CN113171494A - 利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，该方法由合成高分子材料的细胞外管壁和脂肪组织制备的脱细胞外基质组成，然后通过模具注射和冷冻干燥的方式制备。该神经诱导修复导管不仅具有非常好的力学性能，可以满足手术后的强度要求，其对于周围神经的诱导修复具有很好的效果，特别是对于修复3厘米以上的神经损伤也具有非常好的效果，本发明主要针对人体周围神经的损伤进行修复，通过制备结构性的导管进行治疗；其应用领域广阔。

Description

利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法。
背景技术
周围神经的结构或功能的损伤主要是由于事故、创伤和其他相关原因，损伤会导致感觉、运动和自主神经功能部分或完全丧失，以及神经性疼痛等。尽管对周围神经损伤(PNI)的病理生理学和再生机制有很明确的理论基础，但能保证神经功能完全恢复的可靠治疗方法仍然缺乏，这其中神经损伤的修复目前最常用的方式是自体移植，其具有无免疫性、生物活性高、力学性能合适等，但是自体移植也存在很多的限制影响其应用，例如供体部位易发病，供体有限等。
神经导管(nerve guidance conduits，NGC)被认为是一种新型人工制造的用于治疗神经损伤的生物医用支架材料，对于自体神经移植材料具有非常好的替代效果。通过天然或合成生物聚合物制成的具有神经再生所需的机械和生物性能的组织工程管状结构被称为神经导管。人工组织工程材料的神经导管支架作为损伤神经末梢之间的桥梁，为两端提供结构和营养支持，支持周围组织的侵袭和轴突沿导管的再生。最佳修复神经导管损伤的神经导管要求包括具有仿生结构、纵向排列轴突再生的结构特征、满足结构支撑的力学性能、结构中营养的渗透性、导电性、灵活性和生物降解性。
从最初的硅胶导管到现在的可降解生物医用制备的导管，神经诱导修复导管的结构基本稳定在支持材料和功能添加物两个方面，即由支架材料进行神经结构支持并引导轴突和周围细胞的生长，再辅助添加促进轴突导向和再生的种子细胞或者生长因子，从而创造一个良好的周围神经再生微环境以利于神经再生。
目前，修复导管采用自体移植和空心导管；自体移植会导致供体部位受损，且来源受限制；空心导管治疗不利于神经的轴向生长，神经结构变形，最终影响神经传输治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，该神经诱导修复导管由合成高分子材料的外管壁和哺乳动物组织脱细胞制备的纤维蛋白管填充材料组成，其中神经诱导修复导管的外管壁主要通过静电纺丝设备制备得到具有多孔结构的薄层管状结构，管填充物主要由哺乳动物的组织进行脱细胞处理，得到具有生物活性的纤维蛋白组织，然后通过模具注射和冷冻干燥的方式制备。
为实现上述目的，本发明所设计一种利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，包括以下步骤
1)细胞外管壁制备：
按重量比1:1～10称取羧甲基壳聚糖硫酸酯和左旋聚乳酸(PLLA)，并加入反应容器中，然后加入PBS缓冲溶液，充分搅拌至均匀溶液，通过静电纺丝设备将溶液制备成具有多孔结构的中空导管，即为细胞外管壁；
2)脱细胞外基质制备
a.将十二烷基磺酸钠和聚氧乙烯-8-辛基苯基醚加入水中溶解，得到混合液，且混合液中，十二烷基磺酸钠质量分数为0.5％～1.5％，聚氧乙烯-8-辛基苯基醚质量分数为1％～3％；
b.将购买的脂肪组织(猪、牛、羊、狗)切碎后，置于混合液中搅拌浸泡，用去离子水清洗(该方法对组织的处理性更好，脂肪和细胞可以有效脱出，且不损伤蛋白的结构和性能)；
c.然后利用醋酸溶液对步骤b脂肪组织进行处理，完成后去离子水清洗；
d.利用液氮和PBS溶液对步骤c处理的组织进行冻-融处理，然后利用PBS溶液浸泡搅拌，去离子水清洗；
e.向步骤d处理后的脂肪组织中加入水，通过剧烈的机械搅拌得到均一的粘稠状流体；
f.将粘稠状流体通过注射器注射到模具中，然后在温度为-80℃条件下冷冻，形成柱状结构；
g.将冻干好的材料脱模后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到絮状圆柱体材料(即为脱细胞外基质)；
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料放入步骤1)制备的中空导管中，即得到神经诱导修复导管。
进一步地，所述步骤1)中，羧甲基壳聚糖硫酸酯和左旋聚乳酸(PLLA)的重量比1:2。
再进一步地，中空导管的内径为1～3mm。
再进一步地，所述步骤2)的第a小步中，混合液中，十二烷基磺酸钠质量分数为0.5％～1.0％，聚氧乙烯-8-辛基苯基醚质量分数为1％～2％
再进一步地，所述步骤2)的第b小步中，脂肪组织为跟腱组织；处理时间为16～24h，清洗3～7次。
再进一步地，所述步骤2)的第c小步中，醋酸溶液浓度为1wt％；处理时间为16～24h，清洗5～7次。
再进一步地，所述步骤2)的第d小步中，整个冻融过程处理次数为3～5次，搅拌16～24h，清洗5～7次。
再进一步地，所述步骤2)的第f小步中，冷冻24h。
再进一步地，所述步骤2)的第g小步中，冷冻干燥36～72h；絮状圆柱体材料的直径为1～1.5mm。
再进一步地，所述神经诱导修复导管中，絮状圆柱体材料两端离中空导管管口距离为5～8mm。
本发明的有益效果：
1.本发明利用静电纺丝制备多孔的中空管壁材料，具有良好的机械性能；
2.本发明将左旋聚乳酸(PLLA)和羧甲基壳聚糖硫酸酯制备的中空导管(管壁)和絮状圆柱体材料(填充物质)为可降解的材料，无需二次手术取出；该神经诱导修复导管采用外管壁和内填充的结构，外管壁构建结构和环境，内填充为生物活性材料，促进神经轴突生长；
3.本发明采用市面上购买的脂肪组织(以猪的跟腱组织)脱细胞方法，既实现了细胞的完全洗脱，同时也保留了纤维蛋白组织的生物活性和促细胞生长因子等物质；
综上所述，本发明的方法制备的神经诱导修复导管不仅具有非常好的力学性能，可以满足手术后的强度要求，其对于周围神经的诱导修复具有很好的效果，特别是对于修复3厘米以上的神经损伤也具有非常好的效果，因此，其应用领域广阔。
附图说明
图1为聚合物溶液静电纺丝示意图；
图2为神经诱导修复导管的结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管1的方法，包括以下步骤
1)细胞外管壁制备：
称取1.5g左旋聚乳酸(PLLA)和0.5g羧甲基壳聚糖硫酸酯加入到圆底烧瓶中，加入5mL的PBS缓冲溶液，充分搅拌至均匀溶液，通过图1所示的静电纺丝设备将溶液制备成具有多孔结构的中空导管1，中空导管的内径为2.5mm；
2)脱细胞外基质制备
a.将十二烷基磺酸钠和聚氧乙烯-8-辛基苯基醚加入水中溶解，得到混合液，且混合液中，十二烷基磺酸钠质量分数为1％，聚氧乙烯-8-辛基苯基醚质量分数为1％；
b.将购买15g的猪跟腱组织切碎后，置于混合液中浸泡处理24h，用去离子水清洗5次；
c.然后利用浓度为1wt％醋酸溶液对步骤b猪跟腱组织进行处理24h，完成后去离子水清洗5次；
d.利用液氮和PBS溶液对步骤c处理的组织进行冻-融处理，整个冻融过程处理次数为3～5次，然后利用PBS溶液浸泡搅拌24h，去离子水清洗5次；
e.向步骤d处理后的猪跟腱组织加入水，通过剧烈的机械搅拌得到均一的粘稠状流体；
f.将粘稠状流体通过注射器注射到模具中，然后在温度为-80℃条件下冷冻24h，形成柱状结构；
g.将冻干好的材料脱模后放入冷冻干燥机中冷冻干燥36h，得到直径为1.5mm絮状圆柱体材料1；
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料1放入步骤1)制备的中空导管1中，即得到神经诱导修复导管1；絮状圆柱体材料1两端离中空导管1管口距离为5～8mm(图2)。
实施例2
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管2的方法，包括以下步骤：
1)细胞外管壁为实施例1步骤1)的中空导管1
2)脱细胞外基质制备
a.将十二烷基磺酸钠和聚氧乙烯-8-辛基苯基醚加入水中溶解，得到混合液，且混合液中，十二烷基磺酸钠质量分数为1％，聚氧乙烯-8-辛基苯基醚质量分数为1％；
b.将购买15g的猪跟腱组织切碎后，置于混合液中浸泡处理24h，用去离子水清洗3次；
c.然后利用浓度为1wt％醋酸溶液对步骤b猪跟腱组织进行处理24h，完成后去离子水清洗5次d.利用液氮和PBS溶液对步骤c处理的组织进行冻-融处理，整个冻融过程处理次数为3～5次，然后利用PBS溶液浸泡搅拌24h，去离子水清洗5次；
e.向步骤d处理后的猪跟腱组织加入水，通过剧烈的机械搅拌得到均一的粘稠状流体；
f.将粘稠状流体通过注射器注射到模具中，然后在温度为-80℃条件下冷冻24h，形成柱状结构；
g.将冻干好的材料脱模后放入冷冻干燥机中冷冻干燥36h，得到直径为1.5mm絮状圆柱体材料2；
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料2放入步骤1)制备的中空导管1中，即得到神经诱导修复导管2；絮状圆柱体材料2两端离中空导管1管口距离为5～8mm。
实施例3
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管3的方法，包括以下步骤：
1)细胞外管壁为实施例1步骤1)的中空导管1
2)脱细胞外基质制备
a.将十二烷基磺酸钠和聚氧乙烯-8-辛基苯基醚加入水中溶解，得到混合液，且混合液中，十二烷基磺酸钠质量分数为1.5％，聚氧乙烯-8-辛基苯基醚质量分数为1％；
b.将购买15g的猪跟腱组织切碎后，置于混合液中浸泡处理24h，用去离子水清洗5次；
c.然后利用浓度为1wt％醋酸溶液对步骤b猪跟腱组织进行处理24h，完成后去离子水清洗5次；
d.利用液氮和PBS溶液对步骤c处理的组织进行冻-融处理，整个冻融过程处理次数为3～5次，然后利用PBS溶液浸泡搅拌24h，去离子水清洗5次；
e.向步骤d处理后的猪跟腱组织加入水，通过剧烈的机械搅拌得到均一的粘稠状流体；
f.将粘稠状流体通过注射器注射到模具中，然后在温度为-80℃条件下冷冻24h，形成柱状结构；
g.将冻干好的材料脱模后放入冷冻干燥机中冷冻干燥36h，得到直径为1.5mm絮状圆柱体材料3；
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料3放入步骤1)制备的中空导管1中，即得到神经诱导修复导管3；絮状圆柱体材料3两端离中空导管1管口距离为5～8mm。
实施例4
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管4的方法，包括以下步骤
1)细胞外管壁制备：
称取2.0g左旋聚乳酸(PLLA)和0.5g羧甲基壳聚糖硫酸酯加入到圆底烧瓶中，加入5mL的PBS缓冲溶液，充分搅拌至均匀溶液，通过静电纺丝设备将溶液制备成具有多孔结构的中空导管2，中空导管的内径为2.5mm；
2)脱细胞外基质制备为实施例1步骤2)制备的絮状圆柱体材料1；
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料1放入步骤1)制备的中空导管2中，即得到神经诱导修复导管4；絮状圆柱体材料1两端离中空导管2管口距离为5～8mm。
实施例5
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管5的方法，包括以下步骤：
1)细胞外管壁为实施例4步骤1)的中空导管2；
2)脱细胞外基质制备为实施例2步骤2)制备的絮状圆柱体材料2
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料2放入步骤1)制备的中空导管2中，即得到神经诱导修复导管5；絮状圆柱体材料2两端离中空导管2管口距离为5～8mm。
实施例6
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管6的方法，包括以下步骤：
1)细胞外管壁为实施例4步骤1)的中空导管2；
2)脱细胞外基质制备为实施例3步骤2)制备的絮状圆柱体材料3
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料3放入步骤2)制备的中空导管2中，即得到神经诱导修复导管6；絮状圆柱体材料3两端离中空导管2管口距离为5～8mm。
实施例7
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管7的方法，包括以下步骤
1)细胞外管壁制备：
称取1.0g左旋聚乳酸(PLLA)和0.5g羧甲基壳聚糖硫酸酯加入到圆底烧瓶中，加入5mL的PBS缓冲溶液，充分搅拌至均匀溶液，通过静电纺丝设备将溶液制备成具有多孔结构的中空导管3，中空导管的内径为2.5mm；
2)脱细胞外基质制备为实施例1步骤2)制备的絮状圆柱体材料1；
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料1放入步骤1)制备的中空导管3中，即得到神经诱导修复导管7；絮状圆柱体材料1两端离中空导管3管口距离为5～8mm。
实施例8
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管8的方法，包括以下步骤：
1)细胞外管壁为实施例7步骤1)的中空导管3；
2)脱细胞外基质制备为实施例2步骤2)制备的絮状圆柱体材料2
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料2放入步骤1)制备的中空导管3中，即得到神经诱导修复导管8；絮状圆柱体材料2两端离中空导管3管口距离为5～8mm。
实施例9
利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管9的方法，包括以下步骤：
1)细胞外管壁为实施例7步骤1)的中空导管3；
2)脱细胞外基质制备为实施例3步骤2)制备的絮状圆柱体材料3
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料3放入步骤2)制备的中空导管3中，即得到神经诱导修复导管9；絮状圆柱体材料3两端离中空导管2管口距离为5～8mm。
将上述实施例1～9制备的神经诱导修复导管1～9进行SD大鼠大腿动脉神经动物，实验结果见表1。
表1神经诱导修复导管动物实验结果
Figure BDA0003029652040000091
注：
1.实验结果为14周观察所得；
2.评价分为A-功能和结构都修复完好；B-功能部分修复完好，结构修复完好；C-功能修复部分完好，结构修复部分完好；D-功能或结构某一项修复未成功。
根据实验结果分析，实施例1～9制备的神经诱导修复导管对于受损神经的修复具有良好的效果，不论是其外观还是功能的修复，实施例7最好。对比国内外市售的产品，其两项修复的效果都有极大的提升，特别是对于大尺寸的神经损伤处理，本发明产品也能具有非常良好的修复效果，这是目前国内外市售产品不能达到的性能要求。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：包括以下步骤
1)细胞外管壁制备：
按重量比1:1～10称取羧甲基壳聚糖硫酸酯和左旋聚乳酸，并加入反应容器中，然后加入PBS缓冲溶液，充分搅拌至均匀溶液，通过静电纺丝设备将溶液制备成具有多孔结构的中空导管，即为细胞外管壁；
2)脱细胞外基质制备
a.将十二烷基磺酸钠和聚氧乙烯-8-辛基苯基醚加入水中溶解，得到混合液，且混合液中，十二烷基磺酸钠质量分数为0.5％～1.5％，聚氧乙烯-8-辛基苯基醚质量分数为1％～3％；
b.将购买的脂肪组织切碎后，置于混合液中搅拌浸泡，用去离子水清洗；
c.然后利用醋酸溶液对步骤b脂肪组织进行处理，完成后去离子水清洗；
d.利用液氮和PBS溶液对步骤c处理的组织进行冻-融处理，然后利用PBS溶液浸泡搅拌，去离子水清洗；
e.向步骤d处理后的脂肪组织中加入水，通过剧烈的机械搅拌得到均一的粘稠状流体；
f.将粘稠状流体通过注射器注射到模具中，然后在温度为-80℃条件下冷冻，形成柱状结构；
g.将冻干好的材料脱模后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到絮状圆柱体材料；
3)神经诱导修复导管制备
将步骤2)制备好的絮状圆柱体材料放入步骤1)制备的中空导管中，即得到神经诱导修复导管。
2.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述步骤1)中，羧甲基壳聚糖硫酸酯和左旋聚乳酸的重量比1:2。
3.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述步骤1)中，中空导管的内径为1～3mm。
4.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述步骤2)的第a小步中，混合液中，十二烷基磺酸钠质量分数为0.5％～1.0％，聚氧乙烯-8-辛基苯基醚质量分数为1％～2％。
5.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述步骤2)的第b小步中，脂肪组织为跟腱组织；处理时间为16～24h，清洗3～7次。
6.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述步骤2)的第c小步中，醋酸溶液浓度为1wt％；处理时间为16～24h，清洗5～7次。
7.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述步骤2)的第d小步中，整个冻融过程处理次数为3～5次，搅拌16～24h，清洗5～7次。
8.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述步骤2)的第f小步中，冷冻24h。
9.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述步骤2)的第g小步中，冷冻干燥36～72h；絮状圆柱体材料的直径为1～1.5mm。
10.根据权利要求1所述利用细胞外基质材料制备神经诱导修复导管的方法，其特征在于：所述神经诱导修复导管中，絮状圆柱体材料两端离中空导管管口距离为5～8mm。
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