KR101608618B1 - 신경재생도관 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경재생도관 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 세포, 유전자, 지방 등과 같은 면역이나 이물반응 유발물질을 포함하지 않는 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질이 도관 내에 스펀지 구조로 충진 된 신경재생도관을 제공함으로써, 신경세포의 부착 혹은 성장을 개선시켜 끊어진 신경 혹은 조직이 상기 도관 내에서 효율적으로 재생될 수 있는 신경재생도관 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

신경재생도관 및 그 제조방법 {NERVE REGENERATION CONDIUT, AND METHOD FOR PREPARING THEM}

본 발명은 신경재생도관 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 세포, 유전자, 지방 등과 같은 면역이나 이물반응 유발물질을 포함하지 않는 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질이 도관 내에 스펀지 구조로 충진된 신경재생도관을 제공함으로써, 신경세포의 부착 혹은 성장을 개선시켜 끊어진 신경 혹은 조직이 상기 도관 내에서 효율적으로 재생될 수 있는 신경재생도관 및 그 제조방법에 관한 것이다.

말초신경 손상은 사고나 수술의 부작용 및 암 등의 질환에 의해 발생하는 것으로 신경차단(neuropraxia), 축삭절단(axonotmesis), 신경절단(neurotmesis)으로 크게 3가지 유형으로 분류할 수 있다. 치료방법은 신경봉합술이나 자가신경 이식술이 있지만, 신경봉합술은 절단 길이가 5mm 이내에서만 가능하고, 자가이식술은 공여부의 신경이 손상되는 문제를 가지고 있다. 말초신경 손상은 신경종(Neuroma) 형성, 감각 및 통증 이상, 그리고 근육 위축의 영구적인 기능 장애를 초래한다.

말초신경 재생 기전은 말초신경이 절단시 말초와 가까운 부분(원위부, Distal)은 기능장애가 일어나며 변성되어 소멸되는 월러 변성(Wallerian degeneration)이 일어난다. 월러 변성이 일어나는 말초 부분의 축삭은 팽대해져 분절된 후 소실되고 수초는 지방과립으로 변화한다. 또한 축삭이 절단된 세포체와 가까운 부분(Proximal)은 신경섬유마디 부분까지 역행 변성(Retrograde degeneration)이 일어난다. 이 후 말초신경은 재생하기 위해 수초와 슈반세포에 의해 성장원추의 발생을 유도하고, 절단부위의 인식 여부에 따라 재생이 이뤄진다. 성장원추의 크기는 1~10㎛ 이며 이것이 약 50~100개의 축삭원추가 된다. 절단부위가 인식되어 재생이 된다면 6 시간 ~ 5 일경에 근위부에서 약 50 ~ 100 개의 가느다란 축삭원추가 발생되기 시작된다. 이후 축삭원추는 번거(Bunger) 띠를 형성하고 Bunger 띠 1개가 약 20개의 축삭을 형성하여 재생에 이르게 된다. 하지만, 손상된 신경이 재생되는 동안 주변 반흔조직이 침투하여 신경재생을 방해하게 된다.

이러한 반흔조직의 침투를 막기 위하여 1990년에 런드보그(Lundborg)가 실리콘 튜브를 최초로 적용하였다. 실리콘 튜브는 내부가 비어 있는 형태로 끊어진 신경 끝에 씌워 사용하는 것으로, 반흔조직의 침투를 막아주고 축삭 성장을 유도하는 역할을 한다. 신경도관의 목적은 손상된 신경조직을 연결하여 신경 재생 유도 통로를 만들어 주는 것으로, 일반적으로 아래의 5가지 특성을 가져야 한다. 첫째, 신경 재생을 방해하는 반흔조직의 침투를 막아야 한다. 둘째, 외부에서의 영양인자를 침투시키고 내부의 신경영양인자는 유지하는 반투막 특성을 가져야 한다. 셋째, 이식 후 주변 조직으로부터 가해지는 힘에 견딜 수 있는 적절한 물성을 가져야 한다. 넷째, 생체 적합성이 뛰어나야 한다. 다섯째, 신경이 재생되면 도관은 분해되는 분해특성을 가져야 한다.

하지만, 실리콘 튜브는 비분해성으로 신경재생이 이루어지더라도 남아있게 되며, 외부로부터의 영양인자가 침투하지 못해 신경재생 속도 및 재생 길이에 한계를 가진다. 최근 이러한 문제를 극복하기 위하여 합성고분자나 콜라겐을 이용한 분해성 신경도관 제품들이 개발되었다. 현재 제품화 되어 판매되고 있는 도관을 보면, 미국 시노비스(Synovis)사의 뉴로튜브(Neurotube)의 경우 수술용 봉합사에 사용되는 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA)으로 제작된 속이 빈 도관 형태이며, 인테그라(Integra)사 제품인 뉴라젠(NeuraGen)은 콜라겐으로 제작된 도관이다. 속이 빈 도관 형태의 제품은 신경재생 시 신경세포가 도관 벽면을 따라 재생되며, 최대 재생 할 수 있는 신경이 7cm 이내로 알려져 있다. 옥소젠(Axogen)사 제품인 어반스(Avance)의 경우 사체에서 유래된 신경을 탈세포화 제품으로 공여자로부터 질병 감염 우려가 있고, 물성이 약해 인장을 받는 부위에 사용이 어려우며 저장 안정성 문제로 -40℃에서 유통하는 단점을 가지고 있다.

이러한 문제를 극복하기 위하여 콜라겐 도관에 신경성장인자를 코팅한 기술 및 내부를 충진한 기술이 개발 되었다. 미국 등록특허 제5,925,053호에서는 도관 내부에 멀티채널을 제조하는 방법을 제시하였으며, 대한민국 특허공개 제2009-0037439호에서는 PGA 튜브 내측에 콜라겐을 포함시키는 조직 재생 방법을 제시하였다. 그러나 PGA 튜브의 경우 최대 4cm의 재생한계를 갖는 것으로 확인되고 있다.

또한, 미국 등록특허 제7,402,319호에는 신경 탈세포에 관한 내용으로 음이온계면활성제(Triton X-200 등)를 이용한 방법에 대하여 기술하는 등 계면활성제를 사용하여 신경을 탈세포 하는 기술이 제안되고 있다.

상술한 계면활성제는 현재 조직탈세포에 가장 많이 사용되는 물질이지만, 탈세포 과정에서 세포외기질의 파괴가 심하고 세척이 어려워 독성을 유발하는 문제를 가지고 있다.

이에 최대 4cm의 재생한계를 극복하고 조직탈세포에 사용하던 계면활성제를 대체하되, 끊어진 신경세포의 성장 혹은 부착을 효과적으로 재생할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

이에 본 발명의 목적은 세포, 유전자, 지방 등과 같은 면역이나 이물반응 유발물질을 포함하지 않는 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질이 도관 내에 스펀지 구조로 충진된 신경재생도관을 제공함으로써, 신경세포의 부착 혹은 성장을 개선시켜 끊어진 신경 혹은 조직이 상기 도관 내에서 효율적으로 재생될 수 있는 신경재생도관 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 신경재생도관은 도관 내부에, 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질이 충진된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 신경재생도관의 제조방법은,

i) 동물의 채취된 말초신경을 탈세포 공정을 거쳐 면역과 이물반응 유발물질이 제거된 탈세포-세포외기질을 제조하는 단계;

ii) 상기 탈세포-세포외기질을 분쇄하여 미가교 겔로 제조하는 단계; 및

iii) 상기 미가교 겔을 도관 내부에 충진한 다음 동결 건조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 세포, 유전자, 지방 등과 같은 면역이나 이물반응 유발물질을 포함하지 않는 동물 신경 조직의 탈세포-세포외기질이 도관 내에 스펀지 구조로 충진된 신경재생도관을 제공함으로써, 신경세포의 부착 혹은 성장을 개선시켜 끊어진 신경 혹은 조직이 상기 도관 내에서 효율적으로 재생되는 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명으로 제조된 신경재생도관의 제조 모식도이다.
도 2는 통상의 콜라겐 신경도관(좌측)과 본 발명에 따라 제조된 실시예1의 신경재생도관(우측)의 모식도이다. 도 2에서 통상의 콜라겐 신경도관(좌측)은 도관 벽을 따라 신경조직이 재생되지만, 본 발명에 따라 제조된 실시예1은 신경재생도관(우측)이 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질을 통해 조직이 입체적(멀티 채널)으로 재생되는 것을 확인하였다.
도 3은 본 발명의 실시예1에서 동물 신경조직으로서 좌골 신경조직을 사용한 경우 제조예2의 미충진 신경도관과 제조예1의 신경 탈세포물, 그리고 이들이 멀티 채널로 형성된 실시예1의 신경재생도관의 모식도이다. 도 3에서는 출발 물질(좌골말초신경) 내에 위치한 3종 신경(장딴지, 정강이, 종아리의 신경)을 고려하여 도관 안에 도관을 넣은 형태로 제공할 수 있었다.
도 4는 실시예1의 신경재생도관의 전자주사현미경 사진(좌측 x30, 우측 x200)이다. 실시예1의 신경재생 도관에 따르면, 도관 내 신경세포외기질이 스폰지 구조로 충진된 구조를 가짐으로써 신경세포의 부착 혹은 성장을 개선할 수 있다.
도 5는 본 발명에 따른 동물 신경조직의 탈세포 전후 DNA 정량 시험 결과를 도시한 그래프이다. 좌측의 탈세포 전 신경에서 38 ng의 DNA가 검출 되었는데, 우측의 탈세포 후 1.7 ng으로 줄었음을 확인할 수 있었다.
도 6은 본 발명에 따른 동물 신경조직의 탈세포 처리 후 콜라겐 함량 측정 결과를 도시한 그래프이다. 코켄(Koken)사 코켄 아텔로콜라겐 내 콜라겐 함량은 평균 96.63 ± 7.14 중량%이었고, 제조예1의 신경조직 탈세포물 내 콜라겐 함량은 32.59 ± 1.17 중량%이었고, 제조예2의 미충진(비어있는) 신경도관 내 콜라겐 함량은 90.04 ± 5.40 중량%이었으며, 실시예1의 신경재생도관 내 콜라겐 함량은 55.76 ± 3.50 중량%인 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 Koken사 콜라겐과 본 발명에 따른 동물 신경조직의 탈세포 처리 후 엘라스틴 함량 측정 결과를 도시한 그래프이다. Koken사 콜라겐 내 엘라스틴 함량은 평균 3.24 ± 0.47 중량%이었고, 제조예1의 신경조직 탈세포물 내 엘라스틴 함량은 0.26 ± 0.07 중량%이었고, 제조예2의 미충진 신경도관 내 엘라스틴 함량은 0.51 ± 0.02 중량%이었고, 실시예1의 신경재생도관 내 엘라스틴 함량은 0.35 ±0.13 중량%인 것을 확인할 수 있었다.
도 8은 Koken사 콜라겐과 본 발명에 따른 동물 신경조직의 탈세포 처리 후 GAG(glycosaminoglycan) 함량 측정 결과를 도시한 그래프이다. Koken사 콜라겐 내 GAG 함량은 평균 0.13 ± 0.008 중량%이었고, 제조예1의 신경조직 탈세포물 내 GAG 함량은 0.04 ± 0.001 중량%이었고, 제조예2의 미충진 신경도관 내 GAG 함량은 0.19 ± 0.001 중량%이었고, 실시예1의 신경재생도관 내 GAG 함량은 0.04 ± 0.031 중량%인 것을 확인할 수 있었다.
도 9는 제조예1의 동물 신경조직의 탈세포물의 탈세포 전후 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 함량 측정 결과를 대비한 표이다.
도 10은 제조예1의 동물 신경조직의 탈세포물의 탈세포 전후 라미닌 함량 측정 결과를 대비한 표이다. 탈세포 전 신경조직 내 라미닌 함량, 평균 43866.06 ± 1532.92 pg/g을 기준으로, 탈세포 후 신경조직 내 라미닌 함량은 평균 805.45 ± 257.12 pg/g인 것을 확인할 수 있었다.
도 11은 제조예2의 미충진 신경도관(좌측)과 실시예1의 신경재생도관(우측)의 봉합강도 측정 결과를 대비한 그래프이다.
도 12는 랫드를 이용한 좌골신경 손상 모델의 유효성 평가 모델로 음성대조군인 신경결손군, 제조예2의 미충진 신경도관 및 실시예1의 신경재생도관을 적용한 모델을 4주, 8주, 12주차에 각각 육안 관찰한 결과로서, 신경결손군은 신경에 연조직이 침투한 것을 확인하였고, 제조예2의 미충진 신경도관과 실시예1의 신경재생도관은 신경과 잘 연결된 것을 확인하였다.
도 13은 랫드를 이용한 좌골신경 손상 모델의 유효성 평가 모델로서 정상군, 음성대조군인 신경결손군, 제조예2의 미충진 신경도관 및 실시예1의 신경재생도관을 적용한 모델에 대한 4주, 8주, 12주차에 보행각(Ankle stance angle [ASA])을 측정한 결과이다.
도 14는 랫드를 이용한 좌골신경 손상 모델의 유효성 평가 모델로서 음성대조군인 신경결손군, 제조예2의 미충진 신경도관 및 실시예1의 신경재생도관을 적용한 모델에 대한 4주, 8주, 12주차에 좌골신경기능지수(Sciatic Function Index; SFI)를 측정한 결과이다.
도 15는 도 12의 랫드를 이용한 좌골신경 손상 모델로서 제조예2의 미충진 신경도관 및 실시예1의 신경재생도관을 적용한 모델에 대한 유효성 평가 12주째 각 도관의 신경조직을 H&E(위)와 면역조직염색(아래)으로서 S-100으로 염색하여 살펴본 결과이다.
도 16은 동결 건조의 온도조건 별 다공의 크기를 살펴본 전자현미경 사진으로, (a)는 -20℃에서 동결 후 동결건조(좌측 x50, 우측 x150)와 (b)는 -60℃에서 동결 후 동결건조(좌측 x50, 우측 x150)를 대비한 도면이다. (a)에서는 10㎛ 내지 600㎛의 다공을 관찰하였고, (b)에서는 10㎛ 내지 200㎛의 다공을 관찰할 수 있었다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 신경재생도관은 도관 내부에, 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질(extracellular matrix)이 충진 된 것을 기술적 특징으로 한다.

상기 도관은 일례로, 소, 말, 돼지 등 인간을 제외한 포유동물 중 진피조직의 탈세포 멤브레인일 수 있다.

상기 도관은 다른 일례로, 돼지껍데기, 소뼈, 오리발 등의 재료에서 물리·화학적 추출한 것으로, 바람직하게는 타입 1형 콜라겐 재질일 수 있다.

상기 콜라겐은 구체적인 예로, 소, 돼지 등 포유동물(인간 제외로부터 추출되거나 의료용으로 사용되는 것)의 콜라겐, 아텔로콜라겐 및 피부, 심근막, 뼈, 연골, 소장점막하조직, 양막 및 연조직유래의 탈세포 처리 조직 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 탈세포 처리 조직은 알칼리 및 극성 용매를 기반으로 하여, 추출 조직 중 면역 및 이물반응 유발 물질을 1차적으로 제거할 수 있는 탈세포 처리제를 사용하여 수득될 수 있다.

상기 알칼리는 일례로, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아 중에서 선택된 1종 이상을 0.01M 농도 내지 1M 농도 범위 내에서 사용할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 알칼리는 수산화나트륨 0.4M 농도 내지 0.6M 농도를 사용할 수 있다.

상기 극성 용매는 일례로, 탄소수 1 내지 4의 알코올 중에서 선택된 1종 이상을 10% 내지 100% 농도 범위 내로 사용할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 극성 용매는 에탄올 50% 내지 80% 범위 내일 수 있다.

상기 알칼리와 극성 용매는 1:9 ~ 9:1의 중량비로 배합하여 사용할 수 있다.

필요에 따라, 상기 탈세포 처리 전 탄소수 1 내지 4의 알코올 중 1종 이상의 극성 용매로 전처리할 수 있다.

상기 도관은 일례로, 길이(length) 10mm 내지 70mm, 내경(inner diameter) 0.5mm 내지 10mm, 두께 50㎛ 내지 1000㎛, 및 다공크기 400nm 내지 1300nm인 것일 수 있고, 이 범위 내에서 손상된 말초신경에 연결하기 위한 두께와 길이에 적합할 뿐 아니라 상피세포의 침투를 막고 영양물질의 교환에 유리한 다공크기를 가짐으로써 신경재생 측면에서 바람직하다.

또 다른 예로, 상기 도관은 길이 40mm 내지 50mm, 내경 1.5mm 내지 2mm, 두께 150㎛ 내지 350㎛, 및 다공크기 700nm 내지 950nm일 수 있다.

상기 도관의 길이는 재생대상인 분리된 신경에 봉합하였을 때 장력이 없는 텐션리스(tensionless: 분리된 신경의 절단된 간격보다 도관의 길이가 길어야 장력으로 인한 파손이 없음)와 도관 안쪽 5mm 내지 15mm 안쪽의 봉합 지점 위치를 동시에 고려하여, 절단간격보다 10mm 내지 20mm 더한 길이일 수 있고, 분리된 끝단의 신경 외경보다 도관의 내경이 0.1mm 내지 4mm 내로 큰 간극을 갖는 것이 섬유세포의 침투로 인한 재생방해를 방지하고 분리된 신경을 집어넣고 봉합하기에 바람직하다.

이 같은 이유로, 최대 30mm의 절단된 신경 연결 시 최소 40mm 내지 50mm 길이의 도관을 필요로 할 수 있고, 봉합강도 또한 중요한 팩터가 될 수 있다.

상기 도관의 다공도는 일례로 도관 표면적의 30% 내지 70% 범위 내이고, 이 범위 내에서 영양분이 효과적으로 교환되는 효과가 있다.

상기 도관의 다공 실측치는, 일례로 수은 침투를 이용한 기공률 분석기를 이용한 기공구조 분석 시, 평균 823.4 ± 114.7 nm 의 기공이 48.67 ± 2.47 % 범위 내일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "동물 신경조직의 탈세포-세포외기질"은 달리 특정하지 않는 한, 동물 신경조직을 탈세포 처리하여 수득된 신경 성장인자를 포함하는 세포외 기질을 지칭한다.

상기 동물 신경조직은 일례로, 돼지, 소 등의 포유동물 및 닭, 오리 등의 조류를 포함한 동물의 중추신경 조직 혹은 말초신경 조직일 수 있고, 상기 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질은 스펀지 구조일 수 있다.

상기 동물 신경조직에 대한 탈세포 처리제는 상기 도관에서 사용한 것과 동일한 탈세포 처리제를 적용할 수 있다.

다만 본 발명에서는 후술한 바와 같이, 반응 온도, 시간, 교반속도, 교환횟수 등의 탈세포 처리 조건을 최적화하고 면역이나 이물반응 유발물질을 제거할 수 있고, 그 결과 신경재생에 유효성분으로 알려진 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)와 라미닌을 포함하고 있어 별도 투입할 필요가 없는 잇점을 갖는다. 참고로, 상기 BDNF, 라미닌 등의 신경성장인자는 신경의 기능 회복을 증가시키는 유효인자로 공지되어 있다.

참고로, 동물실험 조직학 결과, 실시예1의 신경재생도관 사용시 제조예2의 미충진 신경도관 대비 말초신경의 재생이 증진되고, 빠른 축삭 재생을 유도하는 것을 확인할 수 있다(도 15 참조).

상기 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질은 콜라겐, 엘라스틴, GAG(glycosaminoglycan) 등을 포함할 수 있다.

상기 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질은 일례로, 콜라겐을 10중량% 내지 90중량%, 10중량% 내지 70중량%, 혹은 50중량% 내지 70중량% 범위 내로, 엘라스틴을 0.1중량% 내지 1.0중량%, 0.1중량% 내지 0.5중량%, 혹은 0.1중량% 내지 0.4중량% 범위 내로 포함하고, GAG를 0.001중량% 내지 0.1중량%, 혹은 0.01중량% 내지 0.05중량% 범위 내로 포함할 수 있다.

상기 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질은 라미닌 및 BDNF 등을 유효 성분으로 포함할 수 있다.

상기 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질은 일례로, BDNF를 100pg/g 내지 800pg/g, 혹은 160 내지 760pg/g 범위 내로, 라미닌을 100pg/g 내지 1500pg/g, 혹은 500 내지 1100pg/g 범위 내로 포함할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 BDNF는 탈세포 처리 전 함량 기준으로, 탈세포 후 20중량% 내지 40중량%, 혹은 25중량% 내지 35중량% 잔류하고, 라미닌은 탈세포 처리전 함량 기준으로, 탈세포 후 0.1중량% 내지 5중량%, 혹은 1중량% 내지 3중량% 잔류하는 것으로, 따라서 본 발명에서는 별도로 신경성장인자를 투입할 필요가 없는 잇점을 제공할 수 있다.

상기 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질은 일례로, 상기 미충진 신경도관의 중공(hole) 부피 100% 기준으로 50부피% 내지 100부피%, 혹은 80부피% 내지 100부피%로 충진 될 수 있고, 이 범위 내에서 신경재생을 촉진하는 효과가 있다.

상기 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질은 SEM 사진을 이용한 단면 구조를 통한 기공 분석시(수은을 사용하여 기공분석하기엔 물성이 약함), 자체 다공도가 20% 내지 90%, 혹은 60% 내지 90% 범위 내이고, 다공크기는 10㎛ 내지 1000㎛, 혹은 10㎛ 내지 600㎛일 수 있다.

상기 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질에 대한 다공크기는 동결 건조 조건에 따라 조절할 수 있는 것으로, 일례로, -20℃ 내지 -50℃ 하에 동결 후 동결건조시 10㎛ ~ 600㎛의 다공을 확인할 수 있고, -55℃ 내지 -80℃ 하에 동결 후 동결건조시 10 ~ 200㎛의 다공을 관찰할 수 있다(도 16(a), (b) 참조).

상기 충진은 멀티-채널 충진, 나아가 삼차원 입체 충진의 스펀지상 구조인 것이 손상된 신경세포의 부착 속도 혹은 성장 속도에 바람직한 효과를 제공할 수 있다.

상기 용어 "멀티-채널 충진"이란 달리 특정하지 않는 한, 본 발명의 신경재생도관에 따르면 신경을 재생하고자 하는 부위 내 재생시켜야 할 신경 개수가 2 이상인 경우, 도관 내부에 동물 신경조직의 탈세포-세포외기질이 충진된 신경재생 도관(모 신경재생도관에 해당) 내부에 2이상, 혹은 2 내지 5개의 신경재생도관(자 신경재생도관에 해당)을 내포하는 구조를 갖는 것을 지칭할 수 있다.

구체적인 예로, 도 3에 따르면, 좌골말초신경의 분리된 3개 신경(장딴지, 정강이, 종아리)의 경우 신경재생도관 안에 각 신경별 1종씩 총 3종의 재생도관을 배포시킬 수 있다.

본 발명의 신경재생도관은 다음과 같은 순서로 제조될 수 있다:

i) 동물의 채취된 말초신경을 탈세포 공정을 거쳐 면역과 이물반응 유발물질이 제거된 탈세포-세포외기질을 제조하는 단계;

ii) 상기 탈세포-세포외기질을 분쇄하여 미가교 겔로 제조하는 단계; 및

iii) 상기 미가교 겔을 도관 내부에 충진한 다음 동결 건조하는 단계.

상기 동물 신경조직의 전처리 및 탈세포 처리를 포함한 전체 공정은 일례로 다음과 같이 수행될 수 있다.

즉, 동물의 신경조직을 물리적으로 분리하고(제1 단계), 분리한 신경조직을 극성 용매를 사용하여 전처리하고(제2 단계), 상기 전처리물을 탈세포 처리제를 사용하여 처리하고(제3 단계), 상기 탈세포 처리제로 처리된 전처리물을 알칼리 용매를 사용하여 처리한 후(제4 단계), 수득된 탈세포 처리물은 세척 후 산, 완충용액(PBS) 등을 이용하여 필요로 하는 pH로 조절하는(제5 단계) 것일 수 있다.

다른 일례로, 상기 제1 단계를 통하여 동물의 신경조직을 분리하고, 상기 제2 단계를 통하여 탄소수 1 내지 4의 알코올 중에서 1종 이상 선택되고 10% 내지 100% 농도인 극성 용매를 사용하여 1 내지 24 시간 동안 처리하며, 상기 제3 단계에서 탈세포 처리제로는 에탄올 50% 내지 80%와 수산화나트륨 0.4M 농도 내지 0.6M 농도를 배합한 것을 1 내지 48 시간 동안 사용하고, 상기 제4 단계에서 0.4M 농도 내지 0.6M 농도의 수산화나트륨 용액을 1 내지 24 시간 동안 사용하고, 제5 단계에서 염산, 황산, 퍼아세트산, 아세트산 인산완충용액(PBS) 등에서 선택된 1종 이상을 사용하여 pH 2 내지 10으로 조절하는 것일 수 있다. 여기서 상기 제2 내지 제4단계는 0℃ 내지 37℃의 온도 하에 물리적 교반하여 수행될 수 있다.

구체적인 예로, 상기 제1 단계를 통하여 돼지 좌골신경을 물리적으로 분리하고, 식염수로 세척한 다음, 상기 제2 단계를 통하여 세척한 좌골신경 1g 당 70% 에탄올 20 ml을 넣고 교반 속도 100rpm 내지 120rpm, 온도 5℃ 내지 15℃ 하에 12시간씩 2회 교환하며 교반하고 세척 후, 상기 제3 단계에서 탈세포 처리제로서 70% 에탄올에 0.5 N 수산화나트륨을 넣은 용액으로 교체한 후 교반 속도 180rpm 내지 200rpm, 온도 5℃ 내지 15℃ 하에 16시간씩 3회 교환하며 교반하고, 상기 제4 단계에서 세척 후 정제수에 0.5 N 수산화나트륨을 넣은 용액으로 교체한 후 교반 속도 100rpm 내지 120rpm, 온도 5℃ 내지 15℃ 하에 하에 24시간 동안 교반하고, 상기 제5 단계에서 세척 후 인산완충용액(PBS)을 사용하여 pH를 중성으로 조절하는 것일 수 있다.

상기 도관은 일례로, 동물의 진피조직을 분리 후 탈세포 공정에 의해 멤브레인을 제조하거나, 나아가 도관 형태로 제조하는 단계; 및

상기 멤브레인을 가교하는 단계, 상기 화학적 가교 처리는 헥사메틸렌디이소시아네이트, 에폭시 그룹, 카르보이미드, 또는 아실아자이드 등과 같은 화학적 가교제를 이용하여 처리할 수 있다.

상기 탈세포 공정은 일례로, 에탄올 처리공정, 알칼리 복합용매 처리공정 및 중화 공정을 순차 수행하는 것일 수 있다.

상기 알칼리 복합용매는 일례로 알칼리와 극성용매 알코올의 복합물일 수 있다.

상기 도관의 상술한 전처리 및 탈세포 처리를 포함한 전체 공정은 다음과 같이 수행될 수 있다.

동물의 진피 조직을 물리적으로 분리하고(제1 단계), 분리한 진피 조직을 극성 용매를 사용하여 전처리하고(제2 단계), 상기 전처리물을 상기 탈세포 처리제로 처리하고(제3 단계), 상기 탈세포 처리제로 처리한 전처리물을 알칼리 용매를 사용하여 처리한 후(제4 단계), 수득된 탈세포 처리물은 세척 후 산을 이용하여 필요한 pH로 조절하는(제5 단계) 것일 수 있다.

다른 예로, 상기 제1 단계를 통하여 동물의 진피조직을 분리하고, 상기 제2 단계를 통하여 탄소수 1 내지 4의 알코올 중에서 1종 이상 선택되고 10% 내지 100% 농도인 극성 용매를 사용하여 1시간 내지 24시간 동안 처리하며, 상기 제3 단계에서 탈세포 처리제로 에탄올 50% 내지 80%와 수산화나트륨 0.4M 농도 내지 0.6M 농도를 배합한 것을 1 내지 24 시간 동안 사용하고, 상기 제4 단계에서 0.4M 농도 내지 0.6M 농도의 수산화나트륨 용액을 1 내지 24 시간 동안 사용하고, 제5 단계에서 산으로는 염산, 황산, 퍼아세트산, 아세트산 등에서 선택된 1종 이상을 사용하여 pH 2 내지 10으로 조절할 수 있다. 여기서 상기 제2 내지 제4 단계는 0℃ 내지 37℃의 온도 하에 물리적 교반 조건으로 수행될 수 있다.

구체적인 예로, 상기 제1 단계를 통하여 돼지 진피세포를 물리적으로 분리하고, 식염수로 세척한 다음, 상기 제2 단계를 통하여 세척한 진피세포 1g 당 70% 에탄올 20 ml을 넣고 교반 속도 100rpm 내지 120rpm, 온도 5℃ 내지 15℃ 하에 24시간 동안 교반하고 세척 후, 상기 제3 단계에서 탈세포 처리제로서 70% 에탄올에 0.5 N 수산화나트륨을 넣은 용액으로 교체한 후 교반 속도 100rpm 내지 120rpm, 온도 5℃ 내지 15℃ 하에 24시간 교반하고, 상기 제4 단계에서 세척 후 정제수에 0.5 N 수산화나트륨을 넣은 용액으로 교체한 후 교반 속도 100rpm 내지 120rpm, 온도 5℃ 내지 15℃ 하에 24시간 동안 교반하고, 상기 제5 단계에서 세척 후 1M 아세트산을 사용하여 pH를 중성으로 조절하는 것일 수 있다.

그런 다음 탈세포 된 돼지 피부를 동결건조 후 0.01 내지10% 혹은 0.1 내지 4%의 무게비로 정제수에 분쇄하고, 수득된 섬유상 용액을 직물 천에 분주하고, 그 위에 다시 직물 천을 덮은 후 가압하여 수분을 제거한 압축된 콜라겐 섬유상을, 천으로부터 분리하고 도관 형태의 몰드를 이용하여 도관을 수득할 수 있다.

제조한 도관은 동결 후 동결 건조하되, 가교한 다음 세척하여 미가교 분획은 제거한 다음 동결건조 시키는 방식으로 도관을 제조하였다.

상기 동결은 일례로, 온도 -0℃ 내지 -80℃, -15℃ 내지 -65℃, 혹은 -15℃ 내지 -45℃에서 수행할 수 있다.

상기 동결 건조는 일례로, 온도 0℃ 내지 -120℃, -20℃ 내지 -60℃, 혹은 -50℃ ~ -60℃이고, 일례로 압력 760 Torr 내지 1 mTorr, 10 mTorr 내지 1 mTorr, 혹은 5 mTorr 내지 1 mTorr 조건 하에 수행할 수 있다(1기압 = 760torr).

상기 가교는 통상의 가교 방식을 적용할 수 있는 것으로, 일례로 순도 99% 에탄올에 0.1% 농도의 헥사메틸렌티이소시아네이트(hexamethylene di-isocyanate, HMDI)를 넣고 상온(25 ℃) 하에 24시간 수행할 수 있다.

상기 탈세포-처리한 신경조직을 정제수에 넣은 후 분쇄하여 겔 형태로 수득하고, 얻어진 도관에 충진한 다음 동결건조하여 신경재생도관을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 신경재생도관은 일례로 봉합강도가 0.1 N 이상, 혹은 2 N 이상일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

<제조예 1>

신경조직 탈세포

돼지 좌골신경을 물리적 방법으로 분리한 후 식염수로 세척하였다(1단계). 세척한 좌골신경 1g 당 70% 에탄올 20ml을 넣고 교반 속도 120rpm, 온도 10℃에서 12시간씩 2회 교환하며 교반하였다(2단계).

세척 후 70% 에탄올에 0.5 N 수산화나트륨을 넣은 용액으로 교체한 후 교반 속도 180rpm, 온도 10℃에서 16시간씩 3회 교환하며 교반하였다(3단계).

그런 다음 세척 후 정제수에 0.5 N 수산화나트륨을 넣은 용액으로 교체한 후 교반 속도 100rpm, 온도 10℃에서 24시간 동안 교반하였다. 세척 후 인산완충용액(PBS)을 사용하여 pH를 중성으로 조절(4단계)한 후 탈세포 된 신경조직을 동결건조(-50 ~ -60℃, 1 ~ 5 mTorr)하였다.

<제조예 2>

신경도관(미충진) 제조

돼지 진피세포를 물리적 방법으로 분리한 후 식염수로 세척하였다(1단계). 세척한 진피세포 1g 당 70% 에탄올 20ml을 넣고 교반 속도 120rpm, 온도 10℃에서 24시간 교반하였다(2단계).

세척 후 70% 에탄올에 0.5 N 수산화나트륨을 넣은 용액으로 교체한 후 교반 속도 120rpm, 온도 10℃에서 24시간 교반하였다(3단계).

상기 교반한 다음 세척 후 정제수에 0.5 N 수산화나트륨을 넣은 용액으로 교체한 후 교반 속도 120rpm, 온도 10℃에서 24시간 동안 교반하였다. 세척 후 1M 농도 아세트산을 사용하여 pH를 중성으로 조절하였다(4단계).

상기 4단계 후 탈세포 된 돼지 피부를 동결건조 후 정제수에서 분쇄하여 2% 용액으로 제조하고(5단계), pH를 등전점(pH 4 내외)으로 조절하여 콜라겐 섬유상을 만들고 직물 위에 부은 후 다시 직물을 덮고 프레스를 이용하여 가압하였다. 압축된 콜라겐 섬유상과 천을 분리한 후 일정한 직경을 가지는 도관 형태의 몰드를 이용하여 제조하였다.

상기 제조된 도관은 -20℃에서 동결 후 동결건조하여, 순도 99% 에탄올에 0.1% 농도의 헥사메틸렌티이소시아네이트(hexamethylene di-isocyanate, HMDI)를 넣고 상온(25 ℃)에서 24시간 가교한 다음 세척하여 -55℃, 5 mTorr 압력 조건 하에 동결건조시키는 방식으로 도관을 제조하였다.

상기 제조된 도관은 길이 30mm, 내경 1.5mm, 수은 침투를 이용한 기공률 분석기(Porosimeter_Autopore IV9520, micromeritics, USA)를 이용한 기공구조 분석 결과, 3회 측정 평균 823.4 ± 114.7 nm 의 기공이 48.67 ± 2.47 % 범위 내이었다.

<실시예 1>

신경재생도관의 제조

제조예1의 탈세포-신경조직을 주사용수(정제수)에 2% 무게비로 분쇄하여 겔로 제조하였다. 상기 겔을 제조예 2에서 제조된 도관에 주사기 등을 이용하여 충진한 다음 -20℃로 동결하여 -55℃, 5 mTorr 조건 하에 동결건조하여 신경재생도관을 제조하였다. 참고로, 제조 순서를 도 1에 모식화하였고, 도관 내부에서 신경세포가 성장되는 모식도를 또한 도 2에 나타내었다.

<시험예 1: 미세구조 분석>

실시예1의 신경재생도관의 미세구조를 주사전자현미경(scanning electron microscope, JEOL, JSM-6380, 일본; 20KV)을 이용하여 분석하고 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보듯이, 신경도관 안에 탈세포-신경조직이 다공성 구조로 충진되어 있는 것을 관찰할 수 있었다.

<시험예 2: 신경 탈세포 분석 - DNA 함량>

제조예1 중 탈세포 전후 신경조직의 DNA 함량을 피코그린 DNA 정량법을 사용하여 정량하였다.

그 결과, 도 5의 그래프에서 확인할 수 있듯이, 탈세포 전 신경조직의 DNA 함량은 평균 38 ng 정도로 제조예 1에 따른 탈세포 후 신경조직의 평균 DNA 함량 1.7 ng보다 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 3: 성분분석 - 콜라겐 함량>

제조예1의 신경 탈세포물, 제조예2의 미충진 신경도관, 실시예1의 신경재생도관 내 콜라겐 함량을 분석하기 위해 콜라겐 내에 존재하는 히드록시프롤린(Hydroxyprolin)의 함량을 3회 평균 정량하였다. 검체는 시중에 판매되고 있는 Koken사 콜라겐과 대비하였다.

그 결과, 도 6의 그래프에서 확인할 수 있듯이, Koken사 콜라겐 내 콜라겐 함량은 96.63 ± 7.14 %, 제조예1의 신경 탈세포물 내 콜라겐 함량은 32.59 ±1.17 %, 제조예2의 미충진 신경도관 내 콜라겐 함량은 90.04 ± 5.40 %, 실시예1의 신경재생도관 내 콜라겐 함량은 55.76% ± 3.50 %인 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 4: 성분분석 - 엘라스틴 함량>

제조예1의 신경 탈세포물, 제조예2의 미충진 신경도관, 실시예1의 신경재생도관 내 엘라스틴 함량을 분석하기 위해 파스틴 엘라스틴 어세이 키트(Fastin Elastin assay kit; Biocolor life science assays)를 사용하여 3회 평균 정량하였다.

그 결과, 도 7의 그래프에서 확인할 수 있듯이, Koken사 콜라겐 내 엘라스틴 함량은 3.24 ± 0.47%, 제조예1의 신경 탈세포물 내 엘라스틴 함량은 0.26 ± 0.07%, 제조예2의 미충진 신경도관 내 엘라스틴 함량은 0.51 ± 0.02%, 실시예1의 신경재생도관 내 엘라스틴 함량은 0.35 ± 0.13%인 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 5: 성분분석 - GAG 함량>

제조예1의 신경 탈세포물, 제조예2의 미충진 신경도관, 실시예1의 신경재생도관 내 GAG 함량을 분석하기 위해 설페이티드 글리코스아미노글리칸 어세이 키트(Sulfated glycosaminoglycan assay kit; Biocolor life science assays)를 사용하여 3회 평균 정량하였다. 검체는 시중에 판매되고 있는 Koken사 콜라겐과 비교 분석하였다.

그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이, Koken사 콜라겐 내 GAG 함량은 0.13 ± 0.008%, 제조예1의 신경 탈세포물 내 GAG 함량은 0.04 ± 0.001%, 제조예2의 미충진 신경도관 내 GAG 함량은 0.19 ± 0.001%, 실시예1의 신경재생도관 내 GAG 함량은 0.04 ± 0.031%인 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 6: 신경 탈세포 분석 - BDNF 함량>

제조예1 중 탈세포 전후 신경조직의 BDNF 함량을 Elisa Kit(고마바이오텍, EK0308, Range 31.2 pg/ml ~ 2000 pg/ml, Sensitivity < 2 pg/ml)를 사용하여 정량하였다.

그 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이, 탈세포 전 신경조직의 BDNF 함량은 평균 1539.259 ± 138.9259 pg/g 기준으로, 탈세포 후 신경조직의 평균 472.592 ± 285.52 pg/g로서, 별도로 BDNF를 투입할 필요가 없을 정도로 충분한 함량 범위 내인 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 7: 신경 탈세포 분석 - 라미닌 함량>

제조예1 중 탈세포 전후 신경조직의 라미닌 함량을 Elisa Kit(고마바이오텍, EK0435, Range 156 pg/ml ~ 10,000 pg/ml, Sensitivity < 10pg/ml)를 사용하여 정량하였다.

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이, 탈세포 전 신경조직의 라미닌 함량은 평균 43866.06 ± 1532.926 pg/g 기준으로, 탈세포 후 신경조직의 평균 805.4545 ± 257.1297 pg/g로서, 별도로 라미닌을 투입할 필요가 없을 정도로 충분한 함량 범위 내인 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 8: 봉합강도 분석>

제조예2의 미충진 신경도관과 실시예 1의 신경재생도관의 봉합강도를 측정하였다.

구체적으로, 만능물성측정기(Universal Testing Machine, 3366, Instron)를 이용하여 각 도관(길이20mm, 직경2mm)을 37℃ 인산완충용액(PBS)에서 24시간 수화 시킨 후 봉합찢김강도를 측정하였다.

또한 시편 끝단의 약 3 ㎜ 부분에 4-0 나일론 봉합사로 봉합한 후 로드셀이 연결된 지그에 고정한 후 20 ㎜/min의 속도로 잡아당겨 찢어질 때의 하중 위치 최대 값(N)을 측정하고 봉합 강도를 확인하였다.

도 11의 그래프에서 보듯이, 제조예2의 미충진 신경도관의 봉합 강도는 3회 평균 2.36 N이었고, 실시예1의 신경재생도관의 봉합 강도는 3회 평균 2.75 N이었다.

<시험예 9: 유효성 동물 실험>

제조된 신경재생도관의 유효성을 평가하기 위하여 랫드를 이용한 좌골신경 절제 모델을 이용하여 실험을 진행하였다.

실험그룹은 신경을 절단하고 처지하지 않는 음성대조군, 콜라겐 도관을 이식한 대조군, 신경 ECM 도관을 이식한 실험군으로 진행하였다. 랫드의 좌측 좌골신경을 1cm 절단 한 후 도관을 끊어진 신경에 봉합하여 연결하였다(도 12 참조).

참고로, 랫드를 이용한 좌골신경 손상 모델의 유효성 평가 모델을 4주, 8주, 12주차에 각각 육안 관찰한 도 12에서 보듯이, 신경결손 그룹은 신경에 연조직이 침투한 것을 확인할 수 있고, 제조예2의 미충진 신경도관과 본 발명의 실시예1의 신경재생도관은 신경과 잘 연결된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 4, 8 및 12주 후 쥐를 희생시켜 시술한 신경 부위를 채취한 후 H&E 염색과 면역화학염색인 S-100 염색을 진행하고 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 보듯이, 12주째 제조예2의 미충진 신경도관과 실시예1의 신경재생도관의 신경조직을 H&E와 면역조직염색인 S-100으로 염색하여 살펴본 결과, 신경세포의 부착과 성장이 더욱 치밀하게 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

나아가, 랫드를 이용한 좌골신경 손상 모델의 유효성 평가에서 발목관절 보행각(Ankle stance angle [ASA], 도 13)과 좌골신경 기능지수(Sciatic function index; SFI, 도 14)를 측정하였을 때 기능이 향상된 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 10: 동결건조 온도조건 실험>

상기 실시예1에서 -20℃에서 동결한 후 동결건조하여 측정한 다공크기는 10㎛ 내지 600㎛ 범위 이내였고(도 16(a)), 상기에서 -60℃에서 동결한 후 동결건조하여 측정한 다공크기는 10㎛ 내지 200㎛ 범위 내이었다(도 16(b)).

동결 건조시 동결온도에 따라 마이크로 미터 단위의 다공크기를 수득할 수 있으며, 특히 -20℃에서 동결하여 동결건조시 바람직한 다공을 형성한 것을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

1. 도관 내부에, 인간을 제외한 동물 신경조직의 세포외기질 탈세포처리물이 충진된 것으로, 상기 동물 신경조직은 동물의 중추신경 조직 혹은 말초신경 조직으로서 상기 동물 신경조직의 세포외기질 탈세포처리물은 뇌유래 신경영양인자(BDNF) 100 pg/g 내지 800 pg/g 및 라미닌 100 pg/g 내지 1200 pg/g을 포함하고, 상기 동물 신경조직의 세포외기질 탈세포처리물 총중량 기준으로, 콜라겐 10 내지 90중량%, 엘라스틴 0.1 내지 1.0중량%, 및 GAG(glycosaminoglycan) 0.01 내지 0.1중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경재생도관.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 도관은 길이 10mm 내지 70mm, 내경 0.5mm 내지 10mm, 두께 50㎛ 내지 1000㎛, 및 다공크기 400nm 내지 1300nm를 갖는 동물 진피조직의 탈세포 멤브레인인 것을 특징으로 하는 신경재생도관.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서,
   상기 동물 신경조직의 세포외기질 탈세포처리물은 다공도 20% 내지 90% 및 다공크기 10㎛ 내지 1000㎛를 갖는 것으로, 상기 도관의 중공(hole) 부피 100% 기준, 50 부피% 내지 100 부피%로 충진 된 것을 특징으로 하는 신경재생도관.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 신경재생도관은 내부에 2 이상의 신경재생도관을 내포한 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 신경재생도관.
   
7. i) 인간을 제외한 동물의 채취된 말초신경을 탈세포 공정을 거쳐 면역과 이물반응 유발물질이 제거되고, 뇌유래 신경영양인자(BDNF) 100 pg/g 내지 800 pg/g 및 라미닌 100 pg/g 내지 1200 pg/g을 포함하고, 상기 동물 신경조직의 세포외기질 탈세포처리물 총중량 기준으로, 콜라겐 10 내지 90중량%, 엘라스틴 0.1 내지 1.0중량%, 및 GAG(glycosaminoglycan) 0.01 내지 0.1중량%를 포함하는 세포외기질 탈세포처리물을 제조하는 단계;
   ii) 상기 세포외기질 탈세포처리물을 분쇄하여 미가교 겔로 제조하는 단계; 및
   iii) 상기 미가교 겔을 도관 내부에 충진한 다음 동결 건조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경재생도관의 제조방법.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 미가교 겔은 정제수에 세포외기질 탈세포처리물을 분쇄하여 겔화시켜 제조된 것을 특징으로 하는 신경재생도관의 제조방법.
   
9. 제 7항에 있어서,
   상기 도관은 인간을 제외한 동물의 진피조직을 분리 후 탈세포 공정에 의해 멤브레인을 제조하거나, 나아가 도관 형태로 제조하는 단계; 및
   상기 멤브레인 혹은 도관에 순도 99%(w/w) 이상의 에탄올에 0.1%(v/v) 농도의 디이소시아네이트 화합물을 배합한 가교제를 투입하고 실온에서 24시간 가교 후 세척하고 동결건조하는 단계;로 제조된 것을 특징으로 하는 신경재생도관의 제조방법.
   
10. 제 7항 또는 제 9항에 있어서,
    상기 탈세포 공정은 에탄올 처리공정, 알칼리와 극성용매 알코올을 1:9 내지 9:1의 중량비로 배합한 알칼리 복합용매로의 처리공정 및 중화 공정으로 구성된 것을 특징으로 하는 신경재생도관의 제조방법.
    
11. 제 7항에 있어서,
    상기 동결 건조는 온도 0℃ 내지 -120℃ 및 압력 760 Torr 내지 1 mTorr 압력 조건하에 수행하는 것을 특징으로 하는 신경재생도관의 제조방법.

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