ES2400294T3 - Composiciones y métodos para protección y regeneración del tejido cardiaco - Google Patents

Abstract

Una solución exenta de células que comprende un tampón y un péptido anfifílico autoensamblador quecomprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, en donde la solución exenta de célulascontiene más de 1% en peso del péptido y el péptido no está modificado para contener secuencias activas del factorde crecimiento derivado de las plaquetas, para uso en el tratamiento de una afección cardiaca, que comprendeadministrar en una cantidad terapéuticamente eficaz la solución exenta de células a un sitio de tejido cardiaco queha resultado lesionado debido a uno o más de fibrilación atrial, infarto agudo de miocardio, isquemia-reperfusión,enfermedad pericárdica, enfermedad cardiaca congénita, e insuficiencia cardiaca congestiva.

Description

Composiciones y métodos para protección y regeneración del tejido cardiaco

INTRODUCCIÓN

La insuficiencia cardiaca crónica es común y creciente en prevalencia (1), y la enfermedad cardiaca isquémica es la causa principal de la insuficiencia cardiaca. El infarto agudo de miocardio (AMI) conocido comúnmente como ataque cardiaco ocurre cuando el suministro de sangre al corazón se interrumpe, causando necrosis o muerte del tejido cardiaco. El AMI es una urgencia médica, y es una causa principal de muerte tanto para hombres como para mujeres en todo el mundo. A pesar de las estrategias médicas actuales, de la intervención percutánea y la reperfusión quirúrgica de miocardio (2, 10, 11) queda mucho lugar para mejora.

La presentación clínica de pacientes con AMI varía desde dolor torácico leve a choque cardiógeno o muerte cardiaca repentina. El tratamiento puede ser con medicación (trombólisis) angioplastia o cirugía de bypass. Los tratamientos medicinales pueden incluir aspirina, agentes trombolíticos (estreptoquinasa, uroquinasa, alteplasa (activador del plasminógeno tisular recombinante, rtPA), y reteplasa), herapina, beta-bloqueantes, e inhibidores de la ACE. El objetivo del tratamiento inmediato es el restablecimiento del flujo sanguíneo normal en las arterias coronarias y perfusión tisular mejorada. Esto puede realizarse también con terapia trombolítica intravenosa o angioplastia directa. Pruebas clínicas han demostrado que la angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) restablece el flujo más eficazmente y es el tratamiento de elección cuando se realiza por clínicos experimentados.

La falta de suministro de sangre o isquemia en el corazón es el problema esencial en el AMI; sin embargo, cuando se recupera el flujo sanguíneo puede producirse también lesión de reperfusión. La lesión de reperfusión hace referencia al deterioro del tejido cuando retorna el suministro de sangre a dicho tejido después de un periodo de isquemia. El deterioro de la lesión de reperfusión se debe en parte a la respuesta inflamatoria en el tejido dañado. Cuando se reanuda el flujo sanguíneo, los glóbulos blancos de la sangre transportados al área isquémica liberan una multitud de factores inflamatorios tales como interleuquinas así como la generación de radicales libres. El restablecimiento del flujo sanguíneo causa también deterioro de las proteínas celulares, el DNA y las membranas plasmáticas por la reintroducción de oxígeno y el deterioro de las membranas plasmáticas celulares causa la liberación de radicales libres adicionales. Se cree también que los radicales libres actúan indirectamente para estimular respuestas apoptóticas en los tejidos dañados.

Adicionalmente, la remodelación ventricular posterior a infarto es resultado de la pérdida neta de cardiomiocitos (19) y las técnicas para mejorar la viabilidad y/o el reclutamiento celular a la zona infartada podrían ser beneficiosas en la recuperación de la contractilidad cardiaca.

La promesa inicial del trasplante de células progenitoras para reparación y regeneración cardiaca, sin embargo, ha sido moderada por datos de pruebas clínicas ambiguos que muestran una recuperación mínima de la contractilidad del ventrículo izquierdo (mejora de 3% en la fracción de eyección ventricular izquierda en los grupos tratados frente a los grupos de control), mejora de vida corta (ausencia de diferencia entre los grupos a lo largo de 18 meses) o ausencia total de diferencia. Adicionalmente, estudios realizados han demostrado que después del suministro por infusión intracoronaria, pocas de las células trasplantadas se retienen en el corazón al cabo de 48 horas (4).

SUMARIO

La invención es como se expone en las reivindicaciones

La presente invención proporciona, en diversos aspectos, un material de andamiaje sintético autoensamblador peptídico (SAP) sustancialmente exento de células, biocompatible y biodegradable, sintético denominado CardioMatrix. Los inventores han descubierto que los péptidos autoensambladores purificados pueden diseñarse en geles inyectables e implantables adecuados para uso en numerosas aplicaciones cardiacas. Los materiales CardioMatrix se utilizan para tratar tejido cardiaco que ha resultado lesionado debido a uno o más de AMI, enfermedad pericárdica, fibrilación atrial, isquemia-reperfusión, enfermedad cardiaca congénita, e insuficiencia cardiaca congestiva. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la presente invención proporciona un beneficio terapéutico por reducir la magnitud del MI y las lesiones de reperfusión después de la inyección de CardioMatrix.

Como se utiliza en esta memoria, el término “CardioMatrix” hace referencia a SAP que comprende una secuencia RADARADARADARADA (SEQ. ID. NO.1).

Como se utiliza en esta memoria, el término “afección cardiaca” incluye afecciones, enfermedades y lesiones cardiacas, etc. Como se utiliza en esta memoria las “afecciones cardiacas”, incluyen, pero sin carácter limitante, AMI, enfermedad valvular, enfermedad pericárdica, enfermedad cardiaca congénita, e insuficiencia cardiaca congestiva.

La presente invención proporciona una solución sustancialmente exenta de células que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso, y con preferencia más de aproximadamente 3% de CardioMatrix en peso para uso en el tratamiento del tejido cardiaco que comprende inyección en el tejido a tratar. En diversas realizaciones, la solución comprende una solución de sacarosa que contiene una concentración fisiológicamente aceptable de sacarosa, v.g., una solución de sacarosa al 10% en peso. La solución puede contener uno o más tampones aceptables para llevar la solución a un pH fisiológico aceptable (v.g. pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5) antes de introducir la solución CardioMatrix en un individuo. En diversas realizaciones, este uso proporciona tratamiento, al menos en parte, por uno o más de: suministro local de NO formado a partir de LA, y promueve la formación de óxido nítrico (NO) en respuesta a estímulos fisiológicos y/o patológicos por CardioMatrix.

En diversas realizaciones, la presente invención proporciona una solución sustancialmente exenta de células que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso, y con preferencia más de aproximadamente 3% de CardioMatrix en peso para uso en el tratamiento de un infarto que comprende inyección en un infarto. En diversas realizaciones, la solución comprende una solución de sacarosa que contiene una concentración fisiológicamente aceptable de sacarosa, v.g., una solución de sacarosa al 10% en peso. La solución puede contener uno o más tampones aceptables para llevar la solución a un pH fisiológico aceptable (v.g., pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5) antes de introducir la solución CardioMatrix en un individuo.

Se describen también métodos para el tratamiento de uno o más de hipertensión, choque séptico, neurodegeneración, artritis, y asma por inyección en un tejido a tratar de una solución sustancialmente exenta de células que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso (y con preferencia más de aproximadamente 3% de CardioMatrix en peso) que proporciona tratamiento, al menos en parte, por uno o más de: suministro local de NO formado a partir de LA, y promueve la formación de óxido nítrico (NO) en respuesta a estímulos fisiológicos y/o patológicos por CardioMatrix.

En diversos aspectos, los usos presentes comprenden proporcionar un efecto cardio-protector y/o cardioregenerativo por administración local de una solución sustancialmente exenta de células que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso, y con preferencia más de aproximadamente 3% de CardioMatrix en peso.

Los anteriores y otros aspectos, realizaciones, y características de las presentes invenciones pueden ser comprendidos más plenamente a partir de la descripción y los dibujos que siguen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Presenta información acerca del cambio en la Fracción de Eyección Ventricular Izquierda % entre el día 3 y el día 28 después de isquemia-reperfusión (a) totales de grupo y (b) por animal en cada grupo. El grupo de 3% CardioMatrix exhibe una mejora estadísticamente significativa con respecto a los controles el día 28. Las LVEFs representadas gráficamente por animal el día 3 y el día 28 demuestran las tendencias en mejora de los grupos de 3% y 1%.

Figura 2. Presenta información acerca del registro histopatológico y el análisis fotográfico del corazón de la rata con vehículo solo (a) y 3% CardioMatrix (b). El registro para el tamaño del infarto o adelgazamiento de la pared – sólo la región anterior del corazón se registró como sigue: 0 -0% o ausencia de áreas de registro positivo para infarto o adelgazamiento, 1 -25% del área afectada, denominado leve, 2 -50% del área afectada -moderado, 3 ó 4 (75100%) áreas afectadas -grave. (a) La fotografía del control de vehículo muestra que una gran área de la pared anterior estaba infartada (áreas 1-3 o 75% de la región anterior). Este mismo corte muestra también adelgazamiento grave, mientras que el 3% CardioMatrix muestra un adelgazamiento leve. (b) La fotografía del animal tratado con 3% CardioMatrix demuestra que sólo 25% de la región anterior acusaba infarto. Adicionalmente, existe poco adelgazamiento de la pared en esta sección para el animal tratado con 3% SAP.

Figura 3. Presenta información acerca de la reducción del área de adelgazamiento por el tratamiento CardioMatrix y la severidad. (A) Comparación de cortes por rata con infarto e infarto grave en animales que recibieron 3% CardioMatrix, 1% CardioMatrix y control de vehículo. (B) Cortes por rata con adelgazamiento de pared y adelgazamiento grave de pared en animales que recibieron 3% CardioMatrix, 1% CardioMatrix y control de vehículo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En diversos aspectos, la presente invención proporciona CardioMatrix inyectable, constituida por una secuencia RADARADARADARADA autoensambladora en donde la secuencia no está modificada para contener secuencias activas de factor de crecimiento derivado de las plaquetas, capaces de formar andamiajes de nanofibras que promueven el aumento de uno o más de preservación de las células cardiacas y reclutamiento de células cardiacas. En diversos aspectos, la presente invención proporciona un material CardioMatrix para uso en inyección miocárdica local. En diversas realizaciones, el uso promueve la recuperación mejorada de la contractilidad ventricular después de infarto de miocardio.

Materiales y Soluciones CardioMatrix

Las definiciones siguientes pueden ser útiles en la comprensión de los SAPs, y las estructuras SAP, así como del material CardioMatrix.

Por “andamiaje” se entiende una estructura tridimensional capaz de soportar células. Las células pueden estar encapsuladas por el andamiaje o pueden estar dispuestas en una capa sobre una superficie del andamiaje. La estructura secundaria de hoja beta del andamiaje puede confirmarse utilizando dicroísmo circular estándar para detectar un mínimo de absorbancia a aproximadamente 218 nm y un máximo a aproximadamente 195 nm. El andamiaje está formado por el autoensamblaje de péptidos que pueden incluir L-aminoácidos, D-aminoácidos, aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, o una combinación de los mismos. Si están presentes Laminoácidos en el andamiaje, la degradación del andamiaje produce aminoácidos que pueden ser reutilizados por el tejido hospedador. Se contempla también que los péptidos pueden estar enlazados covalentemente a un compuesto, tal como un quimioatrayente o un compuesto terapéuticamente activo. Los péptidos pueden sintetizarse químicamente o purificarse a partir de fuentes naturales o recombinantes, y los términos amino y carboxi de los péptidos pueden estar protegidos o no protegidos. El andamiaje peptídico puede formarse a partir de una o más especies moleculares distintas de péptidos que son complementarias y estructuralmente compatibles unas con otros. Los péptidos que contienen pares apareados incorrectamente, tales como el apareamiento repulsivo de dos residuos de la misma carga de péptidos adyacentes, pueden formar también andamiajes si la fuerza disruptiva está dominada por interacciones estabilizadoras entre los péptidos. A los andamiajes se hace también referencia en esta memoria como estructuras peptídicas, estructuras de hidrogeles peptídicos, estructuras de gel peptídico, o estructuras de hidrogel.

Por “complementario” se entiende capaz de formar interacciones de enlaces iónicos o enlaces de hidrógeno entre residuos hidrófilos procedentes de péptidos adyacentes en el andamiaje; por ejemplo, cada residuo hidrófilo en un péptido se une por enlaces hidrógeno o se aparea iónicamente con un residuo hidrófilo en un péptido adyacente o se expone a disolvente.

Por “estructuralmente compatible” se entiende capaz de mantener una distancia intrapeptídica suficientemente constante para permitir la formación de andamiaje. En ciertas realizaciones de la invención, la variación en la distancia intrapeptídica es menor que 4, 3, 2, ó 1 angstrom. Se contempla también que variaciones mayores en la distancia intrapeptídica pueden no impedir la formación de andamiaje si están presentes fuerzas estabilizadoras eficientes. Esta distancia puede calcularse basándose en la modelación molecular o basándose en un procedimiento simplificado que ha sido publicado con anterioridad (Patente U.S. Número 5.670.483). En este método, la distancia intrapeptídica se calcula tomando la suma del número de átomos no ramificados en las cadenas laterales de cada aminoácido en un par. Por ejemplo, la distancia intrapeptídica para un par iónico lisina-ácido glutámico es 5 + 4 = 9 átomos, y la distancia para un par de enlaces hidrógeno glutamina-glutamina es 4 + 4 = 8 átomos. Utilizando un factor de conversión de 3 angstroms por átomo, la variación en la distancia intrapeptídica de los péptidos que tienen pares lisina-ácido glutámico y pares glutamina-glutamina (v.g., 9 frente a 8 átomos) es 3 angstroms.

El término “puro” se utiliza para indicar la extensión en la que los péptidos descritos en esta memoria están exentos de otras especies químicas, con inclusión de aductos de deleción del péptido en cuestión y péptidos de longitudes diferentes.

El término “agente biológicamente activo” se utiliza para hacer referencia a agentes, compuestos, o entidades que alteran, inhiben, activan, o afectan de otro modo a eventos biológicos o bioquímicos. Tales agentes pueden ser derivados naturalmente o sintéticos. Los agentes biológicamente activos incluyen clases de moléculas (v.g., proteínas, aminoácidos, péptidos, polinucleótidos, nucleótidos, carbohidratos, azúcares, lípidos, nucleoproteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, esteroides, factores de crecimiento, quimioatrayentes, etc.) que se encuentran comúnmente en células y tejidos, tanto si las moléculas propiamente dichas existen naturalmente como si son creadas artificialmente (v.g., por métodos sintéticos o recombinantes). Los agentes biológicamente activos incluyen también fármacos, por ejemplo, sustancias anticáncer, analgésicos, y opioides. Preferiblemente, aunque no con carácter necesario, el fármaco es uno que ha sido considerado ya como seguro y eficaz para uso por la agencia u organismo gubernamental apropiado. Por ejemplo, fármacos para uso humano enumerados por la FDA bajo 21

C.F.R. $$ 330.5, 331 a 361, y 440 a 460; fármacos para uso veterinario enumerados por la DA bajo 21 C.F.R. $$ 500 a 589 se consideran todos ellos aceptables para uso de acuerdo con la presente invención. Agentes biológicamente activos ilustrativos adicionales incluyen, pero sin carácter limitante, sustancias anti-SIDA, sustancias anti-cáncer, inmunosupresores (v.g., ciclosporina), agentes anti-virales, inhibidores enzimáticos, neurotoxinas, hipnóticos, antihistaminas, lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivos, relajantes musculares y agentes anti-Parkinson, antiespasmódicos y contractivos musculares con inclusión de bloqueadores de canales, mióticos y anticolinérgicos, compuestos anti-glaucoma, agentes anti-parásitos, anti-protozoos, y/o anti-fúngicos, moduladores de las interacciones célula-matriz extracelular con inclusión de inhibidores del crecimiento celular y moléculas antiadhesión, agentes vasodilatadores, inhibidores de la síntesis de DNA, RNA o proteínas, antihipertensivos, antipiréticos, agentes anti-inflamatorios esteroidales y no esteroidales, factores anti-angiogénicos, factores anti

secretores, anticoagulantes y/o agentes antitrombóticos, anestésicos locales, productos oftálmicos, prostaglandinas, agentes de direccionamiento, neurotransmisores, proteínas, modificadores de la respuesta celular, y vacunas.

Como se utiliza en esta memoria, un hidrogel tal como un hidrogel peptídico es “estable con respecto a la agitación mecánica o física” si, cuando se somete a agitación mecánica, el mismo retiene sustancialmente las propiedades físicas (tales como elasticidad, viscosidad, etc.), que caracterizaban al hidrogel antes de la agitación física. El hidrogel no precisa mantener su forma o tamaño y puede fragmentarse en piezas más pequeñas cuando se somete a agitación mecánica, si bien se considera todavía estable con respecto a la agitación mecánica o física. El término “estable” no tiene este significado excepto cuando se utiliza con esta frase.

Como se utiliza en esta memoria, el término “nanofibra” se refiere a una fibra que tiene un diámetro de dimensiones nanoescalares. Típicamente, una fibra nanoescala tiene un diámetro de 500 nm o menos. De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, una nanofibra tiene un diámetro menor que 100 nm. De acuerdo con ciertas otras realizaciones de la invención, una nanofibra tiene un diámetro menor que 50 nm. De acuerdo con ciertas otras realizaciones de la invención, una nanofibra tiene un diámetro menor que 20 nm. De acuerdo con ciertas otras realizaciones de la invención, una nanofibra tiene un diámetro comprendido entre 10 y 20 nm. De acuerdo con ciertas otras realizaciones de la invención, una nanofibra tiene un diámetro comprendido entre 5 y 10 nm. De acuerdo con ciertas otras realizaciones de la invención, una nanofibra tiene un diámetro menor que 5 nm.

El término “andamiaje de ambiente nanoescalar” se refiere a un andamiaje que comprende nanofibras. De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, al menos 50% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, al menos 75% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, al menos 90% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, al menos 95% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, al menos 99% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. Por supuesto, el andamiaje puede comprender también constituyentes distintos de fibras, v.g., agua, iones, agentes inductores de crecimiento y/o diferenciación tales como factores de crecimiento, agentes terapéuticos, u otros compuestos, que pueden encontrarse en solución en el andamiaje y/o unidos a andamiaje.

Como se utiliza en esta memoria, el término “cantidad eficaz” incluye cualquier cantidad eficaz, a las dosis y durante periodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado deseado. Una cantidad eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, y el peso del individuo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz es también una en la cual cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales (v.g., efectos secundarios) están compensados por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

CardioMatrix es un péptido autoensamblador (SAP) que contiene la secuencia RADARADARADARADA y es un miembro de una clase de biomateriales peptídicos que han sido desarrollados en el contexto del cultivo celular, la biología de las células madre y la ingeniería tisular (24, 25). Las secuencias CardioMatrix para uso en la presente invención pueden modificarse también para contener secuencias activas de diversos factores de crecimiento, distintos del factor de crecimiento derivado de las plaquetas, y/o proteínas de la matriz extracelular (v.g. colágeno, laminina) (10, 14). Ejemplos de la preparación y caracterización de SAPs pueden encontrarse en las Solicitudes de Patente U.S. publicadas núms. 2004/0242469 y 2006/0084607. En diversas realizaciones, el material CardioMatrix comprende péptidos anfifílicos purificados donde los péptidos son al menos 75% puros, preferiblemente al menos 85% puros y más preferiblemente al menos 95% puros.

El material CardioMatrix se utiliza en la presente invención en forma de una solución acuosa inyectable. La concentración de cadenas peptídicas en solución puede variar. En diversas realizaciones, la concentración de las cadenas peptídicas en solución es una o más de: entre aproximadamente 1% y aproximadamente 10% en peso, entre aproximadamente 3% y aproximadamente 7% en peso; y entre aproximadamente 6% y aproximadamente 10% en peso. En diversas realizaciones, la concentración de las cadenas peptídicas en solución es una o más de: mayor que aproximadamente 2% en peso; mayor que aproximadamente 3% en peso; mayor que aproximadamente 4% en peso; mayor que aproximadamente 5% en peso; mayor que aproximadamente 6% en peso; mayor que aproximadamente 7% en peso; y mayor que aproximadamente 8% en peso. Las soluciones CardioMatrix están formuladas para evitar el choque osmótico en un individuo después de la administración. En diversas realizaciones, las soluciones CardioMatrix se preparan utilizando una solución de sacarosa de concentración aproximada 10%. Una solución CardioMatrix puede tener una vida útil de al menos un año con o sin electrólito añadido.

La solución CardioMatrix puede contener uno o más tampones aceptables para llevar la solución a un pH fisiológico aceptable (v.g., pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5) antes de introducir la solución en un individuo.

La solución CardioMatrix se esteriliza preferiblemente antes del uso en el individuo. El polvo CardioMatrix puede esterilizarse por radiación, por ejemplo, por exposición a la radiación gamma a aproximadamente 35 Kgrey. Pueden

prepararse soluciones CardioMatrix que son estables con respecto a la exposición a radiación y alteraciones estructurales después de exposición a la radiación esterilizarte.

Las cadenas peptídicas en la solución CardioMatrix pueden hacerse de modo que se autoensamblen espontáneamente en andamiajes a través de interacciones electrostáticas. Las cadenas peptídicas CardioMatrix autoensambladas pueden formar un hidrogel que se mantiene dúctil y capaz de fluir por aplicación de un estímulo apropiado. En general, los SAPs después de la introducción de cantidades milimolares de cationes monovalentes, sea por la adición de solución de sal, medios de cultivo de células o inyección del material in-vivo, pueden sufrir autoensamblaje en nanofibras, de aproximadamente 10 nm de diámetro, que forman andamiajes porosos tridimensionales bien ordenados (13). La densidad de carga de péptidos anfifílicos, el tamaño y las aptitudes de estructuración de agua pueden mimetizar las de la matriz extracelular in vivo. La densidad de nanofibras y el tamaño medio de poro, ~ 5-200 nm, están correlacionados con la concentración de solución peptídica que se utiliza para producir el material.

Las soluciones CardioMatrix pueden conformarse en un andamiaje estable por exposición a una solución salina monovalente. Se añade suficiente electrólito a la solución para iniciar el autoensamblaje de los péptidos en una estructura macroscópica de hoja beta por contacto con el tejido en el sitio de administración. En diversas realizaciones, la concentración del electrólito añadido es al menos 5, 10, 20, ó 50 mM. Concentraciones menores, v.g., 0,1 a 1 mm, o concentraciones mayores pueden utilizarse también. La elección de la concentración depende en parte de la fuerza iónica deseada del gel peptídico y afecta también a la velocidad de gelificación. Los electrólitos adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, Li+, Na+, K+, y Cs+. El electrólito hace que las cadenas peptídicas se autoensamblen en un andamiaje que es estable con respecto a la agitación mecánica.

En diversas realizaciones, la presente invención proporciona una solución sustancialmente exenta de células que comprende un péptido anfifílico autoensamblador que tiene los componentes complementarios para proporcionar: 1) un andamiaje biológico adecuado que crea un nicho de microambiente para los tipos de células cardiacas, y 2) que las células cardiacas endógenas y/o la población de células injertada puedan integrarse rápidamente en el tejido necesario (24, 25).

Los materiales del andamiaje CardioMatrix de la presente invención comprenden una red de nanofibras con espacios interpuestos en lugar de una matriz compacta, que pueden promover la infiltración celular y las interacciones célula-célula para promover la curación. En los métodos de las presentes invenciones, la introducción del material CardioMatrix puede realizarse en condiciones “exentas de células”; por ejemplo, los métodos no requieren la preparación de células a introducir en las áreas infartadas para el tratamiento de los tejidos cardiacos.

Se cree, sin quedar ligados por la teoría, que la creación de un micoambiente similar a las condiciones in vivo, con inclusión de un componente ECM facilita el injerto de las células con éxito (7, 8, 9). Los materiales CardioMatrix de la presente invención proporcionan, en diversas realizaciones, arquitectura tridimensional apropiada, promueven los caminos de señalización que influyen en funciones celulares críticas, tales como proliferación, diferenciación, y migración, o todas ellas (7-10, 14, 15). Adicionalmente, dado que la solución CardioMatrix no se gelifica hasta su administración, ello podría evitar la retro-fuga de las células inyectadas en la región deseada; habiéndose demostrado que esta ventaja técnica es extremadamente útil en varios estudios pre-clínicos realizados por los inventores.

La solución CardioMatrix de la presente invención es inyectable, y puede, en diversas realizaciones, utilizarse para suministro localizado de fármacos. Por ejemplo, de acuerdo con diversas realizaciones, la solución CardioMatrix se utiliza para suministrar fármacos directamente al corazón para terapia a corto plazo, terapia a largo plazo, o ambas. De acuerdo con ello, en lugar de la administración sistémica repetida, CardioMatrix que contiene el agente deseado puede suministrarse periódicamente de manera directa a un área deseada del corazón. Todas las concentraciones de solución CardioMatrix son inyectables con cualquier tamaño de aguja, incluso con agujas de calibre muy fino (calibre 30).

Estas soluciones CardioMatrix, en diversas realizaciones, pueden comportarse como un material moldeado por inyección. Los hidrogeles que pasan a través de una aguja llenan un espacio deseado con un bolus coherente simple en lugar de una masa enmarañada y enhebrada. Es decir, el material se ensambla tanto en la escala de las cadenas peptídicas individuales como en macroescala en forma de un gel. Las soluciones CardioMatrix pueden proporcionar por tanto en diversas realizaciones a la vez un material inyectable para facilidad de administración y una red fibrosa continua que facilita el crecimiento interno y la proliferación celulares. Una gran diversidad de dispositivos pueden utilizarse para suministrar las soluciones inyectables con inclusión, pero sin carácter limitante, de jeringuillas ordinarias, jeringuillas de cámara dual, catéteres de inyección, y catéteres de suministro.

Estas soluciones CardioMatrix, en diversas realizaciones, pueden comportarse como fluidos no Newtonianos. Por ejemplo, la solución puede volverse más viscosa a lo largo del tiempo. Por ejemplo, una solución al 3% podría exhibir una tensión de fluencia de 20-30 Pa y una viscosidad menor que 40 cP aproximadamente una hora después de la mezcladura, pudiendo aumentar la tensión de fluencia a 50-65 Pa después de aproximadamente 5-6 horas, y

después de aproximadamente 2 semanas, la tensión de fluencia podría aumentar hasta aproximadamente 100-160 Pa, y la viscosidad podría aumentar hasta menos de 200 cP.

Uno o más agentes biológicamente activos (plasma rico en plaquetas) por ejemplo, compuestos terapéuticamente activos o quimio-atrayentes, puede(n) añadirse al CardioMatrix (10, 14). Factores de crecimiento solos o en combinación con otros agentes biológicamente activos tales como citoquinas (factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de los nervios, factor de crecimiento transformante-alfa y beta, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento semejante a insulina, factor de crecimiento vascular endotelial, etc.) pueden añadirse al material CardioMatrix (10,14). Cada uno de los fármacos y factores de crecimiento pueden añadirse de manera similar a CardioMatrix, por ejemplo, como sigue: el fármaco o factor de crecimiento deseado a concentración 2X se añade a la solución vehículo de sacarosa, en un volumen igual al de la solución vehículo de sacarosa, y mezclarse luego con CardioMatrix antes de la inyección.

Los tests de biocompatibilidad y toxicología realizados sobre CardioMatrix por la presente invención, han demostrado que estos materiales, cuando se implantan en animales o se testan in vitro, son seguros y biocompatibles. Los autores de la invención han demostrado también que cuando se inyecta in vivo, CardioMatrix se degrada y se excreta en el transcurso de 28 días. Por último, tests de hemocompatibilidad han demostrado que CardioMatrix en contacto directo con sangre y plasma no inician cascadas de coagulación que pudieran ser perjudiciales para muchas aplicaciones in vivo. Los resultados de los tests de biocompatibilidad y toxicología se muestran en el Ejemplo 2.

Métodos de Tratamiento

En diversos aspectos, la presente invención proporciona un material CardioMatrix sustancialmente exento de células para uso en un método de tratamiento que comprende inyección local en un tejido a tratar. El tejido a tratar comprende tejido cardiaco, con inclusión pero sin carácter limitante de tejidos vascular, arterial, muscular, de revestimiento arterial, etc. El material sustancialmente exento de células se inyecta como una solución que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso, y con preferencia más de aproximadamente 3% de CardioMatrix en peso. En diversas realizaciones, los presentes usos comprenden proporcionar un efecto cardioprotector y/o cardio-regenerativo por administración local de una solución sustancialmente exenta de células que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso, y con preferencia más de aproximadamente 3% de CardioMatrix en peso.

Los cambios agudos y crónicos en la remodelación ventricular después de AMI son procesos importantes que afectan a la función cardiaca (16). Los eventos AMI conducen a edema e inflamación en el corazón que causa que la región infartada se expanda más allá del área deteriorada originalmente. La expansión del infarto ocurre 2-10 días después del evento y causa necrosis no sólo en la zona infartada original, sino también en el área expandida (16). Adicionalmente, ocurre “aturdimiento” en el corazón inmediatamente después de la isquemia y la reperfusión subsiguiente, mientras que la “hibernación” es un proceso por el cual el miocardio se adapta a una isquemia crónica que implica un cambio metabólico a tipos alternativos de consumo de energía, típicamente en la forma de glicólisis anaerobia (22). El tejido cardiaco infartado puede entrar en un estado de “hibernación” desde un estado crónicamente “aturdido” y esta transición está correlacionada con una variación temporal y espacial en la expresión de proteínas estructurales durante la progresión (23). De acuerdo con lo anterior, en diversos aspectos, las presentes invenciones proporcionan material CardioMatrix para uso con objeto de proporcionar un efecto cardioprotector y/o cardiorregenerativo por administración local de una solución sustancialmente exenta de células que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso, y preferiblemente más de aproximadamente 3% de CardioMatrix en peso. El tratamiento puede aportar uno o más de control de tamaño del infarto, reducción o prevención de la expansión del infarto, y reducción del estrés de la pared ventricular.

En diversas realizaciones, la solución sustancialmente exenta de células que contiene un péptido anfifílico autoensamblador puede inyectarse en el músculo cardiaco para estimular la producción de músculo en las paredes cardiacas que se adelgazan. Sin pretender quedar ligados por la teoría, se cree que la inyección en ciertos sitios del tejido crea una cavidad permisiva para crecimiento interno de células y desarrollo de tejido. El pH de la solución puede ajustarse para promover ulteriormente el crecimiento interno de las células y la producción de matriz extracelular, y/o pueden añadirse factores de crecimiento para promover, v.g. el comportamiento de células específicas.

Como se utilizan en esta memoria, los términos “tratar”, “terapéutica”, “tratamiento”, y “terapia” se emplean intercambiablemente para hacer referencia a cualquier método utilizado para aliviar parcial o completamente, mejorar, aminorar, inhibir, retardar la aparición de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno, lesión y/o afección particular. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse a un individuo que no exhibe signos de una enfermedad o afección y/o exhibe únicamente signos precoces de la enfermedad o afección; el tratamiento puede administrarse a un individuo que ha sufrido una lesión (por ejemplo como resultado de AMI); etc.

En diversas realizaciones de la presente invención, la solución CardioMatrix trata el tejido dañado por mantenimiento del mismo en un estado aturdido hasta que el edema y la inflamación disminuyen (19, 22). En diversas realizaciones, las soluciones CardioMatrix se emplean como agente de aumento de volumen que protege el tejido contra el estrés de la pared que comprometer ulteriormente la función cardiaca y, por ejemplo, proporciona un efecto

En diversos aspectos, la presente invención proporciona material CardioMatrix para uso en inyección miocárdica local. En diversas realizaciones, la presente invención proporciona una solución sustancialmente exenta de células que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso, y preferiblemente más de aproximadamente

10 3% de CardioMatrix en peso para uso en el tratamiento de un infarto que comprende inyección en el infarto. En diversas realizaciones, la solución comprende una solución de sacarosa que contiene una concentración fisiológicamente aceptable de sacarosa, v.g., un 10% en peso de solución de sacarosa. La solución puede contener uno o más tampones aceptables para llevar la solución a un pH fisiológico aceptable (v.g., pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5) antes de introducir la solución CardioMatrix en un individuo.

15 En diversas realizaciones, el tratamiento aumenta el suministro local de NO al tejido tratado. En diversas realizaciones, el tratamiento proporciona suministro local de NO formado a partir de LA en el CardioMatrix. En diversas realizaciones, el CardioMatrix promueve la formación de óxido nítrico (NO) por los tejidos tratados y/o tejidos en comunicación fisiológica con los tejidos tratados.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: Estudios de CardioMatrix: Modelo de Isquemia-Reperfusión en la Rata

25 En este ejemplo, se utilizó un modelo de isquemia-reperfusión en la rata para testar si el uso de inyección miocárdica local de CardioMatrix mejora la remodelación ventricular después del infarto, tal como se mide por evaluaciones de contractilidad ventricular y patología del tamaño y gravedad del infarto. En estos ejemplos, la introducción del material CardioMatrix se realizó “sin células”, es decir no se utilizaba ni se requería la preparación de células para introducción en las áreas infartadas.

Materiales CardioMatrix

Se preparó CardioMatrix como sigue: se disolvió polvo CardioMatrix en una solución control de vehículo (sacarosa al 10%) para producir las soluciones de concentración 1% y 3% en peso, utilizadas en este ejemplo. La solución

35 estaba sustancialmente exenta de células. La solución se transfirió luego a una jeringuilla para inyección. Se utilizó una solución de sacarosa al 10% como el control.

Cirugía, AMI e Inyección de CardioMatrix

40 Ratas macho Sprague Dawley, n = 29, de 240 a 300 g de peso, sufrieron isquemia transmural creada bajo anestesia general (pentobarbital 0,06-0,10 mg/g ip). Después de intubación y esternotomía en la línea media, se ligó el segmento mediano de la arteria anterior izquierda descendente con una sutura 7/0 y se confirmó la isquemia por una decoloración pálida del miocardio en el territorio distal de la arteria descendente anterior izquierda. Después de 45 minutos, se cortó u se retiró la sutura. Dos ratas murieron mientras se ligaba la arteria.

45 Las ratas (n = 27), se distribuyeron aleatoriamente para recibir uno de tres materiales: 3% CardioMatrix (3% CardioMatrix, 3DM Inc., Cambridge, MA, EE.UU.), 1% CardioMatrix (1% CardioMatrix, 3DM Inc., Cambridge, MA, EE.UU) o control de vehículo (vehículo CardioMatrix, 3DM, Inc., Cambridge, MA, EE.UU.). Después de 3 minutos de la reperfusión miocárdica anterior, se suministraron un total de 50 microlitros del material al miocardio infartado con 3

50 inyecciones en el territorio de la arteria descendente anterior distal izquierda. La esternotomía se cerró luego con sutura 4/0 y se dejó que las ratas se recuperaran.

Ecocardiografía

55 Se realizó una ecocardiografía transtorácica el tercer día después de la cirugía utilizando una sonda ultrasónica de red lineal de 13 MHz (Vivid 7, GE Medical Systems, Milwaukee, WI, EE.UU.) después de sedación ligera (ketamina, 0,05-0,10 mg/g ip). Se midieron las dimensiones del ventrículo izquierdo a partir de los trazados en modo M del eje paraesternal corto al nivel ventricular medio y se calculó la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF) con el método de Teich (5). Se promediaron las medidas obtenidas de 2 trazados consecutivos.

60 Se repitió la ecocardiografía bajo sedación ligera el día vigesimooctavo después de la cirugía utilizando los métodos descritos previamente. Se anestesiaron luego las ratas (pentobarbital-sodio 0,10 mg/g ip), se sacrificaron y se extrajeron los corazones para evaluación patológica.

Patología

Cada corazón se cortó en 5 anillos concéntricos desde el vértice a la base. Cada anillo se evaluó respecto a la presencia o ausencia de infarto, adelgazamiento de la pared, fibrosis e inflamación. Solamente la región anterior del

5 corazón en la que se había creado el infarto se registró respecto a gravedad de infarto o adelgazamiento de la pared. Los efectos se registraron como sigue: 0 -0% o ausencia de áreas con registro positivo respecto a infarto o adelgazamiento, 1 -25% del área afectada, designado leve, 2 -50% del área afectada -moderado, 3 ó 4 (75 -100%) áreas afectadas -grave. Los investigadores que realizaron la cirugía de la rata, la ecocardiografía y la evaluación patológica desconocían el material recibido por la rata.

10 Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS para Windows 10.0 (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.). Como los datos eran paramétricos, los mismos se expresan como valor medio ± desviación estándar con un valor p de 2 colas de 0,05 considerado significativo. Las variables categóricas se compararon con los tests exactos chi cuadrado y Fisher. Se utilizaron tests t apareados y tests t independientes para testar intraindividualmente y entre

15 diferencias de individuos.

Resultados

Ecocardiografía

20 De las 27 ratas, 3 murieron (una de cada grupo) antes del segundo ecocardiograma, quedando 24 para análisis. La Tabla I muestra las medidas LVID en centímetros los días 3 y 28, las LVEFs en porcentaje los días 3 y 28, y el cambio en LVEF desde los días 3 y 28 para cada uno de los 3 grupos experimentales. El día 3 después de la isquemia-reperfusión, no había diferencia alguna en LVEF entre los grupos de 3% CardioMatrix, 1% CardioMatrix y

25 control de vehículo (69,4 ± 5,3%, 68,3 ± 2,7% y 70,5 ± 8,9%, respectivamente, p > 0,50, Tabla 1) demostrando que los infartos se administraron de una manera uniforme a todas las ratas incluidas en el estudio.

30 Tabla 1. Resultados de la ecocardiografía. Se calcularon la media y las SDs por parámetro y se calculó el valor p correspondiente para cada comparación. Adicionalmente, los valores mostrados en negrita se representan gráficamente en la Figura 1.

3% CardioMatrix 1% CardioMatrix Control 3% frente a 1% 3% frente a control 1% frente a control

media ± SD media ± SD media ± SD valor p valor p valor p

I. Ecocardiografía

1.Día 3 LVIDd (cm)

0,63±0,06 0,69±0,11 0,65±0,11 0,15 0,62 0,42

2.Día 3 LVIDs (cm)

0,41±0,05 0,44±0,08 0,42±0,11 0,39 0,69 0,78

3.Día 3 LVEF (%)

69,4±5,3 68,3±2,7 70,5±8,9 0,60 0,77 0,51

4.Día 28 LVIDd (cm)

0,74±0,09 0,72±0,15 0,72±0,16 0,80 0,83 0,98

5.Día 28 LVIDs (cm)

0,44±0,11 0,47±0,14 0,48±0,16 0,61 0,60 0,95

6.Día 28 LVEF (%)

76,4±10,7 70,5±8,9 69,9±11,5 - - -

7.Cambio en LVEF%

+7,0±7,1 +2,2±8,9 -0,6±6,3 0,25 0,04 0,49

8.Valor p dentro del grupo (día 3 frente a 28)

0,028 0,52 0,79 - - -

Con objeto de determinar los efectos del tratamiento con CardioMatrix sobre la función ventricular en este modelo de AMI en la rata, se calcularon los valores p comparando los tratamientos unos con otros (es decir, 3% CardioMatrix frente a 1% CardioMatrix o grupo de control y 1% CardioMatrix frente al control) y los valores p comparando el 40 tratamiento dentro de un mismo grupo (es decir, 3% CardioMatrix, 1% CardioMatrix o control el día 3 frente al día 28) (Figura 1). Los valores p correspondientes se calcularon para las comparaciones entre 3% CardioMatrix frente a 1% v (p = 0,25), 3% CardioMatrix frente al control (p = 0,04) y 1% CardioMatrix frente al control (p = 0,49) (Tabla 1, línea 7 en negrita) y se muestran en la Figura 1 (a). El 3% de CardioMatrix frente al valor de control p de 0,04 demuestra una mejora estadísticamente significativa en los animales que recibieron 3% CardioMatrix comparados con los 45 animales que recibieron el control de vehículo. Cuando se estudió individualmente cada uno de los grupos, se

apreciaba también una mejora estadísticamente significativa en las LVEFs del día 3 al día 28 para el grupo de 3% CardioMatrix (69,4 ± 5,3% frente a 76,4 ± 10,7%, cambio medio de 7,0 ± 7,1%, p = 0,028, Tabla 1, Fig. 1b), una tendencia positiva en el grupo de 1% CardioMatrix (68,3 ± 2,7% frente a 70,5 ± 10,1%, cambio medio de 2,2 ± 8,9%, p = 0,52, Tabla 1, Fig. 1b), pero no para el grupo de control de vehículo (70,5 ± 8,9% frente a 69,9 ± 11,5%, cambio medio de -0,6 ± 6,3%, p = 0,79, Tabla 1, Fig. 1b). La Figura 1(b) incluye también una representación de cada uno de los grupos representado gráficamente por separado, representándose cada animal por una línea simple limitada por las medidas el día 3 y el día 28. De los 8 animales de cada grupo, se apreció una mejora en LVEF en 6 ratas en el grupo de 3% CardioMatrix, 3 en el grupo de 1% CardioMatrix y 2 en el grupo de control de vehículo (véase Figura 1 (b)). Considerados en su conjunto, estos cálculos demuestran que el tratamiento con 3% CardioMatrix comparado con el control de vehículo exhibe una mejora estadísticamente significativa de LVEF en las ratas que habían soportado previamente un evento de AMI.

Patología

Para cada una de las 24 ratas que se sacrificaron a los 28 días, se cortaron los corazones en 5 secciones y se evaluaron por separado en una escala de 0-4 (0 -efecto nulo, 4 -grave) en cuanto al tamaño del infarto, adelgazamiento de la pared, fibrosis e inflamación. Los ejemplos de registro para infarto se representan en la Figura

2. En la parte a de la Figura 2 se muestra que el control de vehículo tiene un área de infarto extensa (75% de la región anterior del corazón) frente a la parte b, correspondiente a 3% CardioMatrix, que demuestra un área de infarto mucho menor (25% de la región anterior del corazón). El número de cortes por rata con infarto, fibrosis e inflamación eran todos ellos similares en los grupos de 3% CardioMatrix, 1% CardioMatrix y control de vehículo (Tabla 1). Los resultados se tabularon también por separado como casos totales y graves para cada indicación. No se apreció diferencia alguna en la cantidad de fibrosis o inflamación presente cuando los grupos se compararon con los otros grupos o dentro de un mismo grupo (comparaciones del día 3 frente al día 28) (Tabla 2, líneas 5 y 6). Sin embargo, se apreciaban tendencias positivas para menos cortes por rata en el 3% y 1% de CardioMatrix comparados con el control de vehículo con respecto a infarto grave (0,9 ± 0,8 y 0,8 ± 1,1 frente a 1,4 ± 1,5) y adelgazamiento de la pared -adelgazamiento global de ambas paredes (1,5 ± 1,2 y 1,4 ± 1,1 frente a 2,3 ± 1,7) y adelgazamiento grave de la pared (0,50 ± 0,8 y 0,4 ± 0,7 frente a 0,9 ± 1,1) (Tabla 2, líneas 1-4, Figura 3). En suma, el tratamiento con CardioMatrix en este modelo de AMI en la rata no sólo mejora la función ventricular sino que reduce también la gravedad y, por consiguiente, el tamaño de los infartos así como el grado de adelgazamiento de la pared presente después de 28 días.

Tabla 2. Resultados de la patología. Se calculan la media y las SDs por parámetro; los valores mostrados en negrita se representan gráficamente en la Figura 3.

3% CardioMatrix 1% CardioMatrix Control

media ± SD media ± SD media ± SD

II. Patología (cortes/rata)

1.Infarto presente

2,6±1,4 3,0±1,3 3,1±2,0

2.Infarto grave

0,9±0,8 0,8±1,1 1,4±1,5

3.Adelgazamiento de pared

1,5±1,2 1,4±1,1 2,3±1,7

4. Adelgazamiento de pared grave

0,5±0,8 0,4±0,7 0,9±1,1

5.Fibrosis presente

2,6±0,7 3,0±1,7 3,1±2,1

6.Inflamación presente

2,9±0,8 2,8±1,5 3,3±1,9

Discusión de los Resultados

En este ejemplo, la función cardiaca mejorada tal como se mide por ecocardiografía demostró la eficacia de un material CardioMatrix de la presente invención en un modelo animal de AMI en la rata. Adicionalmente, la caracterización histológica de los efectos del material CardioMatrix comparados con el control de vehículo respalda adicionalmente el beneficio terapéutico del material CardioMatrix con respecto a tamaños de infarto más pequeños y menor adelgazamiento de la pared en los animales tratados. Específicamente, se apreció la recuperación mejorada de la contractilidad del ventrículo izquierdo después del infarto experimental en el grupo de CardioMatrix de alta dosis al 3% comparado con el grupo de control de vehículo (+7,0% frente a -0,6%, p = 0,04) con una respuesta intermedia en el grupo de dosis baja de CardioMatrix al 1% (+2,2%). A pesar de áreas similares de miocardio en riesgo en los 3 grupos, indicadas por LVEFs similares el día 3 y número similar de cortes cardiacos por rata con fibrosis, inflamación e infarto el día 28, había una reducción del tamaño de infarto y del adelgazamiento de pared en los grupos de CardioMatrix comparados con el grupo de control.

Se ha publicado que las interacciones endotelio-miocito cardiaco juegan un papel fundamental en la regulación cardiaca (6). (17).). Se cree, sin ligarse a la teoría, que el andamiaje formado por el material CardioMatrix proporciona un ambiente angiogénico (v.g., un microambiente del miocardio) que favorece el injerto celular, la supervivencia celular a largo plazo y la formación de estructuras vasculares (v.g., una formación de red semejante a capilares).

Se ha comunicado (14) que la inyección de un SAP solo en su modelo de AMI en la rata no mejoraba estadísticamente el acortamiento de la fracción ventricular o disminuía el tamaño del infarto. Sin embargo, los resultados del ejemplo presente demuestran que se obtiene una recuperación ventricular estadísticamente significativa cuando los resultados para el CardioMatrix utilizado al 3% se comparan con el control de vehículo (p = 0,04).

Se cree, sin ligarse a la teoría, que a nivel celular, la creación de microambientes de andamiaje de nanofibras por inyección de un CardioMatrix de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invención, puede promover la supervivencia y la organización de los cardiomiocitos y las células endoteliales después de lesión isquémica (5) y dar como resultado una mejora en la recuperación de la contractilidad ventricular. Adicionalmente, los resultados demuestran que en diversas realizaciones de la invención pueden promover protección contra la lesión de reperfusión o un efecto cardioprotector. Se cree, sin ligarse a la teoría, que la secuencia peptídica de L-arginina (LA) presente en CardioMatrix de este ejemplo puede promover o proporcionar un efecto cardioprotector. Por ejemplo, puede formarse óxido nítrico (NO) a partir de LA y oxígeno, y se sintetiza NO en respuesta a estímulos fisiológicos y patológicos; dado que la lesión de reperfusión cardiaca ha sido atribuida a actividad reducida de NO resultante de la deficiencia de LA (3), diversas realizaciones de la presente invención pueden proporcionar un tratamiento por la vía de suministro local de NO. Además de la enfermedad cardiaca, varias otras enfermedades se han asociado a una liberación inadecuada de óxido nítrico, con inclusión de hipertensión, choque séptico, neuro-degeneración, artritis, y asma.

Se cree, sin quedar ligados a la teoría, que la administración de LA por un material CardioMatrix a soluciones cardiopléjicas o el uso durante la reperfusión del corazón pueden facilitar la recuperación de la función del ventrículo izquierdo después de isquemia hipotérmica por el aumento de la liberación de óxido nítrico y preservación de la función de las células endoteliales (18). De acuerdo con lo anterior, se describen en esta memoria métodos para facilitar la recuperación de la función ventricular por administración local de una solución sustancialmente exenta de células que contiene más de aproximadamente 1% de CardioMatrix en peso y preferiblemente más de aproximadamente 3% de CardioMatrix en peso.

Se cree también, sin quedar ligados a la teoría, que otro mecanismo por el cual actúa la presente invención es por mejora del crecimiento de las células endoteliales y células precursoras semejantes a miocitos, que da como resultado ambientes microvasculares maduros. Se ha comunicado que dicha mejora puede facilitar la curación (5). Se cree, sin quedar ligados a la teoría, que diferencias en los tipos de células o en la evolución temporal de la población de microambientes de andamiaje de nanofibras son mecanismos de acción que pueden utilizarse para explicar la tendencia a un aumento mayor en la contractilidad con la dosis alta del grupo de 3% CardioMatrix comparada con el grupo de 1% CardioMatrix, a pesar de áreas similares de infarto y adelgazamiento de pared.

Se cree también, sin quedar ligados por la teoría, que en el presente ejemplo el material CardioMatrix podría actuar “rescatando” el tejido dañado por mantenimiento del mismo en un estado de aturdimiento hasta que disminuyen el edema y la inflamación (19, 22). CardioMatrix podría funcionar también como un agente de aumento de volumen que protege el tejido contra el estrés de la pared que podría comprometer ulteriormente la función cardiaca (19). Dado que el estrés de la pared es un marcador sustitutivo importante para la insuficiencia cardiaca congestiva, se cree que la presente invención proporciona efecto protector biomecánico o biofísico para el tejido infartado (19).

EJEMPLO 2: Estudios: Biocompatibilidad y Toxicología

Se han completado estudios estándar de toxicología in vitro, con inclusión de tests EN/ISO para citotoxicidad y hemocompatibilidad. Los tests que siguen fueron realizados en una compañía de tests de toxicología certificada por la FDA (Toxikon Corp, Bedford, MA) utilizando estándares establecidos de medida en un material CardioMatrix (Tablas 3 y 4). La solución CardioMatrix testada en este ejemplo comprendía diversas concentraciones de polvo CardioMatrix en solución acuosa sustancialmente exenta de sacarosa.

Tabla 3. Tests de Biocompatibilidad in vivo y Toxicología Tabla 4. Estudios en Animales in vivo

TEST

*RESULTADO

Citotoxicidad: Difusión en Agar ISO 10993-5

No citotóxico

Hemólisis: Contacto Directo (ISO 10993-4)

No hemolítico

Ensayo de Tiempo de Protrombina:

Sin efecto adverso sobre la coagulación de la protrombina del

TEST

*RESULTADO

plasma humano (ISO 10993-4)

*Estos tests están contratados para la instalación del test comercial de toxicología certificado por la FDA (Toxikon Corp, Bedford, MA.).

TEST

*RESULTADO

ADME Tox: Implante de 14 días

Sin acumulación problemática en órgano alguno, excreción. CardioMatrix al 10% Radiomarcada con 14C excretada no más tarde del día 14

Implante de Músculo de Conejo: 14 días (ISO 10993-6)

Registro no tóxico por 13 categorías de reacciones

Pirogenicidad en el Conejo: 24 horas (ISO-10993-11)

Sin efecto en los animales

Implante Intracutáneo: 72 horas (ISO 10993-12)

Índice de Irritación Primaria = 0,0 "Insignificante". Ausencia de reacción febril de cualquier animal más allá de 24 horas de inyección intravenosa de solución diluida

Lesiones del CNS en los Hamsters: 2-60 días

Escaras reducidas y reinervación a través del tracto óptico cortado caudal a la lesión únicamente en los animales tratados con CardioMatrix.

5 Citotoxicidad

El test de Difusión en Agar (ISO 10993-5) mide un efecto del material sobre cultivos de células, que son extremadamente sensibles a cantidades minúsculas de productos químicos lixiviables y exhiben fácilmente signos característicos de toxicidad en presencia de productos lixiviables potencialmente nocivos. La reactividad biológica de

10 un cultivo de células fibroblastos monocapa de mamífero L929 de ratón en respuesta al artículo de test se determinó como “sin reactividad” en los tests.

Hemólisis

15 El test de hemólisis (Direct Contact, ISO-10993-4) mide la aptitud de un material para hacer que los glóbulos rojos de la sangre se rompan. Este test se deriva de protocolos NIH perfectamente establecidos y se realiza por triplicado. Este test utiliza sangre de conejo en contacto directo con el material de test y el grado de hemólisis se mide espectrofotométricamente. El CardioMatrix arrojó resultados de test “no hemolítico” en los tests realizados por una agencia de tests independiente certificada por la FDA.

Tiempo de Coagulación de la Protrombina

El Tiempo de Protrombina (Plasma Humano, ISO 10993-4) mide el efecto de un extracto de artículo de test sobre el tiempo de coagulación de la sangre humana. Este ensayo se ha convertido en un medio clínico adecuado de

25 determinación de la presencia y capacidad funcional de la protrombina en el proceso de la coagulación. CardioMatrix no tenía un efecto adverso sobre el tiempo de la coagulación de la protrombina del plasma humano, en tests realizados por una agencia de tests independiente certificada por la FDA.

ADME y Biodegradabilidad

30 Para medir la distribución animal local y completa, se generó una versión radiomarcada con carbono 14 de CardioMatrix. La versión radiomarcada se marcó íntegramente en el sitio de la tercera alanina (Acetil-(RADA)-(R[14C(U)-Ala]-D-A)-(RADA)2-CONH2) en oposición a un grupo acetilo marcado que podría escindirse, a fin de caracterizar mejor la adsorción, la degradación, el metabolismo y la excreción (ADME) del material CardioMatrix in

35 vivo. El material radiomarcado se implantó luego en ratas Sprague Dawley en un modelo de defecto en el fémur. Se recogieron muestras de orina y de heces y se contó la radiactividad.

Implante de Músculo de Conejo (2 semanas)

40 Este test evalúa los efectos locales de un material en contacto con tejido vivo. El artículo de test se implantó en el músculo paravertebral de 3 conejos blancos de Nueva Zelanda, con control negativo (GelFoam) implantado en el músculo contralateral de cada animal. Se dejó tiempo para la curación durante 2 semanas. Se sacrificaron los animales y se extirparon los implantes. Los implantes extirpados se examinaron macroscópicamente con una lente de aumento y se fijaron en formalina. Se prepararon cortes histológicos de hematoxilina y eosina (H&E) y secciones

teñidas con Trichrome de Mason fueron estudiadas microscópicamente por un patólogo veterinario certificado por la junta, y se evaluaron en una escala de 0-3. Los implantes de CardioMatrix retenían el volumen de implante, las fibras de colágeno, y la vascularización iniciales del sitio de inyección. El material se clasificó como No-Tóxico (0,13) en una escala iba desde No Tóxico (< 1), Ligeramente Tóxico (1 a < 2), Medianamente Tóxico (2 a < 3), Moderadamente tóxico (3 a > 4), hasta Severamente Tóxico (< 4), en tests realizados por una agencia de tests independiente certificada por la FDA.

Reactividad Intracutánea

Los tests de reactividad de irritación evalúan la reacción localizada de los tejidos, con inclusión de tejido roto y contacto con la sangre, para idear materiales o extractos. Una solución del péptido CardioMatrix al 0,5% p/v se extrajo en NaCl y CSO a una ratio de 0,2 g x 1,0 ml a 70 ± 2ºC durante 24 horas. Se prepararon extractos de control, de manera similar al artículo de test. Se inyectaron intracutáneamente 3 conejos, utilizando un lado del animal para los extractos del artículo de test y el otro lado para los extractos de control, a 0,2 ml por sitio. Los sitios inyectados se examinaron a las 24, 48 y 72 horas después de la inoculación respecto a la evidencia grosera de reacción tisular tal como eritema, edema, y necrosis. Un Índice de Irritación Primaria de 0,5 o menos se considerará como irritante sin importancia, donde 0,5 a < 2 son irritantes leves, 2 a < 5 son irritantes moderados, y > 5 son irritantes severos. Los sitios de test inyectados con CardioMatrix no exhibían signos de eritema o edema durante el periodo de observación de 72 horas. El Índice de Irritación Primaria para el material es 0,0 en los tests realizados por una agencia de test independiente certificada por la FDA.

Pirógeno de Conejo

El propósito del test fue detectar el riesgo de un paciente para una reacción febril como resultado de la administración del extracto del artículo de test. El artículo de test se preparó por mezcladura de 9 ml del artículo de test con 9 ml de Cloruro de Sodio USP para inyección al 0,9% (NaCl) y el gel resultante se extrajo a una ratio de 0,2 g por 1,0 ml. El extracto del artículo de test se administró por inyección intravenosa a 10 ml/kg. Las temperaturas rectales de los conejos inyectados se compararon con la temperatura de un conejo de control inyectado análogamente con Cloruro de Sodio USP para inyección al 0,9% (NaCl). Se utilizaron las temperaturas basales de los conejos, determinadas no más de 30 minutos antes de la inyección del extracto del artículo de test, para excluir aquellos conejos cuyas temperaturas corporales varían en más de 1ºC de uno a otro y cuyas temperaturas son mayores que 39,8ºC. Se registraron las temperaturas corporales a intervalos de 30 minutos entre 1 y 3 horas después de la inyección. Si ningún conejo exhibía un aumento en la temperatura de 0,5ºC o más alrededor de su temperatura basal, el producto cumplía los requerimientos de ausencia de pirógenos. Ninguno de los animales inyectados con el extracto del artículo de test exhibía signos de respuesta pirogénica en los tests realizados por una agencia de test independiente certificada por la FDA.

Los encabezados de las secciones utilizados en esta memoria tienen por objeto servir únicamente para propósitos organizativos y no deben interpretarse en absoluto como limitantes de la materia que constituye el objeto descrita.

REFERENCIAS

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una solución exenta de células que comprende un tampón y un péptido anfifílico autoensamblador que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 1, en donde la solución exenta de células

   5 contiene más de 1% en peso del péptido y el péptido no está modificado para contener secuencias activas del factor de crecimiento derivado de las plaquetas, para uso en el tratamiento de una afección cardiaca, que comprende administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz la solución exenta de células a un sitio de tejido cardiaco que ha resultado lesionado debido a uno o más de fibrilación atrial, infarto agudo de miocardio, isquemia-reperfusión, enfermedad pericárdica, enfermedad cardiaca congénita, e insuficiencia cardiaca congestiva.
2. 2. La solución para el uso de la reivindicación 1, en donde el paso de administración comprende administrar el péptido autoensamblador en una cantidad suficiente para reducir uno o más de infarto de miocardio, expansión de infarto, estrés de la pared ventricular, y fibrilación atrial.

   15 3. La solución para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el paso de administración comprende suministrar localmente óxido nítrico al sitio de lesión del tejido cardiaco y/o al tejido a tratar.
3. 4. La solución para el uso de la reivindicación 3, en donde el óxido nítrico se suministra localmente por uno o más de

   formación a partir de la secuencia peptídica de L-arginina (LA) presente en el péptido autoensamblador y formación 20 en respuesta a un estímulo proporcionado por el péptido autoensamblador.
4. 5. La solución para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el paso de administración comprende inyectar el péptido anfifílico autoensamblador en el tejido cardiaco.

   25 6. La solución para el uso de la reivindicación 1, en donde la solución exenta de células contiene más de 3% en peso de un péptido anfifílico autoensamblador constituido por una secuencia RADARADARADARADA (SEQ. ID. NO. 1).
5. 7. La solución para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la solución exenta de células 30 comprende una concentración fisiológicamente aceptable de sacarosa.