KR20190040373A - 탄력섬유의 생체 내 합성 - Google Patents

Abstract

피부 조직에서 외양을 개선시키는데 사용되는 트로포엘라스틴 조성물이 본원에 개시된다.

Description

탄력섬유의 생체 내 합성{In vivo synthesis of elastic fiber}

본 발명은 조직 내 탄력성을 회복하거나 재생함으로써, 노화되거나 손상된 조직의 신체적 외양 및/또는 기능을 향상시키는 것에 관한 것이다.

본 명세서 내의 임의의 선행기술에 대한 참조는, 이러한 선행기술이 호주 또는 임의의 다른 관할구역에서 통상의 일반적인 지식의 일부를 형성하거나 이러한 선행기술이 당업자에 의하여 바로 확인되고, 이해되고, 관련된 것으로 간주되는 것이 합리적으로 예상될 수 있다는, 인정 또는 모든 형태의 시사가 아니며, 인정 또는 모든 형태의 시사로서 간주되어서도 안 된다.

노화 및 조직 손상은 조직 구조 및/또는 기능의 소실에 이르는 세포외 기질의 퇴행과 연관된다. 처진 피부, 이완된 피하 조직, 세포외 기질의 밀도의 소실, 주름, 튼살 및 섬유증은 퇴행의 신체적 징후이다. 관련된 조직에 따라, 탄력 기능의 소실은 감소된 폐 또는 심장 능력, 또는 다양한 판막들 및 조임근들의 감소된 유연성 및/또는 탄성으로 나타날 수 있다.

약 20년 전, 조직 구조 및 기능의 소실을 교정하기 위한 임상 시험 및 미용 시술들의 범위 내에서 세포외 기질의 다양한 분자들을 사용하고자 하는 연구 노력이 시도되었다. 관심 있는 주요 분자들은 관련된 세포외 기질 섬유들의 기재들, 즉 콜라겐 및 엘라스틴이었다. 일반적으로 접근법은 조직 공극을 충전하거나, 조직을 플럼핑하거나 충전함으로써 조직 외양을 향상시키도록 이식물(implant) 또는 필러(filler)로서 이러한 생물재료를 사용하거나, 결함 있는 기능을 개선하기 위한 이식물 또는 필러로서 이러한 섬유를 사용하는 것이었다.

엘라스틴은, 콜라겐과 다르게, 탄력 이식물 및 필러를 형성하는데 사용될 수 있기 때문에, 몇몇 사람들에 의하여 이러한 작업에 유용한 것으로 간주되었다. 종래 작업은, 개인에게 전달되기 이전이나 이후에, 코아세르베이트가 될 것이고 화학적 또는 효소적으로 가교 결합될 것인 재조합 형태의 트로포엘라스틴의 합성에 초점을 맞추어, 탄력 이식물 또는 필러가 조직 공극들을 충전하거나 조직을 향상시키거나 재형성하기 위하여 생체 외 또는 생체 내에서 형성될 수 있게 한다. 예를 들어, WO1994/14958; WO1999/03886; WO2000/04043을 참조한다. WO2010/102337호는 주사가능한 가교 결합된 생물재료의 형성에서 고체 농도의 관련성을 언급한다.

효소적 가교 결합이 생체 내에서 사용되었을 경우, 재조합 또는 다른 외인성 리실 산화 효소가 사용되었다. USSN 09/498,305호는 외인성 리실 산화 효소 및 트로포엘라스틴 단량체를 포함하는 조성물의 투여에 의한 생체 내 트로포엘라스틴 단량체의 효소적 가교 결합에 대한 한 가지 접근법을 기술한다.

가교 결합된 트로포엘라스틴의 일정 특징과 닮은 재료의 형성에 대한 다른 접근법이 WO2008/058323에 개시되며, WO2008/058323호에 의해 비가교 트로포엘라스틴으로 구성된 탄력 재료가 염기성 조건 하에서 형성된다.

전술된 각 예에서, 외인성 트로포엘라스틴 및 가교제 또는 염기성 조건은 이식물 또는 필러의 형성을 추진하는데 활용된다. 탄력 최종 생성물을 형성하는 시간은 트로포엘라스틴의 농도, 가교제 및 관련된 조건들의 함수이므로, 최종 생성물은 무세포성 과정으로부터 기인한다.

또한, (i) 상처 밀봉제로서(WO94/14958); (ii) 생분해성 또는 생분리성 서방성 제형을 제공하는 활성 성분들을 위한 전달 매개체로서(WO94/14958); (iii) GAG를 위한 결합 시약으로서(WO99/03886); (iv) 엘라스틴 침전의 저해를 위해(WO99/03886); 그리고 (v) 세린 프로테아제가 일반적으로 발견되는 상처 부위, 조직 손상 및 리모델링 위치(WO00/04043)에서의 용도를 포함하는 트로포엘라스틴의 다수의 다른 용도 또한 포함된다.

초기의 작업은 다수의 형태의 트로포엘라스틴이 전술한 적용 중 임의의 하나에 사용될 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 도메인 26A를 포함하는 인간 트로포엘라스틴의 합성 형태에 관한 WO94/14958을 참조한다. WO94/14958은 약학적 조성물에 사용하기 위한 포유동물 및 조류 형태를 기술하고 있다; 도메인 26A, C 말단 도메인 및 기타가 결여된 것을 포함하는 인간 트로포엘라스틴의 다수의 합성 형태에 관한 WO99/03886. WO99/03886은 약학적 적용에 사용하기 위한 인간 및 비인간 형태를 기술한다. 특정 형태인 SHELδ26A가 GAG 결합 활성의 결여; 및 세린 프로테아제, 구체적으로 트롬빈, 플라스민, 칼리크레인, 젤라티나제 A 및 B, 및 매트릭스 메탈로 엘라스타제에 대해 감소된 감수성을 가지는 트로포엘라스틴의 형태에 관한 WO00/04043을 참조하여 논의된다. WO00/04043은 이러한 적용에 유용한, 부분 및 전장 형태 및 이종 형태를 포함하는 감소된 감수성을 가지는 트로포엘라스틴의 관련 형태("감소된 트로포엘라스틴 유도체”로 지칭됨)를 기술하고 있다.

이러한 초기 작업의 각 예에서, 탄력 성질을 가지는 이식물이 조직에 제공될 수 있지만, 이식물의 본질 및 그의 탄력 성질이 정상적으로 조직에 속하는 본질 및 탄력 성질을 시사하지는 않는다. 예를 들어, 이러한 초기 작업에 기술된 바와 같은 필러 또는 이식물에 의해 진피 또는 피하 조직에 부여된 탄력 성질은 이러한 조직의 정상적인 탄력성과 명백하게 다른 것을 볼 수 있다. 다시 말하면, 탄력성을 포함하는 성질을 가지는 재료의 이식으로 조직에 탄력성이 부여될 수 있지만, 정상과 유사한 신체적 외양 또는 기능의 복귀는 되지 않을 수 있다.

돌이켜 생각해보면, 이러한 결과는 어쩌면 놀랍지 않은데, 이는 최근 5 내지 10년에 걸친 보다 최근의 작업에서 주어진 조직의 탄력 프로파일이 '리실 산화효소 및 트로포엘라스틴에 더하여 다수의 인자들이 관여된 엘라스틴화(elastogenesis)'로 알려진 복잡한 과정으로부터 기인한다는 것이 밝혀졌기 때문이다. 엘라스틴화는 일반적으로 섬유아세포, 평활근 세포 등을 포함하는 세포에 의해 트로포엘라스틴 단량체 및 다른 관련 인자로부터 드 노보(de novo)로 탄력 섬유가 생성되는 후기 태아기부터 출생 후 초기에 발생하는 생리학적 과정을 지칭하는 것으로 이해된다. 인자들의 공통적인 세트로부터 시작하여, 관련 조직에 자연적이고 이것으로부터 조직의 탄력 프로파일이 발생하는 탄력 섬유의 합성, 구조화, 및 분배를 초래하는 이러한 인자들의 조직 특이적 상호작용을 관련 조직이 제공한다(Cleary E.G and Gibson M.A . Elastic Tissue, Elastin and Elastin Associated Microfibrils in Extracellular Matrix Vol 2 Molecular Components and Interactions (Ed Comper W.D.) Harwood Academic Publishers 1996 p95). 명백해진 것은 이러한 구조화 및 수반되는 프로파일이 초기 작업에 의해 제안된 바와 같이 생체 외 또는 생체 내에서 외인성 트로포엘라스틴을 외인성 리실 산화효소와 단순히 가교 결합함으로써 재생되지 않는다는 것이다.

성체 조직에서 엘라스틴화(즉, 조직이 인자들의 공통의 세트로부터 탄력 섬유가 드 노보로 합성하는 것)과 유사한 과정의 개시가 바람직한 목표이며, 이는 이러한 과정이 조직에 대한 탄력 프로파일을 회복할 수 있을 것으로 여겨지기 때문이다. 예를 들어, 조직의 프로파일이 더 어린 조직의 프로파일과 닮도록 노화된 조직의 탄력 프로파일이 회복될 수 있다. 불행하게도, 이러한 목표는 달성하기 힘든 것으로 남아있는데, 이는 주로 성체에서 탄력 섬유의 드 노보 형성은 무시해도 좋을 정도이기 때문이다. 비록 탄력 섬유 복구가 일부 심혈관 및 폐질환에서 발생할 수 있지만, 복구 기전으로부터 발생된 탄력 섬유의 본래의 모습 및 구조화는 엘라스틴화로부터 발생된 것과는 다르다(Akhtar et al. 2010 J. Biol . Chem . 285: 37396 -37404).

이러한 문제는 많은 연구 그룹에 의해 최근 10년에 걸쳐 집중적으로 연구되어 왔다(Huang R et al., Inhibition of versican synthesis by antisense alters smooth muscle cell phenotype and induces elastic fiber formation in vitro and in neointima after vessel injury. Circ Res. 2006 Feb 17; 98(3):370-7; Hwang JY et al., Retrovirally mediated overexpression of glycosaminoglycan -deficient biglycan in arterial smooth muscle cells induces tropoelastin synthesis and elastic fiber formation in vitro and in neointimae after vascular injury. Am J Pathol . 2008 Dec;173(6) :1919-28.; Albertine KH et al., Chronic lung disease in preterm lambs: effect of daily vitamin A treatment on alveolarization. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol . 2010 Jul 299(1):L59 -72; Mitts TF et al., Aldosterone and mineralocorticoid receptor antagonists modulate elastin and collagen deposition in human skin. J Invest Dermatol . 2010 Oct;130(10) :2396-406; Sohm B et al., Evaluation of the efficacy of a dill extract in vitro and in vivo . Int J Cosmet Sci . 2011 Apr;33(2) :157-63; Cenizo Vet al., LOXL as a target to increase the elastin content in adult skin: a dill extract induces the LOXL gene expression. Exp Dermatol . 2006 Aug;15(8):574-81). 성체에서의 탄력 섬유 드 노보 형성 부재를 설명하기 위해 널리 고려되는 가설은 성체 세포 또는 이를 포함하는 관련 조직에서 엘라스틴화를 위해 요구되는 과정 및 필수 인자의 하나 이상이 결여되었다는 것이다(Shifren A & Mecham R.P . The stumbling block in lung repair of emphysema: elastic fiber assembly. Proc Am Thorac Soc Vol 3 p 428-433 2006). 가설에 따르면, 성체 조직에 합성 트로포엘라스틴의 제공하는 것은 성체 세포가 합성 트로포엘라스틴으로부터 탄력 섬유를 합성할 수 있도록 하지 못한다.

현재의 연구는 초기 생명체에서 엘라스틴화를 뒷받침하는 기전 및 인자를 이해하고, 이들이 성체 생명체에서 존재하는지를 결정하는 데에 초점을 맞추고 있다(Wagenseil JE & Mecham RP. New insights into elastic fiber assembly. Birth Defects Res C Embryo Today. 2007 Dec;81(4):229-40).

일반적으로, 트로포엘라스틴 단백질 발현 직후, 트로포엘라스틴은 약 200 내지 300 nm의 구형 조립체로 코아세르베이트되고, 그 후 약 일 미크론의 입자로 더 합쳐지는 것으로 생각된다. 그 후, 이러한 입자들이 세포외 기질에서 미세섬유의 길이에 따라 조립되어 탄력 섬유를 형성한다(Kozel BA et al., Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J Cell Physiol . 2006 Apr;207(1) :87-96). 이 과정에서 다양한 추가적인 인자들의 관여는 연구되고 있는 중이다.

다양한 분자적 단계의 시험관 내 연구에서 인간 및 비인간 트로포엘라스틴 기질 및 다양한 상이한 트로포플라스틴 이소형들이 검증되는 경향이 있다(Davidson JM et al., Regulation of elastin synthesis in pathological states. Ciba Found Symp. 1995;192 :81-94; discussion 94-9). 이러한 작업을 통해, 비록 단지 이들 중 일부만이 섬유 생성에 구조적으로 관여된 것으로 보일지라도, 적어도 34개의 상이한 분자가 탄력 섬유와 연관된 것으로 밝혀졌다. 이들은 트로포엘라스틴, 피브릴린-1, 피브릴린-2, 리실 산화효소, 리실 산화효소 유사체-1(LOXL1), 에밀린, 피불린-4 및 피불린-5를 포함한다(Chen et al. 2009 J. Biochem 423: 79 -89). 하나의 그룹은 LOX 패밀리의 구성원인 LOXL1을 일정 성체 조직에서 사라진 주요 분자로 간주한다(US2004/0258676, US2004/0253220 및 US20100040710 참조). 다른 그룹은 피불린-4 및 다른 분자들을 리실 산화효소 또는 다른 분자와의 상호작용을 통해서 식별한다(Yanagisawa H & Davis EC . Unraveling the mechanism of elastic fiber assembly: The roles of short fibulins . Int J Biochem Cell Biol . 2010 Jul;42(7):1084-93).

요약하면, 엘라스틴화에서의 인자들의 상호작용을 고려한 상황은 아직 완성되지 않았지만, 현재의 연구는 하나 이상의 인자들의 결여로 인해 성체 세포 및 조직이 엘라스틴화와 유사한 과정을 완성할 수 없다는 것을 나타낸다. 따라서, 트로포엘라스틴만을 단독으로 성체 조직에 제공하는 것은 그 자체로 조직의 탄력 프로파일을 회복하는 데에 충분하지 않으며, 이는 엘라스틴화에 요구되는 관련 인자들 없이는, 조직이 트로포엘라스틴을 탄력 섬유를 형성하는데 활용할 수 없기 때문이다.

조직의 탄력 프로파일을 회복 또는 재생하거나, 조직에서 탄력 프로파일의 퇴행을 최소화할 필요가 남아있다.

생명체의 초기 단계에서의 조직의 프로파일을 더욱 밀접하게 닮도록 노화된 조직의 탄력 프로파일을 개선할 필요가 있다.

광노화된 조직을 포함하는 노화된 조직의 신체적 외양을 개선, 예를 들어 피부 처짐, 피하 조직의 이완, 세포외 기질의 밀도 소실, 주름 및 튼살을 최소화할 필요가 있다.

또한, 프로파일이 흉터 또는 섬유증 조직을 함유하는 관련 조직의 조직 손상 이전의 프로파일과 더욱 밀접하게 닮도록 흉터가 있거나 섬유증 조직에서 탄력 프로파일을 개선할 필요가 있다.

또한 노화되거나 손상된 조직에 생명체의 초기 단계 또는 손상 이전의 관련 조직의 탄력 기능을 더욱 밀접하게 닮은 개선된 탄력 기능을 제공할 필요가 있다.

전술된 필요성은 앞서의 관련 선행 기술에서와 같은 이식물 또는 필러에 의해 다뤄진 것 및 가교 결합된 트로포엘라스틴으로 조직을 채우기 위한 이식물 또는 필러의 용도와는 구분된다.

본 발명은 하나 이상의 전술된 필요성을 다루고자 하며, 일 구현예에서 개체에서 조직의 탄력 프로파일을 회복하는 방법을 제공하되,

- 탄력 프로파일이 회복될 조직을 갖는 개체를 제공하는 단계;

- 치료 요법에 따라 개체에 트로포엘라스틴을 투여하는 단계로서, 치료 요법은, 트로포엘라스틴으로부터의 탄력 섬유 합성을 위해 투여된 트로포엘라스틴과 탄력 섬유의 형성을 위해 조직 내에서 발현된 인자들이 결합할 수 있도록 하는 기간 동안 투여된 트로포엘라스틴을 조직 내에서 유지하도록 선택되는 것인 단계;

-그럼으로써 개체의 조직의 탄력 프로파일을 회복하거나 재생하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 구현예에서, 개체의 조직의 탄력 프로파일의 퇴행을 최소화하는 방법이 제공되되,

- 탄력 프로파일의 퇴행이 최소화될 조직을 갖는 개체를 제공하는 단계;

- 치료 요법에 따라 개체에 트로포엘라스틴을 투여하는 단계로서, 치료 요법은, 트로포엘라스틴으로부터의 탄력 섬유 합성을 위해 투여된 트로포엘라스틴과 탄력 섬유의 형성을 위해 조직 내에서 발현된 인자들이 결합할 수 있도록 하는 기간 동안 투여된 트로포엘라스틴을 조직 내에서 유지하도록 선택되는 것인 단계;

- 그럼으로써 개체의 조직의 탄력 프로파일의 퇴행을 최소화하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

다른 구현예에서, 탄력 프로파일이 생명체의 초기 단계에서의 조직의 프로파일을 더욱 밀접하게 닮도록 노화된 조직의 탄력 프로파일을 개선하는 방법이 제공되되,

- 탄력 프로파일이 개선될 조직을 갖는 개체를 제공하는 단계;

- 치료 요법에 따라 개체에 트로포엘라스틴을 투여하는 단계로서, 치료 요법은, 트로포엘라스틴으로부터의 탄력 섬유 합성을 위해 투여된 트로포엘라스틴과 탄력 섬유의 형성을 위해 조직 내에서 발현된 인자들이 결합할 수 있도록 하는 기간 동안 투여된 트로포엘라스틴을 조직 내에서 유지하도록 선택되는 것인 단계;

- 그럼으로써, 탄력 프로파일이 생명체의 초기 단계에서의 조직의 프로파일을 더욱 밀접하게 닮도록 노화된 조직의 탄력 프로파일을 개선하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

다른 구현예에서, 노화된 조직의 신체적 외양을 개선하는 방법이 제공되되,

- 신체적 외양이 개선될 조직을 갖는 개체를 제공하는 단계;

- 치료 요법에 따라 개체에 트로포엘라스틴을 투여하는 단계로서, 치료 요법은, 트로포엘라스틴으로부터의 탄력 섬유 합성을 위해 투여된 트로포엘라스틴과 탄력 섬유의 형성을 위해 조직 내에서 발현된 인자들이 결합할 수 있도록 하는 기간 동안 투여된 트로포엘라스틴을 조직 내에서 유지하도록 선택되는 것인 단계;

- 그럼으로써, 노화된 조직의 신체적 외양을 개선하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

다른 구현예에서, 프로파일이 흉터 또는 섬유증 조직을 함유하는 관련 조직의 조직 손상 이전의 프로파일을 더욱 밀접하게 닮도록 흉터가 있거나 섬유증 조직에서 탄력 프로파일을 개선하는 방법이 제공되되,

- 흉터가 있거나 섬유증 조직을 갖는 개체를 제공하는 단계;

- 치료 요법에 따라 개체에 트로포엘라스틴을 투여하는 단계로서, 치료 요법은, 트로포엘라스틴으로부터의 탄력 섬유 합성을 위해 투여된 트로포엘라스틴과 탄력 섬유의 형성을 위해 조직 내에서 발현된 인자들이 결합할 수 있도록 하는 기간 동안 투여된 트로포엘라스틴을 조직 내에서 유지하도록 선택되는 것인 단계;

- 그럼으로써, 흉터가 있거나 또는 섬유증 조직 내의 탄력 프로파일을 개선하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

다른 구현예에서, 생명체의 초기 단계 또는 손상 이전의 관련 조직의 탄력 기능을 보다 밀접하게 닮도록 노화되거나 손상된 조직에서 탄력 기능을 개선하는 방법이 제공되되,

- 노화되거나 손상된 조직을 갖는 개체를 제공하는 단계;

- 치료 요법에 따라 개체에 트로포엘라스틴을 투여하는 단계로서, 치료 요법은, 트로포엘라스틴으로부터의 탄력 섬유 합성을 위해 투여된 트로포엘라스틴과 탄력 섬유의 형성을 위해 조직 내에서 발현된 인자들이 결합할 수 있도록 하는 기간 동안 투여된 트로포엘라스틴을 조직 내에서 유지하도록 선택되는 것인 단계;

- 그럼으로써, 노화되거나 손상된 조직 내의 탄력 기능을 개선하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

다른 구현예에서, 바람직하게는, 개체의 피부의 탄력성을 유지하거나 개선하면서, 개체의 피부에 두께를 제공하기 위한 개체의 피부에 탄력성을 제공하는 방법이 제공되되, 방법은 다음의 단계를 포함한다:

- 개체를 제공하는 단계;

- 개체의 피부 상에 치료 면적을 정의하는 단계로서, 치료 면적은 탄력성이 제공될 피부 면적인 단계;

- 치료 면적 내로 트로포엘라스틴 조성물을 주입하여 치료 면적 외부의 피부에 비해 증가된 양의 트로포엘라스틴이 치료 면적 내에 확립되도록 하는 단계;

- 치료 면적 내에 트로포엘라스틴의 양을 사전 결정된 기간 동안 유지함으로써 개체의 피부에 탄력성을 제공하는 단계.

다른 구현예에서, 하나 이상의 다음의 적용에서 사용하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 트로포엘라스틴 조성물이 제공된다.

● 개체의 조직의 탄력 프로파일을 회복

● 개체의 조직의 탄력 프로파일의 퇴행을 최소화

● 탄력 프로파일이 생명체의 초기 단계의 조직의 프로파일을 더욱 밀접하게 닮도록 노화된 조직의 탄력 프로파일을 개선

● 노화된 조직의 신체적 외양을 개선

● 프로파일이 흉터 또는 섬유증 조직을 함유하는 관련 조직의 조직 손상 전의 프로파일을 더욱 밀접하게 닮도록 흉터가 있거나 섬유증 조직 내의 탄력 프로파일을 개선

● 관련된 조직의 생명체의 초기 단계 또는 손상 전의 탄력 기능을 더욱 밀접하게 닮도록 노화되거나 손상된 조직 내의 탄력 기능 개선.

도 1: 상이한 연령 그룹들로부터 기원한 배양된 인간 섬유아세포에 250 ㎍/ml의 트로포엘라스틴을 첨가한 7일 후에 형성된 엘라스틴망을 나타내는 형광 이미지. a. 신생아 1차 남성(NHF 8-9-09); b. 10세 남성(GM3348); c. 31세 남성 화상 환자(230209A); d. 51세 남성(142BR); e. 92세 남성(AG04064). 엘라스틴망 침전은 녹색, 세포핵은 청색이다.
도 2: 배양된 돼지 및 토끼 섬유아세포에 트로포엘라스틴을 첨가한지 7일 후의 엘라스틴 침전을 나타내는 형광 이미지. a. 10주령 1차 돼지 피부 섬유아세포; b. 성체 토끼 피부 섬유아세포. 엘라스틴 침전은 녹색, 세포핵은 청색이다.
도 3: 트로포엘라스틴의 첨가 7일 후 1차 기도 평활근 세포에 의한 엘라스틴 섬유 형성을 보여주는 형광 이미지. a. 기도 평활근 세포(3785). b. 다른 기원의 기도 평활근 세포(3791). 엘라스틴 침전은 녹색, 세포핵은 청색이다.
도 4: 트로포엘라스틴 또는 유도체들의 첨가 7일 이후 1차 신생아 인간 섬유아세포에 의한 엘라스틴 섬유 형성을 보여주는 형광 이미지. a. 트로포엘라스틴 없음; b. 전장 트로포엘라스틴; c. 인간 피부 엘라스틴 펩티드; d. RKRK 결실; e. RGDS 치환. f. 향상된 바이오 매트릭스 트로포엘라스틴. 엘라스틴 침전은 녹색, 세포핵은 청색이다.
도 5: 블렙비스타틴(blebbistatin) 부재(a) 및 50 μM 블렙비스타틴 존재(b)내에서 125 ㎍/ml 트로포엘라스틴의 첨가 7일 후 1차 신생아 인간 섬유아세포에 의한 엘라스틴 섬유 형성을 보여주는 형광 이미지. 엘라스틴 침전은 녹색, 세포핵은 청색이다.
도 6: 반복되는 트로포엘라스틴 첨가 이후에 1차 신생 인간 섬유아세포들에 의한 엘라스틴망 형성의 정도를 보여주는 형광 이미지. a. 세포; b. 세포 + 10일에 트로포엘라스틴 첨가; c. 세포 + 10일 및 17일에 트로포엘라스틴 첨가; d. 세포들 + 10일, 17일, 24일에 트로포엘라스틴 첨가. 모든 시료들은 31일에 영상화를 위하여 고정되었다. 엘라스틴 침전은 녹색, 세포핵은 청색이다.
도 7: 자가 형광 성숙 엘라스틴 섬유. (a) 트로포엘라스틴 미첨가된 섬유아세포, (b) 트로포엘라스틴 첨가된 섬유아세포.
도 8: 진피 인간 섬유아세포 배양물의 AFM 분석. 이미지들은 모듈러스 채널로 덮어씌워진 배양 토포그래피를 나타낸다. (a) 트로포엘라스틴 미첨가된 섬유아세포, (b) 트로포엘라스틴 첨가된 섬유아세포.
도 9: 인간 신생아 진피 섬유아세포에 의한 탄력 섬유 형성. 트로포엘라스틴은 접종 후 12일에 첨가되었고, 시료는 DAPI, 항 엘라스틴 마우스 항체 및 FITC-접합된 항 마우스로 염색되었다.
도 10: 리실 산화효소의 억제는 탄력 섬유 형성을 방지한다. 리실 산화효소 억제제인 BAPN의 존재 내에서 엘라스틴 섬유 형성. 시료는 DAPI, 항 엘라스틴 마우스 항체 및 FITC-접합된 항 마우스로 염색되었다.
도 11: 인간 진피 섬유아세포 배양물 내의 트로포엘라스틴 소구체들의 초고해상도 현미경 이미지. (a) 눈금자는 1 미크론이다. (b) 눈금자는 2 미크론이다.
도 12: 트로포엘라스틴 첨가 3일 후 인간 진피 섬유아세포 배양물의 TEM 이미지.
도 13은 베르회프 반 기슨(Verhoeff-Van Gieson, VVG) 염색된 2주 생검 절편. 트로포엘라스틴을 함유하는 컨스트럭트를 사용한 전체 두께의 상처의 치료 2주 후 돼지 피부 내 진피 단면에서 엘라스틴에 대한 VVG 염색. 시험 A는 10% 트로포엘라스틴의 존재 하에 가교 결합된, 가교 결합된 콜라겐 템플릿이다. 시험 B는 개질된 HA에 가교 결합된 트로포엘라스틴 매트릭스의 상부 상에 도포된 가교 결합된 콜라겐 템플릿이다. 이미지들은 정상 돼지 피부 및 가교 결합된 콜라겐 템플릿인 대조군과 대조된다.
도 14: RVL 또는 엘라스틴 기반 제형으로 치료된 대상체의 전박 진피에서 취해진 피부 생검 절편. (a) RVL로 치료된 피부는 피부를 더 단단하고 덩어리지게 하는 염색되지 않는 RVL 재료에 떨어져서 신장된 진피 콜라겐 섬유들을 나타낸다. (b) 트로포엘라스틴 기반 제형으로 치료된 피부는 이식 재료와는 분리되는, VVG에 의해 청색으로부터 자주색 내지 검은색으로 염색되는 진피 콜라겐 섬유를 야기하며, 이는 이식 재료가 성숙 엘라스틴 섬유 내로 리모델링 됨을 나타낸다.

본 발명의 주요한 발견은 본 발명자들에 의해 개발되고 본원의 실시예에 예시된 신규한 검정 시스템으로부터 발생하는 것으로 여겨진다. 검정 시스템은 시험관 내에서 탄력 섬유를 형성하기 위해 성체 인간 세포를 이용한다. 시스템은 탄력 섬유 형성의 각 단계를 분석할 수 있고 탄력 섬유 형성에 요구되는 과정 및 구성요소를 식별하도록 조작될 수 있다.

이러한 검정 시스템은 본 발명 이전에 앞서 이해되던 것과는 다른 탄력 섬유 합성의 경로를 밝혀냈다. 주요한 발견은 섬유 형성이 이전에 생각하던 것보다 훨씬 더 세포 상호작용에 의존한다는 것이다.

주요한 발견은 외인성 트로포엘라스틴 단량체가 시스템에 첨가되지 않으면 시스템은 실질적이거나 현저한 탄력 섬유의 합성을 야기하지 않는다는 것이다. 이것은 생체 내 탄력 섬유의 합성에서 트로포엘라스틴의 중요성을 알려준다.

여기에 더하여, 시스템은 시스템이 인간 트로포엘라스틴 단량체를 비인간 세포와 함께 사용한다면 탄력 섬유 형성이 효율적으로 발생하지 않는다는 것을 입증한다.

또한 단량체는 일반적으로 하나 이상의 자연적으로 발생하는 이소형을 취하도록 요구된다. 단량체는 재조합으로 형성될 수 있지만, 비록 내인성 및 외인성 트로포엘라스틴 사이의 서열 차이가 약 65% 상동성 미만이 아니라면 섬유 형성이 어느 정도까지는 가능하더라도, 인간 생리학에서 존재하지 않는 서열 또는 구조를 가지는 재조합 형태는 효율적인 탄력 섬유 형성을 할 수 없다는 것이 밝혀졌다.

여기에 더하여, 시스템에 대한 트로포엘라스틴의 반복 투여가 탄력 섬유를 형성하는 지속적인 능력을 보이며, 이는 트로포엘라스틴이 탄력 섬유 형성의 제한 인자임을 나타낸다.

인간 성체 세포 및 자연적으로 발생하는 인간 트로포엘라스틴 이소형의 사용이 본 검정 시스템을 다른 것(예를 들어, Sato F et al., Distinct steps of cross-linking, self-association, and maturation of tropoelastin are necessary for elastic fiber formation. J Mol Biol . 2007 Jun 8;369(3) :841-51을 참조)들로부터 구분하는 것으로 여겨지며, 아마도 이것은 관련된 연구 그룹들이 세포가 트로포엘라스틴에 노출된다면 인간 성체 세포가 엘라스틴화(elastogenesis)와 유사한 과정에서 탄력 섬유의 합성을 위한 잠재성을 가진다는 것을 이해하지 못했기 때문이다.

추가의 연구에서, 본원에 예시된 임상 시험은 세포가 트로포엘라스틴과 결합하기 위해 충분한 시간 동안 트로토엘라스틴을 조직에서 유지하는 것의 중요성을 확립했다. 이것은 선택된 기간 동안 치료될 조직의 면적에 트로포엘라스틴의 수준을 확립하고 유지하여, 치료된 면적이 치료되지 않은 면적보다 높은 수준의 트로포엘라스틴을 가지도록 함으로써 달성될 수 있다. 트로포엘라스틴이 세포의 결합에 요구되는 충분한 기간 동안 조직에서 지속된다면, 또는 많지 않은 수의 세포를 가지는 경우, 조직이 세포의 결합 및 동원을 위해, 엘라스틴화 유사 과정이 성체 세포에서 발생할 수 있고 조직 내 섬유의 형성 및 탄력 프로파일의 회복을 초래하는 것으로 여겨진다. 조직 내 트로포엘라스틴의 지속 또는 유지를 위한 예시적인 기간은 하기에 더 자세히 논의된다.

본 발명에 따라 형성된 탄력 섬유는 자연계에서 관찰되는 것과 동일한 분자 구조를 가질 수 있지만, 일부 구현예에서, 섬유의 분자 및/또는 물리적 구조가 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일정 구현예에서, 탄력 섬유는 여전히 본 발명의 목적을 달성하면서, 치료된 조직에서의 물리적 구조와 구분되는 물리적 구조를 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 합성된 엘라스틴은 조직, 세포 및/또는 세포외 기질에 통합됨으로써 탄력 프로파일을 회복하거나 재생하거나, 신체적 외양을 개선하거나 다른 임상적 종점을 달성한다. 이러한 구현예에서, 합성된 엘라스틴은 조직 내에서 정상적으로 관찰되는 탄력 섬유와 비교하여 상이한 물리적 또는 분자 구조를 가질 수 있고, 종점의 달성은 엘라스틴 및 관련 조직의 다른 구성요소 사이의 상호작용 또는 결합에 기인할 수 있다. 상호작용 또는 결합은 관련 조직 내의 조직 요소 및 탄력 섬유 사이에서 정상적으로 나타나는 이러한 과정을 표면상 모델링할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따라 형성된 탄력 섬유가 수화된 형태로 제공되어 탄력 잠재성을 가지는 섬유를 채운다.

본 발명의 기반을 형성한 연구는 성체 조직에서 탄력 프로파일의 회복 또는 재생이 가능하며, 이는 섬유아세포, 평활근 세포 등과 같은 성체 세포가 엘라스틴발생(elastogenic) 잠재성, 즉 엘라스틴화와 유사하고, 따라서 조직에 대한 관련 탄력 프로파일을 복귀시키는 과정에 관여될 잠재성을 가지기 때문이라는 것을 입증한다. 또한, 성체 세포가 트로포엘라스틴 단량체의 종 관련 및 잠재적으로는 조직 관련된 이소형과 함께 제공된다면 잠재성이 현실화된다. 더욱이, 본 발명자들에 의해 실질적인 수준의 불순물을 함유하는 재조합 인간 트로포엘라스틴은 엘라스틴 섬유의 효율적인 형성을 초래하지 않는다는 것이 보여진다. 일정 구현예에서, 트로포엘라스틴은 투여를 위한 조성물 내에서 조성물 내의 다른 단백질 또는 분자의 양과 비교하여 트로포엘라스틴의 양에 대해 명시된 정도의 순도를 가진다. 일 구현예에서, 트로포엘라스틴은 적어도 75% 순도, 바람직하게는 85% 순도, 더욱 바람직하게는 90 또는 95%를 초과하는 순도로 조성물 내에 존재한다. 일정 구현예에서 트로포엘라스틴은 조성물의 형태 내에 제공될 수 있는데, 조성물은 트로포엘라스틴, 바림직하게는 트로포엘라스틴의 전장 이소형으로 구성되거나 본질적으로 구성되는 것으로 이해될 것이다. 마지막으로, 트로포엘라스틴이 이미 분자 내에서 상당하게 가교 결합되어 있다면, 세포는 탄력 섬유를 형성하기 위해 트로포엘라스틴을 활용할 수 없다.

본 발명에 따르면, 치료 요법은 세포가 탄력 섬유를 형성하기 위해 투여된 트로포엘라스틴을 활용하고 이와 결합할 수 있는 충분한 시간 동안 조직의 정의된 치료 면적 내에 트로포엘라스틴을 유지하는 것이다. 적절한 요법은 트로포엘라스틴 단량체의 일회 투여를 초과한 투여, 또는 성체화되지 않은 단량체의 투여를 초과한 투여를 포함할 수 있는데, 이는 트로포엘라스틴 단량체가 조직의 정의된 치료 면적 내에서 일반적으로 관련 세포가 탄력 섬유를 형성하기 위해 요구되는 시간 미만의 반감기를 가지는 것으로 여겨지기 때문이다. 더욱 상세하게는, 세포와 결합하지 못하는 트로포엘라스틴 단량체는 치료 면적 내에서 대사되거나 치료 면적으로부터 분산되는 것으로 여겨진다. 따라서, 적절한 치료 요법의 선택 없이는, 투여된 트로포엘라스틴이 탄력 섬유를 형성하도록 세포에 의해 활용될 수 있기 전에 정의된 치료 면적으로부터 표면상 고갈될 수 있다.

하기에 더 기술되는 치료 요법의 하나의 단계는 트로포엘라스틴이 투여되는 부위가 현저한 수의 세포를 가지는 것으로 알려진 부위에서 트로포엘라스틴의 단회 투여를 포함할 수 있다. 세포 수 또는 밀도에 대한 지식은 조직의 조직학적 선행 지식으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 투여의 부위는 치료 부위로의 동원 또는 세포 증식을 유도하는 치료로 사전 치료될 수 있다.

많은 치료 요법은 치료 면적에서 요구되는 시간 동안 투여된 트로포엘라스틴을 조직 내에 유지하도록 조정될 수 있다. 이것은 대략적으로 하기와 같다:

(i) 일정 기간에 걸쳐 트로포엘라스틴을 서서히 방출하는 서방성 제형으로 트로포엘라스틴의 투여.

요구되는 조직 부위에서 트로포엘라스틴의 서방성 방출은 트로포엘라스틴을 비분해성 또는 분해성 전달 비히클에 혼입함으로써 달성될 수 있다. 다수의 이러한 서방성 방출 접근법이 당업자에 의해 채용될 수 있다. 바람직하게는 일단 트로포엘라스틴이 전달된 후 비히클을 제거해야 할 필요성을 피하기 위해 분해성 서방성 제형이 채용된다. 이러한 전달 비히클은 폴리락타이드(PLA) 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA)와 같은 중합체로 이루어질 수 있다. 다른 서방형 전달 비히클은 히알루론산, 잔탄 검 또는 키토산과 같은 다당류로부터 형성된 중합체를 포함할 수 있다. 또한, 일정 구현예에서, 전달 비히클은 트로포엘라스틴을 이온 또는 공유 결합에 의해 이식물 내에 결합시켜 트로포엘라스틴이 이식물이 분해될 때만 방출되도록 화학적으로 개질될 수 있다.

일정 구현예에서, 트로포엘라스틴은 1 내지 90일의 기간 동안 요구되는 치료 부위에서 방출된다. 일정 구현예에서, 트로포엘라스틴은 1 내지 180일의 기간 동안 요구되는 치료 부위에서 방출될 수 있다. 일정 구현예에서, 트로포엘라스틴은 제형화되어 이식물의 적용 후 지연(예를 들면, 10 내지 90일 또는 10 내지 180일) 후에만 방출될 수 있다. 다른 적절한 트로포엘라스틴 전달 시간은 1 내지 30일, 1 내지 60일, 10 내지 60일, 30 내지 60일, 30 내지 180일, 또는 1 내지 180일 초과를 포함한다.

전달될 트로포엘라스틴의 양 및 농도는 치료될 조직의 면적 및 체적, 조직 내에 정상적으로 존재하는 통상적인 내인성 엘라스틴의 수준, 및 요구되는 엘라스틴 섬유 합성의 수준에 의존한다. 통상적으로, 트로포엘라스틴은 조직 각 cm³ 당 1 ㎍ 내지 1 mg의 양으로 조직에 전달될 것이다. 피부에 대해서는 cm² 당 1 ㎍ 내지 1 mg으로 계산될 수 있다. 전달될 수 있는 다른 양은 조직 각 cm³ 당 0.1 ㎍ 내지 10 mg, 조직 각 cm³ 당 1 mg 내지 20 mg, 또는 조직 각 cm³ 당 1 mg 내지 100 mg을 포함한다. 일정 구현예에서, 전달되는 양은 조직 cm³ 당 0.1 ㎍ 미만이거나 100 mg 초과할 수 있다. 치료 부위에 적용될 이식물 내 트로포엘라스틴의 농도는 요구되는 양의 트로포엘라스틴이 전달될 수 있도록 변화될 수 있다. 일정 구현예에서, 이식물 내 트로포엘라스틴의 농도는 1 ㎍/ml 내지 100 mg/ml로 변화될 수 있다. 일정 구현예에서, 생성물 내 트로포엘라스틴 농도는 0.5 mg/ml 내지 200 mg/ml, 1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 5 mg/ml 내지 50 mg/ml 또는 1 mg/ml 내지 25 mg/ml 사이일 것이다.

제형 내에 혼입된 트로포엘라스틴은 치료될 조직에서 자연적으로 발생하는 트로포엘라스틴의 이소형과 실질적으로 동등해야 한다. 또한, 트로포엘라스틴은 불순물이 실질적으로 전혀 없는 형태로 제공되어야 한다. 트로포엘라스틴의 단편, 즉, 트로포엘라스틴 제조 중 의도치 않게 발생하는 트로포엘라스틴 이소형의 절단된 형태도 본 맥락에서 불순물로 간주될 수 있다. 일정 구현예에서, 치료 제형에 혼입된 트로포엘라스틴은 관련된 전장 트로포엘라스틴 이소형의 적어도 65% 길이, 더욱 바람직하게는 관련된 전장 트로포엘라스틴 이소형의 80%일 것이다. 다른 구현예에서, 트로포엘라스틴은 전장의 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과일 것이다. 본원에 기술된 바와 같이, 트로포엘라스틴 내 일정 서열이 다른 것보다 더 중대한데, 예를 들어, 섬유 형성의 효율은 트로포엘라스틴 내 아미노산의 최종 C-말단 서열의 약 4개의 잔기가 관련 조직에 내인성인 트로포엘라스틴 서열에 상동성 또는 동일성을 가지는 경우 증가한다.

탄력 섬유를 형성하기 위해 조직 내에서 요구되는 세포의 활성을 돕기 위해 추가적인 구성요소들도 또한 제형 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 피부의 치료를 위해, 치료 부위에서 섬유아세포의 증식 또는 동원을 돕는 추가적인 구성요소들이 제형 내에 혼입될 수 있다. 이러한 구성요소는 표피 성장 인자 패밀리, 전환 성장 인자 베타 패밀리, 섬유아세포 성장 인자 패밀리, 혈관 내피 성장 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 결합 조직 성장 인자, 인터루킨 패밀리, 및 종양 괴사 인자-α 패밀리를 포함한다.

일정 구현예에서, 치료는 트로포엘라스틴을 사용하는 치료 부위에 세포를 전달하는 것도 또한 포함할 수 있다. 피부의 치료에 대한 예시로서, 치료 부위에서 탄력 섬유의 합성을 돕기 위해 섬유아세포가 치료 제형 또는 절차 내에 포함될 수 있다. 섬유아세포는 신생아 포피와 같은 동종 기원으로부터 기원할 수 있거나 눈에 띄지 않는 피부 부위(예컨대, 귀 뒤)의 생검에 기원할 수 있고, 자가 치료로 사용될 수 있다.

(ii) 프로테아제 감수성 영역이 제거되거나 조직 내에 존재하는 효소로부터 차단된 트로포엘라스틴의 투여

치료에 사용되는 트로포엘라스틴은 프로테아제 분해를 낮추도록 개질될 수 있다. 예를 들어, WO2000/04043에 기술된 바와 같이, 치료될 조직 내에서 자연적으로 발견되는 전장 트로포엘라스틴 종으로 실질적으로 남아있는 정도까지, 단백질 종이 선택될 수 있다. 대안적으로, 치료 제형은 프로테아제 억제제 또는 프로테아제 발현을 증가시키는 것으로 알려진 신호 전달 경로를 차단하는 분자를 혼입할 수 있다. 이러한 분자는 세린 프로테아제 억제제, 매트릭스 메탈로 프로테이나제 억제제, 락토오스와 같은 갈락토시드, 억제성 항체 및 엘라스틴 신호전달의 저분자 억제제를 포함한다.

(iii) 사전 정의된 시점에서 트로포엘라스틴의 반복 투여.

일정 구현예에서, 트로포엘라스틴이 탄력 섬유 구축을 위한 기질로서 세포에 의해 활용될 수 있는 형태로 전달되고 이것이 발생하는 충분한 기간 동안 치료 부위에 남아있는 것을 보장하기 위해, 치료는 부위에 반복 사건으로 적용된다.

일정 구현예에서, 치료될 각 조직 부위는 1 내지 24, 또는 2 내지 12 또는 3 내지 6주의 간격으로 3회의 생성물로의 치료를 받을 것이다. 치료는 치료될 면적(그리드 형성에서 각각 대략 10mm 떨어진)을 가로지르는 다회 주사로 구성될 수 있다. 치료는 27G, 29G, 30G 또는 31G와 같은 미세 게이지 바늘을 이용해서 투여될 수 있다. 바늘은 경사면의 각도 및 배향, 주사의 깊이, 및 투여될 재료의 양을 고려하여 조직에 삽입될 수 있다. 치료는, 예를 들어, 각 주사 부위에 이식된 생성물의 10 내지 100 ul, 10 내지 50 ul, 바람직하게는 20 내지 30 uL의 체적으로 볼루스(bolus)로서 조직에 주사될 수 있다. 각 주사의 완료 후, 바늘을 천천히 빼낼 수 있다. 모든 이식이 완료된 후, 요구되는 경우 치료 부위를 부드럽게 마사지할 수 있어, 이식 재료가 주위 조직의 윤곽과 일치하도록 할 수 있다. 치료 회수, 치료 사이의 기간, 및 각 치료 부위에 전달되는 트로포엘라스틴의 양은 치료될 조직 면적 및 회복될 탄력성의 수준에 기반하여 조정될 것이다.

이러한 접근법 중 임의의 하나는 단독으로 또는 조합하여 실현될 수 있음으로써 조직 내 트로포엘라스틴의 지속을 증가시킨다.

각각의 접근법에서, 투여의 단계는 가역적인 조직 또는 세포 손상 및 이러한 손상에 반응하여 발생하는 다양한 염증성 체계(cascade)의 개시를 초래할 잠재성을 가지는 침습적인 절차인 것으로 인식될 것이다. 본 발명자들은 가역적인 세포 손상 조건(섬유아세포 활성 및/또는 증식을 자극하는 경향이 있는 조건)을 제공하는 이러한 유형의 물리적 치료가 적용될 수 있다는 것을 인식한다. 물리적 치료는 섬유증을 유도하기에 충분하지 않다는 것이 중요하다.

본원에서 논의된 바와 같이, 특정 치료 요법의 선택을 안내하는 고려사항은 조직의 본질, 엘라스틴 프로파일의 퇴행 또는 분해 정도, 및 바람직한 산출물을 포함한다. 다시, 본 발명의 중대한 양태는 세포에게 그들에게 제공된 트로포엘라스틴으로부터 탄력 섬유를 형성하거나, 복구하거나 합성하는 기회가 주어진다는 것이다. 서방성 방출, 분해로부터의 보호 또는 지속적인 공급으로 인해 트로포엘라스틴이 더 긴 기간 동안 효과적으로 조직 내에 지속되는 경우가 더욱 좋은 기회이다. 일반적으로, 탄력 프로파일의 소실이 더 크고 조직이 더 무세포성일 경우, 치료 요법이 더 긴 기간 동안 조직 내에 트로포엘라스틴의 지속을 제공해야 하는 것이 더욱 적절하다.

더욱 상세하게는, 노화된 피부의 개선과 비교하여 어린 피부의 신체적 외양을 개선하려는 목적인 경우 짧은 지속 시간이 적절할 수 있다. 여기서, 전술된 (iii) 및/또는 (i)에 따른 사전 정의된 시점에서 트로포엘라스틴의 반복 투여가 더욱 적절할 수 있다.

조직이 흉터가 있거나 섬유증이고 본질적으로 무세포성인 경우 긴 지속 시간이 요구될 수 있다. 여기서, 관련 조직 내로의 세포의 주화성을 위한 충분한 시간을 남기는 것이 중요할 것이다. (ii) 및/또는 (i)에 따른 요법이 더욱 적절할 수 있다.

언급된 바와 같이, 산출물도 또한 적절한 요법의 선택을 안내하는 관련된 고려사항이다. 산출물이 탄력 기능을 증가시키거나 개선하는 것인 경우, 세포가 기능에 특이적인 요구되는 탄력 섬유 배열을 구축할 수 있게 하는 훨씬 긴 지속 시간이 요구될 수 있다. 여기서, 전술한 (i)에서와 같은 서방성 용출 형태가 더욱 적절할 수 있다.

적절한 치료 요법의 선택과 관련된 고려사항들의 일부 예는 하기에서 더 상세히 논의된다:

(i) 피부의 신체적 외양의 개선.

(ii) 섬유증 및 흉터가 있는 조직의 엘라스틴 함량 증가.

(iii) 연골 또는 맥관의 탄력성 개선.

거의 모든 포유동물 탄력 조직은 탄력 조직 내에 함유된 탄력 섬유로부터 발생하는 엘라스틴 프로파일을 가진다. 각각의 상이한 탄력 조직은 상이한 기능을 가지기 때문에, 따라서 탄력 프로파일은 조직 대 조직에서 동일하지 않다. 예를 들어, 혈액을 유동시키는 좌측 맥관의 탄성은 공기를 흡입하는 기관지 조직의 탄성과 동일하지 않다. 하기 표는 본 발명의 대상이 되는 조직의 예 및 각각의 탄력 프로파일이 어떻게 측정되고 발현될 수 있는지를 기술하고 있다.

통상적으로 본 발명에 따라 치료되는 개체는 인간이다.

바람직하게는, 조직은 피부 조직, 특히 적어도 20세, 바람직하게는 20 내지 50세의 연령, 더욱 바람직하게는 30 내지 60세의 연령인 개체의 피부 조직 내의 조직이다.

피부 조직은 진피 및 표피의 연접에서 탄력 섬유의 파손 또는 단편화를 특징으로 할 수 있다.

피부 조직은 광노화 조직일 수 있다.

피부 조직은 처진 피부, 이완된 피하 조직, 세포외 기질의 밀도의 소실, 주름 및 튼살 중 하나 이상의 특징을 나타낼 수 있다.

피부 조직은 바람직하게는 얼굴, 목, 또는 상지 또는 하지 상에 위치할 수 있다.

바람직하게는 조직은 치료 요법의 시작 시점에 상처를 함유하지 않는다. 선택된 치료 요법에 따른 트로포엘라스틴의 투여의 완료 시, 예를 들어 주사 또는 피부의 다른 물리적 조작에 의해 투여가 이루어진 부위의 조직에 경상이 있을 수 있다.

개체가 인간인 경우, 트로포엘라스틴은 인간에서 발현되는 트로포엘라스틴 이소형의 서열을 가진다. 이러한 구현예에서, 이소형은 SHEL(WO1994/14958 참조) 및 SHELδ26A(WO1999/03886 참조) 및 이러한 이소형의 프로테아제 저항성 유도체(WO2000/0403 참조)로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.

통상적으로, 조직이 인간 피부 조직인 경우 트로포엘라스틴 이소형은 SHELδ26A이다.

트로포엘라스틴 이소형은 조직 내에서 트로포엘라스틴의 서방성 방출을 위해 조정된 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 조직이 인간 피부 조직인 경우, 조성물이 SHELδ26A 및 조성물로부터 트로포엘라스틴의 서방성 방출을 위해 히알루로난, 글루코사미노글리칸, 콜라겐 I형으로 구성된 그룹으로부터 선택된 구성요소를 포함하는 것이 바람직하다.

통상적으로, 트로포엘라스틴을 포함하는 투여를 위한 조성물은 탄력 섬유 형성을 위한 외인성 인자, 특히 리실 산화효소를 함유하지 않는다.

일정 구현예에서, 치료 요법에 따라 실질적으로 단량체 형태인 트로포엘라스틴이 제공된다.

일정 구현예에서, 치료 요법에 따라 실질적으로 분자내 가교 결합이 결여된 형태인 트로포엘라스틴이 제공된다.

일정 구현예에서, 치료 요법에 따라 트로포엘라스틴이 수용액과 같이 트로포엘라스틴 및 트로포엘라스틴에 대한 용매로 구성된 조성물 내에 제공된다. 바람직하게 트로포엘라스틴은 SHELδ26A이다.

일정 구현예에서, 치료 요법에 따라 본질적으로 트로포엘라스틴으로 구성된 조성물 내에 트로포엘라스틴이 제공된다. 일 구현예에서 트로포엘라스틴은 SHELδ26A이다.

일정 구현예에서, 치료는 트로포엘라스틴 및 히알루론산을 포함한다.

일정 구현예에서, 조성물 내의 트로포엘라스틴은 유도체화된 히알루론산(HA)과 가교 결합될 수 있다. 히알루론산과 같은 분자와 트로포엘라스틴의 가교결합은 본 발명에 따른 이식 부위에 트로포엘라스틴이 유지되는 것을 도울 수 있다. 조성물은 5 내지 100 mg/ml 트로포엘라스틴 + 0.1% 내지 2% HA 가교제, 바람직하게는 10 내지 50 mg/ml 트로포엘라스틴 및 0.25% 내지 1% HA 가교제를 가질 수 있다. 본 발명을 위해 적합한 제형은 0.25% 내지 1% HA 가교제에 가교 결합된 10 내지 30 mg/ml의 트로포엘라스틴을 포함할 수 있다.

중요하게, 히알루론산과 같은 다당류와 트로포엘라스틴의 가교결합은 리실 산화효소에서 일어나는 것과 같은 분자 내 트로포엘라스틴 가교 결합을 초래하거나 관여되지 않을 수 있다. 더욱 상세하게는, 히알루론산이 히알루로디아제(피부 효소)에 의해 용해되는 경우, 그 후 트로포엘라스틴은 단량체 형태로 방출된다.

일정 구현예에서, 치료는 트로포엘라스틴의 활용을 증가시키는 화합물과 관련될 수 있다. 예는 다음을 포함한다:

● 디클로페낙(diclofenac) - 항염증 (및 광선각화증의 감소와 연관, 예컨대 솔라레이즈(solaraze) 참조)

● 리스라스틴(Lys'lastine) - 엘라스틴화 촉진

● 아미노산인 글리신, 발린, 알라닌, 프롤린 - 트로포엘라스틴 잔기의 75%에 해당

● 비타민 C, E - 비타민 C는 새로운 콜라겐 합성을 도우며, 비타민 C, E는 항산화물질이다

● 자외선차단제 - 태양 유도 단백질 가수분해를 제한한다

● 화학 증강제 - 각질을 가로지르는 구성요소의 이동을 돕는다

● 보습 유연제 내에서 조정된 pH - 피부를 위한 pH를 전달; 보습은 노화된 피부와 관련된다.

조직이 피부인 경우, 통상적으로 치료 요법은 정의된 시점에서의 트로포엘라스틴의 투여를 포함한다. 임의의 한 시점에서, 트로포엘라스틴의 동시 투여가 있을 수 있다.

바람직하게 트로포엘라스틴은 주사로 투여된다.

조직이 피부인 경우, 트로포엘라스틴이 진피로 투여되는 것이 바람직하다.

일정 구현예에서, 치료 요법은 탄력 섬유의 형성을 향상시킬 수 있는 물질의 국소 도포를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 물질은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 리실 산화효소 발현을 자극하는 딜 추출물(Cenizo et al 2006 Exp . Dermatol . 15:574-81); 및 탄력 섬유 붕괴를 감소시키는 구리 및/또는 아연계 크림을 포함할 수 있다(Mahoney et al 2009 Exp . Dermatol .18:205-211).

일 구현예에서, 개체의 피부에 탄력성을 제공하는 방법이 제공되되, 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:

- 개체를 제공하는 단계;

- 개체의 피부 상에 치료 면적을 정의하는 단계로서, 치료 면적은 탄력성이 제공될 피부의 면적인 것인 단계;

- 치료 면적 내에 트로포엘라스틴 조성물을 주사하여 치료 면적 내에서 치료 면적 외부 피부에 대해 증가된 양의 트로포엘라스틴을 확립하는 단계;

- 사전 결정된 기간 동안 치료 면적 내에서 트로포엘라스틴의 양을 유지함으로써 개체의 피부에 탄력성을 제공하는 단계.

하기 예에 기술된 바와 같이, 방법은 피부 탄력성을 유지하거나 개선하면서 피부의 두께를 증가시킬 수 있도록 한다. 방법은 또한 피부의 자연스러운 외양 및 매끄러움을 유지하면서 (즉, 덩어리짐을 피하면서), 피부 탄력성의 개선 또는 탄력 프로파일의 회복 또는 재생을 가능하게 한다.

통상적으로, 개체는 본원에 기술된 바와 같이 피부 상태가 손실된 성인 개체이다. 예를 들어, 피부의 치료 면적은 광노화, 처진 피부, 이완된 피하 조직, 세포외 기질의 밀도의 소실, 주름 및 튼살을 특징으로 할 수 있다. 성체는 20 내지 70세의 연령, 예를 들어 20 내지 35세의 연령 또는 40 내지 70세의 연령일 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 바람직하게는 본 발명에 따라 치료되는 피부는 얼굴, 목, 또는 상지 또는 하지 상에 위치할 수 있다. 치료 면적은 관련 위치에서 피부의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 피부가 상지에 위치하는 경우, 치료 면적은 상지 전체, 또는 그의 일부, 예를 들어 상지의 중앙 표면을 포함할 수 있다. 피부가 얼굴에 위치하는 경우, 치료 면적은 볼, 눈꺼풀, 턱 등의 주위의 피부 전체 또는 일부를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 치료 면적은 탄력 프로파일이 차선이고/이거나 개선 또는 회복이 요구되는 피부의 면적이다. 이러한 면적은 당업자에게 공지된 임의의 수의 방법으로 정의될 수 있다. 이 중 가장 간단한 방법은 치료될 면적의 제한 또는 경계를 표시함으로써 치료가 요구되지 않는 피부로부터 치료가 요구되는 피부의 면적의 경계를 정하는 것이다. 이는, 예를 들어, 치료될 면적을 치료가 요구되지 않는 면적으로부터 구분하는 마커, 표시자, 가이드 또는 특징, 예를 들어 치료될 영역을 선택적으로 식별하는 마커 또는 치료가 요구되지 않는 면적을 선택적으로 식별하는 마커를 이용함으로써 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 치료될 면적은 치료 면적의 경계를 관련성 있게 확립하는 하나 이상의 좌표를 식별함으로써 정의될 수 있다.

치료 면적을 정의한 후, 트로포엘라스틴 조성물은 치료 면적 내에 위치한 피부로 피내 주사될 수 있다. 주사의 목적은 치료 면적 내에서 정상적으로는 존재하지 않는 양의 트로포엘라스틴을 치료 면적에 확립하거나 제공하는 것이다. 본 맥락에서, 치료 면적 내에 확립된 트로포엘라스틴의 양은 치료 면적 외부에 위치한 피부의 인접하거나 이웃하는 면적에서의 트로포엘라스틴의 양보다 크다.

조성물은 치료 면적이 어디에 위치했는지에 따라 진피 중간 내지는 깊숙이 주사될 수 있다. 예를 들어, 깊은 주사는 목, 데콜테 또는 눈 주위와 같이 피부가 얇은 치료 면적 보다는 얼굴의 볼과 같이 피부가 두꺼운 치료 면적에 더욱 적절할 수 있다.

일부 예에서 목표한 산출물은 하피 내 이식 및 이식 또는 주사 부위로의 엘라스틴화 세포의 동원에 의해 달성될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

전달되는 조성물의 체적은 부분적으로 치료될 피부의 위치에 의존한다. 큰 체적은 얼굴보다는 팔다리 또는 목 상에 위치한 피부에 더욱 적절하거나 가능하다. 각 단회 주사의 체적은 10 내지 100 uL, 바람직하게는 약 20 내지 50 uL의 범위일 수 있다. 주어진 치료의 총 체적은 치료될 피부 면적의 크기 및 적절한 것으로 결정된 각 주사 부위 사이의 거리에 의존하는 제공되는 주사 횟수에 의존할 것이다.

본 발명의 일 특정 바람직한 형태는, 치료 면적으로의 트로포엘라스틴의 반복 주사에 의해 사전 결정된 기간 동안 치료 면적에서 바람직한 양의 트로포엘라스틴이 유지되는 것이다. 이것은 표면상 치료 면적 내 조직으로 트로포엘라스틴의 지속적인 공급을 생성하여 치료 면적 외부에서는 발견되지 않는 원 위치(in situ) 탄력 섬유 형성을 위한 트로포엘라스틴의 임계 수준이 치료 면적에 보유되도록 한다. 치료의 코스(하기에서 논의됨)에 걸쳐, 이는 세포 및 인자들이 주사된 트로포엘라스틴과 결합되는 경향을 증가시킴으로써 탄력 섬유의 형성을 가능하게 하는 것으로 여겨진다.

일정 구현예에서, 치료는 미세 바늘 주사에 의해 중간 또는 깊은 진피 내로 트로포엘라스틴 조성물을 주사로 투여하는 것이다. 주사는 25G, 바람직하게는 27G 이하, 더욱 바람직하게는 30G 또는 31G의 게이지를 가지는 하피 바늘을 사용하여 수행될 수 있다. 주사는 단회 주사기 및 바늘을 사용한 피부에 대한 치료의 수동 적용에 의해 수행될 수 있다.

일정 구현예에서, 단회 치료는 치료 면적 내로의 다회 주사를 포함할 수 있다. 각 치료가 다회 주사를 요구하는 경우, 이것은 1 mm 내지 3 cm 이격될 수 있다.

일정 구현예에서, 주사는 피부 진피 내로의 자동화 주사를 가능하게 하는 장치(예를 들면, 메소테라피 건(Mesotherapy gun)) 또는 전문가용 주사 장치(http://www.nordsonmicromedics.com/se/google/en/artiste-assisted-injection-system.html) 또는 안테이스 주사 장치(http://www.anteis.com/AestheticDermatology/injectionsystem.php)와 같은 지원형 주사 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 일정 구현예에서, 주사기 또는 자동화된 주사 장치는 다수의 바늘이 부착될 수 있는 아답터와 함께 사용될 수 있어서, 한 번에 일 회를 초과하는 주사가 적용될 수 있다. 일정 구현예에서, 치료는 진피 롤러, 또는 더마펜 바늘 시스템과 같은 고체 바늘 시스템(예컨대, Kalluri , H. et al 2011, AAPS Journal 13:473-484에 의해 기술된 바와 같음)을 사용하여 적용될 수 있다.

각 치료 사이에 약 3 내지 168일의 기간이 있을 수 있다. 각 치료 사이의 통상적인 기간은 3 내지 7일, 3 내지 21일, 14 내지 28일, 21 내지 84일 및 3 내지 84일을 포함할 수 있다. 총 1 내지 24, 또는 3 내지 6회의 치료가 있을 수 있다. 일반적으로, 치료의 기간은 약 1년을 초과하지 않으며, 바람직하게는 3주 내지 6개월, 바람직하게는 약 1 내지 3개월이다.

치료의 바람직한 부위는 볼, 눈, 목, 데콜테, 손, 흉터가 있는 조직, 튼살의 근처, 주위, 내부 또는 인접한 부위를 포함한다.

문맥 상 다르게 요구되는 경우를 제외하고, 본원에서 사용된 "포함하다" 라는 용어 및 "포함하는", "포함하다" 및 "포함된다" 같은 용어의 변형들은 추가의 첨가제, 구성요소, 정수 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.

전술된 단락에 기술된 본 발명의 추가 양태 및 본 양태의 추가 구현예는 예시의 방식으로써 제시된 하기 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 명백해질 것이다.

본 명세서에 개시되고 정의된 발명은 문서 또는 도면으로부터 입증되거나 언급된 개별적인 특징들의 두 개 이상의 모든 대안적인 조합까지 연장되는 것으로 이해될 것이다. 이러한 모든 상이한 조합들은 본 발명의 다양한 대안적인 양태를 구성한다.

실시예

실시예 1 탄력 섬유 합성을 위한 시험관 내 검정 시스템

재료 및 방법

a) 세포

b) 세포 배양

세포는 10%의 우태아 혈청(FBS; Invitrogen) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 고 글루코오스(Dulbecco? Modified Eagle Medium High Glucose, DMEM; Invitrogen)에서 배양되었다. 배지는 2 내지 3일마다 교체되었다. 세포는 37℃ 및 5% CO₂에서 항온배양되었다. 세포의 엘라스틴 섬유 형성능을 평가하기 위해, 1 x 10⁵의 세포가 12웰 배양 플레이트 내 유리 커버슬립 상에 접종되었다. 접종 후 10 내지 17일에, PBS 중 전장 트로포엘라스틴(Elastagen), 또는 대안적인 엘라스틴 유래 단백질이 여과 멸균되고 세포 배양물에 첨가되었다. 대안적인 엘라스틴 유래 단백질은 인간 피부 엘라스틴 펩티드(Elastin Products Company; HSP72), C-말단 트로포엘라스틴 결실 컨스트럭트인 ?KRK(Weiss lab), 및 RGDS(Weiss lab)를 함유하는 C-말단 트로포엘라스틴 대체 컨스트럭트를 포함하였다. 또한, 섬유 형성도 50 μM 블렙비스타틴(blebbistatin, Sigma)의 존재 하에 평가되었다. 반복적인 트로포엘라스틴의 첨가의 효과를 평가하는 시험을 위해, 접종 후 10, 17 및 24일에 단백질이 첨가되었다. 세포 기질 두께는 10번의 무작위로 선택된 시계범위에서 최상층 핵으로부터 시료의 하부까지 영상화하기 위해 요구되는 0.41 ㎛ z편의 수를 평균하여 결정하였다.

트로포엘라스틴 첨가 후 설정 시점에서, 세포는 3% (w/v) 포름알데하이드 또는 4% (w/v) 파라포름알데하이드로 20 분간 고정되고 0.2 M 글리신으로 퀀칭되었다. 세포는 0.2% (v/v) 트리톤 X-100을 사용하여 6분간 항온배양되고, 5% 소혈청 알부민으로 4℃에서 밤새 차단되고, 1:500 BA4(Sigma) 마우스 항 엘라스틴 1차 항체로 1.5 시간 및 1:100 항 마우스 IgG-FITC 2차 항체(Sigma)로 1시간 염색되었다. 그 후 DAPI(Invitrogen)와 ProLong Gold 안티페이드 시약과 함께 유리 슬라이드 위에 커버슬립을 장착하였다.

c) 형광 영상화

시료는 Olympus FluoView FV1000 공초점 현미경으로 시각화되었다. 여기에 보여지는 이미지는 z-스택 투사에 의해 제작되었다.

결론 및 고찰

a) 상이한 연령 그룹으로부터 기원한 인간 피부 섬유아세포에 의한 엘라스틴 섬유 형성

우리는 트로포엘라스틴(SHELδ 26A, 즉 26A 도메인을 함유하지 않는 합성 인간 엘라스틴)의 첨가에 이은 인간 피부 섬유아세포의 엘라스틴 섬유 및 망을 형성하는 능력을 평가하였다. 도 1은 신생아, 10, 31, 51 및 92세의 기증자로부터 기원한 피부 섬유아세포에 250 ㎍/ml 트로포엘라스틴 첨가 7일 후 엘라스틴 형성을 나타낸다. 모든 세포주는 엘라스틴 섬유 형성을 보여주었다. 트로포엘라스틴이 첨가되지 않은 대조군 세포 배양에서는 엘라스틴 형성이 나타나지 않았다(데이터 미도시). 어린 기증자 세포는 증가된 핵(청색)의 수에 의해 보여지는 바와 같이 더욱 광범위하게 증식되었다. 트로포엘라스틴이 첨가될 때 어린 기증자 세포는 광범위한 엘라스틴 망을 생성하였다. 나이든 기증자 세포도 첨가된 트로포엘라스틴으로부터 실질적인 엘라스틴 섬유를 생성할 수 있었지만, 망은 성겼다(도 1).

b) 동물 세포에 의한 엘라스틴 섬유 형성

250 ㎍/ml 트로포엘라스틴의 첨가 후 엘라스틴 섬유 및 망을 형성하는 돼지(돼지 10-10) 및 토끼(RAB-9) 피부 섬유아세포의 능력이 평가되었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 이러한 동물 세포 각각은 기질로 트로포엘라스틴을 침전시켰다. 그러나, 오직 토끼 세포만이 엘라스틴 망을 생성할 수 있었다. 인간 및 동물 종 간 사이의 트로포엘라스틴 아미노산 서열 차이는 낮은 효율, 변화된 동물세포에 의한 트로포엘라스틴의 변화된 활용을 설명할 수 있다(도 2).

c) 기도 평활근 세포에 의한 엘라스틴 섬유 형성

우리는 질환을 가진 폐로부터 기원한 1차 인간 기도 평활근 세포의 트로포엘라스틴 첨가 후 엘라스틴 섬유를 형성하는 능력을 평가하였다. 도 3은 250 ㎍/ml 트로포엘라스틴 첨가 7일 후 엘라스틴 형성을 보여준다. 이러한 세포는 섬유 형성의 규모에서 차이가 있다: 최소량의 트로포엘라스틴 소구체 침전으로부터 엘라스틴 섬유망까지(도 3). 이러한 결과는 평활근 세포가 도 1에서 관찰된 섬유아세포처럼 외인성 트로포엘라스틴으로부터 탄력 섬유를 형성하는 능력을 가지며 혈관과 같은 다른 조직으로부터의 평활근 세포도 그러할 것이라는 것을 입증한다.

d) 트로포엘라스틴 유도체가 사용된 경우의 엘라스틴 섬유 형성

우리는 세 개의 대안적인 엘라스틴 유래 단백질을 사용하여 엘라스틴 망을 형성하는 1차 인간 신생아 섬유아세포(NHF8909)의 능력을 평가하였다. 이러한 단백질은 인간 객담 엘라스타제를 사용한 인간 성체 피부 엘라스틴의 효소적 가수분해에 의해 제조된 엘라스틴 피부 펩티드 및 두 개의 트로포엘라스틴 이소형이었다. 트로포엘라스틴은 우리가 αvβ 인테그린에 대한 세포 결합을 유도하는 것을 보여준 GRKRK 모티프를 C-말단에 함유한다. 트로포엘라스틴 이소형 ΔRKRK에서, 이 모티프의 RKRK 서열은 제거되었다. 이소형 +RGDS에서, RKRK 서열은 제거되고 공인된 세포 결합 도메인인 RGDS로 대체되었다. 모든 경우에서, 125 ㎍/ml의 단백질이 접종 후 12일에 1차 인간 신생아 피부 섬유아세포에 첨가되었다.

도 4는 결과로 얻어진 엘라스틴 망을 보여준다. 엘라스틴 섬유 형성은 전장 트로포엘라스틴이 배양물에 첨가될 때 관찰되었다. 반대로, 트로포엘라스틴 유도체가 배양에 첨가될 때 섬유 형성은 현저하게 손상되었다. 기질로의 피부 엘라스틴 펩티드의 침전은 없었다. △RKRK 및 +RGDS 형태 각각에서는 섬유 침전보다는 소구체가 관찰되었다.

e) 세포 수축력이 손상된 경우 엘라스틴 섬유 형성

우리는 세포 배양물에 트로포엘라스틴을 첨가하는 동시에 블렙비스타틴(blebbistatin)을 첨가함으로써 엘라스틴 섬유 형성에서의 세포 수축력에 대한 요구를 조사하였다. 블렙비스타틴은 세포 수축력 및 세포 이동을 변경하는 비근육 미오신 II의 억제제이다. 도 5는 블렙비스타틴 존재 하에 엘라스틴 섬유 형성이 실질적으로 손상된 것을 보여준다.

f) 반복적인 트로포엘라스틴 첨가 후 엘라스틴 섬유 형성

우리는 트로포엘라스틴의 반복적인 첨가로부터 엘라스틴 망을 형성하는 1차 인간 신생아 섬유아세포(NHF8909)의 능력을 평가하였다. 트로포엘라스틴(250 ㎍/ml)은 접종 10일, 10 및 17일, 그리고 10, 17 및 24일 후에 배양물에 첨가되었다. 모든 시료는 접종 31일 후에 고정되었다. 도 6은 반복적인 트로포엘라스틴 치료로 엘라스틴 망 형성이 실질적으로 증가된 것을 보여준다. 이는 세포 기질 두께의 증가를 초래하였는데, 접종 후 31일에 트로포엘라스틴의 첨가가 없는 시료의 경우 두께가 13.4 : 2.2 ㎛이고, 1회 또는 2회 트로포엘라스틴을 첨가한 시료는 각각 두께가 15.3 : 1.2 ㎛ 및 16.9 : 0.8이며, 3회 트로포엘라스틴을 첨가한 시료는 두께가 19.0 2.2 ㎛였다.

g) 시험관 내 형성된 섬유의 탄력성

인간 진피 섬유아세포가 WillCo 유리 바닥 접시 상에 10% (부피/부피) 우태아혈청 및 1%(부피/부피) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Invitrogen, 11995) 중 20,000 cells/cm²의 밀도로 접종되었다. 접종 12일 후, PBS 중 250 ㎍/mL 트로포엘라스틴이 섬유아세포 배양물에 첨가되었다. 배양 배지는 2일마다 교체되었다. 접종 후 19일에 바이오스코프 촉매 원자간력 현미경(BioScope Catalyst Atomic Force Microscope)으로 시료를 분석하였다. 성숙 엘라스틴 섬유의 내재성 자가형광은 배양물 내 그들의 자리를 표시하는 데 사용하였다. 트로포엘라스틴 첨가가 없는 시간 매칭된 대조 시료는 자가형광을 보이지 않았다(도 7). 토포그래피/탄력 모듈러스 맵핑은 탄력 섬유의 형성과 일치되는 ~600KPa의 영스 모듈러스(Young? Modulus)를 가지는 세포내 재료의 영역의 우세에 의해 입증되는 트로포엘라스틴 첨가 후 변화된 배양물 탄력성(도 8, 황색 면적)을 보여준다. 정제되지 않은 자연적인 엘라스틴은 ~600 kPa의 영스 모듈러스를 가진다.

h) 탄력 섬유 형성을 위한 시간 과정

인간 진피 섬유아세포가 유리 커버슬립 상에 10% (부피/부피) 우태아혈청 및 1% (부피/부피) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 중 20,000 cells/cm²의 밀도로 접종되었다. 접종 10 내지 12일 후, PBS 중 250 ㎍/mL 트로포엘라스틴이 섬유아세포 배양물에 첨가되었다. 배양 배지는 2일마다 교체되었다. 설정된 날, 일반적으로 트로포엘라스틴 첨가 1, 3, 및 7일 후, 세포는 4% (중량/부피) 파라포름알데하이드로 20 분간 고정되었고, 0.2 M 글리신으로 퀀칭되었다. 세포는 0.2% (부피/부피) 트리톤 X-100을 사용하여 6분간 항온배양되고, 5% 소혈청 알부민으로 4℃에서 밤새 차단되고, 1:500 BA4 마우스 항 엘라스틴 항체로 1.5 시간 및 1:100 항 마우스 IgG-FITC 항체로 1시간 염색되었다. 그 후 DAPI와 ProLong Gold 안티페이드 시약과 함께 유리 슬라이드 위에 커버슬립을 장착하였다. 시료는 Olympus FluoView FV1000 공초점 현미경으로 시각화되었다. Z 스택이 취해지고 압축된 투사 영상으로 전환되었다.

시험관 내 세포 배양 모델 시스템은 트로포엘라스틴 첨가에 이어 단백질이 ECM 내에 소구체로서 침전되는 것을 보여준다(도 9a). 이어지는 섬유 형성은 광범위하게 분지된 탄력망(도 9c)의 생성 전에 세포의 방향으로 우선 정렬된다(도 9b).

i) 리실 산화효소의 관여

시스템에서 탄력 섬유 형성에 대한 리실 산화효소 억제제인 BAPN의 효과가 연구되었다.

진피 인간 섬유아세포는 기술된 바와 같은 트로포엘라스틴 첨가에 앞서 12일간 생장하였다. 트로포엘라스틴 첨가 후 추가 72 시간 동안 세포를 배양하였다. BAPN은 트로포엘라스틴 첨가에 대하여 다양한 시점에서 첨가되었다. 전술한 바와 같이 시료를 엘라스틴 및 핵에 대해 염색하였다. BAPN의 함유물은 ECM 내로의 일부 소구체의 침전을 허용하지만, 섬유 형성은 방지하였으며(도 10), 이는 세포가 트로포엘라스틴으로부터 탄력 섬유를 형성하는 동안 리실 산화효소를 활용한다는 것을 입증한다.

j) 소구체의 정렬

시험관 내 모델 시스템에서 탄력 섬유 형성을 더 조사하기 위해 초고해상도 현미경이 사용되었다. 인간 진피 섬유아세포가 배양되었고, 기술된 바와 같이 트로포엘라스틴 첨가 3일 후 고정되었다. 세포는 1/500 BA4 마우스 항 엘라스틴 항체로 1.5 시간 및 1/100 항 마우스 IgG-AlexaFluor 488 항체로 1시간 염색되었다. 시료는 Leica SP5 cwSTED 현미경으로 시각화되었다.

소구체의 정렬은 트로포엘라스틴 첨가 3일 후부터 진피 섬유아세포 배양(도 11)의 12일까지 발견되었다. 소구체는 항체와 점상 데코레이션을 보인다. 평균 직경은 605 ± 97 nm이다.

k) 소구체의 처리

본질적으로 기술된 바와 같은 시험관 내 모델 시스템에서 탄력 섬유 형성을 더 조사하기 위해 투과 전자 현미경이 또한 사용되었다. 시료는 12일된 진피 섬유아세포 배양물에 트로포엘라스틴 첨가한 3일 후에 처리되었다. 엘라스틴이 생장하고 있는 세포는 PBS 완충액 중 2% 글루타르알데하이드로 4℃에서 1시간 후고정된 후, 0.1% 사산화오스뮴으로 4℃ 암실에서 10분간 후고정되었으며 증류수로 즉시 각 5분 간 2회 세척되었다. 이어서, 각 10 분간 일련의 구배의 에탄올(즉, 70, 80 및 90% 및 100% 2회)을 통해 시료를 탈수하였다. Epon(레진)을 사용한 시료의 침윤이 다음의 혼합물 및 항온배양 시간에서 달성되었다: 상온에서 에탄올 중 25% 에폰으로 4시간, 에탄올 중 50% 에폰으로 밤새, 그리고 각 8시간 동안 100% 에폰의 2회 교체. 레진 침윤이 완료되면, Kobayashi K. 등(2012)의 이중 중합 방법을 사용하여 시료를 삽입하였다. 삽입된 세포를 함유하는 결과적으로 얻어진 블록 면은 다듬어지고 초마이크로톰(ultramicrotome, Leica, Ultracut-7)을 통하여 초박절편이 생성되어, 200 메시 구리 그리드 상에 장착되는 대략 70 nm의 절편을 산출하였다. 절편은 2% 아세트산 우라늄 수용액 및 레이놀즈 구연산 납(Reynolds? lead citrate)으로 각각 10 분 간 염색되었고, 염색 침전물을 최소화하기 위해 각 단계 사이에서 물을 사용하여 철저하게 세척하였다. 절편은 200 kV에서 JEOL 2100 TEM(JEOL, Japan)을 사용하여 영상화되었다.

3개의 구분되는 엘라스틴 함유 구조가 나타난다(도 12):

(1) 615 : 153 nm의 평균 직경을 가지고 치밀한 껍질에 의해 둘러싸인 소구체. 이러한 소구체는 세포와 직접적으로 접촉한다.

(2) 파열되고 그들의 내용물이 빠져 나온 소구체.

(3) 파열된 소구체을 합침으로써 형성된 탄력 덩어리들

탄력 재료와 세포 및 세포 돌출부의 밀접한 연계는 기계적인 힘이 소구체를 붕괴한다는 것을 시사한다.

1) 동물 모델

얇은 편 피부 이식과 함께 트로포엘라스틴을 함유하는 진피 주형의 엘라스틴 섬유 형성에 대한 효과가 검증되었다. 두 마리의 돼지가 연구에서 사용되었다. 다음과 같은 피부 대체물이 0일에 적용되었다.

1. 대조군: 가교 결합된 콜라겐 주형 단독

2. 시험 A: 10% 트로포엘라스틴의 존재 하에 가교 결합된, 가교 결합된 콜라겐 주형

3. 시험 B: 개질된 HA에 가교 결합된 트로포엘라스틴 기질의 상부에 적용된 콜라겐 주형

0일째에 각 돼지의 등 상부에 4개의 절개 상처(5 cm 직경)이 생성되었다. 한쪽 측면으로부터의 두 개의 상처가 대조군으로 덮였다. 반대쪽 측면의 한 개의 상처는 시험 A를 사용하여 치료되었고 다른 상처는 시험 B를 사용하여 치료되었다. 7일(1주)에 모든 상처에 대해 드레싱을 교체하였다. 14일(2주)에 상처의 모서리로부터 수 mm 떨어져서 4 mm의 생검을 얻었다. 21일(3주)에 모든 상처에 드레싱을 교체하면서 얇은 피부 편 이식을 수행하였다. 28일(4주)에 모든 상처에 대해 드레싱을 교체하였다. 35일(5주)에 동물을 안락사시키고, 상처 조직 및 정상 피부를 수집하였다. 생검을 포르말린에서 고정하고 파라핀에 넣었다.

엘라스틴 섬유 형성은 엘라스틴 섬유의 색상을 자주색/검은색이 되게 하는 절편의 베르회프 반 기슨(Verhoeff van Gieson) 염색(도 13)에 의해 평가되었다. 엘라스틴 섬유는 정상 돼지 피부의 모낭 주위(원)에서 나타난다.

짧고, 산발적으로 관찰되는 섬유가 대조군 시료의 진피에서 때때로 나타난다.

시험 A 시료의 생검 후, 상처 부위로부터의 조직은 섬유 및 섬유 집합체의 형태로 드 노보(de novo)엘라스틴을 나타내었다(예컨대, 검은 원으로 강조된 면적).

시험 B 시료의 생검 후, 상처 부위로부터의 조직은 개질된 HA와 가교 결합된 지속적인 트로포엘라스틴 기질(예컨대, 검은 원으로 강조된 면적) 및 드 노보 엘라스틴 섬유 형성(예컨대, 흰색 원으로 강조된 면적)을 나타내었다.

실시예 2. 주사가능한 엘라스틴 피부 재생 생성물을 이용한 인간 피부의 치료를 평가하기 위한 임상 연구

방법:

레스틸렌 바이탈 라이트(Restylane Vital Light, RVL- BDDE 에 가교 결합된 12 mg/ml 히알루론산, Q-Med, Australia)와 비교하여, (PCT/AU2011/001503, 특히 실시예 3 및 실시예 6에 기술된 바와 같은) 유도체화된 히알루론산과 약간 가교 결합된 트로포엘라스틴 제형을 사용한 임상 연구가 수행되었다. 피험자들은 전박 안쪽 피부 상에 미세 바늘 주사에 의해 생성물을 진피 내로 이식하여 치료를 받았다. 전박은 통상적으로 태양광에 노출되지 않아 건강하고 손상되지 않은 피부 조직으로서 존재하는 피부의 면적임으로 본 연구를 위해 선택되었다. 본 연구는 탄력성을 포함하는 피부 두께 및 질감에 대한 생성물의 영향을 평가하고, 치료된 피부 부위의 외양, 자연스러움 및 매끄러움에 대한 대상 환자의 피드백을 수집하는 것을 목적으로 한다.

연구를 위해 건강한 대상체가 모집되고, 선별 기간에 이어 참가 요건을 만족하는 16명의 대상체가 등록하고, 다양한 트로포엘라스틴 제형(ELAPR002: 유도체화된 히알루론산에 가교 결합된 10 내지 30 mg/ml 트로포엘라스틴) 중 하나로 한 팔을 치료받고, 뿐만 아니라 다른 팔에는 대조군인 레스틸렌 바이탈 라이트(RVL BDDE에 가교 결합된 12 mg/ml 히알루론산)로 치료받도록 무작위적으로 할당되었다. 모든 대상체는 동일한 치료 부위에 3주 간격으로 3회의 이러한 치료를 받았다. 각 치료는 30 Gx¼" 바늘을 사용하여 전달되는 20 내지 30 ul의 생성물의 다회 주사로 구성되고, 각각은 전박 면적 전체에 걸친 그리드 형성에서 대략 1 cm 떨어져 있다.

각 방문 시, 대상체는 치료 부위의 피부의 매끄러움, 자연스러움 및 외양에 관련된 질문을 받았고, 0 내지 100 척도(0은 전혀 매끄럽지 않거나 자연스럽지 않거나 나쁜 외양이며 100은 아주 매끄럽거나 자연스럽거나 양호한 외양임) 상의 선에 표기함으로써 시각 아날로그 척도(visual analogue scale, VAS)를 통해 피드백을 제공하도록 요청받았다. 피부 탄력성 및 피부 두께의 측정은, 각각, Dermal Torque Meter(DTM) 및 피부 칼리퍼를 사용하여 이루어졌다. 생검 절편의 조직병리학은 이식물의 지속성 및 치료 부위에서 엘라스틴 함량의 수준을 평가하기 위해 베르회프 반 기슨(VVG) 염색에 의해 3개월 및 6개월에 수행되었다.

결과:

이식 부위의 조직병리학적 분석:

VVG에 의해 평가되는 피부 부위는 RVL로 치료된 피부 면적이 도 14a에서 우세한 염색되지 않은 세포외 공간에 의해 보여지는 바와 같이 이식 재료에서 떨어져 신장되고 펼쳐진 진피 콜라겐 섬유를 포함하는 진피의 변화를 보여주는 것으로 밝혀졌다. 반대로, ELAPR002로 치료된 피부 면적은 VVG 염색 하에 이식 재료가 청색에서 자주색 내지 검은색으로 전이됨에 의해 증명된 바와 같이 엘라스틴 내로 이식 재료가 리모델링됨을 증거로 이식 재료가 피부 조직에 통합되는 것을 보여준다. 따라서, 트로포엘라스틴의 투여가 엘라스틴화에서 관찰되는 것과 훨씬 유사한 원위치(in situ) 조립 및 탄력 섬유의 침전을 제공한다는 것이 명백하다(도 14b).

피부 두께 & 덩어리짐의 측정

치료 부위에서의 피부 두께는 연구 임상의에 의해 피부 칼리퍼를 사용하여 측정되었다. 표 1은 RVL 및 ELAPR 제형을 사용하여 치료된 부위에 대한 베이스라인 및 3개월에서의 평균 피부 두께 측정값을 보여준다. RVL 및 엘라스틴 제형 모두에서 피부 두께의 증가는 유의한 것으로 밝혀졌다(p<0.001).

: 피부 두께 측정

시간/생성물	RVL	ELAPR002i	ELAPR002ii
베이스라인 피부 두께(mm)	1.66	1.51	1.6
3 개월 피부 두께(mm)	2.55	1.95	2.28

본 연구의 16명의 환자 중에서, RVL로 치료된 16개의 팔 모두는 3개월에 가시적이고 조사자에 의해 느껴질 수 있는 덩어리가 존재하였다. 대조적으로, ELAPR002 제형으로 치료된 16개의 팔 중 오직 1개에만 3개월에 임의의 덩어리가 존재하였다. 이처럼, RVL에 대한 피부 두께 측정은 대개 피부에서 RVL의 덩어리에 대한 측정인 반면, ELAPR002 치료된 부위에서의 측정은 치료 면적을 가로지르는 일반적인 피부 두께에서의 증가를 더욱 정확하게 반영한다.

피부 탄력성의 측정

피부의 탄력 신장 Ue의 측정은 임상 연구의 기간에 걸쳐 각 평가 방문 시 DTM을 사용하여 치료된 피부 부위로부터 이루어졌다.

RVL 및 ELAPR002i에 대한 베이스라인 및 6개월 평균 Ue 점수가 표 2에 제공된다. 표의 데이터로부터 알 수 있듯이, RVL로 치료된 피부 부위는 탄력 신장능의 감소(치료 후 낮아진 Ue)를 보여주었으며, 이는 RVL을 사용한 치료에 기인한 피부 두께 증가는 피부를 단단하게 만들었음을 나타낸다. 반대로, 트로포엘라스틴 이식물로 치료된 피부 면적은 탄력 신장능을 유지하였으며(Ue가 상대적으로 안정하게 유지됨), 이는 피부의 탄력 성질을 유지하면서 피부 두께 증가가 달성되었음을 나타낸다.

: 피부 탄력 신장(Ue)

시간/생성물	RVL	ELAPR002i
베이스라인에서의 평균 Ue(˚)	5.07	4.93
6 개월에서의 평균 Ue(˚)	3.85	4.55

환자 평가

RVL 및 ELAPR002ii로 치료된 피부 부위에 대한 치료된 피부 면적 매끄러움, 자연스러움 및 외양의 환자의 시각 아날로그 평가로부터의 평균 점수가 표 3에 제공된다. 데이터는 매끄러움, 자연스러움 및 외양에 대해 환자가 RVL로의 치료에 비하여 트로포엘라스틴 제형으로 치료된 피부 부위에 더 높게 점수를 주었음을 보여준다(높은 점수는 긍정적 평가를 나타냄).

Claims (20)

1. 개체의 피부 조직의 외양 (appearance)을 개선시키는데 사용하기 위한 트로포엘라스틴 (tropoelastin) 조성물로서,
   - 상기 트로포엘라스틴 조성물은 치료 면적 내 피부 조직으로 주사에 의해 투여되도록 적용되어, 주사하기 전에 치료 면적 내에 트로포엘라스틴의 양에 비해 증가된 양의 트로포엘라스틴을 상기 치료 면적 내에 확립시키고,
   - 상기 치료 면적은 피부 조직의 외양이 개선되어야 하는 피부의 면적이고, 상기 트로포엘라스틴 조성물은 투여되어 상기 치료 면적에서 탄력 섬유를 형성할 수 있고,
   - 상기 피부 외양의 개선은:
   i) 개체에서 튼살 (stretch mark)의 외양을 개선하고;
   ii) 개체의 피부 조직의 탄력 프로파일의 퇴행을 최소화하고;
   iii) 개체의 노화된 조직의 탄력 프로파일 및/또는 물리적 외양을 개선하고; 및
   iv) 개체에서 피부 탄력을 유지 또는 개선시키면서 피부 두께를 증가시키는 것 중 하나 이상인 것인 트로포엘라스틴 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 조성물은 상기 피부 조직 내로 트로포엘라스틴의 서방성 방출 (sustained release)에 적합한 것인 트로포엘라스틴 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 조성물은 치료 면적 내 피부 조직으로 주사에 의해 투여되도록 적용되고,
   - 상기 트로포엘라스틴 조성물은 사전 결정된 치료 일정에 따라 상기 치료 면적 내 피부 조직으로 투여되어 상기 치료 면적 외부의 피부에 비해 증가된 양의 트로포엘라스틴을 상기 치료 면적 내에 확립시키고, 상기 치료 일정은 명시된 치료의 횟수를 정의하고, 각 치료는 1회 이상의 상기 치료 면적으로의 투여 형태이고,
   그럼으로써, 상기 치료 일정에 걸쳐서 사전 결정된 기간 동안 상기 치료 면적 내에 트로포엘라스틴의 양을 유지하여 탄력 섬유를 형성할 수 있고, 그럼으로써, 상기 개체의 피부에서 상기 탄력 프로파일을 회복시키는 것인 트로포엘라스틴 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 치료 일정의 각 치료는 1 내지 24 주의 간격인 것인 트로포엘라스틴 조성물.
5. 청구항 3에 있어서, 상기 치료 일정의 1회 이상의 치료는 복수회 투여를 포함하고, 각각은 다른 투여 부위들로부터 1 mm 내지 3 cm 이격되어 있는 부위에서 수행되는 것인 트로포엘라스틴 조성물.
6. 청구항 3에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 조성물은 10 ㎕ 내지 100 ㎕의 체적으로 투여되고 상기 조성물은 0.5 mg/mL 내지 200 mg/mL의 농도의 트로포엘라스틴을 갖는 것인 트로포엘라스틴 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 조성물은 트로포엘라스틴 및 히알루론산을 포함하는 것인 트로포엘라스틴 조성물.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 트로포엘라스틴 및 수성 용매로 구성된 수성 조성물인 것인 트로포엘라스틴 조성물.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 트로포엘라스틴, 히알루론산 및 수성 용매로 구성된 수성 조성물인 것인 트로포엘라스틴 조성물.
10. 청구항 3에 있어서, 상기 일정은 2주 내지 8주 마다 치료 면적 내로의 투여를 포함하는 것인 트로포엘라스틴 조성물.
11. 청구항 3에 있어서, 상기 일정은 1 내지 6개월의 기간에 걸친 것인 트로포엘라스틴 조성물.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 피부는 20세 내지 70세의 연령의 개체의 것인 트로포엘라스틴 조성물.
13. 청구항 1에 있어서, 상기 치료 부위는 볼, 눈, 목, 데콜테

    

    , 손, 흉터 또는 튼살의 근처, 주위, 내부 또는 인접한 부위인 것인 트로포엘라스틴 조성물.
14. 청구항 1에 있어서, 상기 피부는 광노화, 처짐, 이완된 피하 조직, 주름, 흉터 또는 튼살인 것을 특징으로 하는 것인 트로포엘라스틴 조성물.
15. 청구항 7에 있어서, 상기 트로포엘라스틴은 히알루론산과 연결된 것인 트로포엘라스틴 조성물.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 0.5 내지 50 mg/mL의 트로포엘라스틴 및 0.1% 내지 1%의 히알루론산을 포함하는 것인 트로포엘라스틴 조성물.
17. 청구항 11에 있어서, 상기 일정은 1 내지 3개월의 기간에 걸친 것인 트로포엘라스틴 조성물.
18. 청구항 1에 있어서, 상기 치료 면적은 튼살을 포함하고 상기 조성물은 상기 튼살내에 주사하기 위한 것인 트로포엘라스틴 조성물.
19. 청구항 1에 있어서, 상기 치료 면적은 상처 조직 또는 섬유화 조직을 포함하는 것인 트로포엘라스틴 조성물.
20. 청구항 1에 있어서, 상기 주사로 상기 치료 면적 외부의 피부에 비해 동일하거나 또는 증가된 양의 트로포엘라스틴을 상기 치료 면적 내에 확립시키는 것인 트로포엘라스틴 조성물.

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