PL184298B1 - Sonda nukleotydowa, zbiór sond nukleotydowych i sposób typowania osobniczego - Google Patents

Sonda nukleotydowa, zbiór sond nukleotydowych i sposób typowania osobniczego

Info

Publication number
PL184298B1
PL184298B1 PL96318536A PL31853696A PL184298B1 PL 184298 B1 PL184298 B1 PL 184298B1 PL 96318536 A PL96318536 A PL 96318536A PL 31853696 A PL31853696 A PL 31853696A PL 184298 B1 PL184298 B1 PL 184298B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
probe
probes
sequence
hla
typing
Prior art date
Application number
PL96318536A
Other languages
English (en)
Other versions
PL318536A1 (en
Inventor
Patrice André Allibert
Philippe Cros
Bernard François Mach
Bernard Fabien Mandrand
Jean-Marie Tiercy
Original Assignee
Bio Merieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Merieux filed Critical Bio Merieux
Publication of PL318536A1 publication Critical patent/PL318536A1/xx
Publication of PL184298B1 publication Critical patent/PL184298B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Sonda nukleotydowa wybrana sposród nastepujacych sond: - TGGCAGCTTAAGTTT - CCTAAGAGGGAGTG - GCGAGTGTGGAACCT - AAGACAGGCGGGC lub ich sekwencji komplementarnych. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest także sposób określania typowania osobniczego HLA-DR, rozpoczynającego się od próbki osobniczej, zgodnie ze standardowymi technikami typowania oligonukleotydami, polegający na tym, że stosuje jako sondy wychwytowe lub detekcyjne co najmniej podzbiór zbioru sond wybranych spośród:
- TGGCAGCTTAAGTTT
- CCTAAGAAGGGAGTG
-GCGAGTGTGGAACCT
-AAGACAGGCGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się podzbiór zbioru sond, w którym co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - TGGCAGCTTAAGTTT
Również korzystnie stosuje się podzbiór zbioru sond, w którym co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - CCTAAGAAGGGAGTG.
Również korzystnie stosuje się podzbiór zbioru sond w którym co naj mniej j edna sonda posiada sekwencję - GCGAGTGTGGAACCT.
184 298
Również korzystnie stosuje się podzbiór zbioru sond w którym co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - AAGACAGGCGGGC.
Bardziej korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród:
- GTGGACAACTACTG - GATACTTCTATCACCAA - GCCTGATGAGGAGTAC
- TGGCAGGGTAAGTATAAG - GGGCCCTGGTGGACA - TGCGGTATCTGCACA
- GGAGGAGGTTAAGTT - CTGGAAGACGAGCG - TGGAAGACAAGCGG
- TGCGGAGCACTGGA - AACCAGGAGGAGAACGTG - ACTCTACGGGTGAGTG
- GACACCTATTGCAGAC przy czym część podkreślona odpowiada sekwencji minimalnej lub ich sekwencjom komplementarnym.
Jeszcze bardziej korzystnie stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród:
- TGGACAACTACT- GATACTTGTATCACC - CCTGATGAGGAGTA
- GGCAGGGTAAGTATAAG - GGCCCTGGTGGA - GCGGTATCTGCACA
- GGAGGAGGTTAAGTT - TGGAAGACGAGC - GGAAGACAAGCG
- GCGGAGCACTGG - AACCAGGAGGAGAACGT - CTCTACGGGTGAGT
- ACACCTATTGCAGA lub ich sekwencji komplementarnych.
Najbardziej korzystnie stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród:
- GAGGAGGACTTGCGCT - TACGGGGCTGTGGAG - GGAGCTGCGTAAGT
- TTCCTGGAGAGACAC - GGGAGAGATACTTCC lub ich sekwencji komplementarnych, lub stosuje się ponadto co najmniej jednąsondę wybraną spośród:
- AGGAGGACTTGCGC - ACGGGGCTGTGGA - GAGCTGCGTAAG
- TTCCTGGAGAGACAC - GGAGAGATACTTC lub ich sekwencji komplementarnych.
Również bardzo korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę AACCAGIAGGAGAACGT lub jej sekwencje komplementarne.
Korzystnie można także stosować w sposobie według wynalazku ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród sond:
-GCGGTGACGGAGCTGG
-GAACAGCCAGAAGGAC
-CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
Korzystnie sondy stosuje się w sposobie według wynalazku jako sondy wychwytowe.
Sposób według wynalazku ponadto korzystnie obejmuje etapy składające się z:
- unieruchomienia każdej sondy wychwytowej na stałym nośniku,
- skontaktowania każdej unieruchomionej sondy wychwytowej z ciekłym ośrodkiem, zawierającym co najmniej jeden docelowy fragment kwasu nukleinowego we wstępnie określonych warunkach, pozwalających na zajście hybrydyzacji, jeśli sekwencja komplementarna do sondy jest obecna w celu oraz
- wykrycia obecności możliwie wytworzonych hybryd.
Bardziej korzystnie, etap polegający na skontaktowaniu każdej unieruchomionej sondy wychwytowej z ciekłym ośrodkiem, zawierającym co najmniej jeden fragment docelowego k^asu nukleinowego, prowadzi się w temperaturze 37°C.
Sposób według wynalazku pozwala na określenie osobniczego typowania HLA-DRP zgodnie ze standardowymi technikami typowania z oligonukleotydami, w którym co najmniej część sond ze zbioru sond, jak określono powyżej, używa się jako sond wychwytowych lub detekcyjnych, albo kolejno albo jednocześnie.
W sposobie zautomatyzowanym, używa się zbioru sond, pozwalających na identyfikację każdego znanego typu lub podtypu interesującego HLA-DR. W innych przypadkachjest oczywi184 298 ście możliwe użycie ich jednej po drugiej i zatrzymanie sposobu, gdy zebrana informacja wystarcza do określenia typowania.
W związku z tym sposób według wynalazku zasadniczo obejmuje etapy polegające na:
- dostarczeniu próbek docelowych kwasów nukleinowych, zawierających regiony polimorficzne genu HLA-DR osobnika, w celu zetknięcia zgodnie z wybranąposzczególnątechniką, z co najmniej częścią zbioru sond, jak określono powyżej,
- inkubacji według znanych sposobów w określonych uprzednio warunkach takich, że hybrydyzacja z każdą sondą ma miejsce tylko jeśli cel zawiera sekwencję w pełni komplemetamą z wymienioną sondą oraz
- określeniu, według standardowych technik detekcyjnych, hybrydyzacji lub braku hybrydyzacji z każdą użytą sondą.
Zebranych informacji używa się następnie do określenia typowania zgodnie z uprzednio ustalonym planem typowania, biorąc pod uwagę użyte sondy i znajomość wymienionych typów HLA-DR i/lub związanych podtypów. Pracę tę upraszcza się, wykorzystując plan typowania, czyli w praktyce tablicę, bezpośrednio podającą typy i/lub podtypy zgodnie z zaobserwowaną pozytywną odpowiedzią (hybrydyzacja(e)). Takątablicę dla zbioru sond według niniejszego wynalazku podaje się poniżej, w części doświadczalnej (patrz tabela 6).
Wynalazek dotyczy zwłaszcza sposobu, jak określono powyżej, w którym wspomniane sondy stosuje się jako sondy wychwytowe, przy czym w sposobie tym można to odróżnić, ponieważ obejmuje on etapy polegające na:
a) unieruchomieniu każdej sondy wychwytowej na stałym podłożu,
b) skontaktowaniu każdej unieruchomionej sondy wychwytowej z ciekłym ośrodkiem, zawierającym co najmniej jeden docelowy fragment kwasu nukleinowego, w określonych uprzednio warunkach, pozwalających na hybrydyzację, jeśli sekwencja komplemetama do sondy jest obecna w celu oraz
c) wykryciu obecności każdej hybrydy, która może się utworzyć.
Naturalnie, sondy według wynalazku umożliwiająwykrycie obu fragmentów docelowych, DNA i RNA. Ponadto, jest oczywiście możliwe użycie jako sondy detekcyjnej, niezależnie od powyższych sond, wszystkich odpowiednich sond, w szczególności jednej z sond opisanych poniżej w przykładzie 5.
Gdy sonda wychwytowa jest bardzo krótka, czyli mniejsza niż 20 nukleotydów a zwłaszcza mniejsza niż 17 nukleotydów, dla poprawienia staje się konieczne użycie środków, które umożliwiają wiązanie sondy do stałego nośnika. Następnie wykonuje się dołączenie sondy do stałego nośnika, w postaci pochodnej, będącej wynikiem kowalencyjnego wiązania sondy z ligandem, co ułatwia łączenie ze stałym nośnikiem. Ligand, który może obejmować część hydrofobową, jest w szczególności, ligandem zawierającym co najmniej jedną polarną grupę funkcyjną, np. grupę aminową- Grupa funkcyjna może służyć do łączenia sondy ze stałym nośnikiem, przez stabilizację wiązania kowalencyjnego. Gdy polarna grupa funkcyjna nie reaguje z nośnikiem, poprawia to wiązanie przez adsorpcję na nośniku, nawet jeśli nośnik jest hydrofobowy.
Ligand wybiera się np. z białek i związkówjakie przedstawiono, odpowiednio, we wzorze I i II poniżej:
- P - OZ
OM+ (I)
184 298 w którym:
Z oznacza rodnik alkilowy o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym albo alkenylowy, posiadaj ący 2-12 atomów węgla, podstawiony lub nie podstawiony przez j edną lub więcej grup, wybranych z grupy hydroksylowej i/lub aminowej i M+ oznacza, w szczególności, metal alkaliczny lub jon amonowy.
Ligand ten jest korzystnie złączony z końcem 5' sekwencji nukleotydowej sondy wychwytowej:
(CH2)n-NH2
-CH2-CH-CH2-OH (II) w którym njest liczbą całkowitą, mogącą zmieniać się od 1do 4, a korzystnie n = 1lub 4.
Ligand ten jest korzystnie dołączony do końca 3’ sekwencji nukleotydowej sondy wychwytowej.
Gdy ligandjest białkiem, np. albuminą, wybiera się go, korzystnie, z albuminy surowicy bydlęcej, która może łączyć się z końcem 5' lub 3' sekwencji nukleotydowej sondy wychwytowej.
Nośnik może być każdym nośnikiem, umożliwiającym unieruchomienie sekwencji nukleotydowej lub pochodnej według wynalazku, albo przez bierną adsorpcję albo przez wiązanie kowalencyjne. Nośniki mogą być wykonane z każdego materiału zwyczajowo używanego, takiegojak nitroceluloza, nylon, papier, lub korzystnie hydrofobowego materiału, takiego jak polimer styrenowy albo kopolimer na osnowie styrenu, zawierający co najmniej 10% wagowych jednostek styrenu.
Stały nośnik może mieć, bez ograniczenia, postać płytki do mikromianowania, arkusza, rurki, stożka, studzienek lub temu podobnych.
Zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku otrzymuje się próbkę, zawierającą kwas nukleinowy od osobnika, którego genotyp HLA-DR należy określić. Można użyć każdego typu tkanki, zawierającej kwas nukleinowy HLA-DR, w ramach niniejszego wynalazku. Jest więc możliwe użycie fragmentów kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) uzyskanych po rozszczepieniu kwasu nukleinowego obecnego w próbce osobniczej, przy użyciu metod chemicznych, enzymatycznych lub podobnych.
Jednak sposób typowania z oligonukleotydami według niniejszego wynalazku można ułatwić przez włączenie wcześniejszego etapu powielenia docelowego DNA lub RNA. Zasada analizy polimorfizmu HLA przez hybrydyzację specyficzno-sekwencyjnych oligonukleotydów pozostaje ta sama, ale etap selektywnego powielenia pozwala na wzmocnienie sekwencji docelowej, upraszczając przez to technikę (R.K. Saiki, T.L. Bugawan, G.T. Horn, K.B. Mullis i H.A. Erlich (1986) Naturę 324,163; J.M. Tiercy, M. Jeannet i B. Mach (1990) Eur. J. Immunol. 20,237).
Powielenie można uzyskać albo z DNA albo z RNA. Jest oczywiste dla fachowca, że powielenie sekwencji celu HLA-DR w próbce można wykonać każdą znaną metodą, która umożliwia uzyskanie wystarczającego powielenia, aby można było wykryć docelową sekwencję, przez hybrydyzację kwasu nukleinowego z sondą.
Zazwyczaj kwasem nukleinowym w próbce będzie DNA, częściej DNA genomowy. Jednak niniejszy wynalazek można także wykonać, stosując inne kwasy nukleinowe, takie jak informacyjny RNA lub klonowany DNA, a kwas nukleinowy w próbce osobniczej może być w postaci pojedynczego lub podwójnego łańcucha. Naturalnie, jeśli kwas nukleinowy występuje w postaci podwójnego łańcucha, jest konieczne przeprowadzenie etapu denaturacj i, aby uzyskać kwas nukleinowy o pojedynczym łańcuchu.
Sondy stosowane w niniejszym wynalazku są oligonukleotydami specyficzno-sekwencyjnymi (SSO), które, w odpowiednich warunkach, mogą wiązać się specyficznie z ich sekwencjami komplementarnymi. Jeśli poszczególnej sondy można użyć jedynie do identyfikacji allelu,
184 298 sondę określa się wtedy jako ASO, czyli oligonukleotyd alleiowo-specyficzny. Jest możliwe, że pojedyncza sonda jest niezdolna do identyfikacji specyficznego allelu DRp na skutek zróżnicowanej natury między rozmaitymi allelami DRp.
Zgodnie ze sposobem według wynalazku identyczność allelu wnioskuje się z modelu wiązania zbioru sond, każdej indywidualnej sondy zbioru, będącej specyficzną dla różnych części genów HLA-DR. W efekcie wyboru z różnorodności sond, odpowiadających sekwencjom DNA znanych alleli, specyficzność sposobu typowania z oligonukleotydami według niniejszego wynalazku umożliwia identyfikację wszystkich alleli loci DRB1, DRB3 i DRB5. Naturalnie, sposobu według niniejszego wynalazku można by użyć do identyfikacji alleli innych ogromnie polimorficznych loci, takich jak DQB1 i DPB1. Ponieważ różnice alleliczne są zasadniczo zlokalizowane w eksonie, kodującym pierwsządomenę cząsteczek HLA (aminokwasy 5-94), sondy wybiera się tak, żeby były komplementarne do specyficznych sekwencji zlokalizowanych w tym regionie. W przypadku odkrycia nowych alleli, te ostatnie są natychmiast spisywane w wykazie sekwencji HLA klasy II, który umożliwia aktualizację zbioru wskaźników informacyjnych, i skutkiem tego dostosowanie metodologii do wykrywania każdego nowego allelu.
Aby usprawnić kompletne typowanie HLA klasy II, zaproponowano wprowadzenie, przede wszystkim, pierwszego etapu ogólnego typowania DR, które może rozpoznawać główne specyficzności HLA-DR, czyli HLA-DRl-DRwl8, ograniczoną liczbą sond. Ten etap jest wystarczający dla wielkiej liczby zastosowań klinicznych (patrz. B. Mach i J.M. Tiercy (1991) Human Immunol. 30,278).
Na podstawie wyników tego pierwszego etapu, można wybrać specyficzne sondy potrzebne do wytworzenia, w drugim etapie, mikropolimorfizmu DRp, w celu wykrycia polimorfizmu DQB1 i, jeśli konieczne, scharakteryzować allele DPB1.
Analizę specyficzności HLA-DRl-DRw18, przy użyciu techniki typowania z oligonukleotydami można stosować w laboratoriach zgodności tkankowej, do rutynowego typowania DR, jako zastąpienie serologii DR, w szczególności do wykonywania typowania DR pacjentów z listy oczekujących na przeszczep nerki lub typowania potencjalnych dawców nerki, typowania DR pacjentów z białaczką limfocytamą, u których przeprowadza się przeszczep szpiku kostnego, zarówno członków ich rodzin jak i nie spokrewnionych potencjalnych dawców, typowania DR na wielką skalę, w celu opracowania spisów ochotniczych dawców szpiku, aby określić związki między chorobami i układem HLA, np. w przypadku cukrzycy insulinozależnej, w celu zastosowań w medycynie sądowej lub alternatywnie do testów w kierunku rodzicielstwa i innych identyfikacji sądowych.
Poniżej podaje się kilka terminów użytych w niniejszym zgłoszeniu:
„genotyp” oznacza zbiór cech genotypowych osobnika, w przeciwieństwie do „fenotypu”, który obejmuje cechy osobnikajakie wyłaniająsię z analizy produktów ekspresji genu, a w szczególności białek;
„allele” sąróżnymi, alternatywnymi postaciami tego samego genu, które wykazują różnice w sekwencji kwasu nukleinowego. Różnice te manifestują się w DNA, RNA i w białkach;
„polimorfizm” charakteryzuje różnorodność wprowadzoną do populacji przez istnienie różnych alleli tego samego genu;
„oligonukleotyd”, jak używa się tutaj, określa primery, sondy, fragmenty kwasu nukleinowego, które mają być, wykryte i temu podobne. Oligonukleotydy można wytworzyć każdą znaną, odpowiednią metodą;
„sonda nukleotydową” stanowi fragment naturalnego DNA lub RNA, albo naturalny lub syntetyczny oligonukleotyd, albo syntetyczny fragment DNA lub RNA, nie zmodyfikowany lub zawierający jedną lub więcej zmodyfikowanych zasad, takich jak inozyna (oznaczona literą I), 5-metylodeoksycytydyna, 5-(dimetyioamino)deoksyurydyna, deoksyurydyna, 2,6-diaminopuryna, 5-bromodeoksyurydyna lub każda inna zmodyfikowana zasada, pozwalająca na hybrydyzację.
Ponadto, w niniejszym zgłoszeniu, gdy sekwencje sondy wychwytowej podkreśla się, oznacza to sekwencję optymalną dla typowania według wynalazku. Naturalnie, te optymalne sekwencje można przedłużać przy końcu 3' i/lub 5', o co najmniej jedną zasadę. W tym wypadku,
184 298 niektóre zasady, jakie ewentualnie można dodać, pokazano w nawiasach, jak będzie można zobaczyć np. czytając poniższy opis. Na koniec, możliwe jest dla fachowca modyfikowanie długości sekwencji użytych zgodnie z warunkami pracy (takimi jak: temperatury hybrydyzacji i przemywania, charakter buforu do hybrydyzacji i/lub przemywania) i planem typowania.
Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami Przykład 1
Ligandy użyte w niniejszym wynalazku i podane tutaj jako przykład mogąbyć dostępnymi w handlu związkami, jak w tabeli 1 poniżej.
184 298
Tablica 1
ligand Wzór Dostawca odnośnik
a o II OCH α II / 3 cf3 -c-m- (CH2)6 -op NdzoPr)^ Applied Biosystems 400808
5 --------
b o-(ch2)2-ch / MMTr-HH- (CH2)l2-O-P H(izoPr)2 Clontech Lab Inc 5206-1
c o- (ch2)2 -ch / WTr-NH- (CH2)3 -O-P N(izoPr)2 GlenResearch 10-1903
10 d Ftaoc-NU-CH2-CH-CH2-O-EMTr | o-<ch2)2-ch °-P\ N(izoPr)2 Clontech Lab Inc 5203-3
e CHo-NH-Fmoc 1 CPG-LCAA-O-CH2-CH-CH2-0I9trr Clontech Lab Inc 5221-1
184 298 <CH2>4 -NH-Fłaoc
CPG-ŁCAA-O-CH2-CH-CH2-ODMTr
Clontech Lab Inc 5222-2
MMTr = Monometoksytotyl
DMTr = dlmetoksytntyl
Fmoc = 9-fluoeenytotoetkkskkabbonyl
CPG = skklane perełki o l^K^n^ok^w^i^i^^chłl· porahh
LCAA = aikiloamina długołańcuchowa (rozgałęzienie odległościowe)
Dołączanie ligandu fosforoamidynowego do oligonukleotydu wykonuje się według następującego ogólnego protokołu.
Oligonukleotyd syntetyzuje się na automatycznym aparacie 381 A towarzystwa Applied Biosystems, przy użyciu chemii fosforoamidyny według protokołu konstruktora. Ligand fosforoamidynynowy rozpuszczony w bezwodnym acetonitrylu o stężeniu 0,2 M umieszcza się w pozycji X syntezatora, a dodawanie ligandu ma miejsce na końcu 5' oligonukleotydu, zgodnie ze standardowym protokołem automatycznej syntezy, gdy synteza oligonukleotydujest zakończona.
W wypadku, gdy ligand zawiera zabezpieczającą grupę dimetoksytritylową, taką jak dla związku d, konieczne jest przeprowadzenie dodatkowego etapu odbezpieczenia grupy tritylowej przy pomocy kwasu trichlorooctowego przy końcu syntezy.
Po odbezpieczeniu przez noc, w temperaturze 55°C w 33% NH4OH, po którym następuje precypitacja w etanolu, w temperaturze -20°C, oligonukletyd suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszcza w 1 ml H2O.
Dla związków, posiadających odnośniki b i c, po odbezpieczeniu, wykonuje się dodatkowy etap odszczepienia grupy monometoksytritylowej według protokołu producenta (odpowiednio Clontech i Glen Research).
W wypadku związków, posiadających odnośniki e i f, automatyczna synteza rozpoczyna się szczepieniem krzemionki ligandem, zgodnie z standardowym protokołem. Łączenie ligandu i oligonukleotydu ma miejsce poprzez koniec 3' tego ostatniego.
We wszystkich wypadkach oligonukleotydy zmodyfikowane na ich końcach 5' lub 3' oczyszcza się drogą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (HPLC) na kolumnie Brownlee RP18 (10 mm x 25 cm). Warunki: prędkość przepływu 4,6 ml/min, gradient 10% do 35% buforu B w czasie 30 min, 35% do 100% buforu B w czasie 3 min.
Charakterystyki buforów A i B są następujące:
Bufor A: 0,1 molowy roztwór octanu trietyloamonowego (TEAA), pH 7,00
Bufor B: 50% bufor A + 50% CH3CN.
Przykład 2. Łączenie oligonukleotydu do albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
Oligonukleotyd, posiadający rozgałęzienie ze związaną drugorzędową grupą aminową, maj ący odnośnik a w tabeli 1, syntetyzuj e się jak opisano w przykładzie 1:3 x 10'8 mola oligonukleotydu suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszcza w 25 pl buforu o 0,1 M boranu sodu, pH 9,3. Dodaje się 500 pl roztworu, zawierającego 30 mg/ml DITC (1,4-fenylenodiizotiocjanianu, Fluka 78480) w dMf. Mieszaninę miesza się przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, po czym dodaje się 3 ml H2O. Po ekstrakcji roztworu butanolem (3x3 ml), pozostałą fazę wodną (500 pl) suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem i potem rozpuszcza przy użyciu 1x 10'7 mola (6,6 mg) BSA (Pierce 30444) w 400 pl buforu boranowego (0,1 molowy pH, 9,3). Po mieszaniu przez noc w temperaturze pokojowej, produkt koniugacji oczyszcza się drogą wymiany jonów, przy użyciu HPLC na kolumnie AX300 (Brownlee 4,6 x 100 mm) w gradiencie NaCl (tabela 1). Pik, odpowiadający produktowi koniugacji dializuje się wodą (2x1 litr), zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuszcza w 1 ml H2C) i przechowuje w temperaturze -20°C.
184 298
Warunki chromatografii:
gradient: 1 10% B' do 56% B' w czasie 25 min
56% B' do 100% B' w czasie 2 min
Charakterystyki buforów A' i B' są następujące:
A' = 20 mM fosforanu sodu, pH 7,00; 20% Ch3CN
B' = Bufor A' + 1 M NaCl lub 2 M NaCl.
Przykład 3
Tabela 2 ukazuje ustawienia aminokwasów dla różnych alleli genu DRBeta w celu określenia pozycji zmutowanych aminokwasów odpowiednich do wybranej sekwencji zgody (określonej jako „Dr cons”). Mutacje te odpowiadają nie cichym mutacjom w DNA, czyli mutacjom, które będą indukować zmianę w aminokwasie. Wiadomo, że aminokwasy sąkodowane w DNA przez triplety zasad. Mutacja w pozycji trzeciej generalnie nie będzie prowadzić do zmiany w aminokwasie. Przeciwnie, zmiana w drugiej zasadzie całkiem często będzie indukować zmianę w aminokwasie. Wreszcie, mutacja w pierwszej zasadzie będzie zawsze prowadzić do modyfikacji aminokwasu.
W przypadku typowania różnych alleli, mutacje w DNA, odpowiadające nie cichym mutacjom są skutkiem tego, stosowane najczęściej. Jednak, możliwe jest wykrycie mutacji cichego typu, np. w celu różnicowania dwóch bardzo ściśle powiązanych alleli.
Tabela 3 ukazuje ustawienia nukleotydów genu DRBeta dla wszystkich alleli znanych i publikowanych do dzisiaj w literaturze, związanych z taką samą sekwencjązgodyjak w tabeli 2.
Nomenklatura użyta do oznaczenia różnych alleli jest taka, jak proponowano na piątej konferencj i na temat zgodności tkankowej (Leiden, Holandia, 1991). Oznaczenia w nawiasach w tabeli 2 odnoszą się do nomenklatury poprzedniej.
184 298
DR CONS PRFLEQxKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRR
Cm fiu
CO CO a tt o u tt tt tt co
CO CO CO as 2
> > > 1
w σ o u •4 u 1 I ω
o o I
O 0 0 I I I I I I Cłi H o tt I I I I Cm Cm
O
I
I
Cm co co co co I I I I > >
(u Cm χχχχχχχχβχπ;
u I o O 1 »4
tu ω W U U 1 w
u «4 »4 X 1 1
σ o
Cu Cm Cm tt tt tt tt X X X 1 X
Fm {-» t
•4 «4 U &4 CU tt tt CO co > > > >
X X 1
X X X X X X X 1 1
XXX I t > >
<0 1 <
«•fc < X
X Γ» co H
O O A, Cl CM ł-4 ł~4 o co m <o
<—1 CM 0 Ci *u CM CM X X «-u r-4 w ^4 CM r-4
X 5 * X X X X tt tt X X X X X H X
O O 0 0 O o O O 0 O o Q O O tt 0
Cm Cm
X >
tt
I w
( «-3
I
I
I
I
I
I
I
I r
i i
i
Cm tt tt x x ύ ó ó o
H > Fi H
O «0 CO CO CO W CO CO
X X X X 1 X X
X 1 1 1
χ α o o
<
tt o
o «η» «Ο M
o «4 o CM ω
< tt < X >
Σ co H O co
ł“4 CM <o w CM rM CM ł-M CM i“4 CM CO u· to tO r* O Ot O r-4 r-4 CM rH CM CO V r4 CM
o O o O O O O O O O O O O o O o O O r4 f-t O O O O o O o o o o
r“4 «—4 «-4 m to to to CO co V *r ^ł> o· 5Γ V ’Τ r- r* 0 CO co CO Ot o r-4
O O O ł-4 r-4 o o o O O O o O o O O O O o o o O o o o r4
« * * * * ♦ * * « * * * « * * « * * * ♦ « ♦ * « « « •fc 4t fc
rM »-4 r-4 rM W w r-4 r-4 r-4 ^4 ^4 «u r4 ^4 r4 r-4 r-4 «“4 r-4 r4
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 fT} fl)
tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt tt Cg
O O O 0 O O O O α O 0 O O O O 0 O O 0 0 0 0 0 0 0 0 o o 0 0
184 298
Ciąg dalszy tabeli 2
O o « os os o > £-< Cm CO w o > o 1 1 r 1 1 1 1 1 > 1 | 1 > > < > < > > > > 1 > 1 t 1 f 1 1 1 1 1 1 1 I > c > 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I > 1 1 1 1 > <
o z X 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 X 1
co « os 1 I 1 | I
o >» O > 1 1 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1 z 1 1 z z z 1 1 1 1 1 1 1 1 I i 1 1
o < OS oS 1 1 1 Cd Cd cd X cd Cd u cd td 1 1 1 X <J 1 X σ o X σ u X o o X Ed 1 1 ł 1 1 I | t
c* ♦ σ O o 0 o O o 0 o 0 X o X X 1 X O O
o » w Q X O V) z z I 1 Cm 1 1 1 1 I 1 Cm rt Cm rt rt rt rt Cm 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ł 1 ł 1 1 I 1 1 Cm 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | 1 Cm rt
w ·» ω < o Ou OS 1 co CO X X 1 CO co 1 1 1
♦ Cd 1 1 1 cd > > CO co < < 1 1 1 1 1 1 > 1 I > 1 1 1 1 1 1 < i | |
o 3 ω 1 1 1 1 I 1 1 1 t t 1 1 X X 1 1 1 1 1 1 | | 1 1
tn * > 1 1 1 | t
* < os >H ω o 1 1 Cm 1 1 Im Cm Cm Cm Cm Cm Cm 1 1 1 1 i ł 1 t 1 1 1 1 O 1 1 1 ł 1 1 I ł 1
o > Q co o 1 i 1 1 1 ł 1 1 1 1 ł 1 «-4 1 ( < 1 1 Z I 1
* Cm 1 1 1 X 1
OS > >1 Cd Cd 1 1 1 1 1 -4 U ►4 ►4 Z Z Z Cm Z z Cm 1 t Cm ł 1 t >4 Cm I 1 < < Cm 1 1 < *4 1 o 1 1 I | z z ł
o α z X Cm 1 1 I 1 X X X X X X X X X 1 1 X 1 1 1 X ł X X X 1 1 1 1 1 1 rt rt rt rt
rt * X oS 1 | X X 1 | ł 1 X X ł o | | o o
« Q U Cm es 1 1 1 1 cd ω 1 1 1 1 1 1 X t Cd cd u rt X 1 t Z 1 Z 1 X X
o > OS ω n 1 I 1 1 1 1 I 1 < I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CM « o 1 1 1 1 1
« z Cm Cm X O 1 1 1 1 1 X X 1 I 1 o 1 ł t 1 1 1 1 1 ►4 1 1 1 1 1 1 ł t
O ω co X X 1 1 E-* <0 <0 u <0 o t-ł <0 H CO H CO H CO H CO B-t co H <0 H co H co O H co 1 1 E-ł co 1 1 1 X ►4 >4 ►4 t 1 O X 1 1 < o X o 1 X 1 o
rt « α X X X X X X X X X X X X X X u u t-4 ►4 1 1 1
Cd ►4 Cm X Om 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 1 o 1 1 1 1 1 1 1 1 σ σ 1 1
>
<
z
(u w
CM o 0 <
co o ►4 tO « »4 rt CM CM rt
1 cn X X o co X < *O <0 -Q Λ o CM rt CM
o Cd X < Cd Cd X X CM CM CM CM
o X X z X o H < tn tn m in O o O
n o o rt o CM o rt o CM O rt O O m o O CM O rt o O m o »Ή O rt O CM O rt O rt O rt O CM O rt O
CO rt rt CM CM O CO rt rt rt •*r V V rt CM CM rt rt rt rt CM
z rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt O O O O O O O O
o « * « « * « * * * « * * * * * * * * * * « «
o rt r-ł rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt rt m m tn
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
O o 0 o o O O 0 O O O O O O O 0 0 0 0 0 o O 0
DRB5*0202 (Dw22, ----O-D-Y--------------H-GI
184 298 cd <L>
X>
cd
H o o u o o o o fc* (9 < O (9 O <9 <9 > fc* O O
O < o υ
VI ¢9 < u o < o u
Cu fc* fc* o
OS, O O o > fc* o o >* < fc* <9 u < o o
Cd < o o o < o u 23 fc* >* < fc* α
Cu fc*
O <
fc* <
o <
u <
o o
fc* o
o fc* fc* o o o o t* o o o u o < <5 o fc* o < o o o o fc* *5
O Cu fc* fc*
U Cu fc* fc* fc* X < u fc* u o fc* o ω < o fc* cn u t* fc*t*fc*fc*fc*fc*fc*fc* o o 19 <9 *X <
<9 o
O 1
< o < < < < < <
fc* o <9 O C9 (9 (9 4 (9
o <9 U 1 C9 O (9 (
< < < < < 1 1 1
O U 1 o 1
fc* (9 <9 O LS 1 1
<
< < <
I I I I I I fc* fc* fc* <
o o o o *C rt;
X 3 1 1 I 1 ł 1 o o o o o u u o o α u u u u o u u o o o u o 1 1 1 ł 1 1 I 1
X fc* X o ł 1 fc* t* fc* o o o o u o o u o u o u u u u u u o o u u o fc* t* u 1 o 1 fc* fc* e* «óg 1
X u o u o t* fc* fc* fc* fc* fc* fc* fc* fc* t* t* fc* fc* f* t-f fc* fc* fc* t* e* fc* fc* <9 Ό o o o o o fj o <9 o t » u u
Q| o £4 1 « u o o o o u α u u u o u u u u o o u o α u o 1 1 w o o t
o o I 1 I | fc* fc* e* fc* c* t* fc* fc* fc* e* fc* fc* fc* fc* fc* fc* t* fc* fc* fc* fc* fc* 1 1 1 o 1
U o o 1 1 1 1 l t 1 l 1 1 I 1 o fc* 1 1 1 o t* o fc* O fc* u U o o t* O fc* w c* 1 o fc*
u t* 1 1 1 1 l 1 1 1
fc* o 1 1 1 1 u 1 1 1 o o o 1 o
Cu fc* fc* t* os α o < o coooooooooooooooooooooooooo oo
Ο^ΝΙΝΓϊσίΠΗΗΗΗ^ηηΠΠΠΠ’ΓννΤΤΦβΟΟίΟννί* O O O O O O O ** c* τ-4 «-* ^* r* r-4 w* r* «-* r* »* »H r* r* r* O O O O O O O κσΐσιηπΗΗΗ·*«*......
O “ - - - - I Ν HN oooooooooooo '‘'r‘POOO°Oł-*»-*T>*·* * * * * in m m «-* «η r-t ^-ł
SigSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS ooaoooooooooooooooooooooaoooooooogg^^sSKHęĄ
184 298 < Λ Ο
U
Ο 1 1 1 I 1 t 1 1 1 1 1 1 1 1
(X ο I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
α 1 1 1 1 1 I 1 1 I 1 1 1 1
υ 1 1 ł 1 1 1 1 1 1 1 1 1 f ł
σ < 1 1 ł 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
ο 1 1 t 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
ο 1 1 1 ( 1 1 1 1 1 1 1 1
> F* 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ł 1 t
ο 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
ο 4 1 1 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1
ο F* ο 1 1 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1
4 1 1 1 I » · ł I 1 1 1 1
Ο 1 1 ( ( 1 1 ł 1 1 1 » 1
tu F· 1 1 1 1 1 1 1 I 1 1 I 1
F· 1 t 1 I 1 I 1 ( t 1 1 1
Ο f ( 1 1 1 1 I (
V) Ο ( 1 1 1 1 1 1 1
4 i 1 1 1 1 ł 1 1
C3 1 1 1 1 1 ł 1 1
ω 4 1 1 1 1 1 1 1 1
C3 1 1 1 1 t 1 1 1
κ ο o o 1 o o o o o o 1
ο ο f« F» F» 1 F· F* F· F« F· F· 1
ο ><11111 1
«η F· t t 1 i 1 1 I 1
«ο > F* 1 1 1 1 CJ O 1 1
ο 1 t 1 1 1 1 I 1
α 1 1 1 1 1 1 1 1
ο σ 1 1 1 1 1 1 1 1
ο 1 1 1 1 1 1 ł 1
ο 1 1 1 1 1 t 1 1
> 4 1 1 1 1 1 t 1 1
F· 1 1 t 1 1 1 1 1
U 1 1 1 1 1 t 1 1
ζ g 1 1 1 1 1 1 f 1
Ο 1 1 1 1 1 1 1 1
ζ 4 1 1 t t ł I 1
Ο 1 1 1 1 1 1 (
ο 4 1 1 1 1 1 1 1
00 Λ Ο 1 1 1 1 1 1 1
4 1 1 1 I 1 1 1
Ο 1 1 1 1 1 t I 1
Ο Ο i i i ι ι i i 1
Η 1 1 1 1 1 t 1 1
Ο 1 1 1 1 F· F* 1 t
> 4 1 t 1 1 1 1 f 1
e-i 1 f 1 1 1 1 1 1
ο F· F* F· 1 1 I 1 I I 1
Ε-ι ο 4 4 4 4 4 4 « 1 I 1 « 1 « 1
ο 1 t 1 1 « 1 f 1
Ο 4 1 1 1 1 1 1 1 1
Ο 1 I 1 1 1 1 ł 1
W) Ο 1 1 1 t f 1 i 1
<- > F* 1 1 1 t 1 I 1
ο 1 1 1 1 1 1 1 «
m ο 1 1 1 1 1 1 1 1
X X C3 4 4 4 o o u u o o o o o o
ο Ο CJ o V u u ł I I 1 1 I •
u 1 1 « 1 1 1 1 1
<υ 4 u C3 ο o w o ΰ 1 1 1 t 1 1 1 I
χ> ο 1 I 1 1 1 1 1 1
¢3 ο 1 « 1 1 O U 1 1
4—» 0C ο 1 1 1 « 1 1 I
ο 1 t 1 1 1 1 t
ο 1 < 1 1 1 1 1 I
N X X 4 4 4 4 4 4 C9 4 4 C3 O C3 4 4
ςΛ 4 1 (3 O 1 1 1 C3 <3
Ο ο O U CJ O O O o o
r- ο 4 1 1 1 1 1 1 I t
Ó ο <3 C3 C3 <3 O C3 O <3
ο 4 4 4 4 4 4 4 4
$ ω 4 C3 ο 1 1 1 1 1 1 1 1 1 < 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l
ο -3 F* ο 1 1 1 1 1 1 1 < 1 1 1 1 1 1 1 1
υ >(11111 1
t* 1(11111 1
u F* 4 F* F* 4 F· 4 4
ο I 1 1 1 1 1 1 1
α 4 1(1((11 1
σ 1111(11
«η ο (111(1(
X 5 ((((((I 1
ο ((((((I 1
ο 4 1(((111 1
U (((1(11 1
CJ ( ( 1 1 1 1 1 1
« ο ( 1 ( 1 1 t 1 1
4 1(((((1 I
ο 1(1(111 1
Ζ 3 ( t ( 1 1 1 1 1
ο (11(1(1 1
X ο ((((III 1
F· 1 1 1 1 1 1 1 1 1
ο Ο 1 1 ( 1 1 1 1 1 1 1
w >4 4 CJ I 1 u 1 1 1 1 1 O O 1 1
F« 1 1 1 1 1 1 ł 1 t 1 1 1 1
Ο 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
u 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
<3 1 t 1 1 1 1 1 1
Ο O C3 <3 O 1 1 1 1
4 ο 1 4 4 4 4 1 I 1 1
ο 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Η U o I 1 1 1 1 U U 1 1
Ο 4 f· H 1 1 1 1 ( Fl F· 1 1
C3 1 1 1 1 1 1 1 1 1
F· 1 111(111 1
CU Ο 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
U 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
«η C3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
«η Λ Ο 1 • 1 1 • 1 1 I 1 t 1 « I
Ο I 1 1 1 1 1 11111(1 1
Ο I ł 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 1 1
C3 <3 I 1 1 1 1 1 111(((1 1
C3 I 1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1
C3 I 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1 1 1 1
U F· I t 1 1 1 1 111(111 t
U ι I 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1
Ο I 1 1 1 1 1 1111(11 1
Η 4 ι 1 I i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
C3 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
C3 1 ł I 1 1 ( (»11111 1
C4 υ 1 o (9 1 1 1 (•lilii 1
4 1 1 1 1 1 t 1 I · 1 1 1 1 1
ο C3 1 1 I 1 1 ł t 1 I 1 1 1 1 1
•Π > ¢1 1 ( 1 1 1 1 1 1 · 1 1 1 1 1
ο 1 1 1 f 1 1 i a ι ι ι ι i 1
CJ Ο CJ 4
4 F·
Ο F· 4 CJ
C3 (3 C3 I ο
hhhuu4uu44u4 ο ο ο ο <3 ο ο ο
f· κ < F* ο ο
F· Ε-ι ο ο <υφφφοουοοοο
α CJ u 1 CJ 1
o C3 <3 CJ CJ o C3 1 C3
o C3 C3 1
o u o CJ o
<3 <3 (3 C3 o
4 4 4 4 4 1
e-« η 4 4 4 η
1 1 1 1 u 1 1 U 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 I o 111((1 1 1 O Fl 1 1 1 1 1 1 1 1 ( 1 Fl 1 1 1 ( ( 1 1 1 1 ł 1 1 1 1 Fl F· 1 I F· F» Fl 1 ł F* 1
1 1 CJ O 1 1 1 1 1 1 ( 1 O 1 1 O 1 o CJ 1 1 CJ CJ 1 1 1 t o 1 1 CJ CJ o o cj 1 CJ
C9 C3 1 u 1 <3 u 1 (3 1 (3 C3 1 F· F* | 1 f 1
4 4 1 14 1 14 1 4 4 1 1 1 1 1 1 t
«ΗΗΝΗΗΓΜΗΓΜ<η«ΤΗΟ<ΗΝσ>*«η»·<(ΝΓ>*ΐηΗ<Νσΐ*Η<Ν<η«ϊ,»η«Γ'·®Η
COOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
UOOOOOO«H«-t*H*-4«H(-<«-lW4H«H«H«H«Hv-<«-*«KOOOOOOOOOOOOO'
ΗΗΗΓΜΠΗΓΜΗΗίΝΗΓΜ oooooooooooo ^ΟΗΗΗΗΗίΝίΠίΟνΟΦ
OeHOOOOOOr-1r-<r-(0
Χ0Ο0Ο·-<«ΜΟ»Μ»-Ι»-<.·*«-»»Η.-*«Η»·Η··Η»-Η··Μ»-(»-(»-<.·**·«··4Ο·-Ι “222222222222222222222222222
QOQQQOOQOOOOOQQOOOQOOOOOOOO
Ξί — ^OOOOłOlOr-łe-łOO
22222222222222
QCS0QQQQ0Qqqqqq
184 298
Przykład 4
Stosując 2 protokoły opisane powyżej, z syntetyzowano oligonukleotydy albo niosące li gand, jak opisano w przykładzie 1 i które krótko opisano w tabeli 4 albo połączone z BSA, jak opi sano w przykładzie 2 i które krótko opisano w tabeli 5.
Tabela 4
Odn. Nr. sekwencja 5* - 3* *** ligand X . * * tr
1 563 CTGGAAAGATGCA a 17,11
2 562 TGGAAAGATGCAT a 17,63
3 561 CAGGATAAGTATGA a 17,52
4 579 GCAGGATAAGTATGA a 16,7
5 603 CAGCAGGATAAGTATG b 17,44
6 1094 CAGCAGGATAAGTATG a 16,25
7 546 TGGACAACTACTG a 18,61
7a 570 GGACAACTACTG a 16,09
8 596 GGACAACTACTG b 17,29
9 545 GATACTTCTATCACC a 19,2
10 398 CCTGATGAGGAGTA a 14,6
11 573 CAGGGTAAGTATAAG a 16,18
12 580 GCAGGGTAAGTATAAG a 16,99
13 1064 TGGCAGGGTAAGTAT a 17,55
14 591 GGCAGGGTAAGTATAAG b 18,18
15 1095 GGCAGGGTAAGTATAAG a 17,13
16 400 GGCCCTGGTGGA a 13,79
17 595 GGCCCTGGTGGA b 17,43
18 574 GCGGTATCTGCACA a 16,62
19 556 GGAGGAGGTTAAG a 17,94
20 555 TGGAAGACGAGC a 16,1
21 755 TGCGGAGCACTGGA a 16,85
184 298
Ciąg dalszy tabeli 4
Odn. Nr. sekwencja 5’ - 3' *** ligand X . -Ir 4r tr
22 867 GGAAGACAAGCG a 13,36
23 915 CTCTACGGGTGAG a 19,04
24 1066 CTCTACGGGTGAGT a 17,14
25 990 CACCTATTGCAGA a 17,47
26 1067 CACCTATTGCAGAC a 17,08
27 1068 ACACCTATTGCAGA a 17,81
28 802 CCAGGAGGAGAACGT a 15,86
29 1096 CCAGGAGGAGAACGT c 15,77
30 1097 CCAGGAGGAGAACGT d 13,74
31 1098 CCAGGAGGAGAACGT e 14,03
32 1099 CCAGGAGGAGAACGT f 14,81
33 1100 CCAGIAGGAGAACGT a 14,97
34 1107 ACCAGIAGGAGAACGT a 16,05
34a 1127 AACCAGIAGGAGAACGT a 16,62
35 935 ACCAGGAGGAGAACGTG 19,29
36 997 GAGCTGCGTAAG a 16,55
37 1033 TTCCTGGAGAGACAC a 18,4
38 1030 TTCCTGGAGAGATAC a 18,39
39 1065 TCCTGGAGAGATACT a 18,01
40 1058 GGAGGACTTGCGC a 17,9
41 1059 GGAGGACTTGCGCT a 18,35
42 1060 AGGAGGACTTGCGC a 17,05
42a 1061 ACGGGGCTGTGGA a 16,79
ΪΧ oznacza ligand według nomenklatury użytej poprzednio w tabeli 1
Tr oznacza czas retencji w minutach (min) oligonukleotydu w HPLC w warunkach opisanych w przykładzie 1 (kolumna Brownlee RP 18 (4/6 mm x 25 cm), prędkość przepływu 1 ml/mm) ***Litera I w sekwencji 33, 34 i 34a oznacza inozynę
184 298
Tabela 5
ODNOŚNIK NUMER SEKWENCJA 5’-3* TR* STOSUNEK OLIGO/BSA
43 571B TGGACAACTACT 7,85(2M) 1
44 574B GCGGTATCTGCACA 8,69 (2M) 0,8
45 556B GGAGGAGGTTAAG 7,76 (2M) 1
46 555B TGGAAGACGAGC 16,85 (1M) co o
47 756B GCGGAGCACTGG 17,78 (1M) 1,5
48 867B GGAAGACAAGCG 16,65 (1M) 1,1
49 868B TGGAGACAAGC 8,56 (2M) 1,3
50 856B GAGGAGCTCCTGCGCT 19,96 (1M) 1,2
51 966B AGGAGAACGTGC 19,66 (1M) 1,5
52 997B GAGCTGCGTAAG 18,88 (1M) 0,9
53 998B AGCTGCGTAAGT 16,32 (1M) 1
54 1026B GAGAGACACTTCC 13,98 (1M) 0,5
55 986B GGAGAGATACTTC 15,81 (1M) 0,6
56 1049B GAGAGATACTTCC 15,86 (1M) 1,2
57 1089B ACGGGGCTGTG 17,72 (1M) 1,1
58 1090B TACGGGGCTGT 17,24 (1M) 1
59 1091B CGGGGCTGTGG 17,42 (1M) 1,1
*Tr oznacza czas retencji w minutach (min) oligonukleotydu połączonego z BSA w HPLC w warunkach opisanych w przykładzie 2 (IM) oznacza, że bufor B zawiera 1M NaCl (2M) oznacza, że bufor B zawiera 2M NaCl * Oligonukleotyd określa się ilościowo w pikomolach przez spektrometrię w UV, mierząc absorbancję przy 260 nm według protokołu Applied Biosystem. BSA oznacza się w pikomolach metodą Bradforda (M.M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)). Stosunek oligo/BSA jest stosunkiem tych 2 wartości
184 298
W przykładzie tym, określono oligonukieotydy wychwytowe, które można syntetyzować bez ligandu lub z ligandem albo alternatywnie łączone np. z BSA. Wybór sekwencji syntetyzowanych nukleotydów uwzględnia ustawienie sekwencji DNA różnych alleli, opisanych w tabeli 3 przykładu 3. Wybrane sondy nukteotydowe, użyte np. jako sondy wychwytowe, umożliwiają skonstruowanie planu typowania, tak jak opisano w tabeli 6. Jest całkiem oczywiste dla fachowca, że można określić inne plany typowania z innymi nukleotydami.
W tabeli 6 oznaczenia w nawiasach przedstawiają nomenklaturę użytą przed konferencją na temat zgodności tkankowej (1991) dla podtypów allelu DRB5.
Znak + oznacza, że podtyp w omawianej linii w tabeli 6 daje hybrydyzację z sondąw odpowiadającej kolumnie.
Przy użyciu tabeli 6 można bez trudu interpretować otrzymane wyniki (hybrydyzacja lub brak hybrydyzacji) z różnymi sondami, np. cel, dający pozytywną odpowiedź z sondami 43,14, 28 i 37 odpowiada typom DRB 1*0301 /DRB 1*07.
184 298
α ΓΜ + + + i
CA TT + —
V> + + + +
Γ- Γη + + + + + + + + + +
U
CA o + 4 o + + + +
r- CA + + + +
tT CA + + +
OO CA + + + + + + +
r* tt + +
co TT +
O TT + + + + + +
ΙΖΊ TT +
tt TT +
r— + +
TT +
O + +
σν + +
n TT + +
«Λ + + +
w·* + + +
CA O CA TT O cn o CA O CA CA O AT O
O O wU O o
O W & 44 s o CA O O C*J o o o <A O O O CA O o n o <A O cn o ~ CA 5 3 O o o CA O 1»·* O CA o cn CA O cn *n o cn ’Τ· o cn «η o cn w» ca cn tt tn ?§§§§ o Γ* o s o s o s
a a α §§ Q O «/> § Q v> ca cc O •o a a Q a a α a a o a a α a a o a a α a a o a a Q a a Q a a α a a o a a a § o a a a § a a a a a a a § a a a a a a a a a a a a a
184 298
Przykład 5. Wytworzenie sond detekcyjnych
Zgodnie z przykładem 2, oligonukleotyd, aktywowany i wysuszony pod zmniej szonym ciśnieniem, rozpuszcza się w 1,25 x 10'7 mola (5 mg) peroksydazy chrzanowej (Boehringer Manheim 413470) w 200 pl buforu o 0,1 M boranu sodu, pH 9,3.
Protokół oczyszczania jest identyczny: produkt koniugacji przechowuje się w temperaturze -20°C w 50 mM buforu Tris-HCI, pH 7,0, 40% glicerol.
Tabela 7 krótko opisuje różne produkty koniugacji użyte w wykrywaniu HLA-DR.
Tabela 7
ODNOŚNIK SEKWENCJA 5’-3’*** TR* STOSUNEK OLIGO/- HRP**
Dl CCGGGCGGTGAC (GT) GAGCTGGGGC 11,88(2M) 1,4
D2 CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC 18,09 (2M) 1/ 8
D3 GAACAGCCAGAAGGAC 9,32 (2M) 1
*Tr oznacza czas retencji w minutach (min) oligonukleotydu łączonego z peroksydazą chrzanową (HRP) w HPLC w warunkach opisanych w przykładzie 2.
(2M) znaczy, że bufor B zawiera 2M NaCl ** Oligonukleotyd określa się ilościowo w pikomolach przez spektrometrię w UV, mierząc absorbancję przy 260 nm według protokołu Applied Biosystems. Peroksydazę chrzanową (HRP) oznacza się przez UV przy 402 nm wpikomolach według M. A. Ator, J. Biol. Chem., 31 14954 (1987). Stosunek oligo/HRP jest stosunkiem tych dwóch wartości.
***litera I w sekwencji D2 oznacza inozynę. W sekwencji D1 (GT) znaczy, że występuje równomolowa mieszanina 2 zasad G i T w tej pozycji.
Przykład 6. Wytworzenie materiału genetycznego
Przeprowadza się ekstrakcję kwasów nukleinowych z krwi jako całości, w aparacie Applied Biosystems, według następującego protokołu: 2 do 6 ml krwi jako całości rozpuszcza się w buforze TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,00,1 mM EDTA) (ilość wystarczająca na 6 ml) i umieszcza się w rozdzielaczu do ekstrakcji o 30 ml. Dodaje się roztwór proteinazy K (840 jednostek w 20 mM Tris-HCI, pH 8,5). Całość inkubuje się przy mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze 55°C. Nadmiar obecnych białek usuwa się przez 2 jednoczesne ekstrakcje (8,5 ml) mieszaniną fenol/chloroform. Całość miesza się przez 20 minut w temperaturze 60°C. Po usunięciu fazy organicznej, wykonuje się dalszą ekstrakcję fenolową. Nadmiar fenolu usuwa się przez ekstrakcję chloroformem (9,5 ml) przez 10 minut w temperaturze 37°C. Zawarty w fazie wodnej DNA wytrąca się przez dodanie 0,5 ml 3 M octanu sodu, pH 5,5 i 13,5 ml izopropanolu, po czym odzyskuje się na filtrze. Następnie DNA rozpuszcza się w 1 ml wody destylowanej i potem oznacza przez spektrofotometrię przy 260 nm.
Przykład 7. Powielenie DNA
Wykonuje się enzymatyczne powielenie przy użyciu techniki łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) (Mullis i Faloona, Meth. in Enzymol. tom 155, str. 335-350) zgodnie z następującym protokołem: 0,1 do 2 fig DNA, oczyszczonego lub nie, w całkowitej objętości 100 pl następującego buforu dodaje się do rurki typu Eppendorf:
-10 pl10-krotnie stężonego buforu pCr (500 mMKCl, 100 mM Tris-HCI, pH 8,3 (20°C), 15 mM MgCl2, 0,1% żelatyny);
184 298
- 2μ1 0,5 pM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, TTP);
- 2 ul każdego primera odpowiadającego 25 pmolom;
- 1,5 jednostki polimerazy Taq (Perkin Elmer Cetus);
- woda destylowana (ilość wystarczająca dla 100 pl);
- 50 pl oleju parafinowego.
Rurkę umieszcza się w Termocyklerze (Perkin Elmer Cetus), w którym przeprowadza się 35 następujących cykli temperaturowych:
- 0,5 minuty denaturacji w temperaturze 95°C;
- 0,5 minuty hybrydyzacji w temperaturze 55°C;
- 0,5 minuty wydłużania w temperaturze 72°C.
Użyte primery mają następującą sekwencję:
primer 1 = 5'-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3'; primer 2 = 5'-TCGCCGCTGCACTGTGAAG-3'.
Przykład 8
100 pl roztworu oligonukleotydu wychwytowego o danej specyficzności DR w stężeniu 0,15 pM w 3 x PBS (0,45 M NaCl, 0,15 M fosforanu sodu, pH 7,0) umieszczono w studzience polistyrenowej płytki do mikromianowania (Nunc 439454). Liczba wypełnionych studzienek jest równa liczbie potrzebnej do typowania.
We wszystkich przypadkach powinno się dodać pozytywną próbkę kontrolną, w celu sprawdzenia skuteczności etapu powielenia, a także etapu wykrywania. Sonda wychwytowa, którą stosuje sięjako kontrolę pozytywną, jest obecna na wszystkich allelach znanych do dzisiaj i posiada następującą sekwencję: 5'-GGGGAGTACCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCT-3'.
Płytkę przemywa się 3 razy 300 pl PBS/Tween (0,15 M NaCl, 0,05 M fosforanu sodu, pH 7,0; 0,5% Tween 20 (Merck 822184)). Produkt powielenia (100 pl) jaki opisano w przykładzie 7, denaturuje się 10 pl 2 N NaOH przez 5 minut przy mieszaniu w temperaturze pokojowej. Do tego roztworu dodaje się kolejno 10 pl 2 N kwasu octowego, a następnie objętość buforu PEG (0,1 M fosforanu sodu, pH 7,0,0,5 M NaCl, 0,65% Tween 20,0,14 mg/ml DNA spermy łososia (Sigma D 9156), 2% PEG 4,000 (Merck 807490)) równoważną, n x 50 pl (n jest liczbą sond wychwytowych potrzebnych do typowania). Rozdziela się 50 pl tego roztworu na studzienkę, po czym 50 pl sondy detekcyjnej (produkt koniugacji oligonukleotydu z peroksydazą) przy stężeniu 15 nM w buforze PEG. Płytkę inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 37°C i przemywa 3 x 300 pl PBS/Tween. Dodaje się na studzienkę 100 pl substratu OPD (ortofenylenodiamina, Cambridge Medical Biotechnology ref/456) w buforze OPD (0,05 M kwasu cytrynowego, 0,1 M Na2HPO4, pH 4,93) przy stężeniu 4 mg/ml, do którego dodaje się tuż przed użyciem „30 objętości” H2O2 rozcieńczonego 1/1000. Po 20 minutach reakcji, aktywność enzymu blokuje się 100 pl 1NH2SG4 i wykonuje się odczyt na urządzeniu Axia Microreader (bioMerieux) przy 492 nm.
Przykład 9.
Powiela się 6 DNA wytworzonych według sposobu opisanego w przykładzie 6, zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 7.
Protokół typowania zawiera następujące sondy wychwytowe:
5'a-GATACTTCTATCACC3 = oligogokleotyd o soecyficfności DR3 niosący ligand a na końcu 5' (posiadający odnośnik 545);
5'-GATACTTCTATCACC3 = oligonukleotyd o identycznej sekwencji, ll^e:z bez ligandu (posiadający odnośnik 545 nu);
5'a-TGGACAACTACTG3i = oi igsno0leotgd d gpccyflcznoOgi nsosocy y s gand a w końcu 5' (posiadający odnośnik 546);
= ol igono0leotydo łocHty-czcO lecz bez ligandu (posiadający odnośnik 546 nu)
Protokół typowania jest zgodny z generalnym protokołem opisanym w przykładzie 8. Sondy Dl i D2 (tabela 7) stosuje się w mieszaoioiz 50%/50% jako sondy detekcyjne. Wyniki przedstawiono w tabeli 8 poniżej.
5'-TGGACAACTACTG3'
184 298
Tabela 8
DNA TYPOWANIE DR3 545 NU DR3 545 DR4 546 NU DR4 546
1 DR11/DR11 0,019 0,025 0,021 0,025
2 DR4/DR4 0,018 0,021 0,021 0,138
3 DR8/DR7 0,017 0,022 0,019 0,019
4 DR3/DR11 0,026 0,423 0,021 0,027
5 DR3/DR4 0,023 0,176 0,026 0,296
6 DR3/DR3 0,023 0,387 0,023 0,018
Dwie sondy wychwytowe bez ligandu nie różnicują specyficzności DNA, natomiast te same sekwencje z ligandem a umożliwiają identyfikację specyficzności DR2 i DR4 DNA.
Przykład 10
Powiela się 24 DNA wytworzonych według sposobu opisanym w przykładzie 6, zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 7.
Protokół typowania jest zgodny z generalnym protokołem opisanym w przykładzie 8. Sondy D1 i D2 (tabela 7) stosuje się w mieszaninie 50%/50% jako sondy detekcyjne. Protokół typowania zawiera sondy wychwytowe, krótko opisane w tabeli 9 poniżej.
184 298
Tabela 9
odnośnik numer sekwencja 5*-3*
1 563 CTGGAAAGATGCA
5 603 CAGCAGGATAAGTATG
43 571B TGGACAACTACT
9 545 GATACTTCTATCACC
10 398 CCTGATGAGGAGTA
14 591 GGCAGGGTAAGTATAAG
17 595 GGCCCTGGTGGA
44 574B GCGGTATCTGCACA
45 556B GGAGGAGGTTAAG
46 555B TGGAAGACGAGC
48 867B GGAAGACAAGCG
47 756B GCGGAGCACTGG
28 802 CCAGGAGGAGAACGT
24 1066 CTCTACGGGTGAGT
27 1068 ACACCTATTGCAGA
52 997B GAGCTGCGTAAG
37 1033 TTCCTGGAGAGACAC
55 986B GGAGAGATACTTC
42 1060 AGGAGGACTTGCGC
Wyniki typowania podano w tabeli 10.
184 298
Tabela 10
< co co Γ no «Π 0,016 oo o o 0,024 | NO fm o o 0,015 0,016 1,674 0,021 610*0 1 0,017 | o o 610*0 0,017 910*0 0,021 910Ό 610*0 0,0211 | 610*0 6I0‘0 0,022 1 6t0‘0 | 0,0215 | | 0,024 |
00 < co 03 Γ t* no 00 *n FM O o r* en O O 910*0 090*0 0,042 0,120 0,070 0,020 0,017 | 0,015 | oo fh O o 0,048 0,039 0,036 0,023 0,042 1 0,012 | o t-~ o o 0,025 fM O o 910*0 00 FM O o O O 1 1,973 |
5? < iO m, ·* v> «Π v> 810*0 8Ι0Ό >2,500 0,022 >21,500 8 n CS Λ r- FM O o >21500 0,017 I 610*0 1 FM O o O o > 2,500 0,021 0,073 1,210 | > 2,500 | 0,021 >21500 0,017 0,017 0,020 1 810*0 1 1,931 |
v> < co 03 • NO W) V3 0,022 0,025 0,023 0,024 0,028 0,024 0,031 0,030 0,037 | 0,034 | oo en O O 0,031 . 0,028 0,030 0,028 0,028 1 0,034 1 0,029 0,029 0,028 0,036 1 0,032 0,019 1 | 0,016 |
< CO 03 • V3 0,033 0,031 en en O o 0,031 0,032 0,031 0,033 0,032 0,044 o 0,033 en O o 0,033 0,045 0,050 FH en O o 1 0,076 | 0,041 0,043 0,032 v-> en O O FH o o 0,021 | 1 0,042 1
r- FM 56S 0,072 0,072 o co o o 0,098 0,030 0,068 0,017 o co O O 0,015 | 0,021 | 0,023 NO o o ł—M o o o χί- Ο O 0,536 'ί- ο o | 0,016 | 810*0 0,014 0,018 0,023 0,015 | 0,026 I o o
fh 591 900T 0,929 0,050 0,992 <n o o 0,826 0,016 | 0,019 0,085 | 0,048 1 0,043 0,589 o F« O o 0,448 0,042 0,013 oo o o 0,056 0,046 FH CS o o 0,038 0,036 0,012 | 0,017 |
O FM 398 0,029 0,029 0,024 o o >21500 r-~ FM O o 0,076 >21500 FM en o o 1 0,016 | 0,044 0,032 0,030 910*0 0,017 v-> FM O o 1 0,010 I 0,023 0,013 0,015 0,042 o | 010*0 i 010*0
O 545 0,013 910*0 FM FM O o 0,015 0,042 0,025 0,020 0,025 0,025 1 0,018 | 1,113 0,015 0,013 vn es o o 0,022 0,399 fM o o 0,939 0,016 0,956 1,028 0,014 | 0,013 | 0,037
f*ł 571-BSA 0,718 0,036 o co O o 990*0 | 0,035 0,037 0,027 0,031 0,046 I 0,034 | 0,625 0,625 0,425 I 0,041 0,030 0,023 I 0,468 I 0,035 0,035 0,026 0,031 910*0 1 0,019 I 0,048
v> S NO 0,025 0,024 FM CS o o 0,027 0,089 0,049 0,018 0,017 1,373 | 068*0 1 0,052 0,037 cs o o 0,752 0,959 cn O O en O o 0,747 1,190 0,032 0,035 oo o o o I 0,015 I 0,011
FM 2 m 0,017 O\ o T o FM O o 0,012 OO NO Tt O o o 0,504 0,011 0,459 0,353 610*0 0,015 rM O o oo o o O o 0,007 I 0,015 0,019 1 NO W o o 0,012 0,355 998*0 0,401 o F4 O o
1 SONDA OLIGO NO. DNO No. I 00 Λ •n 2 NO NO t** NO 2 O t- fM Cł P •n 00 t- Ot r* o 00 2 00 00 NO 00 00 CK 00 O On FM 9\ S •n λ
184 298
Ciąg dalszy tabeli 10
w -1 o CS o fR O CS o CS CS o o
ir 1 fR FR fR FR CR i PR cs cn
R O O O o O O O
01 ?2 fR CS rR ^R t -* cn F4 FR CS FR CM rt cn
Si 3 K O O ' O o O o o o FR O O O O O rR fR
c fc r-s cn fr cn i- cn fc fc t fc fc fr cn n s fc s fc fc fc
M FR fR r4 fR Uł Wł rR FR O o FR FR O IO fr F4 fR fR
a » t ffl a a a a a fc > fc fc » ffl » ffl ffl ffl
os Q o =? fR ffl os FR FR ffl n ffl ffl SttSSSSSWWWWtt 9ffl99999fflfflfflfflffl ffl O rH ffl ffl ffl 5^ ffl ffl 2 99
fR O s 9 <99 S 9 rR O fR O FR O fR O s Q_ 9999 fR O O FR O fR O FR O CS o
m ts r* -R r·* Rt FR fR fR rn rn rn *t m Rt n Rt rR fR fR n
o =5 w o a o fR fR O O o o o o => O o O fR O O O O
* fc fc fc fc fc fc fc fc fc fc fc fc fc fc fc fc fc
fR fR fr fR fR fR fR fR fR fR fR fR fR rR fR rR fR fR fR fR fR fR fR FR
ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl a ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl a ffl
os ffl OS ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl ffl
Q O Q ffl H o ft Q O Q Q Q a o O D D D D o a a a a
0 z 00 Os cn SO r* 00 O FM <s cn Wł 00 O\ o tn Rt W) Ό r*. Os o CR Wł
< z Q Wł to so SO SO SO r* t*· r* r* t*· f* t* 00 00 00 00 00 00 00 Os Os Os Os
0 O o g o o o o o o o O o o O O O o O O O o O O o
Li o o o o O o o o o O o o O O o O O O o o O O o
U wł wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł sn Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł Wł
0 CS CS CN CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS CS
U A Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ A A A A A A A A A A A A A
Rt Os O CS sO Wł Rt a SO Rt O Os CS r«M Os Tt (S Rt Rt SO Wł cn CS
CS cn CS CS CS <S 5 CS CS CS r* ^R O CS CS CS CS CS CS cs cs
Mt o o o o o o o o o Rt o o o Rt w> O o o o O o o o o
fR o o o o o o o o o d o o o o O o o o o o o o o o
Λ oo cn SO Wł SO Rt oo oo r* OO r- Wł Os Rt cn o oo Rt Wł Os oo Rt CS CS
Wł wł Λ g g g g g CS o s FR o o FR O r* o O o g rR CS SO rR cn o o r“* O o O r“4 cn o cn
flO CA o d d o o O d d d o d d d o d d d o o d o d d d
S Os wł Rt o cn wł CS cn o Wł F* cn CS Wł OO r-R OO SO r- r** SO CS FR cn
j. w> cn Os cn Os o Wł sO r* 3 cn *R FM 3 Wł cn cn Rt SO FR cn CS cs
cn r* o o oo FR Os cn o o OO O\ o O o o o Wł o o O o
o o rR o d d d oi d d d d d d d d d d d d d o d d
< o oo r* SO r* o OO OO Rt Wł Os o 5 O 00 FR CS O Wł CS CS oo r* Rt
cr Wł o • Wł O 3 r* r* cn O s Wł O o Wł o g cn r* CS SO O 3 en O 3 SO o Os Wł 3 3 3 w> rR CS CS
§ o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o rR
SO Os 3 n Wł CS Os SO SO CS o a o Ό Rt SO 090' Os Wł SO ^R CS CS OO OO
f* n g cn C> FR O s cn o Rt OO s 3 cn O CS o cn o SO O 3 3 Wł O Os O O cn cn o 3 g g
d o o o d d d d d d d d d O o d d d d d d o d d
SO 3 rR cn OO Wł OO CS 3 Si Os cn OO SO t o Rt OO r* Rt \o Os Os
SO CS OO O CS cs o CS CS CS Os CS r* CS 3 r* CS CS cn
cr o <=i o oo o o o P o o o o o o o O o o o SO o o o o
fr o o o o o o o d d d o d d d CS d d o d d d d o o
cn r> cn Rt oo ,107 OO OO Rt Os Wł r* o o CS Os o cn SO SO OO SO Rt
8 § oo o g oo O 8. g g oo o g g 8 8 8. 3 Wł »«R cn o oo rR g g g Wł rR Wł FH
o o o O o o o o d o d o d o d d o o d d d o d d
o X 8 Ó Z 00 wł CA Wł δ SO Ό r* SO δ o FM C* CR r* cn Wł 00 r* £ o 00 2 s Wł 00 SO 00 00 Os 00 O Os fM Os S Wł Os
w M J o i o
184 298
Opisany sposób umożliwia nam jednoznaczne typowanie 24 testowanych DNA. Przykład 11
Zalecaną temperaturąhybrydyzacji w typowaniu HLA-DR opisanym w niniejszym wynalazku jest temperatura 37°C. Jest jednak możliwa zmiana tej temperatury hybrydyzacji.
Przykład, który oastępujsjest identyczoyjak przykład 10, z wyjątkiem temperatury hybrydyzacji, którą zmieniono z 37°C na 45°C. Typowanie przeprowadza się na 11 DNA.
Użyte sondy wychwytowe podaje się w tabeli 11 poniżej.
Tabela 11
odnośnik numer sekwencja 5’-3’
1 563 CTGGAAAGATGCA
5 603 CAGCAGGATAAGTATG
43 571B TGGACAACTACT
9 545 GATACTTCTATCACC
10 398 CCTGATGAGGAGTA
14 591 GGCAGGGTAAGTATAAG
17 595 GGCCCTGGTGGA
44 574B GCGGTATCTGCACA
45 556B GGAGGAGGTTAAG
46 555B TGGAAGACGAGC
48 867B GGAAGACAAGCG
47 756B GCGGAGCACTGG
28 802 CCAGGAGGAGAACGT
Wyniki typowania podaje się w tabeli 12 poniżej.
184 298
Tabela 12
< cc Os SO o r- SO Tt oo CC oo r-
ca cc CC CC Tt CC CC Tt ro ro ro SO
>Ć v> wi o o o o o o o o o o o
o o o o o o o o o o d
< Z) cc oo Os Tt cc ro Os CS ro Ό OO
CD o o o o o O CS ł-H
o o o o o o o o O O o
r* <n o o o o o o o o o o d
oo t r-- Os oo Os oo o Os o
t-. W> o ,00 O o 00' o so rH CS CS
O\ wj o ć> o o o O o o o
ó o o o o o o o o o d
Tt CS CS cc Tt Γ. wc Os o CS CC
8 i-H i—4 o o cs CS CS CS cc
os v> O O o C o ro o o o o
o o o o o O O o o o o
m ro r— Os so Γ oo o CS
o 00 o ,00 O O ć'“'ł o o i—
Os ri 00 O O o o o o o o o
d o o o o o o o o o d
SO CS 1-M so cc oo Tt cc <s
O\ v> w> ,00 ,00 ,00 ( 00' ,00 ,00 ,00 Os i»4 o o oo
o o o o o o o o O o d
< ro ro CC Tt so 00 ro o CS CS CS
β 0 CS ro CS cs Tt CS CS CS o CS
·. o O o 1-4 o o o i—4 o
r* w> o O o o o o o o o o d
ro ,200 ro cs tT ro ro CS so Tt
Wi ri § ,00 ,03 cs o O 8 CC i—4 o O 00' CS Os
o W o o o v™4 o o O
CC Os Os ro ro r> Γ oo 25
ι·4 2 wi 8 60 60' 00' ,00 8 00' 8 g § g
o o o o o o o o o o d
o X o
EJ 8 *« z tH CS ro ro 00 Os o ro TT ro Ό
o 5 r- t- r- r- 00 00 00 00 00
w J a
o
1 TYPOWANIE | CS o o o o ? cScccScoc S CC < # # < < {<3 r\i ν-! IZ) U) Η H r-( O O U H O ♦, CQ CQ CQ CQ PQ * * * * # £§§§33βί «« « « §33SS3££££3 ^oSSSSooooo * * * * * * * * * * * w—1 ł—l ,—t P5wra»eQeQCQcQcqcqcc QODCQQQQQGQ
0 < ki u c 0 o Ψ | >2,500 |> 2,500 [>2,500 [> 2,500 | [>2,500 | [>2,500 | [ >2,500 >2,500 | >2,500 | > 2,500 > 2,500
00 <s | 802 | 0,039 | 0,013 1 0,017 | 0,045 j Γ 0,062 | 1 0,122 | 0,016 0,040 | 0,166 | 0,244 0,038
'5 ω ·’ Ό Wi r* 600‘0 1 600‘0 1 | 0,013 | 0,010 | 1 900‘0 1 | 0,009 | 0,008 0,021 | 0,019 | 0,021 0,020
00 < tfl (0 · <o 00 | 0,016 | 0,010 | 0,011 | 0,007 ) | 0,005 | I 0,013 | 0,012 0,021 | 0,020 | 0,023 O <d
TT < w 0 l' Wi Wi Wi | 0,583 | 0,012 | 0,005 1 0,011 j | 0,005 | I 0,790 | 0,010 Os O © CS ro s- d 0,564 0,017
03 0 z 8 U o 1 DNA No. rH r* CS t- ro 00 OS r- <9 00 2 Tt 00 ro 00 SO 00
184 298
Przykład 12
Zalecany bufor hybrydyzacyjny, oznaczony jako bufor PEG, użyty do typowania HLA-DR, jak opisano w przykładzie 8, ma następujący skład: 0,1 M fosforanu sodu, pH 7,0, 0,5 M NaCl, 0,65% Tween 20, 0,14 mg/ml DNA spermy łososia (Sigma D 9156), 2% PEG 4000 (Merck 807490).
Użyto tego samego buforu, zawierającego formamid (10% końcowo). Wiadomo, że formamid umożliwia redukcję temperatury hybrydyzacji.
Jeśli hybrydyzację przeprowadza się jednak w temperaturze 37°C w obecności formamidu, specyficzność wykrywania powinna się w związku z tym zwiększyć.
Typowanie przeprowadza się na 24 DNA, takich jak użyte w przykładzie 10.
Użyte sondy wychwytowe i otrzymane wartości podaje się w tabeli 13 poniżej.
184 298
Tabela 13
r* ’Τ < «Λ <Ο ·' Ο «η t*» 0,008 0,007 600*0 ΟΟ 8 ο 0,004 0,007 0,340 0,005 0,004 ΟΟ 8 ο 600*0 900*0 0,005 800*0 0,004 0,002 0,005 0,005 900*0 0,007 1 0,008 0,002 m S ο m 8 ο
< V) ο ΟΟ ο οο ΧΟ CS At νη ΟΟ σχ ο CS At CS ο ΟΟ ΟΟ ΧΟ At cn At νη X)
α (Ν ΓΝ ΓΑ τ— ^•4 ο
τ ·’ ο ο ο ο Ο ο Ο Ο ο ο ο ο ο ο Ο ο ο Ο Ο Ο ο ο ο m
Ό 00 ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο
< οο οο Ο\ cn C4 00 ,344 r- Γ- οο Af οο νη ο ^4 οο cn 00 <7\ CS σχ
$ C3 00' 8 ΜΊ cn 00' At cn cn cn 8 Ο ο 8 8 8 οο cn ο ο τ“4 At Γ- cn 3 CS cn 8 00 8 ο cn
•Ο •ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο* ο ο ο ο
< ΟΟ t** Ο\ Ό At οο Ο\ CS Μη νη οο ΧΟ σχ ο CS νη ΟΟ σ\ CS cn νη οο
«λ ’Τ α 00 00 00 00 00 00' 8 Ο Ο 8 8 8 ο ο Ο ο 8 00' 00 g ο 00 Ο 8 8
Ό «Ο «Ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο
ω 03 ,005 ΧΟ Ο ΟΟ ο 90 04 8 οο ο ο 8 00 ο 3 CS νη ο ΧΟ Ο 00 ο 90 cn Ο ο 3 8 3 χο ο 8 8
’Τ ο ο ο ο ο ο ρ ο ρ ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο
ττ t'- •ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ό ο ο ο σ ο ο ο ο ο
νη Γ** ο νη 00 04 8 χο r* Ό >η ΧΟ r* οο cn cn ΧΟ νη χο 8 r* 8 οο 00
«ο 00 ο ο ο ο ο ο Ο ο ο ο ο CS ο ο ο ο ο ο ο
ϊ-4 Οχ «η ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο σ ο ο ο ο ο
ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο
Γ- Ό r* At Γ- νη ο r* C4 νη νη ι νη t** ΧΟ νη ΟΟ Ον χο r- χο
Τ ^4 Οχ «Λ ΧΟ At CS At 00' ΟΟ χο 8 Ο Ο 8 Ο Ο At ο ο CS 8 ο ο 8 8 8 g 8 00' 8 8
ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο
νη νη ο οο νο 8 ο cn οο 8 ο οο 3 CS νη «η ΧΟ 8 οο <s cn νη χο χο
«0 ο ο ο νη τ·4 σχ ο τ«Μ ο ο ο Ο ο ο 00' ο 00 00'
»4 Οχ ο ο Ο ο cn ο ο cn ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο Ο· ο
ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο
Μη 00 Ο\ νη ο ο 4Μ οο ο 04 ^4 «η cn νη ο r* Ό Ό ο
Ον •ο 3 ,00 8 8 ,00 ,01 Ο Τ-Α Ο 4Μ Ο 8 ο cn Ο ,00 ο ο 8 ,00 00 ο 8 ,09 ,07 ,00 8 8
ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο Ο ο ο ο ο ο ο ο ο
νη νο Ο\ r- ι** ο Ό 00 00 r- CJ At cn cn «η cn cn ρ νη >Π νη cn cn >η
8 CS ^4 4Μ ΤΉ 4-Η ΧΟ 8 3. 4Μ 4Μ cn CS
t. Ο Ο Ο Ο ο ο ο ο ρ ο Ο Ο ρ. ο ο ο Ο Ο Ο Ο Ο.
ł*· •ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο
νη «π 00 ο ,022 Οχ cn wn g 8 wn σχ cn wn At 8 | 90 cn »4 σ» οο ο 8 cn ο 2* οο ο łH £ 900* 8 3
•η ο Ο Ο ο ο ο ο ο cn cn ο ο ο cn ο ο CS Ο Ο ο ο
ο ο ο ο ο ο ο ο ο Ο ο ο ο ο ο ο ο Ο ο ο ο ο ο ο
Πν Γ** 00 ο νη t «η •et Ον Ό Μη cn r*· οο 00 cn CM νη
ζ ν> ο οο ο Ο 8 ο 00*0 0.11 Ρ ο ο 4Μ Λ Ο 00*0 οο Ο ο 0.09 8 ο 8 ο 00*0 8 ο 8 ο ο 8 ο ο 8 ο 3 ο 0.03 0.07 3 ο 00*0
1 SONDA 1 ο ζ 8 3 Ο 0 ζ ί C 00 *Λ Ο» V3 2 >ο οο «ο ο ι> <4 C* Ρ «ο Ρ Οχ r- ο 00 3 00 V) 00 Ό 00 r* οο θ’ 00 Ο Οχ Οχ δ
184 298
Ciąg dalszy tabeli 13
3 £ S frt cs cs o o r~ w n n o o o o w ł-H S r-l CS CO o o o © .© ©o t- S Ή NKrlWf-ITTrni-IrtN —( CS TJ- TT m ©K© ©©©©O©©rM©O© O© © HM ♦ on Ηη»«+**»*ΗΗη«Ν*Ν* ♦♦ TH C2 łH lHłHłHlHM)V)łHt—ίπΟΟΗΗΟΙΛΗΗ Η H « a JL 1, JL « JL «««««·.* **.*«* « « tt θ <=? « a a G « Θ «3 $ 9 Θ « « es es a Θ es Θ < $ Θ η η λ > noi—»qt-iłHłHłHł—inoooołHOł—i ł-> ł—i »s © © £Γί__,t5<5©*i©©©©©“t;CjCjti©Ci©©©© «HNr.Ht^łtnwrinnnt^ooTnłTmłrMHHm O O ł-< © O © tH r-ł O © © O O © © © © © h4 © © © O rH ♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦«♦♦♦♦♦♦♦♦♦*♦* r^ tpM r-4 rH rH l-H τ-M HłHHrHHHHHHH W W ncQncQCQcan(annnnnnmncamcanncqpqn αααακαααααααααααααρίαααοία QQQQQQQOQQQQQOQOQOOQOOOO
O z < z o 00 v> et MS cs Ό Ό Ό t* Ό 00 o o t* r» CM C* o t- MS c* oo Ot o o 00 00 Tt 00 vs 00 to 00 c* 00 et 00 o et et cą et MS Ot
O u. C 0 u * | >2,500 ι ! >2,500 | | >2,500 | I >2,500 | | >2,500 | | >2,500 | | >2,500 I | >2,500 | | >2,500 | | >2,500 | | >2,500 1 | >2,500 ι | >2,500 | | >2,500 1 | > 2,500 1 | >2,500 1 | >2,500 ι o o n CS Λ | >2,500 | 8 Ώ. CS Λ | >2,500 | 8 *1 CS Λ 8 n CS Λ 8 Ό. 04 A
c< I 1060 | | 0,009 1 010*0 r4 r-4 o O 010*0 | 0,024 | 4 C3 O 1 600*0 I 800*0 Ί | 0,130 | | 0,150 | O O o | 0,015 j CM T-4 O o 04 ^4 O Os Ό ł“4 © 600*0 r-4 T-4 O o 010*0 | 0,004 | 900*0 600*0 1 0,011 | | 0,012 | 1 600*0 I
r* n | 1033 | | 0,207 | 1 0,009 | | 0,261 1 1 0,012 I 1 0,251 | I 910*0 1 I 0,199 | | 0,539 η | 0,009 1 O O d M* O O Tt tn 04 O* 1 0,315 1 1 0,011 | r* c—M O o Γ 0,014 1 600*0 οιοό 1 | 0,007 | v-4 O <1 O o r*H O O | 600*0 I 810*0 o rM o O
c< V) «< czi CS 1 £ d © | 0,029 | 00 g © | 0,009 | O O o OO 8 O 1 0,009 | © 1 £00*0 1 | 0,021 | | 0,007 | | 0,028 | I 800*0 | a\ o o o O O O | 0,036 | © © oO g o | 0,005 | (0,006 | OO 8 © | 0,028 | | 0,030 |
r* C4 00 s w 1 0,001 I 1 800*0 1 | 0,058 | | 0,007 | | 800*0 | 1 0,009 1 | 0,055 | | 0,005 | | 0,006 | | 0,005 | OO 8 O | 0,004 | | 900*0 | | 0,009 I | 0,007 | | 0,008 1 | 0,007 | | 0,004 | | 0,005 | | 0,039 | o 1 900*0 1 | 0,012 | d
3 1 0,005 1 I 0,006 I 1 0,115 | 1 0,0051 1 0,005 | O I 0,004 I 1 C^.0^03 | I 0.009 I 600*0 | OO o O o | 0,007 ! I 0,007 1 OO o O © 1 991*0 | I 0,006 | I 0,009 1 | 800*0 1 O | 890*0 I O © Γ 010*0 1 | 0,007! 0,008
00 CM g 00 I 0,036 0,002 0,026 I 0,007 | | 600*0 | 036 OO 8 © 0,034 o O © 0,010 00 s O 0.041 0,064 0,007 f 010*0 1 0,056 | 0,063 0,014 1 § © | 800*0 I 00 8 O | 010*0 | 0,040 0,035
<. o •Z o 1Λ OLIOO NO. 0 z < z O 00 «Π e< MS 2 Ό Ό c* te 00 te O r* r-4 r* £ P m t* 00 o Ot c* O 00 2 00 <n 00 te 00 00 et 00 g «Μ et g WS et
184 298
Zalecaną temperaturą hybrydyzacji jest temperatura 37°C i zalecanym buforem hybrydyzacji jest bufor PEG, ale jak pokazują wyniki przykładu 11 i 12 wydaje się możliwa zmiana zarówno temperatury jak i buforu hybrydyzacji.
Jak wynika z powyższego opisu sposób według niniejszego wynalazku łączy następujące praktyczne zalety:
- optymalną specyficzność z możliwością rozróżniania wszystkich alleli, prostotę wdrażania i zmniejszony koszt w stosunku do analizy serologicznej,
- szybkie wdrożenie otrzymanych wyników w przybliżeniu 90 minut po powieleniu równoważne całkowitemu okresowi czasu krótszemu niż 12 godzin, co jest istotne dla dawców nerek,
- zgodność z typowaniem indywidualnym, którejest istotne dla szybkiego typowania i użytku w małych laboratoriach,
- sygnał, któryjest możliwy do ujęcia ilościowego przez pomiar gęstości optycznej i obróbki wyników, gdzie należy, przy użyciu prostego skomputeryzowanego układu, przy możliwości adaptacji do układów automatycznych.
Przykład 13
W sposób analogiczny do opisanego powyżej wytworzono sondy wychwytowe, odpowiadające oligonukleotydom oznaczonym odnośnymi numerami 101, 102, 103, 104, 115 i 11.
Sondy te użyte jako sondy wychwytowe, identyfikująte specyficznościjakie zaznaczono w wykazie.
Ponadto, można użyć sond wychwytowych według tego wynalazku z następującymi sondami detekcyjnymi:
- GCGGTGACGGAGCTGG
- GAACAGCCAGAAGGAC.
184 298
SPIS SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWA: BIO MERIEUX (B) ULICA: Chemin de 1’Orme (C) MIASTO: MARCY L’ETOILE (E) KRAJ: FRANCJA (F) KOD POCZTOWY: 69280 (G) TELEFON: 478872000 (H) TELEFAX: 478872090 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: System sond do przeprowadzania typowania HLA-DR i sposób typowania przy użyciu wymienionych sond.
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 78 (iv) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA:
CA) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: MSWORD 6,0 dla WINDOWS 3,10 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 1:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 1:
GTGGACAACT ACTG
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 2:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 2:
GATACTTCTA TCACCAA 17 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 3:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 3:
GCCTGATGAG GAGTAC 16 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 4:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 4:
TGGCAGGGTA AGTATAAG 18 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 5:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 5:
GGGCCCTGGT GGACA 115 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 6:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 6:
TGCGGTATCT GCACA 115 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 7:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 7:
GGAGGAGGTT AAGTT 115 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 8:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 8:
CTGGAAGACG AGCG
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 9:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 9:
TGGAAGACAA GCGG 14 (2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 10:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 10:
TGCGGAGCAC TGGA 14 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 11:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 11:
AACCAGGAGG AGAACGTG 18 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 12:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 12:
ACTCTACGGG TGAGTG 16 (2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 13:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 13:
GACACCTATT GCAGAC 16 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 14:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix)WŁAŚCIWOŚĆ:
(A) NAZWA/KLUCZ: modyfikowana zasada (B) POŁOŻENIE: 7 (D) INNE INFORMACJE: N oznacza Inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 14:
AACCAGNAGG AGAACGT 17 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 15:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 15:
GAGGAGGACT TGCGCT 16 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 16:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 16:
TACGGGGCTG TGGAG 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 17:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 17:
GGAGCTGCGT AAGT 14 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 18:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 18:
TTCCTGGAGA GACAC
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 19:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 19:
GGGAGAGATA CTTCC 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 20:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 20:
CTGGAAAGAT GCA 13 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 21:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 21:
TGGAAAGATG CAT 13 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 22:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 22:
CAGGATAAGT ATGA 14 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 23:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 23:
GCAGGATAAG TATGA 15 (2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 24:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 24:
CAGCAGGATA AGTATG 16 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 25:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 25:
TGGACAACTA CTG
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 26:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 26:
GGACAACTAC TG 12 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 27:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 27:
GATACTTCTA TCACC 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 28:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 28:
CCTGATGAGG AGTA 14 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 29:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 29:
CAGGGTAAGT ATAAG 115 (2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 30:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 30:
GCAGGGTAAG TATAAG 16 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 31:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 31:
TGGCAGGGTA AGTAT 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 32:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 32:
GGCAGGGTAA GTATAAG
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 33:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 33:
GGCCCTGGTG GA 12 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 34:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 34:
GCGGTATCTG CACA 11 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 35 (i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 35:
GGAGGAGGTT AAG 13 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 36:
(i) CECHY SEKWENC JI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 36:
TGGAAGACGA GC 12 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 37:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 37:
GGAAGACAAG CG 12 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 38:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 38:
CTCTACGGGT GAG 13 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 39:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 39:
CTCTACGGGT GAGT
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 40:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 40:
CACCTATTGC AGA 13 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 41:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 41:
CACCTATTGC AGAC 14 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 42:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 42:
ACACCTATTG CAGA 14 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 43:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 43:
CCAGGAGGAG AACGT (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 44:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) WŁAŚCIWOŚĆ:
(A) NAZWA/KLUCZ: modyfikowana zasada (B) POŁOŻENIE: 5 (D) INNE INFORMACJE: N oznacza Inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 44:
CCAGNAGGAG AACGT (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 45:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) WŁAŚCIWOŚĆ:
(A) NAZWA/KLUCZ: modyfikowana zasada (B) POŁOŻENIE: 6 (D) INNE INFORMACJE: N oznacza Inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 45:
ACCAGNAGGA GAACGT
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 46:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 46:
GAGCTGCGTA AG 12 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 47:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 47:
TTCCTGGAGA GATAC 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 48:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 48:
TCCTGGAGAG ATACT 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 49:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 49:
GGAGGACTTG CGC 13 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 50:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 50:
GGAGGACTTG CGCT 14 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 51:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 51:
AGGAGGACTT GCGC 1-4 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 52:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 52:
ACGGGGCTGT GGA 13
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 53:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 53:
TGGACAACTG CT 12 (2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 54:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 54:
GCGGAGCACT GG 12 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 55:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 55:
TGGAAGACAA GC 12 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 56:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 56:
GAGGAGCTCC TGCGCT (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 57:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 57:
AGGAGAACGT GC (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 58:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 58:
AGCTGCGTAA GT
12(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 59:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 59:
GAGAGACACT TCC
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 60:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 60:
GGAGAGATAC TTC 13 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 61:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 61:
GAGAGATACT TCC 113 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 62:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 11 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 62:
ACGGGGCTGT G 11 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 63:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 11 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 63:
TACGGGGCTG T 11 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 64:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 11 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 64:
CGGGGCTGTG G 11 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 65:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) WŁAŚCIWOŚĆ:
(A) NAZWA/KLUCZ: modyfikowana zasada (B) POŁOŻENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: N oznacza Inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 65:
CCGGGCGGTG ACNGAGCTGG GGC 23 (2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 66:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 66:
GAACAGCCAG AAGGAC 1(5 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 67:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 67:
CCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG 2Ί (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 68:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 68:
TCGCCGCTGC ACTGTGAAG 19 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 69:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 69:
GGGGAGTACC GGGCGGTGAC GGAGCTGGGG CGGCCT
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 70:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 70:
CCGGGCGGTG ACGGAGCTGG GGC 23 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 71:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 71:
CCGGGCGGTG ACTGAGCTGG GGC 23 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 72:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 72:
TGGCAGCTTA AGTTT 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 73:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy
184 298 (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 73:
CCTAAGAGGG AGTG 14 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 74:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 74:
GCGAGTGTGG AACCT 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 75:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 75:
AAGACAGGCG GGC 13 (2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 76:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 76:
GCGGTGACGG AGCTGG
184 298 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 77:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 77:
ACCAGGAGGA GAACGTG 17 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 78:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 78:
AACCAGGAGG AGAACGT 17
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.

Claims (30)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sonda nukleotydową wybrana spośród następujących sond:
    - TGGCAGCTTAAGTTT
    - CCTAAGAGGGAGTG
    -GCGAGTGTGGAACCT
    -AAGACAGGCGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
  2. 2. Sonda nukleotydową według zastrz. 1, posiadająca sekwencję - TGGCAGCTTAAGTTT lub sekwencję komplementarną do niej.
  3. 3. Sonda nukleotydową według zastrz. 1, posiadająca sekwencję - CCTAAGAAGGGAGTG lub sekwencję komplementarną do niej.
  4. 4. Sonda nukleotydową według zastrz. 1, posiadająca sekwencję - GCGAGTGTGGAACCT lub sekwencję komplementarną do niej.
  5. 5. Sonda nukleotydową według zastrz. 1, posiadająca sekwencję - AAGACAGGC GGGC lub sekwencję komplementarną do niej.
  6. 6. Zbiór sond oligonukleotydowych, pozwalających na wykonanie typowania HLA-DR, zawierający co najmniej jedną sondę wybraną spośród następujących sond:
    - TGGCAGCTTAAGTTT
    - CCTAAGAGGGAGTG
    -GCGAGTGTGGAACCT
    -AAGACAGGCGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
  7. 7. Zbiór sond oligonukleotydowych według zastrz. 6, znamienny tym, że co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - TGGCAGCTTAAGTTT.
  8. 8. Zbiór sond oligonukleotydowych według zastrz. 6, znamienny tym, że co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - CCTAAGAGGGAGTG.
  9. 9. Zbiór sond oligonukleotydowych według zastrz. 6, znamienny tym, że co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - GCGAGTGTGGAACCT.
  10. 10. Zbiór sond oligonukleotydowych według zastrz. 6, znamienny tym, że co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - AAGACAGGCGGGC.
  11. 11. Zbiór sond według zastrz. 6 albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że zawiera ponadto co najmniej jedną sondę, wybraną spośród:
    - GTGGACAACTACTG - GATACTTCTATCACCAA - GCCTGATGAGGAGTAC
    - TGGCAGGGTAAGTATAAG - GGGCCCTGGTGGACA - TGCGGTATCTGCACA
    - GGAGGAGGTTAAGTT - CTGGAAGACGAGCG - TGGAAGACAAGCGG
    - TGCGGAGCACTGGA - AACCAGGAGGAGAACGTG
    - ACTCTACGGGTGAGTG - GACACCTATTGCAGAC przy czym część podkreślona odpowiada sekwencji minimalnej lub ich sekwencjom komplementarnym.
  12. 12. Zbiór sond według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera ponadto co najmniej jedną sondę, wybraną spośród:
    - TGGACAACTACT - GATACTTCTATCACC - CCTGATGAGGAGTA
    - GGCAGGGTAAGTATAAG - GGCCCTGGTGGA - GCGGTATCTGCACA
    - GGAGGAGGTTAAGTT - TGGAAGACGAGC - GGAAGACAAGCG - GCGGAGCACTGG
    - AACCAGGAGGAGAACGT - CTCTACGGGTGAGT - ACACCTATTGCAGA
    184 298 lub ich sekwencji komplementarnych.
  13. 13. Zbiór sond według zastrz. 12, znamienny tym, ze zawiera ponadto co najmniej jedną sondę, wybraną spośród:
    - GAGGAGGACTTGCGCT - TACGGGGCTGTGGAG - GGAGCTGCGTAAGT
    - TTCCTGGAGAGACAC - GGGAGAGATACTTCC lub ich sekwencji komplementarnych.
  14. 14. Zbiór sond według zastrz. 13, zawierający co najmniej jedną sondę, wybraną spośród:
    - AGGAGGACTTGCGC - ACGGGGCTGTGGA - GAGCTGCGTAAG
    - TTCCTGGAGAGACAC - GGAGAGATACTTC lub ich sekwencji komplementarnych.
  15. 15. Zbiór sond według zastrz. 14, znamienny tym, ze zawiera ponadto co najmniej jedną sondę: - AACCAGIAGGAGAACGT lub jej sekwencje komplementarne.
  16. 16. Zbiór sond według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera ponadto co najmniej jedną z następujących sond:
    - GCGGTGACGGAGCTGG
    - GAACAGCCAGAAGGAC
    - CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
  17. 17. Sposób określania typowania osobniczego HLA-DR, rozpoczynającego się od próbki osobniczej, zgodnie ze standardowymi technikami typowania oligonukleotydami, znamienny tym, że stosuje jako sondy wychwytowe lub detekcyjne co najmniej podzbiór zbioru sond wybranych spośród:
    - TGGCAGCTTAAGTTT
    - CCTAAGAAGGGAGTG
    - GCGAGTGTGGAACCT
    -AAGACAGGCGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
  18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się podzbiór zbioru sond w którym co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - TGGCAGCTTAAGTTT.
  19. 19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się podzbiór zbioru sond w którym co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - CCTAAGAAGGGAGTG.
  20. 20. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się podzbiór zbioru sond w którym co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - GCGAGTGTGGAACCT.
  21. 21. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się podzbiór zbioru sond w którym co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - AAGACAGGCGGGC.
  22. 22. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród:
    - GTGGACAACTACTG - GATACTTCTATCACCAA - GCCTGATGAGGAGTAC
    - TGGCAGGGTAAGTATAAG - GGGCCCTGGTGGACA - TGCGGTATCTGCACA
    - GGAGGAGGTTAAGTT- CTGGAAGACGAGCG - TGGAAGACAAGC GG
    - TGCGGAGCACTGGA- AACCAGGAGGAGAACGTG - ACTCTACGGGTGAGTG
    - GACACCTATTGCAGAC przy czym część podkreślona odpowiada sekwencji minimalnej lub ich sekwencjom komplementarnym.
  23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród:
    - TGGACAACTACT - GATACTTCTATCACC- CCTGATGAGGAGTA
    - GGCAGGGTAAGTATAAG - GGCCCTGGTGGA - GCGGTATCTGCACA
    - GGAGGAGGTTAAGTT - TGGAAGACGAGC - GGAAGACAAGCG
    - GCGGAGCACTGG - AACCAGGAGGAGAACGT - CTCTACGGGTGAGT
    - ACACCTATTGCAGA lub ich sekwencji komplementarnych.
    184 298
  24. 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród:
    - GAGGAGGACTTGCGCT - TACGGGGCTGTGGAG - GGAGCTGCGTAAGT
    - TTCCTGGAGAGACAC - GGGAGAGATACTTCC lub ich sekwencji komplementarnych.
  25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród:
    - AGGAGGACTTGCGC - ACGGGGCTGTGGA - GAGCTGCGTAAG
    - TTCCTGGAGAGACAC - GGAGAGATACTTC lub ich sekwencji komplementarnych.
  26. 26. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę - AACCAGIAGGAGAACGT lub jej sekwencje komplementarne.
  27. 27. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się ponadto co najmniej jedną sondę wybraną spośród sond:
    -GCGGTGACGGAGCTGG
    - GAACAGCCAGAAGGAC
    - CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
  28. 28. Sposób według zastrz. 17 albo 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, znamienny tym, że wymienione sondy stosuje się jako sondy wychwytowe.
  29. 29. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że obejmuje etapy składające się z:
    - unieruchomienia każdej sondy wychwytowej na stałym nośniku,
    - skontaktowania każdej unieruchomionej sondy wychwytowej z ciekłym ośrodkiem, zawierającym co najmniej jeden docelowy fragment kwasu nukleinowego we wstępnie określonych warunkach, pozwalających na zajście hybrydyzacji, jeśli sekwencja komplementarna do sondy jest obecna w celu oraz
    - wykrycia obecności możliwie wytworzonych hybryd.
  30. 30. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że etap, polegający na skontaktowaniu każdej unieruchomionej sondy wychwytowej z ciekłym ośrodkiem, zawierającym co najmniej jeden fragment docelowego kwasu nukleinowego, prowadzi się w temperaturze 37°C.
    Wynalazek dotyczy sondy nukleotydowej, zbioru sond nukleotydowych i sposobu typowania osobniczego, a zwłaszcza sposobu określania genotypu HLA klasy II poszczególnych osobników, szczególnie zaś dotyczy wykrywania polimorficznych genów HLA-DR. Sposób ten ma zastosowanie w typowaniu HLA w transplantacji, w diagnozie medycznej, w medycynie sądowej i temu podobnych dziedzinach. Układ HLA (antygen ludzkiego leukocytu) kodowany jest przez główny kompleks zgodności tkankowej w człowieku. Układ ten leży u podstaw bardzo istotnego ograniczenia w przeszczepianiu narządów między osobnikami, w skutek zjawiska odróżniania tkanek własnych od obcych. Ponadto, czynniki HLA wiążą się z predyspozycją do wielkiej ilości schorzeń. Antygeny układu HLA stosuje się w sposobach typowania, w celu określenia cech charakterystycznych między dawcami, a biorcami podczas transplantacji narządów (F.H. BACH i J.J. VAN ROOD, N. Engl. J. Med., 295, str.806-13 (1976)), jak również osobniczej predyspozycji do pewnych schorzeń.
    Genetycznie, układ HLA jest dobrze scharakteryzowany i składa się ze zbioru mniej lub bardziej polimorficznych loci, położonych na obszarze w przybliżeniu 2 centymorganów (cM) na krótkim ramieniu chromosomu 6. Trzy loci w tym układzie (HLA-A, -B i -C) kodują klasę alloantygenów o ekspresji kodominującej (klasa I). Inny region (HLA-D), który w rzeczywistości zawiera kilka genów, koduje drugą klasę alloantygenów, o ekspresji kodominacyjnej, ze znacznym stopniem polimorfizmu (klasa II). Kilka innych loci, które w szczególności kontrolują składniki C2, C4 i czynnik Bf kaskady dopełniacza także należy do układu HLA (klasa III). Po184 298 wodzenie w przeszczepieniu narządu zależy w dużej mierze od identyczności HLA (klas I i II) między biorcąi dawcą. Co za tym idzie, typowanie HLA musi być tak dokładne jak tylko to możliwe. Wymóg ten dotyczy głównie transplantacji nerek (P.J. Morris i A. Ting (1982) Immunol. Rev. 66, 103; G. Opelz (1989) Transpl. Proc. 21, 609; E.L. Lagaaij, P.H. Hennemann, M. Ruigr i in, (1985) New Engl. J. Med. 321,701) i przeszczepów szpiku kostnego (P.G. Beatty, R.A. Clift, E.M. Mickelson i in, (1985) New Engl. J. Med. 313,765; J.M. Hows i B.A. Bradley (1990) British J. Hematol. 76, 1). Jeśli chodzi o przeszczepianie szpiku kostnego, doskonała identyczność pod względem antygenów klasy II HLA jest decydującym czynnikiem w powodzeniu przeszczepienia, to znaczy uniknięciu odrzucenia przeszczepu lub rozwoju choroby spowodowanej reakcją przeszczepu przeciw gospodarzowi (P.G. Beatty, J. Hansen, G.M. Longton i in., (1991) Transplantation 51, 443; R.C. Ash, J.T. Casper, C.R. Chitambar i in., (1990) New Engl. J. Med. 322, 485; C. Anasetti, D. Amos, P.G. Beatty i in., (1989) New Engl. J. Med. 320,197).
    Polimorfizm produktów ekspresji genów regionu HLA-D jest zazwyczaj określany technikami serologicznymi, opartymi na analizach z allogenicznymi surowicami odpornościowymi produktów genu HLA, podlegających ekspresji na powierzchni komórek (J. J. Van Rood i A. Van Leeuwen (1963) J. Clin. Invest. 42,1382; J.J. Van Rood, A. VanLeeuwen, J.J. Koning, A.B. Van. Oud Ablas (1975) Tissue Antigens 5,73). Dokładność i odtwarzalność zależy od dostępnej partii surowic. Jednak nawet w najlepszych warunkach, bardzo wiele istniejących alleli nie można wykryć przy użyciu tych technik serologicznych. Ograniczenie analiz serologicznych wynika głównie z braku monospecyficznych surowic odpornościowych, niekompletnego rozróżnienia reaktywności krzyżowych między bardzo ściśle powiązanymi specyficznościami, np. DR3 i DRwl 3 lub alternatywnie, ze zmienionej ekspresji cząsteczek klasy II HLA na powierzchni komórek np. komórek białaczkowych.
    Dzięki stosowaniu biologii molekularnej poznano istnienie o wiele większej liczby genów HLA niż przypuszczano poprzednio i, co najważniejsze, o wiele więcej alleli. Tę różnorodność charakteryzuje się teraz na poziomie sekwencji DNA różnych genów i alleli. Według najnowszych doniesień Komitetu Nazewnictwa HLA (HLA Nomencalture Comitee) (patrz The WHO Nomenclature Comitee w odniesieniu czynników układu HLA (1990) Immunogenetics 31131; i J.G. Bodmer, S.G.E. Marsh, E.D. Albert, W.F. Bodmer, B. Dupont, H.A. Erlich, B. Mach, W.R. Mayr, P. Parham, T. Sasazuki, G.M.T. Schreuder, J.L. Strominger, A.Svejgaard i P. I Teresaki (1991) Tissue Antigens 37, 97), polimorfizm klasy II HLA dzieli się następująco: locus DRB1: 47 alleli, locus DRB3:4 allele, locus DRB4:1 allel, locus DRB5:4 allele, locus DQB1: 17 alleli, locus DQA1: 13 alleli, locus DPB1: 21 alleli, locus DPA1: 4 allele.
    Wiele z tych alleli wymyka się analizie serologicznej i daje się identyfikować tylko na poziomie DNA. Ograniczenia typowania serologicznego można zilustrować serologiczną specyficznością DR4, teraz dodatkowo podzieloną na 11 podtypów (DRB 1*0401-0411) (patrz J.G. Bodmer, S.G.E. Marsh, E. D. Albert, W. F. Bodmer, B. Dupont, H.A. Erlich, B. Mach, W.R. Mayr, P. Parham T. Sasazuki, G.M.T. Schreuder, L.J. Strominger, A. Svejgaard i P.I Terasaki (1991) Tissue Antigens 37, 97), które można identyfikować tylko na poziomie sekwencji DNA.
    Podobnie, specyficzność DRw6, którą z użyciem kilku allogenicznych surowic odpornościowych, można podzielić dodatkowo na DRwl 3 i DRwl 4, zawiera faktycznie 10 sekwencji allelicznych (DRB1*1301-1305 i DRB1*1401-1405) (patrz publikacja J.G. Bodmera cytowana powyżej), którą, także tutaj, można odróżnić tylko przez analizę genotypową na poziomie sekwencji DNA.
    Analiza genotypowajest nowym podejściem do zagadnienia, umożliwiającym analizowanie różnorodności klasy II układu HLA bezpośrednio na poziomie genów'. Analiza genotypowa opiera się na zasadzie hybrydyzacji cząsteczkowej i pierwsze podejście, jakie zaproponowano jest techniką nazywaną «RFLP», polegającąna fragmentowaniu DNA, przy użyciu enzymów restrykcyjnych i analizowaniu rozmiarów specyficznych fragmentów DNA, utworzonych przez te enzymy (patrz C.T. Wake, E.O Long i B. Mach (1982) Nature 300,372; J. Bihme, M. Andersson, G. Andersson, E. Miller, P.A. Peterson i L. Rask(1985) J. Immunol. 135,2149; J.L. Bidwell,E.A. Bidwell, D.A. Savage, D. Middleton, P.T. Klouda i B.A. Bradley (1988) Trasplantatton 45, 640).
    184 298
    Analiza RFLP umożliwia rozpoznanie tylko niektórych różnic alleli, które są niewykrywalne przy użyciu serologii, a technika ta wciąż posiada ograniczenia. W efekcie allel niosący inną sekwencję jest możliwy do zidentyfikowania tylko wtedy, gdy inny nukleotyd położonyjest w miej scu rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny, użyty w analizie i skutkiem tego wielka liczba alleli klasy II HLA nie zostanie rozpoznana drogątej analizy. Co więcej, analiza RFLP rzadko wykrywa modyfikacje w sekwencji kodującej i nie dostarcza informacji o dokładnym charakterze modyfikacji. Wreszcie, technika ta jest długotrwała i nużąca, jako że związana jest z użyciem odpowiednio wielkich ilości kwasu nukleinowego, które muszą być trawione kilkoma enzymami restrykcyjnymi, z seriami elektroforez i przenoszeniami na filtry.
    Aby zilustrować ograniczenia techniki RFLP, można wspomnieć, że podtypy specyficzności DR1, DR4, DRw8, DRwll czy DRwl3 są niewykrywalne drogąRLFP
    Zaproponowano nową technikę analizy genotypowej HLA klasy II, która jest sposobem określanym jako „typowanie z oligonukleotydami”. Dzięki znajomości sekwencji DNA genów HLA klasy II, a zwłaszcza genów DRp, które sąbez porównania najbardziej polimorficzne, używa się oligonukleotydów, które są specyficzne dla danego miejsca w sekwencji genu, jako wskaźnika w analizie polimorfizmu drogą hybrydyzacji. Oligonukleotydy te wybiera się tak, aby niosły jak najwięcej informacji i pozwalały na identyfikację różnych alleli na podstawie ich różnic w sekwencji. W praktyce, można wykryć każdą różnicę w sekwencji, a nawet pojedynczy nukleotyd.
    Technika typowania oligonukleotydami może być stosowana równie dobrze przy DNA, jak opisano w publikacji Angeliniego i in.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA tom 83, str. 4489-4493 (1986), jak i RNA (patrz C. Ucla, J.J. Van Rood, J. Górski i B. Mach (1987) J. Clin. Invest. 80,1155).
    To nowe podejście do zagadnienia oparte jest na zasadzie hybrydyzacji cząsteczkowej, wykorzystującej charakterystyczne właściwości kwasów nukleinowych i możliwości ich interakcji z komplementarną sekwencją poprzez wiązania wodorowe i przez to tworzenie stabilnej hybrydy, zgodnie ze znanymi prawidłami tworzenia się par, czyli A-T, G-C dla DNA i A-U, G-C dla RNA. Tak więc, syntetyczne oligonukleotydy, odpowiadające sekwencjom DNA i RNA znanych alleli, można stosować jako sondy do identyfikowania w próbce sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako docelowa, zawierającej sekwencję komplementarną do takiej sondy. Znakowanie hybrydy utworzonej między celem i sondąpozwala na wykrycie i kwantyfikację celu w próbce. Znakowanie to może być dokonane każdym znanym znacznikiem, takim jak znacznik enzymatyczny, chemiczny lub radioaktywny. W oparciu o te zasady, pierwsze zastosowanie typowania oligonukleotydem dla HLA klasy II przedstawili Angellini i in. w publikacji cytowanej powyżej, przy użyciu techniki nazywanej „SOUTHERN”, zgodnie z którą docelowy DNA umieszcza się na nylonowej membranie i przeprowadza wykrywanie z użyciem znakowanego nukleotydu jako sondy. Następnie stosowano technikę do wykrywania alleli HLA klasy II, niewykrywalnych drogąrutynowej serologii (patrz J.M. Tiercy, J. Górski, M. Jeannet i B. Mach (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,198; J.M. Tiercy, J. Górski, H. Betuel, A.C. Freidel, L. Gebahrer, M. Jeannet i B. Mach (1989) Human Immunol. 24,1). Inne bezpośrednie zastosowanie typowania HLA klasy II jest opisane w Zgłoszeniu Patentowym PCT WO 89/11547, wykorzystujące technikę nazywaną „Dot Biot”. Modyfikację tej techniki stanowi sposób nazywany „Odwrotna Dot Blot”, który polega na związaniu sondy nukleotydowej z membraną z papieru, nitrocelulozy lub ich mieszanin, i przeprowadzeniu wykrywania hybrydyzacji przy pomocy znakowanego celu. Technikę tę stosowano w typowaniu HLA-DQA i w wykrywaniu mutacji β-talasemii śródziemnomorskiej (R.K. Saiki i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA tom 86, str. 6230-6234 (1989)).
    Jako opisano powyżej i wytłumaczono w publikacjach i zgłoszeniu patentowym cytowanych powyżej, typowanie komórkowe wymaga wykrycia punktu mutacji w genomie i wiąże się z ulepszaniem sond, które są wystarczająco czułe, aby wykryć i zróżnicować sekwencje homologiczne z wyjątkiem sekwencji homologicznych pod względem pojedynczych nukleotydów, i stwierdzono konieczność użycia krótkich sond, generalnie krótszych niż 30 nukleotydów, co powoduje, że test jest ogromnie specyficzny, przy zachowaniu dobrej czułości. Użycie krótkich oligonukleotydów sprawia, że możliwe jest do uzyskania szerokie spektrum selektywności.
    184 298
    W wypadku, gdy stosuje się test obejmujący przyłączenie sondy do stałego nośnika, pozostaje problem związany z unieruchomieniem krótkiej sondy o mniej niż 30 nukleotydach, na takim stałym nośniku. R.K. Saiki i in., w publikacji cytowanej powyżej zaproponował sposób, który polega na połączeniu ogonka poli(dT), o 400 zasadach, z końcem 3' sondy, zawierającej od 15 do 20 zasad oraz unieruchomieniu sondy poprzez ten ogonek na filtrze nylonowym, drogą ekspozycji na promienie ultrafioletowe tak, żeby połączyć kowalencyjnie zasady tyminowe z pierwszorzędowymi aminami obecnymi na nylonie.
    Jednakże, sposób ten nie jest całkowicie satysfakcjonujący, jako że występujątu problemy specyficzności. W efekcie, zasady tymidynowe sondy mogąpod wpływem promieniowania UV, reagować także z nośnikiem, co wiąże się ze zmniejszeniem skuteczności hybrydyzacji.
    Ponadto, z powodów handlowych, pożądane jest ulepszenie sposobu typowania, który posiada wielką specyficzność i dobrą czułość, lecz który jest poza tym prosty do przeprowadzenia, szybki do zestawienia, niedrogi, możliwy do automatyzacji i możliwy do użycia w typowaniu indywidualnym.
    Obecnie znaleziono nowy sposób określania osobniczego genotypu HLA-DR, który przezwycięża wady opisane powyżej, podczas wykrywania i różnicowania sekwencji homologicznych, z wyjątkiem homologicznych pod względem pojedynczego nukleotydu.
    Sposób według wynalazku przeprowadza się, przy użyciu sond nukleotydowych wybranych tak, żeby pozwolić na typowanie z minimalną liczbą sond. Ten zbiór sond jest szczególnie korzystny, ponieważ umożliwia pracę w jednej temperaturze, zwłaszcza w temperaturze 37°C (chociaż możliwa jest praca w innej temperaturze, jak to będzie widoczne w części doświadczalnej poniżej).
    Zbiór sond według wynalazku, który zostanie określony poniżej, można stosować w postaci sond detekcyjnych (znakowanych standardowym środkiem wskaźnikowym) w technikach typu Southern lub, korzystnie, w postaci sond wychwytowych (technika sandwiczowa lub odwrotna dot biot) unieruchomionych na stałym nośniku, albo przez bierne wiązanie (adsorpcję) bezpośrednio, albo poprzez ligand, taki jak ligand hydrofobowy (patrz np. europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 405 913) albo przez stabilizację co najmniej jednego wiązania kowalencyjnego, które można wytworzyć, także tutaj, bezpośrednio lub poprzez ligand zdolny do wiązania kowalencyjnego z nośnikiem (patrz np. zgłoszenie patentowe PCT nr WO 88/01 302). Unieruchomienie sond można przeprowadzić albo przy użyciu znanych metod, albo innymi sposobami, które będą opisane poniżej.
    Sondy według wynalazku (sondy nukleotydowe) będą opisane głównie w postaci sekwencji nukleotydowych. Jest oczywiste dla fachowca, że nawet w przypadku sondy przeznaczonej do wykrywania punktu mutacji, w danej temperaturze, możliwe jest użycie sond o zmieniającej się do pewnego stopnia długości (liczba nukleotydów), w szczególności za pośrednictwem roztworów i buforów, które są mniej lub bardziej korzystne w stabilizowaniu kompleksów hybrydyzacyjnych. Skutkiem tego, sondy według wynalazku określa się sekwencją, którą generalnie można uważać za maksymalną (zwłaszcza jeśli jest przeznaczona do pracy w odpowiednio niskiej temperaturze, np. w temperaturze 37°C), ze wskazaniem, dodatkowo, minimalnej sekwencji, którąjeszcze można stosować w wymienionej temperaturze i która będzie wrażliwa nawet na punkt mutacji.
    Jest oczywiste dla eksperta, że każda poszczególna sonda nukleotydową posiada swoją odpowiednią sondę komplementarną, naturalnie zdolną do odgrywania tej samej roli co sonda wychwytowa lub detekcyjna. Wynalazek obejmuje więc również takie sondy, posiadające sekwencję komplementarną do tych, które będą opisane poniżej.
    Jest także oczywiste dla eksperta, że generalnie można zastąpić, w zbiorze sond, j edną sondę, która rozpoznaje pewną szczególną specyficzność X, układem dwóch sond, przy czym jedna z nich rozpoznaje specyficzności X i Y, a inna specyficzności X i Z, co w przypadku pozytywnych odpowiedzi obu sond, XY i XZ, umożliwia wnioskowanie obecności specyficzności X. Wynalazek obejmuje więc również układ sond, jaki określi się poniżej, w którym jedną lub wię8
    184 298 cej sond zastępuje się takim równoważnym układem dwóch lub kilku sond. Naturalnie, taki układ kombinacyjny można stosować przy liczbie specyficzności większej od 2.
    Wynalazek dotyczy sondy nukleotydowej wybranej spośród następujących sond:
    - TGGCAGCTTAAGTTT
    - CCTAAGAGGGAGTG
    -GCGAGTGTGGAACCT
    -AAGACAGGCGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
    Korzystnie sonda nukleotydową posiada sekwencję - TGGCAGCTTAAGTTT lub sekwencję komplementarną do niej.
    Również korzystnie sonda nukleotydową posiada sekwencję - CCTAAGAAGGGAGTG lub sekwencję komplementarną do niej.
    Również korzystnie sonda nukleotydową posiada sekwencję - GCGAGTGTGGAACCT lub sekwencję komplementarną do niej.
    Również korzystnie sonda nukleotydową posiada sekwencję -AAGACAGGCGGGC lub sekwencję komplementarną do niej.
    Sondy nukleotydowe, według wynalazku można stosować w technikach typowania oligonukleotydami w celu określenia typów HLA-DR.
    Wymienione powyżej cztery sekwencje sond określa się przez odnośne numery odpowiednio 101 102, 103 i 104.
    Sonda 101 pozwala na identyfikację typu DRB 1*01.
    Sonda 102 pozwala na identyfikację typu DRB 1*02.
    Sonda 103 pozwala na identyfikację typu DRB4*01 oraz sonda 104 jest użyteczna przy identyfikacji typu DRB 1 * 1305.
    Wynalazek dotyczy także zbioru sond oligonukleotydowych, pozwalających na wykonanie typowania HLA-DR, zawierający co najmniej jedną sondę wybraną spośród następujących sond:
    - TGGCAGCTTAAGTTT
    - CCTAAGAGGGAGTG
    -GCGAGTGTGGAACCT
    -AAGACAGGCGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
    Korzystnie zbiór sond oligonukleotydowych charakteryzuje się tym, że co najmniej jedna sonda posiada sekwencję - TGGCAGCTTAAGTTT.
    Również korzystnie zbiór sond oligonukleotydowych może zawierać co najmniej jedną sondę posiadającą sekwencję -CCTAAGAGGGAGTG.
    Również korzystnie zbiór sond oligonukleotydowych może zawierać co najmniej jedną sondę posiadającą sekwencję -GCGAGTGTGGAACCT.
    Również korzystnie zbiór sond oligonukleotydowych może zawierać co najmniej jedną sondę posiadającą sekwencję -AAGACAGGCGGGC.
    Bardziej korzystnie zbiór sond zawiera ponadto co najmniej jedną sondę, wybraną spośród:
    - GTGGACAACTACTG - GATACTTCTATCACCAA - GCCTGATGAGGAGTAC
    - TGGCAGGGTAAGTATAAG - GGGCCCTGGTGGACA- TGCGGTATCTGCACA
    - GGAGGAGGTTAAGTT - CTGGAAGACGAGCG - TGGAAGACAAGCGG
    - TGCGGAGCACTGGA - AACCAGGAGGAGAACGTG - ACTCTACGGGTGAGTG
    - GACACCTATTGCAGAC przy czym część podkreślona odpowiada sekwencji minimalnej lub ich sekwencjom komplementarnym.
    Trzynaście sekwencji właśnie wymienionych, określono przez odnośne numery odpowiednio 105 do 117.
    184 298
    Zgodnie z zalecaną postacią realizacji, sondy 111 używa się w postaci kompletnej, włączając dwa nie podkreślone T na końcu 3'. Jej specyficzność jest taka sama jak sondy 45.
    Sondy 115 korzystnie używa się w postaci sekwencji podkreślonej plus dwa nie podkreślone A końca 5'. Jej specyficzność jest taka sama jak sondy 28.
    Sondy 105 do 110,112 do 114,116 i 117 używa się korzystnie w postaci sond oznaczonych dalej w części doświadczalnej odnośnymi numerami 43, 9, 10, 14, 17, 44, 46, 48,47, 24 i 27.
    Także korzystnie zbiór sond może zawierać ponadto co najmniej jedną sondę, wybraną spośród:
    - TGGACAACTACT - GATACTTCTATCACC - CCTGATGAGGAGTA
    - GGCAGGGTAAGTATAAG - GGCCCTGGTGGA - GCGGTATCTGCACA
    - GGAGGAGGTTAAGTT - TGGAAGACGAGC - GGAAGACAAGCG
    - GCGGAGCACTGG - AACCAGGAGGAGAACGT - CTCTACGGGTGAGT
    - ACACCTATTGCAGA lub ich sekwencji komplementarnych.
    Bardziej korzystnie zbiór sond może zawierać ponadto co najmniej jedną sondę, wybraną spośród:
    - GAGGAGGACTTGCGCT - TAC GGGGCTGTGGAG - GGAGCTGCGTAAGT
    - TTCCTGGAGAGACAC - GGGAGAGATACTTCC lub ich sekwencji komplementarnych.
    Jeszcze bardziej korzystnie zbiór sond zawiera co najmniej jednąsondę, wybraną spośród:
    - AGGAGGACTTGCGC - ACGGGGCTGTGGA - GAGCTGCGTAAG
    - TTCCTGGAGAGACAC - GGAGAGATACTTC lub ich sekwencji komplementarnych.
    Pięć właśnie wymienionych sekwencji określa się odnośnymi numerami, odpowiednio, 118 do 122. Wymienione sekwencje stosuje się w szczególności w postaci sond posiadających odnośne numery 42, 42a, 52, 37 i 55.
    Specyficzne sondy wymienione powyżej można stosować szczególnie jako sondy wychwytowe lub detekcyjne. Korzystnie stosuje się je w postaci sond wychwytowych unieruchomionych lub możliwych do unieruchomienia na stałym nośniku.
    Zbiór sond, jeszcze bardziej korzystnie może zawierać ponadto co najmniej jedną sondę AACCAGIAGGAGAACGT lub jej sekwencje komplementarne.
    Zbiór sond jeszcze bardziej korzystnie może zawierać ponadto co najmniej jedną z następujących sond:
    -GCGGTGACGGAGCTGG
    -GAACAGCCAGAAGGAC
    -CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC lub ich sekwencji komplementarnych.
PL96318536A 1995-06-07 1996-06-03 Sonda nukleotydowa, zbiór sond nukleotydowych i sposób typowania osobniczego PL184298B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/485,133 US5976789A (en) 1991-07-17 1995-06-07 System of probes enabling HLA-DR typing to be performed, and typing method using said probes
PCT/FR1996/000836 WO1996040989A1 (fr) 1995-06-07 1996-06-03 Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL318536A1 PL318536A1 (en) 1997-06-23
PL184298B1 true PL184298B1 (pl) 2002-09-30

Family

ID=23927027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96318536A PL184298B1 (pl) 1995-06-07 1996-06-03 Sonda nukleotydowa, zbiór sond nukleotydowych i sposób typowania osobniczego

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5976789A (pl)
EP (1) EP0772694A1 (pl)
JP (1) JP3384806B2 (pl)
KR (1) KR970704891A (pl)
CN (1) CN1159211A (pl)
AU (1) AU717296B2 (pl)
CA (1) CA2196921A1 (pl)
IL (1) IL120158A (pl)
NO (1) NO970518L (pl)
NZ (1) NZ311058A (pl)
PL (1) PL184298B1 (pl)
WO (1) WO1996040989A1 (pl)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6147056A (en) * 1995-06-06 2000-11-14 Trustees Of Boston University Use of locally applied DNA fragments
US7094766B1 (en) 1995-06-06 2006-08-22 Trustees Of Boston University Use of locally applied DNA fragments
US20030032610A1 (en) 1996-06-03 2003-02-13 Gilchrest Barbara A. Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
US20020022261A1 (en) * 1995-06-29 2002-02-21 Anderson Rolfe C. Miniaturized genetic analysis systems and methods
EP0953650A1 (en) * 1998-04-20 1999-11-03 Innogenetics N.V. Method for typing of HLA alleles
US6322976B1 (en) * 1998-05-28 2001-11-27 Medical Research Council Compositions and methods of disease diagnosis and therapy
FR2793809B1 (fr) * 1999-05-20 2006-07-28 Biomerieux Sa Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie et amplification adaptee a un tel procede
US6258593B1 (en) * 1999-06-30 2001-07-10 Agilent Technologies Inc. Apparatus for conducting chemical or biochemical reactions on a solid surface within an enclosed chamber
AU2001251115A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Trustees Of Boston University Use of locally applied dna fragments
GB0016836D0 (en) * 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (1)
JP4416492B2 (ja) * 2003-12-25 2010-02-17 キヤノン株式会社 Ｈｌａ−ｄｒアレルを同定するためのプローブセット及び特定方法
EP1713911A4 (en) 2003-12-25 2008-02-20 Kenmoku Takashi PROBE ASSEMBLY AND METHOD FOR IDENTIFYING HLA ALLELE
CN113862342A (zh) * 2021-11-23 2021-12-31 厦门倍博特医学科技有限公司 用于hla-dr*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567809A (en) * 1986-03-13 1996-10-22 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for HLA DRbeta DNA typing
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US6194561B1 (en) * 1986-03-13 2001-02-27 Roche Molecular Systems, Inc. Characterization and detection of sequences associated with autoimmune diseases
US5310893A (en) * 1986-03-31 1994-05-10 Hoffmann-La Roche Inc. Method for HLA DP typing
US4965189A (en) * 1986-07-01 1990-10-23 University Of Massachusetts Medical School Probes for the determination of the proclivity for development of autoimmune diseases
DE3785658T2 (de) * 1986-08-11 1993-08-12 Siska Diagnostics Inc Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden.
EP0405913B1 (en) * 1989-06-30 1998-12-23 Chiron Corporation Hydrophobic nucleic acid probe
JPH03164180A (ja) * 1989-08-10 1991-07-16 Noboru Kashiwagi 新規なｄｎａ塩基配列およびその用途
GB9002625D0 (en) * 1990-02-06 1990-04-04 Univ Singapore Human leukocyte antigen typing
US5387505A (en) * 1990-05-04 1995-02-07 Eastman Kodak Company Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage
CA2049449C (en) * 1990-08-20 1999-08-10 Fumiya Obata Hla-dr antigen gene and its nucleotide sequence and its use
NL9002259A (nl) * 1990-10-17 1992-05-18 Eurodiagnostics B V Werkwijze voor het bepalen van een genotype door het vergelijken van de nucleotidensequentie van leden van een genfamilie, alsmede kit voor het opsporen van genetische variaties.
ATE164630T1 (de) * 1990-12-06 1998-04-15 Hoffmann La Roche Verfahren und reagenzien für die karakterisierung von hla-drbeta-dns
WO1992012996A2 (en) * 1991-01-22 1992-08-06 The Immune Response Corporation Vaccination and methods against diseases resulting from pathogenic responses by specific t cell populations
FR2679252B1 (fr) * 1991-07-17 1993-12-10 Bio Merieux Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes.
WO1993009245A1 (en) * 1991-10-31 1993-05-13 University Of Pittsburgh Reverse dot blot hybridization using tandem head-to-tail monomers containing probes synthesized by staggered complementary primers

Also Published As

Publication number Publication date
JP3384806B2 (ja) 2003-03-10
PL318536A1 (en) 1997-06-23
KR970704891A (ko) 1997-09-06
NZ311058A (en) 1998-12-23
EP0772694A1 (fr) 1997-05-14
IL120158A0 (en) 1997-06-10
CA2196921A1 (fr) 1996-12-19
CN1159211A (zh) 1997-09-10
AU6228996A (en) 1996-12-30
AU717296B2 (en) 2000-03-23
JPH10506541A (ja) 1998-06-30
IL120158A (en) 2000-06-29
NO970518L (no) 1997-04-07
US5976789A (en) 1999-11-02
WO1996040989A1 (fr) 1996-12-19
NO970518D0 (no) 1997-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4410268B2 (ja) メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｔｈｆｒ）の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット及び核酸プローブ
EP1291440A1 (en) Kit and method for determining hla type
PL184298B1 (pl) Sonda nukleotydowa, zbiór sond nukleotydowych i sposób typowania osobniczego
JP4410269B2 (ja) Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ｎａｔ２）の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法
US9637788B2 (en) Discrimination of blood type variants
WO2011030159A1 (en) Method using hla epitope determination
EP0549776B1 (fr) Systeme de sondes permettant d&#39;effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes
KR101206028B1 (ko) 유방암 특이적 다형성 서열을 이용한 유방암의 진단방법,유방암 특이적인 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 마이크로어레이
US20160060696A1 (en) Method for the identification by molecular techniques of genetic variants that encode no d antigen (d-) and altered c antigen (c+w)
JP2009100653A (ja) 一塩基多型（ｓｎｐ）を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドから成るイネ品種判別用ｓｎｐマーカー、及び、該ｓｎｐ分析によるイネの品種判別方法
JP2000511430A (ja) Ｈｌａ ｄｑｂ１タイピングを決定するためのヌクレオチドプローブおよび方法
KR101100437B1 (ko) 단일염기 다형을 포함하는 대장암과 관련된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 진단 키트 및 그를 이용한 대장암의 진단방법
KR102095017B1 (ko) Col6a6 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 조성물과 검출 방법
JP4889258B2 (ja) ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法
US11225684B2 (en) Method and device for SNP genotyping
JP2002101889A (ja) 新規遺伝子型判定方法
KR101150707B1 (ko) 다중유전자 증폭 기술을 이용한 자연살해세포수용체 유전형 동정 방법
WO2006054740A1 (ja) 核酸検出用核酸断片および核酸検出方法
US20090053716A1 (en) Method of detecting human cytochrome p450 (cyp) 2d6 gene mutation
WO1993005179A1 (en) A method for discriminating and identifying alleles in complex loci
JP4399025B1 (ja) Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ｎａｔ２）の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法
WO2006098401A1 (ja) 関節リウマチ罹患リスクの測定方法
JP2010162020A (ja) 新規ｈｌａ−ｄｒｂ１遺伝子およびその用途
JP4399024B1 (ja) Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ｎａｔ２）の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法
JP2006166911A (ja) 核酸検出用核酸断片および核酸検出方法