物中に1対を超えるコントロールプライマ
ーを使用する。
【0137】本発明の遺伝子試験法で使用することがで
きる種々のコントロールについては実施例2を参照のこ
と。
【0138】増幅産物を精製して当該分野で公知の方法
による増幅に使用した遊離のプライマーを除去すること
ができる(例えば、「現代の分子生物学プロトコー
ル」、前出)。好ましい実施形態では、Edge Bi
osystemsのQuickstep(商標)の96
ウェルPCR精製キットを使用してPCR産物を精製す
る。
【0139】VII.PCR増幅産物の存在の検出 DNA変性、プライマーアニーリング、およびプライマ
ーの5’末端によって規定されるDNAセグメントの合
成のサイクルを、検出に十分な量の種特異的または普遍
産物のいずれかが利用可能になるまでテンプレート標的
の増幅に必要な回数だけ反復する。増幅反応の完了後、
増幅産物の存在を当該分野で従来の技術を使用して検出
することができる。
【0140】検出を容易にするために、プライマーを標
識することができる。プライマーを、検出可能なタグ
(例えば、32P、35S、14C、または125Iな
どの放射性標識、フルオレセインまたはローダミンなど
の蛍光化合物、ペルオキシダーゼもしくはアルカリホス
ファターゼなどの酵素、またはアビジンもしくはビオチ
ン)で直接標識することができる。PKD特異的産物の
作製に使用するPKD特異的プライマーおよびコントロ
ール産物の作製のみで使用するコントロールプライマー
は、同一または異なる標識を有し得る。
【0141】好ましい実施形態では、増幅産物をゲル電
気泳動によって分析することが都合がよい。
【0142】フラグメントの所望の分離度をもたらす条
件下で電気泳動を行う。通常、約500pbほど小さい
サイズが異なるフラグメントを分離する分離度で十分で
ある。好ましくは、分離度は約100bpである。より
好ましくは、分離度は約10bpである。フラグメント
のサイズを評価するために、サイズマーカーもまたゲル
上で電気泳動することができる。特異的増幅産物の予備
サイズ分析は、PKD遺伝子内の挿入または欠失を示す
ことができ、その後のDHPLCおよび配列分析から得
た結果と併せて、得られた情報を解釈することができ
る。
【0143】増幅産物パターンを視覚化することができ
る。増幅プライマーを標識した場合、この標識を明らか
にすることができる。分離された標識DNAフラグメン
トを含む基質を、標識の存在を検出する試薬と接触させ
る。例えば、放射性標識プライマーから作製された増幅
産物を、オートラジオグラフィーで検出することができ
る。増幅プライマーが検出されない場合、PCR産物を
有する基質を、臭化エチジウムと接触させて、DNAフ
ラグメントを紫外線下で視覚化することができる。
【0144】VIII.PCR増幅産物の分離 完全に相補的な配列のみがアニーリングし、1つまたは
複数の非相補ヌクレオチドを含む配列はアニーリングし
ない最もストリンジェントな条件下で、PKD特異的プ
ライマーは、真のPKD遺伝子テンプレートのみとアニ
ーリングし、PKDホモログとはアニーリングしない。
したがって、最もストリンジェントな条件下では、PK
D特異的プライマーは、PKD特異的であるか特異的な
逆方向プライマーと組み合わせて、PKDホモログでは
なく真のPKDテンプレートから増幅産物のみを作製す
る。しかし、典型的なPCR増幅反応の際、PKD特異
的プライマーは、特にPCR反応に必要な温度サイクリ
ングによって真のPKD遺伝子およびPKDホモログを
含むテンプレートにアニーリングすることができる。し
たがって、特異的増幅産物および非特異的増幅産物をの
両方を産生することができるにもかかわらず、非特異的
増幅産物の量を少なくとも1つのPKD特異的プライマ
ーの使用によって減少させることができる。
【0145】A.ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の形成 本発明の1つの実施形態では、ホモ二重鎖とヘテロ二重
鎖との混合物を、DHPLC分析前に形成する。標準的
な核酸ホモ二重鎖(例えば、正常なPKD対立遺伝子由
来の増幅産物)をサンプルに添加し、混合物の約90℃
または約95℃への加熱によって混合物を変性させるこ
とができる。変性プロセスで形成された変性一本鎖核酸
を、混合物の周囲温度への緩やかな冷却によってアニー
リングする。サンプルが変異を含む場合、ホモ二重鎖と
ヘテロ二重鎖との新規の混合物が形成される。サンプル
が変異を含まない場合、標準的な核酸のホモ二重鎖のみ
が形成される。好ましい実施形態では、標準的な核酸
は、「正常な」核酸である。
【0146】ほとんどの場合、PKD患者は、PKD遺
伝子を含む遺伝子座でヘテロ接合性である。すなわち、
キャリアはたった1つのPKD対立遺伝子および変異形
態を有し、正常な形態(例えば、野生型)の他の対立遺
伝子を有する。ほとんどのPKD変異により優性表現型
が得られるので、ADPKDの発症リスクの付与には1
つの変異対立遺伝子で十分である。両方の対立遺伝子が
変異しているが、それぞれ1つまたは複数の異なる変異
を有する場合、別のヘテロ接合状況が存在する。ヘテロ
接合性PKD患者について、少なくとも1つのPKD特
異的プライマーを含むプライマー対を使用したPCR増
幅(ネスト化PCR増幅を含む)により、少なくとも2
つの特異的増幅PKD産物(各対立遺伝子由来の産物)
が得られる。2つの特異的増幅PKD産物同一の長さで
あってもなくてもよく(例えば、1つの対立遺伝子上の
変異が欠失または挿入を含む場合、異なる長さ)、それ
ぞれの産物由来の少なくとも1つのヌクレオチドで異な
る。
【0147】増幅産物を変性し、互いに再アニーリング
して二重鎖を形成することができる。正常な対立遺伝子
由来の特異的増幅産物または変異対立遺伝子由来の特異
的増幅産物が同一の対立遺伝子由来の別の特異的増幅産
物にアニーリングする場合、これらはホモ二重鎖を形成
する。しかし、正常な対立遺伝子由来の特異的増幅産物
が変異対立遺伝子由来の特異的増幅産物にアニーリング
する場合、これらはヘテロ二重鎖を形成する。
【0148】まれな場合、変異はホモ接合性形態である
(すなわち、個体(例えば、PKD患者)中の両対立遺
伝子は同一の変異を含む)。ホモ接合性PKD患者から
サンプルを採取する場合、PCR増幅により、変性およ
び再アニーリングの際にヘテロ二重鎖を形成することが
できる特異的増幅産物は得られない。本発明のいくつか
の実施形態では、少なくとも1つのPKD特異的プライ
マーを含むプライマー対を有する増幅により正常なPK
D遺伝子由来の特異的増幅産物が産生されて、PCR増
幅後の変性および再アニーリングプロセスの際にヘテロ
二重鎖の形成が確実になるように、正常な(例えば、野
生型)PKD遺伝子を含むサンプルをPCR反応混合物
に添加する。
【0149】変性および再アニーリングプロセスで形成
されたホモ二重鎖はまた、非特異的増幅産物によって形
成されるものを含み得る。非特異的増幅産物が得られる
テンプレート対立遺伝子(例えば、PKDホモログ配
列)中の配列が1つまたは複数の変異も含むような非常
にまれな場合、ヘテロ二重鎖もまた形成され得る。非特
異的増幅産物間で形成されたヘテロ二重鎖を、さらなる
同定プロセスの分離にも供する。
【0150】B.ヘテロ二重鎖の分離および同定 PKD特異的増幅産物によって形成されたヘテロ二重鎖
の存在は、PKD遺伝子中の変異の存在を示す。ヘテロ
二重鎖野分離によって、変異対立遺伝子が、(例えば、
個体から)採取したサンプル中に存在するかどうかを同
定することができる。この分離プロセスにより非特異的
増幅産物が除去され、それにより正常な対立遺伝子由来
の特異的増幅産物は、変異対立遺伝子およびPKD患者
の同定効率および特異性を改良する。
【0151】ヘテロ二重鎖は塩基対ミスマッチ部位で選
択的に変性し、ヘテロ二重鎖の残存物(すなわち、相補
塩基対を含むヘテロ二重鎖の一部)の変性に必要な低温
で「バブル」を形成することがDNA分野で周知であ
る。ミスマッチ塩基間の水素結合が相補塩基間の水素結
合よりも弱いので、一般に部分変性と呼ばれるこの現象
が起こる。したがって、変異部位でのヘテロ二重鎖の変
性にはエネルギーはあまり必要ないので、鎖の残存物中
よりも塩基対ミスマッチ部位でヘテロ二重鎖を部分的に
変性するためには低温を必要とする。
【0152】ヘテロ二重鎖中の少なくとも1つの塩基対
が相補的でない場合、その部位の塩基の分離にはホモ二
重鎖中の完全に相補的な塩基対アナログと比較して少な
いエネルギーを使用する。これにより、ホモ二重鎖と比
較してヘテロ二重鎖の融解温度が低下する。局所変性よ
り、塩基対ミスマッチ部位に「バブル」(一般名)が形
成される。バブルは、同一の塩基対長の完全に相補的な
ホモ二重鎖と比較してDNAフラグメント構造が歪んで
いる。部分的変性条件下でのこの構造のゆがみを、ヘテ
ロ二重鎖とホモ二重鎖を分離するためのDHPLCの基
本として使用する。
【0153】「変性HPLC」(DHPLC)と呼ばれ
る分離プロセスは、ヘテロ二重鎖(変異の存在から得
る)を分離すること、および同一のbp長を有するホモ
二重鎖によって変異体が検出された。DHPLCを経に
検出に適用する(例えば、Underhillら、19
97、Genome Research、7、996;
Liuら、1998、Nucleic Acid Re
s.、26、1396を参照のこと)。この分離は、ヘ
テロ二重鎖がホモ二重鎖よりも融解温度(Tm)が低い
という事実に基づく。DHPLCを部分的変性温度(す
なわち、塩基ミスマッチ部位でのヘテロ二重鎖の変性に
十分な温度)で行う場合、ホモ二重鎖を、同一の塩基対
長を揺するヘテロ二重鎖から分離することができる(H
ayward−Lesterら、1995、Cenom
e Research、5、494;Underhil
lら、1996、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、93、193;Dorisら、1997、
DHPLC Workshop、Stanford U
niversity)。これらの引例およびこの引例中
の引例は、その全体が本明細書中で参考として援用され
る。したがって、DHPLCの使用を、変異検出に適用
した(Underhillら、1997、Genome
Research、7、996;Liuら、199
8、Nucleic Acid Res.、26、13
96)。DHPLCは、一定の条件下でわずか1つの塩
基対が異なるヘテロ二重鎖を分離することができる。上
記の引例およびこの引例中の引例を参照することによっ
てその全体を本明細書に組み込むものとする。
【0154】規則正しい二重鎖由来のDNA構造の塩基
対を含まない無秩序かつ重なっていない構造への変化
は、二重鎖−ランダム鎖移行(helix−rando
m chain transition)(すなわち、
融解)と呼ばれる。天然の配列の二本鎖分子についての
温度の関数としてこの変化を示す平衡の統計学的機械的
分析は、Wartell and Montroll
(1972、Adv.Chem.Phys.、22、1
29)に示されている。この理論は、各塩基対が以下の
内2つの可能な状態(積み重ね、らせん、および水素結
合または無秩序)でのみで存在することができると仮定
する。塩基配列および非常に少数の経験的に較正したパ
ラメーターのみが与えられた場合、任意の温度で各塩基
対がらせんまたは融解する可能性を計算可能である。統
計的−機械的理論は、各塩基対または塩基付近のクラス
ターの本来の安定性の相違、隣接塩基対がらせんまたは
融解(協同性)している可能性に対する隣接らせん構造
の影響、および両末端がらせん構造で区切られた場合の
無秩序領域の高次構造自由度の制限を考慮する。
【0155】厳密に区切られた一連の温度工程での可能
性の計算および補間法の繰り返しにより、各塩基対がら
せんと融解状態との間で50/50の平衡を保つ温度中
心点が同定される。MELTプログラムにより、温度中
間点およびいくつかの他の関数が得られる。分子に沿っ
た位置の関数としての温度中心点のプロットを、融解マ
ップと呼ぶ。これは、隣接塩基対の融解が個体間の安定
性の相違にもかかわらず分子の実質的な長さを超えて密
接に結合することを明白に示す。ほとんど同一の温度で
全ての塩基が融解するドメインと呼ばれるわずかに長い
領域(30〜300bp)の存在が典型的である。融解
マップは分子の最も低い融解ドメインをそのまま表す。
【0156】部分的変性温度では、サンプル配列中の塩
基対ミスマッチを有するヘテロ二重鎖はミスマッチ部位
で変性し、残りのサンプル配列は無傷のままである。部
分的変性へテロ二重鎖を、DHPLCを使用して分離お
よび検出することができる。
【0157】ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖との混合物を分
離するための部分変性条件下(例えば、DHPLC)で
HPLCを使用する場合、ヘテロ二重鎖は、通常、ホモ
二重鎖の前に溶出される。
【0158】本発明の特定の実施形態では、DHPLC
によってホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離および同定
し、ヘテロ二重鎖の存在はPKD遺伝子中の少なくとも
1つの変異(例えば、変異対立遺伝子中に存在する1つ
または複数のヌクレオチドの置換(または1つまたは複
数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失))の存在を示
す。
【0159】別の特定の実施形態では、DHPLC勾配
を、Transfenomic,Inc.(San J
ose、CA)のWavemaker(商標)4.0ソ
フトウェアによって決定する。
【0160】分離への適用には、変異がフラグメント上
のどこに存在するかに関係なく変異を検出することがで
きることが必要である。この状況では、変異はフラグメ
ントの中央または高温融解ドメイン中に存在し得るが、
両者とも検出が困難である。フラグメントの融解温度範
囲のばらつきは10℃未満が好ましく、ばらつきの範囲
が5℃未満であることが最も好ましい。
【0161】いくつかの変異分析では、DHPLC分析
でたった2つのピークまたは部分的に解析されるピーク
が認められる。2つのホモ二重鎖ピークは、1つのピー
クまたは部分的に解析されたピークとして認められ、2
つのヘテロ二重鎖ピークは、1つのピークまたは部分的
に解析されたピークとして認められ得る。いくつかの場
合、部分的変性条件下では広がった最初のピークのみが
認められる。
【0162】サンプルがサンプル長のホモ接合性DNA
フラグメントを含む場合、ヘテロ二重鎖が形成されない
ので、ハイブリッド形成およびDHPLCによる分析に
より任意の温度で1つのピークのみが得られる。本方法
の操作では、既知の野生型フラグメントとのホモ接合性
サンプルとのハイブリッド形成および部分的変性温度で
のDHPLC分析の実施によって変異を同定することが
できる。サンプルが正常な対立遺伝子を含む場合、ヘテ
ロ二重鎖が形成されないので、DHPLC分析では1つ
のピークが認められる。サンプルがヘテロ接合性変異対
立遺伝子を含む場合、DHPLCでの分析により、ホモ
二重鎖およびヘテロ二重鎖の分離が認められる。
【0163】50%の一定の融解ドメインが変性する温
度もまた、温度に対するDNAサンプルのUV(UV)
吸光度のプロッティングによって実験的に贈呈すること
もできる。吸光度は、温度に伴って増加し、得られたプ
ロットを融解プロフィールと呼ぶ(Breslauer
ら、1986、Proc.Natl.Acad.US
A、83、3746;Breslauer、1987、
「任意の反応分子数の移行についての熱力学的データの
計算」、221、Markyら編、J.Wiley a
nd Sons)。融解プロフィールに対する吸光度の
軸の中心点は、融解温度(Tm)(すなわち、二重鎖中
のDNA鎖の50%が変性する温度)を示す。本発明の
1つの実施形態では、この認められたTmを、変異検出
用のDHPLCの出発温度として使用する。次いで、こ
の温度を、異なるコントロールを使用して認められたパ
ターンにしたがって調整する(以下を参照のこと)。1
つの実施形態では、一定のTmを使用して、異なるサン
プル由来の同一のアンプリコン(すなわち、同一のプラ
イマー対によって産生される)を分析する。
【0164】本発明の別の実施形態では、MELT(L
ermanら、1987、Meth.Enzymo
l.、155、482)またはWinMelt(商標)
バージョン2.0などのソフトウェアを使用して、変異
検出用のDHPLC実施のための出発温度として使用す
る計算したTmが得られる。これらのソフトウェアプロ
グラムは、塩基対の安定性がそれぞれ異なるにもかかわ
らず、隣接する塩基部位の融解温度は密接に協力してい
る(すなわち、協同効果が存在する)ことを示す。した
がって、融解温度が適切に一定している「ドメイン」と
呼ばれる30〜300塩基対長の領域が存在する。類似
の様式では、ソフトウェアMELTSCAN(Bros
setteら、1994、Nucleic Acid
Res.、22、4321)は、DNAフラグメントに
おける融解ドメインおよびその対応する融解温度を計算
する。1つのヘテロ変異部位の選択温度での任意のドメ
イン部分の変異の検出が可能であるので、一定温度の融
解ドメインの概念は重要である。
【0165】別の特定のヘテロ二重鎖の分離および同定
法は、適合イオン核酸クロマトグラフィー(Match
ed Ion Nucleic Acid Chrom
atography)(MIPC)である。二本鎖核酸
と一般的にはDNAとの混合物有効に分離するために、
分離が塩基対長に基づくMIPCを導入した(米国特許
第5,585,236号、同第6,287,822号;
Huberら、1993、Chromatograph
ia、37、653;Huberら、1993、Ana
l.Biochem.、212、351)。これらの引
例およびこの引例中の引例は、その全体が本明細書中で
参考として援用される。MIPC分離は10分以内に完
了し、5分以内に完了することが多い。MIPCシステ
ム(WAVE(商標)DNAフラグメント分析システ
ム、Transgenomic,Inc.、San J
ose、Calif.)は、カラムおよびカラムインレ
ット部を含むコンピュータ制御のオーブンを備えてい
る。
【0166】DHPLCおよびMICPはヘテロ二重鎖
の分離および同定について説明した方法であるにもかか
わらず、当該分野で公知の他の方法をヘテロ二重鎖の同
定に使用することもできることが理解される。例えば、
高分離能ゲル基質でのヘテロ二重鎖分析もまた、1つの
ヌクレオチド多型でさえも検出することができる。(H
auserら、1998、Plant.J.、16、1
17〜25)。ヒトPKD遺伝子の3’末端中のSNP
を検出するための増幅産物の分析のためにPCR/OL
A法を使用することができる(Glick and P
asternak、1994、「分子生物工学:組換え
DNAの原理と応用」、ASM Press、Wash
ington,D.C.、197〜200)。当業者
は、本発明の方法の実施における分析手段として増幅産
物の高次構造感受性ゲル電気泳動を使用することもでき
る。(Markoffら、1998、Eur.J.Ge
net.、6、145〜50)。1つの塩基の置換、欠
失、または挿入を検出することができるPCR−制限フ
ラグメント−SSCPなどの技術によってこれを達成す
ることができる(Tawataら、1996、Gene
t.Anal.、12(3〜4)、125〜27;Le
eら、1992、Anal.Biochem.、20
5、289〜93)。従来の任意の種々のスラブまたは
キャピラリー電気泳動法の使用によって、増幅産物分析
のための電気泳動を迅速且つ高感度に行い、実施者は任
意の容易な核酸フラグメント検出手段(放射性核種、U
V吸収、またはレーザー誘導蛍光(Keparnik
ら、1998、Electorophoresis、1
9、249〜55;Inoueら、1998、J.Ch
romatogr.A.、802、179〜84;Do
vichi、1997、18、2393〜99;Ara
kawaら、1997、J.Pharm.Biome
d.Anal.、15、1537〜44;Baba、1
996、J.Chromatgr.B.Biomed.
Appl.、687、271〜302;Chanら、1
997、J.Chromatogr B.Biome
d.Sci.Appl.、695、13〜15)が含ま
れるが、これらに限定されない)の使用を任意選択的に
選択することができる。任意選択的に任意の種々の蛍光
色素を使用して、分析を容易にするために本発明のプラ
イマーまたは増幅産物を標識することができ、この色素
には、SYBRグリーンI、TIO−PRO−1、チア
ゾールオレンジ、Hex(すなわち、6−カルボキシ−
2’,4’,7’,4,7−ヘキサクロロフルオロセイ
ン)、ピクログリーン、エダンス、フルオレセイン、F
AM(すなわち、6−カルボキシフルオレセイン)、ま
たはTET(すなわち、4,7,2’,7’−テトラク
ロロ−6−カルボキシフルオロセイン)(例えば、Sk
eidsvoll and Ueland、1995、
Anal.Biochem.、231、359〜65;
Iwahanaら、1996、Biotechniqu
es、21、510〜14、516〜19)が含まれる
が、これらに限定されない。
【0167】変異検出の目的でホモ二重鎖およびヘテロ
二重鎖の分離を行うための好ましい実施懈怠における本
発明の使用では、上記の混合物の変性およびアニーリン
グによってDNAサンプルを正常なDNAフラグメント
とハイブリッド形成させる。DNAサンプルを、正常な
DNAと直接ハイブリッド形成することができる。DN
Aサンプルを、PCRによって増幅し、その後正常なD
NAとハイブリッド形成することもできる。あるいは、
PCR増幅前に正常なフラグメントをサンプルに添加す
ることができる。次いで、増幅混合物を、増幅後にハイ
ブリッド形成することができる。これら3つの各ハイブ
リッド形成シナリオでは、サンプル中に変異が存在する
場合、ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖との混合物が得られ
る。このようにして調製したサンプルを、本発明の方法
を使用した変異の存在について、部分的変性条件下(好
ましくは、56〜58℃)でのDHPLCによって分析
する。
【0168】本発明の方法を変異の存在について多数の
サンプルの分離のために使用する場合、フラグメント一
括範囲のための広範囲勾配を使用した各サンプルの分析
の高速化によってサンプル処理量を有意に増加させるこ
とができる。
【0169】本発明の全ての実施形態および態様では、
DHPLCカラムで分離および溶出されたとき、核酸フ
ラグメントが検出される。核酸を検出することができる
任意の検出器を、DHPLC変異検出法で使用すること
ができる。好ましい検出器は、オンラインUV検出器で
ある。DNAフラグメントを蛍光標識または放射性標識
でタグ化する場合、それぞれ蛍光検出器または放射能検
出器を使用することができる。検出後、分離フラグメン
トを個別にビデオディスプレイ上に表示するかプリンタ
ーでプリントする。このようにして表示したフラグメン
トは、ピークまたはレーン中のバンドとして認められ
る。
【0170】C.PKD−2およびPKD−1固有領域
についてのDHPLC評価に有益な品質管理 DHPLCでヘテロ二重鎖−ホモ二重鎖混合物とホモ二
重鎖のみとを区別する化学的原理により、(1)緩衝液
の組成、(2)分析時のオーブン温度、(3)カラム条
件、および(4)サンプル注入時のシステム条件に非常
に感度の高い方法が得られる。溶出パターンのゆらぎは
正常であり、アンプリコンのサイズおよび配列ならびに
分析時の特異的DHPLC条件に依存して変化する。当
業者は、例えば、DHPLC装置の製造者から提供され
たプロトコールにしたがって得られた溶出パターンを解
釈する知識をもっている。しかし、ゆらぎ範囲の限度
は、条件がDNA変異体を有効に分離すると予想される
範囲内であることを確実にするのを援助するのに適切で
ある。以下の品質管理コントロール溶液は、一貫したア
ッセイパフォーマンスを確実にするための各分析条件に
ついて確立した有用な例である。
【0171】1.無DNAコントロール このコントロールは、試薬および材料が患者の分析を妨
害し得る特定のシグナルを発生しないことを示す。いく
つかの実施形態では、コントロールは、例えば組織から
抽出したDNAを含むサンプルに同一の処理をした無D
NAサンプルにおいて最小のシグナル(正常なコントロ
ールピークの高さの10%未満)を示さなければならな
い。分析システムのハードウェアの全てが各サンプル分
析で再利用され、DHPLC分析は成分の分離であるの
で、正常なコントロールの10%までのピークの高さが
許容される。異なる配列との実際の汚染により、10%
汚染物質を検出すると予想されない配列決定に反射して
惹起される偽りの正のDHPLCパターン差が得られ
る。配列の相違が検出される事象では、フラグメント
は、結果を確認するためにPCRポイントから繰り返さ
れる。同様に、正常配列の10%の事実上正の汚染は、
存在するDNAの50%が既に正常であるので、パター
ンを有意に変化させないと予想される。非常にわずかな
パターンの変化が10%過剰によって混乱されるまれな
場合は、注入中の正常なDNAは、感度の推定値が78
〜96%である。しかし、アンプリコンを分析するたび
にDNAシグナルが認められないことは、全体的および
持続的なDNAシグナルの消滅を最小にするかなくすた
めに分析条件を変化させる必要がある。
【0172】2.正常コントロール 1つの実施形態では、正常コントロールのパターンは、
歴史的パターンに一致しなければならない。確立された
パターンとの一致は、許容可能な増幅、保持時間、ピー
クの高さ、およびピークの形状を示す。したがって、実
施例においてPCRおよびDHPLC条件(機械および
緩衝液など)を行う。確立された正常コントロールパタ
ーンと比較したところ、ホモログまたは他の非特異的増
幅シグナルは存在しない。
【0173】3.ポジティブコントロール ポジティブコントロールは、確立されたDHPLC分析
条件(ポジティブコントロールのヘテロ二重鎖を検出す
る)が分析時に有効であることを示すために使用された
「DHPLC分析条件のコントロール」である。正常な
コントロールと区別され、歴史的パターンと一致するポ
ジティブコントロールパターンは、許容可能な保持時
間、ピークの高さ、ピークの形状、およびパターンを示
す。ヘテロ二重鎖検出は、各フラグメントに至適な特異
的DHPLC分析条件が患者分析時に有効であることを
示す。コントロールは必ずしもPKDポジティブシグナ
ルではないことに留意することが重要である。各83P
KDフラグメントについての特異的PKDポジティブサ
ンプルは利用できない。存在しない場合、分析時に適切
な分析条件を示すポジティブ指標として別のヘテロ二重
鎖(ポジティブおよび正常コントロール)を使用する。
【0174】4.さらなるポジティブコントロール さらなるポジティブコントロールにより、この特異的変
異についての歴史的パターンに一致するパターンが得ら
れ、これを使用して非常に共通する多型を分離すること
ができる。一般に、特異的DNA変異体からサンプルか
らサンプルに高度に再生可能な固有の性質のヘテロ二重
鎖パターンが得られる。確立されたパターンに一致する
パターンは、許容可能な保持時間、ピークの高さ、ピー
クの形状、およびパターンを示す。特異的ヘテロ二重鎖
パターンは、このDNA変異体に至適な特異的DHPL
C分析条件が患者の分析の際に有効であるので、これに
適合する患者のパターンを共通の多型を有すると見なす
ことができることを示す。共通多型についてのこの任意
選択的な分離法は、固有のアンプリコンおよび変異体に
非常に特異的であり、変異体に対して固有の適切な確認
研究に依存する。
【0175】D.DHPLC結果の分析 DHPLCが分離プロセスであるので、正常コントロー
ルと異なるシグナルを有する任意の検体(例えば、DN
A、細胞溶解物、または組織サンプル)を、潜在的なポ
ジティブと見なし、環境に依存して利用可能ないくつか
のオプションのうちの1つで処理すべきである。いくつ
かの実施形態のために、弱すぎて解釈できないシグナル
(正常コントロールのピーク高さの25%未満)は、P
CRの失敗、波動輻射(wave injectio
n)の失敗、またはサンプル特有のいくつかの他の散発
的な装置の問題によって発生し得る。オプションには、
PCRポイントの反復、波動輻射(全てのコントロール
を使用)の反復、または決定的でない波動の報告、およ
び配列決定が含まれる。正常コントロールとパターンが
異なるシグナルを、ポジティブと見なし、「P」と記録
し、配列決定すべきである。正常コントロールパターン
とほんのわずか異なるシグナルを「B」と記録し、配列
決定すべきである。正常コントロールシグナルよりもは
るかに強力なシグナルを「P」と記録し、配列決定すべ
きである。患者の検体はこれらの結果のみに基づいて得
ていないことに留意のこと。使用した特異的オプション
は、アンプリコンおよびそのDHPLC動作歴ならびに
検体についての特異的環境によって変化する。
【0176】いくつかの実施形態では、DHPLCから
放出された結果のみが波動分析によって「正常」と記録
された結果である。正常と記録されるために、検体のD
HPLCパターンは、以下のQC基準によって正常なコ
ントロールと一致しなければならない。(a)ピーク
数、(b)ピークの高さ、(c)ピークパターン、
(d)保持時間、(e)ベースラインの形状。言い換え
れば、個体の検体のパターンは、妥当な推定ばらつき範
囲内で正常コントロールの外観でなければならない。必
要ならば、検証データ基準パターンを考察する。DHP
LC分離感度を、正常コントロールと実質的に異なるパ
ターンの計数によって評価した。パターンが真に正常コ
ントロールと異なると考えられる場合、疑いの余地がな
く、ポジティブと記録して配列決定に移る。特異的アン
プリコンの要件を満たし、正常コントロールと一致する
パターンを有する配列を記録し、正常とみなす。
【0177】「一致する」と判断するために使用した特
定の数値の基準には、(a)ピークがシグナル強度の局
所的最大を示すピーク数、(b)ピークの高さまたは最
大シグナル強度(通常、正常コントロールの高さの0.
5倍と2.0倍との間)、(c)ピークの保持時間(対
応する正常コントロールと比較して+/−60秒でなけ
ればならない)が含まれるが、これらに限定されない。
ピークパターンは、ピーク内の各傾斜の変化の相対的対
応ならびに複合体パターン内の各ピークの相対強度およ
び保持時間によって判断される。ベースラインパターン
は、通常、全てのサンプルにおいて滑らかで一貫してい
る。相対的に低いベースラインの変化は、ホモ二重鎖ピ
ークと有意に異なる保持時間で溶出およびおそらく融解
するヘテロ二重鎖を示し得る。各アンプリコンについて
の保持時間およびピークの高さの基準を、実施例に添付
の表に明記する。
【0178】1つの実施形態では、ピークパターン評価
は、(1)正常コントロールと同一の運転コントロール
基準を満たすサンプルシグナルと、(2)運転コントロ
ールとの相対的比較に基づいた正常コントロールと一致
するサンプルシグナルパターンとの組み合わせである。
正常コントロールパターンは、運転毎にわずかに変化す
ると予想されるにもかかわらず許容可能であるので、正
常と記録した各サンプルは、(1)正常コントロールと
同一の運転コントロール基準、(2)上記の正常コント
ロールと各患者サンプルとの比較において固有の相対コ
ントロール基準を満たす組み合わせである。患者サンプ
ルパターンのわずかな変化は正常コントロールの絶対的
運転基準と一致することが明白なようであり、運転内で
の正常と患者との相対的比較を使用すると明白である。
運転内の相対的比較は常に歴史的パターンと交換可能で
あり、正常コントロールはコントロール基準をパスし、
運転は許容されると予想される。
【0179】IX.ヘテロ二重鎖の検証 任意選択的に、同定したヘテロ二重鎖を、1つまたは複
数の制限酵素での増幅産物の消化によって検証すること
ができる。この目的に有用な制限酵素を、真のPKD遺
伝子配列とPKDホモログ配列との比較またはPKD多
型の比較によって選択する。本発明の有用な制限酵素に
より、真のPKD遺伝子およびPKDホモログについて
の区別可能なフラグメントプロフィールが作製される。
このような制限酵素の例には、PstI、StuI、X
maI、MluI、PvuII、BssHII、Fsp
I、MscI、およびBlnIが含まれるが、これらに
限定されない。有用な制限酵素はまた、正常なPKD遺
伝子および変異PKD遺伝子についての区別可能なフラ
グメントプロフィールを作製することができる。PKD
遺伝子とPKDホモログ遺伝子または正常なPKD対立
遺伝子と変異PKD対立遺伝子との単純比較によってよ
り多数の制限酵素を同定することができることが理解さ
れる。切断部位を破壊するか作製するために他方の配列
中ではなく一方の配列中に認識部位または切断部位を有
する制限酵素を、本発明の有用な制限酵素と見なすこと
ができる。核酸の制限後に変性高速液体クロマトグラフ
ィー(DHPLC)または上記の電気泳動(制限−キャ
ピラリー電気泳動を含む)における得られたフラグメン
トの分離およびフラグメントの長さまたは異なるフラグ
メントの移動度の分析を行う。
【0180】X.DHPLCによって同定されたヘテロ
二重鎖の配列決定 DHPLCによって同定された1つまたは複数の変異の
存在を示すヘテロ二重鎖を、クローン化し、増幅し、そ
して/または配列決定することができる。当該分野で公
知の任意の配列決定法を使用して、ヘテロ二重鎖を配列
決定することができる。いくつかの実施形態では、同定
されたヘテロ二重鎖を、PCR増幅用のテンプレートと
して使用し、増幅産物をSequetech Corp
oration(Mountain View、CA)
によって配列決定する。好ましい実施形態では、配列番
号3〜49を含むプライマーの1つを使用して配列決定
を行う。
【0181】いくつかの実施形態では、同定したヘテロ
二重鎖を増幅し、プラスミド(例えば、ZeroBlu
nt TOPO PCRクローニングキット、Invi
trogen、Carlsbad、CA、カタログ番号
4560−01)にクローン化後、配列決定する。PC
Rフラグメントを含むプラスミドを、当該分野で周知の
方法によって増殖させ、配列決定する。
【0182】XI.方法の臨床用途 本出願書類に記載の遺伝子試験法は、ADPKDの病因
であると報告されているスプライス連結受容体/供与体
配列を含むPKD−1またはPKD−2のコード領域の
DNAの変化の同定を目的とする。以下を医師が評価す
るために本方法を行う。
【0183】A.症状を示す個体のPKDに起因するA
DPKDの診断。 B.発症年齢または発症年齢付近の個体における1つま
たは2つの嚢胞の存在を示す超音波の結果の追跡。 C.家族歴、超音波、および他の臨床データからの決定
が好ましくないADPKD(1型および2型)の異なる
変異体の診断。 D.一旦家族にADPKD発端者が同定された場合の他
の危険性のある家族のメンバーの遺伝子カウンセリング
の決定および提供。 E.移植の場合の生存関連ドナーの適合性の決定。
【0184】XII.キット 本発明はまた、本発明の変異分析法およびPKD患者同
定法を行うためのキットを提供する。本発明の方法によ
る本発明のキットの実施形態には、第1の核酸が配列番
号3〜49およびその相補配列からなる群から選択さ
れ、第2の配列が第1の核酸と逆方向であり、第1およ
び第2の核酸が配列番号1または2の配列を含むテンプ
レート核酸のフラグメントを増幅する、少なくとも1つ
の単離した第1の核酸および少なくとも1つの単離した
第2の核酸ならびにパッケージング材料が含まれる。本
発明のキットは、DNAポリメラーゼ、テンプレート核
酸、制限酵素、コントロールオリゴヌクレオチドプライ
マー、ddNTP、PCR反応緩衝液、およびその組み
合わせからなる群から選択される少なくとも1つの成分
をさらに含み得る。試薬に加えて、本発明のキットは、
本発明の方法の実施のための取扱い説明書を含むことが
好ましい。キットは、好ましくは、ユニットコンテナに
封入し、所望の結果を得るために相互に操作するように
デザインされた予め測定した量の試薬を含み得る。
【0185】実施例 本発明を、以下の材料と方法を使用する以下の非限定的
な実施例によって例示する。
【0186】実施例1 試薬、特定の備品、および装置 A.化学薬品 以下は、PKD−1増幅およびDHPLC(WAVE)
分析で使用した化学薬品のリストである。 1%アガロース、1×TBE、臭化エチジウムを含む5
4ウェルゲル(Embitec、カタログ番号GE45
80) 2%アガロース、1×TBE、臭化エチジウムを含む5
4ウェルゲル(Embitec、カタログ番号GE45
82) 96ウェルゲル濾過ブロック(Edge Biosys
tems、カタログ番号91751) Quickstep(商標)96ウェルPCR精製キッ
ト(Edge Biosystems、カタログ番号9
9605) GeneAmp PCR緩衝液IIおよびMgCl
液を含むAmpliTaq Gold(Perkin
Elmer、カタログ番号N808−0241) rTth DNAポリメラーゼ、XL&XL緩衝液II
パック(PerkinElmer、カタログ番号N80
8−00193) TapPlus精密PCRシステム(Stratage
ne、カタログ番号600211) ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma、カタ
ログ番号D−2650) Ready−Load 100bpDNAラダーまたは
等価物(GibcoBRL、カタログ番号10380−
012) Ready−Load 1kbDNAラダーまたは等価
物(Gibco BRL、1800−828−668
6、カタログ番号10380−010) BigDyeターミネーターレディ反応キット(Per
kin Elmer、カタログ番号4303150) ゲル濾過カートリッジ(Edge Biosystem
s、カタログ番号42453) Long Ranger Singel(商標)(FM
C BioProducts、カタログ番号50691
または50693) オリゴヌクレオチド(Operon Technolo
gies,Inc.) WAVE変異スタンダード(209bp)(カタログ番
号560077)(180μl) アセトニトリル−HPLCグレード(VWR、カタログ
番号BJ015−1) HPLCグレード水(VWR、カタログ番号BJ365
−4) 酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(Trans
genomic、カタログ番号SP5890)
【0187】B.試薬および溶液 10μMのオリゴヌクレオチドプライマー:TE緩衝液
に溶解した10μMの作業アリコートのPCRプライマ
ーをPre−PCR冷却装置に4℃で保存すべきであ
り、配列決定プライマー作業アリコートを、Post−
PCR冷却装置に4℃で保存すべきである。
【0188】溶液X−127:アップグレードブルーデ
キストランの50mM EDTA(pH=8.0)溶液 15mlの滅菌遠心分離用コニカルチューブ中で0.5
mlの50mM EDTA(pH=8.0)(溶液X−
35)、500mgのブルーデキストラン、AND9.
5mlの高圧蒸気滅菌し、濾過滅菌したDiHOを組
み合わせる。ボルテックスによって溶液を完全に混合す
る。
【0189】溶液X−126:アップグレードゲルロー
ディング緩衝液:1.5mlの滅菌微量遠心分離チュー
ブ中で、200μlの脱イオンホルムアミドおよび40
μlのアップグレードブルーデキストランの50mM
EDTA溶液(溶液X−127)を組み合わせる。完全
にボルテックスする。
【0190】 WAVE溶液A:溶液A(0.025%ACN) 2Lの調製物:100mlイオン対合剤(TEAA) 500μlアセトニトリル(ACN) HPLCグレート水で2Lにする。 WAVE溶液B:溶液B(25%ACN) 2Lの調製物:100mlイオン対合剤(TEAA) 500mlアセトニトリル(ACN) HPLCグレート水で2Lにする。 WAVEシリンジ洗浄溶液:シリンジ洗浄液(8%ACN) 2Lの調製物:160mlアセトニトリル(ACN) HPLCグレート水で2Lにする。 WAVE溶液D:溶液D(75%ACN) 2Lの調製物:500mlHPLCグレート水 アセトニトリル(ACN)で2Lにする。
【0191】C.装置および備品
【表5】
【0192】実施例2.手順段階I:患者検体由来のDNAおよび/またはRNAの
調製 Puregene(商品名)DNA抽出キットを使用し
て、全血またはリンパ球からDNAを抽出した。これら
の試薬を使用して抽出したDNAは、アッセイに特異的
な条件下で首尾よくPCR増幅されるはずである。プロ
トコール中で特定したアッセイの実行および確認済みの
ポジティブDNAコントロールを用いて得られた結果と
の比較によってこれを試験する。抽出したDNAを定量
し、260/280比は1.4以上得ある。より低い比
のサンプルは、DNAの品質が不十分であり、PCR標
準を満たさないことを示す。アッセイの最終結果が解釈
されない場合、サンプルを再抽出すべきである。
【0193】段階II:PCRによるDNAの増幅 PCR反応混合物およびサイクリングパラメータ(例え
ば、PKD−1遺伝子のエクソン1)を、表5に例示の
ように調整する。PCR条件を同様に調整するが、他の
エクソンの特異的且つ行こうな増幅について至適化す
る。
【0194】
【表6−1】
【0195】1つのワックスビーズを各ウェルに添加
し、80℃で5分間サーマルサイクラー中でインキュベ
ートしてワックスを溶かし、25℃でさらに5分間イン
キュベートし、さらなる操作のために氷上に置く。
【0196】
【表6−2】
【0197】
【表6−3】
【0198】
【表7】
【0199】
【表8】
【0200】PCR増幅フラグメントを、確認済みのポ
ジティブコントロールDNAコントロールと、サイズ、
シグナル強度、および移動パターンについて比較するこ
とができる。PCR増幅フラグメントのサイズを、ゲル
上の分子量マーカー(DNAMASS(商標)Ladd
er−Gibco BRL)との比較によって決定す
る。範囲の狭いDNA分子量ラダーにより、臭化エチジ
ウムでのゲルの染色により二本鎖(100〜2000b
p)DNAの6つのバンドが得られる。
【0201】段階III:PCR産物のDHPLC分析 PCR増幅産物によって形成されたヘテロ二重鎖を、T
ransgenomic,Inc.(Omaha、NE
68164)のWAVE核酸フラグメント分析システ
ムを使用して分析する。
【0202】段階IV:サイクル配列決定 表9および10は、本発明の1つの実施形態で使用した
配列決定条件の例を提供する。
【0203】
【表9】
【0204】
【表10】
【0205】実施例3.結果のまとめ 1つの実験では、PKD−1遺伝子のエクソン1〜34
中の変異の検出を、以下のサイズのDNAフラグメント
を増幅するための8つの異なる第1ラウンドのPCR反
応中の8セットのオリゴヌクレオチドプライマーの使用
によって行った。a)LR1は2.2kbであり、エク
ソン1を含む、b)LR2は4.6kbであり、エクソ
ン2〜7を含む、c)LR3は4.2kbであり、エク
ソン8〜12を含む、d)LR4は4.4kbであり、
エクソン13〜15を含む、e)LR5は3.4kbで
あり、エクソン15(3’末端)〜21を含む、f)L
R6は0.3kbであり、エクソン22を含む、g)L
R7は4.2kbであり、エクソン23〜28を含む、
h)LR8は5.8kbであり、エクソン29〜34を
含む。第1ラウンドの増幅由来の増幅産物を1:10
または1:10に連続希釈して、ゲノム汚染物を除去
し、その後第2ラウンドのネスト化PCRでのテンプレ
ートとして使用した。ネスト化PCR産物をヘテロ二重
鎖にし、DHPLCにて配列の変化についてスクリーニ
ングした。各フラグメントを、アンプリコンに特異的な
温度およびアセトニトリル勾配を使用して正常およびポ
ジティブコントロールに対して分析した。DHPLC分
析によってポジティブな任意の試験サンプルを、精製お
よび配列決定した。サイクル配列決定産物を、ABI3
77自動化シークエンサーで分離し、結果を、配列決定
ソフトウェアの分類を使用して分析した。表11〜12
および図1〜13は、本発明のいくつかの実施形態の結
果および手順を示す。
【0206】
【表11】
【0207】
【表12】
【0208】他の実施形態 上記の実施例は、本発明を構築および実施した本発明者
らによって実施および熟慮した実験を示す。これらの実
施例には、本発明の実施技術の通告、およびその有用性
の証明のために使用する技術の開示が含まれると考えら
れる。本明細書中に開示の技術および実施形態は好まし
い実施形態のみであり、一般に、多数の等価な方法およ
び技術を使用して同一の結果を達成することができるこ
とが当業者に認識される。図面および表を含む全ての出
願書類、特許書類、および明細書で参照された文献は、
その全体を参照することにより本明細書中に組み込むも
のとする。
【0209】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Athena Diagnostics <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENETIC ANALYSIS OF POLYCYSTIC KIDNE Y DISEASE <130> 1133/2002 <140> US 10/083,246 <141> 2002-02-26 <160> 168 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 14136 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcactgcagc gccagcgtcc gagcgggcgg ccgagctccc ggagcggcct ggccccgagc 60 cccgagcggg cgtcgctcag cagcaggtcg cggccgcgca gccccatcca gccccgcgcc 120 cgccatgccg tccgcgggcc ccgcctgagc tgcggtctcc gcgcgcgggc gggcctgggg 180 acggcggggc catgcgcgcg ctgccctaac gatgccgccc gccgcgcccg cccgcctggc 240 gctggccctg ggcctgggcc tgtggctcgg ggcgctggcg gggggccccg ggcgcggctg 300 cgggccctgc gagcccccct gcctctgcgg cccagcgccc ggcgccgcct gccgcgtcaa 360 ctgctcgggc cgcgggctgc ggacgctcgg tcccgcgctg cgcatccccg cggacgccac 420 agcgctagac gtctcccaca acctgctccg ggcgctggac gttgggctcc tggcgaacct 480 ctcggcgctg gcagagctgg atataagcaa caacaagatt tctacgttag aagaaggaat 540 atttgctaat ttatttaatt taagtgaaat aaacctgagt gggaacccgt ttgagtgtga 600 ctgtggcctg gcgtggctgc cgcgatgggc ggaggagcag caggtgcggg tggtgcagcc 660 cgaggcagcc acgtgtgctg ggcctggctc cctggctggc cagcctctgc ttggcatccc 720 cttgctggac agtggctgtg gtgaggagta tgtcgcctgc ctccctgaca acagctcagg 780 caccgtggca gcagtgtcct tttcagctgc ccacgaaggc ctgcttcagc cagaggcctg 840 cagcgccttc tgcttctcca ccggccaggg cctcgcagcc ctctcggagc agggctggtg 900 cctgtgtggg gcggcccagc cctccagtgc ctcctttgcc tgcctgtccc tctgctccgg 960 ccccccgcca cctcctgccc ccacctgtag gggccccacc ctcctccagc acgtcttccc 1020 tgcctcccca ggggccaccc tggtggggcc ccacggacct ctggcctctg gccagctagc 1080 agccttccac atcgctgccc cgctccctgt cactgccaca cgctgggact tcggagacgg 1140 ctccgccgag gtggatgccg ctgggccggc tgcctcgcat cgctatgtgc tgcctgggcg 1200 ctatcacgtg acggccgtgc tggccctggg ggccggctca gccctgctgg ggacagacgt 1260 gcaggtggaa gcggcacctg ccgccctgga gctcgtgtgc ccgtcctcgg tgcagagtga 1320 cgagagcctt gacctcagca tccagaaccg cggtggttca ggcctggagg ccgcctacag 1380 catcgtggcc ctgggcgagg agccggcccg agcggtgcac ccgctctgcc cctcggacac 1440 ggagatcttc cctggcaacg ggcactgcta ccgcctggtg gtggagaagg cggcctggct 1500 gcaggcgcag gagcagtgtc aggcctgggc cggggccgcc ctggcaatgg tggacagtcc 1560 cgccgtgcag cgcttcctgg tctcccgggt caccaggagc ctagacgtgt ggatcggctt 1620 ctcgactgtg cagggggtgg aggtgggccc agcgccgcag ggcgaggcct tcagcctgga 1680 gagctgccag aactggctgc ccggggagcc acacccagcc acagccgagc actgcgtccg 1740 gctcgggccc accgggtggt gtaacaccga cctgtgctca gcgccgcaca gctacgtctg 1800 cgagctgcag cccggaggcc cagtgcagga tgccgagaac ctcctcgtgg gagcgcccag 1860 tggggacctg cagggacccc tgacgcctct ggcacagcag gacggcctct cagccccgca 1920 cgagcccgtg gaggtcatgg tattcccggg cctgcgtctg agccgtgaag ccttcctcac 1980 cacggccgaa tttgggaccc aggagctccg gcggcccgcc cagctgcggc tgcaggtgta 2040 ccggctcctc agcacagcag ggaccccgga gaacggcagc gagcctgaga gcaggtcccc 2100 ggacaacagg acccagctgg cccccgcgtg catgccaggg ggacgctggt gccctggagc 2160 caacatctgc ttgccgctgg acgcctcttg ccacccccag gcctgcgcca atggctgcac 2220 gtcagggcca gggctacccg gggcccccta tgcgctatgg agagagttcc tcttctccgt 2280 tgccgcgggg ccccccgcgc agtactcggt caccctccac ggccaggatg tcctcatgct 2340 ccctggtgac ctcgttggct tgcagcacga cgctggccct ggcgccctcc tgcactgctc 2400 gccggctccc ggccaccctg gtccccaggc cccgtacctc tccgccaacg cctcgtcatg 2460 gctgccccac ttgccagccc agctggaggg cacttgggcc tgccctgcct gtgccctgcg 2520 gctgcttgca gccacggaac agctcaccgt gctgctgggc ttgaggccca accctggact 2580 gcggatgcct gggcgctatg aggtccgggc agaggtgggc aatggcgtgt ccaggcacaa 2640 cctctcctgc agctttgacg tggtctcccc agtggctggg ctgcgggtca tctaccctgc 2700 cccccgcgac ggccgcctct acgtgcccac caacggctca gccttggtgc tccaggtgga 2760 ctctggtgcc aacgccacgg ccacggctcg ctggcctggg ggcagtgtca gcgcccgctt 2820 tgagaatgtc tgccctgccc tggtggccac cttcgtgccc ggctgcccct gggagaccaa 2880 cgataccctg ttctcagtgg tagcactgcc gtggctcagt gagggggagc acgtggtgga 2940 cgtggtggtg gaaaacagcg ccagccgggc caacctcagc ctgcgggtga cggcggagga 3000 gcccatctgt ggcctccgcg ccacgcccag ccccgaggcc cgtgtactgc agggagtcct 3060 agtgaggtac agccccgtgg tggaggccgg ctcggacatg gtcttccggt ggaccatcaa 3120 cgacaagcag tccctgacct tccagaacgt ggtcttcaat gtcatttatc agagcgcggc 3180 ggtcttcaag ctctcactga cggcctccaa ccacgtgagc aacgtcaccg tgaactacaa 3240 cgtaaccgtg gagcggatga acaggatgca gggtctgcag gtctccacag tgccggccgt 3300 gctgtccccc aatgccacgc tagcactgac ggcgggcgtg ctggtggact cggccgtgga 3360 ggtggccttc ctgtggaact ttggggatgg ggagcaggcc ctccaccagt tccagcctcc 3420 gtacaacgag tccttcccgg ttccagaccc ctcggtggcc caggtgctgg tggagcacaa 3480 tgtcatgcac acctacgctg ccccaggtga gtacctcctg accgtgctgg catctaatgc 3540 cttcgagaac ctgacgcagc aggtgcctgt gagcgtgcgc gcctccctgc cctccgtggc 3600 tgtgggtgtg agtgacggcg tcctggtggc cggccggccc gtcaccttct acccgcaccc 3660 gctgccctcg cctgggggtg ttctttacac gtgggacttc ggggacggct cccctgtcct 3720 gacccagagc cagccggctg ccaaccacac ctatgcctcg aggggcacct accacgtgcg 3780 cctggaggtc aacaacacgg tgagcggtgc ggcggcccag gcggatgtgc gcgtctttga 3840 ggagctccgc ggactcagcg tggacatgag cctggccgtg gagcagggcg cccccgtggt 3900 ggtcagcgcc gcggtgcaga cgggcgacaa catcacgtgg accttcgaca tgggggacgg 3960 caccgtgctg tcgggcccgg aggcaacagt ggagcatgtg tacctgcggg cacagaactg 4020 cacagtgacc gtgggtgcgg ccagccccgc cggccacctg gcccggagcc tgcacgtgct 4080 ggtcttcgtc ctggaggtgc tgcgcgttga acccgccgcc tgcatcccca cgcagcctga 4140 cgcgcggctc acggcctacg tcaccgggaa cccggcccac tacctcttcg actggacctt 4200 cggggatggc tcctccaaca cgaccgtgcg ggggtgcccg acggtgacac acaacttcac 4260 gcggagcggc acgttccccc tggcgctggt gctgtccagc cgcgtgaaca gggcgcatta 4320 cttcaccagc atctgcgtgg agccagaggt gggcaacgtc accctgcagc cagagaggca 4380 gtttgtgcag ctcggggacg aggcctggct ggtggcatgt gcctggcccc cgttccccta 4440 ccgctacacc tgggactttg gcaccgagga agccgccccc acccgtgcca ggggccctga 4500 ggtgacgttc atctaccgag acccaggctc ctatcttgtg acagtcaccg cgtccaacaa 4560 catctctgct gccaatgact cagccctggt ggaggtgcag gagcccgtgc tggtcaccag 4620 catcaaggtc aatggctccc ttgggctgga gctgcagcag ccgtacctgt tctctgctgt 4680 gggccgtggg cgccccgcca gctacctgtg ggatctgggg gacggtgggt ggctcgaggg 4740 tccggaggtc acccacgctt acaacagcac aggtgacttc accgttaggg tggccggctg 4800 gaatgaggtg agccgcagcg aggcctggct caatgtgacg gtgaagcggc gcgtgcgggg 4860 gctcgtcgtc aatgcaagcc gcacggtggt gcccctgaat gggagcgtga gcttcagcac 4920 gtcgctggag gccggcagtg atgtgcgcta ttcctgggtg ctctgtgacc gctgcacgcc 4980 catccctggg ggtcctacca tctcttacac cttccgctcc gtgggcacct tcaatatcat 5040 cgtcacggct gagaacgagg tgggctccgc ccaggacagc atcttcgtct atgtcctgca 5100 gctcatagag gggctgcagg tggtgggcgg tggccgctac ttccccacca accacacggt 5160 acagctgcag gccgtggtta gggatggcac caacgtctcc tacagctgga ctgcctggag 5220 ggacaggggc ccggccctgg ccggcagcgg caaaggcttc tcgctcaccg tgctcgaggc 5280 cggcacctac catgtgcagc tgcgggccac caacatgctg ggcagcgcct gggccgactg 5340 caccatggac ttcgtggagc ctgtggggtg gctgatggtg accgcctccc cgaacccagc 5400 tgccgtcaac acaagcgtca ccctcagtgc cgagctggct ggtggcagtg gtgtcgtata 5460 cacttggtcc ttggaggagg ggctgagctg ggagacctcc gagccattta ccacccatag 5520 cttccccaca cccggcctgc acttggtcac catgacggca gggaacccgc tgggctcagc 5580 caacgccacc gtggaagtgg atgtgcaggt gcctgtgagt ggcctcagca tcagggccag 5640 cgagcccgga ggcagcttcg tggcggccgg gtcctctgtg cccttttggg ggcagctggc 5700 cacgggcacc aatgtgagct ggtgctgggc tgtgcccggc ggcagcagca agcgtggccc 5760 tcatgtcacc atggtcttcc cggatgctgg caccttctcc atccggctca atgcctccaa 5820 cgcagtcagc tgggtctcag ccacgtacaa cctcacggcg gaggagccca tcgtgggcct 5880 ggtgctgtgg gccagcagca aggtggtggc gcccgggcag ctggtccatt ttcagatcct 5940 gctggctgcc ggctcagctg tcaccttccg cctgcaggtc ggcggggcca accccgaggt 6000 gctccccggg ccccgtttct cccacagctt cccccgcgtc ggagaccacg tggtgagcgt 6060 gcggggcaaa aaccacgtga gctgggccca ggcgcaggtg cgcatcgtgg tgctggaggc 6120 cgtgagtggg ctgcagatgc ccaactgctg cgagcctggc atcgccacgg gcactgagag 6180 gaacttcaca gcccgcgtgc agcgcggctc tcgggtcgcc tacgcctggt acttctcgct 6240 gcagaaggtc cagggcgact cgctggtcat cctgtcgggc cgcgacgtca cctacacgcc 6300 cgtggccgcg gggctgttgg agatccaggt gcgcgccttc aacgccctgg gcagtgagaa 6360 ccgcacgctg gtgctggagg ttcaggacgc cgtccagtat gtggccctgc agagcggccc 6420 ctgcttcacc aaccgctcgg cgcagtttga ggccgccacc agccccagcc cccggcgtgt 6480 ggcctaccac tgggactttg gggatgggtc gccagggcag gacacagatg agcccagggc 6540 cgagcactcc tacctgaggc ctggggacta ccgcgtgcag gtgaacgcct ccaacctggt 6600 gagcttcttc gtggcgcagg ccacggtgac cgtccaggtg ctggcctgcc gggagccgga 6660 ggtggacgtg gtcctgcccc tgcaggtgct gatgcggcga tcacagcgca actacttgga 6720 ggcccacgtt gacctgcgcg actgcgtcac ctaccagact gagtaccgct gggaggtgta 6780 tcgcaccgcc agctgccagc ggccggggcg cccagcgcgt gtggccctgc ccggcgtgga 6840 cgtgagccgg cctcggctgg tgctgccgcg gctggcgctg cctgtggggc actactgctt 6900 tgtgtttgtc gtgtcatttg gggacacgcc actgacacag agcatccagg ccaatgtgac 6960 ggtggccccc gagcgcctgg tgcccatcat tgagggtggc tcataccgcg tgtggtcaga 7020 cacacgggac ctggtgctgg atgggagcga gtcctacgac cccaacctgg aggacggcga 7080 ccagacgccg ctcagtttcc actgggcctg tgtggcttcg acacagaggg aggctggcgg 7140 gtgtgcgctg aactttgggc cccgcgggag cagcacggtc accattccac gggagcggct 7200 ggcggctggc gtggagtaca ccttcagcct gaccgtgtgg aaggccggcc gcaaggagga 7260 ggccaccaac cagacggtgc tgatccggag tggccgggtg cccattgtgt ccttggagtg 7320 tgtgtcctgc aaggcacagg ccgtgtacga agtgagccgc agctcctacg tgtacttgga 7380 gggccgctgc ctcaattgca gcagcggctc caagcgaggg cggtgggctg cacgtacgtt 7440 cagcaacaag acgctggtgc tggatgagac caccacatcc acgggcagtg caggcatgcg 7500 actggtgctg cggcggggcg tgctgcggga cggcgaggga tacaccttca cgctcacggt 7560 gctgggccgc tctggcgagg aggagggctg cgcctccatc cgcctgtccc ccaaccgccc 7620 gccgctgggg ggctcttgcc gcctcttccc actgggcgct gtgcacgccc tcaccaccaa 7680 ggtgcacttc gaatgcacgg gctggcatga cgcggaggat gctggcgccc cgctggtgta 7740 cgccctgctg ctgcggcgct gtcgccaggg ccactgcgag gagttctgtg tctacaaggg 7800 cagcctctcc agctacggag ccgtgctgcc cccgggtttc aggccacact tcgaggtggg 7860 cctggccgtg gtggtgcagg accagctggg agccgctgtg gtcgccctca acaggtcttt 7920 ggccatcacc ctcccagagc ccaacggcag cgcaacgggg ctcacagtct ggctgcacgg 7980 gctcaccgct agtgtgctcc cagggctgct gcggcaggcc gatccccagc acgtcatcga 8040 gtactcgttg gccctggtca ccgtgctgaa cgagtacgag cgggccctgg acgtggcggc 8100 agagcccaag cacgagcggc agcaccgagc ccagatacgc aagaacatca cggagactct 8160 ggtgtccctg agggtccaca ctgtggatga catccagcag atcgctgctg cgctggccca 8220 gtgcatgggg cccagcaggg agctcgtatg ccgctcgtgc ctgaagcaga cgctgcacaa 8280 gctggaggcc atgatgctca tcctgcaggc agagaccacc gcgggcaccg tgacgcccac 8340 cgccatcgga gacagcatcc tcaacatcac aggagacctc atccacctgg ccagctcgga 8400 cgtgcgggca ccacagccct cagagctggg agccgagtca ccatctcgga tggtggcgtc 8460 ccaggcctac aacctgacct ctgccctcat gcgcatcctc atgcgctccc gcgtgctcaa 8520 cgaggagccc ctgacgctgg cgggcgagga gatcgtggcc cagggcaagc gctcggaccc 8580 gcggagcctg ctgtgctatg gcggcgcccc agggcctggc tgccacttct ccatccccga 8640 ggctttcagc ggggccctgg ccaacctcag tgacgtggtg cagctcatct ttctggtgga 8700 ctccaatccc tttccctttg gctatatcag caactacacc gtctccacca aggtggcctc 8760 gatggcattc cagacacagg ccggcgccca gatccccatc gagcggctgg cctcagagcg 8820 cgccatcacc gtgaaggtgc ccaacaactc ggactgggct gcccggggcc accgcagctc 8880 cgccaactcc gccaactccg ttgtggtcca gccccaggcc tccgtcggtg ctgtggtcac 8940 cctggacagc agcaaccctg cggccgggct gcatctgcag ctcaactata cgctgctgga 9000 cggccactac ctgtctgagg aacctgagcc ctacctggca gtctacctac actcggagcc 9060 ccggcccaat gagcacaact gctcggctag caggaggatc cgcccagagt cactccaggg 9120 tgctgaccac cggccctaca ccttcttcat ttccccgggg agcagagacc cagcggggag 9180 ttaccatctg aacctctcca gccacttccg ctggtcggcg ctgcaggtgt ccgtgggcct 9240 gtacacgtcc ctgtgccagt acttcagcga ggaggacatg gtgtggcgga cagaggggct 9300 gctgcccctg gaggagacct cgccccgcca ggccgtctgc ctcacccgcc acctcaccgc 9360 cttcggcgcc agcctcttcg tgcccccaag ccatgtccgc tttgtgtttc ctgagccgac 9420 agcggatgta aactacatcg tcatgctgac atgtgctgtg tgcctggtga cctacatggt 9480 catggccgcc atcctgcaca agctggacca gttggatgcc agccggggcc gcgccatccc 9540 tttctgtggg cagcggggcc gcttcaagta cgagatcctc gtcaagacag gctggggccg 9600 gggctcaggt accacggccc acgtgggcat catgctgtat ggggtggaca gccggagcgg 9660 ccaccggcac ctggacggcg acagagcctt ccaccgcaac agcctggaca tcttccggat 9720 cgccaccccg cacagcctgg gtagcgtgtg gaagatccga gtgtggcacg acaacaaagg 9780 gctcagccct gcctggttcc tgcagcacgt catcgtcagg gacctgcaga cggcacgcag 9840 cgccttcttc ctggtcaatg actggctttc ggtggagacg gaggccaacg ggggcctggt 9900 ggagaaggag gtgctggccg cgagcgacgc agcccttttg cgcttccggc gcctgctggt 9960 ggctgagctg cagcgtggct tctttgacaa gcacatctgg ctctccatat gggaccggcc 10020 gcctcgtagc cgtttcactc gcatccagag ggccacctgc tgcgttctcc tcatctgcct 10080 cttcctgggc gccaacgccg tgtggtacgg ggctgttggc gactctgcct acagcacggg 10140 gcatgtgtcc aggctgagcc cgctgagcgt cgacacagtc gctgttggcc tggtgtccag 10200 cgtggttgtc tatcccgtct acctggccat cctttttctc ttccggatgt cccggagcaa 10260 ggtggctggg agcccgagcc ccacacctgc cgggcagcag gtgctggaca tcgacagctg 10320 cctggactcg tccgtgctgg acagctcctt cctcacgttc tcaggcctcc acgctgaggc 10380 ctttgttgga cagatgaaga gtgacttgtt tctggatgat tctaagagtc tggtgtgctg 10440 gccctccggc gagggaacgc tcagttggcc ggacctgctc agtgacccgt ccattgtggg 10500 tagcaatctg cggcagctgg cacggggcca ggcgggccat gggctgggcc cagaggagga 10560 cggcttctcc ctggccagcc cctactcgcc tgccaaatcc ttctcagcat cagatgaaga 10620 cctgatccag caggtccttg ccgagggggt cagcagccca gcccctaccc aagacaccca 10680 catggaaacg gacctgctca gcagcctgtc cagcactcct ggggagaaga cagagacgct 10740 ggcgctgcag aggctggggg agctggggcc acccagccca ggcctgaact gggaacagcc 10800 ccaggcagcg aggctgtcca ggacaggact ggtggagggt ctgcggaagc gcctgctgcc 10860 ggcctggtgt gcctccctgg cccacgggct cagcctgctc ctggtggctg tggctgtggc 10920 tgtctcaggg tgggtgggtg cgagcttccc cccgggcgtg agtgttgcgt ggctcctgtc 10980 cagcagcgcc agcttcctgg cctcattcct cggctgggag ccactgaagg tcttgctgga 11040 agccctgtac ttctcactgg tggccaagcg gctgcacccg gatgaagatg acaccctggt 11100 agagagcccg gctgtgacgc ctgtgagcgc acgtgtgccc cgcgtacggc caccccacgg 11160 ctttgcactc ttcctggcca aggaagaagc ccgcaaggtc aagaggctac atggcatgct 11220 gcggagcctc ctggtgtaca tgctttttct gctggtgacc ctgctggcca gctatgggga 11280 tgcctcatgc catgggcacg cctaccgtct gcaaagcgcc atcaagcagg agctgcacag 11340 ccgggccttc ctggccatca cgcggtctga ggagctctgg ccatggatgg cccacgtgct 11400 gctgccctac gtccacggga accagtccag cccagagctg gggcccccac ggctgcggca 11460 ggtgcggctg caggaagcac tctacccaga ccctcccggc cccagggtcc acacgtgctc 11520 ggccgcagga ggcttcagca ccagcgatta cgacgttggc tgggagagtc ctcacaatgg 11580 ctcggggacg tgggcctatt cagcgccgga tctgctgggg gcatggtcct ggggctcctg 11640 tgccgtgtat gacagcgggg gctacgtgca ggagctgggc ctgagcctgg aggagagccg 11700 cgaccggctg cgcttcctgc agctgcacaa ctggctggac aacaggagcc gcgctgtgtt 11760 cctggagctc acgcgctaca gcccggccgt ggggctgcac gccgccgtca cgctgcgcct 11820 cgagttcccg gcggccggcc gcgccctggc cgccctcagc gtccgcccct ttgcgctgcg 11880 ccgcctcagc gcgggcctct cgctgcctct gctcacctcg gtgtgcctgc tgctgttcgc 11940 cgtgcacttc gccgtggccg aggcccgtac ttggcacagg gaagggcgct ggcgcgtgct 12000 gcggctcgga gcctgggcgc ggtggctgct ggtggcgctg acggcggcca cggcactggt 12060 acgcctcgcc cagctgggtg ccgctgaccg ccagtggacc cgtttcgtgc gcggccgccc 12120 gcgccgcttc actagcttcg accaggtggc gcagctgagc tccgcagccc gtggcctggc 12180 ggcctcgctg ctcttcctgc ttttggtcaa ggctgcccag cagctacgct tcgtgcgcca 12240 gtggtccgtc tttggcaaga cattatgccg agctctgcca gagctcctgg gggtcacctt 12300 gggcctggtg gtgctcgggg tagcctacgc ccagctggcc atcctgctcg tgtcttcctg 12360 tgtggactcc ctctggagcg tggcccaggc cctgttggtg ctgtgccctg ggactgggct 12420 ctctaccctg tgtcctgccg agtcctggca cctgtcaccc ctgctgtgtg tggggctctg 12480 ggcactgcgg ctgtggggcg ccctacggct gggggctgtt attctccgct ggcgctacca 12540 cgccttgcgt ggagagctgt accggccggc ctgggagccc caggactacg agatggtgga 12600 gttgttcctg cgcaggctgc gcctctggat gggcctcagc aaggtcaagg agttccgcca 12660 caaagtccgc tttgaaggga tggagccgct gccctctcgc tcctccaggg gctccaaggt 12720 atccccggat gtgcccccac ccagcgctgg ctccgatgcc tcgcacccct ccacctcctc 12780 cagccagctg gatgggctga gcgtgagcct gggccggctg gggacaaggt gtgagcctga 12840 gccctcccgc ctccaagccg tgttcgaggc cctgctcacc cagtttgacc gactcaacca 12900 ggccacagag gacgtctacc agctggagca gcagctgcac agcctgcaag gccgcaggag 12960 cagccgggcg cccgccggat cttcccgtgg cccatccccg ggcctgcggc cagcactgcc 13020 cagccgcctt gcccgggcca gtcggggtgt ggacctggcc actggcccca gcaggacacc 13080 ccttcgggcc aagaacaagg tccaccccag cagcacttag tcctccttcc tggcgggggt 13140 gggccgtgga gtcggagtgg acaccgctca gtattacttt ctgccgctgt caaggccgag 13200 ggccaggcag aatggctgca cgtaggttcc ccagagagca ggcaggggca tctgtctgtc 13260 tgtgggcttc agcactttaa agaggctgtg tggccaacca ggacccaggg tcccctcccc 13320 agctcccttg ggaaggacac agcagtattg gacggtttct agcctctgag atgctaattt 13380 atttccccga gtcctcaggt acagcgggct gtgcccggcc ccaccccctg ggcagatgtc 13440 ccccactgct aaggctgctg gcttcaggga gggttagcct gcaccgccgc caccctgccc 13500 ctaagttatt acctctccag ttcctaccgt actccctgca ccgtctcact gtgtgtctcg 13560 tgtcagtaat ttatatggtg ttaaaatgtg tatatttttg tatgtcacta ttttcactag 13620 ggctgagggg cctgcgccca gagctggcct cccccaacac ctgctgcgct tggtaggtgt 13680 ggtggcgtta tggcagcccg gctgctgctt ggatgcgagc ttggccttgg gccggtgctg 13740 ggggcacagc tgtctgccag gcactctcat caccccagag gccttgtcat cctcccttgc 13800 cccaggccag gtagcaagag agcagcgccc aggcctgctg gcatcaggtc tgggcaagta 13860 gcaggactag gcatgtcaga ggaccccagg gtggttagag gaaaagactc ctcctggggg 13920 ctggctccca gggtggagga aggtgactgt gtgtgtgtgt gtgtgcgcgc gcgacgcgcg 13980 agtgtgctgt atggcccagg cagcctcaag gccctcggag ctggctgtgc ctgcttctgt 14040 gtaccacttc tgtgggcatg gccgcttcta gagcctcgac acccccccaa cccccgcacc 14100 aagcagacaa agtcaataaa agagctgtct gactgc 14136 <210> 2 <211> 6749 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6749) <223> "n" at position 719, 1277, 1278, 1279, 1280, 1288, 1289, 1638, 1 967, 2248, 2251, 2254, 2283, 2585, 2586, 2625, 2932, 2949, 2972, 2978, 3406, is any of A, T, G, and C. <223> "n" at position 3419, 3604, 3675, 3849, 4132, 4337, 4367, 4368, 4369, 4396, 4404, 5700, 5701, 5702, 6611, 6628, 6637, 6700, 6733 is any of A, T, G, and C. <400> 2 ggctcctgag gcgcacagcg ccgagcgcgg cgccgcgcac ccgcgcgccg gacgccagtg 60 accgcgatgg tgaactccag tcgcgtgcag cctcagcagc ccggggacgc caagcggccg 120 cccgcgcccc gcgcgccgga cccgggccgg ctgatggctg gctgcgcggc cgtgggcgcc 180 agcctcgccg ccccgggccg cctctgcgag cagcggggcc tggagatcga gatgcagcgc 240 atccggcagg cggccgcgcg ggaccccccg gccggagccg cggcctcccc ttctcctccg 300 ctctcgtcgt gctcccggca ggcgtggagc cgcgataacc ccggcttcga ggccgaggag 360 gaggaggagg aggtggaagg ggaagaaggc ggaatggtgg tggagatgga cgtagagtgg 420 cgcccgggca gccggaggtc ggccgcctcc tcggccgtga gctccgtggg cgcgcggagc 480 cgggggcttg ggggctacca cggcgcgggc cacccgagcg ggaggcggcg ccggcgagag 540 gaccagggcc cgccgtgccc cagcccagtc ggcggcgggg acccgctgca tcgccacctc 600 cccctggaag ggcagccgcc ccgagtggcc tgggcggaga ggctggttcg cgggctgcga 660 ggtgtaagag cgcgcgaccc gcagcggcag atgcacgaac cagaacggcc ggcgccggng 720 gcttcttaaa taaaatgata tcttttcttt tcttcattat tattttaaag gtctctgggg 780 aacaagactc atggaggaaa gcagcactaa ccgagagaaa taccttaaaa gtgttttacg 840 ggaactggtc acatacctcc tttttctcat agtcttgtgc atctgtaagt agaatatttc 900 cttgcactaa tgggaaagtt ttgaaacgat gtgaatttgt ccaaaatgtt tatccacagg 960 aacaatccct ttgtgaaggc tgctggtatg tggatgtgtg ccggttccct tggggcgttc 1020 atttggatct ttctgtgttc cagtgaccta cggcatgatg agctccaatg tgtactacta 1080 cacccggatg atgtcacagc tcttcctaga cacccccgtg tccaaaacgg agaaaactaa 1140 ctttaaaact ctgtcttcca tggaagactt ctggaaggta tttggaaata actttgaaag 1200 tacctctcta tcacaagcca atgcttggtt atgcaacgat gcaggcaggg caaagcagcg 1260 gcatgagctt gaacttnnnn agatgttnnc tttcttttag ttcacagaag gctccttatt 1320 ggatgggctg tactggaaga tgcagcccag caaccagact gaagctgaca accgaagttt 1380 catcttctat gagaacctgc tgttaggggt tccacgaata cggcaactcc gagtcagaaa 1440 tggatcctgc tctatccccc aggacttgag agatgaaatt aaagagtgct atgatgtcta 1500 ctctgtcagt agtgaagata gggctccctt tgggccccga aatggaaccg cgtaagtgtc 1560 tgtgactcat tggcactcgg tgatattcat ccttgtaatt gcctcaagtg ttccactgat 1620 tgtaactgtt tgtttttngg ttttgttttt aatcagttgg atctacacaa gtgaaaaaga 1680 cttgaatggt agtagccact ggggaatcat tgcaacttat agtggagctg gctattatct 1740 ggatttgtca agaacaagag aggaaacagc tgcacaagtt gctagcctca agaaaaatgt 1800 ctggctggac cgaggaacca gggcaacttt tattgacttc tcagtgtaca acgccaacat 1860 taacctgttc tgtgtggtca ggtgtgtgac tgaggacatg catccctcct atttctgtgt 1920 ggttgtacat acatcctatt ctagggttac ccagaaaaac ctttttntgc aggttgttat 1980 tgttttaatt gttcttattt acatgcaggt tattggttga attcccagca acaggtggtg 2040 tgattccatc ttggcaattt cagcctttaa agctgatccg atatgtcaca acttttgatt 2100 tcttcctggc agcctgtgag attatctttt gtttctttat cttttactat gtggtggaag 2160 agatattgga aattcgcatt cacaaactac actatttcag gagtttctgg aattgtctgg 2220 atgttgtgat cgttgtggta ggtccganca ncancaccaa atttcctatt ctattctaca 2280 agnatgttaa caattaatac attggtgaag aaaaatatac tagtcatatt aaggtaagtt 2340 tcatatttct aaaacactgt aataaaatat aaatattttg cttttcagct gtcagtggta 2400 gctataggaa ttaacatata cagaacatca aatgtggagg tgctactaca gtttctggaa 2460 gatcaaaata ctttccccaa ctttgagcat ctggcatatt ggcagataca gttcaacaat 2520 atagctgctg tcacagtatt ttttgtctgg attaaggtaa tttataaatt tcatgttcta 2580 cattnnaaat aatattttct ttaaaaaaaa tgagttccac aaaancatgc gaaacaatgt 2640 tttattatac acagtcacac catttggttt atccattcat ctattgatgt cttctctctc 2700 ttacagctct tcaaattcat caattttaac aggaccatga gccagctctc gacaaccatg 2760 tctcgatgtg ccaaagacct gtttggcttt gctattatgt tcttcattat tttcctagcg 2820 tatgctcagt tggcatacct tgtctttggc actcaggtcg atgacttcag tactttccaa 2880 gagtgtatgt aagtatatat gaaattaaga agaaaaattt agtcagagta gncactgttg 2940 cgtggacant ctttggtttt gtattgtggt gntttgtntt atttttatag cttcactcaa 3000 ttccgtatca ttttgggcga tatcaacttt gcagagattg aggaagctaa tcgagttttg 3060 ggaccaattt atttcactac atttgtgttc tttatgttct tcattctttt ggtatgtaca 3120 tttatattta tagtggaggt tcaatttaaa cttcgtaaat ccttgtcttc tcttttttga 3180 ttgataattc caaattatgt ttcttccttt aatttttgcc ctcctttcat ttacaaacag 3240 aatatgtttt tggctatcat caatgatact tactctgaag tgaaatctga cttggcacag 3300 cagaaagctg aaatggaact ctcagatctt atcagaaagg taggaaaaac cttaattctc 3360 aaaaattctt ctgtttctga cataaaatga gcattgtttc acccanattt tagaatacnc 3420 taaaccaagt cttttatttt ttctctctct gatagggcta ccataaagct ttggtcaaac 3480 taaaactgaa aaaaaatacc gtggatgaca tttcagagag tctgcggcaa ggaggaggca 3540 agttaaactt tgacgaactt cgacaagatc tcaaagggtg agaatcatgc ttcctgaggt 3600 tctnaaaaat tcctgcttct aaagataaat tcctggtgat aagagtattt ctagcccaag 3660 ggctcatggg aacanaggat gaatgttatc tgtatcctct ctctaatttc aggaagggcc 3720 atactgatgc agagattgag gcaatattca caaagtacga ccaagatgga gaccaagaac 3780 tgaccgaaca tgaacatcag cagatgagag acgacttgga gaaagagagg gtgggtctgg 3840 tttaggagna accggatttg atttggtacc tacaacacca cacttctgtg gggtctcagt 3900 gttctgctcc tcactcagtg accccttgtt cttcaggagg acctggattt ggatcacagt 3960 tctttaccac gtcccatgag cagccgaagt ttccctcgaa gcctggatga ctctgaggag 4020 gatgacgatg aagatagcgg acatagctcc agaaggaggg gaagcatttc tagtggcgtt 4080 tcttacgaag agtttcaagt gtaagtataa aggaattggc agaatttgcg tngacaattt 4140 gtccctctgt actgtgtttt ccttgcagcc tggtgagacg agtggaccgg atggagcatt 4200 ccatcggcag catagtgtcc aagattgacg ccgtgatcgt gaagctagag attatggagc 4260 gagccaaact gaagaggagg gaggtgctgg gaaggctgtt ggatggggtg gccgaggtca 4320 gtagtcatga gctgaanaca ccgctgctga gcatggtgtt attaatnnna atatatgttg 4380 ctgacagttg tatttnaagt attnactgac ccccaacacc agtttctttt tcccttttta 4440 ggatgaaagg ctgggtcgtg acagtgaaat ccatagggaa cagatggaac ggctagtacg 4500 tgaagagttg gaacgctggg aatccgatga tgcagcttcc cagatcagtc atggtttagg 4560 cacgccagtg ggactaaatg gtcaacctcg ccccagaagc tcccgcccat cttcctccca 4620 atctacagaa ggcatggaag gtgcaggtgg aaatgggagt tctaatgtcc acgtatgata 4680 tgtgtgtttc agtatgtgtg tttctaataa gtgaggaagt ggctgtcctg aattgctgta 4740 acaagcacac tatttatatg ccctgaccac cataggatgc tagtctttgt gaccgattgc 4800 taatcttctg cactttaatt tattttatat aaactttacc catggttcaa agattttttt 4860 ttctttttct catataagaa atctaggtgt aaatattgag tacagaaaaa aaatcttcat 4920 gatgtgtatt gagcggtacg cccagttgcc accatgactg agtcttctca gttgacaatg 4980 aagtagcctt ttaaagctag aaaactgtca aagggcttct gagtttcatt tccagtcaca 5040 aaaatcagta ttgttatttt tttccaagag tgtgaaggaa aatggggcaa ttcctttcca 5100 ctctggcata gttcatgagc ttaatacata gctttctttt aagaaaggag cctttttttt 5160 caactagctt cctggggtaa acttttctaa aagataaaat gggaaggaac tccaaactat 5220 gatagaatct gtgtgaatgg ttaagatgaa tgttaaatac tatgcttttt tgtaagttga 5280 tcgtatctga tgtctgtggg actaactgta tcacttaatt tttaccttat tttggctcta 5340 atttgaataa gctgagtaaa accaccaaag atcagttata ggataaaatg gcatctctaa 5400 ccataacaca ggagaattgg aaggagccct aagttgtcac tcagtttaat ttcttttaat 5460 ggttagttta gcctaaagat ttatctgcat attctttttc ccatgtggct ctactcattt 5520 gcaactgaat ttaatgttat aactcatcta gtgagaccaa cttactaaat ttttagtatg 5580 cactgaaagt ttttatccaa caattatgtt cattttaagc aaaattttaa gaaagttttg 5640 aaattcataa agcatttggt tttaaactat tttaagaata tagtactcgg tcaggtatgn 5700 nncacgcctg taatcccagc actttgggag gccgaaacag gcgaatcact tgagcccagg 5760 agttcaagac caacatgggc aatgtggcga aactccatct ctacaaaaaa tgcaaaaata 5820 aaaaatatag tactcaagta ttcttgatcc tgtgtttcaa aactagaatt tgtaatgcaa 5880 atggagctca gtctaataaa aaagaggttt tggtattaaa agttcataca ttagacagta 5940 tcagccaaaa tttgagttag caacactgtt ttctttacga gagggtctca cccaaattta 6000 tggggagaaa tctatttctc aaaaaaaaaa aatcttcttt tacagaaatg ttgagtaagg 6060 tgacattttg agcgctaata agcaaaagag catgcagtgc tgttgaataa ccctcacttg 6120 gagaaccaag agaatcctgt cgtttaatgc tatattttaa tttcacaagt tgttcattta 6180 actggtagaa tgtcagtcca atctccaatg agaacatgag caaatagacc tttccaggtt 6240 gaaagtgaaa catactgggt ttctgtaagt ttttcctcat ggcttcatct ctatctttac 6300 tttctcttga atatgctaca caaagttctt tattactaca tactaaagtt tgcattccag 6360 ggatattgac tgtacatatt tatgtatatg taccatgttg ttacatgtaa acaaacttca 6420 atttgaagtg cagctattat gtggtatcca tgtgtatcga ccatgtgcca tatatcaatt 6480 atggtcacta gaaagtctct ttatgatact ttttattgta ctgtttttca tttcacttgc 6540 aaaattttgc agaattcctc ctttctaccc ataaattaca tataattttt cttctttagt 6600 catggagaac ncccccccat catctcancc ctattanctt tcccatgtgt actggtatta 6660 ttaaaaagac atttacatac gcaagttttt cactgacaan caagaatgtt attaatgtgt 6720 aatactgagc acntttactt cttaataaa 6749 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 3 tggctgcaac tgcctcctgg 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 4 aagcagagac agacctgtga gag 23 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> Synthetic primer <400> 5 gcccccgccg ctctcacagg tctgtctctg cttc 34 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 6 ggcctgtagc ctacccctgg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 7 ggacccctct gaagccacc 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 8 gggaggtggg agacaagaga c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 9 aaagccctgc tgtcactgtg g 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 10 aactaaagcc cagaagacag acc 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 11 aactgtctgc cccagaacat c 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 12 ctaaaggctg ctctctcaac aag 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 13 actcctgttg ggttttgatg ag 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 14 gagaactact cccttgtcct tgg 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> Synthetic primer <400> 15 acgccaagga caagggagta gttc 24 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 16 tgggctcctg gctggtgact gc 22 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> Synthetic primer <400> 17 gcggcccgcc gcccccgccg ctactgaccc gcaccctctg 40 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 18 gctgcgaggg gtgagacg 18 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> Synthetic primer <400> 19 gcggcccgcc gcccccgccg cgtccctccc gccctcctga cc 42 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> Synthetic primer <400> 20 gcccccgccg ctgcggacga gaaatctgtc tgcttg 36 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 21 cagggctgca agcagacaga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 22 ctgagctaag acgccctccc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 23 ctgtacgccc tcactggtgt c 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 24 ggcacagggg ctcagtcagt c 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 25 ggactgactg agcccctgtg c 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 26 agtcggtcaa actgggtgag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 27 caaggtgtga gcctgagccc 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 28 cggtgtccac tccgactcca c 21 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Synthetic primer <400> 29 ccgcccccgc cgcgcgccgg acgccagtga cc 32 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Synthetic primer <400> 30 gcccccgccg ccgcggcctc cccttctcct 30 <210> 31 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> Synthetic primer <400> 31 cggcccgccg cccccgcccg cggccgttct ggttcgtgca tctg 44 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> Synthetic primer <400> 32 gcccccgccg aaatgatatc ttttcttttc ttca 34 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Synthetic primer <400> 33 cccccgcccg aactttccca ttagtgcaag 30 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> Synthetic primer <400> 34 cgccgccccc gcccgtgtga tagagaggta ctttca 36 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Synthetic primer <400> 35 ccgccgcccc cgccgctttt tcaaagatgt ttcctttgc 39 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 36 tatcaccgag tgccaatgag 20 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> Synthetic primer <400> 37 ccgccgcccc cgccggcctc aagtgttcca ctgat 35 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> Synthetic primer <400> 38 cccccgcccg ttgtagaata gaataggaaa tttgg 35 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> Synthetic primer <400> 39 gcccccgccg ttggtgaaga aaaatatact agtca 35 <210> 40 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> Synthetic primer <400> 40 cgccgccccc gcccgtggaa ctcatttttt ttaaaga 37 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Synthetic primer <400> 41 gcgggggcgg cgggccgttt tattatacac agtcacacc 39 <210> 42 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Synthetic primer <400> 42 gcccccgccg cttcctttaa tttttgccct cc 32 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Synthetic primer <400> 43 cgccgccccc gcccggaaac aatgctcatt ttatgtcag 39 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Synthetic primer <400> 44 ccgccgcccc cgccgaaacc aagtctttta ttttttctc 39 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Synthetic primer <400> 45 ccgccgcccc cgccggatga atgttatctg tatcctctc 39 <210> 46 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> Synthetic primer <400> 46 cgccgccccc gcccggcaaa ttctgccaat tccttta 37 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Synthetic primer <400> 47 gcccccgccg tttgtccctc tgtactgtgt tt 32 <210> 48 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Synthetic primer <400> 48 ccgcccccgc cgtgaccccc aacaccagtt tc 32 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> Synthetic primer <400> 49 cggcccgccg cccccgcccg ggacagccac ttcctcactt 40 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 50 cgtcgctcag cagcaggtcg 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 51 cgtcctgctt cccgtcccg 19 <210> 52 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> Synthetic primer <400> 52 gcggcccgcc gcccccgccg ttggggatgc tggcaatgtg tg 42 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 53 gggattcggc aaagctgatg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 54 ttccatcagc tttgccgaat 20 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 55 atctggtctc aagcctggaa g 21 <210> 56 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(49) <223> Synthetic primer <400> 56 gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgccga gacccttccc accagacct 49 <210> 57 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> Synthetic primer <400> 57 cgcccccgcc cgtgagccct gcccagtgtc t 31 <210> 58 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> Synthetic primer <400> 58 gcggcccgcc gcccccgccg gagccaggag gagcagaacc c 41 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 59 cagagggaca ggcaggcaaa gg 22 <210> 60 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Synthetic primer <400> 60 gcccccgccg cccagccctc cagtgcct 28 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 61 atcgctatgt gctgcctggg 20 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 62 ccgaggtgga tgccgctg 18 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 63 gaaggggagt gggcagcaga c 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 64 cactgaccgt tgacaccctc g 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 65 tgccccagtg cttcagagat c 21 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 66 ggagtgccct gagccccct 19 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 67 cccctaacca cagccagcg 19 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 68 tctgttcgtc ctggtgtcct g 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 69 gcaggagggc aggttgtaga a 21 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> Synthetic primer <400> 70 gcggcccgcc gcccccgccg ggtaggggga gtctgggctt 40 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Synthetic primer <400> 71 gaggccaccc cgagtcc 17 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 72 gttgggcatc tctgacggtg 20 <210> 73 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> Synthetic primer <400> 73 cgccgccccc gcccgggaag gtggcctgag gagat 35 <210> 74 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> Synthetic primer <400> 74 gcggcccgcc gcccccgccg ggggtccacg ggccatg 37 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 75 aagcccagca gcacggtgag 20 <210> 76 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> Synthetic primer <400> 76 ccgccgcccc cgccgctgcc ctgcctgtgc cctg 34 <210> 77 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer <400> 77 gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg ttccaccacc acgtccacca c 51 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 78 gtggtggacg tggtggtgga a 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 79 ggctgctgcc ctcactggga a 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 80 taagggcaga gtcctccaca g 21 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 81 ccacccccgc ccacctactg ag 22 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> Synthetic primer <400> 82 gcggcccgcc gcccccgccg tggagggagg gacgccaatc 40 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 83 gaggctgggg ctgggacaa 19 <210> 84 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 84 cccggttcac tcactgcg 18 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Synthetic primer <400> 85 cccccgcccg ccgtgctcag agcctgaaag 30 <210> 86 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> Synthetic primer <400> 86 ggcggggggc ttctgccgag cgggtgggga gcaggtgg 38 <210> 87 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> Synthetic primer <400> 87 cgccgccccc gcccggctct gggtcaggac agggga 36 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 88 cgcctggggg tgttcttt 18 <210> 89 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 89 acgtgatgtt gtcgcccg 18 <210> 90 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> Synthetic primer <400> 90 gcccccgccg gggcgccccc gtggtggtca gc 32 <210> 91 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 91 caggctgcgt ggggatgc 18 <210> 92 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 92 ctggaggtgc tgcgcgtt 18 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Synthetic primer <400> 93 cgcccccgcc cgctggctcc acgcagatgc 30 <210> 94 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 94 cgtgaacagg gcgcatta 18 <210> 95 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> Synthetic primer <400> 95 cccccgcccg gcagcagaga tgttgttgga c 31 <210> 96 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> Synthetic primer <400> 96 ccgccgcccc cgccgccagg ctcctatctt gtgaca 36 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 97 tgaagtcacc tgtgctgttg t 21 <210> 98 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 98 ctacctgtgg gatctgggg 19 <210> 99 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 99 tgctgaagct cacgctcc 18 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 100 gggctcgtcg tcaatgcaag 20 <210> 101 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> Synthetic primer <400> 101 cgccgccccc gcccgccgcc caccacctgc agcccctcta 40 <210> 102 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> Synthetic primer <400> 102 gcggcccgcc gcccccgccg ccgcccagga cagcatcttc 40 <210> 103 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 103 cgctgcccag catgttgg 18 <210> 104 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> Synthetic primer <400> 104 ggccggcagc ggcaaaggct tctc 24 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 105 gcccagcacc agctcacat 19 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 106 cgagccattt accacccata g 21 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 107 ggcagccagc aggatctgaa 20 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 108 ctgtgggcca gcagcaaggt g 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 109 cctgaacctc cagcaccagc g 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 110 aggtccaggg cgactcgctg g 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 111 cagggccaca cgcgctgggc g 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 112 ttggaggccc acgttgacct g 21 <210> 113 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> Synthetic primer <400> 113 cccccgcccg catgggtgtg gacgggtgag g 31 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 114 taaaactgga tggggctctc 20 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 115 ggcctccacc agcactaa 18 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 116 gggtccccca gtccttccag 20 <210> 117 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Synthetic primer <400> 117 tccccagccc gcccaca 17 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 118 gccccctcac caccccttct 20 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 119 tcccgctgct ccccccacgc a 21 <210> 120 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 120 gatgccgtgg ggaccgtc 18 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 121 gtgagcaggt ggcagtctcg 20 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 122 ccaccccctc tgctcgtagg t 21 <210> 123 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 123 ggtcccaagc acgcatgca 19 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 124 tgccggcctc ctgcgctgct ga 22 <210> 125 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> Synthetic primer <400> 125 gcgggcaggg tgagcaggtg gggccatcc 29 <210> 126 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> Synthetic primer <400> 126 gaggctgtgg gggtccagtc aagtgg 26 <210> 127 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Synthetic primer <400> 127 agggaggcag aggaaagggc cgaac 25 <210> 128 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> Synthetic primer <400> 128 cgtcccgcct gcactgacct cacgcatgt 29 <210> 129 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> Synthetic primer <400> 129 cggcccgccg cccccgcccg gccaaaggga aagggattgg a 41 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 130 ccgcggagcc tgctgtgcta t 21 <210> 131 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Synthetic primer <400> 131 ccgccgcccc cgcccgcttg gtggagacgg tgtagttgc 39 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 132 tccaatccct ttccctttgg c 21 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 133 cagcagccca tgaaacagaa ag 22 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 134 tatgctttca ggcccgtggc a 21 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 135 agagcccata cccggtccag tcc 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 136 ggactggacc gggtatgggc tct 23 <210> 137 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> Synthetic primer <400> 137 cccccgcccg cacccaggcc ctcctcgact c 31 <210> 138 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Synthetic primer <400> 138 cccccgccgc tgggtgggct cggctctatc 30 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 139 tggtagcgat gctcacgtca ctt 23 <210> 140 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 140 caggccaaag ctgagatgac ttg 23 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 141 agaggcgcag gagggaggtc 20 <210> 142 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 142 ccctctgccc ccgcattg 18 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 143 aagcgcaaaa gggctgcgtc g 21 <210> 144 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 144 ggccctccct gccttctagg cg 22 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 145 ccgtgctgtg tggaggagag 20 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 146 cctcttcctg cccagccctt c 21 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 147 cttcccgagc agcctttggt g 21 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 148 ctgagctgcc gcccgctgac 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 149 aggaccccca gcccagccca 20 <210> 150 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 150 cttggcgcag cttggact 18 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 151 acacccagca aggacacgca 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 152 tgtgacacat cccctggtac 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 153 gcaagggtga gcttcagagc 20 <210> 154 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer <400> 154 gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg accctatgcc tcctgtacct c 51 <210> 155 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 155 cccctcctct ggcaatcc 18 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 156 cctgccggga gcacgacgag 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 157 ctgggctggg gcacggcggg 20 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 158 gggggctacc acggcgcggg c 21 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 159 ttggggcgtt catttggatc 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 160 accacacaga aataggaggg 20 <210> 161 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> Synthetic primer <400> 161 ttgttattgt tttaattgtt ctta 24 <210> 162 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Synthetic primer <400> 162 ctactctgac taaatttttc ttctt 25 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 163 tttggttttg tattgtggtg 20 <210> 164 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 164 aaggatttac gaagtttaaa ttg 23 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 165 agaacctcag gaagcatgat t 21 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 166 taggtaccaa atcaaatccg 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 167 gtctcagtgt tctgctcctc 20 <210> 168 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 168aaatacaact gtcagcaaca ta 22
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の1つの実施形態で使用されるPKD1
cDNA配列(GenBankアクセッション番号L
33243)を示す図である。エクソンおよびPCR産
物連結点を、ヌクレオチド配列の上に示す。アミノ酸
を、各コドンの中央の下に示す。
【図2】1つの実施形態によるPKD遺伝子のエクソン
配列と2つのホモログ配列との比較を示す図である。P
KDまたはホモログ配列のいずれかのみを切断する制限
酵素部位を示す。
【図3】1つの実施形態による4つの正常なサンプルお
よびヌクレオチド11606での19bp挿入(重複)
(コドン3799)のPKD1エクソン40DHPLC
パターンを示すグラフである。
【図4】1つの実施形態による正常なコントロールおよ
びヌクレオチド11606での19bp挿入(重複)配
列(コドン3799)のPKD1エクソン40配列を示
すグラフである。
【図5】1つの実施形態によるイントロン5推定多型
(IVS5−9−>A)およびヌクレオチド1502で
のフレームシフト(インサートG)のPKD1エクソン
6DHPLCパターンを示すグラフである。
【図6】1つの実施形態によるイントロン5推定多型
(IVS5−9−>A)のPKD1エクソン6配列を示
すグラフである。
【図7】1つの実施形態によるヌクレオチド7518で
のフレームシフト、コドン2436(インサートC)お
よび共通の多型C7652TのPKD1エクソン18D
HPLCパターンを示すグラフである。
【図8】1つの実施形態による正常なコントロールおよ
びヌクレオチド7518でフレームシフトを有する配列
(コドン2436(インサートC))のPKD1エクソ
ン18配列を示すグラフである。
【図9】1つの実施形態によるソフトウェア推定融解プ
ロフィールおよびエクソン末端付近での部分的融解を確
立するために必要な多数の温度の例を示すグラフであ
る。
【図10A】本発明の1つの実施形態において同定され
た患者のDNA変異表現型を示すチャートである。
【図10B】本発明の1つの実施形態において同定され
た患者のDNA変異表現型を示す表である。
【図11】本発明のいくつかの実施形態において使用し
たDHPLC(WAVE)をまとめた表である。
【図12】本発明のいくつかの実施形態において使用し
たPCR条件をまとめた表である。
【図13】本発明の1つの実施形態における患者の検体
処理工程を示す略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェフリー・ジョージ・ジョーンズ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01095, ウィルブレアム,ホースシュー・レイン 21 (72)発明者 ホルヘ・ア・ガルセス アメリカ合衆国マサチューセッツ州01571, ダドリー,エアポート・ロード 34 (72)発明者 ジン・ワン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01605, ウスター,カントリー・クラブ・ブールヴ ァード 72,アパートメント 219 (72)発明者 ジョン・エイ・カラン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01605, ウスター,ジャスミン・ドライヴ 2 (72)発明者 スーザン・キンバリー・アレン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01610, ウスター,モントローズ・ストリート 6,#2 (72)発明者 ケリー・エレン・フリン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01519, グラフトン,シーダー・ヒル・ロード (番地なし) (72)発明者 エイダン・ノエル・ヘニガン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01527, ミルベリー,マイルズ・ストリート 49 (72)発明者 ノーマンド・ジェイ・ロビショード アメリカ合衆国マサチューセッツ州01453, レムスター,ランカスター・ストリート 27 (72)発明者 クリストファー・エム・パラトゥッチ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01545, ソールズベリ,キーズ・ハウス・ロード 21 Fターム(参考) 4B024 AA11 BA80 CA04 CA09 HA08 HA11 HA19 4B063 QA13 QA17 QA19 QQ42 QR08 QR31 QR42 QR56 QR62 QR72 QR77

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 標的核酸の変異分析方法であって、 少なくとも一の第1の核酸および少なくとも一の第2の
    核酸の存在下で、反応混合物中において前記標的核酸を
    含むサンプルをインキュベートするステップであって、
    前記第1の核酸は配列番号1または2の配列の固有の部
    位にアニーリングするプライマー配列を含み、前記第2
    の核酸は前記第1の核酸と逆方向であり、前記インキュ
    ベーションにより増幅産物が産生されることを特徴とす
    るステップと、 前記増幅産物中で二重鎖を作製するステップと、 前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出するステッ
    プとを含み、前記ヘテロ二重鎖の存在は前記標的核酸中
    の潜在的な変異が存在することを示し、前記へテロ二重
    鎖の非存在は前記標的核酸中の変異が存在しないことを
    示すことを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】 ヘテロ二重鎖領域の配列を決定するステ
    ップと、前記ヘテロ二重鎖領域の配列と配列番号1また
    は2とを比較するステップとをさらに含み、前記標的核
    酸によってコードされるタンパク質の機能変化が予想さ
    れる、配列番号1または2と比較した前記ヘテロ二重鎖
    領域の配列の相違は、前記標的核酸の変異の指標とな
    る、請求項1の方法。
  3. 【請求項3】 前記第1または第2の核酸が配列番号3
    〜49からなる群から選択される配列を含む、請求項1
    の方法。
  4. 【請求項4】 前記方法が、テンプレートとして前記第
    1および第2の核酸によって作製された前記増幅産物を
    使用してネスト化増幅反応を行うステップと、前記ネス
    ト化増幅由来の増幅産物中で二重鎖を作製するステップ
    とをさらに含む、請求項1の方法。
  5. 【請求項5】 前記ネスト化増幅反応を、配列番号3〜
    49およびその相補配列からなる群から選択される少な
    くとも一のプライマーを使用して行う、請求項4の方
    法。
  6. 【請求項6】 前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無の
    同定をDHPLCによって行う、請求項1の方法。
  7. 【請求項7】 前記ヘテロ二重鎖領域の配列をDNA配
    列決定によって決定する、請求項1の方法。
  8. 【請求項8】 前記第2の核酸が配列番号1または2の
    配列内の固有の部位にアニーリングするプライマー配列
    を含む、請求項1の方法。
  9. 【請求項9】 前記標的テンプレートを含むサンプル
    が、ゲノムDNA、cDNA、全RNA、mRNA、お
    よび細胞サンプルからなる群から選択される、請求項1
    の方法。
  10. 【請求項10】 前記インキュベーションステップが、
    ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応(LCR)、
    および核酸特異性ベースの増幅からなる群から選択され
    る増幅反応を含む、請求項1の方法。
  11. 【請求項11】 1つまたは複数の制限酵素を使用して
    増幅産物がPKD特異的産物であるかを確認するステッ
    プをさらに含む、請求項1の方法。
  12. 【請求項12】 前記制限酵素がPKD特異的産物を切
    断して、PKDホモログ産物と区別可能な消化パターン
    が得られる、請求項11の方法。
  13. 【請求項13】 前記制限酵素が、PstI、Stu
    I、XmaI、MluI、PvuII、BssHII、
    FspI、MscI、およびBlnIからなる群から選
    択される、請求項11の方法。
  14. 【請求項14】 PKD罹患患者を同定するための診断
    方法であって、 (c)個体からサンプルを得るステップと、 (d)少なくとも一の第1の核酸および少なくとも一の
    第2の核酸の存在下で、反応混合物中において前記サン
    プルをインキュベートするステップであって、前記第1
    の核酸は配列番号1または2中の固有の部位にアニーリ
    ングするプライマー配列を含み、前記第2の核酸は前記
    第1の核酸と逆方向であり、前記インキュベーションに
    より増幅産物が産生され、 (c)前記増幅産物中で二重鎖を作製するステップと、 (d)前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出する
    ステップと、 (e)前記ヘテロ二重鎖領域の配列を決定するステップ
    とを含み、配列番号1または2と比較した前記ヘテロ二
    重鎖領域の存在は、前記個体がPKDを罹患しているこ
    とを示すことを特徴とする方法。
  15. 【請求項15】 前記ヘテロ二重鎖の検出をDHPLC
    によって行う、請求項14の方法。
  16. 【請求項16】 前記配列をDNA配列決定によって決
    定する、請求項14の方法。
  17. 【請求項17】 前記第2の核酸が配列番号1または2
    の配列中の固有の部位にアニーリングするプライマー配
    列を含む、請求項14の方法。
  18. 【請求項18】 前記第1または第2の核酸が配列番号
    3〜49からなる群から選択されるプライマー配列を含
    む、請求項14の方法。
  19. 【請求項19】 テンプレートとして前記第1および第
    2の核酸によって作製された前記増幅産物を使用してネ
    スト化増幅反応を行うステップと、前記ネスト化増幅由
    来の二重鎖を作製するステップとをさらに含む、請求項
    14の方法。
  20. 【請求項20】 前記ネスト化増幅反応を、配列番号3
    〜49およびその相補配列からなる群から選択される少
    なくとも一のプライマーを使用して行う、請求項19の
    方法。
  21. 【請求項21】 前記サンプルが、ゲノムDNA、cD
    NA、全RNA、mRNA、および細胞からなる群から
    選択される、請求項14の方法。
  22. 【請求項22】 前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反
    応、リガーゼ連鎖反応(LCR)、および核酸特異性ベ
    ースの増幅からなる群から選択される、請求項14の方
    法。
  23. 【請求項23】 前記特異的に増幅した産物を1つまた
    は複数の制限酵素を使用して実証するステップをさらに
    含む、請求項14の方法。
  24. 【請求項24】 前記制限酵素がPKD特異的産物を切
    断して、PKDホモログ産物と区別可能な消化パターン
    が得られる、請求項23の方法。
  25. 【請求項25】 前記制限酵素が、PstI、Stu
    I、XmaI、MluI、PvuII、BssHII、
    FspI、MscI、およびBlnIからなる群から選
    択される、請求項24の方法。
JP2002300040A 2001-10-12 2002-10-15 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法 Withdrawn JP2003164300A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32873901P 2001-10-12 2001-10-12
US60/328739 2001-10-12
US10/083246 2002-02-26
US10/083,246 US6916619B2 (en) 2001-10-12 2002-02-26 Compositions and methods for genetic analysis of polycystic kidney disease

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009001743A Division JP4446014B2 (ja) 2001-10-12 2009-01-07 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003164300A true JP2003164300A (ja) 2003-06-10

Family

ID=46204416

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002300040A Withdrawn JP2003164300A (ja) 2001-10-12 2002-10-15 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法
JP2009001743A Expired - Fee Related JP4446014B2 (ja) 2001-10-12 2009-01-07 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009001743A Expired - Fee Related JP4446014B2 (ja) 2001-10-12 2009-01-07 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US6916619B2 (ja)
JP (2) JP2003164300A (ja)
CA (1) CA2403827A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7273701B2 (en) * 2001-10-12 2007-09-25 Athena Diagnostics, Inc. Compositions and methods for genetic analysis of polycystic kidney disease
JP2009544314A (ja) 2006-07-24 2009-12-17 アテナ ダイアグノスティックス,インコーポレイテッド Pkdの変異およびその評価
US20130225443A1 (en) 2010-11-05 2013-08-29 Kyoto University Method of examining polycystic kidney disease and method of screening for therapeutic agent of the disease
JP6723924B2 (ja) 2014-11-19 2020-07-15 大塚製薬株式会社 Pkd1遺伝子及びpkd2遺伝子のエクソンを増幅するためのプライマーセット及び方法
KR20230150973A (ko) * 2021-02-03 2023-10-31 스톡 테라퓨틱스, 인크. 폴리시스틴 발현과 관련된 병태 및 질환의 치료용 조성물
CN116732168B (zh) * 2023-08-04 2023-11-03 北京贝瑞和康生物技术有限公司 检测常染色体显性多囊肾多种突变的方法和试剂盒

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8288A (en) * 1851-08-12 Machine fob jointing staves
US6232452B1 (en) * 1993-12-24 2001-05-15 Julian R. Sampson Tuberous sclerosis 2 gene and uses thereof
US5891628A (en) * 1994-06-03 1999-04-06 Brigham And Women's Hospital Identification of polycystic kidney disease gene, diagnostics and treatment
US6071717A (en) * 1995-01-31 2000-06-06 Genzyme Corporation Polycystic kidney disease gene and protein
US6031088A (en) * 1996-05-23 2000-02-29 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Polycystic kidney disease PKD2 gene and uses thereof
AU2001271998A1 (en) 2000-07-13 2002-01-30 The Johns Hopkins University School Of Medicine Detection and treatment of polycystic kidney disease

Also Published As

Publication number Publication date
CA2403827A1 (en) 2003-04-12
US20030152936A1 (en) 2003-08-14
US6916619B2 (en) 2005-07-12
JP4446014B2 (ja) 2010-04-07
JP2009065988A (ja) 2009-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2704447A1 (en) Predicting amd with snps within or near c2, factor b, plekha1, htra1, prelp, or loc387715
WO2005070104A2 (en) REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION-BASED GENOTYPING ASSAY FOR β2-ADRENERGIC RECEPTOR SINGLE NUCLEODITE POLYMORPHISM
JP2975023B2 (ja) I型糖尿病素因の診断用プローブ
KR101922598B1 (ko) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 rnf213 유전자의 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물 및 이의 이용
JP4446014B2 (ja) 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法
US20140193809A1 (en) Methods for genetic analysis of dna to detect sequence variances
EP1186672A2 (en) Polymorphisms in the human organic anion transporter C (OATP-C) gene
US7521190B2 (en) Compositions and methods for genetic analysis of polycystic kidney disease
US20090098056A1 (en) Alpk1 gene variants in diagnosis risk of gout
JP2004113094A (ja) 高血圧のリスク診断方法
KR101107831B1 (ko) Sult1a1 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 sult1a1 유전자 증폭용 시약 및 그 용도
US7833710B2 (en) Polynucleotide associated with breast cancer comprising single nucleotide polymorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing breast cancer using the same
JP2000511430A (ja) Hla dqb1タイピングを決定するためのヌクレオチドプローブおよび方法
JP4889258B2 (ja) ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法
CA2461106C (en) Compositions and methods for genetic analysis of polycystic kidney disease
US9909182B1 (en) Methods for identifying subjects susceptible to charcot-marie-tooth neuropathy type 1C
JP2007516719A (ja) 一塩基多型を含む二型糖尿病に関与するポリヌクレオチド、それを含むマイクロアレイ及び診断キット、並びにそれを利用したポリヌクレオチドの分析方法
KR101728023B1 (ko) Pcr―ldr을 이용한 atp7b 유전자의 돌연변이 검출
KR102409336B1 (ko) 면역글로불린 a 신병증 및 혈관염 진단용 snp 마커 및 이를 이용한 진단 방법
US7288377B2 (en) Adh1c
JP4502570B2 (ja) 遺伝子多型解析を用いたIgA腎症診断およびIgA腎症診断用キット
US20060257913A1 (en) Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction and uses thereof
US20030148288A1 (en) Colorimetric genetic test for clinically significant TNF polymorphism and methods of use thereof
US20040132024A1 (en) Method of detecting genetic disorders
JP2008502341A (ja) 電位型カリウムチャネルをコードするヒト肥満感受性遺伝子およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050304

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080314

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080613

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080618

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080714

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080717

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080813

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20080912

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090107

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090107

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20090126

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20090127