CN103931614B - 一种植物病原细菌杀/抑菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物病原细菌杀/抑菌剂及其应用，本发明首次直接利用D型氨基酸作为杀/抑菌剂，用D型氨基酸干扰植物病原细菌的生理代谢，诱发病原菌产生丝状或长形的细胞，阻止病原细菌的种群增殖，使得细菌死亡，对常见的植物病原细菌有直接的杀伤和抑制作用，为植物病害的防治提供了一类新型药剂。D型氨基酸对人体无毒害作用，能够生物合成或化学合成，相对于传统的植物病害防治药剂具有安全无污染、高效、快速、成本低廉、增效组合多等优点，可以有效减少和不使用有害农药，具有广阔的应用前景。

Description

一种植物病原细菌杀/抑菌剂及其应用

技术领域

本发明属于制药领域，具体地说，涉及一种植物病原细菌杀/抑菌剂及其应用。

背景技术

微生物感染导致的植物病害，每年导致全球大量的农作物和经济作物减产。无论是粮食作物如水稻、玉米、小麦、还是经济作物、蔬菜水果如油菜、白菜、柑橘、柠檬、苹果等，都会由于微生物的侵染导致减产和产品品质下降甚至导致植株死亡，造成巨大的经济损失。

传统防治方式中，对植物细菌性病害采取抗生素和金属离子等方法进行防治，这容易导致细菌的耐药性大大增强，环境中重金属和抗生素的残留，从而影响植物产品品质，同时污染环境，引起恶性循环和极为不安全的食品隐患。一些植物病害如柑橘黄龙病，目前尚无有效治疗方法，人们不得不采取焚烧病树的办法进行防治；稻瘟病和水稻白叶枯病有时甚至使得作物颗粒无收。

氨基酸是一类具有手性的化合物，同一氨基酸具有同分异构体。组成蛋白质的氨基酸为左旋的L型氨基酸，用于蛋白质的合成和代谢。而右旋的D型氨基酸不参与蛋白质合成，不被核糖体识别，具有独立的产生系统，被称为非蛋白质合成氨基酸。在细菌中，D型氨基酸参与肽聚糖的合成组成细胞壁。长期以来，对D型氨基酸对细菌生理作用的研究甚少。近年Illana Kolodkin-Gald等发现D型氨基酸对细菌的菌膜具有降解作用(Illana Kolodkin-Gal etal.2010.Science)，可能是一种广泛的瓦解菌膜的信号分子。

目前关于D型氨基酸作用于微生物的两个发明专利（用于处理生物薄膜的D-氨基酸，公开号为CN102791262A；一种抗菌药物组合物及其应用，公开号为CN102871996A）提出通过添加D型氨基酸降解微生物的菌膜，从而提高微生物的药物敏感性，然后混合抗生素类药物，进而杀死微生物的办法，其D型氨基酸的作用均为抑制菌膜的产生，并且针对靶标微生物均为对人体有害的微生物上。目前尚未有报道D型氨基酸有直接的改变细菌形态和杀灭有害植物病原菌的作用。

发明内容

本发明的目的是提供D型氨基酸在对植物病原细菌的杀/抑菌中的应用。

本发明的另一目的是提供一种植物病原细菌杀/抑菌剂。

为了实现本发明目的，本发明的一种植物病原细菌杀/抑菌剂，主要成分为D型氨基酸。

为了提高D型氨基酸在实际应用时在植物表面的附着能力，所述植物病原细菌杀/抑菌剂还添加有表面活性剂，所述表面活性剂为吐温80或吐温20或塞班80或曲拉通X100，所述表面活性剂的重量/体积百分比为0.005～0.1%。

优选地，所述D型氨基酸为D-甘氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-脯氨酸、D-色氨酸、D-丝氨酸、D-酪氨酸、D-半胱氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酰胺、D-苏氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸赖氨酸、D-精氨酸和D-组氨酸中的一种或多种组合。所述D型氨基酸的浓度范围是0.01～50mmol/L。

本发明的植物病原细菌杀/抑菌剂的抗菌谱为革兰氏阴性细菌，对西葫芦茎基腐病、甜瓜细菌性软腐病、烟草青枯病、辣椒青枯病、辣椒细菌性叶斑病、大葱、洋葱球茎腐烂病、姜瘟病、茄子细菌性褐斑病、猕猴桃溃疡病、茄子软腐病、甜椒辣椒软腐病、大白菜软腐病、柑桔溃疡病、水稻白叶枯病、水稻细条病等植物细菌性病害病原菌都有杀灭/抑制作用。

将植物病原细菌用D型氨基酸处理后在显微镜下观察，看到植物病原细菌4个明显形态变化：

1.细胞增大期：在细菌接触到浓度为0.001-50mmol/L之间的D型氨基酸后0～3h内，细胞停止分裂，但是细胞膨大为原来体积的8～25倍。细菌的鞭毛可以在光学显微镜下直接观察到。有鞭毛的病原菌运动能力开始减弱或失去。

2.丝状联合细胞期：变大后的细胞在3～12h内细胞原生质继续分裂，但细胞壁并不分开，形成长条联合细胞。该长条联合细胞中常可以包含10-30个以上的单个巨大细胞，总长度可以增加到正常菌体的50倍以上。在此阶段，黄单胞杆菌多个长条细胞首尾相连，变为丝状链状杆菌的形态；长条联合细胞失去鞭毛，丧失运动能力。

3.细胞死亡期：形成长条或丝状的联合细胞，在12～24h内原生质体膨胀为球状，突出细胞壁，然后破裂，原生质溢出，导致细胞死亡。

4.空泡期：D型氨基酸处理24h以后，丝状联合细胞中包含的巨大细胞原生质体已经全部溢出，留下丝状的长形中空细胞壁。细胞悬浮液中出现大量絮状沉淀。将此悬液接种植物寄主进行生测发现，病原细菌失去侵染和致病能力。

通过以上4个明显形态变化观察，说明D型氨基酸对植物病原细菌有直接的杀灭/抑制作用。

有益效果：本发明首次直接利用D型氨基酸杀灭植物病原细菌，（不需要添加抗生素）用D型氨基酸干扰植物病原细菌的生理代谢，诱发病原菌产生丝状或长形的细胞，阻止病原细菌的种群增殖，使得细菌死亡，为植物病害的防治提供了一类新型药剂，能够对常见的植物病原细菌有直接的杀伤和抑制作用。D型氨基酸对人体无毒害作用，能够生物合成或化学合成，相对于传统的植物病害防治药剂具有安全无污染、高效、快速、成本低廉、增效组合多等优点，可以有效减少和不使用有害农药，具有广阔的应用前景。

说明书附图：

图1为本发明的一具体实施方式用D-亮氨酸对柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)的作用效果观察图；

图2为本发明一具体实施方式用D-亮氨酸杀灭夏橙叶片上的柑橘溃疡病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)结果观察图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用化学试剂均为市售商品，所用D型氨基酸和吐温80均购自Sigma公司，所用病原菌均由发明人从患病植株上分离得到并经过形态和分子验证。实施例一、D-亮氨酸对柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)的作用观察

将两组柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)在LB液体培养基，250rmp/min，28℃条件下培养，第一组作为对照组，第二组用7mol/L浓度的D-亮氨酸处理，显微镜下观察不同时间细菌形态的变化。

如图1所示，图中A为第一组对照组，为正常柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)菌体形态图，培养条件为：LB液体培养基，250rmp/min，28℃。第二组柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)与第一组在相同培养条件下培养，培养10小时候后加入7mol/L浓度D-亮氨酸处理。图1中B为D-亮氨酸处理后3h时柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)形态：细胞长宽高变为原来的2～5倍；C为D-亮氨酸处理后4h时柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)形态：增大的细胞原生质分裂，但细胞壁并不分开，形成长条细胞；D为D-亮氨酸处理后8h时柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)形态：分裂的增大细胞开始形成丝状联合细胞，其中包括串联10-30个以上的单个巨大细胞；E为D-亮氨酸处理后20h时柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)形态：箭头所示为突出细胞壁、膨胀为球状的原生质体；F为D-亮氨酸处理后24h时柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)形态：丝状联合细胞中的巨大细胞质全部溢出细胞壁，留下丝状空腔细胞壁，其中无活体原生质体，细菌死亡。

实施例二、用D-亮氨酸杀灭柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)，按照以下步骤进行：

1.D-亮氨酸的预配：将D-亮氨酸用无菌水配制成10.0mmol/L浓度，总体积定容至100mL。

2.柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)在LB液体培养基、250rmp/min、28℃条件下培养10小时后，加入步骤1配制的D-亮氨酸溶液，至终浓度为2.0mmol/L。

3.继续培养24小时后，显微镜下观察细菌形态，可见原生质体溢出细胞外，细菌成为丝状空腔死亡。

实施例三、用D-蛋氨酸杀灭柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)，按照以下步骤进行：

1.D-蛋氨基酸的预配：将D-蛋氨酸用无菌水配制成10mmol/L浓度，总体积定容至100mL。

2.柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)在LB液体培养基、250rmp/min、28℃条件下培养10小时，加入步骤1配制的D-蛋氨酸溶液，至终浓度为1.0mmol/L。

3.继续培养24小时，显微镜下观察细菌形态，可见原生质体溢出细胞外，细菌成为丝状空腔死亡。

实施例四、用D-半胱氨酸杀灭柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)，按照以下步骤进行：

1.D-半胱氨基酸的预配：将D-半胱氨酸用无菌水配制成50mmol/L浓度，总体积定容至100mL。

2.柑橘溃疡病病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)在LB液体培养基、250rmp/min、28℃条件下培养10小时，加入步骤1配制的D-半胱氨酸溶液，至终浓度为10.0mmol/L。

3.继续培养24小时，显微镜下观察细菌形态，可见原生质体溢出细胞外，细菌成为丝状空腔死亡。

实施例五、用D-色氨酸杀灭大白菜软腐病病原菌（胡萝卜软腐欧文氏菌），按照以下步骤进行：

1.D-色氨基酸的预配：将D-色氨酸以无菌水配制成15mmol/L浓度，总体积定容至100mL。

2.大白菜软腐病病原菌(胡萝卜软腐欧文氏菌)在LB液体培养基、250rmp/min、28℃条件下培养10小时，加入步骤1配制的D-色氨酸溶液，至终浓度为1.0mmol/L。

3.继续培养24小时，显微镜下观察细菌形态，可见原生质体溢出细胞外，细菌成为丝状空腔死亡。

实施例六、用D-缬氨酸杀灭大白菜软腐病病原菌（胡萝卜软腐欧文氏菌），按照以下步骤进行：

1.D-缬氨酸的预配：将D-缬氨酸以无菌水配制成15mmol/L浓度，总体积定容至100mL。

2.大白菜软腐病病原菌(胡萝卜软腐欧文氏菌)在LB液体培养基、250rmp/min、在28℃条件下培养10小时，加入步骤1配制的D-缬氨酸溶液，至终浓度为1.0mmol/L。

3.继续培养24小时，显微镜下观察细菌形态，可见原生质体溢出细胞外，细菌成为丝状空腔死亡。

实施例七、用D型氨基酸混合液杀灭烟草青枯菌(青枯假单胞杆菌)，按照以下步骤进行：

1.D型氨基酸的预配：将D-丝氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、D-丝环氨酸分别以无菌水配制成5mmol/L溶液。

2.混合剂配制：将步骤1配制的溶液等体积混合，得到D-丝氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、D-丝环氨酸终浓度均为1.0mmol/L的D型氨基酸混合液。

3.烟草青枯菌(青枯假单胞杆菌)在LB液体培养基、250rmp/min、28℃条件下培养10小时，加入步骤2配制的D型氨基酸混合液，至4种氨基酸的终浓度为0.2mmol/L。

4.继续培养24小时，显微镜下观察细菌形态，可见原生质体溢出细胞外，细菌成为丝状空腔死亡。

实施例八、用D型氨基酸混合液杀灭猕猴桃溃疡病菌(丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种)，按照以下步骤进行：

1.D型氨基酸的预配：将D-丝氨酸，D-脯氨酸，D-亮氨酸，D-缬氨酸分别以无菌水配制成10mmol/L浓度。

2.混合液配制：将上述药剂混合，得到D-丝氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、D-丝环氨酸终浓度均为2.5mmol/L的D-型氨基酸混合液。

3.混合液使用：猕猴桃溃疡病菌(丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种)在LB液体培养基、250rmp/min、28℃条件下培养10小时，加入配制的D型氨基酸混合液，至4种氨基酸的终浓度为0.5mmol/L。

4.继续培养24小时，显微镜观察细菌形态，可见原生质体溢出细胞外，细菌成为丝状空腔死亡。

实施例九、用D-亮氨酸保护柑橘叶片免于柑橘溃疡病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)侵染，按照以下步骤进行：

1.D-亮基酸的预配：将D-亮氨酸以0.01%表面活性剂吐温80水溶液配制成10mmol/L浓度。

2.将步骤1配制的D-亮氨酸喷雾施于夏橙叶片上，10分钟后以针刺接种法接种柑橘溃疡病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)于叶片上；设置不加D-亮氨酸的0.01%表面活性剂吐温80水溶液喷雾、同样接种柑橘溃疡病菌的植株作为对照；设置用无菌的针刺叶片作为空白对照。

3.步骤2处理7天后观察夏橙叶片，如图2所示，图2-B为叶片背面，其中I表示叶片上用不加D-亮氨酸的0.01%表面活性剂吐温80水溶液喷雾做为对照，接种柑橘溃疡病菌的地方产生明显溃疡病水渍状病斑；III表示用无菌的针刺叶片作为空白对照，并未产生水渍状病斑，只有受针刺后的创伤斑；II表示叶片上喷施D-亮氨酸溶液后接种柑橘溃疡病菌的地方仅有极小水渍状，发病显著较I轻，说明D-亮氨酸能有效抑制病原菌侵染，保护植株不受溃疡病危害。图2-A为叶片正面，可见处理I已经有稍微隆起的病斑，用D-亮氨酸溶液喷雾的处理II发病明显比处理I轻，说明D-亮氨酸对柑橘溃疡病菌(黄单胞菌柑橘致病变种)有杀灭/抑制作用。

Claims (5)

1. D 型氨基酸直接作为植物病原细菌的杀/抑菌剂的应用。

2.一种植物病原细菌杀/抑菌剂，其特征在于：活性成分为D 型氨基酸，还添加有表面活性剂，所述表面活性剂为吐温80或吐温20或塞班80或曲拉通X100。

3.根据权利要求2所述的一种植物病原细菌杀/抑菌剂，其特征在于：

所述D 型氨基酸为D-甘氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-脯氨酸、D-色氨酸、D-丝氨酸、D-酪氨酸、D-半胱氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酰胺、D-苏氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸赖氨酸、D-精氨酸和D-组氨酸中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的一种植物病原细菌杀/抑菌剂，其特征在于：所述D 型氨基酸的浓度范围是0.01～50 mmol/L。

5.根据权利要求2或3所述的一种植物病原细菌杀/抑菌剂，其特征在于：所述表面活性剂的重量/体积百分比为0.005～0.1%。