CN112175898A - 一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，利用温敏凝胶培养，在不标记小鼠输卵管内膜干细胞的膜蛋白的情况下分离小鼠输卵管内膜干细胞，具体步骤如下：1)输卵管全细胞准备；2)将步骤1)中的全细胞进行原代培养；3)将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收；4)采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞，本发明摒弃抗体标记等化学物质的处理，直接将全细胞播种于温敏凝胶中使输卵管内膜干细胞在凝胶中增殖并形成细胞团，直接回收细胞团便达到一次性分离和增殖输卵管内膜干细胞的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法。
背景技术
输卵管是精卵授精的地方，其内膜随着发情周期的变化而被破坏、重建。输卵管内膜干细胞在这破坏重建的过程中起到了非常重要的作用。最近发现，某些高危卵巢癌的病因是起源于输卵管的分泌细胞系，因此研究输卵管内膜干细胞对此类疾病的解析非常关键。对输卵管内膜干细胞的分离一直是困扰人们的课题，直到2012年Daniel Paik利用流式分选法在人的输卵管分离出人输卵管内膜干细胞。但这分离方法也是分离干细胞的一个障碍，不仅要用到价格高昂的流式细胞仪，还要对细胞进行物理和化学的处理，从而破坏分离细胞的原始性，影响后续的培养实验。
凝胶培养细胞可以阻碍细胞的流动，使细胞在固定的位置生长。温敏凝胶是人工合成的具有生物相容性的聚合物，其在小于20℃时是液态，高于20℃时转变为固态。本研究利用温敏凝胶来无标记分离小鼠输卵管内膜干细胞。
采用传统分离小鼠输卵管内膜干细胞，标记后FACS分选方法分离小鼠输卵管内膜干细胞时，用多种抗体及化学物质标记细胞，然后用流式细胞仪分选并收集所标记的细胞，存在生产成本高，操作复杂，细胞污染率高，对样本数量的依赖性高等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，利用温敏凝胶培养，在不标记小鼠输卵管内膜干细胞的膜蛋白的情况下分离小鼠输卵管内膜干细胞，具体步骤如下：
1)输卵管全细胞准备；
2)将步骤1)中的全细胞进行原代培养；
3)将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收；
4)采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞。
进一步，步骤1)中所述输卵管全细胞准备的具体步骤为：6-8周龄ICR雌鼠断颈处死取输卵管，在含有2ml DPBS溶液35mm培养皿中将小鼠输卵管组织撕碎，离心收集碎片，在37℃环境中用0.25mg/ml的胶原酶的1ml PBS消化分散细胞。消化25分钟后，加入4ml含10％FBS的PrEGM培养基，吹打并混匀细胞，然后通过40μm网经的细胞滤器。将通过滤器的单细胞溶液300g离心5分钟，弃上清后用PrEGM培养基培养液将输卵管全细胞稀释至浓度为1×107/ml。
进一步，步骤2)中所述将步骤1)中的全细胞进行原代培养的具体步骤为：将0.1ml输卵管全细胞混合液与0.9ml温敏凝胶混合，使细胞的最终浓度为1×106/ml，取0.2～0.25ml于12孔培养板中并置于37℃培养箱中使凝胶凝固，每孔加入1ml的PrEGM或DMEM/F12全培养基，在5％CO2、37℃环境中培养6～12天，凝胶中可见许多细胞聚集而成的细胞团Ⅰ。
进一步，步骤3)中所述将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收的具体步骤为：将培养6-12天后的细胞团Ⅰ的12孔培养板放入冰上5分钟，溶解温敏凝胶并回收，加入冰PBS至10ml，300g离心5分钟，弃上清，用10ml冰PBS重新悬浮细胞团并离心，得到细胞团Ⅱ。
进一步，步骤3)中所述采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞的具体步骤为：
取细胞团Ⅱ加入含10％FBS，50μM EdU的PrEGM BulletKit 1ml，继续培养6小时，使EdU插入到合成的DNA中，然后回收细胞团Ⅱ，EdU插入培养的细胞团Ⅱ用-20℃甲醇固定，室温环境中加入Apollo反应液并轻轻摇晃6小时使其与插入的EdU反应均匀，然后用Hoechst33342染细胞核，得到待观察物Ⅰ，避光保存备用；
取细胞团Ⅱ用-20℃的甲醇固定5小时，然后用含有0.2％Triton-100的冷PBS(PBST)洗2次，将细胞团Ⅱ放入含10％山羊血清的PBST中封闭孵育3小时，加入含1：200anti-EpCAM的PBST溶液，4℃冰箱内过夜孵育。用含1％山羊血清的PBST清洗2次，每次5分钟，300g离心5分钟。细胞团沉淀用含1：400山羊抗小鼠IgG二抗的PBST室温培养2小时，PI复染细胞核，得到待观察物Ⅱ，避光保存备用；
分别取50μl的待观察物Ⅰ和待观察物Ⅱ放入玻璃底培养皿中，置于共聚焦载物台上静止1-2分钟，观察并拍照。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
本发明摒弃抗体标记等化学物质的处理，直接将全细胞播种于温敏凝胶中使输卵管内膜干细胞在凝胶中增殖并形成细胞团，直接回收细胞团便达到分离输卵管内膜干细胞的目的，其优点在于：
1、大大节约了成本。传统标记后FACS分选方法所使用的多种抗体的价格比较昂贵，所使用的分选仪器FACS也比较贵重。本研究省略了抗体的标记以及贵重仪器的使用，为输卵管内膜干细胞的分离节约了大量的成本。
2、操作更加简便。传统标记后FACS分选方法所使用的仪器操作复杂，需要专门的人员进行操作，仪器维护也需要花费时间和精力。本发明非标记分离输卵管内膜干细胞的方法则没有此烦恼，大大简化的分离方法。
3、分离后的输卵管内膜干细胞更加安全。传统标记后FACS分选方法使用多种抗体及化学物质处理细胞，这对细胞有一定的毒性，影响细胞的活力并且影响后续的研究。而本发明所使用的方法不经过任何化学物质处理细胞，使细胞保持原来的活力，不影响后续的研究。
4、减少了细胞污染的几率。传统标记后FACS分选方法由于要经过仪器的分选，增加了污染的几率，而本发明方法不经过仪器分选，减少了因仪器操作而导致的污染机会。
5、减少了对样本数量的依赖。由于输卵管内膜干细胞的数量在输卵管全细胞中所占的比例比较小，传统标记后FACS分选方法需要大量的细胞才能分选出一定数量的输卵管内膜干细胞。而本发明所使用的非标记法，将分选和扩增结合，使用少量的样本经培养一步达到扩增和分离输卵管内膜干细胞的目的。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为输卵管内膜干细胞的标记物在输卵管的内膜层分布结果图；
图3为输卵管全细胞在温敏凝胶中经过6天的培养结果图；
图4为细胞团的细胞经EdU染色结果图；
图5为细胞团的细胞鉴定为输卵管内膜干细胞的结果图；
图6为传统标记FACS分离法结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，如图1所示
1、实验动物
选用清洁级健康6-8周龄ICR雌性小鼠30只，由福建医科大学实验动物中心提供。
2、实验试剂
EdU试剂盒、小鼠anti-EpCAM、山羊抗小鼠IgG、Mebiol Gel温敏凝胶、PrEGMBulletKit。
3、实验方法
3.1输卵管全细胞准备
6-8周龄ICR雌鼠断颈处死取输卵管，在含有2ml DPBS溶液35mm培养皿中将小鼠输卵管组织撕碎，离心收集碎片，在37℃环境中用0.25mg/ml的胶原酶的1ml PBS消化分散细胞。消化25分钟后，加入4ml含10％FBS的PrEGM培养基，吹打并混匀细胞，然后通过40μm网经的细胞滤器。将通过滤器的单细胞溶液300g离心5分钟，弃上清后用PrEGM培养基培养液将输卵管全细胞稀释至浓度为1×107/ml。
3.2全细胞进行原代培养
将0.1ml输卵管全细胞混合液与0.9ml温敏凝胶混合，使细胞的最终浓度为1×106/ml，取0.2～0.25ml于12孔培养板中并置于37℃培养箱中使凝胶凝固，每孔加入1ml的PrEGM或DMEM/F12全培养基，在5％CO2、37℃环境中培养6～12天，凝胶中可见许多细胞聚集而成的细胞团Ⅰ。
3.3回收分离得到的细胞团
将培养6-12天后的细胞团Ⅰ的12孔培养板放入冰上5分钟，溶解温敏凝胶并回收，加入冰PBS至10ml，300g离心5分钟，弃上清，用10ml冰PBS重新悬浮细胞团并离心，得到细胞团Ⅱ。
3.4采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞
取细胞团Ⅱ加入含10％FBS，50μM EdU的PrEGM BulletKit 1ml，继续培养6小时，使EdU插入到合成的DNA中，然后回收细胞团Ⅱ，EdU插入培养的细胞团Ⅱ用-20℃甲醇固定，室温环境中加入Apollo反应液并轻轻摇晃6小时使其与插入的EdU反应均匀，然后用Hoechst33342染细胞核，得到待观察物Ⅰ，避光保存备用；
取细胞团Ⅱ用-20℃的甲醇固定5小时，然后用含有0.2％Triton-100的冷PBS(PBST)洗2次，将细胞团Ⅱ放入含10％山羊血清的PBST中封闭孵育3小时，加入含1：200anti-EpCAM的PBST溶液，4℃冰箱内过夜孵育。用含1％山羊血清的PBST清洗2次，每次5分钟，300g离心5分钟。细胞团沉淀用含1：400山羊抗小鼠IgG二抗的PBST室温培养2小时，PI复染细胞核，得到待观察物Ⅱ，避光保存备用；
分别取50μl的待观察物Ⅰ和待观察物Ⅱ放入玻璃底培养皿中，置于共聚焦载物台上静止1-2分钟，观察并拍照。
5、结果
1、输卵管内膜干细胞标记物在输卵管组织中的位置
由图2可知，EpCAM阳性细胞位于小鼠输卵管组织内膜层。
2、小鼠输卵管全细胞培养结果
有图3可知，小鼠输卵管全细胞经温敏凝胶培养6天后，可以形成许多细胞团块。
3、EdU标记增殖细胞的细胞核结果
由图4可知，EdU的标记结果显示了细胞团中的很多细胞被标记成阳性，这种荧光分布在细胞核中，说明细胞团中的细胞有着明显的分裂增殖活动，证明细胞团内的细胞具有自我更新的能力。
4、EpCAM免疫荧光染色
由图5可知，抗EpCAM标记了小鼠输卵管内膜干细胞的标记物-膜蛋白EpCAM。结果显示，细胞膜被标记上了EpCAM抗体，并且发出了均匀强烈的荧光，因此说明我们分离的细胞具有输卵管内膜干细胞的特征。
综上所示，我们用温敏凝胶分离的细胞团细胞，既具有自我更新的能力，也具有输卵管内膜干细胞的特征性膜蛋白-EpCAM。由此判断在温敏凝胶中形成的细胞团是输卵管内膜干细胞增殖聚集而成。通过此法，可以分离出输卵管内膜干细胞。用此方法，我们不需要事先对靶细胞进行标记并用流式细胞仪进行分离，避免了损伤靶细胞，更加有利于对输卵管内膜干细胞的研究。另外，此方法简单有效，经济省时。
实施例2：
传统的标记FACS分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法
1、实验动物
选用清洁级健康6-8周龄ICR雌性小鼠30只，由福建医科大学实验动物中心提供。
2、实验试剂
PE-偶联抗小鼠EpCAM抗体、DAPI、抗CD31、抗CD45、抗TER119抗体。
3、实验方法
将小鼠输卵管组织撕碎、酶消化使小鼠输卵管组织细胞分散；
离心收集输卵管全细胞，并用DPBS清洗两次；
用PE-偶联抗小鼠EpCAM抗体、DAPI、抗CD31、抗CD45及抗TER119抗体在冰上标记全细胞10-15分钟；
用流式细胞仪分选出各种抗体为阳性的细胞；
分选出的细胞为输卵管内膜干细胞。
4.结果
有图6可知，采用传统的标记FACS法对小鼠输卵管全细胞进行抗体标记，然后通过流式细胞仪分选出EpCAM阳性细胞，分选出的细胞经培养16天后形成的细胞团，得到输卵管内膜干细胞。
实施例3：
将实施例1中的非标记法与实施例2中的传统的标记FACS法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法相比较，有表1可知，由于输卵管内膜干细胞的数量在输卵管全细胞中所占的比例比较小，传统标记后FACS分选方法需要大量的细胞才能分选出一定数量的输卵管内膜干细胞。而本发明所使用的非标记法，将分选和扩增结合，使用少量的样本经培养一步达到扩增和分离输卵管内膜干细胞的目的，非标记法与传统的标记FACS法相比，减少了细胞污染的几率、操作更加简便、节约了成本、分离后的输卵管内膜干细胞更加安全。
表1非标记法与传统的标记FACS法对分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法相比较
最后应当说明：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (5)
1.一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，利用温敏凝胶培养，在不标记小鼠输卵管内膜干细胞的膜蛋白的情况下分离小鼠输卵管内膜干细胞，具体步骤如下：
1)输卵管全细胞准备；
2)将步骤1)中的全细胞进行原代培养；
3)将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收；
4)采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞。
2.如权利要求1所述的一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，步骤1)中所述输卵管全细胞准备的具体步骤为：6-8周龄ICR雌鼠断颈处死取输卵管，在含有2ml DPBS溶液35mm培养皿中将小鼠输卵管组织撕碎，离心收集碎片，在37℃环境中用0.25mg/ml的胶原酶的1ml PBS消化分散细胞。消化25分钟后，加入4ml含10％FBS的PrEGM培养基，吹打并混匀细胞，然后通过40μm网经的细胞滤器。将通过滤器的单细胞溶液300g离心5分钟，弃上清后用PrEGM培养基培养液将输卵管全细胞稀释至浓度为1×107/ml。
3.如权利要求2所述的一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，步骤2)中所述将步骤1)中的全细胞进行原代培养的具体步骤为：将0.1ml输卵管全细胞混合液与0.9ml温敏凝胶混合，使细胞的最终浓度为1×106/ml，取0.2～0.25ml于12孔培养板中并置于37℃培养箱中使凝胶凝固，每孔加入1ml的PrEGM或DMEM/F12全培养基，在5％CO2、37℃环境中培养6～12天，凝胶中可见许多细胞聚集而成的细胞团Ⅰ。
4.如权利要求3所述的一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，步骤3)中所述将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收的具体步骤为：将培养6-12天后的细胞团Ⅰ的12孔培养板放入冰上5分钟，溶解温敏凝胶并回收，加入冰PBS至10ml，300g离心5分钟，弃上清，用10ml冰PBS重新悬浮细胞团并离心，得到细胞团Ⅱ。
5.如权利要求4所述的一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，步骤3)中所述采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞的具体步骤为：
取细胞团Ⅱ加入含10％FBS，50μM EdU的PrEGM BulletKit 1ml，继续培养6小时，使EdU插入到合成的DNA中，然后回收细胞团Ⅱ，EdU插入培养的细胞团Ⅱ用-20℃甲醇固定，室温环境中加入Apollo反应液并轻轻摇晃6小时使其与插入的EdU反应均匀，然后用Hoechst33342染细胞核，得到待观察物Ⅰ，避光保存备用；
取细胞团Ⅱ用-20℃的甲醇固定5小时，然后用含有0.2％Triton-100的冷PBS(PBST)洗2次，将细胞团Ⅱ放入含10％山羊血清的PBST中封闭孵育3小时，加入含1：200anti-EpCAM的PBST溶液，4℃冰箱内过夜孵育。用含1％山羊血清的PBST清洗2次，每次5分钟，300g离心5分钟。细胞团沉淀用含1：400山羊抗小鼠IgG二抗的PBST室温培养2小时，PI复染细胞核，得到待观察物Ⅱ，避光保存备用；
分别取50μl的待观察物Ⅰ和待观察物Ⅱ放入玻璃底培养皿中，置于共聚焦载物台上静止1-2分钟，观察并拍照。
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