JPH10506541A

JPH10506541A - Ｈｌａ−ｄｒ型別判定の実施を可能するプローブ系および該プローブを用いる型別判定法

Info

Publication number: JPH10506541A
Application number: JP9500183A
Authority: JP
Inventors: アリバート，パトリス，アンドレ; クロス，フィリッペ; マッハ，ベルナルド，フランソワ; マンドランド，ベルナルド，ファビアン; ティエルシー，ジャン−マリエ
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1998-06-30
Anticipated expiration: 2016-06-03
Also published as: AU717296B2; CA2196921A1; NO970518D0; EP0772694A1; CN1159211A; PL184298B1; PL318536A1; IL120158A; NO970518L; JP3384806B2; NZ311058A; KR970704891A; AU6228996A; IL120158A0; WO1996040989A1; US5976789A

Abstract

(57)【要約】

Description

【発明の詳細な説明】ＨＬＡ‐ＤＲ型別判定の実施を可能にするプローブ系および該プローブを用いる型別判定法本発明は、個人のクラスIIＨＬＡ遺伝子型を決定するための方法に関し、特に多形性ＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子の検出に関係する。この方法は、特に、移植におけるＨＬＡ型別判定、医療診断、法医学などに適用できる。ＨＬＡ（ヒトリンパ細胞抗原）系は、ヒトにおいて主要組織適合複合体によりエンコードされる。それは、自己と非自己を区別することによって、個人間の器官移植の間の極めて本質的な制限をもたらす。更に、ＨＬＡ因子は、多数の病気に対する素因に関与する。ＨＬＡ系の抗原は従って、器官移植における提供者と被移植者の間の特性（Ｆ．Ｈ．バッハ及びＪ．Ｊ．ファンロート、Ｎ．Ｅngl. Ｊ．Ｍed．、295、806〜13頁、1976）ならびに或る病気に対する個人の素因を決定する型別判定法において用いられてきた。遺伝子的観点からＨＬＡ系は十分に特徴づけられ、そして第６染色体の短腕上の約２センチモーガン（ｃＭ）の間隔内にある多かれ少なかれ多形性の一組の座よりなる。この系中の三つの座（ＨＬＡ‐Ａ、‐Ｂ及び‐Ｃ）は、相互複性的に（codominantly）表現される同種抗原のクラス（クラスＩ）をコードする。事実いくつかの遺伝子を含む他の領域（ＨＬＡ‐Ｄ）は、かなりの程度の多形性を伴なって相互複性的に表現される同種抗原の第二のクラス（クラスII）をコードする。特に補体カスケードの成分Ｃ２、Ｃ４及び因子Ｂfを制御するいくつかの他の座はまた、ＨＬＡ系（クラスIII）に属する。器官移植の成功は、被移植者と提供者の間のＨＬＡ同一性（クラスＩ及びII）に大きく依存する。従って、ＨＬＡ型別判定は、出来るだけ正確でなければならない。この要求は主に、腎臓移植（Ｐ．Ｊ．モリス及びＡ．ティン（1982）Ｉmmunol．Ｒev66、103-Ｇ．オペルツ(1989) Ｔranspl Ｐro c.21、609-Ｅ．Ｌ．ラガーイ、Ｐ．Ｈ．ヘンネマン、Ｍ．ルイクロクら(1985)Ｎ ew Ｅngl．Ｊ．Ｍed.321,701）および骨髄移植（Ｐ．Ｇ．ビーティ、Ｒ．Ａ．クリフト、Ｅ．Ｍ．ミケルソンら(1985)Ｎcw Ｅngl.Ｊ．Ｍed.313,765-Ｊ．Ｍ．ホウ及びＢ．Ａ．ブラドリー(1990) Ｂritish Ｊ．Ｈematol.76、１）に関係する。骨髄移植においては、クラスIIＨＬＡ抗原に関する完全な同一性は、移植の成功、すなわち移植片の拒絶又は移植片対宿主の疾病の進展を妨げるための決定的因子を表わす（Ｐ．Ｇ．ビーティ、Ｊ．ハンセン、Ｇ．Ｍ．ロングトンら (1991)Ｔransplantation 51、443-Ｒ．Ｃ．アシュ、Ｊ．Ｔ．キャスパー、Ｃ．Ｒ．チタンバーら(1990)Ｎew Ｅngl.Ｊ．Ｍed.322、485-Ｃ．アナセッティ、Ｄ．アモス、Ｐ．Ｇ．ビーティら(1989)Ｎew Ｅngl.Ｊ，Ｍed.320,197）。ＨＬＡ‐Ｄ領域の遺伝子の表現産生物の多形性は、細胞の表面で表現されたＨＬＡ遺伝子産生物の同種抗血清での分析に基づく血清学的手法により通常決定される（Ｊ．Ｊ．ファンロード及びＡ．ファンリューウェン(1963)Ｊ．Ｃlin.Ｉnvest,42、1382-Ｊ．Ｊ．ファンロード、Ａ．ファンリューウェン、Ｊ．Ｊ．コニング、Ａ．Ｂ．ファンウドアブラス(1975)Ｔ issue Ａntigens ５、73）。正確性及び再現性は、利用できる血清のバッチに依存する。しかし、最良の条件下でさえ、極めて多数の存在する対立遺伝子がこれらの血清学的手法により検出不能である。血清学的分析の限界は主に、単一特異的な同種抗血清の不存在、極めて密接に関連する特異性たとえばＤＲ３とＤＲw1 3の間の交叉反応性の不完全な区別、あるいは細胞たとえば白血病細胞の表面におけるクラスIIＨＬＡ分子の変更された表現に起因する。分子生物学を用いて、従来予想されていたよりもはるかに多数のＨＬＡ遺伝子、特に多くのより異なる対立遺伝子が存在することが今は知られている。この多様性は今は、種々の遺伝子及び対立遺伝子のＤＮＡ配列によって特徴づけられる。ＨＬＡ命名委員会の最近のレポートによると（ＨＬＡ系の因子のためのＷＨＯ命名委員会(1990)Ｉmmunogenetics 31、131-及びＪ．Ｇ．ボドマー、Ｓ．Ｇ，Ｅ．マーシュー、Ｅ．Ｄ．アルバート、Ｗ．Ｆ．ボドマー、Ｂ．デュポン、Ｈ．Ａ．アーリッヒ、Ｂ．マッハ、Ｗ．Ｒ．メイア、Ｐ．パラム、Ｔ．ササズキ、Ｇ．Ｍ．Ｔ．シュロイダー、Ｊ．Ｌ．ストロミンガー、Ａ．スビガード及びＰ．Ｉ．テラサキ(1991)Ｔissue Ａntigens37、97参照）、クラスIIＨＬＡ多形性は、下記のように分布される。ＤＲＢ１座：47の対立遺伝子、ＤＲＢ３座：４の対立遺伝子、ＤＲＢ４座：１の対立遺伝子、ＤＲＢ５座：４の対立遺伝子、ＤＱＢ１座：17の対立遺伝子、ＤＱＡ１座：13の対立遺伝子、ＤＰＢ１座：21 の対立遺伝子、ＤＰＡ１座：４の対立遺伝子。これら対立遺伝子の多くは、血清学的分析を逃れ、ＤＮＡの点でのみ同定しうる。血清学的型別判定の限界は、ＤＲ４血清学的特異性により例示されうる。これは今は、ＤＮＡ配列の点でのみ同定できる11のサブタイプ（ＤＲＢ１*0401‐0 411）に細分される（Ｊ．Ｇ．ボドマー、Ｓ．Ｇ．Ｅ．マーシュー、Ｅ．Ｄ．アルバート、Ｗ．Ｆ．ボドマー、Ｂ．デュポン、Ｈ．Ａ．アーリッヒ、Ｂ．マッハ、Ｗ．Ｒ．メイア、Ｐ．パラム、Ｔ．ササズキ、Ｇ．Ｍ．Ｔ．シュロイダー、Ｊ．Ｌ．ストロミンガー、Ａ．スビガード及びＰ．Ｉ．テラサキ(1991)Ｔissue Ａ ntigens 37、97参照）同様にいくつかの同種抗血清によりＤＲw 13及びＤＲw 14に細分されうるＤＲ w ６特異性は10の対立遺伝子配列（ＤＲＢ１＊1301‐1305及びＤＲＢ１＊1401‐ 1405）を含み（上記のＪ．Ｇ．ボドマーの文献参照）、これはまたＤＮＡ配列の点での遺伝子型分析によってのみ区別されうる。遺伝子型分析は、クラスIIＨＬＡ系の多様性を遺伝子の点で直接に分析することを可能にする新しいアプローチである。遺伝子型分析は分子ハイブリッド化の原理に基づいており、提案された最初のアプローチは、いわゆる「ＲＦＬＰ」法であり、これは制限酵素を用いてＤＮＡを切断し、これら酵素により発生された特定のＤＮＡフラグメントのサイズを分析することにある（Ｃ．Ｔ．ウェイク、Ｅ．Ｏ．ロング及びＢ．マッハ(198 2)Ｎature300、372‐Ｊ．ビーメ、Ｍ．アンダーソン、Ｇ．アンダーソン、Ｅ．ミラー、Ｐ．Ａ．ペターソン及びＬ．ラスク(1985) Ｊ．Ｉmmunol．135、2149 ‐Ｊ．Ｌ．ビドウェル、Ｅ．Ａ．ビドウェル、Ｄ．Ａ．ザベージ、Ｄ．ミドルトン、Ｐ．Ｔ．クロウダ及びＢ．Ａ．ブラトレィ(1988)Ｔransplantation 45、640 参照）。ＲＦＬＰ分析は、血清学により検出できない対立遺伝子的差異のいくつかのみを認識することを可能にし、この方法はまだ制限がある。実際、異なる配列を持つ一つの対立遺伝子は、異なるヌクレオチドが分析に用いられた制限酵素の認識部位にある場合にのみ同定可能である。従って、多数のクラスIIＨＬＡ対立遺伝子がこの分析により認識されないであろう。また、ＲＦＬＰ分析は、コード配列における変更をまれにしか検出せず、変更の正確な性質について情報を与えない。最後に、この方法は、いくつかの制限酵素により消化されるべき比較的多量の核酸の使用、電気泳動及びフィルターへの移動を含むので、長たらしく、冗長である。ＲＦＬＰ法の限界を例示するために、ＤＲ１、ＤＲ４、ＤＲw ８、ＤＲw 11又はＤＲw 13特異性のサブタイプがＲＦＬＰにより検出できないことが述べられる。クラスIIＨＬＡの遺伝子型分析の新しい方法が提案され、これは、「オリゴヌクレオチドによる型別判定」と呼ばれる方法である。［クラスIIＨＬＡ遺伝子、及び特に、はるかに最も多形性であるＤＲβ遺伝子のＤＮＡ配列の知識の結果、遺伝子の配列中の所与の場所に特異的なオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド化による多形性の分析のためのトレーサーとして用いられうる。これらオリゴヌクレオチドは、出来るだけ最も情報を与えるよう、及び配列におけるそれらの差に基づいて異なる対立遺伝子の同定を可能にするように選ばれる。実際に、配列における何らかの差異、単一のヌクレオチドさえも検出されうる。オリゴヌクレオチドによる型別判定の該手法は、アンゲリニら、Ｐroc.Ｎatl Ａcad.Ｓci．ＵＳＡＶol．83、4489〜4493頁(1986)に記載されるようにＤＮＡに、及びＲＮＡに等しく適用されうる（Ｃ．ウクラ、Ｊ．Ｊ．ファンロード、Ｊ．ゴルスキ及びＢ．マッハ(1987)Ｊ．Ｃlin.Ｉnvest、80、1155参照）。この新しいアプローチは、水素結合を介して相補的配列と相互作用し、それによって公知の対合の法則すなわちＤＮＡにおけるＡ‐Ｔ、Ｇ‐ＣおよびＲＮＡにおけるＡ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃに従って安定なハイブリッドを形成する可能性がある核酸の特徴的性質を用いる分子ハイブリッド化の原理に基づく。すなわち、既知の対立遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に対応する合成オリゴヌクレオチドがプローブとして、試料中の該プローブの配列に相補的な配列を含む標的核酸配列を同定するために用いられうる。標的とプローブの間で形成されたハイブリッドのラベリングは、試料中の標的の検出及び定量化を可能にする。このラベリングは、任意の公知のラベルたとえば酵素的、化学的又は放射性ラベルにより行われる。これら原理に基づいて、クラスII ＨＬＡのためのオリゴヌクレオチドによる型別判定の最初の適用は、いわゆるサザーン法を用いてアンゲリニらにより上記の文献中に示され、それによると標的ＤＮＡがナイロン膜上に沈着され、検出はラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われる。該方法は次に、通常の血清学により同定できないクラス IIＨＬＡ対立遺伝子の検出に適用された（Ｊ．Ｍ．チェルシー、Ｊ．ゴルスキ、Ｍ．ジャネット及びＢ．マッハ(1988)Ｐroc．Ｎatl.Ａcad.Ｓci，ＵＳＡ85、198 ‐Ｊ．Ｍ．チェルシー、Ｊ．ゴルスキ、Ｈ．ベツェル、Ａ．Ｃ．フレイデル、Ｌ．ゲプアーラー、Ｍ．ジャネット及びＢ．マッハ(1989)Ｈuman Ｉmmunol.24、１参照）。クラスIIＨＬＡ型別判定への別の直接的適用は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ 89／11547号に記載されるものであり、いわゆるドットブロット法を用いる。これら手法の変更は、いわゆる逆ドットブロット法により示され、これはヌクレオチドプローブを紙、ニトロセルロース又は両者の混合の膜に結合し、ハイブリッド化の検出をラベルされた標的により行うことにある。この手法は、ＨＬＡ‐ＤＱＡ型別判定及び地中海β‐タラセミアの突然変異の検出に適用された（Ｒ．Ｋ．サイキら、Ｐroc.Ｎatl Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ、Ｖol.86、6230〜6234頁(1989)）。上述したように、及び上記刊行物ならびに特許明細書に説明されているように、細胞型別判定は、ゲノムにおける点突然変異の検出を必要とし、単一ヌクレオチドに関する以外相同な配列を検出し、区別するのに十分に敏感であるプローブの開発を含む。また、良好な感度を保持しながら大きな特異性をテストに与える短いプローブ、一般に30未満のヌクレオチドのプローブを用いることが必要であることが見い出された。短いオリゴヌクレオチドの使用は、広いスペクトルの選択性を利用可能にすることを可能とする。固体支持体へのプローブの結合を含むテストが用いられる場合、そのような固体支持体に30未満のヌクレオチドの短いプローブを固定化することに結びつく問題が残されている。Ｒ．Ｋ．サイキらは上記刊行物中で、15〜20の塩基より成るプローブの３′未満に400の塩基のポリ（ｄＴ）尾をカップリングし、そして紫外線光に曝露してナイロン中に存在する第一アミンにチミン塩基を共有結合的に結合することによってナイロンフィルターに上記尾を介してプローブを固定化することより成る方法を提案した。しかし、この方法は、完全に満足なものではない。なぜなら、それは特異性の問題を示すからである。事実、プローブのチミン塩基もまた、ＵＶ照射下で支持体と反応でき、それによりハイブリッド化の効率の減少をもたらす。また、産業化の理由から、大きな特異性及び良好な感度を有し、しかしまた実施が簡単であり、迅速に実行され、安価であり、自動化でき、かつ個人の型別判定のために用いうるところの型別判定法を開発することが望ましい。今、個人のＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子型を決定するための新規方法が見い出され、これは、単一ヌクレオチドに関する以外相同である配列を検出しかつ区別することを可能にしながら、上記欠点を克服する。本発明法は、最小数のプローブで型別判定を可能にするように選ばれた一組のヌクレオチドプローブを用いて行われる。このプローブの組は、特に、単一の温度、特に37℃で行うことを可能にする利点を持つ（但し、下記の実験の部から判るように他の温度で実施することも可能である）。そのような一組のプローブはまた、本発明の一部を成す。下記で定義される本発明のプローブの組は、サザーン形式の手法において（標準的トレーサー剤でラベルされた）検出プローブの形で、あるいは好ましくは固体支持体上に固定化された（サンドイッチ又は逆ドットブロット法）捕捉プローブの形で、直接にまたはリガンドを介して受身結合（吸着）によりたとえば疎水性リガンドにより（たとえばヨーロッパ特許出願第0,405,913号参照）、あるいは、ここでもまた直接に作られうるあるいは支持体に共有結合的に結合しうるリガンドを介して作られうる少くとも一つの共有結合の設立により（たとえばＰＣＴ特許出願ＷＯ88／01,302号参照）用いられうる。プローブの固定化は、公知法を用いて、又は後述の他の方法を用いて行われうる。本発明のプローブ（ヌクレオチドプローブ）は、主にヌクレオチド配列の形で記述されるであろう。所与の温度で点突然変異を検出することを意図されるプローブの場合においてさえ、ハイブリッド化複合体の安定性に多かれ少なかれ好都合な溶液、緩衝液の使用によって特に、種々の長さ（ヌクレオチドの数）のプローブの使用をもくろむことがある程度可能であることが、当業者には明らかである。従って、本発明のプローブは、最大であると一般に考えられる（特に、もし比較的低い温度たとえば37℃での実施が望まれるなら）配列により定義され、かつ更に、該温度でなお使用可能でありかつ点突然変異にさえ感受性であるであろう最小の配列の表示を伴なう。夫々の特定のヌクレオチドプローブが、その対応する相補性プローブを有し、それは当然、捕捉又は検出プローブとして同じ役割を演じうることが当業者には明らかである。従って、本発明は、後述されるであろう配列に相補性の配列を持つプローブを包含する。また、一組のプローブにおいて一般に、ある特定の特異性Ｘを認識する一つのプローブを、二つのプローブの系（その一つが特異性Ｘ及びＹを認識し、他方が特異性Ｘ及びＺを認識する）で置き代えうることが当業者には明らかである。この場合、ＸＹプローブ及びＸＺプローブの両者による陽の応答は、特異性Ｘの存在を推論するこをと可能にする。従って、本発明は、後述するように、一又は二以上のプローブが二つのプローブまたはいくつかのプローブの均等な系により置き代えられたプローブ系を包含する。当然に、そのような組合せ系は、２より多い多数の特異性に適用されうる。本発明は、ＨＬＡＤＲタイプを決定するためにオリゴヌクレオチドでの型別判定法において用いられうるヌクレオチドプローブに関し、該プローブは下記のものから選択される：直上の４つの配列は、夫々、引用番号１０１，１０２，１０３および１０４で呼ばれる。プローブ１０１は、ＤＲＢ１^*０１タイプを同定することを可能にする。プローブ１０２は、ＤＲＢ１^*０２タイプを同定することを可能にする。プローブ１０３は、ＤＲＢ４^*０１タイプを同定することを可能にし、プローブ１０４は、ＤＲＢ１^*１３０５タイプを同定するために有用である。本発明はまた、プローブ１０１〜１０４から選択された少なくとも１つのプローブを含む１セットのヌクレオチドプローブまたはＨＬＡタイプキットに関する。本発明はまた、下記より選択される少なくとも１つのプローブを更に含む、そのような１セットのヌクレオチドプローブに関する：下線部分は、最小配列に対応する。直上の１３の配列は、夫々、引用番号１０５〜１１７で呼ばれる。好ましい実施態様において、プローブ１１１は、３′末端の下線を付されていない２つのＴを含む完全な形で用いられる。その特異性は、プローブ４５のそれと同じである。プローブ１１５は好ましくは、下線を付された配列プラス５′末端の下線を付されていない２つのＡの形で用いられる。その特異性は、プローブ２８のそれと同じである。プローブ１０５〜１１０、１１２〜１１４、１１６および１１７は好ましくは、下記の実験の部において引用番号４３、９、１０、１４、１７、４４、４６、４８、４７、２４および２７を付されているそれらのプローブの形で用いられる。特に本発明は、上記で定義した１セットのプローブであって、それが更に下記のプローブ（下記部分は最適配列に対応する）の少なくとも１つを含む事実を特徴とする１セットのプローブに関する：直上の５つの配列は、夫々、引用番号１１８〜１２２で呼ばれる。これら配列は、特に、配列番号４２、４２ａ，５２，３７および５５を持つそれらプローブの形で用いられる。上記の特定のプローブは、特に、捕捉プローブまたは検出プローブとして用いられる。それらは好ましくは、固体支持体上に固定化されたまたは固定化されうる捕捉プローブの形で用いられる。本発明の主体はまた、オリゴヌクレオチドでの型別判定の標準的手法に従い個人のＨＬＡ‐ＤＲβ型別判定を行う方法において、上記のプローブの組のプローブの少なくとも一部が、遂次的に又は同時的に捕捉又は検出プローブとして用いられることを特徴とする方法である。自動化された方法において、該プローブの組が用いられるであろう。他の場合には、それらを次々と用い、集められた情報が型別判定のために十分である時に方法を止めることができることが明白である。従って、本発明の方法は、下記の工程を本質的に含む： −個人のＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子の多形性領域を含む標的核酸の試料を、上記定義したプローブの組の少なくとも一部と、選択された特定の手法に従い接触させる、 −標的が該プローブの配列と十分に相補性である配列を含む場合にのみ、各プローブとのハイブリッド化が起るように予め決めた条件下で公知法に従いインキュベートする、そして −用いられた各プローブとのハイブリッド化またはハイブリッド化の不存在を標準的検出手法に従い決定する。集められた情報は次に、用いられたプローブ及びリストされたＨＬＡ‐ＤＲタイプ及び／又は関連するザブタイプの知識を考慮に入れて、予め設定した型別判定計画に従い型別を決定するために用いられる。この仕事は、型別判定計画、すなわち、実際には観察された陽応答（ハイブリッド化）に従い直接にタイプ及び／又はサブタイプを与える表の使用により単純化される。本発明のプローブの組のために、そのような表は下記の実験の部で与えられる（表６を見よ）。本発明は特に、上記プローブが捕捉プローブとして用いられ、方法が下記の工程を含む事により区別されうるところの上記方法に関する： (a) 各捕捉プローブを固体支持体上に固定化する、 (b) 各固定化捕捉プローブを、少なくとも一つの標的核酸フラグメントを含む液体媒体と、プローブの配列と相補性の配列が標的中に存在するならばハイブリッド化を許す予め決めた条件下で接触させる、そして (c) 形成されるハイブリッドの存在を検出する。当然に、本発明のプローブは、ＲＮＡ標的フラグメント及びＤＮＡ標的フラグメントの両者を検出しうる。また、上記プローブとは別に、総ての適当なプローブ、特に実施例５で後述するプローブの一つを検出プローブとして用いることが明らかに可能である。捕捉プローブが非常に短い、すなわち20のヌクレオチドより小さい、特に17のヌクレオチドより小さい場合、固体支持体へのプローブの結合を改善できる手段を用いることが必要になる。ならば、支持体へのプローブの結合は、固体支持体への結合を容易にするリガンドとプローブの共有結合的カップリングから生じる誘導体の形で行われる。リガンド（これは疎水性部分を含みうる）は特に、少なくとも一つの極性官能基たとえばアミノ基を含むリガンドである。該官能基は、共有結合の設立により固体支持体にプローブを結合すべく働きうる。極性官能基が支持体と反応しない場合、それは、たとえ支持体が疎水性であるとしても、支持体への吸着により結合を改善する。リガンドはたとえば、夫々下記式Ｉ及びIIにより示される蛋白質及び化合物から選ばれる：ここでＺは、２〜12個の炭素原子を有し、非置換の又はヒドロキシル及び／又はアミノ基から選ばれた一以上の基により置換された、直鎖又は分枝したアルキルまたはアルケニル残基を示し、Ｍ⁺は特にアルカリ金属またはアンモニウムイオンを示す。このリガンドは好ましくは、捕捉プローブのヌクレオチド配列の５′末端に結合される。ここで、ｎは１〜４で変わりうる整数であり、好ましくはｎ＝１又は４である。このリガンドは好ましくは、捕捉プローブのヌクレオチド配列の３′末端に結合される。リガンドが蛋白質である場合、たとえばアルブミン、好ましくはウシ血清アルブミンが選ばれ、これは捕捉プローブのヌクレオチド配列の５′または３′末端に結合されうる。本発明の支持体は、受身吸着又は共有結合によって、本発明に従いヌクレオチド配列又は誘導体を固定化できる任意の支持であることができる。支持体は、通常用いられる任意の物質、たとえばニトロセルロース、ナイロン、紙又は好ましくは疎水性物質たとえばスチレンポリマーまたは少なくとも10重量％のスチレン単位を含む、スチレンに基づくコポリマーにより作られうる。本発明に従う固定支持体は、限定されないが、微小滴定プレート、シート、管、コーン、くぼみ等の形であることができる。本発明の方法に従い、核酸を含む試料は、そのＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子型が決定されるべき個人から得られる。本発明の文脈において、ＨＬＡ‐ＤＲ核酸を含む任意のタイプの組織を用いうる。すなわち、化学的、酵素的又は同様の手段による個人試料中に存在する核酸の開裂の後に得られる核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）フラブメントを用いることができる。しかし、標的ＤＮＡ又はＲＮＡの増幅の前工程を入れると、本発明のオリゴヌクレオチドでの型別判定のための方法を容易にできる。配列特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリッド化によるＨＬＡ多形性の分析の原理は同じままであるが、選択的増幅工程は標的の配列の富化を可能にし、それによって手法を単純化する（Ｒ．Ｋ．サイキ、Ｔ．Ｌ．ブガワン、Ｇ．Ｔ．ホーン、Ｋ．Ｂ．ムリス及びＨ．Ａ．アーリッヒ(1986)Ｎature 324、163-Ｊ．Ｍ．チェルシー、Ｍ．ジャネット及びＢ．マッハ(1990)Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．20,237）。増幅は、ＤＮＡまたはＲＮＡから得ることができる。試料中のＨＬＡ‐ＤＲ標的の配列の増幅が、プローブへの核酸のハイブリッド化により標的の配列を検出することを可能にすべく十分な増幅を達成できる任意の公知法により実施されうることは、当業者に明らかである。一般に、試料中の核酸はＤＮＡであり、特にゲノムＤＮＡであろう。しかし、本発明はまた他の核酸たとえばメッセンジャーＲＮＡ又はクローン化ＤＮＡを用いても実施でき、個人試料中の核酸は一重鎖又は二重鎖形であってもよい。もちろん、核酸が二重鎖形である場合、一重鎖核酸を得るために変性工程を行う必要がある。本発明で用いられるプローブは、適当な条件下でその相補性配列に特異的に結合しうる配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）である。もし特定のプローブが対立遺伝子を一義的に同定するために用いられうるなら、プローブはＡＳＯすなわち対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドと呼ばれる。単一のプローブが単独で、種々のＤＲβ対立遺伝子間の異なる性質の故にＤＲβ特異的対立遺伝子を同定できないことがありうる。本発明の方法に従い、対立遺伝子の同定は、一組のプローブの結合のモデルから演繹され、ここで一組のプローブの個々のプローブはＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子の異なる部分に特異的である。既知の対立遺伝子のＤＮＡ配列に対応する多数のプローブの選択の結果として、本発明のオリゴヌクレオチドによる型別判定法の特異性は、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３及びＤＲＢ５座の総ての対立遺伝子を同定することを可能にする。もちろん、本発明の方法は、曲の極端に多形性の座、たとえばＤＱＢ１及びＤＰＢ１の対立遺伝子を同定するために用いうる。対立遺伝子的差異は本質的に、ＨＬＡ分子の初めのドメインをコードするエキソン（aa５‐94）中に局在するので、プローブはこの領域中に局在する特定の配列に相補性であるように選択される。新しい対立遺伝子が発見されるかも知れない場合には、それはクラスIIＨＬＡ配列の登録に直ちにリストされ、これは、情報を与えるトレーサーのコレクションを更新し、従って方法論を何らかの新しい対立遺伝子の検出に適合させることを可能にする。完全なクラスIIＨＬＡ型別判定を合理化するために、初めに、主なＨＬＡ‐ＤＲ特異性すなわちＨＬＡ‐ＤＲ１‐ＤＲw 18を限られた数のプローブで認識しうる包括的なＤＲ型別判定の第一工程を導入することが提案されている。この工程は、多数の臨床適用のために十分である（Ｂ．マッハ及びＪ．Ｍ．チェルシー(1 991)Ｈuman Ｉmmunol．30、278参照）。この第一工程の結果に基づいて、ＤＱＢ１多形性を検出し、そしてもし必要ならＤＰＢ１対立遺伝子を特徴づけるために、第二段階でＤＲβミクロ多形性を作るのに必要な特異的なプローブを選択することができる。オリゴヌクレオチドによる型別判定の手法によるＨＬＡ ‐ＤＲ１‐ＤＲw 18の分析は、ＤＲ血清学に代って常用のＤＲ型別判定のための組織適合性テストにおいて、特に、腎臓移植の待機リストに乗っている患者のＤＲ型別判定、可能性ある腎臓提供者の型別判定、骨髄移植が意図される白血病患者ならびにその家族又は非血縁の可能性ある提供者のＤＲ型別判定、骨髄提供ボランディアの登録の編集のための大規模なＤＲ型別判定を行うために、たとえばインスリン依存性糖尿病の場合に疾病とＨＬＡ系の間の関係を調べるために、予防的医薬での利用のために、あるいは父親及び他の法医学的特定のためのテストのために用いることができる。本明細書で用いられる言葉のいくつかの定義を下記に示す。「遺伝子型」は、個人の遺伝子型の特徴のセット（組）を言い、遺伝子の表現産生物とくに蛋白質の分析から明らかになる個人の特徴である「表現型」の対語である。「対立遺伝子」は、核酸配列において相異を示す同じ遺伝子の異なる選択形である。これら相異は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白質に、おいて現われる。「多形性」は、同じ遺伝子に関し異なる対立遺伝子の存在により個体群中に導入される多様性を特徴づける。「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において、プライマー、プローブ及び検出されるべき核酸フラグメントなどを指す。オリゴヌクレオチドは、任意の公知の適当な方法で調製されうる。「ヌクレオチドプローブ」は、天然のＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントまたは天然あるいは合成のオリゴヌクレオチド、又は合成のＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを表わし、未修飾であるか、あるいは一以上の修飾塩基たとえばイノシン（文字Ｉで示される）、５‐メチルデオキシシチジン、５‐（ジメチルアミノ）‐デオキシウリジン、デオキシウリジン、２，６‐ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジンまたはハイブリッド化を許す任意の他の修飾塩基を含む。また、本明細書において捕捉プローブの配列がアンダーラインを付されている場合には、これは本発明に従う型別判定のための最適配列を表わす。当然に、これら最適配列は、少なくとも一つの塩基により３′及び／又は５′末端で延長されうる。この場合、任意的に追加されうるいくつかの塩基は、たとえば下記の文から判るように、カッコ内に示される。最後に、使用される配列の長さを、実施条件（たとえばハイブリッド化及び洗滌の温度、ハイブリッド化及び又は洗滌緩衝液の性質）及び型別判定計画に従って変更することは、当業者にとって可能である。本発明のより良い理解は、本発明の方法の好ましい実施態様を示す非限定的な実施例に言及して書かれた以下の詳細な説明を読むことによって得られるであろう。実施例１本発明で用いられ、ここで例として示されるリガンドは、下記の表１に示すように市販入手可能な化合物でありうる。オリゴヌクレオチドへのホスホルアミダイトリガンドのカップリングは、下記の一般的プロトコールに従って行われる。アプライドバイオシステムズ社の自動装置381Ａで、該製造者のプロトコールに従うホスホルアミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチドが合成される。0. 2Ｍの濃度で無水アセトニトリルに溶解されたホスホルアミダイトリガンドが合成装置の位置Ｘに置かれ、リガンドの付加は、オリゴヌクレオチドの合成が完了した時に自動合成の標準プロトコールに従いオリゴヌクレオチドの５′末端で起る。リガンドがジメトキシトリチル保護基を有する場合、たとえば化合物ｄの場合には、合成の最後にトリクロル酢酸でトリチル基を脱保護する追加的工程を行うことが必要である。 33％ＮＨ₄ＯＨ中で55℃での一夜の脱保護及び続く−20℃でエタノール中での析出の後に、オリゴヌクレオチドは真空乾燥され、１mlの水に溶解される。化合物ｂ及びｃの場合、モノメトキシトリチル基の開裂の追加的工程が、脱保護の後に製造者（夫々、クロンテク及びグレンリサーチ）のプロトコールに従って行われる。化合物ｅ及びｆの場合、自動合成は、標準プロトコールに従いリガンドをグラフトされたシリカから始まる。リガンドとオリゴヌクレオチドとのカップリングは、後者の３′末端を介して起る。総ての場合に、５′又は３′末端で修飾されたオリゴヌクレオチドが、ブラウンリーＲＰ18カラム（１０mm×25cm）上で逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により精製される。条件：流速、4.6ml／分勾配、30分間の経過中に緩衝液Ｂの10％〜35％。３分間の経過中に緩衝液ｂの35％〜100％。緩衝液Ａ及びＢの特徴は下記の通りである。緩衝液Ａ：0.1モル濃度トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）、pH7.00 緩衝液Ｂ：50％緩衝液Ａ＋50％ＣＨ₃ＣＮ。実施例２ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へのオリゴヌクレオチドのカップリング。アミノリンクの２アームを有し、表１で記号ａを付されたオリゴヌクレオチドが実施例１記載のように合成される：３×10^-8モルのオリゴヌクレオチドが真空乾燥され、0.1Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液pH9.3の25μlに溶解される。ＤＭＦ中に30mg／mlのＤＩＴＣ（１，４‐フェニレンジイソチオシアネート、Ｆluka7848 0）を含む溶液500μlを加える。水３mlを加える前に、この混合物を室温で1.5時間撹拌する。溶液をブタノール（３×３ml）で抽出後に、残った水性相（500μl ）を真空乾燥し、次にホウ酸塩緩衝液（0.1Ｍ、pH 9.3）400μl中のＢＳＡ（Ｐi evce 30444）の１×10^-7モル（6.6mg）で溶解する。室温で一夜撹拌後に、接合体をＮaＣl勾配（表１）を有するＡＸ300カラム（ＢＯＷＮＬＥＥ 4.6×100 mm）でＨＰＬＣを用いてイオン交換により精製する。接合体ピークは水（２×１リットル）に対して透析され、真空下で濃縮され、１mlの水で溶解され、−20℃で貯蔵される。クロマトグラフ条件：勾配：25分間の経過中に15％Ｂ′〜56％Ｂ′。２分間の経過中に56％Ｂ′〜100％Ｂ′。緩衝液Ａ′及びＢ′の特徴は下記の通りである。緩衝液Ａ′：20mMリン酸ナトリウム、pH7.00；20％ＣＨ₃ＣＮ。緩衝液Ｂ′：緩衝液Ａ′＋１ＭＮaＣl又は２ＭＮaＣl。実施例３表２は、選択された一致配列（ＤＲＣＯＮＳと呼ぶ）に相対的な突然変異されたアミノ酸の位置を定義する目的をもってＤＲβ遺伝子の種々の対立遺伝子についてのアミノ酸配置を示す。これら突然変異は、ＤＮＡにおける不顕ではない突然変異、すなわちアミノ酸における変化を起すであろう突然変異に対応する。実際に、アミノ酸は、塩基の三連符によりＤＮＡ中でエンコードされていると知られている。第三位置での突然変異は一般に、アミノ酸における変化をもたらないであろう。対照的に、第二塩基における変化は、極めてしばしばアミノ酸における変化を起す。最後に、第一塩基での突然変異は常に、アミノ酸の修飾をもたらすであろう。種々の対立遺伝子の型別判定の場合に、非不顕突然変異に対応するＤＮＡ上の突然変異が従って、最もしばしば用いられる。しかし、不顕イプの突然変異を、たとえば２つの極めて密接に関係する対立遺伝子を区別する目的で検出することが可能である。表３は、今日まで既知の及び刊行物に発表された総ての対立遺伝子に関しＤＲ β遺伝子のヌクレオチドの配置を、表２におけると同じ一致配列に相対的に示す。組織適合性についての第５回会議（オランダ、ライデン、1991）で提案された表記法が、種々の対立遺伝子を指名するために用いられる。表２中のカッコ内の指名は、従来の表記を示す。実施例４上記の二つのプロトコールを用いて、実施例１に記載されかつ表４にまとめて示したリガンドを有するか、又は実施例２に記載されかつ表５にまとめて示したＢＳＡにカップリングされたオリゴヌクレオチドが合成された。この実施例において、リガンドなしで、又はリガンドを用いて、あるいはたとえばＢＳＡへカップリングして合成されることができる捕捉オリゴヌクレオチドが定義された。合成されるオリゴヌクレオチトの配列の選択は、実施例３の表３に記載される種々の対立遺伝子のＤＮＡ配列の配置（アラインメント）を考慮する。選択され、たとえば捕捉プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは、表６に記載のように型別判定計画を立てることを可能にする。他の型別判定計画が別のオリゴヌクレオチドを用いて規定されうることが当業者には全く明らかである。表６において、カッコの間の指名は、ＤＲＢ５対立遺伝子のサブタイプのために、組織適合についての会議（1991）の以前に用いられた命名法を示す。記号＋は、表６中の問題の系統のサブタイプが対応する欄中のプローブとハイブリッド化を与えることを意味する。表６を用いて、種々のプローブで得られた結果（ハイブリッド化またはハイブリッド化の欠如）を簡便に解釈できる。たとえば、プローブ43、14、28及び37との陽の応答を与える標的は、タイプＤＲＢ１*0301／ＤＲＢ１*07に相当する。実施例５：検出プローブの調製実施例２に従い、活性化され真空乾燥されたオリゴヌクレオチドが、0.1Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液pH9.3の200μl中のホースラデッシュパーオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム 413470）の1.25×10^-7モル（５mg）に溶解される。精製プロトコールは同じである：接合体は、50ｍＭＴris‐ＨＣl緩衝液pH7. 0、40％グリセロール中で−20℃で貯蔵される。表７は、ＨＬＡ‐ＤＲ検出のために用いられた種々の接合体をまとめて示す。実施例６：遺伝子物質の調製全血からの核酸の抽出は、下記のプロトコールに従いアプライドバイオシステムズの装置で行われる：２〜６mlの全血をＴＥ緩衝液（10ｍＭＴris‐ＨＣｌ、pH8.00、１ｍＭＥＤＴＡ）（６mlのために十分な量の）中に溶解し、30ml 抽出ロートに入れる。蛋白質分解酵素Ｋの溶液（20ｍＭＴris‐ＨＣｌ、pH8.5 中の840単位）を加える。全体を撹拌下に55℃で１時間インキュベートする。存在する過剰の蛋白質を、フェノール／クロロホルム混合物での２回の同時的抽出（8.5ml）により除去する。全体を60℃で20分間撹拌する。有機相の除去後に、更にフェノール抽出を行う。過剰のフェノールを、クロロホルム（9.5ml）による37℃で10分間の抽出により除去する。水性相中のＤＮＡ含量は、３Ｍ酢酸ナトリウムpH5.5の0.5ml及びイソプロパノール13.5mlを加えることにより析出され、次にフィルター上で回収される。次にＤＮＡは、１mlの蒸留水中に取り上げられ、その後、260nmで分光光学によりアッセイされる。実施例７：ＤＮＡの増幅酵素的増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法（ムリスとファローナ、Ｍeth，in Ｅnzymol．vol．155、335〜350頁）により下記のプロトコールに従って行われる：下記の緩衝液の合計100μl中の精製された又はされないＤＮＡの0.1〜２μgを、エッペンドルフ型管に入れる： − 10倍濃度のＰＣＲ緩衝液（500mＭＫＣl、100mＭＴris‐ＨＣl、pH8.3 （20℃）、15mＭＭgＣl₂、0.1％ゼラチン）の10μl、 − 0.5μM ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＤ，ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）の２μl、 − 25ピコモルに対応する各プライマーの２μl、 − Ｔaq ポリメラーゼ（パーキンエルマーセタス）の1.5単位、 − 蒸留水（100μlとするのに十分な量）、 − パラフィン油の50μl。該管をサーモサイクラー（パーキンエルマーセタス）中に置き、その中で下記の35回の温度サイクルが行われる。 − 95℃での変性の0.5分間、 − 55℃でのハイブリッド化の0.5分間、 − 72℃での延長化の0.5分間。用いたプライマーは、下記の配列を持つ。プライマー１＝５′‐ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ‐３′ プライマー２＝５′‐ＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧ−３′ 実施例８３×ＰＢＳ（0.45ＭＮaＣl、0.15Ｍリン酸ナトリウム、pH7.0）中の0.15 μMの濃度の所与のＤＲ特異性の捕捉オリゴヌクレオチドの溶液100μlを、ポリスチレン微小滴定プレート（Ｎunc 439454）のくぼみ中に置く。充填されたくぼみの数は、型別判定のために必要な数に等しい。総ての場合に、増幅工程及び検出工程の有効性をチェックするために、正の対照が加えられなければならない。正の対照として用いられる捕捉プローブは、今日知られる総ての対立遺伝子上に存在し、下記の配列を持つ。５′‐ＧＧＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴ−３′ プレートは、ＰＢＳ／Ｔween（0.15ＭＮaＣl、0.05Ｍリン酸ナトリウム、 pH7.0；0.5％ Tween20(Ｍerck 822184)）の300μlで３回洗われる。実施例７で記載されるような増幅生成物（１00μl）が、２ＮＮaＯＨの２μlにより室温で撹拌下で５分間変性される。10μlの２Ｎ酢酸、そして次にn×50μl（ｎは型別判定のために必要な捕捉プローブの数である）に等しい体積のＰＥＧ緩街液（ 0.1Ｍリン酸ナトリウム、pH7.0、0.5ＭＮaＣl、0.65％Ｔween 20、0.14mg ／ml サケ精子ＤＮＡ（Ｓigma Ｄ 9156）、２％ＰＥＧ 4000(Ｍerck 8074 90)）が順次、上記溶液に加えられる。この溶液50μlを各くぼみに配り、次にＰＥＧ緩街液中の15nＭの濃度の検出プローブ（オリゴヌクレオチド‐パーオキシダーゼ接合体）の50μlを配る。プレートを37℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔweenの３×300μlで洗う。濃度４mg／mlでＯＰＤ緩衝液（0.05Ｍクエン酸、0.1ＭＮa₂ＨＰＯ₄、pH4.93）中のＯＰＤ培質（オルトフェニレンジアミン、ケンブリッジメディカルバイオテクノロジー参照456）の100μlに、使用直前に１／1000希釈の30体積のＨ₂Ｏ₂を加えたものを、くぼみごとに加える。20 分間の反応後に、酵素活性を１ＮＨ₂ＳＯ₄の100μlでブロックし、そして492n mでＡxia マイクロリーダー（ビオメリウ）を用いて読みを行う。実施例９実施例６に記載された方法に従って作られた６つのＤＮＡが、実施例７記載の方法に従って増幅される。型別判定プロトコールは、下記の捕捉プローブを含む：５′ａ‐ＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＣ３′＝５′末端にリガンドを有する特異性ＤＲ３のオリゴヌクレオチド（参照番号 545）５′ＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＣ３′＝同じ配列であるが、リガンドを有さないオリゴヌクレオチド（参照番号545 nu）５′ａ‐ＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧ３′＝５′末端にリガンドを有する特異性ＤＲ４のオリゴヌクレオチド（参照番号 546）５′ＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧ３′＝同じ配列であるが、リガンドを有さないオリゴヌクレオチド（参照番号546 nu）型別判定プロトコールは、実施例８記載の一般的プロトコールに従う。プローブＤ１及びＤ２（表７）が、50％／50％混合物で検出プローブとして用いられる。結果を下記の表８に示す。リガンドのない２つの捕捉プローブは、ＤＮＡの特異性を区別せず、一方、リカンドａを有する同じ配列はＤＮＡのＤＲ２及びＤＲ４特異性を同定できる。実施例１０実施例６記載の方法に従って作られた24のＤＮＡが、実施例７記載の方法に従って増幅される。型別判定プロトコールは、実施例８記載の一般的プロトコールに従う。プローブＤ１及びＤ２（表７）が50％／50％混合物で検出プローブとして用いられる。型別判定プロトコールは、下記の表９にまとめた捕捉プローブを含む。型別判定の結果を表10に示す。記述した方法は、テストされた24のＤＮＡを曖昧でなく型別判定することを可能にする。実施例１１本発明で記述されるＨＬＡ‐ＤＲ型別判定のための好ましいハイブリッド化温度は、37℃である。しかし、このハイブリッド化温度を変えることができる。下記の実施例は、ハイブリッド化温度が37℃から45℃に変えられた他は、実施例１０と同じである。型別判定は、11のＤＮＡについて行われる。用いられた捕捉プローブを、下記の表11に示す。型別判定の結果を下記の表１２に示す。実施例１２実施例８で記載したようにＨＬＡ‐ＤＲ型別判定のために用いられた好ましいハイブリッド化緩衝液（ＰＥＧ緩衝液と呼ばれる）は、下記の組成を持つ：0.1 Ｍリン酸ナトリウム、pH7.0、0.5ＭＮaＣl、0.65％ Tween 20、0.14mg／m lサケ精子ＤＮＡ（Ｓigma Ｄ 9156）、２％ＰＥＧ 4000（Merck 807490）。ホルムアミドを含む（最終10％）同じ緩衝液が用いられた。ホルムアミドは、ハイブリッド化温度を下げることができると知られている。もしハイブリッド化がホルムアミドの存在下でなお37℃で行われるなら、従って検出の特異性は増大されるはずである。型別判定は、実施例１０で用いられた24のＤＮＡについて行われる。用いられた捕捉プローブ及び得られた値を下記の表13に示す。好ましいハイブリッド化温度は37℃であり、好ましいハイブリッド化緩衝液はＰＥＧ緩衝液である。しかし、実施例１１と１２の結果が示すように、ハイブリッド化温度とハイブリッド化緩衝液の両者を変えることをが可能であることが判る。上述の記載から明らかなように、本発明の方法は、下記の実際的利点を結合する。総ての対立遺伝子の区別の可能性を伴なう最適な特異性、血清学的分析に比べて実施の単純さと低減されたコスト、増幅後約90分間で結果が得られる迅速な実施、12時間未満の合計期間に等しい（これは腎臓提供者にとって重要である）、個人の型別判定との両立性（これは緊急の型別判定及び小さな実験室での使用にとって重要である）、光学密度の測定及び適当な場合には単純なコンピュータ化システムを用いる結果の処理により定量化できる信号、及び自動化システムへの適合性。実施例１３上記と同様の方法で、引用番号１０１、１０２、１０３、１０４、１１５および１１１を付されたそれらオリゴヌクレオチドに対応する捕捉プローブが調製された。これらプローブは、捕捉プローブとして用いられるとき、本明細書で示したようにそれらの特異性を同定する。また、下記の検出プローブと共に本発明の捕捉プローブを用いることができる：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マンドランド，ベルナルド，ファビアンフランス国 69100，ビリュルバン，リュデラドウア 21 (72)発明者ティエルシー，ジャン−マリエスイス国 1224，シェン−ブジェリス，アブニュガスパリン６

Claims

【特許請求の範囲】１．下記またはその相補的配列から選ばれるヌクレオチドプローブ。２．下記またはその相補的配列から選ばれた少なくとも１つのプローブを含む、ＨＬＡＤＲ型別判定を行うことを可能にするオリゴヌクレオチドプローブのセット。３．下記（下線部は最小配列に対応する）またはその相補的配列から選ばれた少なくとも１つのプローブを更に含む、請求項２のプローブのセット。４．下記またはその相補的配列から選ばれた少なくとも１つのプローブを含む、請求項３のプローブのセット。５．下記またその相補的配列から選ばれた少なくとも１つのプローブを更に含む、請求項２または３のプローブのセット。６．下記またはその相補的配列から選ばれた少なくとも１つのプローブを含む、請求項５のプローブのセット。７．下記のプローブまたはその相補的配列を含む、請求項２〜６のいずれか１つに記載のプローブのセット。８．下記プローブまたはその相補的配列を含む、請求項２〜７のいずれか１つに記載のプローブのセット。９．オリゴヌクレオチドでの型別判定の標準的手法に従って、個人からの試料から出発して個人のＨＬＡ‐ＤＲ型別を判定する方法において、請求項２〜８のいずれか１つに記載されるプローブのセットの少なくとも１つのサブセットを、捕捉プローブまたは検出プローブとして用いることを特徴とする方法。 10．プローブが請求項２〜７のいずれか１つに記載のものから選ばれる、請求項９の方法。 11．プローブが捕捉プローブとして用いられる請求項10の方法。 12．方法が、 −各捕捉プローブを固体支持体上に固定化する、 −各固定化捕捉プローブを、少なくとも一つの核酸フラグメント標的を含む液体媒体と、プローブの配列と相補性の配列が標的中に存在するならばハイブリッド化を許す予め決めた条件下で接触させる、そして −形成されるハイブリッドの存在を検出するより成る工程を含む請求項11の方法。 13．各固定化捕捉プローブを、核酸標的の少なくとも１つのフラグメントを含む液体媒体と接触させる工程が、３７℃で行われる請求項12の方法。