CN103232965B

CN103232965B - 一株乙羧氟草醚降解芽孢杆菌fc12及其应用

Info

Publication number: CN103232965B
Application number: CN201310203394.6A
Authority: CN
Inventors: 于国权; 周汝祥; 杜刚; 吕良忠
Original assignee: JIANGSU CHANGQING AGRICULTURAL CHEMISTRY CO Ltd
Current assignee: JIANGSU CHANGQING AGRICULTURAL CHEMISTRY CO Ltd
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103232965A

Abstract

本发明提供一种消除废水中乙羧氟草醚残留的降解菌剂，属于生物高技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌FC12，经鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.)。主要生物学特性为G-，直杆状，芽孢椭圆，周生鞭毛运动，大小0.5~2.5×1.2~10μm；接触酶阳性；氧化酶阴性；能水解淀粉，液化明胶。降解菌产品直接施用可使水中农药残留量降低90％上。

Description

一株乙羧氟草醚降解芽孢杆菌FC12及其应用

技术领域

本发明属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解化学农药，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工，具体涉及一株乙羧氟草醚降解芽孢杆菌FC12及其应用。

背景技术

含氟农药是近几十年来使用的新兴农药。氟原子具有半径小、电负性大的特点，将氟原子和含氟基团（如：-CF3）引入到具有生物活性的有机化合物中，能大大提高有机氟化物的稳定性和生理活性，从而成为当今研究和开发的热点。但含氟农药大量使用导致此类农药在土壤和水体环境中的残留，可能会对生态环境和人体健康构成潜在威胁，因此含氟农药在环境中的迁移、转化和分解等环境行为正受到日益关注。

乙羧氟草醚 (Fluoroglycofen-ethyl)，是由美国罗姆–哈斯公司开发的一种二苯醚类除草剂，具有较高脂溶性和疏水性。该除草剂为触杀型，主要用于禾谷类作物防除阔叶杂草，具有活性高、杀草谱广、毒性低的特点，是一种很有市场前景的三氟甲基二苯醚类除草剂。它通过杂草茎叶吸收后进入细胞内部，破坏细胞膜，使细胞内容物溢出，对植物组织产生物理性伤害，最终导致死亡，可用于防除小麦、大麦、花生、大豆和稻田的苗后阔叶杂草等。目前，国内外有关乙羧氟草醚在环境中降解动态方面的研究不多，而生物修复技术因微生物本身能对各类不同的有机污染物进行降解和转化而具有巨大的潜力。因此，从自然环境中筛选得到能够去除乙羧氟草醚的有效菌种具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、三氟羧草醚等二苯醚类含氟除草剂的残留量降低90％以上。具有较广的降解谱，生产和使用成本较低。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。

本发明提供一种消除乙羧氟草醚残留的降解菌，其菌株FC12是一株革兰氏染色反应阴性菌，于2013年4月9日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号CGMCC NO.7439，经鉴定是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。主要生物学特性为G-，直杆状，芽孢椭圆，周生鞭毛运动，大小0.5~2.5×1.2~10μm；接触酶阳性；氧化酶阴性；能水解淀粉，液化明胶。该菌能以乙羧氟草醚为唯一碳源进行生长。

本发明提供了芽孢杆菌FC12在乙羧氟草醚降解中的应用。在实验室摇瓶培养条件下乙羧氟草醚的降解率达90％以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明提供了含有所述芽孢杆菌FC12的菌剂。

本发明还提供了所述芽孢杆菌FC12生产菌剂的方法。

所述芽孢杆菌FC12生产菌剂的方法，包括：斜面种－摇瓶种－种子罐－生产罐－产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。

所述生产菌剂的方法，具体为：

1）将乙羧氟草醚残留的芽孢杆菌FC12的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；

2）将步骤1）培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液。

3）将步骤2）所述种子液按10％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。

步骤1）中所述的LB培养基配方为：NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,pH7.0。

步骤2）所述的种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH₄）₂SO₄1%，K₂HPO₄0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。

步骤2）所述种子罐和步骤3）所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，步骤2和3的整个工艺流程培养时间为48-60小时。

所述菌剂在乙羧氟草醚降解中的应用。

本发明所述的芽孢杆菌FC12具有较广的降解谱，能使土壤中乙羧氟草醚的残留量降低90％以上，大大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。所制备的菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。田间试验表明，用本发明生产的降解菌剂直接施用于土壤,可使土壤中农药残留量降低90％以上。本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。

附图说明

图1本发明所述的芽孢杆菌FC12的菌落照片；

图2本发明所述的芽孢杆菌FC12的结晶紫染色照片；

图3 本发明所述的芽孢杆菌FC12的摇瓶降解图；

图4含有芽孢杆菌FC12菌剂的田间降解实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 乙羧氟草醚降解芽孢杆菌FC12的筛选和分离

取从生产乙羧氟草醚的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥3.0ml加入乙羧氟草醚浓度为100mg/L的100ml无机盐液体培养中，其配方为：每升含1.50 g K₂HPO₄、0.50 g KH₂PO₄、0.20 g MgSO₄﹒7H₂O、1.00 g NaCl、1.00 g (NH₄)₂SO₄， pH 7.0，于160r/min，30℃条件下振荡培养，每隔5天按3%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次。

取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，配成10^-1的富集液，再吸取1.0ml配好的10^-1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10^-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含乙羧氟草醚的浓度为100mg/L无机盐固体培养基(配方为：每升含1.50g K₂HPO₄、0.50g KH₂PO₄、0.20g MgSO₄﹒7H₂O、1.00g NaCl、1.00g (NH₄)₂SO₄，20.00g 琼脂， pH 7.0)上，30℃培养7天。7天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于3.0ml的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为：NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,pH7.0于8000r/min的条件下离心2min，倒去上清液，加入3.0ml的无菌水摇匀，仍于8000r/min的条件下离心2min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入3.0ml无菌水重悬该菌。吸取1.0ml该菌液加入100ml乙羧氟草醚浓度为100mg/l的无机盐液体培养基中，于160r/min，30℃条件下振荡培养4天后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。

将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为：NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L, 酵母粉5.00g/L,琼脂20.00g/L,pH7.0, 30℃恒温培养48h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态（1000X）。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。其菌落图片见图1，鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；命名为：FC12。其结晶紫染色照片见图2所示，主要主要生物学特性为G-，直杆状，芽孢椭圆，周生鞭毛运动，大小0.5~2.5×1.2~10μm；接触酶阳性；氧化酶阴性；能水解淀粉，液化明胶。

实施例2 芽孢杆菌FC12的摇瓶降解实验

在含100mg/L乙羧氟草醚的无机盐培养基中，其配方为：每升含1.50 g K₂HPO₄、0.50g KH₂PO₄、0.20g MgSO₄﹒7H₂O、1.00g NaCl、1.00g (NH₄)₂SO₄，pH 7.0，按3%的接种量接种YS-03，于30℃振荡培养，48小时取样测定。与空白相比，由图3可以看出，处理样品的吸收峰明显下降，乙羧氟草醚被降解90%以上。

实施例3 含有芽孢杆菌FC12菌剂的制备

将实施例1筛选和分离的乙羧氟草醚降解芽孢杆菌FC12的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的1000ml摇瓶中，LB培养基配方为：酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L，NaCl 10.00g/L，pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH₄）₂SO₄1%，K₂HPO₄0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.01%， CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1: 1.2，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

实施例4 含有芽孢杆菌FC12菌剂的制备

将实施例1筛选和分离的乙羧氟草醚降解芽孢杆菌FC12的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的1000ml摇瓶中，LB培养基配方为：酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L，NaCl 10.00g/L，pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH₄）₂SO₄1%，K₂HPO₄0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.01%， CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为200转/分，无菌空气通入量为1:1。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180转/分，整个工艺流程培养时间为48小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。

实施例5 含有芽孢杆菌FC12菌剂的田间实验

实验用大田为1块尺寸为10m×10m的耕作土壤，对耕作层土壤松土（松土深度大约20cm）、整平备用。

对此耕作土壤施用乙羧氟草醚原药，使乙羧氟草醚初始浓度为50mg/kg，搅拌均匀，喷施含1g/L的葡萄糖水溶液使其含水量达到饱和含水量的60%。然后将1#田平均划分为6块，向其中3块分别加入实施例3制备的菌剂60g；另外3块分别加入同体积的灭菌处理（121℃，30min）的实施例3制备的菌剂。共两种处理，每个处理均是三个重复。分别于5d、10d、15d、20d、25d、30d后取样测定乙羧氟草醚在土壤中的降解率。由图4可知，加入菌体后，加入未灭活的菌剂的土壤中乙羧氟草醚降解明显，降解率可达96%，加入灭活后的菌剂的土壤中乙羧氟草醚没有明显降解。实施例4所述方法制备的菌剂，经过实施例5所述的方法，具有同样的效果，降解率可达92%。

Claims

1.一株乙羧氟草醚降解芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株FC12，其保藏编号为CGMCC NO.7439。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌FC12在乙羧氟草醚降解中的应用。

3.一种含有权利要求1所述的芽孢杆菌FC12的菌剂。

4.权利要求3所述的含有芽孢杆菌FC12的菌剂在乙羧氟草醚降解中的应用。

5.一种权利要求3所述的含有芽孢杆菌FC12的菌剂的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

将乙羧氟草醚残留的芽孢杆菌FC12的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；

将步骤1）培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液；

将步骤2）所述种子液按10％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。

6.根据权利要求5所述的菌剂的生产方法，其特征在于：步骤1）中所述的LB培养基配方为：NaCl10.00g/L,蛋白胨10.00g/L，酵母粉5.00g/L，pH7.0。

7.根据权利要求5所述的菌剂的生产方法，其特征在于：步骤2）所述的种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH₄）₂SO₄1%，K₂HPO₄0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。

8.根据权利要求5所述的菌剂的生产方法，其特征在于：步骤2）所述种子罐和步骤3）所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，步骤2与步骤3的整个工艺流程培养时间为48-60小时。