KR20220089165A - 무세포 신경 이식재 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동종 및 이종 신경 조직을 이용한 무세포 신경 이식재 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 무세포 용액으로 저농도의 염기 용액과 계면활성제를 사용함으로써 전체 제조 공정 상에서 염기 용액과 계면활성제의 사용을 최소화하여 조직내 잔류하는 용매나 계면활성제로 인한 세포 및 조직 독성을 최소화할 수 있다. 또한, 연동 펌프를 사용하여 조직의 구조를 유지하면서 효율적으로 지방과 세포를 제거할 수 있다.

Description

무세포 신경 이식재 및 그 제조방법{ACELLULAR NERVE GRAFT AND METHOD OF MAKING THE SAME}

본 발명은 동종 및 이종 신경 조직을 이용한 무세포 신경 이식재 및 그 제조방법에 관한 것이다.

말초신경이 후천적인 요인으로 손상된 경우, 즉 외상에 의하여 손상을 입거나 치료를 위해 신경을 절제한 경우, 손상 또는 절제된 신경을 접합하기 위해 말초신경 재생술이 사용된다. 그러나, 한번 끊어진 신경의 복원은 쉽지 않으며, 수술을 하더라도 대부분의 경우 신경을 정확하게 접합시키는 것은 거의 불가능하고 접합을 하더라도 장력의 차이로 재생이 잘 이루어지지 않는 경우가 생긴다. 이를 해결하기 위하여, 자가 신경 또는 인조 신경 등과 같은 이식재를 사용하여 재생을 실시한다.

자가신경 이식의 경우, 환자 본인의 신경을 이식하기 때문에 면역반응의 위험성이 적고 신경 재생능이 우수하다. 반면, 충분한 양의 신경 조직을 얻기 어렵고, 채취 가능한 부위가 제한적이고 손상부위의 굵기와 형태가 일치하는 신경 조직을 얻기 어려우며 운동능력, 감각능력 소실과 같은 합병증의 발생 위험도가 높다는 단점이 있다.

인조신경 이식의 경우, 신경 도관의 형태로 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA), 제1형 콜라겐(type I collagen) 등의 흡수성 물질을 사용하여 만든 인공 신경 도관을 사용한다. 인공 신경 도관의 제조는 원하는 크기의 신경을 만들 수 있으나, 면역반응의 위험이 있고 신경 재생능이 부족하여 3 cm 이하의 감각 신경 재생에만 제한적으로 사용된다는 단점이 있다.

이와 같은 단점들을 극복하기 위하여, 사용되는 방법으로 동종으로부터 기증 받은 신경을 무세포화하여 사용하는 동종신경 이식술이 있다. 동종신경 이식술은 동종의 신경을 이식하기 때문에 조직의 무세포화가 필수적이며 이렇게 무세포화한 신경은 면역반응의 위험이 적으며, 다양한 크기의 신경을 만들어 필요한 부위에 사용할 수 있다는 장점이 있다.

동종 신경 이식재는 조직 내 잔류하는 세포로 인한 면역반응을 최소화하기 위하여 세포를 제거하는데 일반적으로, 세포와 세포외기질과의 물리화학적 특성 차이를 이용하여 조직의 손상 없이 세포만 선별적으로 제거하는 방법을 이용한다. 또한, 면역반응은 주로 세포막에 존재하는 막단백질에 의해 야기되므로, 막 단백질을 제거하기 위한 단백질 분해효소와 세포막의 주성분인 인지질을 여러 가지 계면활성제를 이용하여 세포를 제거한다. 일반적으로 소듐도데실설페이트(Sodium dodecylsulfate, SDS)와 같은 이온성 계면활성제, 또는 트리톤엑스-100(Triton X-100), 트윈20(Tween 20), 트윈40, 트윈60, 트윈80, 노니데트피-10(Nonidet P-10, NP-10), 노니데트피-40(NP-40) 등과 같은 비이온성 계면활성제 등이 이용된다. 그러나, 일반적으로 사용되는 효소와 계면활성제를 이용한 무세포화 방법은 신경 조직의 구조를 손상시킬 수 있고 이들의 잔류로 인하여 체내에서 세포 및 조직 독성을 유발할 수 있다. 또한, 이를 최소화시키기 위해, 막대한 양의 세척 시간 및 비용 등을 투입해야 하는 단점이 있다.

현재 알려진 신경 조직 내 세포를 제거하는 방법으로는 Sondell과 Hudson 방법이 있다. Sondell 방법은 Triton X-100과 소듐데옥시클로라이트(Sodium Deoxycholate, SDC)를 사용하며, Hudson 방식은 술포베테인(Sulfobetaine)과 SDC를 사용한다. 하지만, 이러한 방법들은 오랜시간 동안 높은 농도의 계면활성제나 효소를 처리하고 모든 공정을 shaker를 사용하여 진행하기 때문에 신경 조직의 구조를 손상시킬 수 있으며, 조직에 잔류하는 계면활성제를 제거하고 용액을 교체하는데 많은 시간을 필요로 하여 공정이 완료되기까지 3 일에서 4 일의 시간이 걸린다는 단점이 있다.

현재 국내에서 신경 조직을 무세포화 하는 기술은 개발이 되었으나 제품 양산까지 진행된 제품은 없는 것으로 알려져 있다. 반면, 미국 Axogen사의 Avance 제품은 Hudson 방법을 개량하여 세포를 제거한 제품으로 현재 유일한 무세포 사람신경 이식재로 외상으로 인하여 손상된 말초신경의 재생에 효과적인 것으로 보고되고 있다. 그러나, Avance 제품은 효소 및 계면활성제의 사용 비율이 높아 조직 내 효소 및 계면 활성제의 잔류로 인한 면역반응이 있을 수 있고, 이를 최소화하기 위하여 막대한 양의 세척시간이 필요로 하여 제조 공정이 오래 걸리며 모든 공정을 shaker로 진행하기 때문에 조직에 손상을 줄 수 있다. 또한, 동결 상태로만 제공되기 때문에, 유통이나 보관이 어려운 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 새로운 무세포화 기술을 통해 말초신경 손상환자에게 이식 가능한 무세포 신경 이식재 및 그 제조방법을 제시하고자 한다.

1. Histol Histopathol (2017) 32: 779-792

본 발명은 새로운 무세포화 기술을 통해 말초신경 손상환자에게 이식 가능한 무세포 신경 이식재 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 무세포 용액으로 높은 농도의 염기 용액 또는 계면활성제를 사용할 경우 이식재의 구조가 무너지고, 낮은 농도의 염기 용액 또는 계면활성제를 사용할 경우 세포가 완전히 제거되지 않는다는 단점을 개선하기 위하여, 무세포 용액으로 저농도의 염기 용액과 음이온성 계면활성제를 사용함으로써 상기 문제점을 개선하고, 전체 제조 공정 상에서 염기 용액과 음이온성 계면활성제의 사용을 최소화하여 조직내 잔류하는 용매나 계면활성제로 인한 세포 및 조직 독성을 최소화하며, 세척에 사용되는 시간을 단축시키는 무세포 신경 이식재 및 그 제조방법을 제공한다.

또한, Shaker를 이용하여 무세포화 공정을 진행 시 세포가 완전히 제거되지 않고, 조직의 구조를 손상시킬 수 있다는 단점을 개선하기 위하여, 연동 펌프를 사용하여 조직의 구조를 유지하면서 효율적으로 지방과 세포를 제거하고, 동결 보관 이외에 상온에서도 보관할 수 있는 동결 건조 및 수화 형태의 무세포 신경 이식재 및 그 제조방법을 제공한다.

본 발명은 a) 신경 조직의 지질 성분을 제거하는 단계; 및

b) 상기 지질 성분이 제거된 신경 조직에서 세포를 제거하는 단계를 포함하고,

상기 단계 b)는 신경 조직에 염기 용액 및 음이온성 계면활성제를 처리하며,

상기 단계 a) 및 b)는 연동펌프(peristaltic pump) 시스템을 사용하여 수행되는 무세포 신경 이식재의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 무세포 신경 이식재를 제공한다.

본 발명에서는 효소의 사용을 배제한 무세포화 및 탈지방화 공정으로, 무세포 용액으로 저농도의 염기 용액 및 음이온성 계면활성제를 사용함으로써, 염기 용액과 음이온성 계면활성제를 최소한으로 사용하여 계면활성제의 잔류로 인한 체내 세포 및 조직 독성을 최소화할 수 있다. 또한, 염기 용액이나 계면활성제를 단일로 사용했을 때 높은 농도를 사용시 구조가 무너지고 낮은 농도를 사용시 세포가 완벽하게 제거되지 않는 문제를 해결할 수 있다. 또한, 신경 조직의 구조를 유지하면서 완벽히 세포를 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 기존 공정과는 달리 무세포화 공정과 함께 탈지방화 공정을 추가로 추행함으로써, 효과적으로 지방 조직을 제거할 수 있다.

또한, 기존 공정에서는 shaker를 사용하여 공정을 진행하여 이식재의 구조가 망가지는데 비해, 본 발명에서는 연동 펌프를 이용하여 공정을 진행함으로써 조직의 구조를 균일하게 유지하면서 효과적으로 조직의 무세포화를 진행할 수 있다. 또한, 기존 공정이 무세포 신경 이식재를 제작하는데 통상적으로 4일에서 5일 정도가 소요되는데 반해, 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 탈지방화 및 무세포화 기간을 2 일로 단축시킬 수 있다.

또한, 동결 상태로 유통되는 기존 제품과는 달리, 본 발명에서는 상온에서 보관이 가능한 동결건조 또는 수화 타입의 무세포 신경 이식재를 제공할 수 있다.

도 1은 연동 펌프를 사용한 무세포 신경 이식재 제조 공정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 무세포 조건에 따른 신경 조직의 무세포 정도와 조직의 구조를 나타내는 DAPI 및 SEM 사진(a) 및 DNA 정량을 나타내는 그래프(b)이다.
도 3은 연동 펌프 사용에 따른 신경 조직의 무세포 정도와 구조를 나타내는 DAPI 및 SEM 사진(a), DNA 정량을 나타내는 그래프(b) 및 조직의 균일성을 나타낸 그래프(c)이다.
도 4는 기존 공정과 본 발명에 따른 공정에 따라 무세포화된 신경 조직의 탈지방화를 확인하기 위하여 Oil Red O로 염색한 사진이다.
도 5는 기존 공정과 본 발명에 따른 공정에 따라 무세포화된 신경 조직의 무세포화 정도와 구조를 확인하기 위한 DAPI, H&E 및 SEM 사진(a 및 b), 및 DNA 정량을 나타내는 그래프(c)이다.
도 6은 본 발명의 실시예를 통해 제조된 동결건조 및 수화 형태의 무세포 신경 이식재의 모습을 육안으로 확인하고 SEM으로 나타낸 사진이다.

본 발명은 a) 신경 조직의 지질 성분을 제거하는 단계; 및

b) 상기 지질 성분이 제거된 신경 조직에서 세포를 제거하는 단계를 포함하고,

상기 단계 b)는 신경 조직에 염기 용액 및 음이온성 계면활성제를 처리하며,

상기 단계 a) 및 b)는 연동펌프(peristaltic pump) 시스템을 사용하여 수행되는 무세포 신경 이식재의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 실시예에서는 무세포 용액으로 염기 용액 및 음이온성 계면활성제를 사용하여 염기 용액 및 음이온성 계면활성제의 사용량을 최소화하고, 신경 구조를 유지하면서 세포를 완벽히 제거하는 것을 확인하였다. 또한, 탈지방화 및 무세포화 공정 시 연동 펌프를 사용함으로써, 조직의 구조를 유지하면서 보다 효율적으로 지방 및 세포를 제거할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명에 따른 무세포 신경 이식재의 제조 방법을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 무세포 신경 이식재는 신경 조직을 본 발명에 따라 탈지방화 및 무세포하여 제조한 제조물을 의미한다. 이러한, 무세포 신경 이식재는 말초신경 손상환자에게 이식 가능하다.

본 발명에서 신경 조직은 동종 또는 이종의 신경 조직일 수 있다. 상기 동종은 인간을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류를 의미할 수 있다.

본 발명에서는 단계 a)를 수행하기 전에 신경 조직을 수세하는 단계 및/또는 신경 조직을 다듬는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

일 구체예에서, 포셉을 이용하여 신경 조직에서 지방을 탈락시킬 수 있다.

본 발명에서 단계 a)는 신경 조직의 지질 성분을 제거하는 단계로 신경 조직을 탈지방화할 수 있다. 상기 탈지방화(delipidation)는 신경 조직으로부터 지질 성분을 제거하는 것을 의미한다.

일 구체예에서, 탈지방화는 탈지방 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈지방 용액은 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있다. 상기 극성 용매로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 알코올로는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로필 알코올을 사용할 수 있다. 또한, 비극성 용매로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 탈지방 용액으로 이소프로필 알코올(IPA) 및 헥산(Hexane)의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 이때, 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 비율은 20:80 내지 80:20일 수 있다.

일 구체예에서, 단계 a)는 50 내지 300 rpm에서 진행될 수 있다. 상기 조건에서 진행시 신경 조직의 구조가 잘 유지되면서, 탈지방화 효과가 우수하다.

상기 탈지방 용액의 처리 시간은 2 내지 16 시간일 수 있다.

본 발명에서 단계 b)는 단계 a)에 의해 지질 성분이 제거된 신경 조직에서 세포를 제거하는 단계로, 신경 조직을 무세포화할 수 있다. 무세포화(decellularization)는 신경 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 헥산 등을 제거하는 것을 의미한다. 상기 무세포화를 통해 신경 조직의 이식시 조직내 잔류하는 세포로 인한 면역 반응을 억제할 수 있다. 본 발명에서는 탈지방화 및 무세포화를 거친 신경 조직을 무세포 신경 이식재로 표현할 수 있다.

일 구체예에서, 무세포화는 무세포 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 무세포 용액으로 염기 용액 및 음이온성 계면활성제를 사용할 수 있다.

본 발명에서는 염기 용액 및 음이온성 계면활성제의 처리 순서는 제한되지 않으며, 염기 용액을 신경 조직을 처리한 후에, 음이온성 계면활성제를 처리하는 방법으로 무세포화를 수행할 수 있다. 또한, 음이온성 계면활성제를 신경 조직을 처리한 후에, 염기 용액을 처리하는 방법으로 무세포화를 수행할 수 있다.

상기 염기 용액으로, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 무세포 용액으로 수산화나트륨(NaOH)을 사용할 수 있다.

또한, 음이온셩 계면활성제로, 소듐데옥시클로라이트(Sodium Deoxycholate, SDC) 및 소듐도데실설페이트(Sodium dodecyl sulfate, SDS), 알킬벤젠설포네이트(Alkylbenzene sulfonate, ALS), 알코올에테르설페이트(Alcohol ether sulfates, AES), 소듐라우릴설페이트(Sodium Lauryl Sulfate, SLS) 및 폴리에텔렌글리콜(Polyethylen glycol, PEG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

종래에는 계면활성제 또는 효소를 사용하여 무세포화를 수행하였다. 그러나, 효소를 사용하는 경우 신경 조직에 손상을 줄 수 있고, 효소가 잔류하여 체내에 이식되는 경우 환자의 본래 조직에 손상을 줄 수 있으며 심각한 경우엔 면역반응을 일으키는 문제가 있었다. 또한, 계면활성제를 사용하는 경우 높은 농도의 계면활성제가 필요하며, 계면활성제의 잔류를 최소화시키기 위해 세척 작업이 필요하며, 계면활성제의 잔류는 체내에서 세포 및 조직 독성을 나타내는 원인이 될 수 있었다. 또한, 농도가 낮으면 목적하는 무세포 효율을 얻을 수 없었다. 따라서, 본 발명에서는 무세포화시 무세포 용액으로 염기 용액 및 음이온성 계면활성제를 사용하여 전술한 문제점을 해결할 수 있으며, 또한, 세포 독성이 없다는 장점을 가진다.

일 구체예에서, 염기 용액의 농도는 0.1 내지 8N, 0.1 내지 0.5 N 또는 0.1 내지 2 N일 수 있다. 또한, 계면활성제의 농도는 2 내지 16, 2 내지 8% 또는 2 내지 4%일 수 있다. 상기 농도 범위에서 세포의 제거가 용이하다.

일 구체예에서, 단계 b)는 50 내지 300 rpm에서 진행될 수 있다. 상기 조건에서 조직의 구조 유지가 잘 되면서 무세포화 효율이 우수하다.

또한, 일 구체예에서, 단계 b)는 1 내지 18 시간, 1 내지 8 시간 또는 2 내지 4 시간 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 염기 용액의 처리 시간은 30 분 내지 9 시간, 1 내지 4 시간 또는 1 내지 2 시간일 수 있으며, 음이온성 계면활성제의 처리 시간은 30 분 내지 9 시간, 1 내지 4 시간 또는 1 내지 2 시간일 수 있다. 상기 시간 범위에서 세포의 제거가 용이하다.

본 발명에서 단계 a) 및 b), 즉, 탈지방화 및 무세포화는 연동 펌프(peristaltic pump) 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 이때, 연동 펌프는 당업계에서 사용되는 연동펌프를 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 연동 펌프 시스템은 연동 펌프;

상기 연동 펌프와 연결되며, 신경 조직이 내부에 담지된 챔버;

상기 연동 펌프와 연결되며, 상기 신경 조직을 처리하는 처리액이 저장되는 저장소(Reservoir); 및

상기 챔버와 연결되며, 신경 조직에 처리된 처리액이 배출되는 폐수 저장함(Waste)을 포함할 수 있다.

즉, 연동 펌프는 저장소 및 챔버와 각각 연결될 수 있다. 이에 의해, 저장소의 처리액은 연동 펌프를 통해 챔버로 이동하고, 상기 챔버 내에 존재하는 신경 조직과 반응하며 폐수 저장함으로 배출될 수 있다.

일 구체예에서 처리액은 탈지방 용액, 무세포 용액 및 후술한 세척 용액일 수 있다.

일 구체예에서, 신경 조직에 처리된 처리액을 재순환하여 재사용할 수 있다. 즉, 신경 조직에 처리된 처리액은 폐수 저장함으로 배출되지 않고, 저장소로 이동하여 다시 연동 펌프를 통해 챔버로 이동할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 챔버와 폐수 저장함을 연결하는 연결관으로 Three way stopcock를 사용하여 처리액의 순환을 용이하게 할 수 있다.

본 발명에서는 탈지방화 및 무세포화 공정을 통해 1) 최소한의 염기 용액 및 게면활성제를 사용하여 염기 용액이나 계면활성제의 잔류로 인한 체내에서 발생하는 세포 독성을 최소화하고, 2) 연동 펌프를 사용하여 구조를 유지하면서 효율적으로 지방과 세포를 제거하여, 조직내 잔류하는 세포로 인한 체내 면역반응을 최소화하며, 3) 상온에서도 보관이 가능한 동결건조 또는 수화타입의 무세포 신경 이식재를 제조할 수 있다. 또한, 4) 기존 대비 보다 단축된 시간으로 무세포화 공정 및 무세포 신경 조직의 제조를 진행할 수 있다.

본 발명에서는 단계 b)를 수행한 후, 무세포 신경 이식재를 세척하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 세척 용액으로 증류수를 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 세척은 연동 펌프 시스템에서 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 단계 b)를 수행한 후, 무세포 신경 이식재를 동결 건조하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 동결건조를 통해 무세포 신경 이식재의 수분을 제거할 수 있다.

일 구체예에서, 동결건조 후의 무세포 신경 이식재의 수분 함유량은 10% 이하, 또는 1% 내지 8%일 수 있다.

또한, 본 발명에서는 무세포 신경 이식재를 멸균하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

일 구체예에서, 멸균은 방사선을 조사하여 수행할 수 있으며, 방사선의 조사 범위는 10 내지 30 kGy일 수 있다.

일 구체예에서, 무세포 신경 이식재를 수화 타입으로 제공할 경우, 세척 후 멸균하여 상기 수화 타입으로 제조할 수 있다.

또한, 무세포 신경 이식재를 동결 건조 형태로 제공할 경우, 세척이 완료된 무세포 신경 이식재를 동결 보존액으로 동결건조한 후, 멸균하여 상기 동결 건조 형태로 제조할 수 있다. 이때, 동결 보존액으로 당업계에서 사용되는 동결 보존액을 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, Maltitol을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 무세포 신경 이식재의 제조 방법에 의해 제조된 무세포 신경 이식재에 관한 것이다.

본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 무세포 신경 이식재는 지방 및 세포가 제거된 상태로 신경 조직의 구조를 유지하고 있다. 본 발명의 무세포 신경 이식재는 동결 보관이 가능하며, 또한, 상온에서도 보관할 수 있는 동결 건조 및 수화 형태가 가능하다는 장점을 가진다.

이러한 무세포 신경 이식재는 말초신경 손상환자에게 이식 가능하다.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.

실시예

실시예 1. 무세포 신경 이식재 제조

조직은행으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취한 동종 신경 조직을 사용하였으며, 하기 공정을 통해 무세포 신경 이식재를 제조하였다.

a) 포셉(Forcep)을 이용하여 신경 조직에서 지방을 탈락시켰다.

b) 탈락되지 않은 지방을 제거하기 위해 40% 내지 60% 아이소프로필 알코올 및 40% 내지 60% 헥산의 혼합액을 이용하여 2 내지 16 시간 동안 탈지방화 과정을 진행하였다.

c) 상기 지방이 제거된 신경 조직에 NaOH을 처리하고, SDC를 처리하여 세포를 제거하였다(무세포 신경 이식재 제조). 처리 농도 및 처리 시간을 후술할 표 1의 조건으로 수행하였다.

d) 지방 및 세포가 제거된 신경 조직(무세포 신경 이식재)에서 잔여물을 세척하기 위해 멸균 증류수로 30 분 동안 세척하였으며, 세척 과정을 4 내지 8회 반복하였다.

e) 상기 b) 내지 d) 공정은 도 1의 연동 펌프(peristaltic pump, Jenie Well, JWCP-600) 시스템을 사용하여 50 내지 300 RPM으로 진행하였다. 또한, Three way stopcock을 사용하여 d) 공정(세척 과정)에서는 용액을 폐수 저장함으로 보내고 b) 공정인 탈지방화 과정 및 c) 공정인 염기 용액과 계면활성제를 이용하여 세포를 제거하는 과정에서는 순환시켜 용액의 사용을 절감시켰다.

f) 수화 타입의 신경 이식재의 경우, 세척이 완료된 무세포 신경 이식재를 15 kGy 감마선으로 멸균하였다.

g) 동결 건조 형태로 제조할 경우, 세척이 완료된 무세포 신경 이식재를 동결 보존액인 Maltitol에 침지한 후, 수분 함유량이 10% 이하, 바람직하게는 1% 내지 8%가 되도록 동결건조를 진행하였다. 그리고, 동결건조된 최종 산물은 15 kGy 감마선으로 멸균하였다.

실험예 1. 제조 조건별 무세포 신경 이식재의 잔류 세포 및 구조 확인

무세포 신경 이식재 제조 공정의 최적 조건을 확인하기 위하여, NaOH와 SDC를 다양한 농도 및 시간으로 처리하여 제조된 무세포 신경 이식재의 잔류 세포 및 구조를 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1의 제조 방법으로 무세포 신경 이식재를 제조했으며(단, shaker를 사용하여 제조), 이때, NaOH와 SDC의 농도 및 처리 시간은 표 1과 같다.

	무세포 용액(농도)		처리 시간
시료	NaOH	SDC
1	4N 내지 8N	X	4 내지 18시간
2	X	5% 내지 16%	4 내지 8시간
3	0.1N 내지 2N	-	1 내지 2시간
	-	2% 내지 4%	1 내지 2시간

그리고, 제조된 무세포 신경 이식재의 잔류 세포 및 구조의 확인을 위하여 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 염색과 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM) 촬영을 실시하였다. 그 결과를 도 2a에 나타내었다.

또한, DNA 정량을 실시했으며, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.

상기 도 2에 나타난 바와 같이, NaOH 및 SDC를 각각 단독으로 사용한 경우 조직 내부의 세포나 단백질들이 완벽하게 제거되지는 않은 것을 확인할 수 있다.

NaOH 및 SDC를 함께 사용할 경우(시료 1) NaOH와 SDC를 단독으로 사용했을 때(각각 시료 1 및 시료 2)보다 더 낮은 농도 및 더 적은 시간으로 높은 무세포화 효율을 달성할 수 있다. 또한, 시료 1은 다른 시료 대비 잔류 DNA량이 더 낮게 나왔으며, 기준치인 50ng/mg 미만으로 측정되었다. 즉, 본 발명에 따른 무세포화 방법이 보다 우수한 무세포 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다.

다만, shaker를 사용한 시료 1 내지 3은 구조가 균일하지 못한 것으로 확인되었다.

실험예 2. 무세포 신경 이식재의 최적 조건 설정

실험예 1을 통해 무세포 용액으로 NaOH와 SDC를 같이 사용했을 때, 단독으로 사용했을 경우보다 세포 제거가 잘되는 것을 확인하였고 DNA 함량이 기준치인 50ng/mg 미만임을 확인하였다.

다만, 조직 내부의 구조가 균일하지 못하므로, 이를 개선하기 위하여 기존에 shaker를 이용하여 세포를 제거한 것과 달리 연동 펌프를 사용하여 공정을 진행하였다.

구체적으로, 연동 펌프를 사용하는 실시예 1의 제조 방법으로 무세포 신경 이식재를 제조했으며, shaker를 사용하여 제조한 경우를 비교예로 하였다. 이때, 무세포 용액의 처리 농도 및 처리 시간은 실험예 1의 시료 3과 같다.

상기 표 2는 Shaker와 연동 펌프 사용에 따른 전체 공정 시간(즉, 탈지방화, 무세포화 및 세척 공정 시간)을 나타낸다. 상기 표에 나타난 바와 같이, 연동 펌프를 사용할 경우 shaker를 사용할 경우보다 공정 시간이 50% 이상 단축되는 것을 확인할 수 있다.

한편, 제조된 무세포 신경 이식재의 잔류 세포 및 구조의 확인을 위하여 DAPI 염색과 SEM 촬영을 실시했으며, 그 결과를 도 3a에 나타내었다. 또한, DNA 정량을 실시했으며, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

또한, 본 실험예에서는 조직의 균일성을 확인하기 위하여 SEM 사진에서 각 pore의 volume을 측정하였고 전체 pore 수에 대비하여 각 pore의 volume별 분포를 확인하였다. 그 결과를 도 c에 나타내었다.

상기 도 3에 나타난 바와 같이, shaker를 사용했을 때는 조직 내부의 구조가 균일하지 못하고, 조직 내부에 세포나 기타 단백질이 기준치인 50ng/mg 보다는 낮게 나왔으나 기준치에 근접한 수준인 것으로 확인되었다. 그러나, Pump를 사용했을 때는 조직 내부에 남아 있었던 세포나 기타 단백질이 완전히 제거되고, DNA량이 shaker를 사용했을 때보다 50% 이상 낮게 측정되는 것을 확인할 수 있다.

더욱이, Shaker를 사용한 공정은 3 일 정도가 소요되었지만 Pump를 사용했을 때에는 2 일 정도가 소요되었으며, 조직의 구조도 Shaker를 사용했을 때의 pore의 크기는 균일하지 못한데 반하여 Pump를 사용했을 때 대부분의 pore가 10~20um크기로 균일한 것을 확인할 수 있다.

실험예 3. 무세포 신경 이식재의 탈지방화, 무세포화 및 구조 유지 능력 검증

실시예 1에서 제작된 무세포 신경 이식재의 탈지방화, 무세포화 및 구조 유지 능력을 검증을 위하여, 본 발명에 따른 무세포화 공정과 기존 공정(Sondell, Hudson)으로 무세포화 공정을 진행하였다.

(1) 기존 공정 대비 본 공정의 탈지방화 능력 검증

실시예 1의 공정으로 제조된 무세포 신경 이식재를 실험군으로, 기존 공정으로 제조된 무세포 신경 이식재를 대조군으로 사용하였으며, 탈지방화 능력을 검증하기 위해 Oil Red O 염색을 진행하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, Oil Red O 염색 결과, 기존 공정에서는 원재료에 남아있던 지방이 완전히 제거되지 않아 염색된 것에 비해, 실시 예에서 제조된 무세포 신경 이식재에서는 염색된 것이 보이지 않았다. 즉, 본 발명에 따른 제조 방법을 사용할 경우 지방이 완전히 제거된 것을 확인할 수 있다.

(2) 기존 공정 대비 본 공정의 무세포화 능력 검증

실시예 1의 공정으로 제조된 무세포 신경 이식재를 실험군으로, 기존 공정으로 제조된 무세포 신경 이식재를 대조군으로 사용하였으며, 제조된 이식재들의 무세포화 정도를 검증하기 위해 DAPI 및 H&E 염색을 실시하였고, 잔류한 DNA를 정량하기 위해 Nano Drop으로 DNA 함량을 측정하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, DAPI와 H&E 염색 결과, 기존 공정에서 완전히 세포가 제거되지 않은 것과는 달리, 실시예 1의 공정으로 제작된 무세포 신경 이식재에서는 잔여 세포가 없는 것을 확인할 수 있다(도 5a 및 b). 또한, DNA 정량 결과, 실시예 1에서 제작된 무세포 신경 이식재는 DNA 잔류량이 기준치인 50 ng/mg 이하로 측정되어 기존 공정들보다 무세포 능력이 우수한 것을 확인할 수 있다.

(3) 기존 공정 대비 본 공정의 구조 유지 능력 검증

실시예 1의 공정으로 제조된 무세포 신경 이식재를 실험군으로, 기존 공정으로 제조된 무세포 신경 이식재를 대조군으로 사용하였으며, 제조된 이식재들의 구조 유지 능력을 검증하기 위해 SEM 촬영을 통하여 구조분석을 진행하였다.

그 결과를 도 5d에 나타내었다.

도 5d에 나타난 바와 같이, 조직의 구조를 확인한 결과, 기존 공정들의 경우 구조를 유지하지 못하고 무너지는데 반하여, 실시예 1에서 제작된 무세포 신경 이식재의 경우 구조 형태가 무너지지 않고 유지된 모습을 보이는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2. 다양한 형태의 무세포 신경 이식재 제조

실시예 1에서 제작된 무세포 신경 이식재를 동결 건조 형태와 수화 형태로 제조하여 육안으로 관찰한 후 SEM으로 촬영하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 무세포 신경 이식재를 동결건조 후 재수화 했을 때도 구조 형태가 무너지지 않고 유지되는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에 의해 제조된 무세포 신경 이식재는 상온에서도 보관이 가능한 동결건조 또는 수화 타입으로 제공될 수 있다.

Claims (13)

1. a) 신경 조직의 지질 성분을 제거하는 단계; 및
   b) 상기 지질 성분이 제거된 신경 조직에서 세포를 제거하는 단계를 포함하고,
   상기 단계 b)는 신경 조직에 염기 용액 및 음이온성 계면활성제를 처리하며,
   상기 단계 a) 및 b)는 연동 펌프(peristaltic pump) 시스템에서 수행되는 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   신경 조직은 동종 또는 이종의 신경 조직인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   단계 a)는 탈지방 용액을 사용하여 수행하며,
   상기 탈지방 용액은 극성 용매, 비극성 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 포함하는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   단계 b)는 신경 조직에 염기 용액을 처리한 뒤 음이온성 계면활성제를 처리하는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   단계 b)에서 염기 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고,
   음이온성 계면활성제는 소듐데옥시클로라이트(Sodium Deoxycholate, SDC) 및 소듐도데실설페이트(Sodium dodecyl sulfate, SDS), 알킬벤젠설포네이트(Alkylbenzene sulfonate, ALS), 알코올에테르설페이트(Alcohol ether sulfates, AES), 소듐라우릴설페이트(Sodium Lauryl Sulfate, SLS) 및 폴리에텔렌글리콜(Polyethylen glycol, PEG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   염기 용액의 농도는 0.1 내지 8 N이고,
   음이온성 계면활성제의 농도는 2 내지 16%인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
7. 제 1 항에 있어서,
   단계 a) 및 단계 b)는 각각 50 내지 300 rpm에서 진행되는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
8. 제 1 항에 있어서,
   단계 b)는 1 내지 18 시간 동안 수행하는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
9. 제 1 항에 있어서,
   연동 펌프 시스템은 연동 펌프;
   상기 연동 펌프와 연결되며, 신경 조직이 내부에 담지된 챔버;
   상기 연동 펌프와 연결되며, 상기 신경 조직을 처리하는 처리액이 저장되는 저장소(Reservoir); 및
   상기 챔버와 연결되며, 신경 조직에 처리된 처리액이 배출되는 페수 저장함을 포함하는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서,
    신경 조직에 처리된 처리액을 재순환하여 재사용하는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
    
11. 제 1 항에 있어서,
    무세포 신경 이식재를 세척하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 세척은 연동 펌프 시스템에서 수행되는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
    
12. 제 1 항에 있어서,
    무세포 신경 이식재를 동결 건조 및 멸균하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 무세포 신경 이식재의 제조 방법.
    
13. 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 무세포 신경 이식재.

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