CN108546672A - 一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用 - Google Patents

一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用，包括：将健康异育银鲫尾鳍的尾鳍剪下，用75％的酒精消毒处理后剪成大小为1‑2mm3的组织块，均匀移植到培养瓶并将培养瓶翻转，置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL完全培养液，细胞汇合至95％以上时加入1mL胰蛋白酶消化液，部分细胞脱落后用完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2传代培养，细胞传至10代后将完全培养液的胎牛血清浓度降至10％，再按照上述步骤继续传代培养至细胞系稳定传代；上述异育银鲫尾鳍细胞系能无限传代增殖，可用于分离和鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型。

Description

一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于淡水鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用。
背景技术
利用细胞株来鉴定和分离敏感病毒株是世界动物卫生组织推荐的最有效的病原分离和鉴定方法，建立不同种类的鱼类细胞株可为病毒分离和鉴定提供丰富的生物学材料，也为病毒的疫苗研究奠定基础。目前，已构建的异育银鲫细胞系只有异育银鲫脑细胞系(专利号为US 9598671B2)，严重制约了异育银鲫研究的进展。至今为止，只有两株对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的细胞系，一株是金鱼尾鳍细胞系，另外一株是异育银鲫脑细胞系。现有技术中还没有异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，能用于分离鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型的细胞系也很少，长时间缺少敏感细胞系制约了鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒学的研究进展。
发明内容
本发明的发明人经过广泛而深入的研究后发现，异育银鲫尾鳍细胞系是一种能无限传代并可用于鲤疱疹病毒Ⅱ型增殖的永生细胞系。为克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法；本发明的第二目的还在于提供上述异育银鲫尾鳍细胞系在分离和鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型上的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，包括以下步骤：
(1)原代培养：将健康异育银鲫的尾鳍剪下，用75％酒精消毒处理30s，PBS缓冲液洗三遍，再用镊子轻轻刮除表面黏液，PBS缓冲液洗三遍，然后剪成大小为1-2mm3的组织块，均匀移植到培养瓶，然后将培养瓶翻转，置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL上述完全培养液；
(2)传代培养：在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞汇合至95％以上时加入1mL胰蛋白酶消化液，有部分细胞脱落后用上述完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2(v/v)分瓶传代培养，待细胞传至10代后，将完全培养液的胎牛血清浓度降至10％；然后按照上述步骤继续传代培养，至细胞系稳定传代。
步骤(1)中，所述组织块的预处理过程具体为：剪取健康异育银鲫尾鳍，置于含有75％酒精的烧杯中浸泡处理30s，然后用1×PBS缓冲液洗三遍，再用镊子轻轻刮除表面黏液，PBS缓冲液洗三遍，在无菌环境中将清洗后的尾鳍剪成大小为1-2mm3的组织块。
进一步地，步骤(1)中，所述完全培养液为15％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的M199培养液。
进一步地，步骤(1)中，所述培养瓶为25cm2的一次性培养瓶。
进一步地，步骤(2)中，所述消化液为质量浓度0.05％的胰蛋白酶消化液。
本发明的第二方面还在于通过上述构建方法得到的异育银鲫尾鳍细胞系。
进一步地，所述的异育银鲫尾鳍细胞系核型为三倍体。
本发明的第三方面，在于上述异育银鲫尾鳍细胞系在分离和鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型上的应用，具体过程为：从患病的异育银鲫肾脏和脾脏中匀浆提取病毒悬液，然后用病毒悬液孵育细胞，每过24h显微镜下观察一次，记录细胞形态变化；90％的细胞出现病变效应时收获细胞，-80℃下反复冻融三次，然后在转速为5000rpm、温度为4℃离心30min，取上清连续传代20次，再分别利用PCR和实时荧光定量PCR法鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型。
与现有技术相比，本发明的特点在于：
一、本发明的构建方法得到的异育银鲫尾鳍细胞系(命名为GiCF)，原代培养的异育银鲫尾鳍细胞形态多样，主要呈上皮样细胞和纤维样细胞特点，稳定传代后细胞呈纤维样细胞特点；且该细胞系在20-30℃温度范围内均可生长，最适生长温度为25℃，染色体数目分布在140-166之间，3n＝156为三倍体。
二、用从患病异育银鲫肾脏和脾脏中提取的病毒悬液感染异育银鲫尾鳍细胞系，7天后细胞出现明显的病变现象，细胞收缩、变圆、脱落和细胞质空泡化；病毒传至20代后，感染特征依然稳定，证明异育银鲫尾鳍细胞系对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感，可用于鲤疱疹病毒Ⅱ型的分离和鉴定。
附图说明
图1为原代培养和传代培养的异育银鲫尾鳍细胞；其中，A：第一代的异育银鲫尾鳍细胞；B：第5代的异育银鲫尾鳍细胞；C：第20代的异育银鲫尾鳍细胞；D：第40代的异育银鲫尾鳍细胞，bar＝200mm；
图2为第30代异育银鲫尾鳍细胞在20℃、25℃和30℃条件下的生长特性分析；
图3为线粒体16S rRNA鉴定异育银鲫尾鳍细胞的PCR结果图；
图4为第30代异育银鲫尾鳍细胞的核型分析；其中，A：第30代异育银鲫尾鳍细胞染色体中期分裂相；B：第30代异育银鲫尾鳍细胞的染色体数分布情况；
图5为异育银鲫尾鳍细胞系感染鲤疱疹病毒Ⅱ型后的形态变化；其中，A：正常异育银鲫尾鳍细胞；B：第一代病毒感染异育银鲫尾鳍细胞后7天；C：第一代病毒感染异育银鲫尾鳍细胞后9天；D：第20代病毒感染异育银鲫尾鳍细胞后7天，bar＝200mm；
图6为不同代次的鲤疱疹病毒Ⅱ型感染特性鉴定；其中，A：PCR技术鉴定感染2、5、10和20代的鲤疱疹病毒Ⅱ型后，异育银鲫尾鳍细胞中病毒粒子DNA变化情况；B：感染2、5、10和20代的鲤疱疹病毒Ⅱ型后，异育银鲫尾鳍细胞中病毒粒子拷贝数变化情况。
具体实施方式
下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例；以下实施方式中的实验方法如无特殊说明均为常规方法，试剂与材料无特殊说明均市售可得。
本发明获得的异育银鲫尾鳍细胞系的保藏信息如下：
异育银鲫尾鳍细胞系GiCF-LJF-SHOU，分类命名：异育银鲫尾鳍细胞系(Carassiusauratus gibelio caudal fin cell,GiCF)；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武汉大学；保藏编号：CCTCC NO:C201856；保藏日期：2018年4月9日。
实施例1培养异育银鲫尾鳍细胞系
采用先原代培养、后传代培养的方式构建异育银鲫尾鳍细胞系，具体步骤为：1)组织块的处理：剪取健康异育银鲫尾鳍，置于含有75％酒精的烧杯中浸泡处理30s，先用1×PBS缓冲液洗三遍，再用镊子轻轻刮除表面黏液后，PBS缓冲液再洗三遍，在无菌环境中将清洗后的尾鳍剪成大小为1-2mm3的组织块。2)原代培养：将上述处理后的组织块均匀移植到25cm2的一次性培养瓶中，然后将培养瓶翻转，置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL完全培养液进行培养。3)传代培养：在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞汇合至95％以上时，加入1mL胰蛋白酶消化液，看到有部分细胞脱落后用完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2(v/v)分瓶传代培养，待细胞传至10代后，将完全培养液的胎牛血清浓度降至10％，然后按上述条件继续传代培养，如附图1所示。从图中可以看出，原代培养的异育银鲫尾鳍细胞形态多样，主要呈上皮样细胞和纤维样细胞特点，稳定传代后细胞呈纤维样细胞特点，可以看出细胞系构建成功。
实施例2异育银鲫尾鳍细胞系的温度敏感性和物种来源分析
待上述异育银鲫尾鳍细胞传代至30代后，先将细胞接种至24孔培养板，起始浓度为4×104个细胞每孔，再将培养板分别放置在20℃、25℃和30℃的培养箱中培养，培养1、3、5、7、9天后，分别吸弃旧培养基，用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞浓度，然后用血球计数板计数，如附图2所示。从图中可以看出，该细胞系在20-30℃温度范围内均可生长，最适生长温度为25℃。
利用线粒体16S rRNA鉴定异育银鲫尾鳍细胞物种来源，先用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒提取细胞基因组DNA，具体步骤为：1)取一瓶传至30代的异育银鲫尾鳍细胞，除去培养液，用细胞刮刀刮下细胞，加入1.5mL的离心管；2)加入200μLGA和20μLprotein K混匀，56℃孵育1h；3)加入200mlGB混匀，在70℃孵育10min；4)加入200μL的无水乙醇，混匀后短时离心；5)将溶液转至CB3，14000rpm离心30s；6)弃废液，加入500μLGD，14000rpm离心30s；7)倒掉废液，加入600μLPW，14000rpm离心30s，重复上述操作；8)将吸附柱以14000rpm的转速在室温条件下离心1min，然后将吸附柱取出，放入一个新的无菌离心管中，静置5min；9)向吸附柱中加入30μL的TE缓冲液，静置5min，然后14000rpm室温离心2min，弃去吸附柱，保留离心管。
再利用PCR方法扩增线粒体16S rRNA，在PCR扩增过程中使用PrimeSTAR高保真酶，引物为16S-F：5’-GGGTTGCACAATGTGAACTA-3’，16S-R：5’-ACAGGATTCTTTGAGCGTAG-3’；以25μL为反应体系，按照98℃、10s，56℃、1min，72℃、30s的程序进行35个循环，再72℃延伸10min；然后将上述PCR扩增产物经琼脂糖电泳，取出后拍照记录，再将上述PCR扩增产物送至上海生工公司测序，结果如序列表所示。另外，从附图可以看出PCR产物条带在250-500bp之间。
实施例3异育银鲫尾鳍细胞系核型分析
利用吉姆萨染色法鉴定细胞核型，将传至30代的细胞接种至25cm2的培养瓶，24h后细胞长至80％-90％的汇合度，再加入终浓度为0.2μg/mL的秋水仙素，25℃的培养箱继续培养过夜；胰酶消化细胞，800rpm离心10min，然后用0.075mol/ml的KCl溶液低渗处理25min；弃上清，加入甲醇和冰乙酸体积比为3:1的固定液，轻轻颠倒混匀，室温固定10min；用胶头滴管吸取少量细胞悬液，在2m的高度将细胞滴至倾斜放置的预冷载玻片中；将载玻片室温晾干，用新鲜配置的吉姆萨染色液处理20min，自来水冲洗后室温晾干；置于显微镜下观察并且计算染色体数目；随机选择100个易于计数的分裂相，进行核型分析，结果如附图4所示，染色体数目分布在140-166之间，3n＝156为三倍体。
实施例4异育银鲫尾鳍细胞系分离和鉴定分析鲤疱疹病毒Ⅱ型
取鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的异育银鲫肾脏和脾脏组织各0.5g，加入5mL 4℃预冷的PBS，然后用玻璃匀浆器匀浆；将病毒悬液转移至离心管，5000rpm，4℃离心30min，取上清过0.22μm的滤膜；将30代的异育银鲫尾鳍细胞传入25cm2的培养瓶，待细胞融合度至90％左右时进行感染实验，吸出培养瓶中的旧培养液，加入2mL含5％FBS的培养液，然后加入100μL病毒悬液，25℃孵育1h；吸出含病毒的培养液，加入5mL含5％FBS的培养液，继续放入25℃的培养箱培养，每过24h显微镜下观察一次，记录细胞形态变化；90％的细胞出现病变效应时，收获细胞，-80℃下反复冻融三次，然后5000rpm，4℃离心30min，取上清进行传代，结果如附图5所示。从图中可以看出，7天后细胞出现明显的病变现象，细胞收缩、变圆、脱落和细胞质空泡化；病毒传至20代后，感染特征依然稳定，证明异育银鲫尾鳍细胞对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感，可用于鲤疱疹病毒Ⅱ型的分离和鉴定。
实施例5异育银鲫尾鳍细胞系鉴定和定量分析鲤疱疹病毒Ⅱ型
分别取传至2、5、10、15、20代的病毒悬液，用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒提取DNA，再利用PCR技术检测鲤疱疹病毒Ⅱ型，DNA提取步骤同上；利用PCR技术检测鲤疱疹病毒Ⅱ型，PCR用PrimeSTAR酶，引物为鲤疱疹病毒Ⅱ型F：5’-CTTTAGCGTCAGGTCCATAGAGG-3’，鲤疱疹病毒Ⅱ型R：5’-CGTCAGTCCCTGGCAGAAATAAG-3’。反应体系为25μL，反应程序为：98℃、10s；56℃、1min；72℃、1min，35个循环；72℃、5min；PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见附图6A；可以看出各代次的PCR产物均在716bp，说明CyHV-2感染过程中基因组稳定。取上述提取的基因组DNA，用于鲤疱疹病毒Ⅱ型的定量实验，反应体系为25μL，引物为CY-QF:5′-TTAGCGTCAGGTCCATAG-3′，CY-QR：5′-GGCGTGTAGAAATCAAACT-3′，反应程序为：95℃、30s；95℃、5s；55℃、10s，30s；95℃、10s，40个循环，结果如附图6B，可以看出不同代次CyHV-2的拷贝数没有显著性差异，均在1010.25copies/ml左右。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原代培养：将健康异育银鲫尾鳍的尾鳍剪下，用75％的酒精消毒处理后用镊子刮除表面黏液，然后剪成大小为1-2mm3的组织块，均匀移植到培养瓶后将培养瓶翻转，并置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL上述完全培养液；
(2)传代培养：在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞汇合至95％以上时加入1mL胰蛋白酶消化液，部分细胞开始脱落后用上述完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2(v/v)分瓶传代培养，细胞传至10代后，将所述完全培养液的胎牛血清浓度降至10％；然后按照上述步骤继续传代培养至细胞稳定传代，得异育银鲫尾鳍细胞系。
2.如权利要求1所述异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述组织块的预处理过程具体为：剪取健康异育银鲫尾鳍，置于含有75％酒精的烧杯中浸泡处理30s，然后用PBS缓冲液洗三遍，在无菌环境中用镊子轻轻刮除表面黏液，再用PBS缓冲液洗三遍，将清洗后的尾鳍剪成大小为1-2mm3的组织块。
3.如权利要求1所述异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述完全培养液为15％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的M199培养液。
4.如权利要求1所述异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述胰蛋白酶消化液的质量浓度为0.05％(m/v)。
5.如权利要求1-4任一项所述异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法得到的异育银鲫尾鳍细胞系。
6.如权利要求5所述异育银鲫尾鳍细胞系的核型为三倍体。
7.如权利要求5或6所述异育银鲫尾鳍细胞系在分离和鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型上的应用。
8.如权利要求7所述异育银鲫尾鳍细胞系在分离和鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型上的应用，其特征在于，所述分离和鉴定过程为：从患病的异育银鲫肾脏和脾脏中匀浆提取病毒悬液，然后用病毒悬液孵育细胞，每过24h显微镜下观察一次，记录细胞形态变化；当90％的细胞出现细胞病变效应时收获细胞，在-80℃下反复冻融三次，然后在转速为5000rpm、温度为4℃离心30min，取上清连续传代20次后分别利用PCR法和实时荧光定量PCR法鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型。
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