JP2003164300A - 多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法 - Google Patents

多発性嚢胞腎症の遺伝子分析用の組成物および方法

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JP2003164300A JP2002300040A JP2002300040A JP2003164300A JP 2003164300 A JP2003164300 A JP 2003164300A JP 2002300040 A JP2002300040 A JP 2002300040A JP 2002300040 A JP2002300040 A JP 2002300040A JP 2003164300 A JP2003164300 A JP 2003164300A
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ケリー・エレン・フリン
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エイダン・ノエル・ヘニガン
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ノーマンド・ジェイ・ロビショード
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 常染色体優性多発性嚢胞腎に関連する遺伝子
の変化またはこのような変化の非存在を同定するための
遺伝子試験方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、ＤＨＰＬＣを使用したＰＫＤ
遺伝子変異の検出法に関する。本発明は、以下の態様を
含む。ＰＫＤ固有部位の同定；ＰＫＤ特異的プライマー
のデザイン；ＰＫＤ特異的産物の増幅；およびＤＨＰＬ
ＣによるＰＣＲ増幅産物の分析。本発明は、さらに、同
定した固有の部位およびＰＫＤ特異的プライマーなどの
組成物ならびに本発明の方法を実施するためのキットに
関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、常染色体優性多発
性嚢胞腎に関連する遺伝子の変化またはこのような変化
が存在しないことを同定するための遺伝子試験方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫ
Ｄ）は、８００人の生産児あたり約１人発症する非常に
一般的な遺伝性腎疾患である。この疾患は、進行性で、
多発性嚢胞腎の両側への拡大によって特徴付けられ、典
型的には６５歳で末期腎疾患（ＥＳＲＤ）となる。より
一般的な合併症には、高血圧、肉眼的血尿、尿管感染
症、心臓弁の異常、および前腹壁ヘルニアが含まれる。
嚢胞形成は一般的に肝臓でも認められるが、発症は器官
の機能障害に関連していない。あまり報告されていない
が、さらなる腎外発現には、膵嚢胞症、結合組織異常、
および大脳動脈瘤が含まれる。
【０００３】典型的な発症年齢は中年であるが、年齢層
は新生児から８０歳までである。ＡＤＰＫＤの臨床的兆
候は、家族間および家族内で異なり、この障害の遺伝学
的に異なる性質によって部分的に説明される。ほとんど
全てのＡＤＰＫＤの症例で２つの遺伝子ＰＫＤ−１およ
びＰＫＤ−２の変異が認められる（例えば、概説につい
ては、Ａｒｎａｏｕｔ、２００１、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．
Ｍｅｄ．，５２，９３〜１２３；Ｋｏｐｔｉｄｅｓ ａ
ｎｄ Ｄｅｌｔａｓ、２０００、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
ｔ．、１０７、１１５〜１２６を参照のこと）。ＰＫＤ
−１およびＰＫＤ−２は、機能が完全に解明されていな
い内在性膜タンパク質をコードする。ＡＤＰＫＤを担う
主要遺伝子ＰＫＤ−１は完全に特徴付けられており、細
胞−細胞および細胞−基質相互作用に関連すると考えら
れる内在性膜タンパク質ポリシスチン１をコードするこ
とが示されている。ＰＫＤ−２遺伝子は、非選択性陽イ
オンチャネル活性を有すると予想される内在性膜タンパ
ク質であるポリシスチン２をコードする。電位活性化カ
ルシウムチャネルのα１サブユニット成分との配列相同
性に基づいて、ポリシスチン２は、イオンチャネリング
の役割を果たし得ると仮定されている。インビトロ結合
アッセイおよび指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）２ハイブリ
ッド相互作用を使用して、ポリシスチン１およびポリシ
スチン２のＣ末端細胞質テールは相互作用することが認
められている。ＰＫＤ−１中のコイルドコイルドメイン
およびＰＫＤ−２中のＲ８７２付近の領域を介して相互
作用が生じる。ポリシスチン間の相互作用の生物学的関
連性は未だ理解されていないにもかかわらず、ＰＫＤ−
１およびＰＫＤ−２はおそらく共通の経路に沿って機能
すると示唆されている。
【０００４】ＡＤＰＫＤ１型および２型は、腎臓および
腎外の全発症範囲を共有するが、２型は１型と比較して
発症が遅延するようである。高血圧、血尿、および尿管
感染を含むＡＤＰＫＤで認められる共通の表現型合併症
は、２型患者で臨床的に軽度なようである。死またはＥ
ＳＲＤ発症年齢の中央値は、ＰＫＤ−１を有する個体で
５３歳であり、ＰＫＤ−２を有する個体で６９歳と報告
されている。女性は、男性（６７歳）より有意に長い生
存期間の中央値（７１歳）であると報告されている。Ｐ
ＫＤ−１では性別の影響は明確ではない。ＰＫＤ−１遺
伝子の変異は、試験した症例の約８５％でＡＤＰＫＤの
病因であり、ＰＫＤ−２では１５％である。ＡＤＰＫＤ
家族の部分集合が小さいのでＰＫＤ−１またはＰＫＤ−
２のいずれかとの遺伝的関連を証明することができない
にもかかわらず、ＡＤＰＫＤの第３の遺伝子の可能性が
生じ、第３の疾患関連遺伝子座の存在が厳密に調査され
ている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＰＫＤ遺伝子の変化と
ＡＤＰＫＤの発症との間の強力な関連性が発見されたに
もかかわらず、日常的な臨床用のＡＤＰＫＤ疾病素質に
ついての遺伝子試験法の開発は、いくつかの技術的障害
によって妨げられている。
【０００６】ＡＤＰＫＤについてのＤＮＡベースの試験
法の開発における１つの深刻な障害は、ＰＫＤ転写物に
関連する配列（例えば、ＰＫＤ−１）は、ＰＫＤ−１遺
伝子座に隣接する第１６染色体上で少なくとも３回重複
されてＰＫＤ−１ホモログを形成することである。別の
障害は、ＰＫＤ−１ゲノム区間もまた他のゲノム領域中
に存在する繰り返しエレメントを含むことである。さら
に、ＰＫＤ遺伝子の配列は、非常にＧＣリッチであり、
完全な進化について多数のヌクレオチド（１５，８１６
ｂｐ）を分析する必要がある。
【０００７】発現したＰＫＤ遺伝子に固有であり、重複
した相同配列中に存在しないこれらの配列のセグメント
の同定が必要である。ＰＫＤ遺伝子の変異分析用の感度
が高く且つ特異的な遺伝子試験の開発も必要である。こ
のような試験法の開発により、ＡＤＰＫＤの診断および
管理が容易になる。
【０００８】１つの態様では、本発明は、標的核酸の変
異分析法であって、前記方法は、反応混合物中で前記標
的核酸を含むサンプルを少なくとも１つの第１の核酸お
よび少なくとも１つの第２の核酸の存在下でインキュベ
ートするステップであって、前記第１の核酸は配列番号
１または２の配列の固有の部位にアニーリングするプラ
イマー配列を含み、前記第２の核酸は前記第１の核酸と
逆方向であり、前記インキュベーションにより増幅産物
が産生され、前記増幅産物中で二重鎖を作製するステッ
プと、前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出する
ステップとを含み、前記ヘテロ二重鎖の存在は前記標的
核酸中の潜在的な変異の存在を示し、前記へテロ二重鎖
の非存在は前記標的核酸中の変異の非存在を示す方法を
提供する。
【０００９】１つの実施形態では、本方法は、ヘテロ二
重鎖領域の配列を決定するステップと、前記ヘテロ二重
鎖領域の配列と配列番号１または２とを比較するステッ
プとをさらに含み、前記標的核酸によってコードされる
タンパク質の機能変化が予想される配列番号１または２
と比較した前記ヘテロ二重鎖領域の配列の相違は前記標
的核酸の変異の指標となる。
【００１０】好ましくは、第１または第２の核酸は、配
列番号３〜４９からなる群から選択される配列を含む。
【００１１】別の実施形態では、本方法は、テンプレー
トとして前記第１および第２の核酸によって作製された
前記増幅産物を使用してネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）増幅
反応を行う工程と、前記ネスト化増幅由来の増幅産物中
で二重鎖を作製する工程とをさらに含む。
【００１２】好ましくは、ネスト化増幅反応を、配列番
号３〜４９およびその相補配列からなる群から選択され
る少なくとも１つのプライマーを使用して行う。
【００１３】好ましい実施形態では、二重鎖由来のヘテ
ロ二重鎖の有無をＤＨＰＬＣによって同定する。
【００１４】好ましい実施形態では、ヘテロ二重鎖領域
の配列をＤＮＡ配列決定によって決定する。好ましく
は、本発明の方法の第２の核酸は配列番号１または２の
配列内の固有の部位にアニーリングするプライマー配列
を含む。
【００１５】好ましくは、標的テンプレートを含むサン
プルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａ、および細胞サンプルからなる群から選択される。
【００１６】１つの実施形態では、インキュベーション
工程は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応（Ｌ
ＣＲ）、および核酸特異性ベースの増幅からなる群から
選択される増幅反応を含む。
【００１７】本発明の方法は、１つまたは複数の制限酵
素を使用して増幅産物がＰＫＤ特異的産物であるかを確
認する工程をさらに含み得る。
【００１８】好ましくは、制限酵素は、ＰＫＤ特異的産
物を切断してＰＫＤホモログ産物と区別可能な消化パタ
ーンが得られる。
【００１９】より好ましくは、制限酵素は、ＰｓｔＩ、
ＳｔｕＩ、ＸｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＢｓｓＨ
ＩＩ、ＦｓｐＩ、ＭｓｃＩ、およびＢｌｎＩからなる群
から選択される。
【００２０】別の態様では、本発明は、ＰＫＤ罹患患者
を同定するための診断法であって、前記方法は、（ａ）
個体からサンプルを得るステップと、（ｂ）反応混合物
中で前記サンプルを少なくとも１つの第１の核酸および
少なくとも１つの第２の核酸の存在下でインキュベート
するステップであって、前記第１の核酸は配列番号１ま
たは２中の固有の部位にアニーリングするプライマー配
列を含み、前記第２の核酸は前記第１の核酸と逆方向で
あり、前記インキュベーションにより増幅産物が産生さ
れ、（ｃ）前記増幅産物中で二重鎖を作製するステップ
と、（ｄ）前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出
するステップと、（ｅ）前記ヘテロ二重鎖領域の配列を
決定するステップとを含み、配列番号１または２と比較
した前記ヘテロ二重鎖領域の存在は、前記個体がＰＫＤ
を罹患していることを示す方法を提供する。
【００２１】好ましくは、ヘテロ二重鎖の検出をＤＨＰ
ＬＣによって行う。
【００２２】好ましくは、配列をＤＮＡ配列決定によっ
て決定する。
【００２３】１つの実施形態では、第２の核酸が配列番
号１または２の配列中の固有の部位にアニーリングする
プライマー配列を含む。
【００２４】別の実施形態では、第１または第２の核酸
が配列番号３〜４９からなる群から選択されるプライマ
ー配列を含む。
【００２５】本発明の診断法は、テンプレートとして前
記第１および第２の核酸によって作製された前記増幅産
物を使用してネスト化増幅反応を行うステップと、前記
ネスト化増幅由来の二重鎖を作製するステップとをさら
に含み得る。
【００２６】１つの実施形態では、ネスト化増幅反応
を、配列番号３〜４９およびその相補配列からなる群か
ら選択される少なくとも１つのプライマーを使用して行
う。
【００２７】好ましくは、診断法におけるサンプルは、
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および
細胞からなる群から選択される。
【００２８】好ましくは、増幅反応は、ポリメラーゼ連
鎖反応、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および核酸特異
性ベースの増幅からなる群から選択される増幅反応を含
む。
【００２９】診断方法は、特異的に増幅した産物を１つ
または複数の制限酵素を使用して実証するステップをさ
らに含み得る。
【００３０】好ましくは、制限酵素は、ＰＫＤ特異的産
物を切断してＰＫＤホモログ産物と区別可能な消化パタ
ーンが得られる。
【００３１】より好ましくは、制限酵素は、ＰｓｔＩ、
ＳｔｕＩ、ＸｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＢｓｓＨ
ＩＩ、ＦｓｐＩ、ＭｓｃＩ、およびＢｌｎＩからなる群
から選択される。
【００３２】さらなる態様では、本発明は、各プライマ
ーが配列番号３〜４９またはその相補物からなる群から
選択される単離核酸である、１つまたは複数の核酸プラ
イマーを提供する。
【００３３】本発明はまた、対の少なくとも１つの核酸
が配列番号３〜４９〜なる群から選択される、核酸対を
提供する。
【００３４】好ましくは、核酸対は逆方向であり、配列
番号１または２の配列を含むテンプレート核酸のフラグ
メントを増幅する。
【００３５】別の態様では、本発明は、第１の核酸が配
列番号３〜４９およびその相補的配列からなる群から選
択され、第２の鎖が第１の核酸と逆方向であり、第１お
よび第２の核酸は配列番号１または２の配列を含むテン
プレート核酸のフラグメントを増幅する、少なくとも１
つの単離した第１の核酸および少なくとも１つの単離し
た第２の核酸を含む組成物を提供する。
【００３６】１つの実施形態では、本発明の成分は、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、テンプレート核酸、制限酵素、１つ
または複数のコントロールオリゴヌクレオチドプライマ
ー、ｄｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応緩衝液、およびその組み合
わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分を
さらに含む。
【００３７】好ましくは、組成物中のテンプレート核酸
は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。
【００３８】さらなる態様では、本発明は、第１の核酸
が配列番号１〜４９およびその相補的配列からなる群か
ら選択され、第２の鎖が第１の核酸と逆方向であり、第
１および第２の核酸は配列番号１または２の配列を含む
テンプレート核酸のフラグメントを増幅する、少なくと
も１つの単離した第１の核酸および少なくとも１つの単
離した第２の核酸、ならびにその封入材料を含む、ＰＫ
Ｄ患者を同定するためのキットを提供する。
【００３９】１つの実施形態では、本発明のキットは、
ＤＮＡポリメラーゼ、テンプレート核酸、制限酵素、コ
ントロールオリゴヌクレオチドプライマー、ｄｄＮＴ
Ｐ、ＰＣＲ反応緩衝液、およびその組み合わせからなる
群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む。
【００４０】好ましくは、キット中のテンプレート核酸
は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子である。
【００４１】本発明の目的および特徴は、以下の詳細な
説明および添付の図面を参照してさらに理解することが
できる。
【００４２】
【発明の実施の形態】本発明は、ＰＫＤ遺伝子内の固有
の部位の同定、ＰＫＤ特異的プライマーのデザイン、お
よびこれらのＰＫＤ特異的プライマーの使用によって増
幅されたＰＣＲ産物のＤＨＰＬＣ分析に基づく。
【００４３】Ｉ．定義 本明細書中で使用される、「ＡＤＰＫＤ」は、常染色体
優性多発性嚢胞腎をいう。ＡＤＰＫＤは、非常に一般的
な遺伝性腎疾患であり、腎嚢胞、最終的には腎不全の発
症で特徴付けられ、あるいは、またはそれに加えて肝臓
および腎臓を含む他の器官中の嚢胞ならびに胃腸、心血
管、および骨格筋の異常を含み得る。
【００４４】用語「ＰＫＤ遺伝子」は、染色体部位１６
ｐ１３．３（すなわち、ＰＫＤ−１）または染色体部位
４ｑ２１−２３（すなわち、ＰＫＤ−２）にマッピング
されるゲノムＤＮＡ配列をいい、ＰＫＤタンパク質をコ
ードする伝令ＲＮＡ分子が得られる。ＰＫＤ−１および
ＰＫＤ−２遺伝子は、イントロンおよび推定調節配列を
含む配列番号１および配列番号２の配列をそれぞれ含
む。多数の他の遺伝子と同様に、ＰＫＤ−１およびＰＫ
Ｄ−２遺伝子配列は、個体間で比較した場合、配列のば
らつきを示す。サイレントである（すなわち、遺伝子産
物の遺伝子発現または機能に関して）多型を有するこれ
らの遺伝子は、本明細書中では「正常」と定義する。
【００４５】「正常な」ＰＫＤ遺伝子（例えば、ＰＫＤ
−１またはＰＫＤ−２）は、本明細書中ではＰＫＤ遺伝
子（配列番号１または２に記載のものなど）と定義し、
サイレント多型を有する任意の遺伝子が含まれる。
【００４６】「変異」ＰＫＤ遺伝子は、本明細書中で
は、その配列が１つまたは複数の置換（トランジショ
ン、トランスバージョン）、欠失（遺伝子座の欠損を含
む）、挿入（重複を含む）、転座、および／または正常
なＰＫＤ遺伝子と比較した他の改変を含む変異で改変さ
れているＰＫＤ遺伝子（例えば、ＰＫＤ−１またはＰＫ
Ｄ−２）と定義する。変異により、ＰＫＤ遺伝子産物の
発現または機能が検出可能に変化し、ＡＤＰＫＤの原因
である。変異は、１つから数千個ものヌクレオチドを含
み、それにより、１つまたは複数の種々のＰＫＤ発現の
変化（例えば、発現速度の減少または増加）または欠損
ＲＮＡ転写物またはタンパク質産物の発現が得られる。
変異体ＰＫＤ遺伝子には、ヒト個体のゲノム中の１つま
たは複数のコピーの存在がＡＤＰＫＤに関連する遺伝子
が含まれる。
【００４７】用語「塩基対ミスマッチ」は、配列番号１
または２の配列に相補的ではない任意の核酸配列をい
う。したがって、本発明の塩基対ミスマッチは、正常な
ＰＫＤ遺伝子の変化もしくは多型または変異ＰＫＤ遺伝
子中に存在する任意の改変によって生じ得る。「塩基対
ミスマッチ」は、１つのヌクレオチド塩基対ミスマッチ
または２つまたはそれ以上のヌクレオチド（すなわち、
３、４、５、１０、２０、１００、もしくは５００以
上、または１０００ヌクレオチドまで）の核酸配列を含
み得る。本明細書中で定義のミスマッチの有無は、標的
核酸中の潜在的変異の有無を示す。
【００４８】本明細書中で使用される、用語「真の」
は、配列番号１または２のゲノム配列およびこれら由来
の配列を示し、これらの真の配列は「ＰＫＤホモログ」
を区別するために使用する（以下を参照のこと）。
【００４９】「ＰＫＤ−１ホモログ」は、ＰＫＤ−１と
密接に関連しているが、発現したＰＫＤ−１遺伝子産物
をコードしない配列である。染色体部位１６ｐ１３．１
または４ｑ２１−２３にマッピングされるこのホモログ
のいくつかの例を同定および配列決定した。ＰＫＤ−１
ホモログは、真のＰＫＤ遺伝子と９５％を超えて同一の
配列を共有し得る。
【００５０】本明細書中で使用される、用語「特異的に
増幅された産物」は、真のＰＫＤ遺伝子（例えば、配列
番号１または２）内のフラグメントから増幅されるがＰ
ＫＤホモログから増幅されない産物である。「非特異的
に増幅された産物」は、増幅反応において完全に相補的
ではないテンプレート配列への核酸プライマーのアニー
リングによるＰＫＤホモログまたは他の配列から増幅さ
れた産物である。
【００５１】本明細書中で使用される、「固有の部位」
は、ＰＫＤホモログ配列または他の配列中のストレッチ
と異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＫＤ遺
伝子中の１０〜５０塩基対長のストレッチをいう。固有
部位の１つの例は、５’ＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣ
ＴＣＧＣＴＧＧ３’または５’ＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣ
ＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧ３’またはその相補的配列を含
む。
【００５２】本明細書中で使用される、「ＰＫＤ特異的
プライマー」は、特異的なストリンジェンシー条件下で
ＰＫＤ遺伝子（イントロンおよびエクソンを含む）中の
配列にアニーリングする核酸配列をいう。本発明のＰＫ
Ｄ特異的プライマーは、特異的なストリージェンシー条
件下で真の発現ＰＫＤ−１遺伝子またはＰＫＤ−２遺伝
子中に存在する固有の部位にアニーリングするが、ＰＫ
Ｄホモログまたは他の配列にはアニーリングしない。Ｐ
ＫＤ特異的プライマーは、ＰＫＤ遺伝子内の固有の部位
と９５％を超える（例えば、９６％、９６％、９７％、
９８％、９９％を超えるか１００％）配列が同一であ
る。「ＰＫＤ特異的プライマー」は、１０〜６０ヌクレ
オチド長（例えば、１８〜５２ヌクレオチド長）であり
得る。
【００５３】本明細書中で使用される、用語「特異的ス
トリンジェンシー条件」は、ＰＫＤ特異的プライマーが
ＰＫＤ遺伝子内の配列に特異的にアニーリングする増幅
条件をいう。「特異的ストリンジェンシー条件」下で
は、ＰＫＤ特異的プライマーは、ＰＫＤホモログまたは
他の配列にアニーリングしない。例えば、本発明に有用
な１つの特異的ストリンジェンシー条件は、Ｔａｑ Ｐ
ｒｅｃｉｓｉｏｎ緩衝液（ＴａｑＰｌｕｓ Ｐｒｅｃｉ
ｓｉｏｎ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌ
ａ、カタログ番号６００２１０）、５０ｎＭを超えるｄ
ＮＴＰ濃度（例えば、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または
３００ｎＭ）を含む。特異的ストリンジェンシー条件に
おけるアニーリング温度は、最も低いプライマーアニー
リング温度（Ｔｍ）である５℃を超えても５℃未満でも
５℃でもよい（例えば、Ｔｍよりも１℃、２℃、４℃、
５℃、または１０℃高いかＴｍよりも４℃、３℃、２
℃、または１℃低い）。
【００５４】本明細書中で使用される、ＤＮＡの「増
幅」は、ＤＮＡ配列内の特定のＤＮＡ配列濃度を増加さ
せるために使用される反応をいう。ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸特異
性ベースの増幅（ＮＳＢＡ）、または当該分野で公知の
任意の他の方法を使用して増幅を行うことができる。
【００５５】本明細書中で使用される、「ＲＴ−ＰＣ
Ｒ」は、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応との組み合わせ
をいう。この増幅法は、特異的オリゴヌクレオチド、オ
リゴｄＴまたはランダムプライマーの混合物を使用して
ＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡへの逆転写を惹起する最初のス
テップを使用し、このｃＤＮＡを標準的な増幅技術（例
えば、ＰＣＲ）を使用して増幅する。
【００５６】「テンプレート核酸」または「標的核酸」
（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）は、特定の配
列（例えば、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子配列）
であるかこれを含む正常（例えば、野生型）または変異
核酸である。日常的な組換えＤＮＡ操作の一部としてさ
らなるヌクレオチドを開示の配列の５’および／または
３’末端に添加することができることが理解される。さ
らに、保存的ＤＮＡ置換（すなわち、コードされるアミ
ノ酸配列を変化させないタンパク質コード領域の配列変
化）もまた適合し得る。
【００５７】本明細書中で使用される、「核酸プライマ
ー」は、核酸テンプレートをアニーリングして核酸テン
プレートと相補的な伸長産物を産生するための３’末端
を得ることができるＤＮＡまたはＲＮＡをいう。核酸テ
ンプレートは、標的核酸テンプレートに相補的なプライ
マー伸長産物を産生するように触媒する。開始および伸
長条件には、４つの異なるデオキシリボヌクレオシドお
よび重合誘導剤（ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素
など）、適切な緩衝液（「緩衝液」には、ｐＨ、イオン
強度などに影響を与える補因子が含まれる）、および適
切な温度が含まれる。本発明のプライマーは、一本鎖で
あても二本鎖であっても良い。プライマーは、最大の増
幅効率のためには一本鎖出あり、プライマーおよびその
相補物は二本鎖核酸を形成する。しかしそれは二本鎖で
あり得る。本発明で有用な「プライマー」は、１００ヌ
クレオチド長以下である（例えば、９０、８０、７０、
６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１５ヌクレオ
チド長以下、または１０ヌクレオチド長）。
【００５８】本明細書中で使用される、用語「逆方向」
は、プライマーをいう場合、一方のプライマーが標的核
酸テンプレートのセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列
を含み、他方のプライマーが同一の標的核酸テンプレー
トのアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む
ことを意味する。逆方向プライマーは、相補的な適合核
酸テンプレートからＰＣＲ増幅産物を作製することがで
きる。方向の異なる２つのプライマーを、逆方向プライ
マーおよび正方向プライマーということができる。
【００５９】本明細書中で使用される、用語「同一の方
向」は、プライマーが標的核酸テンプレートの同一の鎖
に相補的なヌクレオチド配列を含むことを意味する。同
一方向のプライマーでは相補的な適合核酸テンプレート
からＰＣＲ増幅産物を作製されない。
【００６０】あるいは、本発明のプライマーを、検出可
能な標識（放射性部分または蛍光標識など）で標識する
ことができるか、増幅反応により標識ヌクレオチドを反
応産物に組み込むことができる。したがって、増幅反応
産物を、蛍光または放射性標識での「検出」によって
「検出」することができる。
【００６１】本明細書中で使用される、用語「核酸」
は、一般に、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変Ｒ
ＮＡもしくはＤＮＡであり得るポリリボヌクレオチドま
たはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「核酸」に
は、一本鎖および二本鎖核酸が含まれるが、これらに限
定されない。本明細書中で使用される用語「核酸」に
は、１つまたは複数の改変塩基を含む上記のＤＮＡまた
はＲＮＡも含まれる。したがって、安定性または他の理
由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡ
は、「核酸」である。本明細書中で使用される、用語
「核酸」には、核酸のこのような化学的、酵素的、また
は代謝的改変形態ならびにウイルスおよび細胞（例え
ば、単純および複雑な細胞を含む）に特徴的な化学的Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡ形態が含まれる。
【００６２】本明細書中で使用される、「単離」または
「精製」は、核酸に関して使用する場合、正常な細胞
（例えば、染色体）環境から天然に存在する配列が除去
されているか、非天然の条件下（例えば、人為的に合成
する）で合成されることを意味する。したがって、「単
離」または「精製」配列は、無細胞溶液中に存在するか
異なる細胞環境下で存在し得る。用語「精製」は、ヌク
レオチドのみが存在する配列であることを意図せず、こ
の配列に天然に関連する非ヌクレオチドまたは核酸物質
を本質的に含まず（約９０〜９５％、９９〜１００％ま
で）、単離染色体と区別されることを意図する。
【００６３】本明細書中で使用される、「ゲノムＤＮ
Ａ」は、ＲＮＡ転写物からコピーされた相補的ＤＮＡに
対するものとしての染色体ＤＮＡをいう。本明細書中で
使用される、「ゲノムＤＮＡ」は、１つの細胞中に存在
する全てのＤＮＡであっても１つの細胞中のＤＮＡの一
部であってもよい。
【００６４】本明細書中で使用される、「相補的」は、
核酸（またはその一部）の一本鎖の逆平行核酸一本鎖の
ヌクレオチド（すなわち、任意の非対合ヌクレオチドに
よって妨害されない）間の連続する塩基対合によって逆
方向核酸鎖（またはその一部）にハイブリッド結合して
相補鎖間に二本鎖核酸を形成する能力をいう。第１の各
核酸が第２の核酸の相補的領域内のヌクレオチドと塩基
対合を形成する場合、第１の核酸は第２の核酸に「相補
的」であるという。第１の核酸の一方のヌクレオチドが
第２の核酸中の対応するヌクレオチドと塩基対を形成し
ない場合、第１の核酸は第２の核酸に完全に相補的では
ない。
【００６５】本明細書中で使用される、「サンプル」
は、天然の環境から単離され、標的核酸を含み、精製も
しくは単離核酸からなり得る生体物質をいうか、標的核
酸を含む組織サンプル、生体流動物サンプル、または細
胞サンプルなどの生体サンプルを含み得る。
【００６６】本明細書中で使用される、「二本鎖ＤＮ
Ａ」は、「二重鎖」ともいう。一方の鎖の塩基配列が他
方の鎖の塩基配列に完全相補的である場合、二重鎖を
「ホモ二重鎖」と呼ぶ。二重鎖が相補的ではない少なく
とも１つの塩基対を含む場合、二重鎖を「ヘテロ二重
鎖」と呼ぶ。本発明では、個体から採取したサンプル由
来の増幅産物を変性および再アニーリングした場合、ヘ
テロ二重鎖の形成は、この個体中の潜在的な変異ＰＫＤ
遺伝子の存在を示す。
【００６７】本明細書中で使用される、「ＤＨＰＬＣ」
は、同一のｂｐ長を有するヘテロ二重鎖（変異の存在に
起因する）およびホモ二重鎖の分離によって配列変異を
検出するために使用される「変性高速液体クロマトグラ
フィー」と呼ばれる分離プロセスをいう。この分離は、
ヘテロ二重鎖がホモ二重鎖よりも低い融解温度（Ｔｍ）
を有するという事実に基づく。ＤＨＰＬＣは、一定の条
件下で１つの塩基対しか異ならないヘテロ二重鎖を分離
することができる。ＤＨＰＬＣを使用して、異なるｂｐ
長の二重鎖を分離することもできる。
【００６８】「ヘテロ二重鎖部位分離温度」、「温度中
心点」、または「Ｔｍ」を、本明細書中では、１つまた
は複数の塩基対がヘテロ二重鎖ＤＮＡフラグメント中の
塩基対ミスマッチ部位で変性される（すなわち、分離す
る）温度を意味すると定義する。
【００６９】ＩＩ．ＰＫＤ遺伝子の一般的説明 ＰＫＤ−１遺伝子（例えば、ｇｅｎＢａｎｋアクセッシ
ョン番号Ｌ３９８８９１、配列番号１）は、第１６染色
体（１６ｐ１３．３）上に存在する約５４ｋｂのゲノム
ＤＮＡであり、１４ｋｂ ｍＲＮＡが転写される４６個
のエクソンで分割された１２，９０６ｂｐのコード配列
を含む（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら、１９９６、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２７２、１３３９〜１３４２；Ｈｕｇｈｅｓら、
１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１０、１５１
〜１６０）。ＰＫＤ−１のタンパク質産物ポリシスチン
１は、推定分子量が４６０ｋＤａの４３０３個のアミノ
酸からなるタンパク質である。最近まで、第１６染色体
（１６ｐ１３．１）に沿ってＰＫＤ−１に隣接してマッ
ピングされる少なくとも３つの相同性の高い遺伝子コピ
ーの存在により、ＰＫＤ−１遺伝子の分析に影響を受け
なかった。約７５％のＰＫＤ−１遺伝子が重複してお
り、その相同性コピーと約９７％同一である。整復領域
は、第１の３３エクソンを含む遺伝子の５０ｋｂ
（５’）部分を含む。エクソン３４〜４６を含む遺伝子
のほとんどの３’（５．７ｋｂ）のみが、ＰＫＤ−１に
固有である。ＰＫＤ−１遺伝子の別の顕著な特徴は、
２．５ｋｂ長（ヒトゲノム中で最長）であるイントロン
２１中のポリピリミジン領域である。ＰＫＤ−２遺伝子
（例えば、ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００
４８５９−００４８７３、配列番号２）は６８ｋｂのゲ
ノムＤＮＡであり、第４染色体（４ｑ２１−２３）上に
存在する（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら、１９９６、前出）。
ＰＫＤ−２は１５個のエクソンを含み、約１１０ｋＤａ
の９６８アミノ酸タンパク質産物が作製される５．４ｋ
ｂの転写物をコードする。ＰＫＤ−２が１コピーの遺伝
子であるので、ＰＫＤ−２の変異分析は、ＰＫＤ−１の
変異分析よりも非常に容易である。ＰＫＤ遺伝子および
そのタンパク質産物をまとめた表１を参照のこと。
【００７０】
【表１】
【００７１】正常な対立遺伝子上の体細胞変異の発生を
支持する証拠に基づいて、多数の家族性癌素因症候群の
病因に類似のツーヒットモデルにより、疾患の臨床的な
病巣発現が説明されている（Ｑｉａｎら、１９９６、Ｃ
ｅｌｌ、８７、９７９〜９８７；Ｗａｔｎｉｃｋら、１
９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．、２、２４７〜２５１）。
簡単に述べれば、このモデルにより、ＡＤＰＫＤは細胞
レベルで劣性であり、第２の体細胞性変異またはヘテロ
接合ＰＫＤ欠損バックグラウンドにおける「ヒット」に
より罹患尿細管上皮細胞におけるＰＫＤ機能がホモ接合
的に喪失することが示唆される。ＰＫＤ機能喪失は、固
有細胞分裂に必要なシグナル伝達機構を崩壊する（すな
わち、嚢胞構造での罹患細胞の異常増殖を誘導する）と
仮定される。
【００７２】ＰＫＤ−１遺伝子の直接配列決定により、
正常な個体における多型の存在およびＡＤＰＫＤ罹患個
体における多数の異なる配列変化が明らかとなった。表
２は、現在までの文献中に記載のＰＫＤ−１配列変化の
概要を示す。
【００７３】
【表２】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【表２（つづき）】
【００７４】ＩＩＩ．ＰＫＤ遺伝子中の固有部位の同定 ７０％のＰＫＤ−１遺伝子がＰＫＤ−１と９５％を超え
る配列が同一の非機能的ホモログとして複製されるとい
う事実により、ＰＫＤ−１固有部位の同定は、遺伝子試
験法の開発に重要である。ヒトゲノム配列解読の成功に
より、ＰＫＤ遺伝子中の固有の部位を、ＰＫＤ遺伝子を
含むゲノムＤＮＡ配列とＰＫＤホモログを含むゲノムＤ
ＮＡ配列との比較によって同定することができる。有用
なデータベースおよびコンピュータプログラムは当該分
野で公知である（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩで利用可能なデータベースお
よびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴおよびＤＮＡＳｔａｒ、ｗｗ
ｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍで利用可能なコンピュータ
プログラム）。固有部位は、ＰＫＤホモログまたは他の
配列と８０％以下（例えば、７０％、６０％、５０％、
４０％、３０％、２０％、または１０％以下）同一であ
るＰＫＤ遺伝子中の配列をいう。
【００７５】いくつかの固有部位（例えば、１コピー部
位）は、Ｒｏｓｓｅｔｔｉら、２０００、Ａ．Ｊ．Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６８、４６〜６３（その全体が本明
細書中で参考として援用される）に記載されている。本
出願の出願人は、ＰＫＤ−１の新規の固有部位（５’Ａ
ＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣＴＣＧＣＴＧＧ３’または
５’ＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧ３’
またはその相補的配列）を同定している。他の固有部位
は、例えば、米国特許第６，２２８，５９１号および同
第６，０３１，０８８号（それぞれ、参照することによ
りその全体を本明細書中に組み込むものとする）に見出
すことができる。
【００７６】同定された固有部位を、真のＰＫＤ遺伝子
増幅用のＰＫＤ特異的プライマーのデザインに使用する
ことができる。固有部位の長さは、数個のヌクレオチド
から数千個のヌクレオチドまで変化することができる。
同定されたほとんどの固有部位は、１００個以下のヌク
レオチド（例えば、５０個以下のヌクレオチドまたは３
０個以下のヌクレオチド）を含む。ＰＫＤ特異的プライ
マーを使用した増幅により、増幅反応の特異性が増加
し、ＰＫＤホモログから増幅される副産物が減少する。
個体中の対立遺伝子変異（例えば、変異ＰＫＤ遺伝子）
を同定するための配列決定または他の分析用のクローニ
ングおよび／もしくは発現に特異的に増幅させた真のＰ
ＫＤ遺伝子産物を使用することができる。
【００７７】ＩＶ．本発明に有用なＰＫＤ特異的プライ
マー 変異の有無を分析するためのサンプルは、検出できない
ほど少量の物質を含む場合がある。したがって、第１の
変異検出アッセイステップは、サンプル増幅である。本
発明の好ましい増幅反応はＰＣＲである。ＰＣＲ増幅
は、プライマーデザイン、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の選
択、増幅サイクル数、および試薬濃度などのステップを
含む。これらの各工程およびＰＣＲプロセスに関連する
他のステップは、増幅産物の純度に影響を与える。複製
の忠実度および産物の純度に影響を与えるＰＣＲプロセ
スおよび因子がＰＣＲ分野で周知であるにもかかわら
ず、以前は本発明の分離法（例えば、ＤＨＰＬＣ）を使
用したＰＫＤ遺伝子の変異検出に関するこれらの因子に
ついて取り組んでいなかった。
【００７８】特異的ストリンジェンシー条件下で真のＰ
ＫＤ遺伝子にアニーリングするがＰＫＤホモログまたは
他の配列にアニーリングしない任意のプライマーは、本
発明の有用なＰＫＤ特異的プライマーである。同定した
固有部位配列を、本発明に有用なＰＫＤ特異的プライマ
ーのデザインの基本として使用する。本発明のプライマ
ーを、ＰＫＤ患者同定用の従来のキットに組み込むこと
ができる。
【００７９】Ａ．プライマーの選択基準 ＰＫＤ種特異的プライマーは、ＰＫＤ遺伝子の固有の部
位中に存在する配列に相補的な配列を含むことが好まし
い。ＰＫＤ特異的プライマーは、ＰＫＤホモログ以外の
真のＰＫＤ遺伝子にアニーリングすることが好ましい限
り、正常または変異ＰＫＤ遺伝子の固有の部位に相補的
であり得る。
【００８０】ＰＫＤ種特異的プライマーを、ＰＫＤ遺伝
子について同定した固有部位配列の分析によって手動で
選択することができる。ＰＣＲで増幅されるＤＮＡフラ
グメント配列が公知である場合、市販のソフトウェアを
使用して全フラグメントまたはフラグメント内の任意の
配列を産生するプライマーを作成することができる。フ
ラグメントの融解マップを、ＭａｃＭｅｌｔ（登録商
標）（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅ
ｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）、ＭＥＬＴ（Ｌｅｒｍａ
ｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５、４８２、
１９８７）、またはＷｉｎＭｅｌｔ（商標）（ＢｉｏＲ
ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などのソフトウェア
を使用して構築することができる。
【００８１】約１８〜２５塩基長で５０％のＧ−Ｃ含量
のプライマーは約５２〜５８℃のアニーリング温度で良
好に作用することが当該分野で公知である。本発明のプ
ライマーをデザインする場合、これらの性質は好まし
い。より長いプライマーまたはＧＣ含量がより高いプラ
イマーは、より高い温度でのアニーリングが最適であ
り、同様に、より短いプライマーまたはＧＣ含有量の低
いプライマーはより低い温度でのアニーリングが最適で
ある。プライマー１７〜２５塩基長の融解温度の概算を
得るための便利且つ単純化した式は以下である。 融解温度（Ｔｍ（℃））＝４×（Ｇ数＋Ｃ数）＋２×
（Ａ数＋Ｔ数）。
【００８２】全デザインプロセスは、広範囲（すなわ
ち、第１ラウンドのＰＣＲ）および狭い範囲のプライマ
ー（すなわち、ネスト化ＰＣＲ）デザインからなる。広
範囲のプライマーデザインでは、質の良いＰＣＲ産物を
産生するプライマーをデザインすることが目的である。
「良質」のＰＣＲ産物は、本明細書中では、ＰＣＲ産物
が高収率で産生されることおよびプライマー二量体およ
びＰＣＲ誘導変異などの不純物の量が少ないことを意味
すると定義する。良質のＰＣＲは、他の反応パラメータ
（使用酵素、ＰＣＲサイクル数、使用緩衝液の濃度およ
び型、サーマルサイクリングの温度、ならびにゲノムテ
ンプレートの質など）にも影響され得る。良質のＰＣＲ
産物の作製法は、Ｅｃｋｅｒｔら（「ＰＣＲ：実践アプ
ローチ」、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｑｕｉｒｋｅ，ａｎｄ
Ｔａｙｌｏｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒ
ｄ、第１巻、２２５〜２４４、１９９１）で考察されて
いる。この引例およびこの引例中の引例は、参照するこ
とによってその全体を本明細書中に組み込むものとす
る。
【００８３】狭い範囲のプライマーのデザインは、２つ
の要件を満たすべきである。第１に、全ての広範囲プラ
イマーデザイン要件を満たし、良質のＰＣＲ産物が得ら
れるべきである。さらに、ＤＨＰＬＣ法により増幅フラ
グメント内の変異または多型の位置に関係なく変異また
は多型を検出可能なフラグメントが産生されなければな
らない。例えば、数千塩基対までを有する巨大ＤＮＡフ
ラグメントをＰＣＲによって増幅することができる。増
幅の目的が所望フラグメントを増幅することのみである
場合、この目的で使用することができるプライマーデザ
インの許容度は大きい。しかし、ＰＣＲ増幅の目的がＤ
ＨＰＬＣによる変異検出分析用のＤＮＡフラグメントを
作製することである場合、ＰＣＲ法で作製したフラグメ
ントが検出可能であり且つＤＨＰＬで分析した場合にシ
グナルを発生するようにプライマーをデザインしなけれ
ばならない。本発明の好ましい実施形態では、増幅産物
の長さは、１５０〜６００ｂｐである。より好ましい実
施形態では、ＤＨＰＬＣ変異検出分析用のフラグメント
長は、１５０〜４００ｂｐである。
【００８４】狭い範囲のプライマーのデザインには２つ
の目的が存在する。プライマーデザインの１つの目的
は、「変異分析」試験として使用する場合である。別の
目的は、研究または診断目的（ＰＫＤ患者の同定）のた
めの分析である。本明細書中では、「変異分析」を、フ
ラグメントが集団中にばらつき（すなわち、変異または
多型）を含むかどうかを同定し、このばらつきを疾患に
関連付けるためのＤＮＡフラグメントの研究または分析
と定義する。本発明の文脈内で、用語「変異」には、疾
患についてサイレントである多型は含まれない（例え
ば、正常）と理解される。ＤＨＰＬＣを変異分析技術と
して使用する場合、本発明の重要な態様は、変異部位が
フラグメント内に存在することに関係なく推定変異を検
出することができるフラグメントを産生するためのプラ
イマーのデザイン法である。それに対して、変異が公知
である場合、分析が至適化される（すなわち、ＤＨＰＬ
Ｃにおけるホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖ピークが最大
になる）ようにプライマーデザインをさらに改良するこ
とができる。公知の変異の分析分離度の改良によって、
分析を正確にすることができる。変異診断への適用のた
めに分離度の改良が必要である。さらに、改良された分
離度を使用して、変異の正の存在の自動同定を、正常お
よび変異ＤＮＡサンプルのピークの重ね合わせおよび比
較測定する適切なソフトウェアおよびアルゴリズムによ
ってより容易に行うことができる。
【００８５】変異分析に適用するための別のプライマー
デザイン法は、目的の領域がフラグメント内のより低い
融解ドメインで存在するようにプライマーをデザインす
ることである。この場合、エクソンに向かって移動する
ように分析を行うので、測定されるフラグメントが目的
の領域に重ね合わせるようにプライマーを設計すること
が好ましい。これらの場合、高温融解ドメインと低温融
解ドメインとの間の温度差は、５℃を超えることが好ま
しく、１０℃を超えることが最も好ましい。
【００８６】一旦目的の変異が同定されると、診断また
は臨床用のプライマーを再デザインすることができる。
これらの場合、末端により近いいずれかの末端の２５％
または２５塩基内に変異が存在することが好ましい。フ
ラグメントの他方の末端は、変異が存在する低温ドメイ
ンよりも好ましくは５℃、より好ましくは１０℃、最も
好ましくは１５℃高い高温融解ドメインを含む。プライ
マー選択によりフラグメントの反対側の末端に高温融解
ドメインが得られない場合、所望の末端（例えば、Ａ−
Ｔリッチな末端）で融解温度を増加させるためにＧ−Ｃ
クランプを適用することができる（Ｍｙｅｒｓら、１９
８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３、
３１１１）。Ｇ−Ｃクランピングは、プライマーの片側
または両側の５’末端上にさらなるＧ−Ｃ塩基を含む技
術である。ポリメラーゼ酵素は、増幅フラグメントに組
み込むこれらのさらなる塩基を超えて伸長させて、変異
周辺の融解温度と比較してフラグメントの末端の融解温
度を上昇させる。例えば、変異が増幅フラグメントの中
央に存在し、長さが１００ｂｐ未満であり、融解プロフ
ィールの変化がない場合または変異がフラグメントの高
温融解領域に存在し、高温融解領域がＧ−Ｃリッチな領
域に存在する場合、Ｇ−Ｃクランプが必要であり得る。
これらの場合、適切なプライマー選択により、変異を検
出することができるフラグメントが得られる。Ｇ−Ｃク
ランプのサイズは、４０ｂｐまでであっても、４または
５ｂｐほど小さくても良い。ＤＨＰＬＣによる変異検出
用の最も好ましいＧ−Ｃクランプは、１０〜２０ｂｐで
ある。
【００８７】ＰＣＲ増幅の際に十分にＴｍ内のフラグメ
ント中で一定の融点範囲またはドメインを有するドメイ
ンを産生するプライマーをデザイン不可能である場合、
ＤＨＰＬＣでの首尾の良い変異検出のために目的のドメ
インのＴｍを下げる必要があり得る。例えば、ｄＧＴＰ
のＧ−Ｃ塩基対の融解温度を有効に低下させることが公
知のアナログ７−デアザ−２’−ｄＧＴＰとの置換によ
ってこれを行うことができる（Ｄｉｅｒｉｃｋら、１９
９３、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１、４４２
７）。ドメインのＴｍを上昇させる必要がある場合、Ｐ
ＣＲ増幅においてｄＧＴＰの代わりに２，６−アミノプ
リンを使用することができる。
【００８８】最も好ましい実施形態では、フラグメント
の「低温融解」ドメイン中に変異が存在するようにプラ
イマーを選択する。しかし、高温融解ドメインがフラグ
メント中の他のドメインと非常に異なる融点ではない場
合またはフラグメントの高温融解ドメインを至適化する
より高いカラム温度を使用する場合、フラグメントの高
温融解ドメイン中の変異をＤＨＰＬＣで検出することも
できる。
【００８９】上記の広範囲プライマーデザインを、いく
つかの他の因子が考慮された局所プライマーデザインに
よってさらに改良することができる。例えば、非テンプ
レートテールを有するプライマー（普遍配列決定プライ
マーまたはＴ７プロモーターなど）を回避する必要があ
り得る。好ましいプライマーのＴｍは約５６℃である。
正方向プライマーと逆方向プライマーとのＴｍ差は、好
ましくは約１℃である。プライマーとテンプレートとの
間のＴｍ差は、好ましくは２５℃である。各プライマー
の３’五量体は、好ましくはΔＧ°＝６ｋｃａｌ／ｍｏ
ｌよりも安定している（すなわち、よりネガティブ）。
任意の可能なプライマー二量体は、好ましくは３’五量
体よりも少なくとも５ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定ではない
（すなわち、５ｋｃａｌよりポジティブ）。任意のプラ
イマーの自己アニーリングループのＴｍは、１２℃未満
であることが好ましい。プライマーは、好ましくは不都
合な配列を含まずに純度が高い。分解を回避するため
に、純水を使用したＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩
衝液中で保存することが好ましい。
【００９０】いくつかの実施形態では、変異のためには
５ｋｂまで（例えば、４ｋｂまで、３ｋｂまで、２ｋｂ
まで、または１ｋｂまで）の長いフラグメント（例え
ば、エクソン）を直接分離することがより都合がよい。
このような長いフラグメントは、一般に、複数の融解温
度のドメインを含む。二本鎖ＤＮＡフラグメントは、温
度上昇に反応して変性する温度安定性の異なる、異なる
領域として一連の不連続な工程で溶解した。これらの温
度安定性の異なる領域を「ドメイン」といい、各ドメイ
ンは、約５０〜３００ｂｐ長である。各ドメインは、各
自それぞれのＴｍを有し、その各Ｔｍに関連する熱力学
的挙動を示す。ドメイン内の塩基ミスマッチの存在によ
り、ドメインが不安定化し、ホモ二重鎖中で見出される
完全な水素結合区画と比較してヘテロ二重鎖中のドメイ
ンのＴｍは減少する。一般に、塩基ミスマッチの存在に
より、Ｔｍが約１〜２℃低下する。
【００９１】好ましい実施形態によれば、１８〜５１個
の塩基長のプライマーおよび配列番号３〜４９のプライ
マーに対するＤＮＡ配列を使用して、最適な結果が得ら
れた（表３および表４）。しかし、当業者は、使用する
プライマーの長さを変化させることができることを認識
している。例えば、少なくとも１５個、好ましくは１７
個の塩基（これらのプライマー（配列番号３〜４９）の
ヌクレオチド配列の連続的塩基）を含むより短いプライ
マーが適切であり得ることが想定される。プライマー長
の正確な上限は重要ではない。しかし、典型的には、プ
ライマーは、約６０塩基以下、好ましくは５０塩基以下
である。さらに、プライマー中に含まれる塩基を、当該
分野では通常の改変（ビオチンまたは蛍光標識などの検
出可能な標識の組み込みが含まれるが、これに限定され
ない）を行うことができる。
【００９２】
【表３】
【表３（つづき）】
【表３（つづき）】
【表３（つづき）】
【表３（つづき）】
【表３（つづき）】
【００９３】
【表４】
【表４（つづき）】
【００９４】Ｂ．ＰＫＤ特異的増幅に有用なプライマー
の組み合わせ。 特異的増幅産物を、１つまたは複数のＰＫＤ特異的プラ
イマーの使用によって作製することができる。好ましく
は、１つの増幅産物の作成に使用した両プライマーは、
ＰＫＤ特異的プライマーである。しかし、１つのＰＫＤ
特異的プライマーを、ＰＫＤ遺伝子の固有部位に相補的
ではない別の非ＰＫＤ特異的プライマーと組み合わせて
使用することができる。非ＰＫＤ特異的プライマーを、
ＰＫＤ特異的プライマーについての上記の同一の基準に
したがってデザインすることが好ましく、ＰＫＤ遺伝子
中の固有の配列以外の配列に完全に相補的であることが
好ましい。非ＰＫＤ特異的プライマーを、コントロール
産物を作製するための増幅反応に含まれるコントロール
プライマーとして使用することもできる。
【００９５】表４および表５に列挙した１つの正方向お
よび１つの逆方向プライマーの使用によって最適な結果
を得ることができるが、他の組み合わせを使用すること
もできる。好ましい実施形態では、増幅産物の長さが１
５０〜６００ｂｐであるように、プライマー対を選択す
る。好ましい実施形態では、ＤＨＰＬＣ変異検出分析用
の増幅フラグメント長が１５０〜４００ｂｐであるよう
にプライマー対を選択する。
【００９６】Ｃ．プライマー合成 プライマー合成法は、当該分野で利用可能である。本発
明のオリゴヌクレオチドプライマーを、任意の従来のＤ
ＮＡ合成法（Ｎａｒａｎｇら（１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏ．、６８、９０）またはＩｔａｋｕｒａ
（米国特許第４，３５６，２７０号）に記載のリン酸ト
リエステル法、Ｂｒｏｗｎら（１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．、６８、１０９）に記載のリン酸ジエス
テル法、またはＭｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８
３，２０２号）に記載のその自動化実施形態など）を使
用して調製することができる。特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、１９８９、「分子クローニング：実験マニュア
ル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．
Ｙ．（本明細書中で参考として援用される）もまた参照
のこと。
【００９７】Ｖ．増幅反応用のテンプレートの調製 配列番号１または２またはその変異体（例えば、多型形
態または変異形態）の全部または一部を含む核酸を含む
任意のサンプルを、本発明の増幅反応のテンプレートと
して使用することができる。本発明の有用なテンプレー
トには、ゲノムＤＮＡ調製物、全ＲＮＡ調製物、粗細胞
溶解物、および組織サンプルが含まれるが、これらに限
定されない。
【００９８】本発明のＰＫＤ特異的増幅用のテンプレー
トとしてゲノムＤＮＡを使用することが好ましい。粗細
胞溶解物または組織サンプルを使用することができると
想定されるが、当業者は、サンプル中に存在する任意の
非ＤＮＡ物質がポリメラーゼ反応またはその後の分析を
妨害し得ると認識する。
【００９９】組織サンプルまたは細胞からゲノムＤＮＡ
を単離することができる。好ましくは、本発明でテンプ
レートとして使用されるゲノムＤＮＡを、分解および汚
染を回避する条件下で単離する。ＤＮアーゼ活性がほと
んどないか全くなくなるように組織サンプルまたは細胞
をプロテアーゼで消化することができる。消化物をＤＮ
Ａ溶媒で抽出する。抽出ゲノムＤＮＡを、例えば透析ま
たはクロマトグラフィーによって精製することができ
る。適切なゲノムＤＮＡ単離技術は、例えば、「現代の
分子生物学プロトコール」、Ａｕｓｕｇｅｌ編、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｅｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に記
載のように当該分野で公知である。
【０１００】好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
を個体から採取した組織サンプルの細胞溶解物から抽出
し、ＰＫＤ増幅のテンプレートとして使用する。組織サ
ンプルの回収はまた、個体組織由来の培養ヒト細胞のイ
ンビトロ採取または、例えば採血、脊椎穿刺、組織塗抹
標本、または組織生検による被験体からの直接インビボ
サンプリング手段を含む。任意選択的に、組織サンプル
を、分析前に、分析可能な条件下でサンプルの核酸を保
管する周知の保存手段（急速凍結、凍結制御レジメ（ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｒｅｇｉｍ
ｅ）、凍結防止剤（例えば、ジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）、グリセロール、プロパンジオール−スクロー
ス）の存在下など）によって保存する。組織サンプル
を、分析のための増幅の保存の前後にプールすることも
できる。いくつかの実施形態では、サンプルは、２人ま
たはそれ以上の個体由来のＤＮＡ、組織、または細胞を
含む。
【０１０１】本発明の方法の実施のために、核酸を含む
任意のヒト組織をサンプリングおよび採取することがで
きる。採取に最も好ましく且つ都合の良い組織は血液で
ある。患者は、採血前に準備する必要はない。投薬がサ
ンプル採取または試験を妨害することは知られていな
い。有用な無菌技術および汚染の回避が必要である。
【０１０２】好ましくは、採血日に血液からＤＮＡを抽
出する。使用前に血液を室温（７２°Ｆまたは２５℃）
で保存することが好ましい。しかし、全血を短期間４℃
で保存することができるが、室温が推奨される。全血試
料は、４８時間安定であり得る。その後の溶血はＤＮＡ
回収および完全性に支障をきたす。ＰＣＲアッセイ用の
ＤＮＡ抽出に至適な血液量は、５ｍｌを超える（例え
ば、１０．０ｍｌを超える）ことが好ましい。
【０１０３】ＶＩ．ＰＫＤ特異的プライマーを使用した
ＰＣＲ増幅 本発明は、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応での標的核
酸を含むサンプル由来のＤＮＡの増幅および特異的増幅
産物における標的核酸中の変異の有無の検出による、配
列番号１または２またはその変異体を含む標的核酸の変
異分析法を提供する。
【０１０４】当該分野で周知の手段（例えば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写ベースの増幅（逆転
写）、鎖置換増幅）によって増幅を行うことができる
（「現代の分子生物学プロトコール」を参照のこと）。
好ましくは、Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２
０２号）（その内容が本明細書中で参考として援用され
る）に記載のようなＰＣＲによって増幅を行う。
【０１０５】ＰＣＲにより、「プライマー」と呼ばれる
小さなＤＮＡ鎖を「テンプレート」に沿って伸長させる
ためにＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる選択性の高い酵素
の利用によって、小さなＤＮＡサンプルまたは任意の塩
基対の長さ（サイズ）の他の核酸の増幅（複製）が可能
である。小さなＤＮＡサンプルを、テンプレートとして
使用する。ＰＣＲは、テンプレートまたはその任意の選
択部分中に存在するデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄ
ＮＴＰ）の相補配列を再生する。ＰＣＲは、一般に、例
えば、検出限界未満の濃度のＤＮＡサンプルをＰＣＲ法
によって増幅し、その後このようにして得られた大量の
サンプルを分析する診断技術と組み合わせて使用する。
【０１０６】ＰＣＲ増幅装置（例えば、Ａｉｒ Ｔｈｅ
ｒｍｏ Ｃｙｃｌｅｒ（ＩｄａｈｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ））および試薬は、多数の業者から市販されてい
る（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒカタログ「ＰＣ
Ｒシステム、試薬、および消耗品」、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）。
【０１０７】典型的には、ＰＣＲはｐＨ５〜８の緩衝液
中で行う。緩衝液は、増幅すべき二本鎖ＤＮＡサンプ
ル、正方向プライマー、逆方向プライマー、マグネシウ
ム（例えば、ＭｇＣｌ２）、および一般に「ｄＮＴＰ」
と呼ばれる４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）（ＤＮＡ
の構築ブロック）を含む。反応混合物を、ＤＮＡサンプ
ルの変性に十分な温度（例えば、＞９０℃）に加熱し、
それにより２つの相補核酸鎖が分離する。あるいは、周
囲温度でヘリカーゼ酵素を使用して、ＤＮＡを酵素的に
変性することができる。変性が熱に影響を受け、且つ熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、反応開始前
にＤＮＡポリメラーゼを添加する。他の変性条件は当業
者に周知であり、米国特許第５，６９８，４００号に記
載されている。ＤＮＡポリメラーゼは種々の業者から市
販されている（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ
（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．））。
【０１０８】ＰＣＲで複製すべき変性ＤＮＡ鎖の同定部
分に相補的になるように、プライマー配列をデザインす
る。反応物の適切なアニーリング温度への冷却の際、各
プライマーを複製すべき変性ＤＮＡサンプルの各鎖中の
相補塩基配列にアニーリングする。ＤＮＡポリメラー
ゼ、４つのｄＮＴＰ、およびＭｇ２＋の存在下で約７０
℃に加熱し、複製により相補ｄＮＴＰの添加によりその
３’末端から鎖の長さに沿ってプライマーが伸長する。
ｄＮＴＰは種々の業者から市販されている（例えば、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．
Ｊ．））。このプロセスの多数の反復により、本プロセ
スの初期段階で所望のＤＮＡ鎖数が相乗的に増加する
か、反応液中に十分に過剰な試薬が存在する限り増加す
る。したがって、元のＤＮＡサンプル量が増加する。
【０１０９】ポリメラーゼ量は、所定の増幅サイクル数
を通してＤＮＡ合成の促進に十分でなければならない。
実際のポリメラーゼ量に関するガイドラインは、一般
に、ＰＣＲ試薬の供給者が提供しており、あるいは当業
者によって容易に決定可能である。好ましくは、校正活
性（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を
有するＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【０１１０】各プライマーの量は、実質的に過剰量の増
幅すべき標的ＤＮＡ量でなければならない。当業者は、
反応混合物に必要なプライマー量を、反応の終了後に最
終的な所望の増幅フラグメント数に関して評価すること
ができる。
【０１１１】偽陽性の結果を回避するために、当業者
は、当該分野で従来のようにアッセイはネガティブコン
トロールを含むべきであることを認識する。例えば、適
切なネガティブコントロールは、プライマーおよびＤＮ
Ａを含まない（すなわち、「水コントロール」）。偽陰
性の結果を回避するために、コントロールプライマーに
よってポジティブコントロールを得る（以下を参照のこ
と）。
【０１１２】Ａ．ＰＣＲ条件の至適化 首尾の良い特異的増幅（例えば、本発明による最大量の
特異的増幅産物を産生し、且つ最小量の非特異的増幅産
物を産生する増幅）は、対応する適合テンプレートへの
ＰＫＤ特異的プライマーに非常に依存する。プライマー
が反応混合物中の多数の異なる配列に非特異的にアニー
リングする場合、増幅プロセスは特異的ではない。ほと
んどの実施形態で非特異的アニーリングまたは非特異的
増幅が回避される可能性が低いにもかかわらず、非特異
的増幅が減少する一方で特異的増幅が増加するようにＰ
ＣＲ増幅反応条件を至適化することが望ましい。
【０１１３】さらに、非相補塩基をテンプレートに添加
するＰＣＲ誘導変異が、サンプル増幅中に形成される場
合がある。検出された変異がサンプル中に存在するかＰ
ＣＲプロセス中に産生されたかは明白ではないので、こ
のようなＰＣＲ誘導変異は変異検出結果をあいまいにす
る。出願人は、ＰＣＲ誘導変異の形成を最小にし、推定
上の変異含有サンプルの正確且つ明白な分析を確実にす
るためのＰＣＲサンプル増幅至適化の重要性を認識して
いた。
【０１１４】Ｂ．ＰＫＤ特異的プライマーのＰＫＤ特異
的アニーリングの特異性の制御 ＰＣＲによるＤＮＡフラグメント複製の忠実度は、当該
分野で長く認識されている多数の要因に依存する。これ
らの要因のいくつかは、１つの要因の量または濃度の増
減によって生じるＰＣＲ産物プロフィールの変化を相殺
し得るか異なる要因の変化によって逆になるという意味
で相関関係がある。例えば、酵素濃度の増加により複製
忠実度が減少し得る一方で、反応温度の低下により複製
忠実度が増大し得る。マグネシウムイオン濃度またはｄ
ＮＴＰ濃度の増加により、ＰＣＲ忠実度の減少に影響を
与え得る反応速度が増加し得る。ＰＣＲ忠実度に寄与す
る要因の詳細な考察は、Ｅｃｋｅｒｔら（「ＰＣＲ：実
践アプローチ」、１９９１、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｑｕ
ｉｒｋｅ，ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、第１巻、２２５〜２４４）、Ａｎｄ
ｒｅら（１９７７、「ゲノム研究」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、８４３〜８５２）に示されている。これらの引例
およびこの引例中の引例は、その全体が本明細書中で参
考として援用される。したがって、ＰＣＲプロセスの産
物プロフィールの利用可能性により、ＰＣＲ条件を非常
に有効な様式が得られるように改良することができる。
【０１１５】ＰＣＲ増幅では、アニーリングの特異性
は、第１の数サイクルで最も重要である。残りのサイク
ルは、最初の数サイクルで増幅されたテンプレートのプ
ールを拡大するためだけに使用される。テンプレートへ
のプライマーアニーリングの特異性を、緩衝液のイオン
強度（主に、Ｋ＋濃度）、Ｍｇ２＋濃度（ｄＮＴＰに結
合するのでｄＮＴＰ量の影響を受ける）、および各複製
サイクルのアニーリング温度によって制御する。好まし
い実施形態では、ｄＮＴＰ濃度は、５０ｎＭ、好ましく
は１００ｎＭ、より好ましくは２００ｎＭである。
【０１１６】特定のテンプレート標的へのプライマーの
特異的アニーリング条件を、通常、アニーリング温度の
幾らかの上昇の変化およびアガロースゲル電気泳動によ
る増幅プロセスの特異性および感度の比較によって経験
的に決定しなければならない（「現代の分子生物学プロ
トコール」、前出を参照のこと）。
【０１１７】ＰＫＤ特異的プライマーに相補的な固有領
域はホモログ配列と数個のヌクレオチドのみ（１つのヌ
クレオチドのみの場合もある）が異なり得るので、増幅
反応の特異性は反応で使用した各ＰＫＤ特異的プライマ
ーについて試験する必要がある。
【０１１８】上記のプライマーアニーリング温度の計算
式は、大まかな指針であり、その後の異なるアニーリン
グ温度での試験は、ＰＫＤ特異的増幅反応におけるこの
重要なパラメータを至適化する有用な方法である。特定
のプライマー−温度対の異なるアニーリング温度の同時
試験に装置を利用することができ、これは最適なアニー
リング温度を迅速且つ確実に決定することができる（例
えば、ロボサイクラー・グラジエント・テンペラチャー
・サイクラー、カタログ番号４００８６４、Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ；エッペンドルフマスターサイクラーグラジ
エント、カタログ番号５３３１ ０００．０４５、Ｂｒ
ｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、
Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）。
【０１１９】いくつかの実施形態では、プライマー対の
Ｔｍよりも１℃〜１０℃高いアニーリングおよび伸長温
度で標的配列を増幅する。この温度での増幅は不十分で
あるにもかかわらず、得られた任意のプライマー伸長物
は標的特異的である。したがって、高温サイクル中、サ
ンプルは特定の標的配列が富化し、任意のサイクル数
（すなわち、１〜１５サイクル）で産物特異性が向上す
る。次いで、アニーリング温度を低下させて増幅効率を
上げ、検出可能な量のＰＣＲ産物を得ることができる。
テンプレートとして第１のＰＣＲ反応物由来の増幅産物
を使用してネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）増幅反応を行うこ
ともできる（以下を参照のこと）。
【０１２０】あるいは、最少量の非特異的産物を含む高
収率の特異的産物を得るための至適条件を定義するため
に、一定の温度であるがＫＣｌまたはＭｇＣｌ２濃度が
異なるか、種々の量のホルムアミド（例えば、０、２、
４、６％）、ＤＭＳＯ（１〜１０％）などの変性剤を添
加する反応を同時に行うことができる。
【０１２１】１つの実施形態では、配列番号３〜４９か
らなる群から選択される少なくとも１つを含むプライマ
ー対を、増幅反応混合物で使用する。１つまたは複数の
特異的に増幅する産物が作製されるように、２つのプラ
イマーは逆方向である。
【０１２２】いくつかの実施形態では、ＰＫＤ特異的増
幅で使用するプライマーが配列番号３〜４９から選択さ
れる場合、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ緩衝液ＩＩおよびＭ
ｇＣｌ２溶液を含むＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのｒＴｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼＸＬ＆ＸＬ緩衝液ＩＩパック、お
よびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＴａｑＰｌｕｓ精密ＰＣＲ
システムを使用した。ＰＦＵＴｕｒｂｏ（商標）は、Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから提供されているより高い校正を
有する別の忠実度の高いＤＮＡポリメラーゼである。
【０１２３】他の実施形態では、配列番号３〜４９から
選択されるプライマーを使用したＰＫＤ特異的増幅に６
５℃を超えるアニーリング温度（例えば、６８〜７２
℃）を使用する。
【０１２４】一般に、プライマーおよびテンプレートを
添加後にＤＮＡポリメラーゼを増幅反応混合物に添加す
ることが好ましいが必須ではない。あるいは、例えば、
酵素およびプライマーを最後に添加するか、反応緩衝液
またはテンプレート＋緩衝液を最後に添加する。一般
に、重合に不可欠な少なくとも１つの成分がプライマー
およびテンプレートが共に存在するときまで存在せず、
酵素が所望のプライマー／テンプレート基質に結合およ
び伸長することができることが望ましい。「ホットスタ
ート」と呼ばれるこの方法は、「プライマー−二量体」
の形成を最少にし、増幅特異性を改良する。
【０１２５】ＤＮＡポリメラーゼの特異性の程度は、使
用した反応条件および使用酵素の型で変化する。完全に
エラーのないプライマー伸長が得られる酵素は存在しな
い。したがって、非相補塩基を随時移入することができ
る。このような酵素関連エラーにより、元のＤＮＡサン
プルの正確なコピーではないがＰＣＲ誘導変異を含む二
本鎖ＤＮＡ産物が得られる。他のＰＣＲプロセスの特徴
（反応温度、プライマーアニーリング温度、酵素濃度、
ｄＮＴＰ濃度、Ｍｇ２＋濃度、およびその組み合わせな
ど）は全て本明細書中に記載のＰＣＲプロセスによるＤ
ＮＡ複製の精度または忠実度の低下させる可能性があ
る。
【０１２６】Ｃ．ＰＫＤ特異的増幅感度 本発明のＰＫＤ特異的増幅感度は、増幅反応で使用した
テンプレートおよびプライマーならびに増幅の各サイク
ルのイオン強度およびアニーリング温度に依存する。
【０１２７】テンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用す
る場合、反応条件が至適化されている場合に首尾の良い
ＰＣＲ増幅には１つまたは２つほどのテンプレートコピ
ー（約３〜５ｐｇ）を使用することができる。しかし、
より高いテンプレート濃度により増幅の特異性および効
率を増大することができることが当該分野で公知であ
る。
【０１２８】長いフラグメントよりも短いフラグメント
のほうが増幅効率が高い。好ましくは、１ｋｂ未満、よ
り好ましくは６００ｂｐ長未満、または４５０ｂｐ長未
満の増幅産物を作製するプライマーを使用して、増幅ア
ッセイの感度を上げる。
【０１２９】好ましくは、増幅アッセイの感度は、１０
０ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート未満である。より好ま
しくは、アッセイ感度は１０ｎｇゲノムＤＮＡテンプレ
ート未満である。より好ましくは、アッセイ感度は１ｎ
ｇゲノムＤＮＡテンプレート未満である。より好ましく
は、アッセイ感度は０．１ｎｇゲノムＤＮＡテンプレー
ト未満である。さらにより好ましくは、アッセイ感度は
０．０１ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート未満である。
【０１３０】Ｄ．ネスト化増幅 本発明のいくつかの実施形態では、テンプレートとして
最初の増幅反応の増幅産物を使用してネスト化増幅を行
う。好ましくは、ネスト化増幅反応は、テンプレートと
して最初のＰＣＲ反応由来のＰＣＲ増幅産物を使用した
ネスト化ＰＣＲである。プライマーのアニーリング温度
の至適化に加えて、「ネスト化」増幅を使用して、ＰＫ
Ｄ特異的増幅アッセイの特異性および感度を上げること
ができる。
【０１３１】例えば、ネスト化ＰＣＲを含む方法は、２
つの連続するＰＣＲ反応を含む。少なくとも１つのＰＫ
Ｄ特異的プライマーを含む第１のプライマー対（例え
ば、ＰＫＤ特異的プライマーおよびコントロールプライ
マーまたは２つのＰＫＤ特異的プライマー）を使用した
多サイクルのＰＣＲ後（例えば、１０〜４０、１０〜３
０、または１０〜２０サイクル）、少量のアリコートの
第１の反応物（例えば、５０μｌの反応物のうち１μ
ｌ）を、第１の対の内部または第１の対の間に存在する
配列にアニーリングする少なくとも１つのＰＫＤ特異的
プライマーを含む新規のプライマー組（例えば、ＰＫＤ
特異的プライマーおよびコントロールプライマーまたは
２つのＰＫＤ特異的プライマー）を使用した第２の多サ
イクル（例えば、１０〜４０、１０〜３０、または１０
〜２０サイクル）ＰＣＲ反応用のテンプレートとして使
用する。
【０１３２】ネスト化プライマーのデザインおおびネス
ト化ＰＣＲ法は、当該分野で公知である（現代の分子生
物学プロトコール、前出を参照のこと）。上記のプライ
マーの一般的な選択基準もまた、ネスト化プライマーの
デザインに適用する。両ネスト化プライマーは第１のプ
ライマー対の内部（例えば、プライマー内）の配列およ
び少なくとも１つのネスト化プライマーにアニーリング
する必要があるが、本発明によれば、ＰＫＤ特異的であ
ることが必要である。
【０１３３】ネスト化ＰＣＲ法を使用して、ＰＫＤ特異
性が２倍の首尾よく増幅したテンプレートを選択する。
１つのプライマー対のみでは失敗する場合、ネスト化Ｐ
ＣＲの使用により、種特異的産物の収率も非常に増大
し、アッセイ感度を挙げることができる。
【０１３４】ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むサンプ
ルを使用して、増幅反応用のＤＮＡテンプレートを得る
ことができる。好ましくは、テンプレートとしてゲノム
ＤＮＡを使用する。ゲノムＤＮＡを含むサンプルを反応
混合物で使用する場合、配列番号〜４９からなる群から
選択される少なくとも１つを含むプライマー対により、
少なくとも２つの特異的増幅産物（ゲノムＤＮＡテンプ
レート中の各ＰＫＤ対立遺伝子由来の産物）が作製され
る。
【０１３５】Ｅ．増幅コントロール コントロールプライマーを、ＰＫＤ特異的増幅のポジテ
ィブコントロールとして使用することができる。コント
ロールプライマーを、ＰＫＤ特異性増幅用の同一の反応
混合物に添加するか、同一のパラメーター下の同一のＰ
ＣＲ装置で運転するコントロール反応に添加することが
できる。コントロールプライマーは、ＰＫＤ遺伝子とＰ
ＫＤホモログとの間の任意の同一の配列に相補的な配列
を含み得る。好ましくは、コントロールプライマーによ
りそのサイズが少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマ
ーを含むプライマー対によって増幅されたサイズと区別
することができる１つの増幅産物が作製される。コント
ロールプライマーによる増幅産物のサイズは、少なくと
も１つのＰＫＤ特異的プライマーを含むプライマー対に
よって作製した増幅産物のサイズより大きくても小さく
ても良い。好ましくは、少なくとも１つのＰＫＤ特異的
プライマーを含むプライマー対によって同一の増幅反応
で作製した増幅産物と比較して少なくとも１００ｂｐ、
より好ましくは少なくとも５００ｂｐ、より好ましくは
少なくとも１０００ｂｐサイズが異なるコントロール産
物が作製されるようにコントロールプライマーを選択す
る。
【０１３６】ＰＫＤ特異的プライマーがアニーリングす
る位置で欠失したＰＫＤ対立遺伝子を分析する場合、コ
ントロール増幅は特に重要である。増幅コントロール産
物の存在下での特異的増幅の欠損は、ＰＫＤ遺伝子の特
定の位置での欠失を示し得る。いくつかの実施形態で
は、反応混合物中に１対を超えるコントロールプライマ
ーを使用する。
【０１３７】本発明の遺伝子試験法で使用することがで
きる種々のコントロールについては実施例２を参照のこ
と。
【０１３８】増幅産物を精製して当該分野で公知の方法
による増幅に使用した遊離のプライマーを除去すること
ができる（例えば、「現代の分子生物学プロトコー
ル」、前出）。好ましい実施形態では、Ｅｄｇｅ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕｉｃｋｓｔｅｐ（商標）の９６
ウェルＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ産物を精製す
る。
【０１３９】ＶＩＩ．ＰＣＲ増幅産物の存在の検出 ＤＮＡ変性、プライマーアニーリング、およびプライマ
ーの５’末端によって規定されるＤＮＡセグメントの合
成のサイクルを、検出に十分な量の種特異的または普遍
産物のいずれかが利用可能になるまでテンプレート標的
の増幅に必要な回数だけ反復する。増幅反応の完了後、
増幅産物の存在を当該分野で従来の技術を使用して検出
することができる。
【０１４０】検出を容易にするために、プライマーを標
識することができる。プライマーを、検出可能なタグ
（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、または１２５Ｉな
どの放射性標識、フルオレセインまたはローダミンなど
の蛍光化合物、ペルオキシダーゼもしくはアルカリホス
ファターゼなどの酵素、またはアビジンもしくはビオチ
ン）で直接標識することができる。ＰＫＤ特異的産物の
作製に使用するＰＫＤ特異的プライマーおよびコントロ
ール産物の作製のみで使用するコントロールプライマー
は、同一または異なる標識を有し得る。
【０１４１】好ましい実施形態では、増幅産物をゲル電
気泳動によって分析することが都合がよい。
【０１４２】フラグメントの所望の分離度をもたらす条
件下で電気泳動を行う。通常、約５００ｐｂほど小さい
サイズが異なるフラグメントを分離する分離度で十分で
ある。好ましくは、分離度は約１００ｂｐである。より
好ましくは、分離度は約１０ｂｐである。フラグメント
のサイズを評価するために、サイズマーカーもまたゲル
上で電気泳動することができる。特異的増幅産物の予備
サイズ分析は、ＰＫＤ遺伝子内の挿入または欠失を示す
ことができ、その後のＤＨＰＬＣおよび配列分析から得
た結果と併せて、得られた情報を解釈することができ
る。
【０１４３】増幅産物パターンを視覚化することができ
る。増幅プライマーを標識した場合、この標識を明らか
にすることができる。分離された標識ＤＮＡフラグメン
トを含む基質を、標識の存在を検出する試薬と接触させ
る。例えば、放射性標識プライマーから作製された増幅
産物を、オートラジオグラフィーで検出することができ
る。増幅プライマーが検出されない場合、ＰＣＲ産物を
有する基質を、臭化エチジウムと接触させて、ＤＮＡフ
ラグメントを紫外線下で視覚化することができる。
【０１４４】ＶＩＩＩ．ＰＣＲ増幅産物の分離 完全に相補的な配列のみがアニーリングし、１つまたは
複数の非相補ヌクレオチドを含む配列はアニーリングし
ない最もストリンジェントな条件下で、ＰＫＤ特異的プ
ライマーは、真のＰＫＤ遺伝子テンプレートのみとアニ
ーリングし、ＰＫＤホモログとはアニーリングしない。
したがって、最もストリンジェントな条件下では、ＰＫ
Ｄ特異的プライマーは、ＰＫＤ特異的であるか特異的な
逆方向プライマーと組み合わせて、ＰＫＤホモログでは
なく真のＰＫＤテンプレートから増幅産物のみを作製す
る。しかし、典型的なＰＣＲ増幅反応の際、ＰＫＤ特異
的プライマーは、特にＰＣＲ反応に必要な温度サイクリ
ングによって真のＰＫＤ遺伝子およびＰＫＤホモログを
含むテンプレートにアニーリングすることができる。し
たがって、特異的増幅産物および非特異的増幅産物をの
両方を産生することができるにもかかわらず、非特異的
増幅産物の量を少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマ
ーの使用によって減少させることができる。
【０１４５】Ａ．ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の形成 本発明の１つの実施形態では、ホモ二重鎖とヘテロ二重
鎖との混合物を、ＤＨＰＬＣ分析前に形成する。標準的
な核酸ホモ二重鎖（例えば、正常なＰＫＤ対立遺伝子由
来の増幅産物）をサンプルに添加し、混合物の約９０℃
または約９５℃への加熱によって混合物を変性させるこ
とができる。変性プロセスで形成された変性一本鎖核酸
を、混合物の周囲温度への緩やかな冷却によってアニー
リングする。サンプルが変異を含む場合、ホモ二重鎖と
ヘテロ二重鎖との新規の混合物が形成される。サンプル
が変異を含まない場合、標準的な核酸のホモ二重鎖のみ
が形成される。好ましい実施形態では、標準的な核酸
は、「正常な」核酸である。
【０１４６】ほとんどの場合、ＰＫＤ患者は、ＰＫＤ遺
伝子を含む遺伝子座でヘテロ接合性である。すなわち、
キャリアはたった１つのＰＫＤ対立遺伝子および変異形
態を有し、正常な形態（例えば、野生型）の他の対立遺
伝子を有する。ほとんどのＰＫＤ変異により優性表現型
が得られるので、ＡＤＰＫＤの発症リスクの付与には１
つの変異対立遺伝子で十分である。両方の対立遺伝子が
変異しているが、それぞれ１つまたは複数の異なる変異
を有する場合、別のヘテロ接合状況が存在する。ヘテロ
接合性ＰＫＤ患者について、少なくとも１つのＰＫＤ特
異的プライマーを含むプライマー対を使用したＰＣＲ増
幅（ネスト化ＰＣＲ増幅を含む）により、少なくとも２
つの特異的増幅ＰＫＤ産物（各対立遺伝子由来の産物）
が得られる。２つの特異的増幅ＰＫＤ産物同一の長さで
あってもなくてもよく（例えば、１つの対立遺伝子上の
変異が欠失または挿入を含む場合、異なる長さ）、それ
ぞれの産物由来の少なくとも１つのヌクレオチドで異な
る。
【０１４７】増幅産物を変性し、互いに再アニーリング
して二重鎖を形成することができる。正常な対立遺伝子
由来の特異的増幅産物または変異対立遺伝子由来の特異
的増幅産物が同一の対立遺伝子由来の別の特異的増幅産
物にアニーリングする場合、これらはホモ二重鎖を形成
する。しかし、正常な対立遺伝子由来の特異的増幅産物
が変異対立遺伝子由来の特異的増幅産物にアニーリング
する場合、これらはヘテロ二重鎖を形成する。
【０１４８】まれな場合、変異はホモ接合性形態である
（すなわち、個体（例えば、ＰＫＤ患者）中の両対立遺
伝子は同一の変異を含む）。ホモ接合性ＰＫＤ患者から
サンプルを採取する場合、ＰＣＲ増幅により、変性およ
び再アニーリングの際にヘテロ二重鎖を形成することが
できる特異的増幅産物は得られない。本発明のいくつか
の実施形態では、少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライ
マーを含むプライマー対を有する増幅により正常なＰＫ
Ｄ遺伝子由来の特異的増幅産物が産生されて、ＰＣＲ増
幅後の変性および再アニーリングプロセスの際にヘテロ
二重鎖の形成が確実になるように、正常な（例えば、野
生型）ＰＫＤ遺伝子を含むサンプルをＰＣＲ反応混合物
に添加する。
【０１４９】変性および再アニーリングプロセスで形成
されたホモ二重鎖はまた、非特異的増幅産物によって形
成されるものを含み得る。非特異的増幅産物が得られる
テンプレート対立遺伝子（例えば、ＰＫＤホモログ配
列）中の配列が１つまたは複数の変異も含むような非常
にまれな場合、ヘテロ二重鎖もまた形成され得る。非特
異的増幅産物間で形成されたヘテロ二重鎖を、さらなる
同定プロセスの分離にも供する。
【０１５０】Ｂ．ヘテロ二重鎖の分離および同定 ＰＫＤ特異的増幅産物によって形成されたヘテロ二重鎖
の存在は、ＰＫＤ遺伝子中の変異の存在を示す。ヘテロ
二重鎖野分離によって、変異対立遺伝子が、（例えば、
個体から）採取したサンプル中に存在するかどうかを同
定することができる。この分離プロセスにより非特異的
増幅産物が除去され、それにより正常な対立遺伝子由来
の特異的増幅産物は、変異対立遺伝子およびＰＫＤ患者
の同定効率および特異性を改良する。
【０１５１】ヘテロ二重鎖は塩基対ミスマッチ部位で選
択的に変性し、ヘテロ二重鎖の残存物（すなわち、相補
塩基対を含むヘテロ二重鎖の一部）の変性に必要な低温
で「バブル」を形成することがＤＮＡ分野で周知であ
る。ミスマッチ塩基間の水素結合が相補塩基間の水素結
合よりも弱いので、一般に部分変性と呼ばれるこの現象
が起こる。したがって、変異部位でのヘテロ二重鎖の変
性にはエネルギーはあまり必要ないので、鎖の残存物中
よりも塩基対ミスマッチ部位でヘテロ二重鎖を部分的に
変性するためには低温を必要とする。
【０１５２】ヘテロ二重鎖中の少なくとも１つの塩基対
が相補的でない場合、その部位の塩基の分離にはホモ二
重鎖中の完全に相補的な塩基対アナログと比較して少な
いエネルギーを使用する。これにより、ホモ二重鎖と比
較してヘテロ二重鎖の融解温度が低下する。局所変性よ
り、塩基対ミスマッチ部位に「バブル」（一般名）が形
成される。バブルは、同一の塩基対長の完全に相補的な
ホモ二重鎖と比較してＤＮＡフラグメント構造が歪んで
いる。部分的変性条件下でのこの構造のゆがみを、ヘテ
ロ二重鎖とホモ二重鎖を分離するためのＤＨＰＬＣの基
本として使用する。
【０１５３】「変性ＨＰＬＣ」（ＤＨＰＬＣ）と呼ばれ
る分離プロセスは、ヘテロ二重鎖（変異の存在から得
る）を分離すること、および同一のｂｐ長を有するホモ
二重鎖によって変異体が検出された。ＤＨＰＬＣを経に
検出に適用する（例えば、Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、１９
９７、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７、９９６；
Ｌｉｕら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．、２６、１３９６を参照のこと）。この分離は、ヘ
テロ二重鎖がホモ二重鎖よりも融解温度（Ｔｍ）が低い
という事実に基づく。ＤＨＰＬＣを部分的変性温度（す
なわち、塩基ミスマッチ部位でのヘテロ二重鎖の変性に
十分な温度）で行う場合、ホモ二重鎖を、同一の塩基対
長を揺するヘテロ二重鎖から分離することができる（Ｈ
ａｙｗａｒｄ−Ｌｅｓｔｅｒら、１９９５、Ｃｅｎｏｍ
ｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５、４９４；Ｕｎｄｅｒｈｉｌ
ｌら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、９３、１９３；Ｄｏｒｉｓら、１９９７、
ＤＨＰＬＣ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。これらの引例およびこの引例中
の引例は、その全体が本明細書中で参考として援用され
る。したがって、ＤＨＰＬＣの使用を、変異検出に適用
した（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７、９９６；Ｌｉｕら、１９９
８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２６、１３
９６）。ＤＨＰＬＣは、一定の条件下でわずか１つの塩
基対が異なるヘテロ二重鎖を分離することができる。上
記の引例およびこの引例中の引例を参照することによっ
てその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０１５４】規則正しい二重鎖由来のＤＮＡ構造の塩基
対を含まない無秩序かつ重なっていない構造への変化
は、二重鎖−ランダム鎖移行（ｈｅｌｉｘ−ｒａｎｄｏ
ｍ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（すなわち、
融解）と呼ばれる。天然の配列の二本鎖分子についての
温度の関数としてこの変化を示す平衡の統計学的機械的
分析は、Ｗａｒｔｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｎｔｒｏｌｌ
（１９７２、Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、２２、１
２９）に示されている。この理論は、各塩基対が以下の
内２つの可能な状態（積み重ね、らせん、および水素結
合または無秩序）でのみで存在することができると仮定
する。塩基配列および非常に少数の経験的に較正したパ
ラメーターのみが与えられた場合、任意の温度で各塩基
対がらせんまたは融解する可能性を計算可能である。統
計的−機械的理論は、各塩基対または塩基付近のクラス
ターの本来の安定性の相違、隣接塩基対がらせんまたは
融解（協同性）している可能性に対する隣接らせん構造
の影響、および両末端がらせん構造で区切られた場合の
無秩序領域の高次構造自由度の制限を考慮する。
【０１５５】厳密に区切られた一連の温度工程での可能
性の計算および補間法の繰り返しにより、各塩基対がら
せんと融解状態との間で５０／５０の平衡を保つ温度中
心点が同定される。ＭＥＬＴプログラムにより、温度中
間点およびいくつかの他の関数が得られる。分子に沿っ
た位置の関数としての温度中心点のプロットを、融解マ
ップと呼ぶ。これは、隣接塩基対の融解が個体間の安定
性の相違にもかかわらず分子の実質的な長さを超えて密
接に結合することを明白に示す。ほとんど同一の温度で
全ての塩基が融解するドメインと呼ばれるわずかに長い
領域（３０〜３００ｂｐ）の存在が典型的である。融解
マップは分子の最も低い融解ドメインをそのまま表す。
【０１５６】部分的変性温度では、サンプル配列中の塩
基対ミスマッチを有するヘテロ二重鎖はミスマッチ部位
で変性し、残りのサンプル配列は無傷のままである。部
分的変性へテロ二重鎖を、ＤＨＰＬＣを使用して分離お
よび検出することができる。
【０１５７】ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖との混合物を分
離するための部分変性条件下（例えば、ＤＨＰＬＣ）で
ＨＰＬＣを使用する場合、ヘテロ二重鎖は、通常、ホモ
二重鎖の前に溶出される。
【０１５８】本発明の特定の実施形態では、ＤＨＰＬＣ
によってホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離および同定
し、ヘテロ二重鎖の存在はＰＫＤ遺伝子中の少なくとも
１つの変異（例えば、変異対立遺伝子中に存在する１つ
または複数のヌクレオチドの置換（または１つまたは複
数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失））の存在を示
す。
【０１５９】別の特定の実施形態では、ＤＨＰＬＣ勾配
を、Ｔｒａｎｓｆｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊ
ｏｓｅ、ＣＡ）のＷａｖｅｍａｋｅｒ（商標）４．０ソ
フトウェアによって決定する。
【０１６０】分離への適用には、変異がフラグメント上
のどこに存在するかに関係なく変異を検出することがで
きることが必要である。この状況では、変異はフラグメ
ントの中央または高温融解ドメイン中に存在し得るが、
両者とも検出が困難である。フラグメントの融解温度範
囲のばらつきは１０℃未満が好ましく、ばらつきの範囲
が５℃未満であることが最も好ましい。
【０１６１】いくつかの変異分析では、ＤＨＰＬＣ分析
でたった２つのピークまたは部分的に解析されるピーク
が認められる。２つのホモ二重鎖ピークは、１つのピー
クまたは部分的に解析されたピークとして認められ、２
つのヘテロ二重鎖ピークは、１つのピークまたは部分的
に解析されたピークとして認められ得る。いくつかの場
合、部分的変性条件下では広がった最初のピークのみが
認められる。
【０１６２】サンプルがサンプル長のホモ接合性ＤＮＡ
フラグメントを含む場合、ヘテロ二重鎖が形成されない
ので、ハイブリッド形成およびＤＨＰＬＣによる分析に
より任意の温度で１つのピークのみが得られる。本方法
の操作では、既知の野生型フラグメントとのホモ接合性
サンプルとのハイブリッド形成および部分的変性温度で
のＤＨＰＬＣ分析の実施によって変異を同定することが
できる。サンプルが正常な対立遺伝子を含む場合、ヘテ
ロ二重鎖が形成されないので、ＤＨＰＬＣ分析では１つ
のピークが認められる。サンプルがヘテロ接合性変異対
立遺伝子を含む場合、ＤＨＰＬＣでの分析により、ホモ
二重鎖およびヘテロ二重鎖の分離が認められる。
【０１６３】５０％の一定の融解ドメインが変性する温
度もまた、温度に対するＤＮＡサンプルのＵＶ（ＵＶ）
吸光度のプロッティングによって実験的に贈呈すること
もできる。吸光度は、温度に伴って増加し、得られたプ
ロットを融解プロフィールと呼ぶ（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ
ら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳ
Ａ、８３、３７４６；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ、１９８７、
「任意の反応分子数の移行についての熱力学的データの
計算」、２２１、Ｍａｒｋｙら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａ
ｎｄ Ｓｏｎｓ）。融解プロフィールに対する吸光度の
軸の中心点は、融解温度（Ｔｍ）（すなわち、二重鎖中
のＤＮＡ鎖の５０％が変性する温度）を示す。本発明の
１つの実施形態では、この認められたＴｍを、変異検出
用のＤＨＰＬＣの出発温度として使用する。次いで、こ
の温度を、異なるコントロールを使用して認められたパ
ターンにしたがって調整する（以下を参照のこと）。１
つの実施形態では、一定のＴｍを使用して、異なるサン
プル由来の同一のアンプリコン（すなわち、同一のプラ
イマー対によって産生される）を分析する。
【０１６４】本発明の別の実施形態では、ＭＥＬＴ（Ｌ
ｅｒｍａｎら、１９８７、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．、１５５、４８２）またはＷｉｎＭｅｌｔ（商標）
バージョン２．０などのソフトウェアを使用して、変異
検出用のＤＨＰＬＣ実施のための出発温度として使用す
る計算したＴｍが得られる。これらのソフトウェアプロ
グラムは、塩基対の安定性がそれぞれ異なるにもかかわ
らず、隣接する塩基部位の融解温度は密接に協力してい
る（すなわち、協同効果が存在する）ことを示す。した
がって、融解温度が適切に一定している「ドメイン」と
呼ばれる３０〜３００塩基対長の領域が存在する。類似
の様式では、ソフトウェアＭＥＬＴＳＣＡＮ（Ｂｒｏｓ
ｓｅｔｔｅら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．、２２、４３２１）は、ＤＮＡフラグメントに
おける融解ドメインおよびその対応する融解温度を計算
する。１つのヘテロ変異部位の選択温度での任意のドメ
イン部分の変異の検出が可能であるので、一定温度の融
解ドメインの概念は重要である。
【０１６５】別の特定のヘテロ二重鎖の分離および同定
法は、適合イオン核酸クロマトグラフィー（Ｍａｔｃｈ
ｅｄ Ｉｏｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＭＩＰＣ）である。二本鎖核酸
と一般的にはＤＮＡとの混合物有効に分離するために、
分離が塩基対長に基づくＭＩＰＣを導入した（米国特許
第５，５８５，２３６号、同第６，２８７，８２２号；
Ｈｕｂｅｒら、１９９３、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｉａ、３７、６５３；Ｈｕｂｅｒら、１９９３、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１２、３５１）。これらの引
例およびこの引例中の引例は、その全体が本明細書中で
参考として援用される。ＭＩＰＣ分離は１０分以内に完
了し、５分以内に完了することが多い。ＭＩＰＣシステ
ム（ＷＡＶＥ（商標）ＤＮＡフラグメント分析システ
ム、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊ
ｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）は、カラムおよびカラムインレ
ット部を含むコンピュータ制御のオーブンを備えてい
る。
【０１６６】ＤＨＰＬＣおよびＭＩＣＰはヘテロ二重鎖
の分離および同定について説明した方法であるにもかか
わらず、当該分野で公知の他の方法をヘテロ二重鎖の同
定に使用することもできることが理解される。例えば、
高分離能ゲル基質でのヘテロ二重鎖分析もまた、１つの
ヌクレオチド多型でさえも検出することができる。（Ｈ
ａｕｓｅｒら、１９９８、Ｐｌａｎｔ．Ｊ．、１６、１
１７〜２５）。ヒトＰＫＤ遺伝子の３’末端中のＳＮＰ
を検出するための増幅産物の分析のためにＰＣＲ／ＯＬ
Ａ法を使用することができる（Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐ
ａｓｔｅｒｎａｋ、１９９４、「分子生物工学：組換え
ＤＮＡの原理と応用」、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９７〜２００）。当業者
は、本発明の方法の実施における分析手段として増幅産
物の高次構造感受性ゲル電気泳動を使用することもでき
る。（Ｍａｒｋｏｆｆら、１９９８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇｅ
ｎｅｔ．、６、１４５〜５０）。１つの塩基の置換、欠
失、または挿入を検出することができるＰＣＲ−制限フ
ラグメント−ＳＳＣＰなどの技術によってこれを達成す
ることができる（Ｔａｗａｔａら、１９９６、Ｇｅｎｅ
ｔ．Ａｎａｌ．、１２（３〜４）、１２５〜２７；Ｌｅ
ｅら、１９９２、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０
５、２８９〜９３）。従来の任意の種々のスラブまたは
キャピラリー電気泳動法の使用によって、増幅産物分析
のための電気泳動を迅速且つ高感度に行い、実施者は任
意の容易な核酸フラグメント検出手段（放射性核種、Ｕ
Ｖ吸収、またはレーザー誘導蛍光（Ｋｅｐａｒｎｉｋ
ら、１９９８、Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１
９、２４９〜５５；Ｉｎｏｕｅら、１９９８、Ｊ．Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．、８０２、１７９〜８４；Ｄｏ
ｖｉｃｈｉ、１９９７、１８、２３９３〜９９；Ａｒａ
ｋａｗａら、１９９７、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ａｎａｌ．、１５、１５３７〜４４；Ｂａｂａ、１
９９６、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．
Ａｐｐｌ．、６８７、２７１〜３０２；Ｃｈａｎら、１
９９７、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．、６９５、１３〜１５）が含ま
れるが、これらに限定されない）の使用を任意選択的に
選択することができる。任意選択的に任意の種々の蛍光
色素を使用して、分析を容易にするために本発明のプラ
イマーまたは増幅産物を標識することができ、この色素
には、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＴＩＯ−ＰＲＯ−１、チア
ゾールオレンジ、Ｈｅｘ（すなわち、６−カルボキシ−
２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオロセイ
ン）、ピクログリーン、エダンス、フルオレセイン、Ｆ
ＡＭ（すなわち、６−カルボキシフルオレセイン）、ま
たはＴＥＴ（すなわち、４，７，２’，７’−テトラク
ロロ−６−カルボキシフルオロセイン）（例えば、Ｓｋ
ｅｉｄｓｖｏｌｌ ａｎｄ Ｕｅｌａｎｄ、１９９５、
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３１、３５９〜６５；
Ｉｗａｈａｎａら、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、２１、５１０〜１４、５１６〜１９）が含まれる
が、これらに限定されない。
【０１６７】変異検出の目的でホモ二重鎖およびヘテロ
二重鎖の分離を行うための好ましい実施懈怠における本
発明の使用では、上記の混合物の変性およびアニーリン
グによってＤＮＡサンプルを正常なＤＮＡフラグメント
とハイブリッド形成させる。ＤＮＡサンプルを、正常な
ＤＮＡと直接ハイブリッド形成することができる。ＤＮ
Ａサンプルを、ＰＣＲによって増幅し、その後正常なＤ
ＮＡとハイブリッド形成することもできる。あるいは、
ＰＣＲ増幅前に正常なフラグメントをサンプルに添加す
ることができる。次いで、増幅混合物を、増幅後にハイ
ブリッド形成することができる。これら３つの各ハイブ
リッド形成シナリオでは、サンプル中に変異が存在する
場合、ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖との混合物が得られ
る。このようにして調製したサンプルを、本発明の方法
を使用した変異の存在について、部分的変性条件下（好
ましくは、５６〜５８℃）でのＤＨＰＬＣによって分析
する。
【０１６８】本発明の方法を変異の存在について多数の
サンプルの分離のために使用する場合、フラグメント一
括範囲のための広範囲勾配を使用した各サンプルの分析
の高速化によってサンプル処理量を有意に増加させるこ
とができる。
【０１６９】本発明の全ての実施形態および態様では、
ＤＨＰＬＣカラムで分離および溶出されたとき、核酸フ
ラグメントが検出される。核酸を検出することができる
任意の検出器を、ＤＨＰＬＣ変異検出法で使用すること
ができる。好ましい検出器は、オンラインＵＶ検出器で
ある。ＤＮＡフラグメントを蛍光標識または放射性標識
でタグ化する場合、それぞれ蛍光検出器または放射能検
出器を使用することができる。検出後、分離フラグメン
トを個別にビデオディスプレイ上に表示するかプリンタ
ーでプリントする。このようにして表示したフラグメン
トは、ピークまたはレーン中のバンドとして認められ
る。
【０１７０】Ｃ．ＰＫＤ−２およびＰＫＤ−１固有領域
についてのＤＨＰＬＣ評価に有益な品質管理 ＤＨＰＬＣでヘテロ二重鎖−ホモ二重鎖混合物とホモ二
重鎖のみとを区別する化学的原理により、（１）緩衝液
の組成、（２）分析時のオーブン温度、（３）カラム条
件、および（４）サンプル注入時のシステム条件に非常
に感度の高い方法が得られる。溶出パターンのゆらぎは
正常であり、アンプリコンのサイズおよび配列ならびに
分析時の特異的ＤＨＰＬＣ条件に依存して変化する。当
業者は、例えば、ＤＨＰＬＣ装置の製造者から提供され
たプロトコールにしたがって得られた溶出パターンを解
釈する知識をもっている。しかし、ゆらぎ範囲の限度
は、条件がＤＮＡ変異体を有効に分離すると予想される
範囲内であることを確実にするのを援助するのに適切で
ある。以下の品質管理コントロール溶液は、一貫したア
ッセイパフォーマンスを確実にするための各分析条件に
ついて確立した有用な例である。
【０１７１】１．無ＤＮＡコントロール このコントロールは、試薬および材料が患者の分析を妨
害し得る特定のシグナルを発生しないことを示す。いく
つかの実施形態では、コントロールは、例えば組織から
抽出したＤＮＡを含むサンプルに同一の処理をした無Ｄ
ＮＡサンプルにおいて最小のシグナル（正常なコントロ
ールピークの高さの１０％未満）を示さなければならな
い。分析システムのハードウェアの全てが各サンプル分
析で再利用され、ＤＨＰＬＣ分析は成分の分離であるの
で、正常なコントロールの１０％までのピークの高さが
許容される。異なる配列との実際の汚染により、１０％
汚染物質を検出すると予想されない配列決定に反射して
惹起される偽りの正のＤＨＰＬＣパターン差が得られ
る。配列の相違が検出される事象では、フラグメント
は、結果を確認するためにＰＣＲポイントから繰り返さ
れる。同様に、正常配列の１０％の事実上正の汚染は、
存在するＤＮＡの５０％が既に正常であるので、パター
ンを有意に変化させないと予想される。非常にわずかな
パターンの変化が１０％過剰によって混乱されるまれな
場合は、注入中の正常なＤＮＡは、感度の推定値が７８
〜９６％である。しかし、アンプリコンを分析するたび
にＤＮＡシグナルが認められないことは、全体的および
持続的なＤＮＡシグナルの消滅を最小にするかなくすた
めに分析条件を変化させる必要がある。
【０１７２】２．正常コントロール １つの実施形態では、正常コントロールのパターンは、
歴史的パターンに一致しなければならない。確立された
パターンとの一致は、許容可能な増幅、保持時間、ピー
クの高さ、およびピークの形状を示す。したがって、実
施例においてＰＣＲおよびＤＨＰＬＣ条件（機械および
緩衝液など）を行う。確立された正常コントロールパタ
ーンと比較したところ、ホモログまたは他の非特異的増
幅シグナルは存在しない。
【０１７３】３．ポジティブコントロール ポジティブコントロールは、確立されたＤＨＰＬＣ分析
条件（ポジティブコントロールのヘテロ二重鎖を検出す
る）が分析時に有効であることを示すために使用された
「ＤＨＰＬＣ分析条件のコントロール」である。正常な
コントロールと区別され、歴史的パターンと一致するポ
ジティブコントロールパターンは、許容可能な保持時
間、ピークの高さ、ピークの形状、およびパターンを示
す。ヘテロ二重鎖検出は、各フラグメントに至適な特異
的ＤＨＰＬＣ分析条件が患者分析時に有効であることを
示す。コントロールは必ずしもＰＫＤポジティブシグナ
ルではないことに留意することが重要である。各８３Ｐ
ＫＤフラグメントについての特異的ＰＫＤポジティブサ
ンプルは利用できない。存在しない場合、分析時に適切
な分析条件を示すポジティブ指標として別のヘテロ二重
鎖（ポジティブおよび正常コントロール）を使用する。
【０１７４】４．さらなるポジティブコントロール さらなるポジティブコントロールにより、この特異的変
異についての歴史的パターンに一致するパターンが得ら
れ、これを使用して非常に共通する多型を分離すること
ができる。一般に、特異的ＤＮＡ変異体からサンプルか
らサンプルに高度に再生可能な固有の性質のヘテロ二重
鎖パターンが得られる。確立されたパターンに一致する
パターンは、許容可能な保持時間、ピークの高さ、ピー
クの形状、およびパターンを示す。特異的ヘテロ二重鎖
パターンは、このＤＮＡ変異体に至適な特異的ＤＨＰＬ
Ｃ分析条件が患者の分析の際に有効であるので、これに
適合する患者のパターンを共通の多型を有すると見なす
ことができることを示す。共通多型についてのこの任意
選択的な分離法は、固有のアンプリコンおよび変異体に
非常に特異的であり、変異体に対して固有の適切な確認
研究に依存する。
【０１７５】Ｄ．ＤＨＰＬＣ結果の分析 ＤＨＰＬＣが分離プロセスであるので、正常コントロー
ルと異なるシグナルを有する任意の検体（例えば、ＤＮ
Ａ、細胞溶解物、または組織サンプル）を、潜在的なポ
ジティブと見なし、環境に依存して利用可能ないくつか
のオプションのうちの１つで処理すべきである。いくつ
かの実施形態のために、弱すぎて解釈できないシグナル
（正常コントロールのピーク高さの２５％未満）は、Ｐ
ＣＲの失敗、波動輻射（ｗａｖｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏ
ｎ）の失敗、またはサンプル特有のいくつかの他の散発
的な装置の問題によって発生し得る。オプションには、
ＰＣＲポイントの反復、波動輻射（全てのコントロール
を使用）の反復、または決定的でない波動の報告、およ
び配列決定が含まれる。正常コントロールとパターンが
異なるシグナルを、ポジティブと見なし、「Ｐ」と記録
し、配列決定すべきである。正常コントロールパターン
とほんのわずか異なるシグナルを「Ｂ」と記録し、配列
決定すべきである。正常コントロールシグナルよりもは
るかに強力なシグナルを「Ｐ」と記録し、配列決定すべ
きである。患者の検体はこれらの結果のみに基づいて得
ていないことに留意のこと。使用した特異的オプション
は、アンプリコンおよびそのＤＨＰＬＣ動作歴ならびに
検体についての特異的環境によって変化する。
【０１７６】いくつかの実施形態では、ＤＨＰＬＣから
放出された結果のみが波動分析によって「正常」と記録
された結果である。正常と記録されるために、検体のＤ
ＨＰＬＣパターンは、以下のＱＣ基準によって正常なコ
ントロールと一致しなければならない。（ａ）ピーク
数、（ｂ）ピークの高さ、（ｃ）ピークパターン、
（ｄ）保持時間、（ｅ）ベースラインの形状。言い換え
れば、個体の検体のパターンは、妥当な推定ばらつき範
囲内で正常コントロールの外観でなければならない。必
要ならば、検証データ基準パターンを考察する。ＤＨＰ
ＬＣ分離感度を、正常コントロールと実質的に異なるパ
ターンの計数によって評価した。パターンが真に正常コ
ントロールと異なると考えられる場合、疑いの余地がな
く、ポジティブと記録して配列決定に移る。特異的アン
プリコンの要件を満たし、正常コントロールと一致する
パターンを有する配列を記録し、正常とみなす。
【０１７７】「一致する」と判断するために使用した特
定の数値の基準には、（ａ）ピークがシグナル強度の局
所的最大を示すピーク数、（ｂ）ピークの高さまたは最
大シグナル強度（通常、正常コントロールの高さの０．
５倍と２．０倍との間）、（ｃ）ピークの保持時間（対
応する正常コントロールと比較して＋／−６０秒でなけ
ればならない）が含まれるが、これらに限定されない。
ピークパターンは、ピーク内の各傾斜の変化の相対的対
応ならびに複合体パターン内の各ピークの相対強度およ
び保持時間によって判断される。ベースラインパターン
は、通常、全てのサンプルにおいて滑らかで一貫してい
る。相対的に低いベースラインの変化は、ホモ二重鎖ピ
ークと有意に異なる保持時間で溶出およびおそらく融解
するヘテロ二重鎖を示し得る。各アンプリコンについて
の保持時間およびピークの高さの基準を、実施例に添付
の表に明記する。
【０１７８】１つの実施形態では、ピークパターン評価
は、（１）正常コントロールと同一の運転コントロール
基準を満たすサンプルシグナルと、（２）運転コントロ
ールとの相対的比較に基づいた正常コントロールと一致
するサンプルシグナルパターンとの組み合わせである。
正常コントロールパターンは、運転毎にわずかに変化す
ると予想されるにもかかわらず許容可能であるので、正
常と記録した各サンプルは、（１）正常コントロールと
同一の運転コントロール基準、（２）上記の正常コント
ロールと各患者サンプルとの比較において固有の相対コ
ントロール基準を満たす組み合わせである。患者サンプ
ルパターンのわずかな変化は正常コントロールの絶対的
運転基準と一致することが明白なようであり、運転内で
の正常と患者との相対的比較を使用すると明白である。
運転内の相対的比較は常に歴史的パターンと交換可能で
あり、正常コントロールはコントロール基準をパスし、
運転は許容されると予想される。
【０１７９】ＩＸ．ヘテロ二重鎖の検証 任意選択的に、同定したヘテロ二重鎖を、１つまたは複
数の制限酵素での増幅産物の消化によって検証すること
ができる。この目的に有用な制限酵素を、真のＰＫＤ遺
伝子配列とＰＫＤホモログ配列との比較またはＰＫＤ多
型の比較によって選択する。本発明の有用な制限酵素に
より、真のＰＫＤ遺伝子およびＰＫＤホモログについて
の区別可能なフラグメントプロフィールが作製される。
このような制限酵素の例には、ＰｓｔＩ、ＳｔｕＩ、Ｘ
ｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｆｓｐ
Ｉ、ＭｓｃＩ、およびＢｌｎＩが含まれるが、これらに
限定されない。有用な制限酵素はまた、正常なＰＫＤ遺
伝子および変異ＰＫＤ遺伝子についての区別可能なフラ
グメントプロフィールを作製することができる。ＰＫＤ
遺伝子とＰＫＤホモログ遺伝子または正常なＰＫＤ対立
遺伝子と変異ＰＫＤ対立遺伝子との単純比較によってよ
り多数の制限酵素を同定することができることが理解さ
れる。切断部位を破壊するか作製するために他方の配列
中ではなく一方の配列中に認識部位または切断部位を有
する制限酵素を、本発明の有用な制限酵素と見なすこと
ができる。核酸の制限後に変性高速液体クロマトグラフ
ィー（ＤＨＰＬＣ）または上記の電気泳動（制限−キャ
ピラリー電気泳動を含む）における得られたフラグメン
トの分離およびフラグメントの長さまたは異なるフラグ
メントの移動度の分析を行う。
【０１８０】Ｘ．ＤＨＰＬＣによって同定されたヘテロ
二重鎖の配列決定 ＤＨＰＬＣによって同定された１つまたは複数の変異の
存在を示すヘテロ二重鎖を、クローン化し、増幅し、そ
して／または配列決定することができる。当該分野で公
知の任意の配列決定法を使用して、ヘテロ二重鎖を配列
決定することができる。いくつかの実施形態では、同定
されたヘテロ二重鎖を、ＰＣＲ増幅用のテンプレートと
して使用し、増幅産物をＳｅｑｕｅｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）
によって配列決定する。好ましい実施形態では、配列番
号３〜４９を含むプライマーの１つを使用して配列決定
を行う。
【０１８１】いくつかの実施形態では、同定したヘテロ
二重鎖を増幅し、プラスミド（例えば、ＺｅｒｏＢｌｕ
ｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット、Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号
４５６０−０１）にクローン化後、配列決定する。ＰＣ
Ｒフラグメントを含むプラスミドを、当該分野で周知の
方法によって増殖させ、配列決定する。
【０１８２】ＸＩ．方法の臨床用途 本出願書類に記載の遺伝子試験法は、ＡＤＰＫＤの病因
であると報告されているスプライス連結受容体／供与体
配列を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２のコード領域の
ＤＮＡの変化の同定を目的とする。以下を医師が評価す
るために本方法を行う。
【０１８３】Ａ．症状を示す個体のＰＫＤに起因するＡ
ＤＰＫＤの診断。 Ｂ．発症年齢または発症年齢付近の個体における１つま
たは２つの嚢胞の存在を示す超音波の結果の追跡。 Ｃ．家族歴、超音波、および他の臨床データからの決定
が好ましくないＡＤＰＫＤ（１型および２型）の異なる
変異体の診断。 Ｄ．一旦家族にＡＤＰＫＤ発端者が同定された場合の他
の危険性のある家族のメンバーの遺伝子カウンセリング
の決定および提供。 Ｅ．移植の場合の生存関連ドナーの適合性の決定。
【０１８４】ＸＩＩ．キット 本発明はまた、本発明の変異分析法およびＰＫＤ患者同
定法を行うためのキットを提供する。本発明の方法によ
る本発明のキットの実施形態には、第１の核酸が配列番
号３〜４９およびその相補配列からなる群から選択さ
れ、第２の配列が第１の核酸と逆方向であり、第１およ
び第２の核酸が配列番号１または２の配列を含むテンプ
レート核酸のフラグメントを増幅する、少なくとも１つ
の単離した第１の核酸および少なくとも１つの単離した
第２の核酸ならびにパッケージング材料が含まれる。本
発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、テンプレート核
酸、制限酵素、コントロールオリゴヌクレオチドプライ
マー、ｄｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応緩衝液、およびその組み
合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分
をさらに含み得る。試薬に加えて、本発明のキットは、
本発明の方法の実施のための取扱い説明書を含むことが
好ましい。キットは、好ましくは、ユニットコンテナに
封入し、所望の結果を得るために相互に操作するように
デザインされた予め測定した量の試薬を含み得る。
【０１８５】実施例 本発明を、以下の材料と方法を使用する以下の非限定的
な実施例によって例示する。
【０１８６】実施例１ 試薬、特定の備品、および装置 Ａ．化学薬品 以下は、ＰＫＤ−１増幅およびＤＨＰＬＣ（ＷＡＶＥ）
分析で使用した化学薬品のリストである。 １％アガロース、１×ＴＢＥ、臭化エチジウムを含む５
４ウェルゲル（Ｅｍｂｉｔｅｃ、カタログ番号ＧＥ４５
８０） ２％アガロース、１×ＴＢＥ、臭化エチジウムを含む５
４ウェルゲル（Ｅｍｂｉｔｅｃ、カタログ番号ＧＥ４５
８２） ９６ウェルゲル濾過ブロック（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ、カタログ番号９１７５１） Ｑｕｉｃｋｓｔｅｐ（商標）９６ウェルＰＣＲ精製キッ
ト（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９
９６０５） ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ緩衝液ＩＩおよびＭｇＣｌ２溶
液を含むＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｎ８０８−０２４１） ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＸＬ＆ＸＬ緩衝液ＩＩ
パック（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号Ｎ８０
８−００１９３） ＴａｐＰｌｕｓ精密ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ、カタログ番号６００２１１） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、カタ
ログ番号Ｄ−２６５０） Ｒｅａｄｙ−Ｌｏａｄ １００ｂｐＤＮＡラダーまたは
等価物（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１０３８０−
０１２） Ｒｅａｄｙ−Ｌｏａｄ １ｋｂＤＮＡラダーまたは等価
物（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、１８００−８２８−６６８
６、カタログ番号１０３８０−０１０） ＢｉｇＤｙｅターミネーターレディ反応キット（Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号４３０３１５０） ゲル濾過カートリッジ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、カタログ番号４２４５３） Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ Ｓｉｎｇｅｌ（商標）（ＦＭ
Ｃ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号５０６９１
または５０６９３） オリゴヌクレオチド（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．） ＷＡＶＥ変異スタンダード（２０９ｂｐ）（カタログ番
号５６００７７）（１８０μｌ） アセトニトリル−ＨＰＬＣグレード（ＶＷＲ、カタログ
番号ＢＪ０１５−１） ＨＰＬＣグレード水（ＶＷＲ、カタログ番号ＢＪ３６５
−４） 酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）（Ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｏｍｉｃ、カタログ番号ＳＰ５８９０）
【０１８７】Ｂ．試薬および溶液 １０μＭのオリゴヌクレオチドプライマー：ＴＥ緩衝液
に溶解した１０μＭの作業アリコートのＰＣＲプライマ
ーをＰｒｅ−ＰＣＲ冷却装置に４℃で保存すべきであ
り、配列決定プライマー作業アリコートを、Ｐｏｓｔ−
ＰＣＲ冷却装置に４℃で保存すべきである。
【０１８８】溶液Ｘ−１２７：アップグレードブルーデ
キストランの５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）溶液 １５ｍｌの滅菌遠心分離用コニカルチューブ中で０．５
ｍｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）（溶液Ｘ−
３５）、５００ｍｇのブルーデキストラン、ＡＮＤ９．
５ｍｌの高圧蒸気滅菌し、濾過滅菌したＤｉＨ２Ｏを組
み合わせる。ボルテックスによって溶液を完全に混合す
る。
【０１８９】溶液Ｘ−１２６：アップグレードゲルロー
ディング緩衝液：１．５ｍｌの滅菌微量遠心分離チュー
ブ中で、２００μｌの脱イオンホルムアミドおよび４０
μｌのアップグレードブルーデキストランの５０ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液（溶液Ｘ−１２７）を組み合わせる。完全
にボルテックスする。
【０１９０】 ＷＡＶＥ溶液Ａ：溶液Ａ（０．０２５％ＡＣＮ） ２Ｌの調製物：１００ｍｌイオン対合剤（ＴＥＡＡ） ５００μｌアセトニトリル（ＡＣＮ） ＨＰＬＣグレート水で２Ｌにする。 ＷＡＶＥ溶液Ｂ：溶液Ｂ（２５％ＡＣＮ） ２Ｌの調製物：１００ｍｌイオン対合剤（ＴＥＡＡ） ５００ｍｌアセトニトリル（ＡＣＮ） ＨＰＬＣグレート水で２Ｌにする。 ＷＡＶＥシリンジ洗浄溶液：シリンジ洗浄液（８％ＡＣＮ） ２Ｌの調製物：１６０ｍｌアセトニトリル（ＡＣＮ） ＨＰＬＣグレート水で２Ｌにする。 ＷＡＶＥ溶液Ｄ：溶液Ｄ（７５％ＡＣＮ） ２Ｌの調製物：５００ｍｌＨＰＬＣグレート水 アセトニトリル（ＡＣＮ）で２Ｌにする。
【０１９１】Ｃ．装置および備品
【表５】
【０１９２】実施例２．手順段階Ｉ：患者検体由来のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの
調製 Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（商品名）ＤＮＡ抽出キットを使用し
て、全血またはリンパ球からＤＮＡを抽出した。これら
の試薬を使用して抽出したＤＮＡは、アッセイに特異的
な条件下で首尾よくＰＣＲ増幅されるはずである。プロ
トコール中で特定したアッセイの実行および確認済みの
ポジティブＤＮＡコントロールを用いて得られた結果と
の比較によってこれを試験する。抽出したＤＮＡを定量
し、２６０／２８０比は１．４以上得ある。より低い比
のサンプルは、ＤＮＡの品質が不十分であり、ＰＣＲ標
準を満たさないことを示す。アッセイの最終結果が解釈
されない場合、サンプルを再抽出すべきである。
【０１９３】段階ＩＩ：ＰＣＲによるＤＮＡの増幅 ＰＣＲ反応混合物およびサイクリングパラメータ（例え
ば、ＰＫＤ−１遺伝子のエクソン１）を、表５に例示の
ように調整する。ＰＣＲ条件を同様に調整するが、他の
エクソンの特異的且つ行こうな増幅について至適化す
る。
【０１９４】
【表６−１】
【０１９５】１つのワックスビーズを各ウェルに添加
し、８０℃で５分間サーマルサイクラー中でインキュベ
ートしてワックスを溶かし、２５℃でさらに５分間イン
キュベートし、さらなる操作のために氷上に置く。
【０１９６】
【表６−２】
【０１９７】
【表６−３】
【０１９８】
【表７】
【０１９９】
【表８】
【０２００】ＰＣＲ増幅フラグメントを、確認済みのポ
ジティブコントロールＤＮＡコントロールと、サイズ、
シグナル強度、および移動パターンについて比較するこ
とができる。ＰＣＲ増幅フラグメントのサイズを、ゲル
上の分子量マーカー（ＤＮＡＭＡＳＳ（商標）Ｌａｄｄ
ｅｒ−Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）との比較によって決定す
る。範囲の狭いＤＮＡ分子量ラダーにより、臭化エチジ
ウムでのゲルの染色により二本鎖（１００〜２０００ｂ
ｐ）ＤＮＡの６つのバンドが得られる。
【０２０１】段階ＩＩＩ：ＰＣＲ産物のＤＨＰＬＣ分析 ＰＣＲ増幅産物によって形成されたヘテロ二重鎖を、Ｔ
ｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｏｍａｈａ、ＮＥ
６８１６４）のＷＡＶＥ核酸フラグメント分析システ
ムを使用して分析する。
【０２０２】段階ＩＶ：サイクル配列決定 表９および１０は、本発明の１つの実施形態で使用した
配列決定条件の例を提供する。
【０２０３】
【表９】
【０２０４】
【表１０】
【０２０５】実施例３．結果のまとめ １つの実験では、ＰＫＤ−１遺伝子のエクソン１〜３４
中の変異の検出を、以下のサイズのＤＮＡフラグメント
を増幅するための８つの異なる第１ラウンドのＰＣＲ反
応中の８セットのオリゴヌクレオチドプライマーの使用
によって行った。ａ）ＬＲ１は２．２ｋｂであり、エク
ソン１を含む、ｂ）ＬＲ２は４．６ｋｂであり、エクソ
ン２〜７を含む、ｃ）ＬＲ３は４．２ｋｂであり、エク
ソン８〜１２を含む、ｄ）ＬＲ４は４．４ｋｂであり、
エクソン１３〜１５を含む、ｅ）ＬＲ５は３．４ｋｂで
あり、エクソン１５（３’末端）〜２１を含む、ｆ）Ｌ
Ｒ６は０．３ｋｂであり、エクソン２２を含む、ｇ）Ｌ
Ｒ７は４．２ｋｂであり、エクソン２３〜２８を含む、
ｈ）ＬＲ８は５．８ｋｂであり、エクソン２９〜３４を
含む。第１ラウンドの増幅由来の増幅産物を１：１０４
または１：１０５に連続希釈して、ゲノム汚染物を除去
し、その後第２ラウンドのネスト化ＰＣＲでのテンプレ
ートとして使用した。ネスト化ＰＣＲ産物をヘテロ二重
鎖にし、ＤＨＰＬＣにて配列の変化についてスクリーニ
ングした。各フラグメントを、アンプリコンに特異的な
温度およびアセトニトリル勾配を使用して正常およびポ
ジティブコントロールに対して分析した。ＤＨＰＬＣ分
析によってポジティブな任意の試験サンプルを、精製お
よび配列決定した。サイクル配列決定産物を、ＡＢＩ３
７７自動化シークエンサーで分離し、結果を、配列決定
ソフトウェアの分類を使用して分析した。表１１〜１２
および図１〜１３は、本発明のいくつかの実施形態の結
果および手順を示す。
【０２０６】
【表１１】
【０２０７】
【表１２】
【０２０８】他の実施形態 上記の実施例は、本発明を構築および実施した本発明者
らによって実施および熟慮した実験を示す。これらの実
施例には、本発明の実施技術の通告、およびその有用性
の証明のために使用する技術の開示が含まれると考えら
れる。本明細書中に開示の技術および実施形態は好まし
い実施形態のみであり、一般に、多数の等価な方法およ
び技術を使用して同一の結果を達成することができるこ
とが当業者に認識される。図面および表を含む全ての出
願書類、特許書類、および明細書で参照された文献は、
その全体を参照することにより本明細書中に組み込むも
のとする。
【０２０９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Athena Diagnostics <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENETIC ANALYSIS OF POLYCYSTIC KIDNE Y DISEASE <130> 1133/2002 <140> US 10/083,246 <141> 2002-02-26 <160> 168 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 14136 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcactgcagc gccagcgtcc gagcgggcgg ccgagctccc ggagcggcct ggccccgagc 60 cccgagcggg cgtcgctcag cagcaggtcg cggccgcgca gccccatcca gccccgcgcc 120 cgccatgccg tccgcgggcc ccgcctgagc tgcggtctcc gcgcgcgggc gggcctgggg 180 acggcggggc catgcgcgcg ctgccctaac gatgccgccc gccgcgcccg cccgcctggc 240 gctggccctg ggcctgggcc tgtggctcgg ggcgctggcg gggggccccg ggcgcggctg 300 cgggccctgc gagcccccct gcctctgcgg cccagcgccc ggcgccgcct gccgcgtcaa 360 ctgctcgggc cgcgggctgc ggacgctcgg tcccgcgctg cgcatccccg cggacgccac 420 agcgctagac gtctcccaca acctgctccg ggcgctggac gttgggctcc tggcgaacct 480 ctcggcgctg gcagagctgg atataagcaa caacaagatt tctacgttag aagaaggaat 540 atttgctaat ttatttaatt taagtgaaat aaacctgagt gggaacccgt ttgagtgtga 600 ctgtggcctg gcgtggctgc 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aagtatatat gaaattaaga agaaaaattt agtcagagta gncactgttg 2940 cgtggacant ctttggtttt gtattgtggt gntttgtntt atttttatag cttcactcaa 3000 ttccgtatca ttttgggcga tatcaacttt gcagagattg aggaagctaa tcgagttttg 3060 ggaccaattt atttcactac atttgtgttc tttatgttct tcattctttt ggtatgtaca 3120 tttatattta tagtggaggt tcaatttaaa cttcgtaaat ccttgtcttc tcttttttga 3180 ttgataattc caaattatgt ttcttccttt aatttttgcc ctcctttcat ttacaaacag 3240 aatatgtttt tggctatcat caatgatact tactctgaag tgaaatctga cttggcacag 3300 cagaaagctg aaatggaact ctcagatctt atcagaaagg taggaaaaac cttaattctc 3360 aaaaattctt ctgtttctga cataaaatga gcattgtttc acccanattt tagaatacnc 3420 taaaccaagt cttttatttt ttctctctct gatagggcta ccataaagct ttggtcaaac 3480 taaaactgaa aaaaaatacc gtggatgaca tttcagagag tctgcggcaa ggaggaggca 3540 agttaaactt tgacgaactt cgacaagatc tcaaagggtg agaatcatgc ttcctgaggt 3600 tctnaaaaat tcctgcttct aaagataaat tcctggtgat aagagtattt ctagcccaag 3660 ggctcatggg aacanaggat gaatgttatc tgtatcctct ctctaatttc aggaagggcc 3720 atactgatgc 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<222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 111 cagggccaca cgcgctgggc g 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 112 ttggaggccc acgttgacct g 21 <210> 113 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> Synthetic primer <400> 113 cccccgcccg catgggtgtg gacgggtgag g 31 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 114 taaaactgga tggggctctc 20 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 115 ggcctccacc agcactaa 18 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 116 gggtccccca gtccttccag 20 <210> 117 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Synthetic primer <400> 117 tccccagccc gcccaca 17 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 118 gccccctcac caccccttct 20 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 119 tcccgctgct ccccccacgc a 21 <210> 120 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 120 gatgccgtgg ggaccgtc 18 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 121 gtgagcaggt ggcagtctcg 20 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 122 ccaccccctc tgctcgtagg t 21 <210> 123 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Synthetic primer <400> 123 ggtcccaagc acgcatgca 19 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 124 tgccggcctc ctgcgctgct ga 22 <210> 125 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> Synthetic primer <400> 125 gcgggcaggg tgagcaggtg gggccatcc 29 <210> 126 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> Synthetic primer <400> 126 gaggctgtgg gggtccagtc aagtgg 26 <210> 127 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Synthetic primer <400> 127 agggaggcag aggaaagggc cgaac 25 <210> 128 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> Synthetic primer <400> 128 cgtcccgcct gcactgacct cacgcatgt 29 <210> 129 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> Synthetic primer <400> 129 cggcccgccg cccccgcccg gccaaaggga aagggattgg a 41 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 130 ccgcggagcc tgctgtgcta t 21 <210> 131 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> Synthetic primer <400> 131 ccgccgcccc cgcccgcttg gtggagacgg tgtagttgc 39 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 132 tccaatccct ttccctttgg c 21 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 133 cagcagccca tgaaacagaa ag 22 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 134 tatgctttca ggcccgtggc a 21 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 135 agagcccata cccggtccag tcc 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 136 ggactggacc gggtatgggc tct 23 <210> 137 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> Synthetic primer <400> 137 cccccgcccg cacccaggcc ctcctcgact c 31 <210> 138 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Synthetic primer <400> 138 cccccgccgc tgggtgggct cggctctatc 30 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 139 tggtagcgat gctcacgtca ctt 23 <210> 140 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 140 caggccaaag ctgagatgac ttg 23 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 141 agaggcgcag gagggaggtc 20 <210> 142 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 142 ccctctgccc ccgcattg 18 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 143 aagcgcaaaa gggctgcgtc g 21 <210> 144 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 144 ggccctccct gccttctagg cg 22 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 145 ccgtgctgtg tggaggagag 20 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 146 cctcttcctg cccagccctt c 21 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 147 cttcccgagc agcctttggt g 21 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 148 ctgagctgcc gcccgctgac 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 149 aggaccccca gcccagccca 20 <210> 150 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 150 cttggcgcag cttggact 18 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 151 acacccagca aggacacgca 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 152 tgtgacacat cccctggtac 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 153 gcaagggtga gcttcagagc 20 <210> 154 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer <400> 154 gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg accctatgcc tcctgtacct c 51 <210> 155 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Synthetic primer <400> 155 cccctcctct ggcaatcc 18 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 156 cctgccggga gcacgacgag 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 157 ctgggctggg gcacggcggg 20 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 158 gggggctacc acggcgcggg c 21 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 159 ttggggcgtt catttggatc 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 160 accacacaga aataggaggg 20 <210> 161 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> Synthetic primer <400> 161 ttgttattgt tttaattgtt ctta 24 <210> 162 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Synthetic primer <400> 162 ctactctgac taaatttttc ttctt 25 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 163 tttggttttg tattgtggtg 20 <210> 164 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Synthetic primer <400> 164 aaggatttac gaagtttaaa ttg 23 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Synthetic primer <400> 165 agaacctcag gaagcatgat t 21 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 166 taggtaccaa atcaaatccg 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic primer <400> 167 gtctcagtgt tctgctcctc 20 <210> 168 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic primer <400> 168aaatacaact gtcagcaaca ta 22
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１つの実施形態で使用されるＰＫＤ１
ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ
３３２４３）を示す図である。エクソンおよびＰＣＲ産
物連結点を、ヌクレオチド配列の上に示す。アミノ酸
を、各コドンの中央の下に示す。
【図２】１つの実施形態によるＰＫＤ遺伝子のエクソン
配列と２つのホモログ配列との比較を示す図である。Ｐ
ＫＤまたはホモログ配列のいずれかのみを切断する制限
酵素部位を示す。
【図３】１つの実施形態による４つの正常なサンプルお
よびヌクレオチド１１６０６での１９ｂｐ挿入（重複）
（コドン３７９９）のＰＫＤ１エクソン４０ＤＨＰＬＣ
パターンを示すグラフである。
【図４】１つの実施形態による正常なコントロールおよ
びヌクレオチド１１６０６での１９ｂｐ挿入（重複）配
列（コドン３７９９）のＰＫＤ１エクソン４０配列を示
すグラフである。
【図５】１つの実施形態によるイントロン５推定多型
（ＩＶＳ５−９−＞Ａ）およびヌクレオチド１５０２で
のフレームシフト（インサートＧ）のＰＫＤ１エクソン
６ＤＨＰＬＣパターンを示すグラフである。
【図６】１つの実施形態によるイントロン５推定多型
（ＩＶＳ５−９−＞Ａ）のＰＫＤ１エクソン６配列を示
すグラフである。
【図７】１つの実施形態によるヌクレオチド７５１８で
のフレームシフト、コドン２４３６（インサートＣ）お
よび共通の多型Ｃ７６５２ＴのＰＫＤ１エクソン１８Ｄ
ＨＰＬＣパターンを示すグラフである。
【図８】１つの実施形態による正常なコントロールおよ
びヌクレオチド７５１８でフレームシフトを有する配列
（コドン２４３６（インサートＣ））のＰＫＤ１エクソ
ン１８配列を示すグラフである。
【図９】１つの実施形態によるソフトウェア推定融解プ
ロフィールおよびエクソン末端付近での部分的融解を確
立するために必要な多数の温度の例を示すグラフであ
る。
【図１０Ａ】本発明の１つの実施形態において同定され
た患者のＤＮＡ変異表現型を示すチャートである。
【図１０Ｂ】本発明の１つの実施形態において同定され
た患者のＤＮＡ変異表現型を示す表である。
【図１１】本発明のいくつかの実施形態において使用し
たＤＨＰＬＣ（ＷＡＶＥ）をまとめた表である。
【図１２】本発明のいくつかの実施形態において使用し
たＰＣＲ条件をまとめた表である。
【図１３】本発明の１つの実施形態における患者の検体
処理工程を示す略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェフリー・ジョージ・ジョーンズ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01095, ウィルブレアム，ホースシュー・レイン 21 (72)発明者 ホルヘ・ア・ガルセス アメリカ合衆国マサチューセッツ州01571, ダドリー，エアポート・ロード 34 (72)発明者 ジン・ワン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01605, ウスター，カントリー・クラブ・ブールヴ ァード 72，アパートメント 219 (72)発明者 ジョン・エイ・カラン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01605, ウスター，ジャスミン・ドライヴ ２ (72)発明者 スーザン・キンバリー・アレン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01610, ウスター，モントローズ・ストリート ６，＃２ (72)発明者 ケリー・エレン・フリン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01519, グラフトン，シーダー・ヒル・ロード （番地なし) (72)発明者 エイダン・ノエル・ヘニガン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01527, ミルベリー，マイルズ・ストリート 49 (72)発明者 ノーマンド・ジェイ・ロビショード アメリカ合衆国マサチューセッツ州01453, レムスター，ランカスター・ストリート 27 (72)発明者 クリストファー・エム・パラトゥッチ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01545, ソールズベリ，キーズ・ハウス・ロード 21 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA09 HA08 HA11 HA19 4B063 QA13 QA17 QA19 QQ42 QR08 QR31 QR42 QR56 QR62 QR72 QR77

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的核酸の変異分析方法であって、 少なくとも一の第１の核酸および少なくとも一の第２の
    核酸の存在下で、反応混合物中において前記標的核酸を
    含むサンプルをインキュベートするステップであって、
    前記第１の核酸は配列番号１または２の配列の固有の部
    位にアニーリングするプライマー配列を含み、前記第２
    の核酸は前記第１の核酸と逆方向であり、前記インキュ
    ベーションにより増幅産物が産生されることを特徴とす
    るステップと、 前記増幅産物中で二重鎖を作製するステップと、 前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出するステッ
    プとを含み、前記ヘテロ二重鎖の存在は前記標的核酸中
    の潜在的な変異が存在することを示し、前記へテロ二重
    鎖の非存在は前記標的核酸中の変異が存在しないことを
    示すことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 ヘテロ二重鎖領域の配列を決定するステ
    ップと、前記ヘテロ二重鎖領域の配列と配列番号１また
    は２とを比較するステップとをさらに含み、前記標的核
    酸によってコードされるタンパク質の機能変化が予想さ
    れる、配列番号１または２と比較した前記ヘテロ二重鎖
    領域の配列の相違は、前記標的核酸の変異の指標とな
    る、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記第１または第２の核酸が配列番号３
    〜４９からなる群から選択される配列を含む、請求項１
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記方法が、テンプレートとして前記第
    １および第２の核酸によって作製された前記増幅産物を
    使用してネスト化増幅反応を行うステップと、前記ネス
    ト化増幅由来の増幅産物中で二重鎖を作製するステップ
    とをさらに含む、請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 前記ネスト化増幅反応を、配列番号３〜
    ４９およびその相補配列からなる群から選択される少な
    くとも一のプライマーを使用して行う、請求項４の方
    法。
  6. 【請求項６】 前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無の
    同定をＤＨＰＬＣによって行う、請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 前記ヘテロ二重鎖領域の配列をＤＮＡ配
    列決定によって決定する、請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 前記第２の核酸が配列番号１または２の
    配列内の固有の部位にアニーリングするプライマー配列
    を含む、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 前記標的テンプレートを含むサンプル
    が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、お
    よび細胞サンプルからなる群から選択される、請求項１
    の方法。
  10. 【請求項１０】 前記インキュベーションステップが、
    ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、
    および核酸特異性ベースの増幅からなる群から選択され
    る増幅反応を含む、請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 １つまたは複数の制限酵素を使用して
    増幅産物がＰＫＤ特異的産物であるかを確認するステッ
    プをさらに含む、請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 前記制限酵素がＰＫＤ特異的産物を切
    断して、ＰＫＤホモログ産物と区別可能な消化パターン
    が得られる、請求項１１の方法。
  13. 【請求項１３】 前記制限酵素が、ＰｓｔＩ、Ｓｔｕ
    Ｉ、ＸｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、
    ＦｓｐＩ、ＭｓｃＩ、およびＢｌｎＩからなる群から選
    択される、請求項１１の方法。
  14. 【請求項１４】 ＰＫＤ罹患患者を同定するための診断
    方法であって、 （ｃ）個体からサンプルを得るステップと、 （ｄ）少なくとも一の第１の核酸および少なくとも一の
    第２の核酸の存在下で、反応混合物中において前記サン
    プルをインキュベートするステップであって、前記第１
    の核酸は配列番号１または２中の固有の部位にアニーリ
    ングするプライマー配列を含み、前記第２の核酸は前記
    第１の核酸と逆方向であり、前記インキュベーションに
    より増幅産物が産生され、 （ｃ）前記増幅産物中で二重鎖を作製するステップと、 （ｄ）前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出する
    ステップと、 （ｅ）前記ヘテロ二重鎖領域の配列を決定するステップ
    とを含み、配列番号１または２と比較した前記ヘテロ二
    重鎖領域の存在は、前記個体がＰＫＤを罹患しているこ
    とを示すことを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】 前記ヘテロ二重鎖の検出をＤＨＰＬＣ
    によって行う、請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 前記配列をＤＮＡ配列決定によって決
    定する、請求項１４の方法。
  17. 【請求項１７】 前記第２の核酸が配列番号１または２
    の配列中の固有の部位にアニーリングするプライマー配
    列を含む、請求項１４の方法。
  18. 【請求項１８】 前記第１または第２の核酸が配列番号
    ３〜４９からなる群から選択されるプライマー配列を含
    む、請求項１４の方法。
  19. 【請求項１９】 テンプレートとして前記第１および第
    ２の核酸によって作製された前記増幅産物を使用してネ
    スト化増幅反応を行うステップと、前記ネスト化増幅由
    来の二重鎖を作製するステップとをさらに含む、請求項
    １４の方法。
  20. 【請求項２０】 前記ネスト化増幅反応を、配列番号３
    〜４９およびその相補配列からなる群から選択される少
    なくとも一のプライマーを使用して行う、請求項１９の
    方法。
  21. 【請求項２１】 前記サンプルが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤ
    ＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および細胞からなる群から
    選択される、請求項１４の方法。
  22. 【請求項２２】 前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反
    応、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および核酸特異性ベ
    ースの増幅からなる群から選択される、請求項１４の方
    法。
  23. 【請求項２３】 前記特異的に増幅した産物を１つまた
    は複数の制限酵素を使用して実証するステップをさらに
    含む、請求項１４の方法。
  24. 【請求項２４】 前記制限酵素がＰＫＤ特異的産物を切
    断して、ＰＫＤホモログ産物と区別可能な消化パターン
    が得られる、請求項２３の方法。
  25. 【請求項２５】 前記制限酵素が、ＰｓｔＩ、Ｓｔｕ
    Ｉ、ＸｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、
    ＦｓｐＩ、ＭｓｃＩ、およびＢｌｎＩからなる群から選
    択される、請求項２４の方法。
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