CN113774018A

CN113774018A - 一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法

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Publication number: CN113774018A
Application number: CN202111003749.8A
Authority: CN
Inventors: 胡鑫; 安培培; 贺玉泉; 么宇彤; 万由衷; 樊吉文
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-08-30
Also published as: CN113774018B

Abstract

本发明公开了一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，它包括：(1)分离新生1‑2天的乳鼠心脏；(2)消化乳鼠心脏组织；(3)使用心肌成纤维细胞培养液I重悬细胞沉淀，差速贴壁培养；(4)移走混有心肌细胞的悬液，培养心肌成纤维细胞；将混有心肌细胞的悬液过筛，离心，使用心肌细胞培养液II重悬心肌细胞，培养；(5)心肌细胞贴壁培养40h后，更换为含1%FBS的心肌细胞培养液III，心肌细胞可保持搏动并继续存活33天以上。本发明可同时获得两种细胞，分离操作耗时短，心肌细胞搏动时间早、存活时间长、在较长的培养时间内维持高的细胞纯度，心肌成纤维细胞、纯度高、得率高。

Description

一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法。

背景技术

心肌细胞体外培养能提供单一细胞的同源性集落，并且不受神经、体液因素影响，已成为研究心肌信号传导和药物筛选的基本方法之一。体外培养的心肌细胞中通常存在两大类：心肌细胞(myocardial cells)和心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)，还有少量的血管内皮细胞等。此外因其特殊的组织结构，心肌细胞在分离时极易受伤，心肌成纤维细胞在培养数代后也出现老化。因此，如何快速分离得到纯化的心肌细胞和心肌成纤维细胞是实验成功的关键。

心肌细胞的培养方法已有很多报道，但均存在细胞存活率低、纯度不高等问题。常见的心肌细胞分离方式有2种，组织块分离法和酶消化法，其中组织块分离法目前很少应用，多采用酶消化法。常用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶以及Dispase和透明质酸酶。胰蛋白酶作用较强，可分解心肌组织间酪蛋白成分，有效解离心肌细胞，但对心肌细胞膜蛋白亦有较强的破坏作用，容易损伤心肌细胞。而胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤较小，目前被广泛采用。

原代分离培养动物的心肌细胞与心肌成纤维细胞，以此为基础，建立各种药物刺激或诱导的、与心脏疾病相关的体外研究模型，是探索和解决心脏相关各种疾病的有效的技术手段。

由于源自心肌组织的原代培养为混合细胞培养，如何分离相对纯净的心肌细胞，在实验周期中抑制非心肌细胞生长，是保证实验成功的关键步骤。本发明集中优化了新生SD大鼠原代心肌细胞的分离与培养技术方法，同时保证原代心肌成纤维细胞的扩增与培养，是一种非常高效、便捷的原代细胞分离与培养的技术方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前新生大鼠心肌细胞培养方法存在分离过程耗时长、心肌细胞长期培养难以维持高纯度，进而影响后续实验等问题，而提供的一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法。

一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，它包括：

1、新生乳鼠，将心脏剪下后置于冰上预冷的CBFHH缓冲液中，洗涤心脏组织去除血水，使用眼科直剪剪去心房组织，放入提前加有预冷CBFHH缓冲液的6孔板中依次洗涤并逐步剪碎心脏组织，最后剪为0.5-1 mm³大小的组织块；

2、使用 II型胶原酶与胰酶-EDTA消化酶混合液进行初次消化，然后加入混有DNase I的II型胶原酶溶液进行短时、多次消化；

3、离心收集细胞沉淀，心肌成纤维细胞培养液I重悬细胞后，将细胞悬液接种10.0 cm平皿，贴壁30 min，收集培养心肌成纤维细胞；

4、收集含心肌细胞的细胞悬液至新10.0 cm平皿，继续贴壁45 min后，收集含较高纯度心肌细胞的细胞悬液，离心后，使用含Brdu的心肌细胞培养液II重悬细胞沉淀，以每孔5-10×10⁵个细胞/mL的密度，加入提前包被多聚赖氨酸的细胞6孔板中，贴壁培养心肌细胞；

5、培养40 h后更换为含1%FBS的心肌细胞培养液III，长期培养心肌细胞；

步骤1所述CBFHH缓冲液（Calcium and Bicarbonate-Free Hanks with HEPES，CBFHH）的组成为：137 mM NaCl，5.36 mM KCl，0.81 mM MgSO₄﹒7H₂O，5.55 mM D-葡萄糖，0.44 mM KH₂PO₄﹒7H₂O，0.34 mM NaH₂PO₄﹒2H₂O及终浓度20 mM HEPES，pH值为7.5；

步骤2所使用的II型胶原酶与胰酶-EDTA消化酶混合液组成为：0.15-0.35mg/mL的II型胶原酶（最佳浓度为0.25mg/mL）和0.01-0.1%的胰酶-EDTA（最佳浓度为0.05%）；所述的混有DNase I的II型胶原酶溶液组成为：0.0005%-0.005% DNase I（最佳浓度为0.001%）的0.4-1.0 mg/mL的II型胶原酶溶液（最佳浓度为0.8mg/mL）；

步骤3所述细胞培养液I组成为：1% 双抗，1% GlutaMAX，1%NEAA，1%丙酮酸钠，0.1%2-Mercaptoethanol，10% FBS，86% DMEM/F12；

步骤4所述细胞培养液II组成为：1%双抗，1%ITS，100 μM Brdu，100 μM CaCl₂，2g/L BSA，5%HBS和93%DMEM/F12；所述的多聚赖氨酸为：0.005-0.05%的多聚赖氨酸溶液（最佳浓度为0.01%）；

步骤5所述细胞培养液III组成为：1%双抗，1%ITS，1%FBS，19.4%M199和77.6%DMEM/F12。

本发明的技术方案，具有如下技术优势：

首先，本发明的技术方案是使用含 1%FBS 的心肌细胞培养液 III，对心肌细胞进行长时间持续培养，在培养的第 21 天，心肌细胞生长状态良好，心肌细胞纯度仍维持在60%以上，心肌细胞存活天数可达 33 天及以上。

其次，本发明首先使用胰蛋白酶与 II 型胶原酶的混合液进行初次消化，除去心脏组织细胞间粘蛋白及糖蛋白，使组织结构松散，然后采用 II 型胶原酶联合脱氧核糖核酸酶 I（DNaseI）的方法以短时、多次的方式逐步解离心脏组织块上的心肌细胞及心肌成纤维细胞，有效避免长时间对组织过度消化导致细胞活性差，得率低的问题，而且能防止细胞分离降解出的 DNA 而导致细胞凝聚的问题，使心脏组织消化的更均匀透彻。

另外，本发明使用合适浓度的多聚赖氨酸包被孔板的促心肌细胞贴壁体系，不仅能够促进大部分心肌细胞贴壁生长，而且避免较高浓度多聚赖氨酸导致的细胞毒性，并且多聚赖氨酸比较廉价，在极大程度上降低了实验成本。

最后，在分离心肌细胞的同时，分离培养心肌成纤维细胞，并分别提供了浓度、成分均适合的细胞培养液体系，培养的细胞生长良好，活力高，该技术发明具有较大的推广意义。

本发明提供了一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，它包括：(1) 分离新生 1-2 天的乳鼠心脏；(2) 消化乳鼠心脏组织；(3) 使用心肌成纤维细胞培养液I重悬细胞沉淀，差速贴壁培养；(4) 移走混有心肌细胞的悬液，培养心肌成纤维细胞；将混有心肌细胞的悬液过筛，离心，使用心肌细胞培养液II重悬心肌细胞，培养；(5) 心肌细胞贴壁培养40h后，更换为含1%FBS的心肌细胞培养液III，心肌细胞可保持搏动并继续存活20-33天以上。本发明可同时获得两种细胞，分离操作耗时短，心肌细胞搏动时间早、存活时间长、在较长的培养时间内维持高的细胞纯度，心肌成纤维细胞、纯度高、得率高。

附图说明

图1原代心肌细胞与心肌成纤维细胞形态观察。A：心肌细胞；B：心肌成纤维细胞；

图2心肌细胞贴壁培养 40 h 后，心肌细胞状态观察。A：普通培养液体系下细胞状态观察；B：本技术发明心肌细胞培养液 II 培养后细胞状态观察；C：心肌细胞贴壁培养 2天后活细胞计数；

图3心肌细胞 α-SA 免疫荧光染色；A：Merge 图；B：α-SA 染色；C：DAPI 染色；

图4 心肌成纤维细胞 α-SA 免疫荧光染色；A：Merge 图；B：α-SA 染色；C：DAPI 染色；

图5 不同血清浓度培养液条件下培养 8 天后，心肌细胞纯度比较；A-a：本技术发明培养

液 III-1%血清浓度体系下细胞状态观察；B-b：5%血清浓度下细胞状态观察；C-c：10%血

清浓度下细胞状态观察；

图6 心肌细胞在本技术发明心肌细胞培养液 III 中持续培养 33 天，α-SA 荧光染色检测心肌细胞纯度的变化。

具体实施方式

实施例1 一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法

1、分离新生1-2天的乳鼠心脏：

将乳鼠于 75%酒精中浸泡 1min 左右，左手固定乳鼠，右手使用眼科直剪沿肋骨中线偏左的位置（乳鼠仰卧位），剪开胸腔，左手挤压乳鼠，将心脏从胸腔挤出，并迅速剪下置于冰上 6 孔板内提前加入的 CBFHH 缓冲液中。

2、乳鼠心脏剪去心房（心底部位），留心尖组织：

CBFHH 缓冲液清洗乳鼠心脏 2 次后，将乳鼠心脏转移至 6 孔板的第 1 个孔中，左手使用眼科镊夹稳心脏后，右手使用眼科直剪将心房剪掉，并将剪去心房的心脏组织放入第 2 个带有干净 CBFHH 缓冲液的孔中，依次将第 2 个孔中的心脏组织一分为二放入第 3 个孔中，再一分为四至第 4 个孔中，然后一分为八至第5 个孔中，将所有心脏组织小块使用眼科直镊转移至第 6 个孔中后，使用眼科弯镊将其剪为 1mm³ 大小的碎块。

3、消化乳鼠心脏组织：

（1）将1mm³大小的心脏组织碎块转移至15mL离心管中，弃上清，加入5mL的0.25mg/mL的II型胶原酶与0.05%胰酶-EDTA混合溶液，轻轻混匀，于37℃细胞培养箱的立式混合器中旋转孵育5min（8转/min），弃上清；

（2）准备4个15mL的离心管，加入5mL的新生小牛血清（终止消化使用），放在冰上备用；

（3）向装有 1mm³ 大小心脏组织碎块的 15mL 离心管加入 5mL 混有0.001%DNase I的 0.8 mg/mL 的 II 型胶原酶溶液，于 37℃细胞培养箱的立式混合器中旋转孵育 5min（8 转/min），然后将消化液上清转移至冰上预冷的提前加入新生小牛血清的 15mL离心管中，上下颠倒混匀、终止消化，放置在冰上备用；

（4）重复5mL/次的消化操作（共计8次左右），消化后半程即第5次消化后，可用3mL滴管柔和吹打剩余组织块，第7次消化后可用1mL枪头吹打剩余组织块，至组织块几乎肉眼不见为止；

（5）1000 rpm/min，4℃离心5min，弃上清液，保留细胞沉淀；

（6）使用48 mL的心肌成纤维细胞培养液I重悬细胞沉淀，转移至6个10 cm的平皿中，37℃二氧化碳培养箱中先后贴壁培养 30min 和 45min；

（7）600μL/6孔板一个孔包被多聚赖氨酸溶液，37℃细胞培养箱中孵育1 h左右，回收多聚赖氨酸溶液，加入2 mL/孔的PBS，洗2遍，除去残留的多聚赖氨酸溶液；

（8）贴壁完成后，使用移液器吸走培养皿中细胞上清液至放有70 目滤器的50 mL离心管中过滤，用5 mL的心肌成纤维细胞培养液I轻晃平皿洗涤残留未贴壁的细胞，均收集到2个50mL离心管中，1000rpm/min ，4℃离心5min，使用5mL含Brdu的心肌细胞培养液II重悬细胞沉淀；

（9）细胞计数，以每孔9×10⁵个细胞/mL的密度，将细胞悬液加入到包被多聚赖氨酸的细胞6孔板中，使用含Brdu的心肌细胞培养液II补足体积，37℃二氧化碳培养箱中贴壁培养40h后，观察细胞状态，拍照并更换为含1%FBS的心肌细胞培养液III；

（10）贴有心肌成纤维细胞的6个10.0 cm平皿补足12 mL的心肌成纤维细胞培养液I，于37℃二氧化碳培养箱中贴壁培养，即为F0代的心肌成纤维细胞。

所述的CBFHH缓冲液（Calcium and Bicarbonate-Free Hanks with HEPES，CBFHH）组成为：137 mM NaCl，5.36 mM KCl，0.81 mM MgSO₄﹒7H₂O，5.55 mM D-葡萄糖，0.44mM KH₂PO₄﹒7H₂O，0.34 mM NaH₂PO₄﹒2H₂O及终浓度20 mM HEPES，pH值为7.5；

所述的II型胶原酶与0.05%胰酶-EDTA混合溶液组成为：0.25mg/mL的II型胶原酶和0.05%的胰酶-EDTA；

步骤（6）所述的心肌成纤维细胞培养液I组成为：1% 双抗（每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素），1% GlutaMAX，1%NEAA，1%丙酮酸钠，0.1% 2-Mercaptoethanol，10%FBS，86% DMEM/F12；

步骤（8）所述的含Brdu的心肌细胞培养液II成为：1%双抗，1%ITS，100 μM Brdu，100 μM CaCl₂，2g/L BSA，5%HBS和93%DMEM/F12；

所述的多聚赖氨酸为：0.01%的多聚赖氨酸溶液；

步骤（9）所述的心肌细胞培养液III为：1%双抗，1%ITS，1%FBS，19.4%M199和77.6%DMEM/F12。

4、细胞形态观察：

由图 1A 所示，心肌细胞贴壁生长，显微镜下观察心肌细胞轮廓清晰明亮、细胞质中含有较多小而亮圆的线粒体颗粒；心肌细胞初始贴壁形态大多数为长梭形，在细胞密度较低时，大部分细胞均发生自发性搏动，但搏动频率和节律各不相同；随着体外培养时间的延长，心肌细胞发生 80%以上的融合，显微镜下观察心肌细胞成团成簇，并以此为单位发生同步性搏动，并能连续搏动 20 天以上；由图 1B 所示，心肌成纤维细胞贴壁生长，细胞分布均匀，散在生长，不聚集成团，无自发搏动，低代数的成纤维细胞中混有少量心肌细胞，但随着培养时间的增长及传代次数的增多，心肌细胞逐渐消失。

实施例2 马血清对心肌细胞生长的影响

本实施例是比较本技术发明条件下心肌细胞贴壁用含 5%马血清、2g/L BSA及Brdu 的心肌细胞培养液 II 与普通心肌细胞培养液（10%胎牛血清）体系下，心肌细胞贴壁率及存活率的比较。新鲜分离的乳鼠原代心肌细胞，以 15×10⁵ 个细胞/mL 的密度培养在细胞 6 孔板中，一部分使用本发明条件下心肌细胞贴壁用培养液 II 使心肌细胞贴壁 40h，一部分使用普通心肌细胞培养液体系即含有 10%FBS 和 1%双抗的 DMEM/F12 培养液使心肌细胞贴壁 40 h，之后分别更换为心肌细胞培养液 III 和普通心肌细胞培养液。

本技术发明条件下的心肌细胞培养液 II 中，马血清中具有促细胞生长的活性因子，与胎牛血清相比能提高心肌细胞活力，又因为胎牛血清中含有促成纤维细胞生长的活性因子，因此使用马血清代替胎牛血清可进一步提高心肌细胞的纯度；牛血清白蛋白在心肌细胞贴壁过程中能起到生理和机械保护作用，维持渗透压，因此在本技术发明条件下心肌细胞贴壁率、存活率及细胞状态均显著优于普通心肌细胞培养液体系，结果如下图 2C所示。

实施例3 心肌细胞与心肌成纤维细胞阳性率统计

取新鲜分离的原代心肌细胞以7×10⁴个细胞/mL的密度培养在提前放有无菌盖玻片的24孔细胞培养板中培养3天左右；准备传代2次的心肌成纤维细胞以5×10⁴个细胞/mL的密度培养在提前放有无菌盖玻片的24孔细胞培养板中，制作细胞爬片，贴壁培养后的第二天与心肌细胞一起进行α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomericactin，α-SA）的免疫细胞荧光染色以及荧光显微镜下统计心肌细胞阳性率。结果如图3所示，心肌细胞阳性率为95%左右；心肌成纤维细胞阳性率为90%左右（图4）。

实施例4 不同血清浓度对心肌细胞纯度的影响

在目前现有的新生大鼠心肌细胞培养方法中多采用 10%的血清浓度甚至 15%的血清浓度培养心肌细胞。本技术发明对比了不同血清浓度下培养 8 天左右的心肌细胞纯度的区别，即采用新鲜分离的乳鼠原代心肌细胞，以 7×10⁵个细胞/mL的密度培养在细胞6 孔板中，分别采用 1%FBS（本技术发明条件）、5%FBS 和10%FBS 的心肌细胞培养液对心肌细胞进行培养。结果如图 5A-a 所示，在本技术发明心肌细胞培养液 III 条件下-含 1%FBS，视野中细胞边缘清晰明亮的心肌细胞占大多数；而在 5%和 10%FBS 的细胞培养液下，结果如图 5B-b 和 C-c 所示心肌细胞中混有的心肌成纤维细胞开始大量扩增，心肌细胞聚集成细胞团并逐渐减少，严重影响心肌细胞的纯度。

实施例5 心肌细胞持续培养实验

本技术发明采用新鲜分离的乳鼠原代心肌细胞，以 15×10⁵ 个细胞/mL 的密度培养在包被多聚赖氨酸的细胞 6 孔板中，采用 1%FBS（本技术发明心肌细胞培养液 III）对心肌细胞进行长达 30 天以上的持续培养，每隔 1 天更换 1 次新鲜培养液，每隔 1 周选取6 孔板的 3 个孔进行 α-SA 免疫细胞荧光染色，检测心肌细胞纯度的变化情况。

在本技术发明含 1%FBS的心肌细胞培养液 III 条件下，心肌细胞存活天数可达33 天及以上，且心肌细胞的纯度为 30%（图 6 E）；心肌细胞的纯度在体外培养的第 13 天仍可维持在 88%左右（图 6 B）；随着培养时间的延长，心肌细胞总数在减少，在 21 天细胞总数减少到最低，但纯度仍维持在 68%左右（图 6 C），随后心肌细胞中混有的心肌成纤维细胞开始显现生长优势，缓慢扩增。心肌细胞在体外培养的第 26 天，其纯度下降到 52%左右（图 6 D），只有少数心肌细胞团仍维持缓慢搏动。

Claims

1.一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，它包括：

1），将新生乳鼠心脏剪下，置于冰上预冷的CBFHH缓冲液中，洗涤心脏组织去除血水，使用眼科直剪剪去心房组织，放入提前加有预冷CBFHH缓冲液的6孔板中依次洗涤并逐步剪碎心脏组织，最后剪为0.5-1 mm³大小的组织块；

2）使用 II型胶原酶与胰酶-EDTA消化酶混合液进行初次消化，然后加入混有DNase I的II型胶原酶溶液进行短时、多次消化；

3）离心收集细胞沉淀，心肌成纤维细胞培养液I重悬细胞后，将细胞悬液接种10.0 cm平皿，贴壁30 min，收集培养心肌成纤维细胞；

4）收集含心肌细胞的细胞悬液至新10.0 cm平皿，继续贴壁45 min后，收集含较高纯度心肌细胞的细胞悬液，离心后，使用含Brdu的心肌细胞培养液II重悬细胞沉淀，以每孔5-10×10⁵个细胞/mL的密度，加入提前包被多聚赖氨酸的细胞6孔板中，贴壁培养心肌细胞；

5）培养40 h后更换为含1%FBS的心肌细胞培养液III，长期培养心肌细胞。

2. 根据权利要求1所述的一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，其特征在于：步骤1所述CBFHH缓冲液为含137 mM NaCl，5.36 mM KCl，0.81 mM MgSO₄﹒7H₂O，5.55 mM D-葡萄糖，0.44 mM KH₂PO₄﹒7H₂O，0.34 mM NaH₂PO₄﹒2H₂O及终浓度20 mM HEPES，pH值为7.5的缓冲液。

3.根据权利要求2所述的一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，其特征在于：步骤2所使用的II型胶原酶与胰酶-EDTA消化酶混合液组成为0.25mg/mL的II型胶原酶及0.05%的胰酶-EDTA；所述的混有DNase I的II型胶原酶溶液组成为0.001% DNaseI的0.8 mg/mL的II型胶原酶溶液。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，其特征在于：步骤3所述细胞培养液I组成为1%双抗，1% GlutaMAX，1%NEAA，1%丙酮酸钠，0.1% 2-Mercaptoethanol，10% FBS，86% DMEM/F12。

5.根据权利要求4所述的一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，其特征在于：步骤4所述细胞培养液II组成为1%双抗，1%ITS，100 μM Brdu，100 μM CaCl₂，2g/L BSA，5%HBS和93%DMEM/F12；所述的多聚赖氨酸为0.01%的多聚赖氨酸溶液。

6.根据权利要求5所述的一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，其特征在于：步骤5所述细胞培养液III组成为1%双抗，1%ITS，1%FBS，19.4%M199和77.6%DMEM/F12。