CN111955455A - 维持角膜活性的保存液 - Google Patents

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Abstract

本发明的维持角膜活性的保存液，包括角膜基础保存液和一氧化氮纳米泡，一氧化氮纳米泡均匀地分散于角膜基础保存液中。角膜基础保存液包括聚谷氨酸10.0g/L、泊洛沙姆10g/L、胆红素50mg/L、表皮细胞生长因子5mg/L。一氧化氮纳米泡是由蛋黄磷脂为泡膜材料包裹一氧化氮气体形成的泡囊组成，在角膜基础保存液中的浓度为1×106～5×106个/mL。本发明的保存液用于角膜的体外保存。

Description

维持角膜活性的保存液
技术领域
本发明涉及一种维持角膜活性的保存液，特别涉及一种维持角膜活性的体外保存溶液。
背景技术
近年来，角膜疾病已成为我国第二大致盲性眼病。但作为一种可治性盲，通过进行板层或穿透性角膜移植手术即可使患者重获光明。由于我国国情所限，可供移植的角膜材料相对匮乏且分配不均，临床上使用的角膜材料相当一部分需要经过不同时间的保存。
角膜内皮为角膜内侧的单层细胞，可不断排出基质中水分而保持角膜透明。角膜内皮作为眼表的重要屏障，其完整性对角膜移植，尤其是角膜缘组织移植的成功与否有着重要影响，长期角膜内皮缺损会引起创口迁延不愈，角膜基质浑浊、瘢痕形成，新生血管形成，最终导致移植失败。因此，角膜内皮细胞数量和活力对于角膜移植的术后效果具有重要影响。
多项研究表明，角膜内皮活细胞数量会随着保存时间延长而逐渐减少，从而无法用于角膜移植，因此，为了进一步的适应临床应用的需要，开发一种即能延长角膜内皮细胞活性的保存时间又能够有效维持内皮细胞活性的保存液已经成为制约角膜移植治疗发展的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于克服制约角膜治疗技术发展的瓶颈，提供一种提高角膜内皮细胞活性和延长保存时间的保存溶液，保证角膜的生物活性，同时满足临床角膜移植治疗的安全、有效、便捷、经济的要求。
本发明申请人发现，适宜浓度的一氧化氮气体对于角膜的物活性具有显著作用，但这种作用受到多方面因素的影响，尤其是微环境，对于一氧化氮气体发挥角膜保护作用影响显著。但一氧化氮(NO)微溶于水，无法直接应用于角膜保存液中。已有报道的用于补充体内一氧化氮的方法多是应用一氧化氮供体化合物。一氧化氮供体化合物分为两类：非酶生型和酶生型。非酶生型一氧化氮供体化合物大部分来自硝基化合物，包括硝普盐、有机或无机亚硝酸盐和硝酸盐、亚硝胺、氮芥、联氨等，剂量小且毒副作用大。而酶生型一氧化氮供体化合物(如精氨酸)需要通过体内生物酶等作用分解产生出一氧化氮分子。以上这些一氧化氮供体化合物都无法直接应用于角膜保存液中。此外，表皮细胞生长因子对于角膜具有一定保护作用，但单独应用表皮细胞生长因子对于表皮细胞有损伤的角膜，保护效果并不理想。
本发明申请人通过大量实验，制备出维持角膜活性的保存液，该保存液包括角膜基础保存液和一氧化氮纳米泡，一氧化氮纳米泡均匀地分散于角膜基础保存液中。
上述的角膜基础保存液包括：聚谷氨酸10.0g/L、泊洛沙姆10g/L、胆红素50mg/L、表皮细胞生长因子5mg/L。
上述的角膜基础保存液中进一步加入：糖、电解质盐、抗凝剂、氨基酸、pH值缓冲剂、抗菌剂和抗氧化剂。
上述的一氧化氮纳米泡是由蛋黄磷脂为泡膜材料包裹一氧化氮气体形成的泡囊组成。
上述的一氧化氮纳米泡的粒径范围为500～900nm。
上述的一氧化氮纳米泡的优选粒径范围为600～800nm。
上述的一氧化氮纳米泡在角膜基础保存液中的浓度为1×106～5×106个/mL。
上述维持角膜活性的保存液的使用温度为0～37℃。
上述维持角膜活性的保存液的优选使用温度为15～20℃。
上述维持角膜活性的保存液用于角膜的体外保存。
本发明的维持角膜活性的保存液与现有的角膜保存液相比，具有以下优点：①保存液中各组分发挥协同作用，特别是聚谷氨酸、泊洛沙姆、胆红素和表皮细胞生长因子，对于一氧化氮纳米泡起到协同增效作用；②不使用任何一氧化氮供体化合物，不会因为一氧化氮供体化合物对机体组织产生不良反应和毒副作用；③一氧化氮纳米泡是由蛋黄磷脂为泡膜材料包裹一氧化氮气体形成的泡囊组成，对角膜具有良好的亲和性和生物相容性；④使用温度范围较宽，满足医疗储存和运输的需要；⑤对于角膜活性保持时间长，能最大程度地保持角膜的生物学活性。
具体实施方式
下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1 角膜保存液的制备
实验组的维持角膜活性的保存液的制备如下：
(1)一氧化氮纳米泡的制备：5mL甘油和45mL磷酸盐缓冲液混合，加热至65℃，加入蛋黄磷脂，混匀后转入具塞保温耐压容器中，抽真空后注入一氧化氮气体，通过漩涡混合器高速振荡3min，高压通过规定孔径筛网进行粒径均化处理，即得一氧化氮纳米泡溶液。
(2)配制角膜基础保存液，角膜基础保存液中各组分浓度：聚谷氨酸10.0g/L、泊洛沙姆10g/L、胆红素50mg/L、表皮细胞生长因子5mg/L，然后与步骤(1)制备的一氧化氮纳米泡溶液混合，按照表1的设计，调整一氧化氮纳米泡的浓度，规定温度下密封避光放置。
对照组的维持红细胞活性的保存液制备方法参考实验组进行。各个实验组是根据本申请权利要求项保护范围内的组分和比例配置的，而各个对照组是某项组分缺失或组分质量百分含量超出本申请权利要求项保护的范围。
表1 实验组和对照组的维持角膜活性保存液的组成
Figure BSA0000216752530000031
注：“√”代表该项角膜基础保存液为实施例1的配方制备；“/”代表该项不存在；NO代表一氧化氮气体；O2代表氧气；N2代表氮气；*不同比例的保存液：聚谷氨酸5.0g/L、泊洛沙姆10g/L、胆红素5mg/L、表皮细胞生长因子5mg/L；#单一成分替换保存液A、B、C和D：分别对应单一组分被其它等浓度组分替换的四组保存液，依次是聚谷氨酸替换为低分子右旋糖酐、泊洛沙姆替换为硫酸软骨素、胆红素替换为维生素C、表皮细胞生长因子替换为角质细胞生长因子-2。
实施例2 维持角膜活性的保存液应用效果
本实施例应用实施例1的制备的角膜保存溶液用于原代大鼠角膜保存的效果评价。
角膜的获取：新西兰大白兔，处死后，取出眼球，含抗生素的无菌生理盐水冲洗浸泡，无菌条件下沿巩膜外1～2mm处剪取完整兔角膜，分别在本发明实验组和对照组的角膜保存液中，在表1规定的温度环境避光保存20天，每天更换保存液。20天后取出角膜经过锥兰-茜素红内皮染色、计数内皮细胞密度，使用TUNEL方法计算内皮细胞凋亡率，指标测定结果见表2。
表2实验组和对照组的角膜存活率结果
组别 内皮细胞活性计数(个/mm<sup>2</sup>) 内皮细胞凋亡率(％)
实验组1 2686 7.8
实验组2 2712 7.3
实验组3 2803 6.6
实验组4 2764 6.9
实验组5 2722 7.2
实验组6 2826 6.5
对照组1 1304 17.7
对照组2 1391 17.1
对照组3 1855 13.4
对照组4 1616 14.3
对照组5 1562 13.3
对照组6 1659 13.3
对照组7 1552 16.1
对照组8 1932 13.5
对照组9 1341 17.5
对照组10 2158 12.0
对照组11 712 21.7
对照组12 1312 17.7
对照组13 1942 13.5
对照组14 1863 14.0
对照组15 2043 12.8
对照组16 2367 10.6
对照组17 1235 18.2
对照组18 531 22.9
从表2结果可见，各实验组对于大白兔角膜的生物活性起到良好的保护作用，角膜内皮细胞形态规则，活性计数在2600个/mm2以上，内皮细胞凋亡率在8％以下，特别是实验组6，对于角膜的生物活性维持的最好。相比实验组，对照组角膜的生物活性保存效果明显较差，特别是对照组1、2、7、9、11、12、17和18，角膜内皮细胞的变形及融合现象增多，规则的六边形内皮细胞数量明显下降，证明缺乏本发明技术保护方案中的任一组分和条件，都会对角膜的生物活性产生明显的破坏。表2的结果证明，本发明的维持角膜活性的保存液能明显延长角膜活性的保存时间，具有良好的应用开发前景。
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.维持角膜活性的保存液，其主要特征在于：所述的保存液包括角膜基础保存液和一氧化氮纳米泡，一氧化氮纳米泡均匀地分散于角膜基础保存液中。
2.根据权利要求1的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述的角膜基础保存液包括：聚谷氨酸10.0g/L、泊洛沙姆10g/L、胆红素50mg/L、表皮细胞生长因子5mg/L。
3.根据权利要求2的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述的角膜基础保存液中进一步加入：糖、电解质盐、抗凝剂、氨基酸、pH值缓冲剂、抗菌剂和抗氧化剂。
4.根据权利要求1的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述的一氧化氮纳米泡是由蛋黄磷脂为泡膜材料包裹一氧化氮气体形成的泡囊组成。
5.根据权利要求1的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述的一氧化氮纳米泡的粒径范围为500～900nm。
6.根据权利要求5的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述的一氧化氮纳米泡的粒径范围为600～800nm。
7.根据权利要求1的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述的一氧化氮纳米泡在角膜基础保存液中的浓度为1×106～5×106个/mL。
8.根据权利要求1的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述维持角膜活性的保存液的使用温度为0～37℃。
9.根据权利要求1的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述维持角膜活性的保存液的使用温度为15～20℃。
10.根据权利要求1～9任一项所述的维持角膜活性的保存液，其特征是：所述维持角膜活性的保存液用于角膜的体外保存。
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