CN102166376A - 眼用载药羊膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种眼用载药羊膜,包括纤维蛋白胶,新鲜羊膜或保存羊膜,其特征在于还有载加替沙星的壳聚糖纳米粒子;其制备方法由制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液、制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉和制备载药羊膜三步过程组成。用本发明方法制得的眼用载药羊膜产品,其加替沙星、壳聚糖纳米粒子、纤维蛋白胶和羊膜相互能发挥协同增效作用和多重缓释作用,可延长所含药物的释放,使药物通过羊膜施用能维持较长的局部有效浓度,避免频繁地用药;它具有变态反应率低、组织相容性好、没有毒副作用、可逐步吸收、修复创面、填补空腔、有利于伤口愈合和无需手术取出药物缓释载体等优点。
Description
技术领域
本发明属于医疗用的敷贴或移植生物材料,具体涉及一种眼科用的载药羊膜及其制备方法。
背景技术
眼表疾病,包括翼状胬肉、角膜炎、角膜穿孔、眼表化学烧伤、眼表外伤等是眼科的常见病,常导致患者视力下降。对其采取积极有效的治疗措施,在防盲治盲的工作中有着重要的意义。常规的治疗方法是点眼药或者眼药联合手术敷贴或移植新的膜性材料,以修复眼表;目前用于眼表的生物材料主要是羊膜,单纯的羊膜敷贴或移植在手术过程中存在易卷曲的特性,因此羊膜多是采用缝合的方式固定在眼表,有时为了达到一定的治疗效果还会将眼睑缝合,这就妨碍了其他药物的继续使用;即便是在不需眼睑缝合的病例,由于手术后频繁的需要开睑点药,病人的依从性不是很好,也导致药物的使用率不高,而且,病人自身不当的点药有可能会引起继发感染。因此,近年来,国内外学者积极探索怎样提高药物利用度以及如何延长药物的作用时间。目前研究的比较多的是:一、将药物制备成纳米药物,提高药物的眼表穿透性和药物在眼表的停留时间,但纳米眼药仍然存在需要频繁滴药的问题;二、增加储药系统,即将药物放在一定载体上,通过药物的释放而达到治疗目的,但一般的载体由于不是生物活性膜,因此不能承受手术缝线的牵拉,不易固定在眼表。在现有技术中,有一件发明名称为“药物羊膜及其制备方法”的中国发明专利申请于2007年9月26日公开(CN101040616A),该药物羊膜含有外源性细胞生长因子,其制备方法是通过将羊膜浸没于含有外源性细胞生长因子的保存液中,经深低温冷冻保存或冷冻干燥制得;它可以使羊膜在长期保存后具有生物活性,还可在使用时将从保存液中吸收的外源性细胞生长因子缓释到创面上,有利于创伤愈合,据称它可用于眼科创伤的修复;但是它的制备方法采用的是浸泡方式,在羊膜中所含的外源性生长因子的含量不稳定,而且量不易掌握,重复性较差,因此制得的药物羊膜很难具有药物长效缓释作用。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷或不足,本发明的目的是,提供一种使用安全、含有治疗药物、兼具药物长效缓释作用及良好生物活性的眼用载药羊膜;另一目的是提供这种眼用载药羊膜的制备方法。
本发明所采取的技术方案如下。
一种眼用载药羊膜,包括纤维蛋白胶,新鲜羊膜或保存羊膜,其特征在于还有载加替沙星的壳聚糖纳米粒子;纤维蛋白胶:载加替沙星的壳聚糖纳米粒子的重量份配比=10:0.04~0.06 ;在制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液时所需原料组分的重量百分配比是加替沙星 8 ~35、壳聚糖 15~48、冰醋酸 25~64、多聚磷酸钠 3~25;制得的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子,其粒径为100~300nm,包封率为65-75%。
上述眼用载药羊膜的制备方法由以下三步过程组成:
1、制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液
按照制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液时所需原料组分的重量百分配比量,先将壳聚糖溶于浓度为1.5~3.0mg/ml的冰醋酸中,使壳聚糖的浓度为1.0~2.0mg/ml,再将多聚磷酸钠溶液滴加到均匀搅拌下的壳聚糖醋酸溶液中,最后将加替沙星加入到该壳聚糖醋酸溶液中,充分搅拌至溶解,使加替沙星浓度为0.5~1.5mg/ml,即制得粒径为100~300nm的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液;
2、制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉
将第1步所制备的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液在5000r/min转速和 4℃温度下离心分离至少30分钟,再将分离掉上清液的部分置于-20℃冰箱冷冻至少5小时,转移至真空冷冻干燥机中在≦-50℃下真空冷冻干燥至少5小时获得粒径为100~300nm纳米粒子干粉,最后将纳米粒子干粉射线消毒;
3、制备载药羊膜
将第2步所制备的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉按纤维蛋白胶:载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉的重量份配比=10:0.04~0.06 , 加入到纤维蛋白胶中混匀,使加替沙星的浓度达到3mg/ml,再通过双枪管喷涂于带上皮的新鲜羊膜或保存羊膜基底面,用玻璃压贴器使其分布均匀,控制喷涂厚度在0.2~1.0mm,制得眼用载药单层胶联羊膜;或者再在该纤维蛋白胶上方覆盖一层带上皮的新鲜羊膜或保存羊膜羊膜,使得纤维蛋白胶被夹在两层羊膜之间,制得眼用载药双层胶联羊膜;在 25~35℃干燥10min-2h直接使用,或在-20℃无菌密封避光保存备用,使用时常温解冻即可。
本发明的眼用载药羊膜制备方法,能将加替沙星融合到壳聚糖纳米粒子中,并通过纤维蛋白胶负载在单层羊膜或双层羊膜上,使羊膜中富含药物,且含量可控、稳定,重复性好,完全克服了现有技术采用浸泡方式存在的缺陷。用本发明方法制得的本发明眼用载药羊膜产品,经体外实验和动物实验证明:其加替沙星、壳聚糖纳米粒子、纤维蛋白胶和羊膜相互能发挥协同增效作用和多重缓释作用,可延长所含药物的释放时间,使药物通过羊膜施用能维持较长的局部有效浓度,避免频繁地用药;它具有变态反应率低、组织相容性好、没有毒副作用、可逐步吸收、修复创面、填补空腔、有利于伤口愈合和无需手术取出药物缓释载体等优点。
具体实施方式
下面用制备实例来具体说明本发明的眼用载药羊膜的技术方案;同时,用体外试验、毒理试验、动物实验的试验例来验证本发明的有益效果。但是所举制备实例和试验例旨在进一步说明本发明的技术方案及其有益效果,并非是对本发明的限定。
制备实施例
实施例一 载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜的制备
1、制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液
称取0.2g壳聚糖溶于200ml浓度为1.5mg/ml冰醋酸溶液中搅拌均匀,将0.2g多聚磷酸钠添加到该壳聚糖醋酸溶液中,使其浓度为1.0mg/ml,搅拌均匀,搅拌速度700-800r/min,反应时间为半小时,再将300mg加替沙星原料药加入,搅拌均匀,即制得粒径为100~300nm的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液;
2、制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉
将按1所制得的加替沙星壳聚糖纳米粒子混悬液进行离心(5000r/min,30min,4℃,)去掉上清液,将剩余部分置于-20℃冰箱冷冻过夜。于真空冷冻干燥机(-53℃,0.073负压,5h)中获得粒径为100~300nm纳米粒子干粉,将纳米粒子干粉射线消毒;
3、制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜
将第2步所制备的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉按纤维蛋白胶:载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉的重量份配比=10:0.05 ,加入到纤维蛋白胶中混匀,使加替沙星的浓度达到3mg/ml,再通过双枪管喷涂于带上皮的新鲜羊膜或保存羊膜基底面,用玻璃压贴器使其分布均匀,控制喷涂厚度在0.2~1.0mm,制得眼用载药单层胶联羊膜;或者再在该纤维蛋白胶上方覆盖一层带上皮的新鲜羊膜或保存羊膜羊膜,使得纤维蛋白胶被夹在两层羊膜之间,制得眼用载药双层胶联羊膜;为使药胶与羊膜粘合更紧密,按上述方法制备好的载加替沙星壳聚糖纳米粒子胶联羊膜,在25-35℃下干燥10min-2h,即可投入使用;也可装入无菌空瓶中,密封避光-20℃保存备用,使用时常温下复温。使用时,用羊膜环切刀或相应环钻切取所需大小的胶联羊膜药膜片,并揭去羊膜贴纸,缝合或敷贴至创面即可。
实验例及分析
[实验例一] 载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜的体外抑菌实验
方法:采用改良的琼脂扩散法。按照实施例一的方法,无菌条件下制备浓度为3mg/ml载加替沙星的壳聚糖纳米粒胶联羊膜(直径3mm,高0.5mm)。另用载普通加替沙星粉针制备浓度为3mg/ml加替沙星-纤维蛋白胶药物羊膜(直径3mm,高0.5mm)作为对照组。受试菌株为肺炎链球菌(临床菌株),金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌标准菌株。将受试菌株接种于琼脂平皿上,接种菌量为105 cfu/ml;将制备好的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜及载普通加替沙星-纤维蛋白胶药物羊膜分别置于琼脂平皿表面,置35℃孵箱培养24h后,测量各组细菌平板抑菌圈直径,同时将载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜及载普通加替沙星-纤维蛋白胶药物羊膜分别置于另一载有受试菌株的琼脂平皿上,24h后再次重复上述步骤,以此循环观察载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜制备后1d,2d,3d,4d,5d的抑菌情况。共进行5次平行实验。
结果:载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜与对照组载普通加替沙星-纤维蛋白胶药物羊膜在制备后第1d,2d,3d对三种细菌均有明显的抑菌作用,且差异无显著性(p>0.05);在第4d,5d时对照组抑菌作用明显减弱,抑菌圈明显缩小,而载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜仍有较强的抑菌作用,差异有显著意义(p<0.05)。
[实验例二] 载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜移植后兔房水药物浓度测定
方法:按照实施例一的方法无菌条件下制成浓度3mg/ml载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜。新西兰大白兔30只,随机分为6组,每组5只。左眼为对照眼,右眼为实验眼,实验眼予以直径20mm载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜片缝合固定于角巩膜缘,对照眼滴入浓度3mg/ml加替沙星滴眼液,共4次每小时1次。分别于实验眼术后6h及对照眼最后一次滴眼后2h、1d、2d、3d、4d、5d双眼同时抽取兔眼房水0.2ml, 高效液相色谱法检测实验眼和对照眼家兔房水中加替沙星浓度;结果:实验眼各时间点房水中均可测出加替沙星,其中术后6h、1d、2d、3d房水中加替沙星浓度分别为0.203±0.003??g/ml、0.274±0.004??g/ml、 0.201±0.004??g/ml、 0.177±0.003??g/ml,第4、5天房水浓度有所降低,为0.112±0.001??g/ml、0.056±0.002??g/ml。对照眼当日(最后一次点眼后2小时)房水浓度为0.291±0.002??g/ml,略高于实验眼6h后房水浓度,对照眼第1d房水中加替沙星浓度为0.034±0.001??g/m,显著低于实验眼第1d房水中浓度,差异有显著意义(P<0.01),对照眼第2、3、4、5天房水中已检测不到加替沙星。
结果提示,加替沙星眼液需要较频繁点眼(每日4次以上),房水中才能检测到一定浓度,而载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜一次性移植即可在超过5天内检测到有效浓度,该药膜的缓释效应是明显的。
[实验例三]载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜治疗细菌性角膜炎的实验
方法:建立兔角膜细菌性角膜溃疡感染模型(细菌为金葡菌),分为生理盐水组、加替沙星滴眼液组、载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜移植组和无药单层羊膜移植组,前二组每日点眼4-6次共7天,后二组一次性移植不用其他眼液,观察各组治疗效果及溃疡愈合的时间,并通过大体、裂隙灯观察,细菌培养试验和组织病理学检查比较各组治疗效果。
结果:加替沙星滴眼液组有1例角膜穿孔,其余在10-14天愈合;载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜移植组无穿孔,角膜溃疡在7-10d愈合,溃疡处形成角膜白斑,其余角膜透明,细菌培养阴性,组织病理学检查角膜上皮形成,实质层见少量中性白细胞,生理盐水组有2例穿孔,无药单层羊膜移植组有1例穿孔,未穿孔眼溃疡愈合天数为16±3.7d,溃疡愈合后形成灰白色较大混浊斑,并有新生血管形成,细菌培养两组中2例阳性,其余为阴性,组织病理学检查角膜上皮虽然修复,但不平整,实质层较多中性白细胞。
通过上述体外实验和动物实验说明,本发明的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子胶联羊膜生物安全性高,治疗效果好。它同时具有抗菌和促进组织生长修复、抑制新生血管和瘢痕生长等功效。
Claims (2)
1. 一种眼用载药羊膜,包括纤维蛋白胶,新鲜羊膜或保存羊膜,其特征在于还有载加替沙星的壳聚糖纳米粒子;纤维蛋白胶:载加替沙星的壳聚糖纳米粒子的重量份配比=10:0.04~0.06 ;在制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液时所需原料组分的重量百分配比是加替沙星 8 ~35、壳聚糖 15~48、冰醋酸 25~64、多聚磷酸钠 3~25;制得的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子,其粒径为100~300nm,包封率为65-75%。
2.一种如权利要求1所述眼用载药羊膜的制备方法,其特征在于由以下三步过程组成:
1) 制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液
按照制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液时所需原料组分的重量百分配比量,先将壳聚糖溶于浓度为1.5~3.0mg/ml的冰醋酸中,使壳聚糖的浓度为1.0~2.0mg/ml,再将多聚磷酸钠溶液滴加到均匀搅拌下的壳聚糖醋酸溶液中,最后将加替沙星加入到该壳聚糖醋酸溶液中,充分搅拌至溶解,使加替沙星浓度为0.5~1.5mg/ml,即制得粒径为100~300nm的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液;
2) 制备载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉
将第1步所制备的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子混悬液在5000r/min转速和 4℃温度下离心分离至少30分钟,再将分离掉上清液的部分置于-20℃冰箱冷冻至少5小时,转移至真空冷冻干燥机中在≦-50℃下真空冷冻干燥至少5小时获得粒径为100~300nm纳米粒子干粉,最后将纳米粒子干粉射线消毒;
3) 制备载药羊膜
将第2步所制备的载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉按纤维蛋白胶:载加替沙星的壳聚糖纳米粒子干粉的重量份配比=10:0.04~0.06 ,加入到纤维蛋白胶中混匀,使加替沙星的浓度达到3mg/ml,再通过双枪管喷涂于带上皮的新鲜羊膜或保存羊膜基底面,用玻璃压贴器使其分布均匀,控制喷涂厚度在0.2~1.0mm,制得眼用载药单层胶联羊膜;或者再在该纤维蛋白胶上方覆盖一层带上皮的新鲜羊膜或保存羊膜羊膜,使得纤维蛋白胶被夹在两层羊膜之间,制得眼用载药双层胶联羊膜;在 25~35℃干燥10min-2h直接使用,或在-20℃无菌密封避光保存备用,使用时常温解冻即可。
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