CN115633676A - 角膜保存液 - Google Patents

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CN115633676A CN202210206327.9A CN202210206327A CN115633676A CN 115633676 A CN115633676 A CN 115633676A CN 202210206327 A CN202210206327 A CN 202210206327A CN 115633676 A CN115633676 A CN 115633676A
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Abstract

本发明公开了一种角膜器官保存组合物，该组合物包含有效量的已缓冲、已平衡且营养的电解质水溶液、γ‑谷胺酸及阿魏酸，可维持角膜组织细胞的完整性并可存活超过14天。

Description

角膜保存液
技术领域
本发明总体上涉及一种眼用液剂，更具体地，是涉及一种用于后续移植的角膜组织的储存培养液。
背景技术
角膜是眼睛的最外层，它是一个透明的圆顶形表面，覆盖了眼睛的前部。角膜组织包括五个基本层：上皮层(epithelial layer)、前弹力层(Bowman's layer)、基质(stroma)、后弹力层(Decemet's membrane)及内皮层(endothelial layer)。内皮层细胞在保持角膜清洁方面发挥着最重要的作用。正常情况下，液体从眼睛内部缓慢地进入角膜层(基质)的中间。内皮的主要任务是将多余的液体泵出基质。如果没有这种泵送动作，基质会随着水膨胀，变得朦胧，并最终变得不透明。通常由于病理或损伤，内皮细胞可能被破坏。事实上，角膜内皮细胞并不会增殖。因此，当内皮细胞因外伤或疾病失去时，失去的细胞不会被替换，而是相邻的内皮细胞迁移并扩展到缺损处。
当内皮细胞密度低于一定水平，通常约低于400个细胞/mm2时，会发生角膜水肿(Corneal edema)。清晰的视力取决于角膜的清澈度，而角膜的清澈度又取决于角膜的消肿。后期角膜肿胀与严重的视力丧失及失明有关。由于疾病或疤痕形成的角膜混浊也与视力丧失有关，严重将导致失明。
角膜移植是治疗不可逆角膜水肿或疤痕的唯一可用疗法，是从器官捐献者处获得的健康、透明的角膜来替换患病、或有疤痕、或受创伤的角膜。
与其他器官移植的情况一样，必须先对捐赠者的血液进行各种检测，以排除可能传染给受赠者的各种传染病，从而导致了手术延迟。需要运送捐赠者组织的情况也并非罕见，这会导致进一步的延误。因此，有必要对取得的组织及细胞进行体外储存或维持，直到进行移植。对于捐赠者角膜，必须确保角膜细胞的存活、密度(尤其是内皮层的细胞)，以及角膜不膨胀并保持其透明度。
目前已开发了多种溶液及培养基来保存组织以储存及/或运输供后续使用。然而，即使有专门为其准备的储存培养基可用，实际储存时间也很有限。例如，广泛使用的McCarey-Kaufman培养基被认为可用于保存角膜组织仅达四天。美国眼库(eye bank)中最常用的角膜保存培养基是市售的OptisolTM溶液(Bausch&Lomb)，设计用于4℃的中继储存。OptisolTM溶液是一种无血清培养基，含有基础培养基、缓冲液、硫酸软骨素(chondroitinsulfate)、葡聚醣(dextran，分子量40kD)、维生素及ATP前驱物。尽管有研究报告(如Kaufman et al.Arch Ophthalmol；109:864-868(1991)；Lindstrom et al.Am Journal ofOphthalmol；114:345-346(1992))指出OptisolTM可有效保留内皮结构长达两周，但在这段时间之后内皮存活率会显著下降，并且大多数外科医生不偏好使用储存在此溶液超过五天的角膜。故本领域尚需开发改良的角膜储存培养基，以促进角膜组织的长期保存。
因此，本领域存在迄今未解决的上述与角膜细胞保存相关的缺陷及不足，特别是用于后续移植的用途。
发明内容
因此，本发明提供了一种角膜储存组合物，包含：
(a)一已缓冲、已平衡、具有营养及电解质之水溶液；
(b)γ-谷胺酸(γ-PGA)；及
(c)阿魏酸(ferulic acid)。
进一步地，其中所述γ-谷胺酸的浓度为1至5％。
进一步地，其中所述阿魏酸的浓度范围为0.1至5mM。
进一步地，其中所述角角膜储存组合物进一步包含至少一种选自表皮生长因子(Epidermal growth factor)、原半胱胺酸(Procysteine)、胸腺素β4(Thymosinsβ4)及D-甘露糖-6-磷酸(Mannose-6-phosphate)。
进一步地，其中所述表皮生长因子、原半胱胺酸、胸腺素β4及D-甘露糖-6-磷酸的浓度分别为5至1000ng/ml、10至500μM、10至500μM及50至1000μM。
进一步地，其中所述角膜储存组合物进一步包含表皮生长因子、原半胱胺酸、胸腺素β4及D-甘露糖-6-磷酸。
进一步地，其中所述的角膜储存组合物不含右旋糖酐(Dextran)及硫酸软骨素(Chondroitin sulfate)。
进一步地，其中所述角膜储存组合物不含葡萄糖(Glucose)。
进一步地，其中所述角膜储存组合物不含β-巯乙醇(β-mercaptoethanol)。
本发明还提供了一种用于储藏及保存角膜组织的方法，包含：
将一角膜组织置于如权利要求1的角膜储存组合物中。
进一步地，其中所述角膜组织的细胞存活可维持至少14天。
进一步地，其中所述方法进一步包含将角膜储存组合物的温度保持在2至8℃。
进一步地，其中所述方法进一步包含将角膜储存组合物的温度保持在4℃。
本发明还提供了一种减少保存过程中角膜组织肿胀的方法，包含：将一角膜组织置于如权利要求1所述的角膜储存组合物中。
本发明是一种新配方的培养基，包含特定的聚合物，通过外部渗透压的调节来为眼组织提供保护。如此一来，良好地保持了基质的含水，以保持角膜透明度。另一种成分是在植物细胞壁成分中发现的丰富的植物性酚类化合物，具有抗氧化、抗菌特性及神经保护作用。因此，本发明可避免捐赠的角膜肿胀并提供良好的保存条件。本发明的组合物特别适合用于眼科储存培养基，通常可用于外科手术，但也考虑了其他用途，例如组织储存、移植准备以及局部应用。本发明涉及一种新颖组合物，其利用聚-γ-谷胺酸(poly-γ-glutamicacid,γ-PGA)这种试剂来调节渗透压及避免组织水肿。使用不同的γ-PGA浓度可将渗透压调节在330至390mOsM的范围内，从而在储存过程中保持角膜基质内的含水，它比玻尿酸(hyaluronic acid)保湿力强十倍，也远比胶原蛋白(collagen)具有弹性。尚有一种成分是阿魏酸(ferulic acid)，它具有多种药理特性，包括抗发炎及抗氧化。上述的储存培养基在中、长期储存对保护角膜及视网膜更有效，而且成本更低许多。
通过以下对优选实施例的描述配合相应附图，本发明的上述及其他方面可为所属技术领域中具有通常知识者了解，并据以实现，但在不脱离本公开的新颖概念的精神及范围的情况下仍可在其中做出变化及修改。
附图说明了本发明的一个或多个实施例，并且与书面说明一起用于解释本发明的原理。在可能的情况下，所有附图中使用相同的附图标记来代表实施例的相同或相似组件。
附图说明
图1显示渗透压具γ-PGA浓度依赖性。渗透压是由Advanced Instrument,Co.,Inc.生产的渗透压计所测量。
图2显示γ-PGA对牛角膜内皮细胞(Bovine corneal endothelium cells,BCEC)没有细胞毒性。细胞毒性是根据ISO 10993，使用CytoTox
Figure BDA0003503905880000041
试验来评估。
图3显示阿魏酸(50μM及100μM)对人类角膜内皮细胞(Human cornealendothelium cells,HCEC)没有细胞毒性。HCEC的细胞凋亡是使用与荧光异硫氰酸(Fluorescein isothiocyanate,FITC)结合的AnnexinV蛋白及碘化丙啶(Propidiumiodide)染色，以流式细胞实验来评估。
图4显示阿魏酸(50μM)预防及/或拮抗AAPH(25mM)所诱导的牛角膜内皮细胞(Bovine corneal endothelium cells,BCEC)损伤。BCEC的细胞凋亡是使用末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPnick end labeling,TUNEL)测定法来评估。
图5显示包含γ-PGA及阿魏酸的储存培养基有效地减少了基质的膨胀。图5A及5B：在包含γ-PGA及阿魏酸的培养基中4℃下储存14天后的兔角膜组织切片。图5C及5D：在M199细胞培养基中4℃下储存14天后的兔角膜组织切片。图5A及5C：HE染色；图5B及5D：细胞核的DAPI荧光染色。
图6显示包含γ-PGA及阿魏酸的储存培养基可保持角膜内皮细胞之间的连接完好并保持细胞核于均匀及完整的型态。图A-D：兔角膜组织切片在含有γ-PGA及阿魏酸的培养基中4℃下储存7天。A及C：ZO-1染色；B及D：细胞核的DAPI荧光染色。
图7显示分别在4℃储存14天及21天后，含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基皆比OptisolTM培养基更好地保持角膜内皮细胞存活。
具体实施方式
本说明书中使用的术语在本领域、本发明的内文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有它们的一般含义。用于描述本发明的某些术语在下文或说明书中的其他地方讨论，以提供从业人员关于本发明实施方式的额外指导。为方便起见，某些术语可能会被强调，例如使用斜体及/或引号。强调与否对术语的范围及含义没有影响；在相同的上下文中，术语的范围及含义是相同的，无论是否被强调。用不同的方式描述同一件事情也是可以理解的，因此替代语言及同义词亦可用于此处讨论的任何一个或多个术语，并且对术语没有任何特殊意义，无论该术语于此处是否详述或讨论。本说明书提供了某些术语的同义词。一个或多个同义词的陈述不排除使用其他同义词。本说明书中任何地方的示例的使用，包括本文讨论的任何术语的示例，仅是说明性的，绝非限制本发明或任何示例性术语的范围及含义。同样地，本发明亦不限于本说明书中给出的各种实施例。
除非另有定义，本文使用的所有技术及科学术语与本发明所属领域的通常知识者一般理解的含义相同。发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。
用于本说明书，“约”或“大约”通常表示在给定值或范围的20％以内，优选在10％以内，并且更优选在5％以内。本文给出的数值是近似值，意味着如果没有明确说明，可以推断出术语“约”或“大约”。
一种明确界定的储存培养基，含有在约4℃至37℃的温度下维持及加强眼组织保存的成分，该培养基包含有效量的消肿剂、抗氧化剂及抗发炎剂。本发明提供用于保存组织的方法及组合物，特别是用于角膜组织的冷藏及移植。在一个实施例中，本发明提供的明确界定的储存培养基，是一种基于基本生理学原理及实验室关于维持细胞膜完整性的研究结果的独特角膜保存培养基。培养基通常以无菌溶液提供，成分及其各自功能的更详细描述如下所述。
本发明的LCD培养基在许多特定方面不同于先前的配方。例如，用于优选配方的基础培养基为OptiMEM(GIBCO/Life Technologies)，其含有对支持细胞增殖很重要的成分，例如胰岛素(insulin)、转铁蛋白(transferrin)及硒(selenium)。含有这三种成分的其他营养培养基皆可以取代OptiMEM。然而本发明的培养基还含有γ-PGA、阿魏酸、6-磷酸甘露糖(mannose 6-phosphate)及胸腺素β4(thymosinβ4)。
在保存培养基中添加保水化合物可以防止角膜肿胀。其中最常用的一种消肿化合物是右旋糖酐(dextran)，可以单独使用(McKarey,BB及Kaufman,HE(1974)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.13,165)或与硫酸软骨素(chondroitin sulfate，一种葡糖胺聚醣(glucosaminoglycan))合并使用(Kaufman HE等人(1991)Arch.Ophthalmol.109,864-868)。然而，硫酸软骨素是一种异质化合物，聚合物内硫酸根的分布不固定(Scott,1995)。因此，用于角膜储存的组合物可能会因批次而异。此外，由于硫酸软骨素(为硫酸盐分子)带有很强的负电荷。据报导，硫酸软骨素会穿透角膜并促使其肿胀，特别是在移植前，将组织从4℃重新回温至室温的时候(Kaufman et al.1991)。为了减少由硫酸软骨素引起的角膜肿胀，也有团队配制了角膜保存组合物，其添加了消肿剂，例如右旋糖酐，与硫酸软骨素搭配(EP 517,972)。然而，右旋糖酐在储存过程中也可能会渗入基质，并增加回温时的膨胀压力。再者，现在也很清楚的是，右旋糖酐对角膜具毒性，会诱导衰老及退化(Chen etal.,1996)。聚-γ-谷胺酸(poly-γ-PGA)的分子量为1至200万。这种高分子量的γ-PGA太粘稠，必须与一些其他保水组分结合使用，才适合作为储存培养基成分，以兼顾防止角膜肿胀而又不增加溶液的黏度。因此，本发明的一个目的是提供一种角膜储存液，其能够为活角膜提供合适的储存条件，同时避免现有保存液的缺点。
氧自由基可能会损伤等待移植的角膜上皮及内皮。阿魏酸(ferulic acid)的抗氧化活性高于L-抗坏血酸(L-ascorbic acid，维生素C)及α-生育酚(α-tocopherol，维生素E)。维生素C是为数不多的外用药物之一，其对抗皱纹及细纹的有效性有大量可靠科学证据的支持。可惜的是，维生素C相对不稳定，当暴露在空气中时，维生素C溶液会发生氧化，不仅无效还可能有害。
维生素E是一种脂溶性抗氧化剂。在生命系统中，维生素C及E可以相互再生，从而增强彼此的抗氧化作用。虽然维生素E在水溶液中保护维生素C免受氧化的效果尚属中等，但维生素E能够增强维生素C的抗氧化作用。研究指出，维生素C及E的组合比单独使用任何一种维生素都能提供更好的保护，防止紫外线引起的损伤。另一方面，维生素E几乎不影响维生素C刺激胶原蛋白合成的能力。
阿魏酸(ferulic acid)是一种天然存在的酚类化合物，主要存在于植物细胞壁中。它是一种有效的抗氧化剂，即使单独使用也对皮肤有益。然而，阿魏酸的护肤相关研究仅集中在其增强维生素C及E作用的能力上。初步研究指出，阿魏酸可提高维生素C在水溶液中的稳定性。此外，在维生素C及E的组合物中添加阿魏酸可增强防止紫外线引起的皮肤损伤。尽管维生素C、E及阿魏酸的组合物已比单独使用维生素C具有明显的优势，进一步再搭配原半胱胺酸(procysteine)更可对脂质过氧化(lipid peroxidation)产生协同保护作用。
实施例
以下提供根据本发明实施例的示例性仪器、装置、方法及其相关结果，并非意图限制本发明的范围。请注意，为了方便读者，在示例中可使用标题或副标题，这不应限制本发明的范围。此外，本文提出及公开的某些理论，无论其对错，亦不应限制本发明的范围，只要根据本发明可付诸实施而不须考虑任何特定的理论或方案。
γ-PGA是一种阴离子胜肽，为产生于芽孢杆菌属荚膜物质或粘液中的天然化合物(Crit.Rev.Biotechnol.2001；21:219-232)。γ-PGA的独特之处在于它是以酰胺键(amidebond)连接在一起的L-谷胺酸所组成。γ-PGA是一种水溶性、可生物降解且无毒的聚合物。由于其独特的离子捕获性能及高吸水性，它已被广泛应用于各方面，如金属螯合物、吸收剂、冷冻保护剂、老化抑制剂、药物载体或保湿剂。近年来，γ-PGA作为一种具有良好膨胀能力及生物兼容性的生物材料被广泛应用于生物胶、组织工程及药物递送系统等临床领域。本发明涉及发现γ-PGA具有调节渗透压的能力。
阿魏酸具有高抗氧化活性及光稳定性，可防止角膜内皮损伤及白内障形成。阿魏酸是一种在蔬菜及玉米麸皮中含量非常丰富的多酚，是当归的衍生物。一些证据显示，阿魏酸之所以在体外可作为一种有效的抗氧化剂，是因为它能够清除自由基并通过上调细胞保护酶(如血铁质氧化酶-1(heme oxygenase-1)、胞外讯号调节激酶1/2(extracellularsignal-regulated kinase 1/2)及Akt等)，诱导强劲的细胞压力应对(stress response)。此外，阿魏酸抑制一些细胞毒性酶的表达及/或活性，包括一氧化氮合成酶(nitric oxidesynthase)、半胱天冬酶(caspases)及环氧合酶-2(cyclooxygenase-2)。
原半胱胺酸是一种可渗透细胞的谷胱甘肽(glutathione)前驱物。原半胱胺酸是半胱胺酸的一种修饰形式，毒性稍低，并且相较于半胱胺酸是较稳定的闲置状态，维持细胞内的谷胱甘肽水平。原半胱胺酸还改善了大鼠心脏再灌流损伤(ischemia-reperfusioninjury)的恢复(The Journal ofNutritional Biochemistry Volume 5,Issue 7,July1994)。
胸腺素β4是在糖皮质激素(glucocorticoids)存在下由单核细胞产生的抗发炎剂(Nat Med.1999Dec；5(12):1424-7)，为43个胺基酸组成的水溶性酸性多肽(pI 5.1)，分子量为4.9kDa。胸腺素β4可能通过调控发炎的关键调节剂NFκB的活性来发挥其抗发炎作用(Experimental Eye Research Volume 84,Issue 4,April2007,Pages 663-669)。
在进一步的实施例中，眼用制剂可包含6-磷酸甘露糖(Mannose 6-phosphate,M6P)。M6P是一种在免疫系统中与凝集素(lectin)结合的分子。理论上，M6P透过与胰岛素样生长因子II受体(Insulin-like growth factor II receptor)上的潜在转变生长因子β(Transforming Growth Factorβ,TGF-β)结合位竞争而起作用(G.Sutton,et al.,Lasersand Light,Vol.7,No.2/3,pp.117-119(1996))。6-M6P显著降低了TGF-β1介导的人类角膜纤维母细胞(corneal fibroblasts)向肌纤维母细胞(myofibroblasts)的转化。它也是角膜伤口愈合的潜在调节剂，可以减少屈光手术后的混浊(J Cataract RefractSurg.2010Jan；36(1):121-6)。
实施例1配方
表1中描述了由聚-γ-谷胺酸组成的LCD培养基组合物，与包含硫酸软骨素及葡聚醣(Optisol-GS)或单独葡聚醣(McKarey-Kaufman)的市售角膜储存培养基做对比。
Figure BDA0003503905880000081
表1 LCD培养基与MK1TM及Optisol-GSTM的特性比较
OPTI-MEM I是Eagle基本必需培养基的改良版，以HEPES及碳酸氢钠缓冲，并补充次黄嘌呤(hypoxanthine)、胸苷(thymidine)、丙酮酸钠(sodium pyruvate)、L-谷胺酰胺(L-glutamine)或GLUTAMAX、微量元素及生长因子。包含降低浓度的酚红做为pH指示剂。本发明LCD培养基的优选配方组成如下(表2)。
Figure BDA0003503905880000091
表2 LCD培养基的配制
实施例2γ-PGA对角膜内皮细胞没有明显的细胞毒性
使用CytoTox
Figure BDA0003503905880000092
Assay来测量以不同浓度的γ-PGA处理后的细胞死亡。CytoTox
Figure BDA0003503905880000093
Assay可定量检测细胞裂解时释放出的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)。首先将牛角膜内皮细胞以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔培养板上。将不同浓度的γ-PGA(质量/体积浓度为0.2％至4％)添加到适当的孔中，使每孔内最终液体体积为100–150μl，并在37℃下培养1天及7天，阴性对照是不含γ-PGA的培养基。在每个时间点，从所有测试组及对照组各取样50μl转移到新鲜的96孔平底透明盘中，并分别加入50μl CytoTox
Figure BDA0003503905880000094
试剂，避光并在室温下培养30分钟后，在每个反应混合物中加入50μl终止液。排除液面气泡，并记录波长490nm处的吸光度。使用以下公式中的校正曲线来计算细胞毒性百分比：
Figure BDA0003503905880000095
图2显示，所有γ-PGA组对牛角膜内皮细胞没有细胞毒性。
实施例3阿魏酸对角膜内皮细胞没有明显的细胞毒性
Annexin V染色是检测凋亡细胞的常用方法。使用与荧光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶联的Annexin V蛋白以及碘化丙啶(propidiumiodide)的流式细胞技术来评估人角膜内皮细胞(HCEC)的细胞凋亡(如图3)。HCEC在含有50μM或100μM阿魏酸的DMEM/F12中培养。简言之，HCEC生长至汇合并在24孔盘中使用与前几组实验相同的条件培养24小时。在冷的PBS溶液中离心及洗涤后，将HCEC重新悬浮在结合缓冲液(10mM HEPES、140mM氯化钠、5mM氯化钾、1mM二氯化镁、2.5mM二氯化钙，pH 7.4)中，浓度为106个细胞/毫升。将500μl含有5×105个细胞的结合缓冲液移至培养管中，并加入1.25mLFITC偶联的Annexin V蛋白。细胞凋亡及坏死(体积浓度为10％的乙醇)细胞死亡提供阳性对照。为了同时对各组细胞反应进行评分，各104个细胞的试样立即进行荧光启动细胞分选(fluorescence-activated cell sorting,FACS)，在FACS Calibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)上完成。激发参数设定为λEx＝488nm，在λEm＝518nm处侦测Annexin V-FITC的荧光发射。
实施例4阿魏酸防止AAPH诱导的角膜内皮细胞凋亡
根据制造商(DeadEndTM Fluorometric TUNEL System,Promega,Madison,USA)的操作说明，使用末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记(Terminaldeoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)进行细胞凋亡分析(图4)。简言之，牛角膜内皮细胞以1×104个细胞/孔的密度接种在Lab-
Figure BDA0003503905880000101
玻片上24小时，用50μM阿魏酸处理3小时，再与25mM AAPH(2,2’-azobis(2-amidinopropanedihydrochloride)反应6小时。将玻片浸入体积浓度为4％的甲醛中进行固定，用
Figure BDA0003503905880000102
X-100对细胞进行透化处理。接着加入平衡缓冲液、核苷酸混合物及rTdT酶以标记凋亡细胞。最后用碘化丙啶复染细胞核，以荧光显微镜观察。图4中的荧光点代表凋亡细胞(fluorescein-12-dUTP)。
实施例5含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基有效减少基质的膨胀
具有完整眼睑保护角膜表面的去核兔眼取自纽西兰兔，置于Hank平衡盐溶液(pH7.4)中。手术切除眼睑及眼肌后，兔角膜分别在含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基及M199培养基中4℃保存14天。之后，角膜组织立即用体积浓度为4％甲醛固定，石蜡包埋。4mm切片以H&E染色，并在光学显微镜下观察。此外，将切片用40,6-二脒基-2-苯基吲哚(40,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核染色并在荧光显微镜下检查(图5)。含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基有效地减少了基质的膨胀。
实施例6含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基可保持角膜内皮细胞之间的连结完好，并保持细胞核形状均匀完整
对兔角膜全片进行免疫染色，首先将组织去核并在含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基中4℃保存7天，然后将角膜切下并在20mM EDTA中于37℃培养30分钟，并在室温下在PBS、质量/体积浓度为0.2％的TritonX-100、质量/体积浓度为1％的BSA中阻隔1小时。抗ZO-1抗体(1:400；Sigma)以阻隔溶液制备，并与兔角膜在4℃下过夜培养。最后用PBS洗涤角膜，在室温下用适当的二抗培养3小时，并用DAPI复染。图6显示，含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基可保持角膜内皮细胞之间的连结完好，并保持细胞核形状均匀完整。
实施例7：含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基可维持角膜内皮细胞存活
Live/Dead staining kit使用两种荧光染剂，钙黄绿素-AM及乙锭二聚体(ethidium homodimer,EthD-1)。钙黄绿素-AM是一种非荧光分子，可以在细胞内被酯酶水解为带高负电荷的绿荧光钙黄绿素。EthD-1是一种高亲和性核酸染剂，在与DNA结合之前仅有微弱荧光，在死细胞中产生亮红色荧光。兔角膜分别在LCD培养基(含有γ-PGA及阿魏酸的储存培养基)及Optisol-GS中4℃保存14天及21天，接着除去培养基并用PBS洗涤3次，最后在角膜内皮层上加入Live/Dead staining药剂3分钟，立即用荧光显微镜观察(图7)。
前述本发明的示例性实施例仅出于说明及描述的目的而呈现并不旨在穷举或将本发明限制为所揭露的精确形式。根据上述教示，可以有许多修改及变化。
实施例的挑选及描述是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够利用本发明、各种实施例以及适合于预期的特定用途的各种修改。在不脱离本发明的精神及范围的情况下，替代实施例对于本发明所属领域的技术人员是显而易见的。因此，本发明的范围由所附权利要求来限定，而非前述实施方式及其中描述的示例性实施例。
在本发明的描述中引用及讨论了一些参考文献，包括专利、专利申请及各种出版物。此类参考文献的引用及/或讨论仅用于阐明本发明的描述，并非承认任何此类参考文献是本文所述发明的「先前技术」。本说明书中引用及讨论的所有参考文献均通过引用以其整体并入本文，其程度等同于每个参考文献均通过引用单独并入。

Claims (14)

1.一种角膜储存组合物，其特征在于，包含：
(a)一已缓冲、已平衡、具有营养及电解质之水溶液；
(b)γ-谷胺酸(γ-PGA)；及
(c)阿魏酸(ferulic acid)。
2.如权利要求1所述的角膜储存组合物，其特征在于，γ-谷胺酸的质量/体积浓度为1至5％。
3.如权利要求1所述的角角膜储存组合物，其中阿魏酸的浓度范围为0.1至5mM。
4.如权利要求1所述的角角膜储存组合物，进一步包含至少一种选自表皮生长因子、原半胱胺酸、胸腺素β4及D-甘露糖-6-磷酸。
5.如权利要求4所述的角膜储存组合物，其特征在于，表皮生长因子、原半胱胺酸、胸腺素β4及D-甘露糖-6-磷酸的浓度分别为5至1000ng/ml、10至500μM、10至500μM及50至1000μM。
6.如权利要求1所述的角膜储存组合物，其特征在于，进一步包含表皮生长因子、原半胱胺酸、胸腺素β4及D-甘露糖-6-磷酸。
7.如权利要求1所述的角膜储存组合物，其特征在于，不含右旋糖酐及硫酸软骨素。
8.如权利要求1所述的角膜储存组合物，其特征在于，不含葡萄糖。
9.如权利要求1所述的角膜储存组合物，其不含β-巯乙醇。
10.一种用于储藏及保存角膜组织的方法，其特征在于，包含：
将一角膜组织置于如权利要求1之角膜储存组合物中。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该角膜组织的细胞存活维持至少14天。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，进一步包含将角膜储存组合物的温度保持在2至8℃。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，进一步包含将角膜储存组合物的温度保持在4℃。
14.一种减少保存过程中角膜组织肿胀的方法，其特征在于，包含：将一角膜组织置于如权利要求1所述的角膜储存组合物中。
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