CN108157367A

CN108157367A - 2,6-二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂在苹果叶部的应用

Info

Publication number: CN108157367A
Application number: CN201711204880.4A
Authority: CN
Inventors: 张清明; 王彩霞; 练森; 李保华; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: CN108157367B

Abstract

本发明公开了2,6‑二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂在苹果叶部的应用，属于植物诱导抗病性技术领域。0.05mmol·L^‑1～0.2mmol·L^‑1浓度的2,6‑二叔丁基对甲酚溶液可用于诱导苹果叶片抗病性，防治苹果病害。本发明的2,6‑二叔丁基对甲酚溶液本身无离体的杀菌或抑菌作用，在活体条件下才能诱发植物抗病性，诱导产生的抗病性具有持效性长和广谱特性特点，且环保安全，不宜产生抗药性；使用方法简单，浓度低，用量少，成本低；还能提高植物体内防御酶的活性和抗病相关基因的表达水平。

Description

2,6-二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂在苹果叶部的应用

技术领域

本发明属于植物诱导抗病性技术领域，具体涉及2,6-二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂的应用。

背景技术

苹果含有丰富的碳水化合物、维生素和无机盐等物质，是人们重要的营养来源和物质基础。在我国苹果作为重要的经济作物和出口水果，栽培面积和产量均居世界首位，然而，苹果出口率不足总产量的3％，在国际上的市场占有率与我国苹果生产大国的地位极不相称，苹果病害是造成该现象的一个重要因素。

苹果叶部病害主要有褐斑病(Diplocarpon mali)、炭疽叶枯病(Glomerellacingulata)、斑点落叶病(Alternaria alternate f.sp.mali)等。叶部病害主要导致叶片枯黄，早期大量脱落，不仅直接降低果品产量和品质，造成严重的经济损失，而且严重消弱树势，降低树体抗病力，诱发枝干病害及根部病害的危害。对于叶部病害的防控主要依靠化学杀菌剂，频繁使用化学杀菌剂不仅使果园生态环境恶化，给食品安全带来极大隐患；而且苹果炭疽叶枯病发病迅速，潜育期只有2～4d，病原菌一旦侵入寄主组织，几乎没有用药防治时间。如该病无法得到有效控制，嘎啦、秦冠等感病优良品种在我国将面临被淘汰的风险。化学杀菌剂的广泛使用，给人类健康及环境安全带来严重威胁，进而带来的抗药性问题也逐渐显露。因此，寻求可替代化学杀菌剂的安全有效防治措施已成为苹果生产和病害防治中亟待解决的问题。

通过激发植物本身的防御体系来控制病害，是开发高效、安全、绿色农药的一条重要途径。通过长期的进化，植物已经形成了一套完整的防御机制，植物的诱导抗性起始于植物对来自病原菌信号物质的识别，通过激活植物体内多种信号途径，如水杨酸、茉莉酸、乙烯等信号途径，导致植物产生一系列抗性反应，其中包括防御基因表达水平升高、防御化合物的累积等等。能够诱导植物产生抗病性的化学物质称为植物抗病激活剂(Plantactivator)，BTH是目前商品化最成功的植物抗病激活剂。大量研究已表明，利用诱导抗性控制植物病害具有抗性持续时间长、抗病谱广及不污染环境等优点，被认为是植物病害防治的一种新策略和可行途径。

发明内容

本发明针对目前农业生产中苹果叶部病害防治难度大，成本高，化学农药残留及抗药性日益突出等问题，提供了一种诱导苹果叶片抗病性的方法，对苹果叶部病害进行有效防治。以此减少化学药剂的使用次数和使用量，消弱其对环境的破坏以及对人类身体健康的影响，并可延迟苹果叶部病害病原菌抗、耐药菌株的出现，以实现苹果产业向着安全、高效、可持续的方向发展。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

2,6-二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂在苹果叶部的应用。具体的，所述2,6-二叔丁基对甲酚用于增强植物体内防御酶的活性，所述的防御酶为CAT、PPO、PAL和POD；并能提高植物体内抗病相关基因的表达水平，所述的抗病相关基因为β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因。

在上述方案的基础上，使用时将2,6-二叔丁基对甲酚制备成溶液，使用喷雾器在苹果树体喷洒浓度为0.05mmol·L^-1～0.2mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液施用于苹果叶片，直到叶片表面有水滴滴下。

2,6-二叔丁基对甲酚可以防治由苹果叶部病害病原菌引起的苹果褐斑病、炭疽叶枯病和斑点落叶病。

在上述方案的基础上，所述苹果炭疽叶枯病病原菌为围小丛壳菌(Glomerellacingulata)、褐斑病病原菌为苹果双壳菌(Diplocarpon mali)、斑点落叶病病原菌为链格孢苹果专化型(Alternaria alternate f.sp.mali)。

本发明的有益效果：

本发明所提供的化合物2,6-二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂，与传统农药相比具有以下优点：1)本身无离体的杀菌或抑菌作用，在活体条件下才能诱发植物自身的免疫系统抵御病害的侵袭；2)诱导产生的抗病性具有广谱特性，经2,6-二叔丁基对甲酚处理过的苹果树体，对苹果褐斑病、炭疽叶枯病和斑点落叶病的病原菌的侵染均具有显著的抗性，处理后树体对苹果褐斑病、炭疽叶枯病和斑点落叶病的最高防治效果可达81％，具有很高的经济效益；3)2,6-二叔丁基对甲酚诱导产生的抗病性属于植物机体自身生理代谢反应，环保安全，不易产生抗药性；4)使用方法简单，浓度低，用量少，成本低；5)使用2,6-二叔丁基对甲酚还能提高苹果果实内防御酶CAT、PPO、PAL和POD的活性，并能提高植物体内抗病相关基因β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因的表达水平。

附图说明

图1不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病菌菌丝生长和孢子萌发的影响，A为苹果炭疽叶枯病菌菌落直径，B为苹果炭疽叶枯病菌孢子萌发率；

图2不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病的防治效果(病情指数)；

图3不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病的防治效果(病斑数)；

图4不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病的防治效果，A为水溶液处理的对照；B和C分别为0.1mmol·L^-1和0.2mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液的防治效果；

图5不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果褐斑病的防治效果，A为不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果褐斑病病斑数的影响，B为不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果褐斑病病情指数的影响

图6 2,6-二叔丁基对甲酚处理对苹果叶片内防御酶活性的影响；

图7 2,6-二叔丁基对甲酚处理对苹果叶片内抗病相关基因表达的影响。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明涉及一种激发苹果叶片抗病性的方法，其包括将有效浓度的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液应用于苹果树体，经吸收后激发叶片的抗病性，从而提高苹果对叶部病害的抗性。

本发明所述的2,6-二叔丁基对甲酚具有以下结构：

实施例1

1.1 2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病菌菌丝生长的影响

配置PDA培养基，在其中添加2,6-二叔丁基对甲酚水溶液，使其终浓度为0.05mmol·L^-1、0.1mmol·L^-1和0.2mmol·L^-1，在上述PDA培养基中接种活化好的苹果炭疽叶枯病病原菌围小丛壳菌(Glomerella cingulata)。该菌为本领域的常规病原菌，于25℃恒温暗培养5d，测量菌落直径。

上述所用PDA培养基，其组分及配方如下：马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15～20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000mL，pH值天然，在121℃高压蒸汽灭菌20min。

结果显示，0.05mmol·L^-1、0.1mmol·L^-1和0.2mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚对上述病原菌的菌落直径无明显影响，说明该浓度化合物对病原菌菌丝生长没有抑制作用。

1.2 2,6-二叔丁基对甲酚对苹果叶部病害病原菌孢子萌发的影响

分别制备苹果炭疽叶枯病病原菌围小丛壳菌(Glomerella cingulata)、褐斑病病原菌苹果双壳菌(Diplocarpon mali)、斑点落叶病病原菌链格孢苹果专化型(Alternariaalternate f.sp.mali)的孢子悬浮液，浓度为10⁵个·mL^-1，分别向上述孢子悬浮液中添加2,6-二叔丁基对甲酚水溶液，使其终浓度为0.05mmol·L^-1、0.1mmol·L^-1和0.2mmol·L^-1，置于25℃条件下，24h观察孢子萌发情况。

结果显示：0.05mmol·L^-1、0.1mmol·L^-1和0.2mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚对上述病原菌孢子萌发没有明显影响，说明该浓度化合物对病原菌孢子萌发没有抑制作用。

不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病菌菌丝生长和孢子萌发的影响，结果见图1。

实施例2

不同浓度的2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病和褐斑病的防治效果：

制备苹果炭疽叶枯病病原菌围小丛壳菌(Glomerella cingulata)的孢子悬浮液，将病原菌在PDA上恒温暗培养，待菌丝长至2/3平皿时，用接种环刮除气生菌丝，2～3d后可见橘黄色的分生孢子角产生，配置分生孢子悬浮液调节浓度至5×10⁴个·mL^-1。

制备苹果褐斑病病原菌苹果双壳菌(Diplocarpon mali)的孢子悬浮液，褐斑病病叶采自青岛农业大学胶州试验站，于20℃保湿培养72h，病叶上产生大量的新鲜分生孢子后，将其配成孢子悬浮液2～3×10⁴个·mL^-1。

配置0.05mmol·L^-1、0.1mmol·L^-1和0.2mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液，选取长势一致的一至二年生完全展开叶的嘎啦和富士苹果枝条，分别均匀喷雾上述不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚溶液，直到叶片有水滴滴下，以无菌水作对照。上述不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚溶液处理后3d，嘎啦苹果叶片喷雾接种上述浓度苹果炭疽叶枯病菌孢子悬浮液，富士苹果叶片喷雾接种上述浓度褐斑病菌孢子悬浮液，田间接种后用塑料袋进行保湿24h，定期观察记录叶片发病情况。

按GB/T17980.124-2004《农药田间药效试验准则(二)》分级，并计算病情指数。

0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的10％以下；3级：病斑面积占叶面积的11％～30％；5级：病斑面积占叶面积的30％～50％；7级：病斑面积占叶面积的51％；9级：落叶。

按以下公式计算:病情指数＝100×∑(各级病叶数×该病级值)/(调查总叶片数×最高级值)；防治效果＝(对照病情指数-2,6-二叔丁基对甲酚处理病情指数)/对照病情指数×100％

所述不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病的防治效果见图2、图3和图4，不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚溶液处理后，苹果炭疽叶枯病病斑数和病情指数均显著降低，其中0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚的防治效果最好，接种后3d防效达66.7％，接种后7d时防效仍达61.7％。

所述不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果炭疽叶枯病的防治效果见图5，不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚溶液处理后，苹果褐斑病的病斑数和病情指数均显著降低，其中0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚的防治效果最好，接种后12d防效达81.3％，接种后21d时防效仍达61.8％。

实施例3

2,6-二叔丁基对甲酚对苹果褐斑病和斑点落叶病的防治效果：

制备斑点落叶病病原菌链格孢苹果专化型(Alternaria alternate f.sp.mali)的孢子悬浮液，在PDA培养基上接种苹果斑点落叶病菌，25℃恒温培养箱培养，菌落转为黑色时，刮下菌丝及分生孢子，用无菌水冲洗，混合液经3层擦镜纸过滤，得到孢子悬浮液并调节浓度为2～3×10⁵个·mL^-1。

配置0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液，选取长势一致的一至二年生完全展开叶的富士苹果枝条，均匀喷雾上述浓度2,6-二叔丁基对甲酚溶液，直到叶片有水滴滴下，以无菌水作对照。上述浓度2,6-二叔丁基对甲酚溶液处理后3d，剪取处理枝条，室内喷雾接种上述浓度苹果斑点落叶病病菌孢子悬浮液，接种后置于25℃，相对湿度95％的培养箱中，定期观察记录叶片发病情况。

0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的10％以下；3级：病斑面积占叶面积的11％～30％；5级：病斑面积占叶面积的30％～50％；7级：病斑面积占叶面积的51％～75％；9级：病斑面积占叶面积的76％以上。

按照实施例2的公式，计算病情指数和防治效果。

0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚处理后，可显著降低苹果斑点落叶病的病情指数，对照病情指数为35.5，0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚处理后病情指数仅为8.5，其防治效果高达76.1％。说明2,6-二叔丁基对甲酚作为植物激活剂使用，表现出良好的广谱抗病性且防效显著。

实施例4

2,6-二叔丁基对甲酚诱导果实抗病机理：

4.1 2,6-二叔丁基对甲酚对苹果叶片内防御酶活性的影响

配置0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液，选取长势一致的一至二年生完全展开叶的苹果枝条，按照实施例1种方法，均匀喷雾上述2,6-二叔丁基对甲酚溶液，直到有水滴滴下。分别于处理后0、0.5、1、2、3、4、5d取样，测定叶片组织内防御相关酶活性的变化趋势。

结果如图6所示：0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚处理苹果枝条后，叶片组织内过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)活性相比对照均显著升高，且处理后5d时，各酶活性仍显著高于对照，说明2,6-二叔丁基对甲酚可通过提高叶片内防御酶活性诱导苹果对叶部病害的抗性，且持续时间长。

4.2 2,6-二叔丁基对甲酚对苹果叶片内抗病相关基因的影响

配置0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液，选取长势一致的一至二年生完全展开叶的苹果枝条，按照实施例1种方法，均匀喷雾上述2,6-二叔丁基对甲酚溶液，直到有水滴滴下。分别于处理后12、24、48、72和120h取样，测定叶片组织内抗病相关基因表达水平的动态变化。

结果如图7所示：0.1mmol·L^-1的2,6-二叔丁基对甲酚处理苹果枝条后，叶片组织内抗病相关基因β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因表达量相比对照均显著升高，其中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量在处理后48h达到峰值，是对照的31倍，几丁质酶基因表达量在处理后24h达到高峰。接种后120h时，两个基因的表达量仍维持在较高水平，说明2,6-二叔丁基对甲酚可通过提高叶片内抗病相关基因的表达水平，诱导苹果叶片对病原菌侵染的抗性，且抗性诱导持续时间长。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.2,6-二叔丁基对甲酚用于增强植物体内防御酶的活性和/或用于提高植物体内抗病相关基因的表达水平的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，所述防御酶为CAT、PPO、PAL和POD；所述的抗病相关基因为β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因。

3.根据权利要求1或2所述的用途，所述植物体为苹果叶片。

4.一种植物抗病激活剂，其特征在于，有效成分为2,6-二叔丁基对甲酚。

5.一种权利要求4所述的植物抗病激活剂的用途，其特征在于，用于诱导苹果叶片抗病性，防治苹果病害。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述苹果病害为由苹果叶部病害病原菌引起的苹果炭疽叶枯病、苹果褐斑病和斑点落叶病。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述苹果炭疽叶枯病病原菌为围小丛壳菌(Glomerella cingulata)、褐斑病病原菌为苹果双壳菌(Diplocarpon mali)、斑点落叶病病原菌为链格孢苹果专化型(Alternaria alternate f.sp.mali)。

8.一种诱导苹果叶片抗病性的方法，其特征在于，使用2,6-二叔丁基对甲酚溶液。

9.根据权利要求8所述的诱导苹果叶片抗病性的方法，其特征在于，所述2,6-二叔丁基对甲酚的浓度为0.05mmol·L^-1～0.2mmol·L^-1。

10.根据权利要求8或9所述的诱导苹果叶片抗病性的方法，其特征在于，使用喷雾器在苹果树体叶片上喷洒2,6-二叔丁基对甲酚溶液。