CN107252478A - 弹性纤维的体内合成 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及弹性纤维的体内合成。本文公开了使用含原弹性蛋白的组合物恢复组织弹性的方法。

Description

弹性纤维的体内合成
本申请是申请日为2012年9月27日、申请号为“201280047832.8”、发明名称为“弹性纤维的体内合成”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/AU2012/001179的中国国家阶段申请。
技术领域
本发明涉及恢复或重建组织的弹性，从而改善老化或受损组织的物理外观和/或功能。
背景技术
本说明书中引用的任何现有技术不是且不应被视为承认或以任何形式暗示该现有技术构成澳大利亚或任何其他管辖区之公知常识的一部分或该现有技术可以被本领域技术人员合理地预期为确定的、被理解的和视为相关。
老化和组织损伤与细胞外基质退化相关，导致组织结构和/或功能丧失。皮肤松弛(loosened)、皮下组织疏松(relaxed subcutaneous tissue)、细胞外基质密度降低、皱纹(wrinkling)、妊娠纹(stretch mark)和纤维化是退化的物理表现。根据相关的组织，弹性功能丧失可表现为肺容量或心脏容量降低或者多种瓣膜和括约肌的顺应性(compliance)和/或恢复力(resilience)降低。
约20年前，研究致力于在一系列临床和化妆品介入中使用多种细胞外基质分子校正组织结构和功能的丧失。关键目的分子是那些相关细胞外基质纤维的底物，即胶原和弹性蛋白。通常的方法是使用这些生物材料作为植入物(implant)或填充物通过填充组织空隙(void)或通过使组织丰满或填充来加强组织的外观，或者使用这些纤维作为植入物或填充物来改善功能缺陷。
弹性蛋白被一些人认为对这项工作是有利的，这是因为与胶原蛋白不同，弹性蛋白可用于形成弹性植入物和填充物。早期的工作集中于原弹性蛋白(tropoelastin)重组体形式的合成，随后所述原弹性蛋白在递送至个体之前或之后被凝聚(coacervate)并且化学交联或酶交联，使得离体或体内形成弹性植入物或填充物以用于填充组织空隙或者用于加强组织或使组织再成形。参见例如，WO1994/14958；WO1999/03886；WO2000/04043。WO2010/102337涉及固体浓度在形成可注射的交联生物材料中的相关性。
当体内使用酶交联时，使用了重组体或其他外源性赖氨酰氧化酶。USSN 09/498,305描述了通过施用包含外源性赖氨酰氧化酶和原弹性蛋白单体的组合物来使原弹性蛋白单体在体内酶交联的一种方法。
形成类似于交联原弹性蛋白之某些特征的材料的另一种方法公开于WO2008/058323，其中在碱性条件下形成了包含非交联原弹性蛋白的弹性材料。
在上述各实例中，使用外源性原弹性蛋白和交联剂或碱性条件来促使植入物或填充物的形成。弹性终产物的形成时间是原弹性蛋白的浓度、交联剂的浓度和相关条件的函数，使得由非细胞方法产生终产物。
还考虑了原弹性蛋白的多种其他用途，包括：(i)作为创伤密封剂(woundsealant)(WO94/14958)；(ii)作为活性成分的递送载剂，提供生物可降解或生物可分离(biodissociable)的缓慢释放制剂(WO94/14958)；(iii)作为GAG的结合剂(WO99/03886)；(iv)用于介入弹性蛋白沉积(WO99/03886)；以及(v)用于通常发现丝氨酸蛋白酶的创伤部位、组织损伤和重构的位置(WO00/04043)。
早期的工作表明可将多种形式的原弹性蛋白用于任何一个上述申请。参见例如WO94/14958，其涉及包含结构域26A之人原弹性蛋白的合成形式。WO94/14958，其描述了用于药物组合物的哺乳动物和鸟类形式；WO99/03886涉及人原弹性蛋白的多种合成形式，包括缺乏结构域26A、C端结构域等的那些。WO99/03886描述了用于药物应用的人和非人形式。就缺乏GAG结合活性而言，讨论了特定的形式SHELδ26A；WO00/04043，其涉及对丝氨酸蛋白酶类具有降低之易感性的原弹性蛋白形式，所述丝氨酸蛋白酶类具体为凝血酶、纤维蛋白溶酶(plasmin)、激肽释放酶、明胶酶A和B以及基质金属弹性蛋白酶。WO00/04043描述了具有降低之易感性的原弹性蛋白相关形式(称为“降低的原弹性蛋白衍生物”)，可用于包括部分长度形式和全长形式以及异种(xenogeneic)形式的这些应用。
在该早期工作的每个实例中，虽然可以向组织提供具有弹性性质的植入物，但是该植入物及其弹性的性质不表明该组织通常具有的性质。例如，可以看到由该早期工作中描述的填充物或植入物赋予真皮或皮下组织的弹性性质与该组织的正常弹性明显不同。换句话说，虽然可以通过植入具有包括弹性在内之性质的材料来赋予组织弹性，但是无法恢复到与正常相似的物理外观或功能。
在事后看来这个结果或许并不奇怪，因为过去5至10年间的更多近期工作揭示了给定组织的弹性特性(profile)由涉及除了赖氨酰氧化酶和原弹性蛋白之外的多种因子的复杂过程(称作“弹性发生(elastogenesis)”)产生。弹性发生通常被理解为是指从晚期胎儿生命到早期出生后生命发生的生理过程，其中通过细胞(包括成纤维细胞、平滑肌细胞等)由原弹性蛋白单体和其他相关因子从头产生弹性纤维。从一组常见的因子开始，相关组织提供了这些因子的组织特异性相互作用，导致了相关组织固有的弹性纤维的合成、组织和分布，由此产生组织的弹性特性(Cleary E.G和Gibson M.A.Elastic Tissue.Elastin and Elastin ASSociated Microfibrils in Extracellular Matrix第2卷Molecular Components and Interactions (Ed Comper W.D.)Harwood Academic Publishers 1996p95)。已经清楚的是，该组织及伴随的特性不能简单地通过由早期工作提出的离体或体内使外源性原弹性蛋白与外源性赖氨酰氧化酶交联来重建。
在成体组织中启动与弹性发生(即，在其中组织从一组常见的因子从头合成弹性纤维的过程)相似的过程是期望的目标，这是因为相信这样的过程将恢复组织的弹性特性。例如，可以恢复老化组织的弹性特性使得组织的特性与较年轻组织的特性相似。不幸的是该目标仍然是难以把握的，主要是由于成体中弹性纤维的从头形成可以忽略不计。虽然在一些心血管和肺部疾病中可能发生弹性纤维修复，但是由修复机制所产生的弹性纤维的完整性和组织与由弹性发生所产生的不同(Akhtar等2010J.Biol.Chem.285：37396-37404)。
在过去的十年间这一问题已经被许多研究小组高强度地研究(Huang R等 .Inhibition of versican synthesis by antisense alters smooth muscle cell phenotype and induces elastic fiber formation in vitro and in neointima after vessel injurv.Circ Res.2006 Feb 17：98(3)：370-7；Hwang JY等.Retrovirally mediated overexpression of glvcosaminoglvcan-deficient biglvcan in arterial smooth muscle cells induces tropoelastin synthesis and elastic fiber formation in vitro and in neointimae after vascular injury.Am J Pathol.2008 Dec：173(6)：1919-28.；Albertine KH等.Chronic lung disease in preterm lambs： effect of daily vitamin A treatment on alveolarization.Am J Phvsiol Lung Cell Mol Physiol.2010 Jul 299(1)：59-72；Mitts TF等.Aldosterone and mineralocorticoid receptor antagonists modulate elastin and collagen deposition in human skin.J Invest Dermatol.2010 Oct：130(10)：2396-406；Sohm B 等.Evaluation of the efficacy of a dill extract in vitro and in vivo.Iht J Cosmet Sci.2011 Apr；33(2)：157-63；Cenizo Vet al.，LOXL as a target to increase the elastin content in adult skin：a dill extract induces the LOXL gene expression.Exp Dermatol.2006 Aug；15(8)：574-81)。用于解释在成体中缺乏弹性纤维从头形成的公认假说是成体细胞或含有其的相关组织缺乏弹性发生所需的一种或更多种必要因子和过程(Shifren A&Mecham R.P.The stumbling block in lung repair of emphysema：elastic fiber assembly.Proc Am Thorac Soc第3卷p428-433 2006)。根据该假说，向成体组织提供合成的原弹性蛋白不能使成体细胞从合成的原弹性蛋白合成弹性纤维。
目前的研究集中于理解在早期生命中支持弹性发生的机制和因子以及确定这些是否在成体生命中存在(Wagenseil JE&Mecham RP.New insights into elastic fiber assembly.Birth Defects Res C Embryo Today.2007 Dec；81(4)：229-40.)
通常认为，原弹性蛋白在其表达不久后凝聚为约200-300nm的球体组件(assembly)，其随后进一步合并成约1微米的颗粒。然后这些颗粒沿着细胞外基质中微纤丝的长度聚集，由此形成弹性纤维(Kozel BA等，Elastic fiber formation：a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.J Cell Physiol.2006 Apr；207(1)：87-96)。在该过程中涉及的一系列其他因素仍然有待探索。
多种分子步骤的体外研究已倾向于检验人和非人原弹性蛋白底物以及一系列不同的原弹性蛋白同种型(Davidson JM等，Regulation of elastin svnthesis in pathological states.Ciba Found Svmp.1995；192：81-94；讨论94-9)。通过这项工作，已经揭示了至少34种不同的分子与弹性纤维相关，尽管只有这些中的一些已经显示在结构上涉及纤维产生。这些包括原弹性蛋白、肌原纤维蛋白-1、肌原纤维蛋白-2、赖氨酰氧化酶、赖氨酰氧化酶样-1(lysyl oxidase-like-1，LOXL1)、弹性微纤维界面蛋白(emilin)、腓骨蛋白(fibulin)-4和腓骨蛋白-5(Chen等，2009 J.Biochem 423：79-89)。一个小组认为LOXL1(LOX家族的一个成员)是在某些成体组织中的关键缺失分子(参见US2004/0258676、US2004/0253220和US20100040710)。另外的小组通过与赖氨酰氧化酶或其他分子的相互作用鉴定了腓骨蛋白4和另一些分子(Yanagisawa H&Davis EC.Unraveling the mechanism of elastic fiber assembly：The roles of short fibulins.Int J Biochem Cell Biol.2010 Jul：42(7)：1084-93)。
总之，虽然关于弹性发生之因子的相互作用的状况还未完全理解，但是目前的研究表明，成体细胞和组织中不能完成与弹性发生相似的过程是因为它们缺少一个或更多个因子。结果是，单独向成体组织提供原弹性蛋白本身应不足以恢复组织的弹性特性，这是因为在不存在弹性发生所需的相关因子的情况下，组织不能利用原弹性蛋白形成弹性纤维。
仍然需要恢复或重建组织的弹性特性或者尽可能减少组织弹性特性的退化。
需要改善老化组织的弹性特性，使得其更接近地类似于在生命较早阶段的组织特性。
需要改善老化组织(包括光老化(photo-aged)的组织)的物理外观以例如尽可能减少皮肤松弛、皮下组织疏松、细胞外基质密度降低、皱纹和妊娠纹。
还需要改善疤痕或纤维化组织中的弹性特性，以使得该特性更接近地类似于组织损伤前含该疤痕或纤维化组织之相关组织的特性。
还需要在老化或损伤组织中提供改善的弹性功能，使得其更接近地类似于生命较早阶段或损伤前之相关组织的弹性功能。
上述需要与通过植入物或填充物解决的那些和使用具有交联原弹性蛋白的所述植入物或填充物填充组织解决的那些不同，如以上相关现有技术所述的。
发明内容
本发明致力于解决一种或更多种上述需要，并且在一个实施方案中提供了恢复个体组织之弹性特性的方法，其包括：
-提供个体，其具有弹性特性待恢复的组织；
-根据处理方案为个体施用原弹性蛋白，已经选择所述处理方案以将组织中施用的原弹性蛋白维持一段时间，使得用于形成弹性纤维的在组织中表达的因子与施用的原弹性蛋白相接触以由其合成弹性纤维；
-从而恢复或重建个体组织的弹性特性。
在另一个实施方案中提供了尽可能减少个体组织之弹性特性的退化的方法，其包括：
-提供个体，其具有弹性特性退化待尽可能减少的组织；
-根据处理方案为个体施用原弹性蛋白，已经选择所述处理方案以将组织中施用的原弹性蛋白维持一段时间，使得用于形成弹性纤维的在组织中表达的因子与施用的原弹性蛋白相接触以由其合成弹性纤维；
-从而尽可能减少个体组织之弹性特性的退化。
在另一实施方案中提供了改善老化组织的弹性特性使得其更接近地类似于在生命较早阶段之组织特性的方法，其包括：
-提供个体，其具有弹性特性待改善的组织；
-根据处理方案为个体施用原弹性蛋白，已经选择所述处理方案以将组织中施用的原弹性蛋白维持一段时间，使得用于形成弹性纤维的在组织中表达的因子与施用的原弹性蛋白相接触以由其合成弹性纤维；
-从而改善老化组织的弹性特性使得其更接近地类似于生命较早阶段的组织特性。
在另一个实施方案中提供了改善老化组织之物理外观的方法，其包括：
-提供个体，其具有物理外观待改善的组织；
-根据处理方案为个体施用原弹性蛋白，已经选择所述处理方案以将组织中施用的原弹性蛋白维持一段时间，使得用于形成弹性纤维的在组织中表达的因子与施用的原弹性蛋白相接触以由其合成弹性纤维；
-从而改善老化组织的物理外观。
在另一个实施方案中提供了改善有疤痕的或纤维化的组织中的弹性特性使得该特性更接近地类似于组织损伤前含该疤痕或纤维化组织之相关组织的特性的方法，其包括：
-提供个体，其具有有疤痕的或纤维化的组织；
-根据处理方案为个体施用原弹性蛋白，已经选择所述处理方案以将组织中施用的原弹性蛋白维持一段时间，使得用于形成弹性纤维的在组织中表达的因子与施用的原弹性蛋白相接触以由其合成弹性纤维；
-从而改善有疤痕的或纤维化的组织中的弹性特性。
在另一个实施方案中提供了改善老化或损伤组织中弹性功能以使其更接近地类似于生命较早阶段或损伤前之相关组织的弹性功能的方法，其包括：
-提供个体，其具有老化或损伤的组织；
-根据处理方案为个体施用原弹性蛋白，已经选择所述处理方案以将组织中施用的原弹性蛋白维持一段时间，使得用于形成弹性纤维的在组织中表达的因子与施用的原弹性蛋白相接触以由其合成弹性纤维；
-从而改善老化或损伤组织中的弹性功能。
在另一个实施方案中提供了为个体的皮肤提供弹性的方法，优选用于为个体皮肤提供厚度，同时维持或改善个体皮肤的弹性，所述方法包括以下步骤：
-提供个体；
-在个体皮肤上限定处理区域，其中所述处理区域是待在其中提供弹性的皮肤区域；
-将原弹性蛋白组合物注射到处理区域内在处理区域内以建立原弹性蛋白的量，其相对于处理区域以外的皮肤是提高的；
-将处理区域内原弹性蛋白的量维持预定的时间段，从而为个体的皮肤提供弹性。
在另一个实施方案中提供了如本文所述的原弹性蛋白组合物，其用于一种或更多种以下应用：
·恢复个体组织的弹性特性
·尽可能减少个体组织之弹性特性的退化
·改善老化组织的弹性特性使得其更接近地类似于生命较早阶段的组织特性
·改善老化组织的物理外观
·改善有疤痕的或纤维化的组织中的弹性特性使得该特性更接近地类似于组织损伤前含该疤痕或纤维化组织之相关组织的特性
·改善老化或损伤组织中的弹性功能使其更接近地类似于生命较早阶段或损伤前之相关组织的弹性功能。
附图说明
图1：荧光图像，其显示在向所培养的源自不同年龄组的人成纤维细胞添加250μg/ml原弹性蛋白后7天形成的弹性蛋白网络。A.新生儿原代男性(NHF 8-9-09)；B.10岁男性(GM3348)；C.31岁男性烧伤患者(230209A)；D.51岁男性(142BR)；E.92岁男性(AG04064)。弹性蛋白网络沉积物为绿色，细胞核为蓝色。
图2：荧光图像，其显示在向所培养的猪和兔成纤维细胞添加原弹性蛋白后7天的弹性蛋白沉积物。A.10周原代猪皮肤成纤维细胞；B.成年兔皮肤成纤维细胞。弹性蛋白沉积物为绿色，细胞核为蓝色。
图3：荧光图像，其显示添加原弹性蛋白之后7天由原代气道平滑肌细胞形成的弹性蛋白纤维。A.气道平滑肌细胞(3785)。B.另一来源的气道平滑肌细胞(3791)。弹性蛋白沉积物为绿色，细胞核为蓝色。
图4：荧光图像，其显示添加原弹性蛋白或衍生物之后7天由原代新生儿人成纤维细胞形成的弹性蛋白纤维。A.无原弹性蛋白；B.全长原弹性蛋白；C.人皮肤弹性蛋白肽；D.RKRK缺失；E.RGDS替换。F.Advanced Biomatrix原弹性蛋白。弹性蛋白沉积物为绿色，细胞核为蓝色。
图5：荧光图像，其显示在50μM blebbistatin不存在(A)和存在(B)的情况下，添加125μg/ml原弹性蛋白后7天由原代新生儿人成纤维细胞形成的弹性蛋白纤维。弹性蛋白沉积物为绿色，细胞核为蓝色。
图6：荧光图像，其显示重复的原弹性蛋白添加后由原代新生儿人成纤维细胞形成的弹性蛋白网络的范围。A.细胞；B.细胞+第10天添加原弹性蛋白；C.细胞+第10天和第17天添加原弹性蛋白；D.细胞+第10天、第17天和第24天添加原弹性蛋白。在第31天固定所有样品用于成像。弹性蛋白沉积物为绿色，细胞核为蓝色。
图7：使成熟的弹性蛋白纤维自发荧光(autofluorescence)。(A)未添加原弹性蛋白的成纤维细胞，(B)添加原弹性蛋白的成纤维细胞。
图8：真皮人成纤维细胞培养物的AFM分析。图像表示被模量通道覆盖的培养物形貌(topography)。(A)未添加原弹性蛋白的成纤维细胞，(B)添加了原弹性蛋白的成纤维细胞。
图9：由人新生儿真皮成纤维细胞形成的弹性纤维。接种后12天添加原弹性蛋白，并且样品用DAPI、抗弹性蛋白小鼠抗体和缀合FITC的抗小鼠染色。
图10：抑制赖氨酰氧化酶阻止弹性纤维形成。在赖氨酰氧化酶抑制剂BAPN存在下的弹性蛋白纤维形成。样品用DAPI、抗弹性蛋白小鼠抗体和缀合FITC的抗小鼠染色。
图11：人真皮成纤维细胞培养物中原弹性蛋白小球的超分辨率显微图像。(A)比例尺为1微米。(B)比例尺为2微米。
图12：添加原弹性蛋白3天后人真皮成纤维细胞培养物的TEM图像。
图13：第2周活组织检查的Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色切片。用含原弹性蛋白的构建体处理完全厚度伤口2周后对猪皮肤中真皮横切面中的弹性蛋白进行VVG染色。测试A是在10％原弹性蛋白存在下交联的交联胶原蛋白模板。测试B是施加到与经修饰HA交联的原弹性蛋白基质顶部的交联胶原蛋白模板。图像与正常猪皮肤和对照对比，所述对照是交联胶原蛋白模板。
图14：取自用基于RVL或弹性蛋白的制剂处理上臂真皮之对象的皮肤活组织检查切片。(A)用RVL处理的皮肤示出真皮胶原蛋白纤维被未染色的RVL材料拉伸分离，所述RVL材料使皮肤更僵硬且粗糙(lumpy)。(B)用基于原弹性蛋白的制剂处理的皮肤导致真皮胶原蛋白纤维被植入材料分开，所述植入材料被VVG由蓝色染色为紫色至黑色，表明植入材料重塑到成熟的弹性蛋白纤维中。
具体实施方案
相信本发明的关键发现由本发明人开发的并且在本文实施例中举例说明的新测定系统产生。该测定系统使用成年人细胞体外形成弹性纤维。可以操作该系统使得能够剖析弹性纤维形成的每一步，并且鉴别弹性纤维形成所需的组分和过程。
该测定系统还揭示了弹性纤维合成的途径，其不与本发明之前的先前理解相似。一个关键发现是纤维形成远比之前认为的更依赖于细胞相互作用。
一个关键发现是该系统不导致大量地或另外地显著合成弹性纤维，除非向该系统添加外源性原弹性蛋白单体。这指出了原弹性蛋白在体内合成弹性纤维中的重要性。
更进一步地，该系统证实如果该系统使用人原弹性蛋白单体和非人细胞，则不有效地发生弹性纤维形成。
另外，通常需要单体处于一种或更多种天然存在之同种型的形式。虽然单体可以重组合成，但是已经发现具有不存在于人生理学中之序列或结构的重组体形式不能有效地使弹性纤维形成，尽管纤维形成在一定程度上仍是可能的，前提是内源性原弹性蛋白和外源性原弹性蛋白之间的序列差异不低于约65％同源性。
更进一步地，向该系统重复施用原弹性蛋白证明了形成弹性纤维的持续能力，这表明原弹性蛋白是弹性纤维形成的限制因素。
相信使用人成体细胞和天然存在的人原弹性蛋白同种型将该测定系统与其他系统区分开来(参见例如Sato F等，Distinct steps of cross-linking，self-association， and maturation of tropoelastin are necessary for elastic fiber formation.J Mol Biol.2007 Jun 8；369(3)：841-51)，并且可能这就是为什么这些相关的研究小组还未理解人成体细胞确实具有用于在类似弹性发生的过程中合成弹性纤维的潜能，前提是将细胞暴露于原弹性蛋白。
在进一步的研究中，本文举例说明的临床测试确立了将组织中原弹性蛋白维持足够时间以使细胞与原弹性蛋白相接触的重要性。这可以通过在待处理的组织区域中建立一定水平的原弹性蛋白并维持选定的时间段以使得经处理的区域具有比未经处理的区域高的原弹性蛋白水平来实现。相信如果原弹性蛋白在组织中持续细胞接触所需的足够长的时间段，或者其中该组织具有极少细胞(用于细胞的招募(recruitment)和接触)，则可以在成体组织中发生弹性发生样过程，导致在组织中形成纤维并恢复弹性特性。使原弹性蛋白在组织中持续或维持的示例性时间段将在下文中进一步讨论。
虽然在一些实施方案中纤维的分子和/或物理结构可能不同，但应理解根据本发明形成的弹性纤维可以具有与天然观察到的相同的分子结构。在某些实施方案中，弹性纤维可以具有与所处理的组织中的物理结构不同的物理结构，同时仍实现本发明的目的。
在具体的实施方案中，根据本发明的方法合成的弹性蛋白与组织、细胞和/或细胞外基质结合，从而恢复或重建弹性特性，改善物理外观或实现其他临床终点。在这些实施方案中，所合成的弹性蛋白可以具有与组织中通常观察到的弹性纤维相比不同的物理或分子结构，并且终点的获得可以从弹性蛋白和相关组织的其他组分之间的相互作用或接触产生。所述相互作用或接触可以表面上模拟那些通常在相关的组织中弹性纤维和组织元件之间观察到的过程。
在一个实施方案中，以含水形式提供根据本发明形成的弹性纤维，从而使纤维充满弹性潜力。
构成本发明之基础的研究证明在成体组织中恢复或重建弹性特性是可能的，这是因为成体细胞(例如成纤维细胞、平滑肌细胞等)具有弹性发生潜能；即参与与弹性发生相似并且因此使组织恢复相关弹性特性的过程的潜能。另外，实现该潜能的前提是向该成体细胞提供原弹性蛋白单体的种类和潜在组织相关同种型。此外，本发明人已示出含有显著水平杂质的重组人原弹性蛋白不导致弹性蛋白纤维的有效形成。在某些实施方案中，与组合物中其他蛋白质或分子的量相比，就用于施用的组合物中原弹性蛋白的量而言，原弹性蛋白具有特定程度的纯度。在一个实施方案中，原弹性蛋白处于具有至少75％纯度、优选85％纯度、更优选高于90％或95％纯度的组合物中。应理解，在某些实施方案中，可以以组合物形式提供原弹性蛋白，所述组合物由或基本由原弹性蛋白、优选原弹性蛋白的全长同种型组成。最后，如果原弹性蛋白已经大量地分子内交联，则细胞不能利用原弹性蛋白形成弹性纤维。
根据本发明，处理方案是这样的方案，其将原弹性蛋白在组织的限定处理区域内维持足够时间，其间细胞可以接触并利用施用的原弹性蛋白形成弹性纤维。适当的方案可以包括多于单次施用原弹性蛋白单体，或多于施用无杂质单体，这是因为相信原弹性蛋白单体在组织的限定处理区域内中的半衰期通常比相关细胞形成弹性纤维所需的短。更具体地，相信不与细胞接触的原弹性蛋白单体在处理区域中被代谢，或者从处理区域扩散。结果是在未选择合适的处理方案的情况下，施用的原弹性蛋白明显可能在其可以被细胞用于形成弹性纤维之前从限定的处理区域耗尽。
以下进一步描述的处理方案中的一个步骤可以包括单次施用原弹性蛋白，其中原弹性蛋白所施用的部位已知具有相当数目的细胞。细胞数目或密度的知识可以由组织的现有组织学知识得到。或者，施用部位可以经用于诱导细胞增殖的处理或向处理部位的招募预先处理。
可以采用多种处理方案以将组织中施用的原弹性蛋白在处理区域中维持需要的时间。这些大体上如下：
(i)施用持续释放制剂中的原弹性蛋白，该制剂经一段时间逐渐释放原弹性蛋白。
原弹性蛋白在所需组织部位的持续释放可以通过将原弹性蛋白掺入不可降解或可降解的递送载剂中实现。本领域技术人员可以采用多种这样的持续释放方法。优选地采用可降解持续释放制剂以避免在原弹性蛋白被递送后除去载剂的需要。这样的递送载剂可以由聚合物(例如聚丙交酯(PLA)和聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA))构成。其他持续递送载剂可以包括由多糖(例如透明质酸、黄原胶或壳聚糖)形成的聚合物。此外，在某些实施方案中，递送载剂可以是经化学修饰以通过离子键或共价键以将原弹性蛋白结合入植入物中，使得原弹性蛋白只有在植入物被降解时才释放。
在某些实施方案中，在所需的处理部位释放原弹性蛋白1天至90天的时间。在某些实施方案中，可在所需的处理部位释放原弹性蛋白1天至180天。在某些实施方案中，可配制原弹性蛋白使得其仅在施用植入物的延迟之后(例如10天至90天或10天至180天)释放。其他合适的原弹性蛋白递送时间包括1天至30天、1天至60天、10天至60天、30天至60天、30天至180天或者1天至＞180天。
待递送的原弹性蛋白的量和浓度取决于待处理组织的面积和体积二者、在组织中正常存在的弹性蛋白的通常内源性水平；以及所需要的弹性蛋白纤维合成的水平。通常，原弹性蛋白将会以1μg/cm3至1mg/cm3组织的量递送至组织。对于皮肤，可以按1μg/cm2至1mg/cm2计算。可被递送的其他量包括0.1μg/cm3至10mg/cm3组织、1mg/cm3至20mg/cm3组织或者1mg/cm3至100mg/cm3组织。在某些实施方案中，递送的量可以少于0.1μg/cm3或多于100mg/cm3组织。待施用至处理部位的植入物中原弹性蛋白的浓度可以变化以使所需量的原弹性蛋白能够被递送。在某些实施方案中，植入物中原弹性蛋白的浓度可以从1μg/ml至100mg/ml变化。在某些实施方案中，产物中原弹性蛋白浓度会为0.5mg/ml至200mg/ml、1mg/ml至50mg/ml、5mg/ml至50mg/ml或1mg/ml至25mg/ml。
掺入制剂中的原弹性蛋白应当基本上等于待处理组织中天然存在的原弹性蛋白同种型。此外，原弹性蛋白应当以基本不含杂质的形式提供。通过原弹性蛋白制造意外出现的原弹性蛋白的片段(即，原弹性蛋白同种型的截短形式)可以被视为本文中的杂质。在某些实施方案中，掺入处理制剂中的原弹性蛋白将是相关全长原弹性蛋白同种型长度的至少65％，更优选相关全长原弹性蛋白同种型的80％。在另一些实施方案中，原弹性蛋白将是全长的大于85％、大于90％或大于95％。如本文所述，原弹性蛋白中的某些序列比另一些更重要，例如，当原弹性蛋白中氨基酸的最终C端序列的约4个残基与相关组织内源性原弹性蛋白序列具有同源性或一致性时，纤维形成的效率增加。
制剂中还可以包含其他组分，从而帮助激活组织中需要的细胞以形成弹性纤维。例如对于皮肤的处理，可以将另外的组分掺入制剂，所述组分有助于成纤维细胞在处理部位的招募或增殖。这样的组分包括表皮生长因子家族、转化生长因子β家族、成纤维细胞生长因子家族、血管内皮生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板源生长因子、结缔组织生长因子、白介素家族和肿瘤坏死因子α家族。
在某些实施方案中，处理还可以包括将具有原弹性蛋白的细胞递送到处理部位。例如对于处理皮肤，成纤维细胞可以被包含在处理制剂或过程中以帮助弹性纤维在处理部位的合成。成纤维细胞可以源自同种异体来源(例如新生儿包皮)或非可见皮肤部位(例如，耳后)的活组织检查并用作自体治疗。
(ii)施用原弹性蛋白，其中蛋白酶易感区域已经从存在于组织中的酶移除或阻断
在处理中使用的原弹性蛋白可以经修饰以降低蛋白酶降解。例如，可以按照WO2000/04043中的描述选择蛋白质种类以达到它们基本上保留在待处理组织中天然存在之原弹性蛋白种类的全长的程度。或者，处理制剂可以掺入蛋白酶抑制剂或阻断已知提高蛋白酶表达之信号传导通路的分子。这样的分子包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、半乳糖苷(例如乳糖)、弹性蛋白信号传导的抑制抗体和小分子抑制剂。
(iii)在预定时间点重复施用原弹性蛋白
在某些实施方案中，为了确保原弹性蛋白递送形式可以被细胞用作构建弹性纤维的底物并且在处理部位保留足够长的时间以使该情况发生，处理将以重复的情形施用至该部位。
在某些实施方案中，每个待处理的组织部位将接受产物的三次处理，间隔1至24周或2至12周或3至6周。处理可由穿过待处理区域的多个注射组成，每次以网格形式隔开约10mm。可以用细针头(例如27G、29G、30G或31G)施用处理物。将针插入到组织中时，可考虑斜面的角度和方向、注射的深度以及待施用材料的量。可以将处理物大量(bolus)注射到组织中，例如在各个注射部位植入体积为10-100μl、10-50μl、优选为20至30μl产物。每次注射完成后，可慢慢取出针。当所有的植入已经完成，如果需要可轻轻按摩处理部位以使植入材料能够适应周围组织的轮廓(contour)。将根据待处理的组织面积和待恢复的弹性水平调整处理的次数、处理间隔时间以及在每个处理部位递送的原弹性蛋白的量。
这些方法的任何一种可以单独或组合实施，从而延长原弹性蛋白在组织中的持续。
在每种方法中将认识到施用步骤是侵入过程，其具有引起可逆的组织或细胞损伤以及引发响应于这种损伤的多种炎症级联反应的可能。本发明人认识到，可以应用这一类型的物理处理以提供可逆的细胞损伤的情况，因为这样的情况可能刺激成纤维细胞活化和/或增殖。重要的是，物理处理不足以诱导纤维化。
如本文中所讨论的，指导选择特定处理方案的考虑包括组织的性质、弹性蛋白特性降解或退化的程度以及期望的结果。再者，本发明的关键方面是，给予细胞机会以由提供至它们的原弹性蛋白形成、修复或合成弹性纤维。由于持续释放、保护免于降解或连续供给，有更多机会使原弹性蛋白有效地在组织中持续更长的时间段。通常，弹性特性的损失越大且非细胞组织越多，越适合原弹性蛋白在组织中持续较长时间段的处理方案。
更具体地，相比于对较老皮肤的改善，当目的为改善较年轻皮肤的物理外观时，较短的持续时间可能是适合的。本文中，根据上述(iii)和/或(i)在预定时间点重复施用原弹性蛋白可能更适合。
组织为有疤痕的或纤维化的以及基本无细胞的情况下，可能需要较长的持续时间。本文中，给细胞化学趋向进入相关组织留充足的时间将是重要的。根据(ii)和/或(i)的方案可能更适合。
如提到的，结果也是指导选择适合方案的相关考虑。当结果是为了提高或改善弹性功能时，可能需要长得多的持续时间以使细胞能够建造所需对功能具有特异性的弹性纤维阵列。本文中，如在上述(i)中所述的持续释放形式可能更适合。
与选择适当处理方案相关之考虑的一些实例在以下更详细地讨论：
(i)改善皮肤的物理外观。
(ii)增加纤维化和疤痕组织的弹性蛋白含量。
(iii)改善软骨或脉管系统的弹性。
几乎所有哺乳动物的弹性组织都具有弹性蛋白特性，其由包含在其中的弹性纤维产生。由于每种不同的弹性组织具有不同的功能，因此弹性特性因组织而异。例如，左侧脉管系统对血流的恢复力(resilience)与吸入空气的支气管组织的恢复力不相同。下表描述了本发明涉及的组织的实例以及可如何测量和表达各自的弹性特性：
通常根据本发明处理的个体是人。
优选地，组织是皮肤组织，尤其是至少20岁、优选20至50岁年龄、更优选30至60岁年龄的个体皮肤组织中的组织。
皮肤组织的特征可为在真皮和表皮连接处之弹性纤维的破裂或破碎。
皮肤组织可以是光老化组织。
皮肤组织可以呈现以下一个或更多个特征：皮肤松弛、皮下组织疏松、细胞外基质密度降低、皱纹和妊娠纹。
皮肤组织优选地位于面部、颈部或者上肢或下肢。
优选地，组织在处理方案开始的时间不含创伤。有可能在根据所选处理方案完成施用原弹性蛋白时，存在组织的小创伤，例如通过注射或皮肤的其他物理操作施用时。
当所述个体是人时，原弹性蛋白具有在人中表达的原弹性蛋白同种型的序列。在该实施方案中，该同种型可以选自SHEL(参见WO1994/14958)和SHELδ26A(参见WO1999/03886)以及这些同种型的蛋白酶抗性衍生物(参见WO2000/0403)。
通常原弹性蛋白同种型是SHELδ26A，其中组织为人皮肤组织。
可以以组合物形式提供原弹性蛋白同种型，所述组合物适于原弹性蛋白在组织中的持续释放。当组织是人皮肤组织时，优选地组合物包含SHELδ26A和用于使来自组合物之原弹性蛋白持续释放的选自以下的成分：透明质酸、糖胺聚糖、胶原蛋白I型。
通常用于施用的包含原弹性蛋白的组合物不含有用于弹性纤维形成的外源性因子，尤其是赖氨酰氧化酶。
在某些实施方案中，根据处理方案以基本上单体形式提供原弹性蛋白。
在某些实施方案中，根据处理方案以基本上缺乏分子内交联之形式提供原弹性蛋白。
在某些实施方案中，根据处理方案在组合物中提供原弹性蛋白，所述组合物由原弹性蛋白和用于原弹性蛋白的溶剂(例如，水溶液)组成。优选地原弹性蛋白是SHELδ26A。
在某些实施方案中，根据处理方案在组合物中提供原弹性蛋白，所述组合物基本上由原弹性蛋白组成。在一个实施方案中，原弹性蛋白是SHEL626A。
在某些实施方案中，处理物包含原弹性蛋白和透明质酸。
在某些实施方案中，组合物中的原弹性蛋白可以与衍生的透明质酸(HA)交联。根据本发明将原弹性蛋白与分子(例如透明质酸)交联可以有助于在植入部位维持原弹性蛋白。组合物可以具有5至100mg/ml原弹性蛋白+0.1％至2％HA交联剂，优选10至50mg/ml原弹性蛋白和0.25％至1％HA交联剂。适合于本发明的制剂可以包含与0.25％至1％HA交联剂交联的10mg/ml至30mg/ml原弹性蛋白。
重要的是，原弹性蛋白与多糖(例如透明质酸)的交联不能导致或涉及分子内原弹性蛋白交联，例如与赖氨酰氧化酶发生的那些。更具体地，如果透明质酸被透明质酸酶(一种皮肤酶)溶解，那么原弹性蛋白之后可能以单体形式释放。
在某些实施方案中，处理物可以包括提高原弹性蛋白之利用的化合物。实例包括：
·双氯芬酸-一种抗炎剂(与光化角质(actinic keratose)减少有关，例如，参见Solaraze)
·Lys’lastine-促进弹性发生
·氨基酸Gly、Val、Ala、Pro-对应于75％的原弹性蛋白残基
·维生素C、E-维生素C有助于新胶原蛋白形成并且二者都是抗氧化剂
·防晒霜(sunscreen)-限制阳光诱导的蛋白水解
·化学增强剂-有助于组分穿过角质层
·在保湿润肤剂中调节pH-向皮肤提供pH；保湿与较老的皮肤相关
当组织是皮肤时，通常处理方案包括在限定的时间点施用原弹性蛋白。在任一时间点，可以存在同时的原弹性蛋白施用。
优选地，通过注射施用原弹性蛋白。
当组织是皮肤时，优选将原弹性蛋白施用到真皮。
在某些实施方案中，处理方案还可另外包括局部施用能够增强弹性纤维形成的物质。这样的物质会是本领域技术人员公知的并且可以包括但不限于莳萝(dill)提取物以刺激赖氨酰氧化酶表达(Cenizo等2006 Exp.Dermatol.15：574-81)；和基于铜和/或锌的乳膏以减少弹性纤维分解(Mahoney等2009 Exp.Dermatol.18：205-211)。
在一个实施方案中提供了为个体的皮肤提供弹性的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供个体；
-在个体的皮肤上限定处理区域，其中所述处理区域是待在其中提供弹性的皮肤区域；
-将原弹性蛋白组合物注射到处理区域内以在处理区域内建立原弹性蛋白的量，其相对于处理区域以外的皮肤是提高的；
-将处理区域内原弹性蛋白的量维持预定的时间段，从而为个体的皮肤提供弹性。
如在以下实例中描述的，所述方法能够使个体增加皮肤的厚度，同时维持或改善皮肤弹性。所述方法还能够改善皮肤弹性或者恢复或重建弹性特性，同时保持皮肤的平滑度(即避免粗糙)和自然外观。
通常个体是如本文所述的已经失去皮肤状态的成年个体。例如，皮肤处理区域的特征可以为光老化、皮肤松弛、皮下组织疏松、细胞外基质密度降低、皱纹和妊娠纹。成人可以为20岁至70岁的年龄，例如20岁至35岁的年龄或40岁至70岁的年龄。
如本文中所讨论的，优选根据本发明处理的皮肤可以位于面部、颈部或者上肢或下肢。处理区域可以包括相关位置的所有或部分皮肤。例如，当皮肤位于上肢，处理区域可以包括上肢的全部，或它的一部分(例如上肢的内侧面)。当皮肤位于面部，处理区域可以包括脸颊、眼睑、下巴等周围的所有或部分皮肤。
根据本发明，处理区域是其中弹性特性不理想(suboptimal)和/或需要改善或恢复的皮肤区域。该区域可以通过技术人员已知的任意种方法限定。其中最简单的是通过指明待处理区域的界限或边界来将无需处理的皮肤与需要处理的皮肤区域区分开。这可以例如使用区别待处理区域与无需处理区域的标志物(marker)、指示器、指南或印刷物(character)来完成，例如选择性地鉴别待处理区域的标志物，或者选择性地鉴别无需处理的区域的标志物。在一个实施方案中，可以通过鉴别一个或更多个适当建立处理区域之边界的坐标来限定待处理的区域。
一旦已经限定了处理区域，可以将原弹性蛋白组合物真皮内注射到位于处理区域内的皮肤。注射的目的是向处理区域建立或提供一定量的原弹性蛋白，其在处理区域中通常不存在。在此情形下，在处理区域中建立的原弹性蛋白的量高于位于处理区域外之相邻或邻近区域中原弹性蛋白的量。
根据处理区域的位置，可以将组合物注射到中等至深度的真皮。例如，相对于皮肤较薄的处理区域(例如，颈部、肩部或眼睛周围)，较深的注射可更适合于皮肤较厚的处理区域(例如面部的脸颊)。
应理解，在一些情况下，可以通过植入下皮层和向植入或注射部位招募弹性发生细胞来实现目的结果。
被递送组合物的体积部分地取决于待处理皮肤的位置。相比于面部，当皮肤位于肢体或颈部时，较大体积是更合适或可能的。各单次注射的体积可以为10μL至100μL，优选约20μL至50μL。所给予的处理物的总体积将取决于所提供的注射次数，其进而取决于待处理皮肤区域的大小和确定为适当的各注射部位之间的距离。
在本发明的一个特别优选的形式中，通过向处理区域重复注射原弹性蛋白，使期望量的原弹性蛋白在处理区域维持预定的时间段。这明显产生了向处理区域中的组织连续提供原弹性蛋白，使得处理区域维持用于原位弹性纤维形成之原弹性蛋白的未在处理区域以外发现的阈值水平。相信在处理过程期间(下文讨论)，这提高了细胞和因子与注射的原弹性蛋白相接触的可能性，从而使弹性纤维能够形成。
在某些实施方案中，通过经细针注射将原弹性蛋白组合物注射到中等至深度的真皮以施用处理物。可以使用规格为25G、优选27G或更小、更优选30G或31G的下皮层针进行注射。可以根据处理皮肤的应用手册使用单个注射器和针进行注射。
在某些实施方案中，单次处理可以包括向处理区域的多个注射。当每次处理需要多个注射时，这些注射可以间隔1mm至3cm。
在某些实施方案中，可以使用能够向皮肤真皮自动注射的装置(如美塑枪(Mesotherapy gun))或辅助注射装置(例如artiste注射装置(http：// www.nordsonmicromedics.com/se/google/en/artiste-assisted-injection- system.html)或anteis注射装置(http：//www.anteis.com/AestheticDermatology/ injectionsystem.php))进行注射。在某些实施方案中，可将注射器或自动注射装置与适配器一起使用，从而能够连结多个针头使得可以一次施用多于一个的注射。在某些实施方案中，可使用实心针系统(例如微针(dermal roller))或dermapen针刺系统(例如，如Kalluri，H.等2011，AAPS Journal 13：473-4841描述的)施加处理。
在各处理之间可以有约3天至168天的时期。各处理之间的通常时期可以包括3天至7天、3天至21天、14天至28天、21天至84天和3天至84天。总计可以有1次至24次或3次至6次处理。通常处理的时期不超过约1年，优选3周至6个月，优选约1个月至3个月。
优选的处理部位包括靠近或邻近脸颊、眼睛、颈部、肩部、手、疤痕组织、妊娠纹或者在其周围或内部的那些。
如本文所使用的，除非上下文另有要求，否则术语“包含”和该术语的变体(如“comprising”、“comprises”和“comprised”)并不旨在排除其他添加剂、组分、整数或步骤。
通过给定的实施例并参考附图，在前面段落中描述的本发明的其他方面和所述方面的其他实施方案将从以下描述中变得清楚。
应理解，在本说明书中公开和限定的本发明延伸至由文字或附图提到或明显的两个或更多个单个特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成本发明的多个替代方面。
实施例
实施例1弹性纤维合成的体外测定系统
材料与方法
a)细胞
b)细胞培养
在含有10％胎牛血清(FBS；Invitrogen)和1％(体积/体积)青霉素/链霉素(Invitrogen)的Dulbecco′s改良Eagle培养基高葡萄糖(DMEM；Invitrogen)中培养细胞。每2至3天更换培养基。细胞孵育在37℃和5％CO2下。为评估细胞形成弹性蛋白纤维的能力，将1×105个细胞接种到12孔培养板的盖玻片上。接种后10至17天对全长原弹性蛋白(Elastagen)或替代弹性蛋白衍生的蛋白质(PBS中)过滤灭菌，并添加到细胞培养物中。替代弹性蛋白衍生的蛋白质包括人皮肤弹性蛋白肽(Elastin Products Company；HSP72)、C端原弹性蛋白缺失构建体ΔRKRK(Weiss实验室)和含有RGDS的C端原弹性蛋白替换构建体(Weiss实验室)。还在50μM blebbistatin(Sigma)的存在下评估了纤维形成。为了实验评估重复添加原弹性蛋白的作用，在接种后第10、17和24天添加蛋白质。通过对在随机挑选的10个视野里从最上部的核到样品底部的需要成像之0.41μm z切片的数目求平均数确定了细胞基质厚度。
在原弹性蛋白添加后的设定时间点，将细胞用3％(重量/体积)甲醛或4％(重量/体积)多聚甲醛固定20分钟并用0.2M甘氨酸淬灭。将细胞用0.2％(体积/体积)的Triton X-100孵育6分钟，用5％牛血清白蛋白在4℃封闭过夜，并用1：500 BA4(Sigma)小鼠抗弹性蛋白一抗染色1.5小时，并用1：100的抗小鼠IgG-FITC二抗(Sigma)染色1小时。然后将盖玻片安装到具有ProLong Gold抗褪色(antifade)试剂和DAPI(Invitrogen)的玻片上。
c)荧光成像
样品用Olympus FluoView FV1000共聚焦显微镜可视化。本文示出的图像是通过z堆叠投影构建的。
结果与讨论
a)由源自不同年龄群体的人皮肤成纤维细胞形成弹性蛋白纤维
我们评估了在添加原弹性蛋白(SHELδ26A(即，不包含结构域26A的合成人弹性蛋白))后人皮肤成纤维细胞形成弹性蛋白纤维和网络的能力。图1显示向源自新生儿、10、31、51和92岁供体的皮肤成纤维细胞添加250μg/ml原弹性蛋白后7天的弹性蛋白形成。所有的细胞系均证实弹性蛋白纤维形成。在未添加原弹性蛋白的对照细胞培养物中未看到弹性蛋白形成(数据未示出)。如由细胞核(蓝色)数目增加示出的较年轻的供体细胞更广泛地增殖。当添加原弹性蛋白时，年轻的供体细胞产生大量的弹性蛋白网络。较老的供体细胞仍能够由添加的原弹性蛋白产生大量的弹性纤维，但是网络是较稀疏的(图1)。
b)由动物细胞形成弹性蛋白纤维
评估了在添加了250μg/ml原弹性蛋白后猪(Pig 10-10)和兔(RAB-9)皮肤成纤维细胞形成弹性蛋白纤维和网络的能力。如图2所示，这些动物细胞各自将原弹性蛋白沉积到基质中。但是，只有兔细胞能够产生弹性蛋白网络。人和动物种类之间原弹性蛋白的氨基酸序列差异可能是动物细胞效率较低、原弹性蛋白利用不同的原因(图2)。
c)由气道平滑肌细胞形成弹性蛋白纤维
我们评估了在添加原弹性蛋白后源自患病肺的原代人气道平滑肌细胞形成弹性蛋白纤维的能力。图3示出添加250μg/ml原弹性蛋白后7天的弹性蛋白形成。这些细胞的纤维形成程度不同：从最小量的原弹性蛋白小球沉积到弹性蛋白纤维网络(图3)。结果证实平滑肌细胞与图1中观察到的成纤维细胞相似，具有由外源性原弹性蛋白形成弹性纤维的能力，其他组织(例如脉管系统)的平滑肌细胞也会如此。
d)使用原弹性蛋白衍生物时的弹性蛋白纤维形成
我们使用3种替代弹性蛋白衍生的蛋白质评估了原代人新生儿成纤维细胞(NHF8909)形成弹性蛋白网络的能力。这些蛋白质是通过用人唾液弹性蛋白酶和两种原弹性蛋白同种型酶促水解人成年皮肤弹性蛋白制备的弹性蛋白皮肤多肽。原弹性蛋白在其C端含有模体GRKRK，我们已经示出其指导细胞与αvβ3整合素结合。在原弹性蛋白同种型ΔRKRK中，该模体的RKRK序列已经被移除。在同种型+RGDS中，RKRK序列已经被移除并被标准细胞结合结构域RGDS替代。在所有情况下在接种后12天向原代人新生儿皮肤成纤维细胞添加125μg/ml蛋白质。
图4显示所形成的弹性蛋白网络。当全长原弹性蛋白被添加到该培养物中时，观察到弹性蛋白纤维形成。反之，当将原弹性蛋白衍生物添加到该培养物中时，纤维形成显著受损。皮肤弹性蛋白肽不沉积进入基质。观察到ΔRKRK和+RGDS形式各自的小球而不是纤维沉积物。
e)细胞收缩力受损时的弹性蛋白纤维形成
我们通过在添加原弹性蛋白的同时向细胞培养物添加blebbistatin来研究了在弹性蛋白纤维形成中所需的细胞收缩力。Blebbistatin是非肌肉肌球蛋白II的抑制剂，其改变细胞收缩力和细胞迁移。图5示出在blebbistatin存在下弹性蛋白纤维形成大幅受损。
f)重复添加原弹性蛋白后的弹性蛋白纤维形成
我们评估了原代新生儿人皮肤成纤维细胞(NHF8909)由重复添加的原弹性蛋白形成弹性蛋白网络的能力。在接种后第10天、第10和17天以及10、17和24天向培养物添加了原弹性蛋白(250μg/ml)。在接种后第31天固定所有样品。图6示出重复原弹性蛋白处理的显著增加的弹性蛋白网络形成。这导致细胞基质厚度增加，其中接种后31天不添加原弹性蛋白的样品厚度为13.4±2.2μm，进行一次和两次原弹性蛋白添加的样品厚度分别为15.3±1.2μm和16.9±0.8μm，进行三次原弹性蛋白添加的样品厚度为19.0±2.2μm。
g)体外形成之纤维的弹性
在补充有10％(体积/体积)胎牛血清和1％(体积/体积)青霉素/链霉素的DMEM(Invitrogen，11995)中，将人真皮成纤维细胞以20,000细胞/cm2的密度接种到WillCo玻璃底培养皿上。在接种后第12天，将PBS中250μg/mL原弹性蛋白添加到成纤维细胞培养物中。每2天更换培养基。在接种后第19天，用BioScope Catalyst原子力显微镜分析了样品。使用成熟弹性蛋白纤维的固有自身荧光指明其在培养物中的位置。未添加原弹性蛋白的时间匹配的对照样品不表现自身荧光(图7)。形貌/弹性模量的作图表明原弹性蛋白添加后培养物弹性改变(图8，黄色区域)，如通过细胞间物质主要区域具有～600kPa的杨氏模量所证明的，与弹性纤维的形成一致。未纯化的天然弹性蛋白具有～600kPa的杨氏模量。
h)用于弹性纤维形成的时间过程
在补充有10％(体积/体积)胎牛血清和1％(体积/体积)青霉素/链霉素的DMEM中，将人真皮成纤维细胞以20,000细胞/cm2的密度接种到玻璃盖玻片上。接种后第10-12天，将PBS中250μg/mL原弹性蛋白添加至成纤维细胞培养物中。每2天更换培养基。在添加原弹性蛋白后的设定天数(通常1、3和7天)，将细胞用4％(重量/体积)多聚甲醛固定20分钟并用0.2M甘氨酸淬灭。将细胞用0.2％(体积/体积)的Triton X-100孵育6分钟，用5％牛血清白蛋白在4℃封闭过夜，并用1：500 BA4小鼠抗弹性蛋白抗体染色1.5小时，用1：100抗小鼠IgG-FITC抗体染色1小时。然后将盖玻片安装到具有ProLong Gold抗褪色试剂和DAPI的玻片上。将样品用Olympus FluoView FV1000共聚焦显微镜可视化。进行Z堆叠并转化成压缩投影图像。
该体外细胞培养物模型系统显示添加原弹性蛋白后，蛋白质作为小球沉淀到ECM中(图9a)。随后的纤维形成初始沿细胞的方向排列(图9b)，之后产生广泛的分支弹性网络(图9c)。
i)赖氨酰氧化酶的参与
研究了该系统中赖氨酰氧化酶抑制剂BAPN对弹性纤维形成的作用。
如所述的，在添加原弹性蛋白前真皮人成纤维细胞生长12天。将细胞在原弹性蛋白添加后继续培养72小时。在相对于原弹性蛋白添加的多个时间点添加BAPN。如上所述地对样品弹性蛋白和细胞核染色。包含BAPN允许一些小球沉淀到ECM中，但阻止纤维形成(图10)，表明细胞在由原弹性蛋白形成弹性纤维期间利用赖氨酰氧化酶。
j)小球的排列(Alignment)
在体外模型系统中使用超分辨率显微镜进一步研究了弹性纤维形成。如所述的，培养人真皮成纤维细胞并在添加原弹性蛋白后3天固定。将细胞用1\500 BA4小鼠抗弹性蛋白抗体染色1.5小时，并用1\100抗小鼠IgG-AlexaFluor 488抗体染色1小时。将样品用Leica SP5 cwSTED显微镜可视化。
向12天龄真皮成纤维细胞培养物添加原弹性蛋白后3天发现了排列中的小球(图11)。小球示出带有抗体的点状修饰。小球平均直径为605±97nm。
k)小球的处理
在基本上如所述的体外模型系统中，还使用了透射电子显微镜进一步研究弹性纤维形成。在向12天龄真皮成纤维细胞培养物添加原弹性蛋白后3天处理样品。生长在弹性蛋白上的细胞用PBS缓冲液中2％戊二醛于4℃后固定(post-fixed)1小时，并用0.1％四氧化锇在黑暗中于4℃再次后固定10分钟，并且立即用蒸馏水清洗两次，每次5分钟。随后样品通过一系列梯度的乙醇脱水每次10分钟(即，70％、80％和90％以及2次的100％)。用下述混合物和孵育时间实现Epon(树脂)对试样的浸润(infiltration)：含25％Epon的乙醇4小时，含50％Epon的乙醇过夜，以及室温下100％Epon更换两次(每次8小时)。当树脂浸润完成时，使用Kobayashi K.等(2012)的双聚合法将样品包埋。对所产生的含有包埋细胞的封闭面进行修剪，并经超薄切片机(Leica，Ultracut-7)产生超薄切片，得到约70nm的切片，其被放置在200目铜网上。切片用2％醋酸铀酰(uranyl acetate)水溶液和Reynolds’s柠檬酸铅各染色10分钟，并且在步骤之间用水彻底地清洗以使染色沉积最小化。使用JEOL 2100 TEM(JEOL，Japan)在200kV使切片成像。
观察到3种不同的含弹性蛋白的结构(图12)：
(1)被稠密的壳包围的小球，其平均直径为615±153nm。这些小球直接与细胞接触。
(2)破裂的小球，溢出其内含物。
(3)由合并破裂的小球形成的弹性物块。
弹性材料与细胞和细胞突起物的紧密结合表明机械力破坏了小球。
l)动物模型
检验了含有原弹性蛋白的真皮模板和薄分层皮肤移植(thin split skingrafting)对弹性蛋白纤维形成的作用。在该研究中使用了两只猪。在第0天施加以下皮肤替代物。
1.对照：单独的交联胶原蛋白模板
2.测试A：在10％原弹性蛋白存在下交联的交联胶原蛋白模板
3.测试B：施加到与经修饰HA交联的原弹性蛋白基质顶部的交联胶原蛋白模板
在第0天，在每只猪的上背部建立4处切除伤口(excisional wound)(5cm直径)。一侧的两处伤口用对照覆盖。另一侧的一处伤口用测试A处理，另一伤口用测试B处理。在第7天(1周)，给所有伤口更换敷料。在第14天(2周)，采集距离伤口边缘数毫米远的4mm活检物。在第21天(3周)，在所有伤口上进行薄分层皮肤移植并更换敷料。在第28天(4周)，给所有伤口更换敷料。在第35天(5周)，对动物进行安乐死，并采集伤口组织和正常皮肤。活检物用福尔马林固定并包埋在石蜡中。
通过切片的Verhoeff van Gieson染色评估弹性蛋白纤维形成(图13)，其使得弹性蛋白纤维呈紫色/黑色。在正常猪皮肤(被圈出)中看到弹性蛋白纤维环绕毛囊。
简言之，零星地观察到纤维在对照样品的真皮中偶尔出现。
实验A样品的活组织检查后，来自伤口部位的组织展示出纤维形式的新的(denovo)弹性蛋白和纤维的集合物(collection)(例如，用黑色圆圈突出的区域)。
实验B样品的活组织检查后，来自伤口部位的组织展示出与经修饰HA交联的持续原弹性蛋白基质(例如，用黑色圆圈突出的区域)和新的弹性蛋白纤维形成(例如，用白色圆圈突出的区域)。
实施例2.用于评估使用弹性蛋白可注射皮肤更新产品处理人皮肤的临床研究
方法：
相对于Restylane Vital Light(RVL-12mg/ml与BDDE交联的透明质酸，Q-Med，澳大利亚)，使用与衍生的透明质酸轻度交联的原弹性蛋白制剂(如PCT/AU2011/001503中描述的，特别是实施例3和实施例6)进行临床研究。参与者在上臂的内侧皮肤上接受处理，该处理通过细针注射将产品植入到真皮中。选择上臂用于研究是因为该皮肤区域不通常暴露于阳光并因此作为健康未受损皮肤组织存在。该研究旨在评估该产品对皮肤厚度和质地(包括弹性)的影响，并收集患者对受处理皮肤部位的外观、自然性(naturalness)和平滑度的主观反馈。
健康的对象被招募到本研究中，并且在筛选期之后，16名满足进入要求的对象被招入并随机分配在一只手臂上接受用一系列原弹性蛋白制剂(ELAPR002：10-30mg/ml与衍生的透明质酸交联的原弹性蛋白)之一的处理，在另一只手臂上用对照Restylane VitalLight(RVL-12mg/ml与BDDE交联的透明质酸)处理。所有对象在相同的处理部位接受3次这样的处理，相隔3周。每次处理由使用30Gx1/4”针递送的20-30μl产品的多个注射组成，每个注射间隔约1cm，以网格形式覆盖上臂区域。
每次访问时，对象会被问到涉及受处理部位皮肤的平滑度、自然性和外观的问题并且被要求经视觉模拟评分法(Visual Analogue Scale，VAS)通过在0-100的范围作出评价来提供反馈(0是不十分平滑、自然或不良的外观，100是十分平滑、自然和良好的外观)。分别使用皮肤扭力计(Dermal Torque Meter，DTM)和皮肤卡尺(skin caliper)进行皮肤弹性和皮肤厚度的测量。在3个月和6个月时进行活组织检查切片的组织病理学以评估植入物的持续性，并通过Verhoff Van Giesen(VVG)染色评估处理部位弹性蛋白含量的水平。
结果：
植入部位的组织病理学分析：
通过VVG评估的皮肤部位揭示了用RVL处理的皮肤区域示出真皮变化，包括真皮胶原蛋白纤维被植入材料拉伸并铺展分离，如通过图14A中主要的未染色细胞外空隙所示。相反，用ELAPR002处理的皮肤区域显示与皮肤组织融为一体的植入材料，表明植入材料重塑进入弹性蛋白，如通过植入材料在VVG染色下从蓝色过渡到紫色至黑色所证明的。因此，明显的是原弹性蛋白的施用提供了原位组装和弹性纤维的沉积，与在弹性发生中观察到的非常相似(图14B)。
皮肤厚度和粗糙(Lumpiness)的测量
进行研究的临床医生通过使用皮肤卡尺测量了处理部位的皮肤厚度。表1示出在基线和3个月时测量经RVL和ELAPR制剂处理之部位的平均皮肤厚度。对于RVL和弹性蛋白制剂二者，发现皮肤厚度的增加是显著的(p＜0.001)。
表1.皮肤厚度测量
时间/产物 RVL ELAPR002i ELAPR002ii
基线皮肤厚度(mm) 1.66 1.51 1.6
3个月时皮肤厚度(mm) 2.55 1.95 2.28
在本研究的16名患者中，所有16只被RVL处理的手臂呈现肿块(lump)，其在3个月时是可见的并且可以被研究者感受到。相反，用ELAPR002制剂处理的16只手臂中仅一只在3个月呈现任意的肿块。由此，对RVL的皮肤厚度测量很大程度上是测量皮肤中RVL的肿块，而ELAPR002处理部位的测量更精确地反映整个处理区域的一般皮肤厚度的增加。
皮肤弹性的测量
贯穿临床研究的整个时期，在每次评估访问时使用DTM对经处理的皮肤部位进行皮肤的弹性延伸测量(Ue)。
在表2中提供了对于RVL和ELAPR002i在基线和6个月的平均Ue得分。从表中的数据可以看出，用RVL处理的皮肤部位表现出弹性延伸之能力的降低(处理后Ue降低)，这表明用RVL处理导致的皮肤厚度增加使皮肤更僵硬。相反，用原弹性蛋白植入物处理的皮肤区域维持了弹性延伸的能力(Ue保持相对稳定)，这表明实现皮肤厚度增加的同时维持皮肤的弹性性质。
表2：皮肤弹性延伸(Ue)
时间/产物 RVL ELAPR002i
基线的平均Ue(°) 5.07 4.93
6个月的平均Ue(°) 3.85 4.55
患者评估
在表3中提供了对于用RVL和ELAPR002ii处理的皮肤部位的经处理皮肤区域平滑度、自然性和外观之患者视觉模拟评估的平均得分。数据示出与用RVL处理的那些相比，患者高度评价了用原弹性蛋白制剂处理的皮肤部位的平滑度、自然性和外观(得分较高表示积极评价)。
安慰剂/制剂 RVL ELAPR002ii
基线平均皮肤平滑度 74.9 68.6
6个月平均皮肤平滑度 48.9 81.1
基线平均皮肤自然性 84.8 79.8
6个月平均皮肤自然性 51.9 83.1
基线平均皮肤外观 82.9 74.9
6个月平均皮肤外观 43.6 82.0

Claims (18)

1.为个体的皮肤提供弹性的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供个体；
-在所述个体的皮肤上限定处理区域，其中所述处理区域是待在其中提供弹性的皮肤区域；
-将原弹性蛋白组合物注射到所述处理区域内的皮肤组织中以在所述处理区域内建立原弹性蛋白的量，其相对于所述处理区域以外的皮肤是提高的；
-将所述处理区域内所述原弹性蛋白的量维持预定的时间段，
从而为所述个体的皮肤提供弹性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述原弹性蛋白组合物适于在所述处理区域内的皮肤组织中持续释放原弹性蛋白，从而将所述处理区域内原弹性蛋白的量维持预定的时间段。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述原弹性蛋白组合物包含0.5至200mg/mL的量的原弹性蛋白。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原弹性蛋白组合物包含原弹性蛋白和透明质酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原弹性蛋白与透明质酸连接。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含0.5至50mg/mL原弹性蛋白和0.1％至1％透明质酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物是由原弹性蛋白组成的含水组合物。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述组合物是由原弹性蛋白和透明质酸组成的含水组合物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中原弹性蛋白组合物的每次注射体积为约10至100μL。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述原弹性蛋白组合物根据预定的处理时间表注射到所述处理区域内的皮肤组织中，所述处理时间表限定处理的具体次数，每次处理以注射形式在具体时间点进行，从而将所述处理区域内原弹性蛋白的量维持预定的时间段。
11.根据权利要求10所述的方法，其中至少一次处理包括多个注射。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述处理中的每个注射在与其他注射部位间隔预定距离的注射部位进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中每一注射部位与其他注射部位间隔约10mm至3cm。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述时间表包括每2至8周向处理区域进行注射。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述时间表历经约1至6个月的时期，优选约1至3个月的时期。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮肤是20至70岁年龄之个体的皮肤。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理部位靠近或邻近脸颊、眼睛、颈部、肩部、手、疤痕或妊娠纹，或者在其周围或内部。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮肤的特征在于光老化、松弛、皮下组织疏松、皱纹、疤痕或妊娠纹。
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