CN108018331A - 体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试剂盒 - Google Patents

体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒可特别用于进行抗肿瘤治疗剂的体外筛选或药物研发。

Description

体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试 剂盒
技术领域
本发明涉及体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒可特别用于进行抗肿瘤治疗剂的体外筛选。
背景技术
尽管不断努力改进诊断和治疗，但癌症仍然是全球死亡的主要原因。癌症的多样性或异质性对新疗法的发展构成障碍，也难以识别可能的应答者。此外，许多癌症治疗受到原发耐性(primary resistance)和获得性耐性(acquired resistance)的挑战，包括绕开治疗试剂靶点的替代途径和额外的点突变。
未来成功的治疗方法可能依赖于对肿瘤进展和转移过程所依据的事件的综合分析，以及快速和非选择性生成患者来源的原代肿瘤细胞的发展，所述细胞可以容易地操作以准确评估化学治疗剂和靶向治疗剂的功效。
作为一个例子，已经描述了使用经辐射的饲养细胞和Rho激酶抑制剂Y27632的癌细胞的原代培养物来促进异源肿瘤上皮细胞的生长并调查个体患者的药物敏感性(参见例如Liu等人，Am J Pathol， 180：599-607，2012)。然而，当仅仅接种来自患者肿瘤的分离的单个细胞时，这些共培养条件受到基质细胞及正常上皮细胞过度生长的困扰。
解决这种基质细胞污染的一种方法是使用FACS来净化上皮细胞粘附分子(EpCAM)阳性细胞亚群。但是基于细胞表面标志物表达的纯化增加了来源于原始患者肿瘤的肿瘤细胞的克隆选择的风险，因此通常不能公平地代表原始患者肿瘤的克隆多样性。
因此，需要开发用于在饲养细胞和Rock抑制剂系统中富集原代上皮肿瘤细胞的改善的培养条件，其不仅降低基质细胞和/或正常上皮细胞生长，而且还维持原始肿瘤样品的克隆多样性。
另外，目前所用的体外药筛方法由于体外重编程培养过程中出现正常细胞的干扰以及使用的筛选手段的限制，最终往往无法快速有效地获得体外药筛的准确结果。因此，也需要一种能够防止正常细胞的干扰、准确性提高的体外药物筛选方法。
发明内容
本发明涉及用于体外检测人上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂的反应性的方法，包括：
(a)将包含人上皮肿瘤细胞的人离体来源的癌组织起源球状体 (CTOS)解离成基本上单细胞的悬浮液，
(b)在确定成分的细胞培养基中与饲养细胞共培养由步骤(a) 解离的CTOS，所述确定成分的细胞培养基包含至少一种Rho相关的含盘绕圈的蛋白激酶(ROCK)抑制剂，并且不含或基本不含骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂，
(c)将治疗剂施用到步骤(b)得到的培养物中，和
(d)测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡，
其中上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮肿瘤细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的反应性，其中缺乏上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的抗性。
在文本中，癌组织起源球状体(cancer-tissue originated spheroid)亦简称为CTOS。CTOS是现有技术公知的，关于CTOS 的相关讨论、获取和处理方法，可参见：例如，Kondo et al.,PNAS USA.108:6235-6240,2011；Endo et al.,J Thorac Oncol.8:131-9,2013； WO 2012065067；和Liu et al.,Am J Pathol.180:599-607,2012等文献。
在一些实施方案中，人离体来源的CTOS(human ex vivo- derived CTOS)是从患癌症的人患者移除的肿瘤样品培养获得的，所述肿瘤样品例如选自手术样品、活检样品、胸腔积液样品和腹水样品。在一些实施方案中，人患者具有选自结肠癌、结直肠癌、肺癌、胃癌和乳腺癌的癌症。在一些实施方案中，人上皮肿瘤细胞选自结肠癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞和乳腺癌细胞。
在本申请中，“确定成分的细胞培养基”，亦称“确定成分的培养基”(“definedmedium”)，是指适用于人或动物细胞的体外或离体培养的生长培养基，其化学组成是已知的。在一些实施方案中，确定成分的培养基包含血清，例如胎牛血清(FBS)或小牛血清(fetal calf serum，FCS)。在一些实施方案中，血清的浓度为约 1-5％，或约1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施方案中，确定成分的培养基不含血清或基本上不含血清，即培养基缺乏或基本上缺乏加入的血清，例如FBS或FCS。
在一些实施方案中，确定成分的培养基包括基础培养基，例如 DMEM、F12、RPMI1640、 hESC SFM或其组合，例如 DMEM/F12，其可以补充有另外的组分，例如生长因子、抗氧化剂和/或能量来源。因此，在特定实施方案中，确定成分的培养基包括Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM)、Ham's Nutrient Mixture(F12)、RPMI1640、DMEM/F12或 hESC SFM。在一些实施方案中，培养基包括例如比值为约10:1、9:1、8:1、7:1、 6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、 1:9、1:10的DMEM/F12。
在某些实施方案中，所述培养或扩增上皮肿瘤细胞的方法不使用细胞外基质(ECM)组分。ECM的具体实例包括胶原、基质胶、层粘连蛋白和纤连蛋白。
“Rho相关的含螺旋线圈的蛋白激酶抑制剂”，在本领域是公知的，亦称为“Rho激酶抑制剂”或“ROCK抑制剂”(Rho激酶简称为ROCK)。作为ROCK抑制剂，可以使用例如ROCK-1和/或 ROCK-2抑制剂。在本发明的一些实施方式中，所述ROCK抑制剂选自Y27632、HA1100盐酸盐、HA1077和GSK429286中的一种或多种。ROCK抑制剂例如Y27632的浓度范围是约0.1-1000、0.5- 1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000 μM，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100- 500μM，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100μM，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50μM，或约0.1-40、0.5-40、 1-40、5-40、10-40μM，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30 μM，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20μM，或约0.1-10、 0.5-10、1-10、5-10μM，或约0.1-5、0.5-5、1-5μM，或约0.1-1或0.5-1μM。
步骤(b)中的饲养细胞可以从任何哺乳动物获得，且饲养细胞的动物来源不需要与所培养的CTOS的动物来源相同。例如，饲养细胞的示例性来源包括但不限于小鼠、大鼠、犬科动物、猫科动物、牛、马、猪、非人灵长类动物和人饲养细胞。特定类型的饲养细胞包括脾细胞、巨噬细胞、胸腺细胞和成纤维细胞。在一些实施方案中，脾细胞、巨噬细胞、胸腺细胞和/或成纤维细胞是非增殖性的。一个特定的实例包括J2细胞，其是源自建立的Swiss3T3细胞系的小鼠成纤维细胞的亚克隆。在一些实施方案中，γ辐射J2细胞。在特定实施方案中，用丝裂霉素C处理J2细胞。在特定实施方案中，饲养细胞是非增殖性成纤维细胞，例如人成纤维细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是非增殖性饲养细胞。例如，在一些情况下，处理饲养细胞以抑制增殖但保持代谢活性。在特定情况下，用γ辐照辐射并/或用丝裂霉素C处理饲养细胞，其阻止细胞分裂，但维持细胞的代谢活性。在一些实施方案中，不处理饲养细胞以抑制增殖。例如，在某些情况下，将饲养细胞放置在防止与CTOS物理接触的多孔滤器上，并与CTOS一起培养，而不需要处理饲养细胞以抑制其增殖。
在本发明的一些实施方式中，所述饲养细胞是非增殖成纤维细胞，任选的小鼠或人成纤维细胞。
骨形态生成蛋白抑制剂(Bone Morphogenetic Protein inhibitor) 亦称“BMP抑制剂”，为现有技术已知的。例如，所述BMP抑制剂可以是头蛋白Noggin。所述Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂是现有技术已知的，例如可以是R-spondin-1。
在本发明的一些实施方式中，所述方法在步骤(a)和(b)之后约14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1 天内在细胞培养基中提供至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90、或100％的肿瘤细胞增殖。
在本发明的一些实施方式中，在共培养解离的CTOS的同一天施用治疗剂。
在本发明的一些实施方式中，在共培养解离的CTOS后至少一天施用所述治疗剂。
在本发明的一些实施方式中，在共培养解离的CTOS后1、2、3、 4、5、6或7天内施用所述治疗剂。
这里“治疗剂”是指抗肿瘤治疗剂，其可以是已知的或将来开发的对癌症或肿瘤有潜在治疗效果或抑制效果的任何试剂或试剂组合，例如但不限于烷基化试剂、紫杉醇类化合物、与肿瘤相关抗原结合的各种抗体等等。具体例子可以是例如5-FU、奥沙利铂、伊立替康等。
在本发明的一些实施方式中，在施用所述治疗剂的14天内测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。
在本发明的一些实施方式中，在施用所述治疗剂的14、13、12、 11、10、9、8、7、6或5天内测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。
在本发明的一些实施方式中，在施用所述治疗剂的7、6或5天内测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。
可以使用本领域已知的任何方法来测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。在本发明的一些实施方式中，测量上皮肿瘤细胞增殖的步骤包括测量细胞增殖标志物。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞增殖标志物选自3H-胸苷、溴脱氧尿苷(BrdU)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(Edu)、Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)中的一种或多种。
细胞凋亡是指细胞程序性死亡。在本发明的一些实施方式中，测量上皮肿瘤细胞凋亡的步骤包括测量细胞凋亡标记。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞凋亡标志物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)、半胱天冬酶激活、聚ADP 核糖聚合酶(PARP)切割、DRAQ5、DRAQ7和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP切口标记(TUNEL)测定。
在本发明的一些实施方式中，所述上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡的测量通过高内涵筛选来完成。
在本发明的一些实施方式中，所述治疗剂是抗肿瘤治疗剂，例如5-FU、奥沙利铂、伊立替康或其组合。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述方法用于抗肿瘤治疗剂的体外筛选。在本发明的一些实施方式中，本发明所述方法还可以用于新型抗肿瘤治疗剂或药物的研发。
在本发明的一些实施方式中，所述人离体来源的CTOS是从患有癌症或肿瘤(例如结直肠癌)的人类患者移除的含肿瘤样品培养的，其任选地包括：在组织消化培养基中切碎并培养含肿瘤样品；在CTOS生长培养基中培养含肿瘤样品，时间足以形成CTOS。所述CTOS生长培养基可以是例如含有烟酰胺、Wnt3A、骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、Wnt/β-连环蛋白信号传导激动剂和ROCK抑制剂的确定成分的无血清和无饲养层的生长培养基。
本发明还涉及用于体外检测人上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂的反应性的试剂盒，包含：
-确定成分的、无血清且无饲养层的癌组织起源球状体(CTOS) 生长培养基；
-组织消化培养基；
-具有低细胞结合表面的组织培养板；
-确定成分的细胞培养基，任选地不含或基本不含骨形态生成蛋白BMP抑制剂和Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂；
-冷冻的饲养细胞；
-Rho相关的含螺旋线圈的蛋白激酶(ROCK)抑制剂；和任选地
-细胞增殖标记物和/或细胞凋亡标记物。
在本发明的一些实施方式中，所述CTOS生长培养基包含烟酰胺、 Wnt3A、骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂和/或ROCK抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述CTOS生长培养基中BMP抑制剂是头蛋白Noggin。在一些实施方式中，BMP抑制剂例如头蛋白 Noggin的浓度范围是约0.1-10,000或1-1000ng/ml，或约0.1-1000、1- 1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、 70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400- 1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000ng/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、 60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、400-500ng/ml，或约0.1-400、1-400、10-400、20-400、30-400、50- 400、40-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、200-400、 300-400ng/ml，或约0.1-300、1-300、10-300、20-300、30-300、40- 300、50-300、60-300、70-300、80-300、90-300、100-300、200-300 ng/ml，或约0.1-200、1-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50- 200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200ng/ml，或约0.1- 150、1-150、10-150、20-150、30-150、40-150、50-150、60-150、 70-150、80-150、90-150、100-150ng/ml，或约0.1-120、1-120、10- 120、20-120、30-120、40-120、50-120、60-120、70-120、80-120、 90-120、100-120ng/ml，或约0.1-100、1-100、10-100、20-100、30- 100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述CTOS生长培养基中Wnt/β- 连环蛋白信号通路激动剂是R-spondin-1。在一些实施方式中， Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂的浓度范围是0.1-10,000或1-1000或 100-1000ng/ml，或约0.1-10,000、1-10,000、10-10,000、20-10,000、 30-10,000、40-10,000、50-10,000、60-10,000、70-10,000、80-10,000、 90-10,000、100-10,000、200-10,000、300-10,000、400-10,000、500- 10,000、1000-10,000、5000-10,000ng/ml，或约0.1-5000、1-5000、 10-5000、20-5000、30-10,000、40-5000、50-5000、60-5000、70- 5000、80-5000、90-5000、100-5000、200-5000、300-5000、400- 5000、500-5000、1000-5000ng/ml，或约0.1-1000、1-1000、10-1000、 20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、70-1000、80-1000、 90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、 600-1000、700-1000、800-1000、900-1000ng/ml，或约0.1-800、1- 800、10-800、20-800、30-800、40-800、50-800、60-800、70-800、 80-800、90-800、100-800、200-800、300-800、400-800、500-800、 600-800、700-800ng/ml，或约0.1-700、1-700、10-700、20-700、30-700、40-700、50-700、60-700、70-700、80-700、90-700、100-700、 200-700、300-700、400-700、500-700、600-700ng/ml，或约0.1-600、1-600、10-600、20-600、30-600、40-600、50-600、60-600、70-600、 80-600、90-600、100-600、200-600、300-600、400-600、500-600 ng/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50- 500、60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300- 500、400-500ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述CTOS生长培养基中烟酰胺的浓度范围例如是约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000mM，或约0.1-500、0.5-500、1-500、 5-500、10-500、50-500、100-500mM，或约0.1-100、0.5-100、1- 100、5-100、10-100、50-100mM，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、 10-50mM，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40mM，或约0.1- 30、0.5-30、1-30、5-30、10-30mM，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5- 20、10-20mM，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10mM，或约0.1-5、 0.5-5、1-5mM，或约0.1-1或0.5-1mM。
在本发明的一些实施方式中，所述CTOS生长培养基中Wnt3A的浓度范围例如是约0.1-10,000或1-1000ng/ml，或约0.1-1000、1- 1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、 70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000ng/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、 60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、 400-500ng/ml，或约0.1-400、1-400、10-400、20-400、30-400、50- 400、40-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400,200-400、 300-400ng/ml，或约0.1-300、1-300、10-300、20-300、30-300、40- 300、50-300、60-300,70-300、80-300、90-300、100-300、200-300 ng/ml，或约0.1-200、1-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50- 200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200ng/ml，或约0.1- 150、1-150、10-150、20-150、30-150、40-150、50-150、60-150、 70-150、80-150、90-150、100-150ng/ml，或约0.1-120,1-120、10-120、20-120、30-120、40-120、50-120、60-120、70-120、80-120、 90-120、100-120ng/ml，或约0.1-100、1-100、10-100、20-100、30- 100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述CTOS生长培养基中ROCK抑制剂例如是Y27632。在本发明的一些实施方式中，所述CTOS生长培养基中ROCK抑制剂，例如Y27632，的浓度范围是约0.1-1000、 0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000 μM，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100- 500μM，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100,50-100μM，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50μM，或约0.1-40、0.5-40、 1-40、5-40、10-40μM，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30μM，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20μM，或约0.1-10、0.5-10、 1-10、5-10μM，或约0.1-5、0.5-5、1-5μM，或约0.1-1或0.5-1μM。
上文关于本发明的体外检测人上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂的反应性的方法所述的各种优选实施方式、优选项同样也适合于本发明的体外检测试剂盒；反之亦然。
在本发明的一些实施方式中，所述组织消化培养基包含包含一种或多种蛋白酶。蛋白酶的实例包括选自胶原酶I、胶原酶II、中性非梭菌蛋白酶及其任何组合中的一种或多种的蛋白酶。可商购的组织消化的非限制性实例包括LiberaseTM、LiberaseTM TL、LiberaseTM TM和LiberaseTM DH等。
具有低细胞结合表面的组织培养板的非限制性实例包括具有低细胞结合表面的6孔板、12孔板、24孔板、48孔板和微量滴定板例如 96孔板、384孔板和1536孔板。具有低细胞结合表面的组织培养板可商购(参见例如NuncTM低细胞结合平板或微量滴定板)。使用低细胞结合平板可以例如减少细胞附着和不希望的干细胞分化，并且相对于上皮肿瘤细胞优先消耗正常的上皮细胞和基质细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述确定成分的培养基包含血清，任选的胎牛血清(FBS)。
在本发明的一些实施方式中，所述冷冻饲养细胞是非增殖成纤维细胞，任选的小鼠或人成纤维细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述ROCK抑制剂选自Y27632、 HA1100盐酸盐、HA1077和GSK429286中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞增殖标记选自3H-胸苷、溴脱氧尿苷(BrdU)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(Edu)、Ki-67，和增殖细胞核抗原(PCNA)。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞凋亡标记物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)、半胱天冬酶活化、聚ADP 核糖聚合酶(PARP)切割、DRAQ5、DRAQ7和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP切口标记(TUNEL)测定。
在本发明的一些实施方式中，所述治疗剂是抗肿瘤治疗剂，例如5-FU、奥沙利铂、伊立替康或其组合。
在本发明的一些实施方式中，肿瘤细胞可直接从病人肿瘤组织获得；也可为肿瘤患者来源的移植瘤(patient-derived xenografts, PDXs)；可用于特定培养的肿瘤细胞类型包括肺癌细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞和乳腺癌。在一些实施方式中，肿瘤细胞可从手术标本、活检、胸腔积液和腹水中获得。
可以根据药物浓度构建药物浓度和药敏反应的逻辑斯蒂S型函数曲线。GI50(可取得50％肿瘤细胞生长抑制的药物浓度)和AUC(药物浓度梯度-反应相关曲线下面积)可按以下计算方法获得：
肿瘤细胞库增殖率最大抑制率(EdU):Amax＝MIcmax/MIc
肿瘤细胞库增殖率半最大抑制药物浓度：GI50
肿瘤细胞库增殖率药物抑制有效面积:DSS(AUC)＝∫MI(x)dx
上文针对本发明所述的培养基(或培养物)各种组分或本发明的方法各个步骤所述的各种实施方式和优选项可以相互组合(只要它们彼此之间不是内在矛盾的)，由此组合而形成的各种实施方式都视为本申请公开的一部分。
使用本发明的药敏性检测方法，至少具有如下一个或多个优点：
可体外高效扩增上皮肿瘤细胞，无正常上皮细胞污染，同时保持肿瘤细胞异质性；
本专利中细胞体外培养方法可短时间内获得足够药物筛选的细胞量，原代肿瘤细胞来源不仅仅局限于手术标本、可以为活检、胸腔积液和腹水；
采用高内涵检测仪(HCS，Thermo Scientific Cellomics ArrayScan XTi HCSreader)搜集数据信息，更全面有效的对获得的数据进行分析，处理，对结果的评价更全面，准确。
附图说明
图1A-1B展示了从结肠直肠肿瘤手术样品中成功分离的癌组织起源球状体(CTOS)；图1C-1D是在确定成分的生长培养基中作为悬浮液培养以形成癌组织起源球状体(CTOS)的肿瘤细胞。
图2A-2B展示了从正常结肠直肠组织手术样品中分离的单细胞。
图3A-3B展示了从正常结肠直肠组织手术样品中分离、并接种在饲养细胞/Rock抑制剂(Y27632)共培养系统中的细胞。通过Edu 并入测量细胞增殖。蓝色的染色是DAPI，黄色染色是EpCam，红色染色是Edu。
图示结果显示，正常结直肠上皮细胞不能在使用了确定成分的培养基的共培养系统中生长。
图4A-4F展示了来自六位不同患者的癌组织来源的球状体 (CTOS)的单个肿瘤细胞，它们被解离并接种在饲养细胞/Rock抑制剂(Y27632)选择性共培养系统中。通过Edu并入来测量细胞增殖。蓝色的染色是DAPI，黄色染色是EpCam，红色染色是Edu。
图示结果显示，从不同患者获得的肿瘤上皮细胞能在使用确定成分的培养基的共培养体系中生长。
图5A-5D展示了从患者结肠直肠肿瘤手术样品中分离并接种于饲养细胞/Rock抑制剂(Y27632)选择性共培养系统中的未富集的单个细胞。通过Edu并入测量细胞增殖。
图示结果显示，未富集的单细胞悬液中存在大量间质细胞和肌纤维细胞，可以在使用确定成分的培养基的共培养体系中生长，这些细胞的生长可以影响药敏检测的准确性。
图6展示了富集后的共培养系统，其中使用原代肿瘤上皮细胞测试对药物和药物组合的反应性。蓝色染色是DAPI，黄色染色是 EpCam，红色染色是Edu。从上到下每行分别是：氟尿嘧啶(5- FU)、奥沙利铂、奥沙利铂+5-FU(10μM)；SN-38；SN-38+5- FU(10μM)；SN-38+5-FU(10μM)+奥沙利铂(2.5μM)。从左到右每列展示了递减浓度的主要测试药物。
图示结果表明，随着药物浓度的升高，肿瘤上皮细胞的生长逐渐被抑制。
图7A-7B展示了来自八位个体患者的肿瘤上皮细胞对某些化疗剂及其组合的应答谱，包括在AUC浓度下的肿瘤生长抑制(图7A) 和在不同药物浓度处理下的定量药敏性评分(DSS)(图7B)。
MI数值小于80％的患者对药物敏感性较低；而MI大于80％的患者，如果DSS越大，患者对该药物越敏感。
图8A-8H展示了从来自两位不同患者的正常结肠直肠组织手术 样品分离、接种、并于饲养细胞/Rock抑制剂(Y27632)共培养系 统中培养的细胞，所述共培养系统使用(8A-8B)完全培养基、 (8C-8D)不含Wnt3A-Noggin的完全培养基，(8E-8F)不含R- spondin-1和Noggin的完全培养基，和(8G-8H)不含Wnt3A、R- spondin和Noggin的完全培养基。通过Edu并入测量细胞增殖。蓝 色的染色是DAPI，黄色染色是EpCam，红色染色是Edu。
图示结果表明，从肠癌患者来源的正常上皮细胞在完全培养基 和不含Wnt3A-Noggin的完全培养基中可以生长，但不能在不含R- spondin-1和Noggin的完全培养基、和不含Wnt3A、R-spondin和 Noggin的完全培养基中生长。
图9A-9H展示了从患者来源的肿瘤组织起源球状体(CTOS) 分离的肿瘤细胞，它们被解离并接种在饲养细胞/Rock抑制剂 (Y27632)共培养系统中，所述系统使用(9A-9B)完全培养基、 (9C-9D)不含Wnt3A-Noggin的完全培养基，(9E-9F)不含R- spondin和Noggin的完全培养基，和(9G-9H)不含Wnt-3A、R- spondin和Noggin的完全培养基。通过Edu并入测量细胞增殖。蓝 色的染色是DAPI，黄色染色是EpCam，红色染色是Edu。与正常 细胞相反，结肠直肠肿瘤上皮细胞在图9E-9F的选择性培养基和图 9G-9H的选择性培养基上生长。
图示结果表明从肠癌患者来源的肿瘤上皮细胞在完全培养基，不含Wnt3A-Noggin的完全培养基，不含R-spondin和Noggin的完全培养基，和不含Wnt-3A、R-spondin和Noggin的完全培养基的共培养系统中均可以快速生长。
实施方式
本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。
实施例1
CTOS的分离和单细胞培养物的条件重编程
在取得病人知情同意后，于北京肿瘤医院取得结直肠癌手术患者的肿瘤样本和正常样本。
首先，仔细的将非肿瘤组织和坏死组织从肿瘤样本中剥离。用剪刀将肿瘤组织和正常组织剪成直径小于1mm的小块。将剪碎的肿瘤组织和正常组织转移到有磁力搅拌棒的100毫升无菌三角玻璃瓶中。分别向剪碎的组织中加入含有0.25U/ml Liberase DH消化酶(一定比例的胶原酶I和胶原酶，具有中性非梭菌蛋白酶) 的10-15ml消化培养基，在温和的磁力搅拌下于37℃孵育1-2小时。
将部分被消化的肿瘤细胞簇先经100-μm滤网过滤，滤液再经 40-μm滤网过滤。收集保留于滤网上的肿瘤细胞簇，用HBSS洗涤两次，然后重悬于补充有细胞生长因子和小分子抑制剂的确定成分的生长培养基中。将肿瘤细胞簇在确定成分的生长培养基中恢复过夜。
确定成分的完全生长培养基是补充有：烟酰胺、Wnt3A、头蛋白Noggin(BMP抑制剂)、R-spondin-1(Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂)和Y27632(Rho-相关的含螺旋线圈的蛋白激酶(ROCK- 1)抑制剂)的 hESC SFM(确定成分的、无血清和无饲养细胞的培养基(SFM))。
还测试了一些选择生长培养基，包括未补充R-spondin-1和头蛋白Noggin，在一些情况下也未补充Wnt3A的前述完全生长培养基 (见图8A-8H和图9A-9H及相关附图说明)。正常的上皮细胞在确定成分的完全生长培养基上生长(图8A-8D)，但不在选择生长培养基上生长(图8E-8H)。相反，肿瘤上皮细胞在确定成分的完全生长培养基(图9A-9D)和选择生长培养基(图9E-9H)二者上均生长。
为了进行条件重编程，将恢复的CTOS解离，并以约3000个细胞/孔的浓度接种于含有饲养细胞/Rock抑制剂(Y27632)共培养系统的具有低细胞结合表面的组织培养板中(见图4A-4F及相关附图说明)。
实施例2
体外药敏试验
在初始接种后，在确定成分的选择生长培养基中使用解离的肿瘤上皮细胞进行药物测试，所述确定成分的选择生长培养基为补充有烟酰胺和Y27632(Rho-相关的含螺旋线圈的蛋白激酶(ROCK-1) 抑制剂)的 hESC SFM(确定成分的、无血清和无饲养细胞的培养基(SFM)。
对于离体药物测试，将接种的肿瘤细胞暴露于药物或药物组合中72小时。药物在DMSO中制备，培养基中DMSO的最终浓度为 0.1％。药物和药物组合在十点连续稀释下进行测试(见图6及相关附图说明)。暴露于药物后，用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(Edu)标记肿瘤上皮细胞以评估肿瘤细胞增殖率。标记过程在药物暴露的情况下持续24小时。在对照组中，上皮细胞未接受培养基变化的药物暴露，但与Edu类似地标记。将标记的肿瘤细胞固定并用Hoechst 33342在含有0.5％Triton X-100和3％BSA的封闭缓冲液中于4℃过夜染色。将肿瘤细胞与EpCAM抗体(1:4000)在室温下温育2小时，并用PBST冲洗。随后，将肿瘤细胞与Alexa 647缀合的山羊抗小鼠二抗在室温下孵育30分钟，并用PBST冲洗。
通过Click-iT反应检测并入的Edu，其中将固定的细胞在黑暗中与含有1X Click-iT Edu反应缓冲液、CuSO4和叠氮化物缀合的 Alexa Fluor染料的反应混合物一起温育。染色的细胞用PBS洗涤，然后分散到黑色壁的培养板中进行图像采集和分析。
对正常组织而言，在实施例1中所述部分酶消化后未观察到肿瘤簇。收集单个细胞，并以3000细胞/孔的浓度接种在饲养细胞和Rock抑制剂T27632上。将正常细胞培养72小时，之后用5-乙炔基 -2'-脱氧尿苷(Edu)标记，以评估肿瘤细胞增殖率。将正常细胞用EpCAM抗体染色以鉴定上皮细胞。
实施例3
图像采集和分析
通过高内涵筛选(HCS)平台(Thermo Scientific Cellomics ArrayScan XTi HCSreader)对经染色的肿瘤细胞进行成像。选择 10X物镜搜集图像，每个检测孔选择25个视野，分析总量大于3000 个细胞。从HCS读书器中获得来自图像的三种荧光信号。蓝色荧光信号记录用Hoechst 33342染色的细胞核信号；绿色荧光信号检测新合成的DNA中并入的Edu；红色荧光信号检测EpCAM阳性上皮细胞群。计算Edu阳性亚群细胞占总上皮细胞数量的百分比。
如图7A-7B中所示，针对八位不同的患者，产生针对药物和药物组合的Edu并入百分比的剂量响应数据，以及定量药敏性评分 (图7B)。数据展示为具有最大效应水平(Amax)的逻辑斯蒂S 型函数(logistic sigmoidal function)曲线，化合物的半最大活性浓度(EC50)，表示信号转换的Hill系数、和基于活性面积(DSS) 捕获多参数剂量应答关系以鉴定选择性药物应答模式的定量评分途径。
Amax(EdU)＝MIcmax/MIc
DSS(AUC)＝∫MI(x)dx
Amax、EC50和DSS可被用于建立患者对测试的药物或药物组合应答的预测模型。
最终测试数据结果在图7A和图7B中给出，图7A是以AUC浓度计的不同药物对肿瘤细胞生长的抑制，图7B是不同药物对肿瘤细胞的定量药敏性评分。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。

Claims (27)

1.用于体外检测人上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂的反应性的方法，包括：
(a)将包含人上皮肿瘤细胞的人离体来源的癌组织起源球状体(CTOS)解离成基本上单细胞的悬浮液，
(b)在确定成分的细胞培养基中与饲养细胞共培养由步骤(a)解离的CTOS，所述确定成分的细胞培养基包含至少一种Rho相关的含盘绕圈的蛋白激酶(ROCK)抑制剂，并且不含或基本不含骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂，
(c)将治疗剂施用到步骤(b)得到的培养物中，和
(d)测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡，
其中上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮肿瘤细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的反应性，其中缺乏上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的抗性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述BMP抑制剂是头蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂是R-spondin-1。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤(a)和(b)之后约14天内在细胞培养基中提供至少约10％的肿瘤细胞增殖。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在共培养解离的CTOS的同一天施用治疗剂。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在共培养解离的CTOS后至少一天施用所述治疗剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在共培养解离的CTOS后1、2、3、4、5、6或7天内施用所述治疗剂。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在施用所述治疗剂的14天内测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在施用所述治疗剂的14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测量上皮肿瘤细胞增殖的步骤包括测量细胞增殖标志物。
11.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞增殖标志物选自3H-胸苷、溴脱氧尿苷(BrdU)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(Edu)、Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)中的一种或多种。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测量上皮肿瘤细胞凋亡的步骤包括测量细胞凋亡标记。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞凋亡标志物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)、半胱天冬酶激活、聚ADP核糖聚合酶(PARP)切割、DRAQ5、DRAQ7和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP切口标记(TUNEL)测定。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡的测量通过高内涵筛选来完成。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是5-FU、奥沙利铂、伊立替康或其组合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于抗肿瘤治疗剂的体外筛选。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述上皮肿瘤细胞选自人结肠癌细胞、人结直肠癌细胞、人肺癌细胞、人胃癌细胞和人乳腺癌细胞。
18.用于体外检测人上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂的反应性的试剂盒，包含：
-确定成分的、无血清且无饲养层的癌组织起源球状体(CTOS)生长培养基；
-组织消化培养基；
-具有低细胞结合表面的组织培养板；
-确定成分的细胞培养基，任选地不含或基本不含骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂；
-冷冻的饲养细胞；
-Rho相关的含螺旋线圈的蛋白激酶(ROCK)抑制剂；和任选地
-细胞增殖标记物和/或细胞凋亡标记物。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述CTOS生长培养基包含烟酰胺、Wnt3A、骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂和/或ROCK抑制剂。
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述组织消化培养基包含选自胶原酶I、胶原酶II、中性非梭菌蛋白酶及其任何组合中的一种或多种的蛋白酶。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的试剂盒，其中所述确定成分的培养基包含血清，任选的胎牛血清(FBS)。
22.根据权利要求18-20中任一项所述的试剂盒，其中所述冷冻饲养细胞是非增殖成纤维细胞，任选的小鼠或人成纤维细胞。
23.根据权利要求18-20中任一项所述的试剂盒，其中所述ROCK抑制剂选自Y27632、HA1100盐酸盐、HA1077和GSK429286中的一种或多种。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞增殖标记选自3H-胸苷、溴脱氧尿苷(BrdU)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(Edu)、Ki-67，和增殖细胞核抗原(PCNA)。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞凋亡标记物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)、半胱天冬酶活化、聚ADP核糖聚合酶(PARP)切割、DRAQ5、DRAQ7和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP切口标记(TUNEL)测定。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的试剂盒，其中所述治疗剂是5-FU、奥沙利铂、伊立替康或其组合。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的试剂盒，其中所述上皮肿瘤细胞选自人结肠癌细胞、人结直肠癌细胞、人肺癌细胞、人胃癌细胞和人乳腺癌细胞。
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