ES2928997T3

ES2928997T3 - Síntesis in vivo de fibra elástica

Info

Publication number: ES2928997T3
Application number: ES19155435T
Authority: ES
Inventors: Suzanne Marie Mithieux; Anthony Steven Weiss
Original assignee: Allergan Pharmaceuticals International Ltd
Current assignee: Allergan Pharmaceuticals International Ltd
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2022-11-24
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: KR101969104B1; HUE044367T2; US20190328845A1; AU2019204915B2; AU2017204582B2; AU2017204582A1; AU2012315489A1; CA2850384A1; TR201905884T4; KR20140084059A; AU2020204197B2; AU2012315489B2; EP2760466B1; US20140235547A1; RU2016139716A3; US20240000898A1; RU2016139716A; CN107252478A; DK2760466T3; RU2020121715A

Abstract

En el presente documento se describen métodos para restaurar la elasticidad en tejidos usando composiciones que contienen tropoelastina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Síntesis in vivo de fibra elástica

Campo de la invención

[0001] La invención está relacionada con la restauración o la recreación de la elasticidad de un tejido, con la que se mejora el aspecto físico y/o la función del tejido envejecido o dañado.

Antecedentes de la invención

[0002] El envejecimiento y el daño tisular están asociados a la degeneración de la matriz extracelular, que conduce a la pérdida de la estructura y/o función del tejido. La piel flácida, el tejido subcutáneo relajado, la pérdida de densidad de la matriz extracelular, las arrugas, las estrías y la fibrosis son las manifestaciones físicas de la degeneración. Dependiendo del tejido relevante, la pérdida de la función elástica puede manifestarse como una disminución de la capacidad pulmonar o cardíaca o una disminución de la distensibilidad y/o resiliencia de varias válvulas y esfínteres.

[0003] Hace aproximadamente 20 años, con las distintas investigaciones se buscaba utilizar las diversas moléculas de la matriz extracelular en una variedad de intervenciones clínicas y cosméticas para corregir la pérdida de estructura y función de los tejidos. Las moléculas de interés clave fueron aquellas que son sustratos de las fibras de la matriz extracelular relevantes, a saber, colágeno y elastina. En general, el enfoque fue usar estos biomateriales, ya fuera como implantes o rellenos para aumentar el aspecto del tejido al rellenar los vacíos del tejido o devolver la estructura o rellenar el tejido, o mediante el uso de estas fibras como implantes o rellenos para mejorar su función defectuosa.

[0004] Algunos consideraron que la elastina era ventajosa para este fin porque, a diferencia del colágeno, podía usarse para formar implantes y rellenos elásticos. Las investigaciones iniciales se centraron en la síntesis de formas recombinantes de tropoelastina que luego se coacervarían y se reticularían química o enzimáticamente, antes o después de su administración a un individuo, para formar un implante o relleno elástico ex vivo o in vivo para rellenar huecos del tejido o para aumentar o remodelar el tejido. Véanse, por ejemplo, los documentos WO1994/14958; WO1999/03886; WO2000/04043. WO2010/102337 se refiere a la relevancia de la concentración de sólidos en la formación de un biomaterial reticulado inyectable.

[0005] Cuando se utilizó la reticulación enzimática in vivo, se usó lisil oxidasa recombinante u otra oxidada exógena. En el documento USSN 09/498,305 se describe un método para la reticulación enzimática de monómeros de tropoelastina in vivo mediante la administración de una composición que incluye monómeros exógenos de lisil oxidasa y tropoelastina.

[0006] Otro enfoque para la formación de un material que se asemeja a algunas características de la tropoelastina reticulada se describe en el documento WO2008/058323, según el cual se forma un material elástico compuesto por tropoelastina no reticulada en condiciones alcalinas.

[0007] En cada uno de los ejemplos anteriores, la tropoelastina exógena y el agente de reticulación o las condiciones alcalinas se utilizan para inducir la formación del implante o relleno. El tiempo de formación del producto final elástico depende de la concentración de tropoelastina, del agente de reticulación y de las condiciones relevantes, de modo que el producto final resulta de un proceso que es acelular.

[0008] También se contemplaron otros usos de la tropoelastina, incluidos: (i) como agente de cierre de heridas (WO94/14958); (ii) como vehículo de administración de ingredientes activos que proporcionan formulaciones de liberación lenta biodegradables o biodisociables (WO94/14958) (iii) como reactivo de unión para GAG (WO99/03886); (iv) para interferir con el depósito de elastina (WO99/03886); y (v) en sitios de heridas, lugares de daño tisular y remodelación donde se suelen encontrar serina proteasas (WO00/04043).

[0009] Las primeras investigaciones sugirieron que se podrían usar múltiples formas de tropoelastina para cualquiera de las aplicaciones anteriores. Véase, por ejemplo, el documento WO94/14958, que trata sobre una forma sintética de tropoelastina humana que incluye el dominio 26A. En el documento WO94/14958 se describen formas de mamíferos y de aves para su uso en composiciones farmacéuticas; WO99/03886 trata sobre varias formas sintéticas de tropoelastina humana, incluidas aquellas que carecen del dominio 26A, el dominio C-terminal y otras. En el documento WO99/03886 se describen formas humanas y no humanas para su uso en aplicaciones farmacéuticas. Se habla de una forma particular, SHEL526A, con referencia a la falta de actividad de unión a GAG; y WO00/04043, que se refiere a formas de tropoelastina que tienen susceptibilidad reducida a las serina proteasas, específicamente trombina, plasmina, calicreína, gelatinasas A y B y metaloelastasas de la matriz. En el documento WO00/04043 se describen las formas relevantes de tropoelastina que tienen susceptibilidad reducida (denominadas "derivado reducido de la tropoelastina”), útiles en estas aplicaciones que incluyen formas de longitud parcial y completa y formas xenogénicas.

[0010] En cada ejemplo de esta investigación inicial, aunque se podía proporcionar un implante con propiedades elásticas al tejido, la naturaleza del implante y sus propiedades elásticas no eran similares a las que normalmente se atribuyen al tejido. Por ejemplo, las propiedades elásticas impartidas por un relleno o implante como se describe en esta investigación inicial a un tejido dérmico o subcutáneo podrían verse claramente diferentes a la elasticidad normal de ese tejido. En otras palabras, si bien se podría impartir elasticidad a un tejido mediante la implantación de un material con propiedades que incluyen elasticidad, no se podría volver a un aspecto físico o función similar a la normal.

[0011] En retrospectiva, este resultado quizás no sea sorprendente, ya que una investigación más reciente durante los últimos 5 a 10 años ha revelado que el perfil elástico de un tejido dado es el resultado de un proceso complejo en el que están involucrados múltiples factores además de la lisil oxidasa y la tropoelastina, conocido como "elastogénesis". La elastogénesis generalmente se entiende como un proceso fisiológico que ocurre desde la vida fetal tardía hasta la vida posnatal temprana, mediante el cual se crea fibra elástica de novo por células entre las que se incluyen los fibroblastos, las células musculares lisas y similares a partir de monómeros de tropoelastina y otros factores relevantes. Comenzando con un conjunto común de factores, un tejido relevante proporciona una interacción específica de tejido de estos factores que da como resultado una síntesis, organización y distribución de fibra elástica que es natural para el tejido relevante y de la cual surge el perfil elástico del tejido. (Cleary EG y Gibson M.A. Elastic Tissue, Elastin and Elastin Associated Microfibrils in Extracellular Matrix Vol 2 Molecular Components and Interactions (Ed Comper W.D.) Harwood Academic Publishers 1996 p95). Lo que ha quedado claro es que esta organización y el perfil concomitante no pueden recrearse simplemente reticulando la tropoelastina exógena con la lisil oxidasa exógena ex vivo o in vivo como propone la investigación inicial.

[0012] La iniciación de un proceso que es como la elastogénesis (es decir, uno mediante el cual el tejido sintetiza una fibra elástica de novo a partir de un conjunto común de factores) en tejido adulto es un objetivo deseable porque se cree que tal proceso restauraría el perfil elástico de un tejido. Por ejemplo, se podría restaurar el perfil elástico de un tejido envejecido de modo que el perfil del tejido se asemeje al de un tejido más joven. Desafortunadamente, el objetivo sigue siendo difícil de alcanzar, principalmente porque en los adultos la formación de fibra elástica de novo es insignificante. Aunque la reparación de la fibra elástica puede ocurrir en algunas enfermedades cardiovasculares y pulmonares, la integridad y organización de la fibra elástica que surge de los mecanismos de reparación es diferente a la que surge de la elastogénesis. (Akhtar et al. 2010 J. Biol. Chem 285: 37396-37404).

[0013] Este problema ha sido estudiado intensamente por varios grupos de investigación durante la última década (Huang R et al., Inhibition of versican synthesis by antisense alters smooth muscle cell phenotype and induces elastic fiber formation in vitro and in neointima after vessel injury. Circ Res. 2006 Feb 17; 98(3):370-7; Hwang JY et al., Retrovirally mediated overexpression of glycosaminoglycan-deficient biglycan in arterial smooth muscle cells induces tropoelastin synthesis and elastic fiber formation in vitro and in neointimae after vascular injury. Am J Pathol. 2008 Dec;173(6):1919-28.; Albertine KH et al., Chronic lung disease in preterm lambs: effect of daily vitamin A treatment on alveolarization. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010 Jul 299(1):L59-72; Mitts TF et al., Aldosterone and mineralocorticoid receptor antagonists modulate elastin and collagen deposition in human skin. J Invest Dermatol. 2010 Oct,130(10):2396-406, Sohm B et al., Evaluation of the efficacy of a dill extract in vitro and in vivo. Int J Cosmet Sci. 2011 Apr;33(2):157-63; Cenizo Vet al., LOXL as a target to increase the elastin content in adult skin: a dill extract induces the LOXL gene expression. Exp Dermatol. 2006 Aug;15(8):574-81). La hipótesis ampliamente considerada para explicar la ausencia de formación de fibras elásticas de novo en adultos es que las células adultas o el tejido relevante en el que están contenidas carecen de uno o más de los factores y procesos necesarios para la elastogénesis (Shifren A & Mecham R.P. The stumbling block in lung repair of emphysema: elastic fiber assembly. Proc Am Thorac Soc Vol 3 p 428-4332006). Según esta hipótesis, la provisión de tropoelastina sintética al tejido adulto no debería permitir que una célula adulta sintetice fibra elástica a partir de la tropoelastina sintética.

[0014] La investigación actual se ha centrado en comprender los mecanismos y factores que son la base de la elastogénesis en la vida temprana y determinar si estos están presentes en la vida adulta. (Wagenseil JE y Mecham RP. New insights into elastic fiber assembly. Birth Defects Res C Embryo Today. 2007 Dec;81(4):229-40.)

[0015] En general, se cree que poco después de la expresión de la proteína tropoelastina, se coacerva en un conjunto de esferas de aproximadamente 200-300 nm que luego se fusionan en partículas de aproximadamente una micra. Luego, estas partículas se ensamblan a lo largo de las microfibrillas en la matriz extracelular, formando así fibras elásticas. (Kozel BA et al., Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J Cell Physiol. 2006 Apr;207(1):87-96). Se sigue investigando la participación de una serie de factores adicionales en este proceso.

[0016] En los estudios in vitro de los diversos pasos moleculares se ha tendido a examinar sustratos de tropoelastina humana y no humana y una gama de diferentes isoformas de tropoelastina. (Davidson JM et al., Regulation of elastin synthesis in pathological states. Ciba Found Symp. 1995;192:81-94; discussion 94-9). A través de esta obra se ha revelado que al menos 34 moléculas diferentes están asociadas con las fibras elásticas, aunque solo se haya podido demostrar que algunas de ellas están involucradas estructuralmente en la producción de fibras. Estas incluyen la tropoelastina, la fibrilina-1, la fibrilina-2, la lisil oxidasa, la lisil oxidasa-like-1 (LOXL1), la emilina, la fibulina-4 y la fibulina -5. (Chen et al. 2009 J. Biochem 423: 79-89). Un grupo considera que LOXL1, un miembro de la familia de la LOX, es la molécula clave que falta en cierto tejido adulto (véanse los documentos US2004/0258676, US2004/0253220 y US20100040710). Otros grupos identifican la fibulina 4 y otras moléculas, ya sea a través de la interacción con la lisil oxidasa u otras moléculas. (Yanagisawa H & Davis EC. Unraveling the mechanism of elastic fiber assembly: The roles of short fibulins. Int J Biochem Cell Biol. 2010 Jul;42(7):1084-93).

[0017] En resumen, aunque el panorama acerca de la interacción de los factores en la elastogénesis aún no está completo, la investigación actual indica que las células y los tejidos adultos no completan un proceso similar a la elastogénesis porque carecen de uno o más factores. De ello se deduce que la provisión de tropoelastina por sí sola al tejido adulto no debería ser suficiente por sí misma para restaurar el perfil elástico del tejido, porque sin los factores relevantes requeridos para la elastogénesis, el tejido no puede utilizar la tropoelastina para formar una fibra elástica.

[0018] Sigue existiendo la necesidad de restaurar o recrear un perfil elástico de un tejido, o de minimizar la degeneración de un perfil elástico de un tejido.

[0019] Existe la necesidad de mejorar el perfil elástico de un tejido envejecido para que se asemeje más al perfil del tejido en una etapa anterior de la vida.

[0020] Existe la necesidad de mejorar el aspecto físico del tejido envejecido, incluido el tejido fotoenvejecido, por ejemplo, para minimizar la piel flácida, el tejido subcutáneo relajado, la pérdida de densidad de la matriz extracelular, las arrugas y las estrías.

[0021] También existe la necesidad de mejorar el perfil elástico de tejidos cicatriciales o fibróticos para que el perfil se asemeje más al perfil del tejido relevante que contiene la cicatriz o el tejido fibrótico antes de que se dañara.

[0022] También existe la necesidad de proporcionar una función elástica mejorada a un tejido envejecido o dañado que se asemeje más a la función elástica del tejido relevante en una etapa más temprana de la vida o antes de que se dañara.

[0023] Las necesidades mencionadas anteriormente son distintas de las que abordan los implantes o rellenos y el uso de estos para rellenar tejido con tropoelastina reticulada, como en el estado de la técnica pertinente que se acaba de describir.

Resumen de la invención

[0024] La invención pretende abordar una o más de las necesidades mencionadas anteriormente. La invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0025] En una forma de realización, se proporciona un método para restaurar un perfil elástico de un tejido de un individuo, que incluye:

- contar con un individuo que tenga un tejido cuyo perfil elástico se desea restaurar;

- administrar tropoelastina al individuo de acuerdo con un régimen de tratamiento que se ha seleccionado para mantener la tropoelastina administrada en el tejido durante un período de tiempo que permite que los factores expresados en el tejido para la formación de una fibra elástica se unan a la tropoelastina administrada para la síntesis de fibra elástica a partir de esta;

- de esta manera, se restaura o se recrea el perfil elástico del tejido del individuo.

[0026] En otra forma de realización, se proporciona un método para minimizar la degeneración de un perfil elástico de un tejido de un individuo, que incluye:

- contar con un individuo que tenga un tejido en el que se desea minimizar la degradación de un perfil elástico;

- de esta manera, se minimiza la degeneración de un perfil elástico de un tejido de un individuo.

[0027] En otra forma de realización, se proporciona un método para mejorar el perfil elástico de un tejido envejecido para que se asemeje más al perfil del tejido en una etapa anterior de la vida, que incluye:

- contar con un individuo que tenga un tejido cuyo perfil elástico se desea mejorar;

- de esta manera, se mejora el perfil elástico del tejido envejecido para que se asemeje más al perfil del tejido en una etapa anterior de la vida.

[0028] En otra forma de realización, se proporciona un método para mejorar el aspecto físico del tejido envejecido, que incluye:

- contar con un individuo que tenga un tejido cuyo aspecto físico se desea mejorar;

- de esta manera, se mejora el aspecto físico del tejido envejecido.

[0029] En otra forma de realización, se proporciona un método para mejorar el perfil elástico de tejido cicatricial o fibrótico para que el perfil se asemeje más al perfil del tejido relevante que contiene la cicatriz o el tejido fibrótico antes del daño tisular, que incluye:

- contar con un individuo que tenga un tejido cicatricial o fibrótico;

- de esta manera, se mejora el perfil elástico del tejido cicatricial o fibrótico.

[0030] En otra forma de realización, se proporciona un método para mejorar la función elástica de tejido envejecido o dañado de modo que se asemeje más a la función elástica del tejido relevante en una etapa anterior de la vida o antes del daño, que incluye:

- contar con un individuo que tenga un tejido envejecido o dañado;

- de esta manera, se mejora la función elástica del tejido envejecido o dañado.

[0031] En otra forma de realización, se proporciona un método para proporcionar elasticidad a la piel de un individuo, preferiblemente para proporcionar grosor a la piel de un individuo mientras se mantiene o se mejora la elasticidad de la piel del individuo, método incluye los siguientes pasos:

- contar con un individuo;

- definir un área de tratamiento en la piel del individuo, en donde el área de tratamiento es un área de piel a la que desea a proporcionar elasticidad;

- inyectar una composición de tropoelastina dentro del área de tratamiento para establecer una cantidad de tropoelastina dentro del área de tratamiento que aumenta con respecto a la piel que está fuera del área de tratamiento;

- mantener la cantidad de tropoelastina en el área de tratamiento durante un período de tiempo predeterminado, proporcionando así elasticidad a la piel de un individuo.

[0032] En otra forma de realización, se proporciona una composición de tropoelastina como se describe en este documento para usar en una o más de las siguientes aplicaciones:

- restaurar el perfil elástico de un tejido de un individuo

- minimizar la degeneración del perfil elástico de un tejido de un individuo

- mejorar el perfil elástico de un tejido envejecido para que se parezca más al perfil del tejido en una etapa anterior de la vida

- mejorar el aspecto físico del tejido envejecido

- mejorar el perfil elástico del tejido cicatricial o fibrótico para que el perfil se asemeje más al perfil del tejido relevante que contiene la cicatriz o el tejido fibrótico antes del daño tisular

- mejorar la función elástica del tejido envejecido o dañado para que se asemeje más a la función elástica del tejido relevante en una etapa anterior de la vida o antes del daño.

Breve descripción de los dibujos

[0033]

Figura 1: Imágenes fluorescentes en las que se muestran redes de elastina formadas 7 días después de la adición de 250 pg/ml de tropoelastina a fibroblastos humanos cultivados procedentes de diferentes grupos de edad. A. Neonato de sexo masculino (NHF 8-9-09); B. Varón de 10 años (GM3348); C. Varón 31 años con quemaduras (230209A); D. Varón de 51 años (142Br ); E. Varón de 92 años (AG04064). El depósito de la red de elastina está en verde, los núcleos celulares en azul.

Figura 2: Imágenes fluorescentes en las que se muestra el depósito de elastina 7 días después de la adición de tropoelastina a fibroblastos de cerdo y conejo cultivados. A. Fibroblastos primarios de piel de cerdo de 10 semanas; B. Fibroblastos de piel de conejo adulto. El depósito de elastina es verde, los núcleos celulares son azules.

Figura 3: Imágenes fluorescentes en las que se muestra la formación de fibras de elastina por las células musculares lisas de las vías respiratorias primarias 7 días después de la adición de tropoelastina. A. Células musculares lisas de las vías respiratorias (3785). B. Otra fuente de células musculares lisas de las vías respiratorias (3791). El depósito de elastina es verde, los núcleos celulares son azules.

Figura 4: Imágenes fluorescentes en las que se muestra la formación de fibras de elastina por fibroblastos humanos neonatales primarios 7 días después de la adición de tropoelastina o derivados. A. Sin tropoelastina; B. Tropoelastina de longitud completa; C. Péptidos de elastina de piel humana; D. Deleción de RKRK; E. Sustitución de RGDS. F. Tropoelastina de Advanced Biomatrix. El depósito de elastina es verde, los núcleos celulares son azules.

Figura 5: Imágenes fluorescentes en las que se muestra la formación de fibras de elastina por fibroblastos humanos neonatales primarios 7 días después de la adición de 125 pg/ml de tropoelastina en ausencia (A) y presencia (B) de blebistatina 50 pM. El depósito de elastina es verde, los núcleos celulares son azules.

Figura 6: Imágenes fluorescentes en las que se muestra el grado de formación de la red de elastina por fibroblastos humanos neonatales primarios después de adiciones repetidas de tropoelastina. A. Células; B. Adición de células tropoelastina el día 10; C. Adiciones de células tropoelastina el día 10 y el día 17; D. Adiciones de células tropoelastina el día 10, el día 17 y el día 24. Todas las muestras se fijaron para obtener imágenes el día 31. El depósito de elastina es verde, los núcleos celulares son azules.

Figura 7: Fibras de elastina maduras autofluorescentes. (A) fibroblastos sin tropoelastina añadida, (B) fibroblastos con tropoelastina añadida.

Figura 8: análisis por AFM de cultivos dérmicos de fibroblastos humanos. Las imágenes representan la topografía de cultivo superpuesta con el canal de módulo. (A) Fibroblastos sin tropoelastina añadida, (B) fibroblastos con tropoelastina añadida.

Figura 9: Formación de fibras elásticas por fibroblastos dérmicos neonatales humanos. Se añadió tropoelastina 12 días después de la siembra y las muestras se tiñeron con DAPI, anticuerpo de ratón antielastina y anti-ratón conjugado con FITC.

Figura 10: La inhibición de la lisil oxidasa previene la formación de fibras elásticas. Formación de fibras de elastina en presencia de BAPN, un inhibidor de la lisil oxidasa. Las muestras se tiñen con DAPI, anticuerpo de ratón anti-elastina y anti-ratón conjugado con FITC.

Figura 11: Imágenes de microscopía de súper resolución de esférulas de tropoelastina dentro de un cultivo de fibroblastos dérmicos humanos. (A) La barra de escala es de 1 micra. (B) La barra de escala es de 2 micras. Figura 12: Imágenes de MET de cultivo de fibroblastos dérmicos humanos 3 días después de la adición de tropoelastina.

Figura 13: Secciones teñidas con Verhoeff-Van Gieson (VVG) de biopsias de la semana 2. Tinción con VVG para elastina en cortes transversales dérmicos en piel de cerdo 2 semanas después del tratamiento de una herida de grosor completo con construcciones que contienen tropoelastina. La prueba A es un modelo de colágeno reticulado en presencia de tropoelastina al 10 %. La prueba B es un modelo de colágeno reticulado aplicado sobre una matriz de tropoelastina reticulada con un HA modificado. Las imágenes se contrastan con piel de cerdo normal y el control, que es un modelo de colágeno reticulado.

Figura 14: Secciones de biopsia de piel de sujetos tratados con formulaciones basadas en RVL o elastina en la dermis de la parte superior del brazo. (A) La piel tratada con RVL muestra fibras de colágeno dérmicas separadas por material RVL sin teñir que hace que la piel se vuelva más rígida y con bultos. (B) La piel tratada con formulaciones a base de tropoelastina da como resultado fibras de colágeno dérmico separadas por el material del implante que se tiñe por VVG de azul a púrpura a negro, lo que indica que el material del implante se remodela para convertirse en fibras de elastina maduras.

Descripción detallada de las formas de realización

[0034] Se cree que los descubrimientos clave de la invención surgen de un sistema de ensayo novedoso desarrollado por los inventores y ejemplificado en los Ejemplos del presente documento. El sistema de ensayo utiliza células humanas adultas para formar fibras elásticas in vitro. El sistema se puede manipular para permitir la disección de cada paso de la formación de fibras elásticas y para identificar los componentes y procesos necesarios para la formación de fibras elásticas.

[0035] Este sistema de ensayo ha revelado una ruta de síntesis de fibras elásticas diferente a la conocida previamente antes de la invención. Un hallazgo clave es que la formación de fibras depende mucho más de la interacción celular de lo que se pensaba anteriormente.

[0036] Un hallazgo clave es que el sistema no da como resultado una síntesis sustancial o significativa de fibra elástica a menos que se añada monómero de tropoelastina exógena al sistema. Esto apunta a la importancia de la tropoelastina en la síntesis de fibras elásticas in vivo.

[0037] Además de esto, el sistema demuestra que la formación de fibras elásticas no se produce de forma eficaz si el sistema utiliza monómeros de tropoelastina humana con células no humanas.

[0038] Además, generalmente se requiere que los monómeros adopten la forma de una o más isoformas naturales. Si bien los monómeros se pueden sintetizar de forma recombinante, se ha descubierto que las formas recombinantes que tienen una secuencia o estructura que no existe en la fisiología humana no permiten la formación eficiente de fibras elásticas, aunque la formación de fibras sigue siendo posible hasta cierto punto siempre que la diferencia de secuencia entre la tropoelastina endógena y exógena no sea inferior a aproximadamente el 65 % de homología.

[0039] Además de esto, la administración repetida de tropoelastina al sistema demuestra una capacidad continua para formar fibras elásticas, lo que indica que la tropoelastina es el factor limitante para la formación de fibras elásticas.

[0040] Se cree que el uso de células adultas humanas e isoformas de tropoelastina humana naturales distingue el sistema de ensayo de otros (véase, por ejemplo, Sato F et al., Distinct steps of cross-linking, self-association, and maturation of tropoelastin are necessary for elastic fiber formation. J Mol Biol. 2007 Jun 8;369(3):841-51) y es probable que por eso estos grupos de investigación relevantes no hayan entendido que las células adultas humanas sí tienen potencial para la síntesis de fibra elástica en un proceso parecido a la elastogénesis, siempre que las células estén expuestas a la tropoelastina.

[0041] En estudios adicionales, un ensayo clínico ejemplificado aquí establece la importancia de mantener la tropoelastina en el tejido durante el tiempo suficiente para que las células se unan a la tropoelastina. Esto se puede lograr estableciendo y manteniendo una cantidad de tropoelastina en un área de tejido que se desea tratar durante un período de tiempo seleccionado de modo que el área tratada tenga una cantidad de tropoelastina mayor que un área no tratada. Se cree que, siempre que la tropoelastina persista en el tejido durante un período de tiempo lo suficientemente largo como para que se una con las células o, cuando el tejido tenga pocas células, para el reclutamiento y la unión con las células, puede ocurrir un proceso similar a la elastogénesis en tejido adulto que resulta en la formación de fibra y una restauración del perfil elástico del tejido. Los períodos de tiempo ejemplares para la persistencia o el mantenimiento de la tropoelastina en el tejido se analizan más adelante.

[0042] Se entenderá que la fibra elástica formada de acuerdo con la invención puede tener la misma estructura molecular que la observada en la naturaleza, aunque en algunas formas de realización la estructura molecular y/o física de la fibra puede ser diferente. En algunas formas de realización, la fibra elástica puede tener una estructura física distinta de la del tejido tratado, al mismo tiempo que logra los objetivos de la invención.

[0043] En formas de realización particulares, la elastina que se sintetiza según los métodos de la invención se integra con los tejidos, las células y/o la matriz extracelular, restaurando o recreando así el perfil elástico, mejorando el aspecto físico o logrando otros criterios de valoración clínicos. En estas formas de realización, la elastina sintetizada puede tener una estructura física o molecular diferente en comparación con la fibra elástica que se suele observar en el tejido, y la obtención de un resultado deseado puede deberse a una interacción o unión entre la elastina y los otros componentes del tejido relevante. La interacción o acoplamiento puede modelar ostensiblemente los procesos que normalmente se observan entre la fibra elástica y los elementos de tejido en el tejido relevante.

[0044] En una forma de realización, la fibra elástica formada según la invención se proporciona en forma hidratada, imbuyendo así a la fibra de potencial elástico.

[0045] Los estudios que forman la base de esta invención demuestran que una restauración o recreación del perfil elástico es posible en tejido adulto porque las células adultas tales como los fibroblastos, las células musculares lisas y similares tienen potencial elastogénico, es decir, potencial para participar en un proceso que es como la elastogénesis y que, por lo tanto, devuelve un perfil elástico relevante al tejido. Además, el potencial se alcanza siempre que las células adultas reciban especies e isoformas de monómero de tropoelastina potencialmente relevantes para los tejidos. Además, los inventores han demostrado que la tropoelastina humana recombinante que contiene niveles sustanciales de impurezas no da como resultado una formación eficaz de fibras de elastina. En algunas formas de realización, la tropoelastina tiene un grado específico de pureza con respecto a la cantidad de tropoelastina en una composición para la administración, en comparación con las cantidades de otras proteínas o moléculas de la composición. En una forma de realización, la tropoelastina está en una composición que tiene al menos un 75 % de pureza, preferiblemente un 85 % de pureza, más preferiblemente más de un 90 o un 95 % de pureza. Se entenderá que, en algunas formas de realización, la tropoelastina se puede proporcionar en forma de una composición que consiste en, o consiste esencialmente en, tropoelastina, preferiblemente una isoforma de tropoelastina de longitud completa. Finalmente, las células son incapaces de utilizar la tropoelastina para formar una fibra elástica si la tropoelastina ya se ha reticulado sustancialmente en el plano intramolecular.

[0046] Según la invención, el régimen de tratamiento es uno que mantiene la tropoelastina dentro de un área de tratamiento definida de un tejido durante un tiempo suficiente dentro del que las células pueden unirse y utilizar la tropoelastina administrada para formar una fibra elástica. Un régimen apropiado puede implicar más de una sola administración de monómeros de tropoelastina, o más que la administración de monómeros no adulterados, porque se cree que los monómeros de tropoelastina tienen una semivida dentro de un área de tejido de tratamiento definida que generalmente es menor que la requerida para que las células pertinentes formen la fibra elástica. Más en detalle, se cree que los monómeros de tropoelastina que no interactúan con las células se metabolizan en un área de tratamiento o se dispersan desde un área de tratamiento. De ello se deduce que, sin la selección de un régimen de tratamiento apropiado, una tropoelastina administrada puede agotarse ostensiblemente de un área de tratamiento definida antes de que una célula pueda utilizarla para formar una fibra elástica.

[0047] Un paso en los regímenes de tratamiento descritos más adelante puede incluir una sola administración de tropoelastina cuando se sabe que el sitio en el que se administra la tropoelastina tiene un número significativo de células. El conocimiento del número o densidad celular puede derivarse del conocimiento histológico previo del tejido. Alternativamente, el sitio de administración puede haberse tratado previamente con un tratamiento para inducir la proliferación celular o el reclutamiento al sitio de tratamiento.

[0048] Podrían adoptarse varios regímenes de tratamiento para mantener la tropoelastina administrada en el tejido durante el tiempo requerido en un área de tratamiento. Estos son, en términos generales, los siguientes:

(i) administración de tropoelastina en una formulación de liberación sostenida que libera tropoelastina de forma gradual a lo largo de un período de tiempo.

[0049] La liberación sostenida de tropoelastina en el sitio del tejido requerido puede lograrse mediante la incorporación de la tropoelastina en un vehículo de administración no degradable o degradable. Un experto en la materia podría emplear varios enfoques de liberación sostenida de este tipo. Preferiblemente, se emplea una formulación de liberación sostenida degradable para evitar la necesidad de eliminar el vehículo una vez que se ha administrado la tropoelastina. Dichos vehículos de administración pueden estar compuestos por polímeros tales como ácido poliláctico (PLA) y ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA). Otros vehículos de administración sostenida pueden incluir polímeros formados a partir de polisacáridos como el ácido hialurónico, la goma xantana o el quitosano. Además, en algunas formas de realización, el vehículo de administración puede modificarse químicamente para que se una a la tropoelastina mediante enlaces iónicos o covalentes en el implante, de modo que la tropoelastina solo se libere a medida que se degrada el implante.

[0050] En algunas formas de realización, la tropoelastina se libera en el sitio de tratamiento requerido durante un período de entre 1 y 90 días. En algunas formas de realización, la tropoelastina puede liberarse en el sitio de tratamiento requerido entre 1 y 180 días. En algunas formas de realización, la tropoelastina se puede formular de modo que se libere solamente después de que pase un tiempo después de la aplicación del implante, como de 10 a 90 días o de 10 a 180 días. Otros tiempos apropiados de administración de tropoelastina incluyen de 1 a 30 días, de 1 a 60 días, de 10 a 60 días, de 30 a 60 días, de 30 a 180 días o de 1 a >180 días.

[0051] La cantidad y la concentración de tropoelastina que se administra depende tanto del área como del volumen de tejido que se desea tratar, de los niveles endógenos típicos de elastina presentes en el tejido normalmente y del grado de síntesis de fibra de elastina requerido. Por lo general, la tropoelastina se administrará al tejido en una cantidad de 1 pg a 1 mg por cada cm3 de tejido. Para la piel, esto se puede calcular como de 1 pg a 1 mg por cm2. Otras cantidades que pueden administrarse incluyen de 0,1 pg a 10 mg por cada cm3 de tejido, de 1 mg a 20 mg por cada cm3 de tejido, o de 1 mg a 100 mg por cm3 de tejido. En algunas formas de realización, las cantidades administradas pueden ser inferiores a 0,1 pg o superiores a 100 mg por cm3 de tejido. La concentración de tropoelastina en los implantes que se aplicarán al sitio tratado puede variar para permitir que se administren las cantidades requeridas de tropoelastina. En algunas formas de realización, la concentración de tropoelastina en los implantes puede variar de 1 pg/ml a 100 mg/ml. En algunas formas de realización, la concentración de tropoelastina en el producto estará entre 0,5 mg/ml y 200 mg/ml, 1 mg/ml y 50 mg/ml, 5 mg/ml y 50 mg/ml o 1 mg/ml y 25 mg/ml.

[0052] La tropoelastina incorporada en la formulación debe ser sustancialmente equivalente a una isoforma de tropoelastina que se produce naturalmente en el tejido que se desea tratar. Además, la tropoelastina debe proporcionarse en una forma que esté sustancialmente libre de impurezas. Los fragmentos de tropoelastina, es decir, formas truncadas de una isoforma de tropoelastina que surgen de forma no intencionada a través de la fabricación de tropoelastina, pueden considerarse impurezas en este contexto. En algunas formas de realización, la tropoelastina incorporada en la formulación de tratamiento será al menos el 65 % de la longitud de la isoforma de tropoelastina de longitud completa relevante, más preferiblemente el 80 % de la isoforma de tropoelastina de longitud completa relevante. En otras formas de realización, la tropoelastina tendrá más del 85 %, más del 90 % o más del 95 % de longitud total. Como se describe en este documento, algunas secuencias de la tropoelastina son más importantes que otras, por ejemplo, la eficiencia de la formación de fibras aumenta cuando la secuencia C-terminal final de aminoácidos de la tropoelastina de aproximadamente 4 residuos tiene homología o identidad con la secuencia de la tropoelastina que es endógena al tejido correspondiente.

[0053] También se pueden incluir componentes adicionales en la formulación para ayudar a la activación de las células requeridas en el tejido para formar la fibra elástica. Por ejemplo, para el tratamiento de la piel, se pueden incorporar componentes adicionales a la formulación que ayuden al reclutamiento o a la proliferación de fibroblastos en el sitio de tratamiento. Dichos componentes incluyen la familia del factor de crecimiento epidérmico, la familia del factor de crecimiento transformante beta, la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento del endotelio vascular, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento del tejido conectivo, la familia de las interleucinas y la familia del factor de necrosis tumoral a.

[0054] En algunas formas de realización, el tratamiento también puede incluir la administración de células al sitio de tratamiento con la tropoelastina. A modo de ejemplo, para el tratamiento de la piel, se pueden incluir fibroblastos en la formulación o procedimiento de tratamiento para ayudar a la síntesis de fibra elástica en el sitio de tratamiento. Los fibroblastos pueden obtenerse de una fuente alógena como el prepucio neonatal o obtenerse mediante biopsia de un sitio de la piel no visible (por ejemplo, de detrás de la oreja) y usarse como un tratamiento autólogo.

(ii) administración de tropoelastina en la que las regiones sensibles a la proteasa se han eliminado o bloqueado de las enzimas presentes en el tejido.

[0055] La tropoelastina utilizada en el tratamiento puede modificarse para reducir la degradación de las proteasas. Por ejemplo, las especies de proteínas se pueden seleccionar como se describe en el documento W02000/04043 en la medida en que sean especies de tropoelastina de longitud sustancialmente completa que se encuentran de forma natural en el tejido que se desea tratar. Alternativamente, las formulaciones de tratamiento pueden incorporar inhibidores de las proteasas o moléculas que bloquean vías de señalización que se sabe que aumentan la expresión de las proteasas. Dichas moléculas incluyen inhibidores de las serinaproteasas, inhibidores de metaloproteinasa de la matriz, galactósidos como lactosa, anticuerpos inhibidores e inhibidores de moléculas pequeñas de la señalización de elastina.

(iii) administración repetida de tropoelastina en puntos de tiempo predefinidos.

[0056] En algunas formas de realización, para garantizar que la tropoelastina se administre en una forma que las células puedan utilizar como sustrato para la construcción de fibra elástica y que permanezca en el sitio de tratamiento durante un período de tiempo suficiente para que esto ocurra, el tratamiento se aplica al sitio en repetidas ocasiones.

[0057] En algunas formas de realización, cada sitio de tejido que se desea tratar recibirá los tres tratamientos del producto, de 1 a 24, o de 2 a 12 o de 3 a 6 semanas. El tratamiento puede consistir en múltiples inyecciones en el área que se desea tratar, cada una separada aproximadamente 10 mm en forma de cuadrícula. El tratamiento se puede administrar con una aguja de calibre fino, como 27G, 29G, 30G o 31G. La aguja se puede insertar en el tejido teniendo en cuenta el ángulo y la orientación del bisel, la profundidad de la inyección y la cantidad de material que se ha de administrar. El tratamiento se puede inyectar en el tejido como un bolo, por ejemplo, con un volumen de 10-100 |_il, 10-50 ul, preferiblemente de 20 a 30 ul de producto implantado en cada sitio de inyección. Después de completar cada inyección, la aguja puede retirarse lentamente. Cuando se hayan completado todos los implantes, el sitio tratado puede masajearse suavemente si es necesario para permitir que el material del implante se adapte al contorno de los tejidos circundantes. El número de tratamientos, el período entre tratamientos y la cantidad de tropoelastina administrada en cada sitio de tratamiento se ajustará en función del área de tejido que se desee tratar y el nivel de elasticidad que se desee restaurar.

[0058] Cualquiera de estos enfoques podría implementarse individualmente o en combinación, aumentando así la persistencia de la tropoelastina en el tejido.

[0059] En cada uno de los enfoques se reconocerá que el paso de administración es un procedimiento invasivo que tiene el potencial de causar un daño tisular o celular reversible y el inicio de varias cascadas inflamatorias que surgen en respuesta a dicho daño. Los inventores reconocen que este tipo de tratamiento físico puede aplicarse para crear condiciones para un daño celular reversible, ya que es probable que tales condiciones estimulen la activación y/o la proliferación de fibroblastos. Es importante que el tratamiento físico no sea suficiente para inducir la fibrosis.

[0060] Como se ha comentado en este documento, las consideraciones que guían la selección de un régimen de tratamiento particular incluyen la naturaleza del tejido, el grado de degradación o degeneración del perfil de elastina y el resultado deseado. De nuevo, un aspecto fundamental de la invención es que las células tienen la oportunidad de formar, reparar o sintetizar fibras elásticas a partir de la tropoelastina que se les proporciona. Hay más oportunidades cuando, gracias a la liberación sostenida, la protección contra la degradación o el suministro continuo, la tropoelastina persiste efectivamente en el tejido durante un período de tiempo más prolongado. Por lo general, cuanto mayor es la pérdida del perfil elástico y más acelular es el tejido, más apropiado es que un régimen de tratamiento proporcione la persistencia de la tropoelastina en el tejido durante un período de tiempo más prolongado.

[0061] Más en detalle, un tiempo de persistencia más corto puede ser apropiado cuando el objetivo es mejorar el aspecto físico de la piel más joven en comparación con tal mejora de una piel de mayor edad. En este caso, pueden ser más apropiadas las administraciones repetidas de tropoelastina en puntos de tiempo predefinidos de acuerdo con los pasos (iii) y/o (i) anteriores.

[0062] Puede ser necesario un tiempo de persistencia más largo cuando el tejido es cicatricial o fibrótico y esencialmente acelular. En este caso será importante dejar un tiempo suficiente para la quimiotaxis de las células en el tejido correspondiente. Un régimen de acuerdo con (ii) y/o (i) puede ser más apropiado.

[0063] Como se ha mencionado, el resultado también es una consideración relevante que guía la selección de un régimen apropiado. Cuando el resultado es aumentar o mejorar la función elástica, puede ser necesario un tiempo de persistencia mucho más largo que permita a las células construir la matriz de fibras elásticas requerida específica para la función. En este caso, una forma de liberación sostenida puede ser más apropiada como en el paso (i) anterior.

[0064] Algunos ejemplos de consideraciones relevantes para la selección de regímenes de tratamiento apropiados se analizan con más detalle a continuación:

(i) Mejora del aspecto físico de la piel.

(ii) Aumento del contenido de elastina del tejido fibrótico y cicatricial.

(iii) Mejora de la elasticidad del cartílago o vasculatura.

[0065] Casi todos los tejidos elásticos de los mamíferos tienen un perfil de elastina que surge de las fibras elásticas que contienen. Como cada tejido elástico diferente tiene una función diferente, se deduce que el perfil elástico no es el mismo de un tejido a otro. Por ejemplo, la resiliencia de la vasculatura del lado izquierdo al flujo sanguíneo no es la misma que la resiliencia del tejido bronquial al aire inhalado. En la siguiente tabla se describen ejemplos de tejidos a los que se dirige la invención y cómo se puede medir y expresar el perfil elástico de cada uno:

[0066] Normalmente, el individuo tratado según la invención es un ser humano.

[0067] Preferiblemente, el tejido es tejido cutáneo, en especial tejido de la piel de un individuo de al menos 20 años de edad, preferiblemente de 20 a 50 años, más preferiblemente de 30 a 60 años.

[0068] El tejido cutáneo puede caracterizarse por una rotura o fragmentación de las fibras elásticas en la unión de la dermis y la epidermis.

[0069] El tejido cutáneo puede ser tejido fotoenvejecido.

[0070] El tejido cutáneo puede presentar una o más de las siguientes características: piel flácida, tejido subcutáneo relajado, pérdida de densidad de la matriz extracelular, arrugas y estrías.

[0071] El tejido cutáneo se localiza preferentemente en la cara, el cuello o las extremidades superiores o inferiores.

[0072] Preferiblemente, el tejido no tiene ninguna herida en el momento del comienzo del régimen de tratamiento. Es posible que al finalizar la administración de tropoelastina de acuerdo con un régimen de tratamiento seleccionado haya heridas menores en el tejido, como por ejemplo cuando la administración se realiza mediante inyección u otra manipulación física de la piel.

[0073] Cuando el individuo es un humano, la tropoelastina tiene la secuencia de una isoforma de tropoelastina que se expresa en un ser humano. En esta forma de realización, la isoforma se puede seleccionar del grupo que consiste en SHEL (véase WO1994/14958) y SHEL526A (véase WO1999/03886) y derivados resistentes a la proteasa de estas isoformas (véase W02000/0403).

[0074] Típicamente, la isoforma de tropoelastina es SHEL526A, donde el tejido es tejido cutáneo humano.

[0075] La isoforma de la tropoelastina se puede proporcionar en forma de una composición que está adaptada para una liberación sostenida de la tropoelastina en el tejido. Cuando el tejido es tejido cutáneo humano, se prefiere que la composición incluya SHEL526A y un componente para la liberación sostenida de la tropoelastina de la composición seleccionada del grupo que consiste en hialuronano, glucosaminoglucanos, colágeno de ipo I.

[0076] Normalmente, la composición para administración que incluye tropoelastina no contiene factores exógenos para la formación de fibras elásticas, especialmente lisil oxidasa.

[0077] En algunas formas de realización, la tropoelastina se proporciona de acuerdo con un régimen de tratamiento en una forma sustancialmente monomérica.

[0078] En algunas formas de realización, la tropoelastina se proporciona de acuerdo con un régimen de tratamiento en una forma que carece sustancialmente de puntos de reticulación intramoleculares.

[0079] En algunas formas de realización, la tropoelastina se proporciona según un régimen de tratamiento en una composición que consiste en tropoelastina y un disolvente para la tropoelastina, como una solución acuosa. Preferiblemente, la tropoelastina es SHEL526A.

[0080] En algunas formas de realización, la tropoelastina se proporciona según un régimen de tratamiento en una composición que consiste esencialmente en tropoelastina. En una forma de realización, la tropoelastina es SHEL526A.

[0081] En algunas formas de realización, el tratamiento incluye tropoelastina y un ácido hialurónico.

[0082] En algunas formas de realización, la tropoelastina de la composición puede estar reticulada con ácido hialurónico (HA) derivatizado. La reticulación de la tropoelastina con una molécula como el ácido hialurónico puede ayudar a mantener la tropoelastina en el lugar del implante según la presente invención. La composición puede tener de 5 a 100 mg/ml de tropoelastina 0,1 % a 2 % de reticulante de HA, preferiblemente de 10 a 50 mg/ml de tropoelastina y 0,25 % a 1 % de reticulante de HA. Las formulaciones adecuadas para la invención pueden incluir de 10 a 30 mg/ml de tropoelastina reticulada a de 0,25 % a 1 % de reticulante de HA.

[0083] Es importante destacar que la reticulación de la tropoelastina con un polisacárido como el ácido hialurónico puede no dar como resultado, o implicar, puntos de reticulación intramoleculares de tropoelastina, como los que se dan con la lisil oxidasa. Más en detalle, si la hialuronidasa (una enzima de la piel) disuelve el ácido hialurónico, la tropoelastina puede liberarse en forma monomérica.

[0084] En algunas formas de realización, el tratamiento puede implicar compuestos que aumentan la utilización de tropoelastina. Entre los ejemplos se incluyen:

- el diclofenaco - un antiinflamatorio (y asociado con la reducción de las queratosis actínicas, por ejemplo, véase Solaraze)

- Lys'lastine - para estimular la elastagénesis

- los aminoácidos Gly, Val, Ala, Pro - correspondientes al 75 % de los residuos de tropoelastina

- las vitaminas C, E - La vitamina C ayuda a la formación de colágeno nuevo y ambos son antioxidantes - protector solar - limita la proteólisis inducida por el sol

- los potenciadores químicos: ayudan a la transferencia de componentes a través del estrato córneo - pH ajustado en un emoliente humectante - para regular el pH de la piel; la hidratación es relevante para las pieles de más edad

[0085] Cuando el tejido es piel, por lo general el régimen de tratamiento incluye la administración de tropoelastina en momentos definidos. En cualquier momento, puede haber una administración simultánea de tropoelastina.

[0086] Preferiblemente, la tropoelastina se administra mediante inyección.

[0087] Cuando el tejido es piel, se prefiere que la tropoelastina se administre en la dermis.

[0088] En algunas formas de realización, el régimen de tratamiento puede incluir adicionalmente la aplicación tópica de sustancias capaces de aumentar la formación de fibra elástica. Tales sustancias serían las ampliamente conocidas por los expertos en la materia y pueden incluir, entre otros, un extracto de eneldo para estimular la expresión de lisil oxidasa (Cenizo et al 2006 Exp. Dermatol. 15:574-81); y cremas de cobre y/o zinc para reducir la descomposición de las fibras elásticas (Mahoney et al 2009 Exp. Dermatol.18:205-211).

[0089] En una forma de realización, se proporciona un método para proporcionar elasticidad a la piel de un individuo, método que incluye los siguientes pasos:

- contar con un individuo;

- definir un área de tratamiento en la piel del individuo, en donde el área de tratamiento es un área de piel a la que se va a proporcionar elasticidad;

- inyectar una composición de tropoelastina dentro del área de tratamiento para establecer una cantidad de tropoelastina dentro del área de tratamiento que aumenta con respecto a la piel fuera del área de tratamiento;

[0090] Como se describe en los ejemplos siguientes, el método permite aumentar el grosor de la piel a la vez que se mantiene o se mejora la elasticidad de la piel. El método también permite mejoras en la elasticidad de la piel, o la restauración o recreación del perfil elástico a la vez que conserva la uniformidad (es decir, evita la formación de bultos) y el aspecto natural de la piel.

[0091] Típicamente, el individuo es un individuo adulto que ha perdido el estado óptimo de la piel, como se describe en este documento. Por ejemplo, el área de tratamiento de la piel puede caracterizarse por fotoenvejecimiento, piel flácida, tejido subcutáneo relajado, pérdida de densidad de la matriz extracelular, arrugas y estrías. El adulto puede tener de 20 a 70 años, por ejemplo, de 20 a 35 años o de 40 a 70 años.

[0092] Como se describe en este documento, la piel que se trata preferiblemente de acuerdo con la invención puede estar ubicada en la cara, el cuello o las extremidades superiores o inferiores. El área de tratamiento puede comprender toda o parte de la piel en la ubicación relevante. Por ejemplo, cuando la piel está situada en una de las extremidades superiores, el área de tratamiento puede comprender toda la extremidad superior, o parte de ella, por ejemplo, la superficie medial de la extremidad superior. Cuando la piel está situada en la cara, el área de tratamiento puede comprender toda o parte de la piel de una mejilla, párpado, mentón, etc.

[0093] De acuerdo con la invención, un área de tratamiento es un área de piel en la que el perfil elástico es subóptimo y/o requiere una mejora o restauración. Esta área se puede definir de varias maneras conocidas por el trabajador especializado. La más simple de ellas es demarcar el área de la piel que requiere tratamiento para distinguirla de la piel en la que no se requiere tratamiento indicando los límites o el contorno del área que se desea tratar. Esto se puede hacer, por ejemplo, utilizando un marcador, indicador, guía o carácter que distinga el área que se desea tratar del área donde no se requiere tratamiento, por ejemplo, un marcador que identifique selectivamente un área que se desea tratar, o que identifique selectivamente un área donde no se requiere tratamiento. En una forma de realización, el área que se desea tratar puede definirse mediante la identificación de una o más coordenadas que establezcan de manera relevante el límite del área de tratamiento.

[0094] Una vez definida un área de tratamiento, la composición de tropoelastina puede inyectarse por vía intradérmica en la piel ubicada dentro del área de tratamiento. El propósito de la inyección es establecer o proporcionar una cantidad de tropoelastina al área de tratamiento que normalmente no está presente en el área de tratamiento. En este contexto, la cantidad de tropoelastina establecida en el área de tratamiento es mayor que la cantidad de tropoelastina en un área de piel adyacente o contigua ubicada fuera del área de tratamiento.

[0095] La composición se puede inyectar en la dermis media a profunda dependiendo de dónde se encuentre el área de tratamiento. Por ejemplo, las inyecciones más profundas pueden ser más apropiadas para las áreas de tratamiento donde la piel es más gruesa, como las mejillas, que para las áreas de tratamiento donde la piel es más fina, como el cuello, el escote o alrededor de los ojos.

[0096] Se entenderá que, en algunos casos, el resultado deseado puede lograrse mediante la implantación en la hipodermis y el reclutamiento de células elastogénicas en el sitio de la implantación o inyección.

[0097] El volumen de composición que se administra depende en parte de la ubicación de la piel que se desea tratar. Volúmenes más grandes son más apropiados o posibles cuando la piel está ubicada en una extremidad o cuello que en la cara. Los volúmenes de cada inyección individual pueden oscilar entre 10 y 100 ul, preferiblemente entre 20 y 50 ul. El volumen total del tratamiento administrado dependerá de la cantidad de inyecciones proporcionadas, que a su vez depende del tamaño del área de la piel que se desea tratar y la distancia que se determine como apropiada entre cada sitio de inyección.

[0098] En una forma particularmente preferida de la invención, se mantiene una cantidad deseada de tropoelastina en el área de tratamiento durante un período de tiempo predeterminado, mediante la inyección repetida de tropoelastina en el área de tratamiento. Esto crea ostensiblemente un suministro continuo de tropoelastina al tejido en el área de tratamiento, de modo que el área de tratamiento retiene un nivel de umbral de tropoelastina para la formación de fibras elásticas in situ que no se encuentra fuera del área de tratamiento. Se cree que, en el transcurso de un tratamiento (descrito más adelante), esto aumenta la probabilidad de que las células y los factores se unan a la tropoelastina inyectada, lo que permite la formación de fibras elásticas.

[0099] En algunas formas de realización, el tratamiento se administra mediante inyección de la composición de tropoelastina en la dermis media a profunda mediante inyección con aguja fina. La inyección se puede realizar usando una aguja hipodérmica con un calibre de 25G, preferiblemente 27G o menos, más preferiblemente 30G o 31G. La inyección se puede realizar con una sola jeringa y aguja mediante la aplicación manual del tratamiento en la piel.

[0100] En algunas formas de realización, un único tratamiento puede incluir múltiples inyecciones en un área de tratamiento. Cuando cada tratamiento requiera múltiples inyecciones, éstas pueden espaciarse entre 1 mm y 3 cm.

[0101] En algunas formas de realización, la inyección se puede realizar utilizando un dispositivo que permite la inyección automática en la dermis de la piel, como una pistola de mesoterapia, o un dispositivo de inyección asistida, como el dispositivo de inyección Artiste. (http://www.nordsonmicromedics.com/se/google/en/artisteassisted-iniection-svstem.html) o el dispositivo de inyección anteis (http://www.anteis.com/AestheticDermatology/iniectionsvstem.php). En algunas formas de realización, la jeringa o el dispositivo de inyección automatizado se puede usar con un adaptador para permitir que se conecten múltiples agujas de modo que se pueda aplicar más de una inyección a la vez. En algunas formas de realización, el tratamiento se puede aplicar utilizando un sistema de agujas macizas, como un rodillo dermatológico o un sistema de agujas dermapen (por ejemplo, como se describe en Kalluri, H. et al 2011, AAPS Journal 13: 473 4841).

[0102] Puede haber un período de alrededor de 3 a 168 días entre cada tratamiento. Los períodos típicos entre cada tratamiento pueden incluir de 3 a 7 días, de 3 a 21 días, de 14 a 28 días, de 21 a 84 días y de 3 a 84 días. Puede haber de 1 a 24, o de 3 a 6 tratamientos en total. Generalmente, el período de tratamiento no es superior a 1 año, preferiblemente de 3 semanas a 6 meses, preferiblemente de 1 a 3 meses.

[0103] Los sitios de tratamiento preferidos incluyen los que están cerca, alrededor, en o adyacentes a las mejillas, los ojos, el cuello, el escote, las manos, el tejido cicatricial y las estrías.

[0104] Como se usa en este documento, excepto cuando el contexto requiera lo contrario, el término "comprender” y las variaciones del término, como "que comprende", "comprende" y "comprendido", no pretenden excluir otros aditivos, componentes, números enteros o pasos adicionales.

[0105] Otros aspectos de la presente invención y otras formas de realización de los aspectos descritos en los párrafos anteriores resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción, proporcionada a modo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos.

[0106] Se entenderá que la invención descrita y definida en esta memoria se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes a partir del texto o los dibujos. Todas estas combinaciones diferentes constituyen varios aspectos alternativos de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 Sistema de ensayo in vitro para la síntesis de fibras elásticas

Materiales y métodos

[0107]

a) Células

b) Cultivo celular

[0108] Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM; Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS; Invitrogen) y penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v) (Invitrogen). Los medios se cambiaron cada 2-3 días. Las células se incubaron a 37 ° C y CO2 al 5 %. Para evaluar la capacidad de las células para formar fibras de elastina se sembraron 1 x 105 células en cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo de 12 pocilios. De diez a 17 días después de la siembra, se esterilizó por filtración tropoelastina de longitud completa (Elastagen), o una proteína alternativa derivada de elastina, en PBS y se añadió a los cultivos celulares. Las proteínas derivadas de elastina alternativas incluyeron péptidos de elastina de piel humana (Elastin Products Company; HSP72), una construcción de tropoelastina con deleción en el extremo C-terminal ARKRK (Weiss lab) y una construcción de tropoelastina con sustitución en el extremo C-terminal que contenía RGDS (Weiss lab). También se evaluó la formación de fibras en presencia de blebistatina 50 |jM (Sigma). Para los experimentos en los que se evaluó el efecto de las adiciones repetidas de tropoelastina, se añadió la proteína 10, 17 y 24 días después de la siembra. El grosor de la matriz celular se determinó promediando el número de cortes z de 0,41 jm necesarios para obtener imágenes desde los núcleos superiores hasta la parte inferior de la muestra en diez campos de visión elegidos al azar.

[0109] En puntos temporales establecidos después de la adición de tropoelastina, las células se fijaron con formaldehído al 3 % (p/v) o paraformaldehído al 4 % (p/v) durante 20 min y se neutralizaron con glicina 0,2 M. Las células se incubaron con Triton X-100 al 0,2 % (v/v) durante 6 min, se bloquearon con albúmina de suero bovino al 5 % a 4 °C durante la noche y se tiñeron con anticuerpo primario antielastina de ratón BA4 1:500 (Sigma) durante 1,5 h y anticuerpo secundario IgG-FITC anti-ratón 1:100 (Sigma) durante 1 h. Luego, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio con reactivo antidecoloración ProLong Gold con DAPI (Invitrogen).

c) Adquisición de imágenes por fluorescencia

[0110] Las muestras se visualizaron con un microscopio confocal Olympus FluoView FV1000. Las imágenes que se muestran aquí se construyeron por proyección de z-stack.

Resultados y comentarios

a) Formación de fibras de elastina por fibroblastos de piel humana provenientes de diferentes grupos de edad.

[0111] Se evaluó la capacidad de los fibroblastos de la piel humana para formar redes y fibras de elastina tras la adición de tropoelastina (SHEL526A (es decir, elastina humana sintética que no contiene el dominio 26A)). En la figura 1 se muestra la formación de elastina 7 días después de la adición de 250 jg/ml de tropoelastina a fibroblastos de piel procedentes de donantes neonatos, de 10, 31, 51 y 92 años. Todas las líneas celulares mostraron formación de fibras de elastina. No se observó formación de elastina en los cultivos de células de control en los que no se añadió tropoelastina (datos no mostrados). Las células de donantes más jóvenes proliferaron más extensamente, como lo muestra el mayor número de núcleos (azul). Las células de donantes más jóvenes crearon extensas redes de elastina cuando se añadió tropoelastina. Las células de donantes de más edad todavía eran capaces de crear fibras de elastina sustanciales a partir de la tropoelastina añadida; sin embargo, la red era más escasa (Figura 1).

b) Formación de fibras de elastina por células animales.

[0112] Se evaluó la capacidad de los fibroblastos de piel de cerdo (Pig 10-10) y conejo (RAB-9) para formar redes y fibras de elastina tras la adición de 250 jg/ml de tropoelastina. Como se muestra en la Figura 2, cada una de estas células animales depositó tropoelastina en la matriz. Sin embargo, solo las células de conejo fueron capaces de producir una red de elastina. Las diferencias en la secuencia de aminoácidos de la tropoelastina entre las especies humana y animal pueden explicar la menor eficiencia y la variada utilización de la tropoelastina por parte de las células animales (Figura 2).

c) Formación de fibras de elastina por las células musculares lisas de las vías respiratorias.

[0113] Se evaluó la capacidad de células musculares lisas primarias de las vías respiratorias humanas procedentes de pulmones enfermos para formar fibras de elastina tras la adición de tropoelastina. En la Figura 3 se muestra la formación de elastina 7 días después de la adición de 250 jg/ml de tropoelastina. Estas células diferían en la extensión de la formación de fibras: desde una cantidad mínima de depósito de esférulas de tropoelastina hasta una red de fibras de elastina (Figura 3). Los resultados demuestran que las células musculares lisas, como los fibroblastos observados en la Figura 1, tienen capacidad para la formación de fibra elástica a partir de tropoelastina exógena, al igual que las células musculares lisas de otros tejidos, como la vasculatura.

d) Formación de fibras de elastina cuando se utilizan derivados de tropoelastina

[0114] Se evaluó la capacidad de fibroblastos neonatales humanos primarios (NHF8909) para formar redes de elastina utilizando tres proteínas alternativas derivadas de elastina. Estas proteínas eran péptidos de elastina de la piel preparados por hidrólisis enzimática de elastina de piel adulta humana con elastasa de esputo humano y dos isoformas de tropoelastina. La tropoelastina contiene un motivo GRKRK en su extremo C terminal, que se ha demostrado que dirige la unión celular a ay03 integrina. En la isoforma de tropoelastina ARKRK, se ha eliminado la secuencia RKRK de este motivo. En la isoforma RGDS, la secuencia RKRK se eliminó y se reemplazó con el dominio de unión a células canónico RGDS. En todos los casos, se añadieron 125 pg/ml de proteína a fibroblastos primarios de piel neonatal humana 12 días después de la siembra.

[0115] La figura 4 demuestra las redes de elastina resultantes. Se observó una formación de fibras de elastina cuando se añadió tropoelastina de longitud completa a los cultivos. Por el contrario, la formación de fibras se vio significativamente afectada cuando se añadieron derivados de tropoelastina a los cultivos. No hubo depósito de péptidos de elastina de la piel en la matriz. Se observó depósito de esférulas en lugar de fibras de cada una de las formas ARKRK y RGDS.

e) Formación de fibras de elastina cuando se alteran las fuerzas contráctiles celulares

[0116] Se investigó el requisito de fuerzas contráctiles celulares en la formación de fibras de elastina añadiendo blebistatina al cultivo celular al mismo tiempo que se añadía tropoelastina. La blebistatina es un inhibidor de la miosina II no muscular que altera las fuerzas contráctiles celulares y la migración celular. En la Figura 5 se muestra que la formación de fibras de elastina se deteriora sustancialmente en presencia de blebistatina.

f) Formación de fibras de elastina tras adiciones repetidas de tropoelastina

[0117] Se evaluó la capacidad de los fibroblastos primarios de piel humana neonatal (NHF8909) para formar redes de elastina a partir de adiciones repetidas de tropoelastina. Se añadió tropoelastina (250 pg/ml) a los cultivos 10 días, 10 y 17 días y 10, 17 y 24 días después de la siembra. Todas las muestras se fijaron 31 días después de la siembra. En la Figura 6 se muestra que la formación de redes de elastina aumentó sustancialmente con tratamientos repetidos de tropoelastina. Esto dio como resultado un aumento en el grosor de la matriz celular, donde una muestra sin tropoelastina añadida 31 días después de la siembra tenía un grosor de 13,4 ± 2,2 pm, las muestras con una y dos adiciones de tropoelastina tenían un grosor de 15,3 ± 1,2 pm y 16,9 ± 0,8 pm respectivamente y una muestra con tres adiciones de tropoelastina tenía un grosor de 19,0 ± 2,2 pm.

g) Elasticidad de la fibra formada in vitro

[0118] Se sembraron fibroblastos dérmicos humanos en placas con fondo de vidrio WillCo a una densidad de 20000 células/cm2 en DMEM (Invitrogen, 11995) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (vol/vol) y penicilina/estreptomicina al 1 % (vol/vol). A los 12 días de la siembra, se añadieron 250 pg/ml de tropoelastina en PBS a los cultivos de fibroblastos. Los medios de cultivo se cambiaron cada 2 días. A los 19 días después de la siembra, las muestras se analizaron con un microscopio de fuerza atómica BioScope Catalyst. Se utilizó la autofluorescencia intrínseca de las fibras de elastina maduras para indicar su posición dentro del cultivo. Las muestras de control emparejadas en el tiempo sin adición de tropoelastina no mostraron autofluorescencia (Fig. 7). El mapeo de topografía/módulo elástico demostró un cambio en la elasticidad del cultivo (Fig. 8, áreas amarillas) luego de la adición de tropoelastina, como lo demuestra una región dominante de material intercelular con un módulo de Young de ~600 kPa, compatible con la formación de fibras elásticas. La elastina natural sin purificar tiene un módulo de Young de ~600 kPa.

h) Evolución temporal de la formación de fibras elásticas

[0119] Se sembraron fibroblastos dérmicos humanos en cubreobjetos de vidrio a una densidad de 20000 células/cm2 en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % (vol/vol) y penicilina/estreptomicina al 1 % (vol/vol). A los 10-12 días después de la siembra, se añadieron 250 pg/ml de tropoelastina en PBS a los cultivos de fibroblastos. Los medios de cultivo se cambiaron cada 2 días. En los días fijados, generalmente 1, 3 y 7 días después de la adición de tropoelastina, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % (p/vol) durante 20 min y se neutralizaron con glicina 0,2 M. Las células se incubaron con Triton X-100 al 0,2 % (vol/vol) durante 6 min, se bloquearon con albúmina de suero bovino al 5 % a 4 °C durante la noche y se tiñeron con anticuerpo antielastina de ratón BA4 1:500 durante 1,5 h y anticuerpo IgG-FITC anti-ratón 1 :100 durante 1 h. Luego, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio con reactivo antidecoloración ProLong Gold con DAPI. Las muestras se visualizaron utilizando un microscopio confocal Olympus FluoView FV1000. Se tomaron Z-stacks y se convirtieron en imágenes de proyección comprimidas.

[0120] Este sistema de modelo de cultivo celular in vitro muestra que, después de la adición de tropoelastina, la proteína se deposita en la MEC en forma de esférulas (Fig. 9a). La formación de fibras posterior se alinea inicialmente en la dirección de las células (Fig. 9b) antes de generar una extensa red elástica ramificada (Fig. 9c).

i) Participación de la lisil oxidasa

[0121] Se estudió el efecto de BAPN, un inhibidor de la lisil oxidasa, sobre la formación de fibras elásticas en este sistema.

[0122] Se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos durante 12 días antes de la adición de tropoelastina como se describe. Las células se cultivaron durante 72 horas más después de la adición de tropoelastina. Se añadió BAPN en varios puntos de tiempo en relación con la adición de tropoelastina. Las muestras se tiñeron para detectar la elastina y los núcleos como se describe anteriormente. La inclusión de BAPN permite el depósito de algunas esférulas en la MEC, pero previene la formación de fibras (Fig. 10), lo que demuestra que las células utilizan la lisil oxidasa durante la formación de fibras elásticas a partir de la tropoelastina.

j) Alineación de esférulas

[0123] Se utilizó microscopía de súper resolución para investigar más a fondo la formación de fibras elásticas en un sistema modelo in vitro. Se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos y se fijaron 3 días después de la adición de tropoelastina como se describe. Las células se tiñeron con 1\500 de anticuerpo antielastina de ratón BA4 durante 1,5 h y 1\100 de anticuerpo anti-IgG-AlexaFluor 488 de ratón durante 1 h. Las muestras se visualizaron con un microscopio Leica SP5 cwSTED.

[0124] Se encuentran esférulas alineadas 3 días después de agregar tropoelastina a un cultivo de fibroblastos dérmicos de 12 días (Fig. 11). Las esférulas muestran decoraciones punteadas con el anticuerpo. El diámetro medio de la esférula es de 605 ± 97 nm.

k) Procesamiento de las esférulas

[0125] La microscopía electrónica de transmisión también se usó para investigar más a fondo la formación de fibras elásticas en un sistema modelo in vitro esencialmente como se describe. Las muestras se procesaron 3 días después de la adición de tropoelastina a un cultivo de fibroblastos dérmicos de 12 días. Las células cultivadas en elastina se fijaron posteriormente con glutaraldehído al 2 % en tampón PBS durante 1 hora a 4 °C y luego se fijaron posteriormente con tetróxido de osmio al 0,1 % durante 10 minutos en la oscuridad a 4 °C y se lavaron inmediatamente dos veces con agua destilada durante 5 minutos cada uno. Posteriormente, las muestras se deshidrataron a través de una serie de gradientes de etanol durante 10 min cada una (es decir, 70, 80 y 90 % y dos veces 100 %). La infiltración de la muestra con Epon (resina) se logró con las siguientes mezclas y tiempos de incubación: Epon al 25 % en etanol durante 4 h, Epon al 50 % en etanol durante la noche y dos cambios de Epon al 100 % durante 8 h cada uno a temperatura ambiente. Cuando se completó la infiltración de resina, la muestra se embebió utilizando el método de doble polimerización de Kobayashi K., et al. (2012). Las caras de bloque resultantes que contenían las células embebidas se recortaron y se generaron secciones ultrafinas mediante un ultramicrótomo (Leica, Ultracut-7), produciendo secciones de aproximadamente 70 nm que se montaron en rejillas de cobre de malla 200. Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo acuoso al 2 % y citrato de plomo de Reynolds durante 10 min cada una, y se lavaron minuciosamente con agua entre los pasos para minimizar los depósitos de tinción. Se tomaron imágenes de las secciones utilizando un JEOL 2100 TEM (JEOL, Japón) a 200 kV.

[0126] Se ven tres estructuras distintas que contienen elastina (Fig. 12):

(1) Esférulas rodeadas por una capa densa con un diámetro medio de 615 ± 153 nm. Estas esférulas están en contacto directo con las células.

(2) Esférulas que se rompieron, derramando su contenido.

(3) Masas elásticas formadas a partir de esférulas rotas coalescentes.

[0127] La estrecha asociación del material elástico con las células y las proyecciones celulares sugiere que las fuerzas mecánicas rompen las esférulas.

l) Modelo animal

[0128] Se examinó el efecto de modelos dérmicos que contenían tropoelastina junto con un injerto de piel de espesor dividido delgado sobre la formación de fibras de elastina. En el estudio se utilizaron dos cerdos. Los siguientes sustitutos de la piel se aplicaron el día 0.

1. Control: modelo de colágeno reticulado solo

2. Prueba A: modelo de colágeno reticulado, reticulado en presencia de 10 % de tropoelastina

3. Prueba B: modelo de colágeno reticulado, aplicado sobre una matriz de tropoelastina reticulada con un HA modificado.

[0129] El Día 0 se crearon cuatro heridas de escisión (5 cm de diámetro) en la parte superior de la espalda de cada cerdo. Dos heridas de un lado se cubrieron con el Control. Se trató una herida del otro lado con la prueba A y la otra herida con la prueba B. El día 7 (semana 1) se cambiaron los vendajes de todas las heridas. El día 14 (semana 2) se recogieron biopsias de 4 mm a unos pocos mm del borde de las heridas. El día 21 (semana 3) se llevó a cabo un injerto de piel de espesor dividido delgado en todas las heridas con cambios de vendaje. El día 28 (semana 4) se cambiaron los vendajes de todas las heridas. El día 35 (semana 5) se sacrificó a los animales y se recogió tejido de la herida y de la piel normal. Las biopsias se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina.

[0130] La formación de fibras de elastina se evaluó mediante la tinción de Verhoeff van Gieson de secciones (Figura 13), que hace que las fibras de elastina sean de color púrpura/negro. Se ven fibras de elastina rodeando un folículo piloso en piel de cerdo normal (en un círculo).

[0131] Ocasionalmente, se observaron fibras cortas de manera esporádica en la dermis de las muestras de control.

[0132] Después de la biopsia de las muestras de la Prueba A, el tejido del sitio de la herida mostró elastina de novo en forma de fibras y grupos de fibras (por ejemplo, las áreas resaltadas con círculos negros).

[0133] Después de la biopsia de las muestras de la Prueba B, el tejido del sitio de la herida mostró una matriz de tropoelastina persistente reticulada con HA modificado (por ejemplo, el área resaltada con un círculo negro) y formación de fibras de elastina de novo (por ejemplo, el área resaltada con un círculo blanco).

Ejemplo 2. Estudio clínico para evaluar el tratamiento de la piel humana utilizando un producto de rejuvenecimiento cutáneo inyectable de elastina.

Métodos:

[0134] Se llevó a cabo un estudio clínico usando una formulación de tropoelastina ligeramente reticulada con un ácido hialurónico derivatizado (como se describe en PCT/AU2011/001503, en particular en el Ejemplo 3 y el Ejemplo 6) en comparación con Restylane Vital Light (RVL - 12 mg/ml de ácido hialurónico reticulado con BDDE, Q-Med, Australia). Los participantes recibieron tratamiento en la piel de la cara interna de la parte superior del brazo mediante la implantación del producto en la dermis mediante una inyección con aguja fina. Se eligió la parte superior del brazo para el estudio porque es un área de la piel que normalmente no está expuesta a la luz solar y, por lo tanto, se presenta como un tejido cutáneo sano y sin daños. El estudio tuvo como objetivo evaluar el impacto de los productos en el grosor y la textura de la piel, incluida la elasticidad, y recopilar comentarios subjetivos de los pacientes sobre el aspecto, la naturalidad y la uniformidad del área de la piel tratada.

[0135] Se reclutaron sujetos sanos para el estudio y, luego de un período de selección, dieciséis sujetos que cumplían con los requisitos de ingreso se inscribieron y se asignaron al azar para recibir tratamiento con una de las formulaciones de tropoelastina (ELAPR002: 10 - 30 mg/ml de tropoelastina reticulada a un ácido hialurónico derivatizado) en un brazo más el control Restylane Vital Light (RVL - 12 mg/ml de ácido hialurónico reticulado con BDDE) en el otro brazo. Todos los sujetos recibieron tres tratamientos de este tipo en el mismo sitio de tratamiento, con 3 semanas de diferencia. Cada tratamiento consistió en múltiples inyecciones de 20-30 ul de producto administradas con una aguja de 30Gx%", cada una separada aproximadamente 1 cm en una formación de cuadrícula en el área de la parte superior del brazo.

[0136] En cada visita, a los sujetos se les hicieron preguntas relacionadas con la uniformidad, la naturalidad y el aspecto de la piel en el sitio tratado y se les pidió que proporcionaran comentarios a través de una escala analógica visual (EAV) marcando una línea en una escala de 0-100 (siendo 0 poco uniforme, natural o con mal aspecto, y 100 muy uniforme, natural y con buen aspecto). Las mediciones de la elasticidad de la piel y el grosor de la piel se realizaron utilizando un medidor de par dérmico (DTM) y plicómetros para la piel, respectivamente. La histopatología de las secciones de biopsia se realizó a los 3 y 6 meses para evaluar la persistencia de los implantes y los niveles de contenido de elastina en los sitios de tratamiento mediante tinción de Verhoff Van Giesen (VVG).

Resultados:

Análisis histopatológico de los sitios de los implantes:

[0137] Los sitios de la piel evaluados por VVG revelaron que las áreas de la piel tratadas con RVL mostraban cambios dérmicos, incluidas fibras de colágeno dérmicas estiradas y separadas por el material del implante, como se muestra en los espacios extracelulares sin teñir que dominan la Figura 14A. Por el contrario, las áreas de la piel tratadas con ELAPR002 mostraron que el material del implante se integraba con el tejido cutáneo con evidencia de remodelación del material del implante en elastina como lo demuestra la transición del material del implante de azul a púrpura a negro por la tinción VVG. Está claro, por lo tanto, que la administración de tropoelastina ha provocado un ensamblaje y un depósito de fibra elástica in situ muy similar al observada en la elastogénesis (Figura 14B).

Mediciones del grosor e irregularidad de la piel

[0138] El grosor de la piel en los sitios de tratamiento fue medido por el médico investigador usando plicómetros. En la Tabla 1 se muestran las medidas promedio del grosor de la piel para los sitios tratados con las formulaciones de RVL y ELAPR al inicio y a los 3 meses. Se observó que el aumento en el grosor de la piel era significativo tanto para las formulaciones de RVL como para las de elastina (p<0,001).

T l 1: M i i n ^ l r r l i l

[0139] De los dieciséis pacientes del estudio, los dieciséis brazos tratados con RVL presentaban bultos que eran visibles y que el investigador podía palpar a los 3 meses. Por el contrario, solo 1 de los 16 brazos tratados con formulaciones de ELAPR002 presentó bultos a los 3 meses. Como tal, las medidas del grosor de la piel para RVL son en gran medida una medida de los bultos de RVL en la piel, mientras que las medidas de los sitios tratados con ELAPR002 reflejan con mayor precisión un aumento en el grosor general de la piel en el área tratada.

Mediciones de la elasticidad de la piel

[0140] Se tomaron mediciones del estiramiento elástico de la piel, Ue, de los sitios de piel tratados usando el DTM en cada visita de evaluación durante el período del estudio clínico.

[0141] Las puntuaciones medias de Ue al inicio y a los 6 meses se proporcionan en la Tabla 2 para RVL y ELAPR002i. Como se puede ver en los datos de la tabla, los sitios de la piel tratados con RVL revelaron una capacidad decreciente de estiramiento elástico (Ue reducido después del tratamiento), lo que indica que el aumento del grosor de la piel como resultado del tratamiento con ^rV^lhace que la piel se vuelva más rígida. Por el contrario, las áreas de la piel tratadas con los implantes de tropoelastina mantuvieron la capacidad de estiramiento elástico (Ue permanece relativamente estable), lo que indica que se logra un mayor grosor de la piel a la vez que se mantienen las propiedades elásticas de la piel.

T l 2: E ir mi n l i l i l

Evaluaciones de los pacientes

[0142] Las puntuaciones medias de la evaluación análoga visual del paciente de la uniformidad, naturalidad y aspecto del área de la piel tratada se proporcionan en la Tabla 3 para los sitios de la piel tratados con RVL y ELAPR002ii. Los datos muestran que los pacientes calificaron los sitios de la piel tratados con formulaciones de tropoelastina con puntuaciones altas en cuanto a uniformidad, naturalidad y aspecto en comparación con los tratados con RVL (las puntuaciones más altas representan una evaluación positiva).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método no terapéutico para mejorar el aspecto de la piel de un individuo, método que incluye los siguientes pasos de tratamiento:

- contar con un individuo;

- definir un área de tratamiento en la piel del individuo, en donde el área de tratamiento es un área de la piel que requiere una mejora de aspecto

- inyectar una composición de tropoelastina que comprende una concentración de 0,5 mg/ml a 200 mg/ml de tropoelastina en el tejido cutáneo dentro del área de tratamiento para permitir la formación de fibras elásticas en el área de tratamiento, en donde al menos uno de;

i) la composición de tropelastina se inyecta en el tejido cutáneo dentro del área de tratamiento de acuerdo con un programa de tratamiento predeterminado, en donde dicho programa de tratamiento predeterminado está caracterizado por el hecho de que tiene uno o más tratamientos, cada tratamiento en forma de al menos una inyección en el área de tratamiento, y de que al menos un tratamiento del programa de tratamiento incluye inyecciones múltiples en el área de tratamiento para establecer una cantidad de tropoelastina dentro del área de tratamiento que aumenta con respecto a la piel que está fuera del área de tratamiento; y

ii) la composición de tropoelastina se inyecta en el tejido cutáneo dentro del área de tratamiento para establecer una cantidad de tropoelastina dentro del área de tratamiento que aumenta en relación con la piel fuera del área de tratamiento, y donde la composición de tropoelastina está adaptada para la liberación sostenida de tropoelastina en el tejido cutáneo dentro del área de tratamiento, en donde la composición de tropoelastina comprende tropoelastina y ácido hialurónico, y en donde que la tropoelastina carece sustancialmente de puntos de reticulación intramoleculares, con lo que se mantiene una cantidad de tropoelastina en el área de tratamiento para permitir la formación de fibras elásticas y, por lo tanto, mejorar el aspecto de la piel del individuo, en donde mejorar el aspecto de la piel es al menos uno de

a) mejorar el aspecto de una estría del individuo;

b) minimizar la degeneración de un perfil elástico de un tejido cutáneo del individuo;

c) mejorar el perfil elástico y/o el aspecto físico del tejido envejecido del individuo; y d) aumentar el grosor de la piel manteniendo o mejorando la elasticidad de la piel del individuo.

2. Método según la reivindicación 1, en donde cada tratamiento del programa de tratamiento está espaciado por entre 1 y 24 semanas.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde, cuando un tratamiento incluye múltiples inyecciones en el área de tratamiento, cada inyección se realiza en un sitio de inyección que está separado de otros sitios de inyección entre 1 mm y 3 cm.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición de tropoelastina se inyecta en un volumen de 10 |_il a 100 |_il.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la tropoelastina está unida al ácido hialurónico, y en donde, más preferiblemente, la composición incluye de 0,5 a 50 mg/ml de tropoelastina y de 0,1 % a 1 % de ácido hialurónico.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición consiste en tropoelastina, ácido hialurónico y una solución acuosa.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el programa de tratamiento incluye inyecciones en el área de tratamiento cada 2 a 8 semanas, opcionalmente en donde el programa de tratamiento abarca un período de aproximadamente 1 a 6 meses, preferiblemente de aproximadamente 1 a 3 meses.

8. Método según la reivindicación 1, en donde el área de tratamiento incluye una estría y la composición de tropoelastina se inyecta dentro de la estría.

9. Método según la reivindicación 1, en donde el área de tratamiento incluye tejido cicatricial o fibrótico.