CN105284788A - 一种角膜中期保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种角膜中期保存液及其制备方法，该角膜中期保存液为含有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、胎牛血清、妥布霉素、Hepes和雷帕霉素的MEM细胞培养基，其中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20～26g/L、低分子右旋糖酐8～12g/L、L-谷氨酰氨0.37～0.38mg/L、胎牛血清2～5.5％、妥布霉素0.08～0.12g/L、Hepes？9～10g/L、雷帕霉素0.9～1.1nM/L。本发明的角膜中期保存液可保护角膜内皮细胞，避免因长时间保存而出现的内皮细胞坏死及融合现象，更有效地延长角膜保存时间。
Description
技术领域
本发明属于角膜保存液制备技术领域，具体涉及一种角膜中期保存液及其制备方法。
背景技术
近年来，角膜疾病己成为我国第二大致盲性眼病。但作为一种可治性眼病，通过进行板层或穿透性角膜移植手术即可使患者重获光明。按对内皮细胞活性的保存时间，角膜保存可分为短期、中期和长期保存，中期保存是通过保存液4℃下使角膜内皮细胞活性保持4天以上的方法，由于操作简便易行，其已成为目前世界上眼库广泛使用的角膜保存方法。
角膜内皮为角膜内侧的单层细胞，可不断排出基质中水分而保持角膜透明。角膜内皮不可逆的损伤将导致角膜混浊，透明度下降，角膜内皮细胞数量和活力对于穿透角膜移植的术后效果具有重要影响。多项研究表明角膜内皮活细胞数量会随着保存时间延长而逐渐减少，从而无法用于穿透性角膜移植，因此有必要提供一种即能提高角膜内皮细胞活性和延长保存时间的中期角膜液。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种角膜中期保存液及其制备方法，可保护角膜内皮细胞，避免因长时间保存而出现的内皮细胞坏死及融合现象，更有效地延长角膜保存时间。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种角膜中期保存液，该角膜中期保存液为含有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、胎牛血清、妥布霉素、Hepes和雷帕霉素的MEM细胞培养基，其中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20～26g/L、低分子右旋糖酐8～12g/L、L-谷氨酰氨0.37～0.38mg/L、胎牛血清2～5.5％、妥布霉素0.08～0.12g/L、Hepes9～10g/L、雷帕霉素0.9～1.1nM/L。
一实施例中：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素25g/L、低分子右旋糖酐10g/L、L-谷氨酰氨0.375mg/L、胎牛血清5％、妥布霉素0.1g/L、Hepes9.5g/L、雷帕霉素1nM/L。
一实施例中：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素21g/L、低分子右旋糖酐9g/L、L-谷氨酰氨0.372mg/L、胎牛血清3％、妥布霉素0.09g/L、Hepes9.2g/L、雷帕霉素0.95nM/L。其余同实施例1。
一实施例中：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素24g/L、低分子右旋糖酐11g/L、L-谷氨酰氨0.378mg/L、胎牛血清4％、妥布霉素0.11g/L、Hepes9.8g/L、雷帕霉素1.05nM/L。
一实施例中：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素22g/L、低分子右旋糖酐10.5g/L、L-谷氨酰氨0.373mg/L、胎牛血清2.5％、妥布霉素0.105g/L、Hepes9.6g/L、雷帕霉素1.02nM/L。
一实施例中：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素23g/L、低分子右旋糖酐9.5g/L、L-谷氨酰氨0.376mg/L、胎牛血清3.5％、妥布霉素0.095g/L、Hepes9.3g/L、雷帕霉素0.98nM/L。
一实施例中：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20g/L、低分子右旋糖酐8g/L、L-谷氨酰氨0.37mg/L、胎牛血清5.5％、妥布霉素0.12g/L、Hepes10g/L、雷帕霉素0.9nM/L；或：硫酸软骨素26g/L、低分子右旋糖酐12g/L、L-谷氨酰氨0.38mg/L、胎牛血清2％、妥布霉素0.08g/L、Hepes9g/L、雷帕霉素1.1nM/L。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
上述角膜中期保存液的制备方法，在无菌条件下进行，包括：
1)配制MEM培养基；
2)取硫酸软骨素配制成硫酸软骨素溶液；取低分子右旋糖酐配制成低分子右旋糖酐溶液；
3)按照硫酸软骨素，低分子右旋糖酐和妥布霉素的终浓度分别为20～26g/L，8～12g/L和0.08～0.12g/L的比例，在步骤1)的MEM培养基中加入相应量的步骤2)的硫酸软骨素溶液，低分子右旋糖酐溶液，及妥布霉素；
4)用Hepes调整步骤3)得到的混合液pH值至7.2～7.4，得到所述角膜中期保存液的储存液；
5)使用前，在步骤4)的储存液中加入L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素，并使L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素的终浓度分别为0.37～0.38mg/L，2～5.5％和0.9～1.1nM/L，即得所述之角膜中期保存液。
一实施例中：所述步骤1)中，取MEM培养基粉末9.4g加入注射用水500ml配制得到MEM培养基；所述步骤2)中，配制125g/L的硫酸软骨素溶液和100g/L的低分子右旋糖酐溶液；所述步骤3)中，MEM培养基，硫酸软骨素溶液，低分子右旋糖酐溶液和妥布霉素的配方比例为500ml：200ml：100ml：0.1g；所述步骤4)中，Hepes调节pH值后定容至终体积为1000ml。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
上述角膜中期保存液的用途，所述用途是指通过维持角膜内皮细胞活性及正常形态和/或降低离体角膜内皮细胞的凋亡来延长角膜保存时间。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明的角膜中期保存液通过各组分的协同增效，不仅能维持角膜内皮细胞活性及正常形态，还能增强角膜内皮细胞的存活能力，尤其是中长期保存效果更为明显，长期保存未出现对照组角膜内皮细胞变形、坏死、细胞融合等现象，与保存短时间的角膜内皮形态一致，细胞仍规则，细胞融合现象少，本发明的保存液能够很好的避免离体角膜材料保存中存在的内皮细胞凋亡现象，可使角膜在较长的保存时间内维持透明的特性。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1
一种角膜中期保存液，该角膜中期保存液为含有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、胎牛血清、妥布霉素、Hepes和雷帕霉素的MEM细胞培养基，其中各组分的浓度如下：硫酸软骨素25g/L、低分子右旋糖酐10g/L、L-谷氨酰氨0.375mg/L、胎牛血清5％、妥布霉素0.1g/L、Hepes9.5g/L、雷帕霉素1nM/L。
上述角膜中期保存液的制备方法包括：
1)按照MEM培养基的说明书，取MEM培养基粉末9.4g加入注射用水500ml，溶解后过滤灭菌，配制得到MEM培养基；
2)取硫酸软骨素25g加入注射用水200ml，溶解后过滤灭菌，配制成125g/L的硫酸软骨素溶液；取低分子右旋糖酐(平均分子量20000～40000kD)10g加入注射用水100ml，溶解后过滤灭菌，配制成100g/L的低分子右旋糖酐溶液；
3)取无菌容器，加入步骤1)的MEM培养基500ml，步骤2)的125g/L硫酸软骨素溶液200ml和100g/L的低分子右旋糖酐溶液100ml，并加入妥布霉素0.1g；
4)用Hepes调整步骤3)得到的混合液pH值至7.2～7.4，加入注射用水至终体积为1000ml，使得硫酸软骨素，低分子右旋糖酐和妥布霉素的终浓度分别为25g/L，10g/L和0.1g/L，得到所述角膜中期保存液的储存液；检测渗透压300～380mOsm/kgH2O，将该储存液分装为每10ml一支的安瓶，冷藏，经细菌、真菌培养检测，备用；
5)使用前，在步骤4)的储存液中加入L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素，并使L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素的终浓度分别为0.375mg/L，5％和1nM/L，即得所述之角膜中期保存液。
实施例2
本实施例之中，所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素21g/L、低分子右旋糖酐9g/L、L-谷氨酰氨0.372mg/L、胎牛血清3％、妥布霉素0.09g/L、Hepes9.2g/L、雷帕霉素0.95nM/L。其余同实施例1。
实施例3
本实施例之中，所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素24g/L、低分子右旋糖酐11g/L、L-谷氨酰氨0.378mg/L、胎牛血清4％、妥布霉素0.11g/L、Hepes9.8g/L、雷帕霉素1.05nM/L。
实施例4
本实施例之中，所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素22g/L、低分子右旋糖酐10.5g/L、L-谷氨酰氨0.373mg/L、胎牛血清2.5％、妥布霉素0.105g/L、Hepes9.6g/L、雷帕霉素1.02nM/L。
实施例5
本实施例之中，所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素23g/L、低分子右旋糖酐9.5g/L、L-谷氨酰氨0.376mg/L、胎牛血清3.5％、妥布霉素0.095g/L、Hepes9.3g/L、雷帕霉素0.98nM/L。
实施例6
本实施例之中，所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20g/L、低分子右旋糖酐8g/L、L-谷氨酰氨0.37mg/L、胎牛血清5.5％、妥布霉素0.12g/L、Hepes10g/L、雷帕霉素0.9nM/L。
实施例7
本实施例之中，所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素26g/L、低分子右旋糖酐12g/L、L-谷氨酰氨0.38mg/L、胎牛血清2％、妥布霉素0.08g/L、Hepes9g/L、雷帕霉素1.1nM/L。
上述实施例均可实现下述实验例之效果：
实验例1：本发明的角膜中期保存液的保存效果检测
角膜内皮细胞活性检测：角膜片的保存步骤如下：新西兰大白兔，处死后，取出眼球，含抗生素的无菌生理盐水冲洗浸泡，无菌条件下沿巩膜外1～2mm处剪取完整兔角膜，分别在本发明的角膜中期保存液和作为对照的角膜活性保存液中4℃保存0天、4天、7天和14天。
角膜内皮细胞凋亡情况检测：钻取兔角膜中央8mm范围角膜片，分别在本发明的角膜中期保存液和作为对照的角膜活性保存液中于4℃保存0天、4天、7天和14天。取出角膜片行锥兰-茜素红内皮染色、计数内皮细胞密度，并使用TUNEL方法计数凋亡细胞数量。
结果如表1和表2所示，随着保存时间延长，作为对照的角膜活性保存液保存的角膜因内皮细胞的变形及融合现象增多，规则的六边形内皮细胞数量明显下降；而本发明的角膜中期保存液诱导了自噬的发生，随保存时间的延长，可以明显降低内皮细胞的变形及融合。
表l：两种保存液中角膜内皮细胞计数统计
表2：两种保存液中角膜内皮细胞凋亡数量计数统计
实验例2：本发明的角膜中期保存液的应用病例1
实施例1的角膜中期保存液保存人角膜1周后，用于穿透性角膜移植。
方法：取临床移植后新鲜角膜环保存于本发明的角膜中期保存液中，4℃冷藏保存1周。以角膜白斑患者行穿透性角膜移植，常规术前准备，取出保存的角膜片，无菌生理盐水冲洗，行穿透性角膜移植。
结果：术后移植角膜植片愈合良好，无感染，无充血，无排斥反应，角膜术后一年患者视力由0.6提升至1.0。
实验例3：本发明的角膜中期保存液的应用病例2
实施例2的角膜中期保存液保存人角膜2周后，用于穿透性角膜移植。
方法：取临床移植后新鲜角膜环保存于本发明的角膜中期保存液中，4℃冷藏保存2周。以圆锥角膜患者行穿透性角膜移植，常规术前准备，取出保存的角膜片，无菌生理盐水冲洗，行穿透性角膜移植。
结果：术后移植角植片愈合良好，无感染，无充血，无排斥反应，角膜术后一年患者视力由0.1提升至0.5。
本领域技术人员可知，当本发明的技术参数在如下范围内变化时，可以预期得到与上述实施例相同或相近的技术效果：
一种角膜中期保存液，该角膜中期保存液为含有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、胎牛血清、妥布霉素、Hepes和雷帕霉素的MEM细胞培养基，其中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20～26g/L、低分子右旋糖酐8～12g/L、L-谷氨酰氨0.37～0.38mg/L、胎牛血清2～5.5％、妥布霉素0.08～0.12g/L、Hepes9～10g/L、雷帕霉素0.9～1.1nM/L。
上述角膜中期保存液的制备方法，在无菌条件下进行，包括：
1)配制MEM培养基；
2)取硫酸软骨素配制成硫酸软骨素溶液；取低分子右旋糖酐配制成低分子右旋糖酐溶液；
3)按照硫酸软骨素，低分子右旋糖酐和妥布霉素的终浓度分别为20～26g/L，8～12g/L和0.08～0.12g/L的比例，在步骤1)的MEM培养基中加入相应量的步骤2)的硫酸软骨素溶液，低分子右旋糖酐溶液，及妥布霉素；
4)用Hepes调整步骤3)得到的混合液pH值至7.2～7.4，得到所述角膜中期保存液的储存液；
5)使用前，在步骤4)的储存液中加入L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素，并使L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素的终浓度分别为0.37～0.38mg/L，2～5.5％和0.9～1.1nM/L，即得所述之角膜中期保存液。
所述步骤1)中，取MEM培养基粉末9.4g加入注射用水500ml配制得到MEM培养基；所述步骤2)中，配制125g/L的硫酸软骨素溶液和100g/L的低分子右旋糖酐溶液；所述步骤3)中，MEM培养基，硫酸软骨素溶液，低分子右旋糖酐溶液和妥布霉素的配方比例为500ml：200ml：100ml：0.1g；所述步骤4)中，Hepes调节pH值后定容至终体积为1000ml。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种角膜中期保存液，其特征在于：该角膜中期保存液为含有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、胎牛血清、妥布霉素、Hepes和雷帕霉素的MEM细胞培养基，其中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20～26g/L、低分子右旋糖酐8～12g/L、L-谷氨酰氨0.37～0.38mg/L、胎牛血清2～5.5％、妥布霉素0.08～0.12g/L、Hepes9～10g/L、雷帕霉素0.9～1.1nM/L。
2.根据权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素25g/L、低分子右旋糖酐10g/L、L-谷氨酰氨0.375mg/L、胎牛血清5％、妥布霉素0.1g/L、Hepes9.5g/L、雷帕霉素1nM/L。
3.根据权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素21g/L、低分子右旋糖酐9g/L、L-谷氨酰氨0.372mg/L、胎牛血清3％、妥布霉素0.09g/L、Hepes9.2g/L、雷帕霉素0.95nM/L。其余同实施例1。
4.根据权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素24g/L、低分子右旋糖酐11g/L、L-谷氨酰氨0.378mg/L、胎牛血清4％、妥布霉素0.11g/L、Hepes9.8g/L、雷帕霉素1.05nM/L。
5.根据权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素22g/L、低分子右旋糖酐10.5g/L、L-谷氨酰氨0.373mg/L、胎牛血清2.5％、妥布霉素0.105g/L、Hepes9.6g/L、雷帕霉素1.02nM/L。
6.根据权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素23g/L、低分子右旋糖酐9.5g/L、L-谷氨酰氨0.376mg/L、胎牛血清3.5％、妥布霉素0.095g/L、Hepes9.3g/L、雷帕霉素0.98nM/L。
7.根据权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于：所述角膜中期保存液中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20g/L、低分子右旋糖酐8g/L、L-谷氨酰氨0.37mg/L、胎牛血清5.5％、妥布霉素0.12g/L、Hepes10g/L、雷帕霉素0.9nM/L；或：硫酸软骨素26g/L、低分子右旋糖酐12g/L、L-谷氨酰氨0.38mg/L、胎牛血清2％、妥布霉素0.08g/L、Hepes9g/L、雷帕霉素1.1nM/L。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的一种角膜中期保存液的制备方法，其特征在于：在无菌条件下进行，包括：
1)配制MEM培养基；
2)取硫酸软骨素配制成硫酸软骨素溶液；取低分子右旋糖酐配制成低分子右旋糖酐溶液；
3)按照硫酸软骨素，低分子右旋糖酐和妥布霉素的终浓度分别为20～26g/L，8～12g/L和0.08～0.12g/L的比例，在步骤1)的MEM培养基中加入相应量的步骤2)的硫酸软骨素溶液，低分子右旋糖酐溶液，及妥布霉素；
4)用Hepes调整步骤3)得到的混合液pH值至7.2～7.4，得到所述角膜中期保存液的储存液；
5)使用前，在步骤4)的储存液中加入L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素，并使L-谷氨酰氨，胎牛血清和雷帕霉素的终浓度分别为0.37～0.38mg/L，2～5.5％和0.9～1.1nM/L，即得所述之角膜中期保存液。
9.根据权利要求8所述的一种角膜中期保存液的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，取MEM培养基粉末9.4g加入注射用水500ml配制得到MEM培养基；所述步骤2)中，配制125g/L的硫酸软骨素溶液和100g/L的低分子右旋糖酐溶液；所述步骤3)中，MEM培养基，硫酸软骨素溶液，低分子右旋糖酐溶液和妥布霉素的配方比例为500ml：200ml：100ml：0.1g；所述步骤4)中，Hepes调节pH值后定容至终体积为1000ml。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的角膜中期保存液的用途，所述用途是指通过维持角膜内皮细胞活性及正常形态和/或降低离体角膜内皮细胞的凋亡来延长角膜保存时间。
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