CN106344965A - 一种去细胞神经外膜导管及其制备与在周围神经损伤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料和神经损伤修复技术领域，具体涉及一种去细胞神经外膜导管及其制备方法，与在修复周围神经损伤中的应用。本发明制备猪的去细胞神经外膜导管，从孔隙率、溶胀率与体外降解率、细胞毒性试验等方面研究其生物学特性，同时研究其免疫原性。本发明建立大鼠坐骨神经横断伤模型，神经断端行显微外科缝合后，其外裹以去细胞神经外膜导管，研究其具有促进神经再生、防止神经粘连以及神经瘤形成的作用。本发明提供了一种具有良好的生物学特性和低免疫原性，并能有效地减少周围神经粘连、降低神经瘤发生率的去细胞神经外膜导管，为战创伤性周围神经损伤的修复以及神经损伤后灼性神经痛的治疗提供一种新型修复材料。

Description

一种去细胞神经外膜导管及其制备与在周围神经损伤修复中的应用

技术领域

本发明属于生物材料和神经损伤修复技术领域，具体涉及一种去细胞神经外膜导管及其制备方法，与在修复周围神经损伤中的应用。

背景技术

周围神经损伤在和平年代及战时均十分常见。据第二次世界大战战伤统计，四肢神经伤约占外伤总数的10％。在现代战争、现代交通事故、高能量爆炸和工伤事故中，神经的损伤比率更高。周围神经战伤已上升到现在的20％～40％，火器伤骨折中约有60％合并神经伤。火器性周围神经损伤常可致神经断伤，与其他因素所致神经断伤的临床表现相似，伤后对应肢体的运动、感觉功能完全丧失，肌肉明显萎缩。常伴有肌肉，大血管或其他器官损伤。但因火器性周围神经伤的震荡因素，其损伤范围广，恢复慢。火器性神经损伤还可引起灼性神经痛，火器性周围神经损伤后灼性神经痛的发生率可高达12％。

目前国内外对周围神经火器伤或神经断伤的修复方法大多采用显微外科技术，即神经缝合术、自体神经移植术、神经松解术、神经植入术、神经移位术、神经束膜切开术等(参见文献[1]朱盛修，刘郑生，王岩.周围神经束膜减压术治疗火器性灼性神经痛.中华创伤杂志，1994，10(6)：281-282.)。对于火器性周围神经损伤，因神经内微血管广泛受损，神经组织缺氧水肿，长时间水肿将导致纤维细胞长入，神经内、外瘢痕形成，神经缝合或神经植入及移植后往往与其周围的结构发生粘连。另外，神经粘连及神经瘢痕的形成是火器性周围神经损伤后灼性神经痛发生的重要原因，也是亟待解决的难题之一。

研究发现，在修复神经缺损时，与其他可降解生物材料相比，去细胞神经支架材料具有最接近神经的网架结构、良好的生物相容性、生物力学性能，其表面具备细胞膜受体识别位点，可引导神经再生(参见文献[2]Place ES,Evans ND,Stevens MM.Complexity in biomaterials for tissue engineering.NatMater,2009,8(6):457-470.)。2008年，美国Axogen公司首次推出了去细胞同种异体神经修复材料，并应用于阿富汗战场，修复因枪伤、爆炸伤等严重受损神经。我国中山大学研制的“去细胞同种异体神经修复材料”(神桥)也于2012年获准临床使用与上市。本发明人所在的第二军医大学解剖学教研室以犬的去细胞神经基膜管复合毛囊神经嵴干细胞或骨髓神经组织定向干细胞，桥接大鼠、兔及犬的长段神经缺损，较好地恢复了神经的功能(参见文献[3]Lin H,Liu F,Zhang C,Zhang Z,Kong Z,Zhang X,Hoffman RM.Characterization of nerve conduits seeded with neurons and Schwann cellsderived from hair follicle neural crest stem cells.Tissue Engineering(part A),2011,17(13-14):1691-1698.文献[4]Lin H,Liu F,Zhang C,Zhang Z,Guo J,Ren C,Kong Z.Pluripotent hair follicle neural crest stem cell-derived neuronsand Schwann cells functionally repair sciatic nerves in rats.Mol Neurobiol,2009,40(3):216-223.文献[5]Zhiying Zhang,Congli Ren,Chuansen Zhang,Fang Liu,Liang Li.Bridging sciatic nerve gap using engineered nerve derived neuraltissue-committed stem cells of bone marrow.Neural Regen Res,2009,4(5):344-349.)。虽然这些去细胞神经修复材料对于桥接周围神经缺损起着积极的作用，但却不足以解决周围神经损伤修复过程中出现的粘连、瘢痕以及神经瘤的形成等问题。

研究表明，在神经损伤修复中，于吻合口处采用生物膜(如聚乳酸生物膜等)包绕，以创造一个相对密闭的环境，充分发挥远端神经的趋化作用，同时阻隔外部环境对再生神经的影响，减少炎性细胞的浸润，从而减轻神经吻合口与周围结构的粘连，可有效防止吻合口瘢痕的形成(参见文献[6]谢峰，李青峰，顾彬，刘凯.神经导管修复周围神经损伤的临床应用.整形再造外科杂志,2004,1:144-146.)。Siemionow等以异体大鼠坐骨神经神经外膜导管桥接周围神经缺损，并在其中注入骨髓基质细胞，发现其修复效果与自体神经移植相近似。而且目前临床上应用神经外膜翻转缝合法修复神经损伤，也有很好的神经再生诱导作用(参见文献[7]Siemionow M,Duggan W,Brzezicki G,Klimczak A,Grykien C,Gatherwright J,Nair D.Peripheral nervedefect repair with epineural tubes supported with bone marrow stromal cells.AnnPlast Surg,2011,67:73-84.)。因此，本发明人认为神经外膜导管在火器伤性周围神经损伤或复杂神经断伤的修复中很可能发挥重要作用。

在火器性周围神经损伤或复杂神经断伤中，受损神经的神经外膜已受到不同程度的破坏，其他部位的自体神经外膜来源受限，异体或异种的神经外膜又具有免疫原性。为降低及消除异体或异种神经外膜的免疫原性，应尽可能地去除神经外膜内的细胞成分，最大程度地保留细胞外基质成分。实验证明，采用去细胞技术对异种动物组织如神经、骨骼肌、血管等进行处理，可以获得无免疫原性的神经支架及其原料(参见文献[8]Schmidt CE，LeachJB.Neural tissue engineering:strategies for repair and regeneration.Annu RevBiomed Eng,2003,5:293-347.文献[9]Hudson TW,Zawko S,Deister C.Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supportsregeneration.Tissue Engineering,2004,10(11/12):1641-1651.)，这也是目前最有前景的方法之一。

在去细胞神经的制备方法中，化学脱细胞法的去细胞效果较物理脱细胞法更彻底。化学脱细胞法主要有：(1)Dumont萃取法，主要应用L-a-溶血卵磷脂和核糖核酸酶，萃取作用较温和，但脱细胞效果较弱(参见文献[10]Dumont CE,Hentz VR.Enhancement of axon growth by detergent 2extractednerve grafts.Transplantation,1997,63(19):1210-1215.)；(2)Sondell萃取法，主要应用Triton X-100和脱氧胆酸钠，制备所需时间短，辅以震荡处理，脱细胞效果较好(参见文献[11]Sondell M,L undborg G,Kanje M.Regenerationof the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction.Brain Res,1998,795(122):44-54.)；(3)Haase萃取法，与Sondell萃取法所用试剂相似，另辅以甘油-生理盐水、SDS溶液等，脱细胞耗时较长(参见文献[12]Haase SC,Rovak JM,Dennis RG.Recovery of muscle contractilefunction following nerve gap repair with chemically acellularized peripheralnerve grafts.J Reconstr Microsurg,2003,19(4):241-248.)。

理想的周围神经支架材料应具备如下特征：①良好的生物相容性，不对机体和组织产生不良的影响，有利于种子细胞的黏附、生长和分化；②良好的生物降解性，能随着细胞的增殖而在体内逐渐降解、代谢，最终被吸收。降解率应与组织细胞生长率相适应；③具有三维立体多孔结构，具有较高的面积/体积比，为细胞和组织生长提供足够的空间和交换通道；④良好的可塑性和一定的机械强度；⑤良好的材料-细胞界面，有利于细胞黏附、生长。(参见文献[13]Kim BS,Mooney DJ.Development of biocompatible syntheticextracellular matrices for tissue engineering.Trends Biotechol,1998,16(5):224-230.)

目前尚无文献报道去细胞的神经外膜导管的制备；也无文献报道去细胞的神经外膜导管在周围神经损伤修复中的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有良好的生物学特性和低免疫原性，并能有效地减少周围神经粘连、降低神经瘤发生率的新型神经修复材料，具体地这种新型神经修复材料是一种去细胞神经外膜导管；本发明的另一目的在于提供所述的去细胞神经外膜导管的制备方法。

本发明首先研究分析去细胞神经的三种化学脱细胞法，发现Dumont萃取法虽然作用较温和，有利于神经基膜管结构完整性的保存，但其脱细胞的效果较差；Haase萃取法虽然脱细胞效果较好，对于神经基膜管结构的保存较好，但其耗时长，不利于细胞外基质成分的保存。神经外膜是包裹于神经干最外层的结缔组织膜，包裹着若干神经束，含有大量的细胞外基质成分以及少量的细胞成分(主要包括成纤维细胞、脂肪细胞等)，而且不涉及神经基膜管结构，因此去细胞神经外膜导管的制备关键在于去细胞的效果以及细胞外基质成分的保留。与Dumont萃取法和Haase萃取法相比，Sondell萃取法既可以在较短的时间内达到脱细胞的效果，又可以较好地保存细胞外基质成分。

本发明在Sondell萃取法基础上，针对神经外膜导管结构较疏松、细胞成分较少等特点，进一步进行条件筛选，如选用不同浓度的Triton X-100水溶液和脱氧胆酸钠水溶液，设置不同的处理时间，通过比较结果，证实目前筛选条件是最佳的。

本发明的主要技术方案如下：制备猪的去细胞神经外膜导管，从孔隙率、溶胀率与体外降解率、细胞毒性试验等方面研究其生物学特性，同时研究其免疫原性。建立大鼠坐骨神经横断伤模型，神经断端行显微外科缝合后，其外裹以去细胞神经外膜导管，研究其促进神经再生、防止神经粘连以及神经瘤形成的作用。通过体外、体内实验，研究一种具有良好的生物学特性和低免疫原性，并能有效地减少周围神经粘连、降低神经瘤发生率的去细胞神经外膜导管，以期为战创伤性周围神经损伤的修复以及神经损伤后灼性神经痛的治疗提供一种新型修复材料。

本发明的第一方面，提供了一种去细胞神经外膜导管的制备方法。

所述的制备方法主要包括以下步骤：

将神经外膜导管，先用Triton X-100水溶液，筛选浓度分别为1ml/L、10ml/L和30ml/L，处理时间的筛选分别为6h、12h、24h；再用脱氧胆酸钠水溶液，10g/L～40g/L处理6～48h。

所述的Triton X-100水溶液，Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基醚，原液可购自Sigma公司(T9284)，使用前配制相应浓度的水溶液；优选浓度为10ml/L。

所述的脱氧胆酸钠水溶液，脱氧胆酸钠粉剂可购自Sigma公司(D6750)，使用前配制相应浓度的水溶液；优选浓度为40g/L。

在本发明的一个优选实施例中，先用Triton X-100水溶液处理12h；再用脱氧胆酸钠水溶液处理24h。

所述的神经外膜导管，为猪的坐骨神经外膜导管，也可为其他大型哺乳动物的神经外膜导管等。

所述的神经外膜导管，可以用以下方法获取：取猪新鲜坐骨神经，将其截成1～4cm(较优为2cm)长的神经段，在手术显微镜下去除表面的脂肪组织，借助于冲洗器和显微外科镊将神经外膜与神经束分离，剥离获得神经外膜导管，约长1.5cm。

所述的神经外膜导管，可以从上海屠宰场购得大型哺乳动物的坐骨神经，参照文献[7]获得神经外膜导管。

本发明的第二方面，提供了根据上述方法制备得到的一种去细胞神经外膜导管。

本发明的一种去细胞神经外膜导管进行生物学特性及免疫原性的研究，从去细胞神经外膜导管的孔隙率、溶胀率、体外降解率、细胞毒性试验等方面研究其生物学特性，通过肌内种植实验评价免疫排斥反应强度。结果显示，去细胞神经外膜导管的溶胀率、体外降解率均大于未脱细胞的神经外膜导管(P＜0.01)，二者的孔隙率相近。细胞毒性试验显示，小鼠成纤维细胞L929在去细胞神经外膜材料上的生长、粘附、增殖状况良好，肌内种植实验显示去细胞神经外膜的免疫排斥反应弱。

本发明的第三方面，提供了上述的去细胞神经外膜导管在制备周围神经损伤修复材料中的应用。

本发明建立了周围神经横断伤动物模型，再用本发明的一种去细胞神经外膜导管体内移植修复周围神经损伤，具体是采用显微外科技术缝合后，其外裹以去细胞神经外膜导管，于不同时相点观测神经粘连、神经吻合口生长情况、神经纤维再生及神经功能检测。结果显示，去细胞神经外膜导管可以有效地缓解神经粘连、减少神经瘤的形成，促进神经纤维的再生和神经功能的恢复。

本发明提供一种具有良好的生物学特性和低免疫原性，并能有效地减少周围神经粘连、降低神经瘤发生率的新型神经修复材料。本发明为周围神经损伤、复杂神经断伤的修复提供了新的临床治疗手段。

附图说明

图1去细胞神经外膜导管(大体照片)，取自猪坐骨神经，*示管腔部分。

图2猪去细胞神经外膜导管(H.E.染色)，×100。可见神经外膜导管脱细胞完全，细胞外基质成分保存完好。*示管腔部分，因有部分神经外膜延伸至神经内部的神经束之间，故神经外膜导管的管腔呈不规则形。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

实施例1：去细胞神经外膜导管的制备

将若干段神经外膜导管置于蒸馏水中震荡、漂洗6h。

将神经放入10ml/L的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚，购自Sigma公司)水溶液中静置12h，在蒸馏水中漂洗3次后，再放入40g/L的脱氧胆酸钠水溶液(购自Sigma公司)中室温下震荡24h，最后在蒸馏水中震荡漂洗3次。⁶⁰Co辐照(20kGy)灭菌12h，4℃保存备用。

实施例2.去细胞神经外膜导管生物学特性的研究

(1)超微结构的观察

在扫描电镜和透射电镜下观察去细胞神经外膜导管横截面、纵截面及材料外表面的超微结构。结果显示，去细胞神经外膜导管内的胶原成分保存完好，细胞去除彻底。

(2)孔隙率的测定

将去细胞神经外膜导管置于冷冻干燥机中冻干24h，采用液体替代法测材料孔隙率。具体如下：取10根材料，截面直径随机选取5点测量并求平均值。电子天平称其质量(精确到小数点后4位)，称5次求平均值。把已知质量M1、体积V0的样品浸入装有水的密封容器中，以负压抽吸的方法排除材料孔隙内的空气，直到无气泡从材料中逸出为止，将材料取出，以滤纸吸干表面的液体，再次称重，为M2(精确到小数点后4位，电子天平称5次取平均值)。用M2-M1/l(1为水的密度)，得V1，即为材料中的孔隙体积，V1/V0即可得出材料的孔隙率。所得去细胞神经外膜导管的孔隙率为(84.00±6.11)％，未去细胞组(对照组)孔隙率为(82.00±1.27)％，P＞0.05。

(3)溶胀率和体外降解率的测定

取无菌材料20根，用电子天平称5次取其平均值W0(精确到小数点后4位)。一个培养皿中放1根样品，加入l0ml 0.01mol/L PBS，24h后取5根材料，用无菌滤纸擦干水分后称重W1。溶胀率(％)＝(W1-W0)/W0×100％。再将剩余的15根材料5根一组分3个时间段测定。用恒温振荡器振动(转速为50r/min，温度为37℃)，每隔3d换液一次，换液时离心，去上清，重新加入10ml PBS。分别于4、8、12周收集材料剩余段，用无菌滤纸擦干水分后冻干，电子天平称重5次，取平均值W2(精确到小数点后4位)。降解率(％)＝(W1-W2)/Wl×100％。所得去细胞神经外膜导管的溶胀率为(147.37±20.71)％，未去细胞组的溶胀率为(99.53±14.01)％，P＜0.01；去细胞神经外膜导管的降解率为(22.94±2.44)％，未去细胞组的降解率为(17.23±1.91)％，P＜0.01。

(4)细胞毒性试验

培养小鼠成纤维细胞L929(美国ATCC细胞系)，培养液为DMEM/F12+10％胎牛血清。采用直接接触法和MTT比色法检测材料的细胞毒性。

直接接触法：小鼠成纤维细胞L929长成单层后，分别加入三组相同形状和大小的材料及阴性(聚乙烯塑料)和阳性(乳胶橡胶)对照材料，使其与细胞单层直接接触，继续培养24h后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。结果显示，L929细胞在去细胞神经外膜上生长、粘附、增殖状态良好，优于阴性和阳性对照组。

浸提液MTT比色法：将三组材料用10％胎牛血清+DMEM/F12培养液进行浸泡，培养24h，制成浸提液备用。将培养的L929细胞制成6×10³/ml的单细胞悬液，在96孔培养板上每孔接种100μl的细胞悬浮液，接种40孔，培养24h；弃去原培养液，每孔加入100μl材料浸提液，分别于接种48h后取出，每孔再加入MTT 50μl，继续培养2h，吸弃原培养液，立即加入二甲基亚砜，每孔150μl，室温放置并轻轻震荡10～15min。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔A值。根据所测A值计算细胞相对增殖率＝实验组平均A值/阴性对照组平均A值×100％。根据细胞相对增殖率评定材料的毒性程度。结果显示，去细胞神经外膜组的细胞增殖率均大于阴性和阳性对照组。

实施例3.去细胞神经外膜导管免疫原性的研究

将猪去细胞神经外膜导管及新鲜神经外膜导管分别植入SD大鼠椎旁肌内，于术后1～4周分别取材进行组织学观察，通过H.E.染色评价炎症反应程度；应用免疫组织化学方法观察移植物及周围组织中的CD3、CD4和CD8阳性T细胞浸润程度，评价其免疫排斥反应强度。结果显示，去细胞神经外膜导管组的炎症反应及免疫排斥反应均弱于新鲜神经外膜导管组。

实施例4：去细胞神经外膜导管修复周围神经损伤的动物实验

(1)周围神经横断伤动物模型的建立

SD大鼠股外侧行斜形皮肤切口，显露并横断坐骨神经。显微镜下缝合神经两断端，剪开去细胞神经外膜导管，将其缠绕于神经吻合口处。本实验共分3组，①单纯缝合组；②去细胞神经外膜导管组；③聚乳酸生物膜组。每组均设1周、2周、4周、8周、16周等5个时相点。

(2)去细胞神经外膜导管修复周围神经损伤的在体研究

A、观察神经与周围结构是否存在粘连，吻合口生长情况，是否有神经瘤的形成等。结果显示，经去细胞神经外膜导管包裹的神经吻合口生长状况好，无粘连发生，无神经瘤的形成。

B、应用H.E.染色、β-Ⅲ-tubulin、GAP43等免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色等方法检测再生神经纤维的数量、粗细、髓鞘形成以及厚度等。测定肌肉湿重、骨骼肌细胞直径及截面积等。结果显示，去细胞神经外膜导管组的再生神经纤维的数量及髓鞘的形成等均优于其余两组。

C、应用辣根过氧化物酶(HRP)逆行追踪技术，于各组的不同时相点在神经吻合口远端的坐骨神经干注入30％HRP溶液10μl，动物继续饲养72h。神经取材后取脊髓腰骶膨大段和相应的背根神经节(L3～L6)，冰冻切片，TMB呈色，中性红复染细胞核，在显微镜下观察被HRP标记的神经元。结果显示，去细胞神经外膜导管组示踪到的神经元数目最多。

D、坐骨神经功能检测：肌力测定、肌电图分析、步态分析、电生理检测大鼠受损坐骨神经功能的修复情况。结果显示，去细胞神经外膜导管组坐骨神经功能恢复最好。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种去细胞神经外膜导管的制备方法，其特征在于，所述的制备方法主要包括以下步骤：

将神经外膜导管，先用浓度为1ml/L～30ml/L的Triton X-100水溶液处理6h～24h；再用浓度为10g/L～40g/L的脱氧胆酸钠水溶液处理6～48h。

2.根据权利要求1所述的一种去细胞神经外膜导管的制备方法，其特征在于，所述的Triton X-100水溶液浓度为10ml/L，处理12h。

3.根据权利要求1所述的一种去细胞神经外膜导管的制备方法，其特征在于，所述的脱氧胆酸钠水溶液浓度为40g/L，处理24h。

4.根据权利要求1所述的一种去细胞神经外膜导管的制备方法，其特征在于，所述的神经外膜导管为猪的坐骨神经外膜导管。

5.根据权利要求4所述的一种去细胞神经外膜导管的制备方法，其特征在于，所述的猪的坐骨神经外膜导管根据以下方法获取：取猪新鲜坐骨神经，将其截成1～4cm长的神经段，在手术显微镜下去除表面的脂肪组织，借助于冲洗器和显微外科镊将神经外膜与神经束分离，剥离获得神经外膜导管。

6.一种如权利要求1至5任一制备方法制备得到的去细胞神经外膜导管。

7.根据权利要求6所述的去细胞神经外膜导管在制备周围神经损伤修复材料中的应用。