KR20100028053A - 단일 쇄 항체의 서열에 기초한 공학처리 및 최적화 - Google Patents

단일 쇄 항체의 서열에 기초한 공학처리 및 최적화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안정성, 가용성, 및 항원 결합 친화성을 비롯한, 단일 쇄 항체(scFv)의 구조적 특성 및 생체물리학적 특성을 변형시키고 개선시키기 위한, 서열에 기초한 분석 및 합리적 전략법의 사용 방법을 제공한다. 이러한 방법 및 전략법은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 실험을 통해 우수한 가용성 및 안정성을 갖는 것으로서 선택되어진 스크리닝된 항체 scFv 라이브러리로부터의 scFv 서열을 포함하는 데이타베이스의 용도를 포함한다. 본 발명은 또한 단일 쇄 항체 단편의 안정성 및 가용성 특성을 개선시키기 위해서 scFv 항체를 재형상화하는 일반 접근법에서 이들 선택된 항체에 대해 발견된 특성을 사용하는 방법을 제공한다.
면역결합제, 단일 쇄 항체, 공학처리, 안정성, 가용성, 돌연변이화

Description

단일 쇄 항체의 서열에 기초한 공학처리 및 최적화{SEQUENCE BASED ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SINGLE CHAIN ANTIBODIES}
관련 출원
본 출원은 2007년 6월 25일 출원된 미국 가출원 제60/937,112호 (발명의 명칭 "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies")에 대한 우선권을 주장한다. 본 출원은 또한 2008년 3월 12일 출원된 미국 가출원 제61/069,057호 (발명의 명칭 "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies")에 대한 우선권도 주장한다.
항체는 암, 자가면역 질환 및 기타 질병의 치료에 있어 매우 효과적이고 성공적인 치료제라는 것이 입증되어 있다. 전형적으로는 전장의 항체가 임상적으로 사용되어 왔지만, 예를 들면 조직 침투의 증가, 다른 효과기 기능을 첨가할 수 있는 능력과 조합된 Fc-효과기 기능의 부재, 및 전신에서 생체내 반감기가 단축됨으로써 전신 부작용이 감소될 수 있다는 가능성과 같이, 항체 단편을 사용하는 경우에도 많은 장점을 제공할 수 있다. 항체 단편의 약동학적 특성은, 항체 단편이 특히 국소의 치료학적 접근법에 매우 적합할 수 있다는 것을 시사한다. 추가로, 특정 발현 시스템에서는 항체 단편이 전장의 항체보다 생산하기가 더 용이할 수 있 다.
항체 단편의 한가지 유형으로는 단일 쇄 항체(scFv)가 있는데, 이는 링커 서열을 통해 경쇄 가변 도메인(VL)에 접합되어 있는 중쇄 가변 도메인(VH)으로 구성되어 있다. 따라서, scFv에는 모든 항체 불변 영역 도메인이 존재하지 않으며, 전자의 가변/불변 도메인 경계면에 있는 아미노산 잔기 (경계면 잔기)는 용매에 노출되게 된다. scFv는 확립된 재조합 공학처리 기법을 통해 전장의 항체 (예로서, IgG 분자)로부터 제조될 수 있다. 그러나, 전장의 항체를 scFv로 형질전환시킬 경우, 종종 단백질의 안정성과 가용성은 감소하게 되고, 생산 수율은 저하되며, 응집 경향은 증가하게 되어, 면역원성에 대한 위험은 상승하게 된다.
따라서, scFv의 특성, 예를 들면 가용성과 안정성을 개선시키려고 시도되어 왔다. 예를 들어, 니에바, L(Nieba, L.) 등 (문헌 [Prot. Eng. (1997) 10:435-444])은 경계면 잔기로 알려져 있는 3개의 아미노산 잔기를 선택하고, 이들을 돌연변이화시켰다. 세균에서 상기 돌연변이화된 scFv의 원형질막주위 발현은 증가하였을 뿐만 아니라, 열역학적 안정성과 가용성은 유의적으로 변경되지 않았음에도, 열에 의해 유도되는 응집 속도는 감소한 것이 관찰되었다. 부위 지정 돌연변이 유발법을 scFv 내의 특정 아미노산 잔기에서 수행한 다른 연구도 보고된 바 있다 (예로서, 문헌 ([Tan, P.H. et al. (1988) Biophys . J. 75:1473-1482]; [Worn, A. and Pluckthun, A. (1998) Biochem. 37:13120-13127]; [Worn, A. and Pluckthun, A. (1999) Biochem. 38:8739-8750]) 참조). 이런 다양한 연구에서 돌연변이 유발법을 위해 선택된 아미노산 잔기는 (예로서, 분자 모델링 연구로부터) scFv 구조 내의 상기 아미노산 잔기들의 공지된 위치에 기초하여 선택된 것이다.
또다른 접근법에서는 발현이 매우 미약한 scFv로부터의 상보성 결정 영역(CDR)을, 바람직한 특성을 갖는 것으로 입증된 scFv의 프레임워크 영역으로 이식시켰다 (문헌 [Jung, S. and Pluckthun, A. (1997,) Prot . Eng . 10:959-966]). 그 결과, scFv는 개선된 가용성 발현 및 열역학적 안정성을 나타내었다.
기능적 특성을 개선시키기 위해 scFv를 공학처리하는 것이 진보되었다는 것은 예를 들어, 문헌 [Worn, A. and Pluckthun, A. (2001) J. Mol . Biol. 305:989-1010]에서 살펴볼 수 있다. 그러나, 우수한 기능적 특성을 갖는 scFv의 합리적인 디자인을 설계할 수 있는 새로운 접근법, 특히, 공학처리를 위해 잠재적으로 개연성을 지닌 아미노산 잔기를 선택함에 있어 당업자에게 도움이 될 수 있는 접근법은 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 서열에 기초한 분석을 사용하여 안정성 및/또는 가용성에 대해 잠재적으로 개연성을 지닌 scFv 서열 내의 아미노산 잔기를 동정할 수 있도록 하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명의 방법에 따라 동정된 아미노산 잔기는 돌연변이화를 위해 선택될 수 있고, 돌연변이화된 공학처리된 scFv가 제조될 수 있고, 개선된 기능적 특성, 예를 들면 안정성 및/또는 가용성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 기능에 의해 선택된 scFv의 데이타베이스를 사용하여 생식계열 및/또는 성숙 항체 면역글로불린 서열 중의 상응하는 위치에서보다 가변성에 대한 내성이 더 크거나 더 작은 아미노산 잔기 위치를 동정함으로써 상기 동정된 잔기 위치가 scFv 기능성, 예를 들면 안정성 및/또는 가용성을 개선시키기 위해 공학처리하는데 적합할 수 있다는 것을 지시하는 것인 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 기능에 의해 선택된 scFv 서열의 데이타베이스를 사용하는 것에 기초한 "기능적 칸센서스" 접근법을 제공하고, 그의 잇점을 입증한다.
추가의 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 면역결합제 내의 관심의 대상이 되는 아미노산 위치 (예를 들면, 적어도 하나의 바람직한 특성을 갖는 scFv 서열의 데이타베이스, 예를 들면 QC 분석으로부터 선택된 것과 같은 서열의 데이타베이스를 성숙 항체 서열의 데이타베이스, 예를 들면 카바트(Kabat) 데이타베이스와 비교함으로써 동정된 아미노산 위치)에서 치환되는 바람직한 아미노산 잔기 (별법으로, 배제되는 아미노산 잔기)를 동정하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 추가로 특정 아미노산 잔기를 선택하는 "강화/배제" 방법을 제공한다. 또한 추가로, 본 발명은 본원에 기술된 "기능적 칸센서스" 접근법을 사용하여 동정된 특정 프레임워크 아미노산 위치를 돌연변이화시킴으로써 면역결합제 (예를 들면, scFv, 전장의 면역글로불린, Fab 단편, 단일 도메인 항체 (예를 들면, Dab) 및 나노바디)를 공학처리하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 프레임워크 아미노산 위치는 현존하는 아미노산 잔기를, 본원에 기술된 "강화/배제" 분석 방법을 사용하여 "강화된" 잔기로 밝혀진 잔기로 치환함으로써 돌연변이화된다.
하나의 측면에서, 본 발명은
a) scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을, 다수의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 데이타베이스로 입력하여 상기 scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열과 함께 정렬시키는 단계;
b) 상기 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치를 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교하는 단계;
c) scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치가, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 아미노산 잔기로 점유되어 있는지 여부를 측정하는 단계; 및
d) scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치가, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있을 때에 상기 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치를 돌연변이화를 위한 아미노산 위치로서 동정하는 단계를 포함하는, VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 항체(scFv) 중 돌연변이화를 위한 아미노산 위치를 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의, 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 것을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 무작위 또는 편향된 돌연변이 유발법에 의해 돌연변이화되어 돌연변이화된 scFv의 라이브러리를 생성할 수 있고, 이어서, 돌연변이화된 scFv의 라이브러리는 스크리닝되고, 적어도 하나의 개선된 기능적 특성을 갖는 scFv의 선별 (예를 들면, 효모 품질 관리-시스템 (QC-시스템)을 사용한 라이브러리의 스크리닝)이 이루어질 수 있다.
다양한 유형의 데이타베이스가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열은 생식계열 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열이다. 또다른 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열은 재배열된 친화성 성숙된 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열이다. 추가의 또다른 특히 바람직한 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열은 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성 (예를 들면, scFv 안정성 또는 scFv 가용성)을 갖는 것으로서 선택된 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 1 초과의 데이타베이스가 비교 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 특히 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 생식계열 데이타베이스 또는 재배열된 친화성 성숙된 항체 데이타베이스 뿐만 아니라, 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된 scFv의 데이타베이스가 사용되는데, 여기서, scFv 데이타베이스로부터 얻은 서열 비교 결과는 다른 데이타베이스(들)로부터 얻은 결과와 비교된다.
본 발명의 방법은 예를 들어, scFv의 VH 영역, scFv의 VL 영역, 또는 그 둘 모두를 분석하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 관심의 대상이 되는 scFv 서열 내의 관심의 대상이 되는 하나의 아미노산 위치를 분석할 수 있지만, 더욱 바람직하게는 본 방법을 사용하여 scFv 서열을 따라 다수의 아미노산 위치를 분석할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시태양에 있어 상기 방법의 단계 b)에서, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 다수의 아미노산 위치를 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교한다. 예를 들어, 바람직한 실시태양에서, scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 각 프레임워크 위치를 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 각각의 상응하는 프레임워크 위치와 비교한다. 추가로 또는 별법으로, scFv의 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 위치를 분석할 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 각 아미노산 위치를 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 각각의 상응하는 아미노산 위치와 비교한다.
데이타베이스의 서열 중에서 "보존되는" 아미노산 위치는 하나 이상의 특정 유형의 아미노산 잔기로 점유될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, "보존되는" 위치는 매우 높은 빈도로 상기 위치를 점유하고 있는 하나의 특정 아미노산 잔기로 점유된다. 즉, 상기 방법의 단계 c)에서, 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 아미노산 잔기는 가장 빈번하게 존재하는 아미노산 잔기 또는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내에서 가장 현저하게 강화된 아미노산 잔기이다. 이러한 상황하에서, 공학처리된 scFv를 생성하기 위해서는 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치를 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 빈번하게 관찰되거나, 가장 현저하게 강화된 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있다. 또다른 실시태양에서, 데이타베이스의 서열 중에서 "보존되는" 아미노산 위치는 (i) 소수성 아미노산 잔기, (ii) 친수성 아미노산 잔기, (iii) 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기 또는 (iv) β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기로 점유될 수 있다. 즉, 상기 방법의 단계 c)에서 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치는 (i) 소수성 아미노산 잔기, (ii) 친수성 아미노산 잔기, (iii) 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기 또는 (iv) β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기로 보존된다.
따라서, 공학처리된 scFv를 생성하기 위해서는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치가 소수성 아미노산 잔기로 보존될 경우, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 소수성 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 scFv 내의 상기 위치에서 최적합인 것으로서 선택된 소수성 아미노산 잔기 (예를 들면, 분자 모델링 연구에 기초하여 scFv의 구조와 기능을 유지시킬 수 있는 가능성이 가장 큰 소수성 잔기)로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 부위 지정 돌연변이 유발법을 통해 소수성 아미노산 잔기 패널로 치환됨으로써 공학처리된 scFv 라이브러리를 생성할 수 있고, 가장 바람직한 치환(들)은 (예를 들면, 효소 QC-시스템에서) 바람직한 기능적 특성에 대해 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택될 수 있다.
추가로, 공학처리된 scFv를 생성하기 위해서는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치가 친수성 아미노산 잔기로 보존될 경우, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 친수성 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 scFv 내의 상기 위치에서 최적합인 것으로서 선택된 친수성 아미노산 잔기 (예를 들면, 분자 모델링 연구에 기초하여 scFv의 구조와 기능을 유지시킬 수 있는 가능성이 가장 큰 친수성 잔기)로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 부위 지정 돌연변이 유발법을 통해 친수성 아미노산 잔기 패널로 치환됨으로써 공학처리된 scFv 라이브러리를 생성할 수 있고, 가장 바람직한 치환(들)은 (예를 들면, 효소 QC-시스템에서) 바람직한 기능적 특성에 대해 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택될 수 있다.
또한 추가로, 공학처리된 scFv를 생성하기 위해서는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치가 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기로 보존될 경우, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 scFv 내의 상기 위치에서 최적합인 것으로서 선택된 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기 (예를 들면, 분자 모델링 연구에 기초하여 scFv의 구조와 기능을 유지시킬 수 있는 가능성이 가장 큰 잔기)로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 부위 지정 돌연변이 유발법을 통해 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기 패널로 치환됨으로써 공학처리된 scFv 라이브러리를 생성할 수 있고, 가장 바람직한 치환(들)은 (예를 들면, 효소 QC-시스템에서) 바람직한 기능적 특성에 대해 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택될 수 있다.
또한 추가로, 공학처리된 scFv를 생성하기 위해서는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치가 β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기로 보존될 경우, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 scFv 내의 상기 위치에서 최적합인 것으로서 선택된 β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기 (예를 들면, 분자 모델링 연구에 기초하여 scFv의 구조와 기능을 유지시킬 수 있는 가능성이 가장 큰 잔기)로 치환될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 부위 지정 돌연변이 유발법을 통해 β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기 패널로 치환됨으로써 공학처리된 scFv 라이브러리를 생성할 수 있고, 가장 바람직한 치환(들)은 (예를 들면, 효소 QC-시스템에서) 바람직한 기능적 특성에 대해 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택될 수 있다.
또다른 실시태양에서, scFv 중의 돌연변이를 위한 아미노산 위치를 동정하는 본 발명의 방법은 오직 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열에 대해 높은 유사성(%)을 갖는 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열만이 데이타베이스에 포함되어 있는 한정된 데이타베이스인 데이타베이스를 사용하여 실시될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 분석되는 아미노산 위치의 보존성 (즉, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 "상응하는 위치")을 정량하기 위해, 심슨(Simpson) 지수를 사용하여 아미노산 위치에 보존도를 할당한다.
본 발명의 방법은 또한 돌연변이화를 위한 이들 공변이 쌍 위치들 중 하나 또는 그 둘 모두가 동정될 수 있도록 서로서로 공변하는 아미노산 위치를 동정하기 위해 scFv 서열 내의 아미노산 위치 쌍을 조사하는데 사용될 수 있다. 따라서, 또다른 실시태양에서, 본 발명은
a) 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열에 대한 공변이 분석을 수행하여 공변이 쌍의 아미노산 위치를 동정하는 단계;
b) 공변이 쌍의 아미노산 위치를, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교하는 단계;
c) scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치가 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 아미노산 잔기로 점유되었는지 여부를 측정하는 단계; 및
d) scFv 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두가, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있을 때에 상기 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두를 돌연변이화를 위한 아미노산 위치로서 동정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
이러한 공변이 분석은 또한 단계 a) - d)로 상기에 기술되어 있는, scFv 중의 돌연변이화를 위한 아미노산 위치를 동정하는 방법이 추가로
e) 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열에 대한 공변이 분석을 수행하여 공변이 쌍의 아미노산 위치를 동정하는 단계;
f) 공변이 쌍의 아미노산 위치를, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교하는 단계;
g) scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치가 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 아미노산 잔기로 점유되었는지 여부를 측정하는 단계; 및
h) scFv 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두가, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있을 때에 상기 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두를 돌연변이화를 위한 아미노산 위치로서 동정하는 단계를 포함할 수 있도록 각개 아미노산 위치를 분석하는 것과 조합될 수 있다.
공변이 분석 방법을 단일의 공변이 쌍에 적용시킬 수 있거나, 또는 별법으로 다수의 공변이 쌍의 아미노산 위치를 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내에서 동정하고, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교할 수 있다.
본 발명은 추가로 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있는 scFv 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두를 돌연변이화시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있는 scFv 내의 상응하는 위치 중 하나는 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산 잔기로 치환된다. 또다른 실시태양에서, 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있는 scFv 내의 상응하는 위치 중 그 둘 모두는 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산 잔기로 치환된다.
scFv 서열을 사용하여 돌연변이화를 위한 아미노산 위치를 동정하는 것인, 서열에 기초한 본 발명의 방법은 scFv의 구조를 분석할 수 있도록 하는 다른 방법들과 조합될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 서열에 기초한 방법은 scFv 구조를 추가로 분석하는 분자 모델링 방법과 조합될 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 단계 a) - d)로 상기 기술되어 있는 방법은 추가로 예를 들어,
e) scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 분자 모델링하는 단계; 및
f) 돌연변이화를 위한 scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 추가의 아미노산 위치를 동정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 방법은 추가로 분자 모델링에 의해 돌연변이화를 위한 것으로서 동정된 scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 추가의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계를 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 돌연변이화를 위한 것으로서 동정된 하나 이상의 아미노산 위치에서 하나 이상의 돌연변이화가 이루어지는 본 발명의 방법에 따라 제조된 scFv 조성물에 관한 것이다. 전형적으로 scFv 조성물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제 또한 제공한다.
추가의 또다른 측면에서, 본 발명은
a) VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열의 제1 데이타베이스를 제공하는 단계;
b) 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열의 제2 데이타베이스를 제공하는 단계;
c) 제1 데이타베이스의 각 프레임워크 위치에서의 아미노산 가변성과, 제2 데이타베이스의 각 프레임워크 위치에서의 아미노산 가변성을 측정하는 단계;
d) 제1 데이타베이스와 제2 데이타베이스 간에 아미노산 가변도가 차이가 나는 하나 이상의 프레임워크 위치를 동정함으로써 단일 쇄 항체(scFv) 중 돌연변이화를 위한 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정하는 단계를 포함하는, VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 항체(scFv) 중 돌연변이화를 위한 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 각 프레임워크 위치에서의 아미노산 가변성은 심슨 지수를 사용하여 보존도를 할당함으로써 측정된다. 하나의 실시태양에서, 제1 데이타베이스와 비교하였을 때 제2 데이타베이스에서 더 낮은 심슨 지수(SI) 값을 갖는 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치에 기초하여 돌연변이화를 위한 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정한다. 또다른 실시태양에서, 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치는 제1 데이타베이스 (예를 들면, 생식계열 데이타베이스)와 비교하였을 때 제2 데이타베이스에서 더 높은 심슨 지수 값을 갖는 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치에 기초하여 돌연변이화를 위한 것으로서 동정된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 제2 데이타베이스 (예를 들면, QC 데이타베이스)의 아미노산 위치는 제1 데이타베이스 (예를 들면, 카바트 데이타베이스)에서 상응하는 아미노산 위치의 SI 값보다 적어도 적어도 0.01 더 작은 SI 값, 및 더욱 바람직하게 0.05 더 작은 SI 값 (예를 들면, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 또는 0.1 더 작은 SI 값)을 갖는다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 제2 데이타베이스의 아미노산 위치는 제1 데이타베이스에서 상응하는 아미노산 위치의 SI 값보다 적어도 0.01 더 작은 SI 값 예를 들면, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 또는 0.5 더 작은 SI 값)을 갖는다.
또다른 측면에서, 본 발명은
a) 분류된 VH 또는 VL 아미노산 서열 (예로서, 카바트 패밀리 하위유형에 따라 분류된 생식계열 및/또는 성숙 항체 서열)의 제1 데이타베이스를 제공하는 단계;
b) (예를 들면, QC 분석에 따라) 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된, 분류된 scFv 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열의 제2 데이타베이스를 제공하는 단계;
c) 제1 데이타베이스의 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도 및 제2 데이타베이스의 상응하는 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도를 측정하는 단계;
d) 아미노산 잔기가 제1 데이타베이스에 비해 제2 데이타베이스에서 더 높은 빈도로 존재하는 경우 (즉, 강화된 잔기), 상기 아미노산 잔기를 면역결합제의 상응하는 아미노산 위치에서의 치환에 바람직한 아미노산 잔기로서 동정하는 단계를 포함하는, 면역결합제에서 치환시키는데 바람직한 아미노산 잔기를 동정하는 방법을 제공한다.
추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명은
a) 분류된 VH 또는 VL 아미노산 서열 (예로서, 카바트 패밀리 하위유형에 따라 분류된 생식계열 및/또는 성숙 항체 서열)의 제1 데이타베이스를 제공하는 단계;
b) (예를 들면, QC 분석에 따라) 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된, 분류된 scFv 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열의 제2 데이타베이스를 제공하는 단계;
c) 제1 데이타베이스의 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도 및 제2 데이타베이스의 상응하는 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도를 측정하는 단계;
d) 아미노산 잔기가 제1 데이타베이스에 비해 제2 데이타베이스에서 더 낮은 빈도로 존재하는 경우에 아미노산 잔기를 면역결합제의 상응하는 아미노산 위치에서의 치환에 바람직하지 못한 아미노산 잔기로서 동정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 잔기 유형은 바람직하지 못한 아미노산 잔기 (즉, 배제된 잔기)인 것인, 면역결합제로부터 배제되는 아미노산 잔기를 동정하는 방법을 제공한다. 특정의 바람직한 실시태양에서, 강화 인자(EF)가 1 미만이라면, 바람직하지 못한 아미노산 잔기가 동정된다.
특정 실시태양에서, 제1 데이타베이스는 생식계열 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 제1 데이타베이스는 생식계열 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열로 구성된다. 추가의 또다른 실시태양에서, 제1 데이타베이스는 성숙 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제1 데이타베이스는 성숙 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열로 구성된다. 예시적인 실시태양에서, 성숙 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열은 카바트 데이타베이스(KDB)로부터의 것이다.
특정 실시태양에서, 제2 데이타베이스는 QC 분석으로부터 선택된 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 실시태양에서 제2 데이타베이스는 QC 분석으로부터 선택된 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열로 구성된다.
하나의 실시태양에서, 바람직한 기능적 특성은 개선된 안정성이다. 또다른 실시태양에서, 바람직한 기능적 특성은 개선된 가용성이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 바람직한 기능적 특성은 응집이 일어나지 않는 것이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 바람직한 기능적 특징은 (예로서, 원핵 세포에서의) 발현 개선이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 기능적 특성은 봉입체 정제 공정 이후의 리폴딩 수율의 개선이다. 특정 실시태양에서, 바람직한 기능적 특성은 항원 결합 친화성이 개선되지 않는 것이다. 또다른 실시태양에서, 하나 이상의 바람직한 기능의 조합이 이루어질 수 있다.
추가의 또다른 측면에서, 본 발명은
a) 돌연변이화를 위한 면역결합제 내의 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계;
b) 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계
를 포함하며, 여기서 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 중쇄 아미노산 위치일 경우, 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, 위치 1, 6, 7, 10, 12, 13, 14, 19, 20, 21, 45, 47, 50 ,55, 77, 78, 82, 86, 87, 89, 90, 92, 95, 98, 103 및 107 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 18, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76, 78, 79, 81, 82b, 84, 89 및 93)로 구성된 군으로부터 선택되고,
돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 경쇄 아미노산 위치일 경우, 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, 위치 1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 12, 14, 18, 20, 24, 46, 47, 50, 53, 56, 57, 74, 82, 91, 92, 94, 101 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 12, 14, 18, 20, 24, 38, 39, 42, 45, 48, 49, 58, 66, 73, 74, 76, 83 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 면역결합제를 공학처리하는 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은
a) 돌연변이화를 위한 면역결합제 내의 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계;
b) 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계
를 포함하며, 여기서 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는
(i) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH3의 아미노산 위치 1, 6, 7, 89 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 7, 78 및 89)
(ii) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1a의 아미노산 위치 1, 6, 12, 13, 14, 19, 21, 90, 92, 95 및 98 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 11, 12, 13, 18, 20, 79, 81, 82b 및 84);
(iii) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1b의 아미노산 위치 1, 10, 12, 13, 14, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87 및 107 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 9, 11, 12, 13, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76 및 93);
(iv) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ1의 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 47, 50, 57, 91 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 39, 42, 49, 73 및 85);
(v) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ3의 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 56, 74, 94, 101 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 48, 58, 76, 83 및 85); 및
(vi) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vλ1의 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 46, 53, 82, 92 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 38, 45, 66, 74 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 면역결합제를 공학처리하는 방법을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 돌연변이화시키는 것은 AHo 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 12, 13 및 144 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 12, 85 및 103)로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 아미노산 위치에서의 하나 이상의 (바람직하게는 모든) 쇄의 치환을 포함한다.
특정 바람직한 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 (예를 들어, 효모 QC-시스템에서) 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된 항체 서열 중 상응하는 아미노산 위치에서 발견되는 아미노산 잔기로 돌연변이화된다. 추가의 다른 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 본 발명의 강화/배제 분석 방법에 따라 동정된 아미노산 잔기 (예를 들면, "강화된 아미노산 잔기")로 돌연변이화된다.
바람직하게, 면역결합제는 scFv이지만, 다른 면역결합제, 예를 들면 전장의 면역글로불린 및 다른 항체 단편 (예를 들면, Fab 또는 Dab) 또한 본 발명에 따라 공학처리될 수 있다. 본 발명은 또한 공학처리 방법에 따라 제조된 면역결합제 뿐만 아니라, 면역결합제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 하기에 기술하는 본 발명의 상세한 설명을 참작할 때 보다 잘 이해될 수 있고, 상기 기술된 것 이외의 목적 대상들이 자명해질 것이다. 그러한 설명은 첨부되는 도면을 참조로 하여 이루어지며, 여기서,
도 1은 본 발명에 따른 방법에 따라 scFv를 서열에 기초하여 분석하는 일반 scFv 분석을 요약한 흐름도 다이어그램이다.
제1 단계에서는 가용성 및 안정성을 개선시키고자 하는 scFv의 서열을 제공하고 (박스 1), 이어서, 항체 서열 데이타베이스 (박스 2), 예를 들면 오픈 소스 생식계열 서열 데이타베이스 (예로서, Vbase, IMGT; 박스 3), 오픈 소스 성숙 항체 서열 데이타베이스 (예로서, KDB; 박스 4) 또는 안정적이며 가용성인 완전 인간 scFv 단편의 데이타베이스 (예로서, QC; 박스 5)와 비교한다.
예를 들면, 박스 3에 기술되어 있는 것과 같은 오픈 소스 생식계열 서열 데이타베이스를 적용시킴으로써, 전개되는 동안 선택되고, 이에 전장의 항체 관계에 있어서 가변 도메인의 안정성에 기여하는 것으로 여겨지는 고도로 보존되는 위치가 동정될 수 있도록 한다 (박스 3'). 오픈 소스 성숙 항체 서열 데이타베이스 (4)와 비교함으로써 각각의 CDR과는 상관없이, 안정성, 가용성 및/또는 결합의 개선을 나타내는 패턴을 동정할 수 있다 (박스 4'). 또한, 안정적이며 가용성인 완전 인간 scFv 단편의 데이타베이스 (박스 5)와 비교함으로써 특히 scFv 포맷 중 안정성 및/또는 가용성에 대해 중요한 잔기를 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 특히, scFv 포맷, 예로서 VL 및 VH 조합물 중 각각의 CDR과는 상관없이, 안정성, 가용성 및/또는 결합의 개선을 나타내는 패턴을 동정할 수 있다 (박스 5').
다음 단계 (박스 6)에서는 중요한 잔기가, 각 데이타베이스에서 동정된 것으로서 가장 빈번하게 존재하는 적합한 아미노산으로 치환된다.
마지막으로 (박스 7), 중요한 잔기의 무작위 또는 편향된 돌연변이 유발법이 이루어지고, 이어서, 효모 QC-시스템에서 개선된 안정성 및/또는 가용성에 대하여 스크리닝이 실시될 수 있다. 돌연변이체는 상기 언급한 절차를 다시 거칠 수 있다 (화살표로 표시된 바와 같이 박스 2로 이동).
도 2는 scFv를 서열에 기초하여 분석하는 일례의 다단계 방법에 관한 흐름도 다이어그램이다.
제1 단계 (박스 1)에서는 생물 정보학적 도구로부터 얻은 결과에 기초하여 각 위치에 존재하는 상이한 아미노산의 출현도를 비교함으로써 프레임워크 중의 각 잔기의 빈도를 측정한다. 제2 단계에서는 예로서, 수학식 D = ∑ n i ( n i -1)/N(N-1)으로 심슨 지수를 사용함으로써 각 위치에서의 보존도를 정의한다. 제3 단계에서는 (예로서, 볼츠만 법칙: ΔΔGth = -RTln(f 모체 /f 칸센서스 )를 적용시켜) 전체 자유 에너지를 최소화시키는 최적의 치환을 결정한다. 마지막으로 (단계 4), 잠재적인 안정화 돌연변이의 역할을 결정한다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어, 국소 및 비-국소 상호작용, 정규 잔기, 경계면, 노출 정도 및 β-회전 성향을 고려할 수 있다.
도 3은 효모에서 안정적이며 가용성인 scFv를 선택하는 일례의 품질 관리(QC) 시스템에 관한 개략도이다. 이러한 시스템의 경우, 환원 환경하에서 안정적이며 가용성인 scFv를 발현할 수 있는 숙주 세포는 안정적이며 가용성인 scFv-AD-Gal11p 융합 단백질의 존재에 따라 발현을 달리하는 유도성 리포터 작제물의 존재에 기인하여 선택된다. 상기 융합 단백질과 Gal4(1-100)이 상호작용하게 되면, 선별가능한 마커의 발현을 활성화시키는 기능적 전사 인자가 형성되게 된다 (도 3A 참조). 불안정적이고/거나 불용성인 scFv는 기능적 전사 인자를 형성할 수 없고, 선별가능한 마커의 발현을 유도할 수 없는 바, 선택에서 배제된다 (도 3B). 선택된 scFv는 심지어 환원 조건하에서도 안정적이며 가용성인 폴딩 단백질 (여기서, 디설피드 결합은 폴딩되어 있지 않은 단백질)을 수득할 수 있는 반면, 불안정적이 고/거나 불용성인 scFv는 언폴딩되고, 응집되고/거나 분해되는 경향이 있다. 산화 조건하에서 선택된 scFv는 여전히 우수한 가용성 및 안정성 특징을 나타낸다.
도 4는 또다른 일례의 품질 관리(QC) 시스템에 관한 개략도이다. 가용성이며 안정적인 scFv를 선택한다는 전반적인 개념은 도 3에 기술된 것과 동일하지만, 본 변형 시스템에서는 scFv가 활성화 도메인(AD) 및 DNA-결합 도메인(DBD)을 포함하는 기능적 전사 인자에 직접 융합된다. 도 4A는, 기능적 전사 인자에 융합되었을 때에는 선별가능한 마커의 전사를 방해하지 않는, 일례의 가용성이며 안정적인 scFv를 도시한다. 대조적으로, 도 4B는, 불안정한 scFv가 전사 인자의 융합으로 인해 선별가능한 마커의 전사를 활성화시킬 수 없는 비-기능적 융합 작제물이 형성된다는 시나리오를 도시한다.
도 5는 체세포 돌연변이 이전에 이루어진 천연 생식계열 서열 내의 특정 프레임워크(FW) 위치에서의 가변성 분석 (도 5A) 및 QC 시스템에서 선택된, 체세포 돌연변이 이후에 이루어진 성숙 항체 서열 내의 상응하는 FW 위치에서의 가변성 분석 (도 5B)에 관한 개략도이다. 생식계열 및 QC 서열 (즉, 각각 "G" 값 및 "Q" 값) 내의 각 FW 위치 (예로서, 고도로 가변적인 프레임워크 잔기 ("hvFR"))에 다른 가변성 값을 할당받을 수 있다. 특정 위치에서 G > Q인 경우에는, 상기 위치에 적합한 안정적인 FW 잔기의 수는 제한되어 있다는 것이다. 특정 위치에서 G < Q인 경우, 이는 잔기가 최적의 가용성 및 안정성을 위해 천연적으로 선택되었다는 것을 시사할 수 있다.
도 6은 25 내지 95℃의 온도 범위에서 열 유도성 스트레스를 가한 이후에 ESBA105 변이체에 대하여 관찰된 변성 프로파일을 도시한다. 생식계열 칸센서스 잔기 (V3Q, R47K, 또는 V103T)로 역돌연변이화된 ESBA-105 변이체는 점선으로 표시되어 있다. 본 발명의 방법에 의해 동정된 바람직한 치환을 포함하는 변이체 (QC11.2, QC15.2, 및 QC23.2)는 실선으로 표시되어 있다.
도 7은 칸센서스 역돌연변이 (S-2, D-2, D-3), 알라닌(D-1)으로의 돌연변이 또는 QC 잔기 (QC7.1, QC11.2, QC 15.2, QC23.2)를 포함하는, 한 세트의 ESBA105 변이체들의 열적 안정성을 비교한 것을 도시한다. 각 변이체의 열적 안정성 (임의의 언폴딩 단위로)을 제공한다.
도 8은 25 내지 95℃의 온도 범위에서 열 유도성 스트레스를 가한 이후에 ESBA212 변이체에 대하여 관찰된 변성 프로파일을 도시한다. 생식계열 칸센서스 잔기 (V3Q 또는 R47K)로 역돌연변이화된 ESBA212 변이체는 점선으로 표시되어 있다. 모체 ESBA212 분자는 실선으로 표시되어 있다.
도 9는 야생형 ESBA105 및 그의 가용성 변이체의, PEG 침전에 의한 가용성 곡선을 도시한다.
도 10은 광범위한 온도 범위 (25-96℃)에서의 열적 검사 이후에 측정된, 야생형 ESBA105 및 그의 가용성 변이체에 대한 열적 변성 프로파일을 도시한다.
도 11은 열적 스트레스의 조건하에서 2주간의 인큐베이션 기간이 경과된 이후에, 각종 ESBA105 가용성 돌연변이체의 분해 양상을 보여주는 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 안정성, 가용성 및/또는 친화성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 면역결합제 특성, 특히 scFvs 특성을 서열에 기초하여 공학처리하고 최적화시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 돌연변이화됨으로써 scFv의 하나 이상의 물리적인 특성을 개선시킬 수 있는 scFv 내의 아미노산 위치를 동정하기 위해 항체 서열 분석을 사용하여 scFv 항체를 최적화시키는 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 생산되거나 수득할 수 있는, 공학처리된 면역결합제, 예로서 scFv에 관한 것이다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 다수의 항체 서열 데이타베이스 중에서 각각의 중쇄 및 경쇄 프레임워크 위치에 존재하는 아미노산의 빈도를 분석하는 것에 기초한다. 특히, 항체 서열 데이타베이스 (예로서, 생식계열 항체 서열 데이타베이스 또는 성숙 항체 데이타베이스, 예로서 카바트 데이타베이스)의 빈도 분석을, 원하는 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된 scFv 서열의 데이타베이스에 관한 빈도 분석과 비교하였다. (예로서, 심슨 지수를 사용하여) 각 프레임워크 위치에 가변도를 할당하고, 다른 유형의 항체 서열 데이타베이스 내의 각 프레임워크 위치에서의 가변도를 비교함으로써 이에 scFv의 기능적 특성 (예로서, 안정성, 가용성)에 중요한 프레임워크 위치를 동정할 수 있게 되었다. 이에, 프레임워크 아미노산 위치에 대한 "기능적 칸센서스"를 정의할 수 있게 되었고, 여기서, 면역글로불린 서열 (예로서, 생식계열 또는 성숙 면역글로불린 서열) 중의 상응하는 위치에서보다 가변성에 대한 내성이 더 크거나 더 작은 프레임워크 위치를 동정하게 되었다. 따라서, 본 발명은 기능에 의해 선택된 scFv 서열의 데이타베이스를 사용하는 것에 기초한 "기능적 칸센서스" 접근법을 제공하고, 그의 잇점을 입증한다. 또한 추가로, 본 발명은 본원에 기술된 "기능적 칸센서스" 접근법을 사용하여 동정된 특정 프레임워크 아미노산 위치를 돌연변이화시킴으로써 면역결합제 (예로서, scFv)를 공학처리하는 방법을 제공한다.
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해서 먼저 특정 용어들을 정의한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시 또는 시험에는 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질을 하기에 기술한다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌들은 그의 전문이 참고로 인용된다. 의견이 상반되는 경우, 정의부를 비롯한 본 명세서를 통해 조정될 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 "면역글로불린"과 동의어이다. 본 발명에 따른 항체는 면역글로불린의 적어도 하나의 가변 도메인, 예를 들면 단일 가변 도메인, Fv (문헌 [Skerra A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41]), scFv (문헌 ([Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26]; [Huston, J.S. et al (1988; Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-83])), Fab, (Fab')2 또는 당업자에게 잘 알려져 있는 다른 단편을 포함하는 완전한 면역글로불린 또는 그의 단편일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체 프레임워크"는 가변 도메인, VL 또는 VH의 일부로서, 이러한 가변 도메인의 항원 결합 루프에 대한 스캐폴드로서 작용을 하는 것을 지칭한다 (문헌 [Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242]).
본원에서 사용된 용어 "항체 CDR"은 문헌 [Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242]에 의해 정의되어 있는 바와 같이, 항원 결합 루프로 이루어진 항체의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 항체 Fv 단편의 2개의 가변 도메인 각각은 예를 들어, 3개의 CDR을 포함한다.
용어 "단일 쇄 항체" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 그러한 scFv 분자는 일반 구조식: NH2 -VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "동일성"은 2개의 폴리펩티드, 분자간 또는 2개의 핵산 간의 서열 매칭을 지칭한다. 비교되는 두 서열, 둘 모두의 위치에 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유니트가 점유하고 있다면 (예컨대, 2개의 폴리펩티드 각각의 위치에 리신이 점유하고 있다면), 각 분자는 그 위치에서 동일한 것이다. 두 서열 간의 "동일성(%)"은 두 서열이 공유하고 있는 매칭 위치의 갯수를 비교되는 위치의 갯수로 나누고, 그에 100을 곱하여 얻은 함수이다. 예컨대, 두 서열내 10개의 위치 중 6개가 매치된다면, 두 서열은 60% 동일성을 갖는다. 일반적으로, 두 서열이 최대 동일성을 갖도록 정렬시켜 비교한다. 상기 정렬은 예컨대, 얼라인 프로그램(Align program)(DNA스타, 인크.(DNAstar, Inc.))과 같은 컴퓨터 프로그램에 의하여 통상적으로 수행되는, 문헌 [Needleman et al. (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453]의 방법을 사용하여 제공받을 수 있다.
"유사한" 서열은 정렬되었을 때에 동일하고 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 서열로서, 여기서, 유사한 잔기는 정렬된 참조 서열 중 상응하는 아미노산 잔기의 보존적 치환이다. 이와 관련하여, 참조 서열 중 잔기의 "보존적 치환"은 상응하는 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기, 예로서 크기, 형태, 전하, 및 공유 결합 또는 수소 결합 형성 능력과 같은 화학적 성질 등이 유사한 잔기에 의한 치환이다. 따라서, "보존적 치환으로 변형된" 서열은 하나 이상의 보존적 치환이 존재한다는 점에서 참조 서열 또는 야생형 서열과 차이를 보이는 서열이다. 두 서열 간의 "유사성(%)"은 두 서열이 공유하고 있는, 매칭 잔기 또는 보존적 치환을 포함하는 위치의 갯수를 비교되는 위치의 갯수로 나누고, 그에 100을 곱하여 얻은 함수이다. 예컨대, 두 서열내 10개의 위치 중 6개가 매치되고, 10개의 위치 중 2개가 보존적 치환을 포함한다면, 두 서열은 80%의 양성 유사성을 갖는 것이다.
본원에서 사용되는 "아미노산 칸센서스 서열"은 적어도 2개, 및 바람직하게는 그 이상의 정렬된 아미노산 서열의 행렬의 사용하여 생성될 수 있고, 각 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산을 결정할 수 있도록 하기 위해 정렬 중에 갭을 허용하는 아미노산 서열을 지칭한다. 칸센서스 서열이란 각 위치에서 가장 빈 번하게 나타나는 아미노산을 포함하는 서열이다. 2개 이상의 아미노산이 단일 위치에서 동등하게 나타나는 경우, 칸센서스 서열은 이들 아미노산 둘 모두 또는 그들 모두를 포함한다.
단백질의 아미노산 서열은 다양한 수준으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 보존성 또는 가변성은 단일 잔기 수준으로, 다중 잔기 수준으로, 갭을 포함하는 다중 잔기 등으로 나타낼 수 있다. 잔기는 동일한 잔기로 이루어지는 보존을 나타낼 수 있거나, 부류 수준으로 보존될 수 있다. 아미노산 부류의 예로는 비전하성 극성 R기 (세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민); 양전하성 R기 (리신, 아르기닌, 및 히스티딘); 음전하성 R기 (글루탐산 및 아스파르트산); 소수성 R기 (알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신); 및 특수 아미노산 (시스테인, 글리신 및 프롤린)을 포함한다. 기타 부류도 당업자에게 알려져 있으며, 이는 구조 측정 또는 치환가능성을 평가하는 다른 데이타를 사용함으로써 정의될 수 있다. 이러한 의미에서, 치환가능성 아미노산이란 상기 위치에서 치환될 수 있으며, 기능적 보존성을 유지할 수 있는 임의의 아미노산을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 하나의 아미노산 서열 (예로서, 제1 VH 또는 VL 서열)이 하나 이상의 추가의 아미노산 서열 (예로서, 데이타베이스 중의 하나 이상의 VH 또는 VL 서열)과 함께 정렬되었을 때, 하나의 서열 (예로서, 제1 VH 또는 VL 서열) 중의 아미노산 위치는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열 중의 "상응하는 위치"와 비교될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "상응하는 위치"란, 서열을 최적으 로 정렬하였을 때, 즉, 동일성(%) 또는 유사성(%) 값이 최고값에 도달하도록 서열을 정렬하였을 때에 비교되는 서열(들) 중 등가의 위치를 나타내는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 데이타베이스"란 2개 이상의 항체 아미노산 서열 ("다수"의 서열)의 집합을 지칭하는 것이며, 전형적으로는 수십 개, 수백 개 또는 심지어는 수천 개의 항체 아미노산 서열 집합을 지칭한다. 항체 데이타베이스는 아미노산 서열, 예를 들어, 항체 VH 영역, 항체 VL 영역, 또는 그 둘 모두의 집합을 저장할 수 있거나, VH 및 VL 영역으로 이루어진 scFv 서열 집합을 저장할 수 있다. 바람직하게, 데이타베이스는 검색가능한 고정 매체에, 예를 들면 컴퓨터 상의 검색가능한 컴퓨터 프로그램에 저장된다. 하나의 실시태양에서, 항체 데이타베이스는 생식계열 항체 서열을 포함하거나, 그로 구성된 데이타베이스이다. 또다른 실시태양에서, 항체 데이타베이스는 성숙 (즉, 발현된) 항체 서열 (예로서, 성숙 항체 서열의 카바트 데이타베이스, 예로서 KBD 데이타베이스)을 포함하거나, 그로 구성된 데이타베이스이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 항체 데이타베이스는 기능적으로 선택된 서열 (예로서, QC 분석으로부터 선택된 서열)을 포함하거나, 그로 구성된다.
용어 "면역결합제"란 특이적으로 표적 항원을 인식할 수 있도록 항체의 항원 결합부 모두 또는 그 일부, 예를 들면 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 모두 또는 그 일부를 포함하는 분자를 지칭한다. 면역결합제의 비제한적인 일례로는 전장의 면역글로불린 분자 및 scFv 뿐만 아니라, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설피드 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 일부를 포함하는 Fab인 Fab' 단편 (문헌 [FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993] 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (vi) 단일 도메인 항체, 예를 들면 VH 또는 VL 도메인으로 구성된 Dab 단편 (문헌 [Ward et al, (1989) Nature 341:544-546]), 카멜리드(Camelid) (문헌 ([Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993)], 및 [Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)]) 참조) 또는 상어(Shark) 항체 (예로서, 상어 Ig-NAR 나노바디®); 및 (vii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역인 나노바디를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "기능적 특성"이란, 예를 들면 폴리펩티드의 제조 특성 또는 치료학적 효능을 개선시키기 위해서는 (예로서, 종래 폴리펩티드에 비하여) 폴리펩티드 (예로서, 면역결합제)에 대해 개선시키는 것이 바람직할 수 있거나, 당업자에게 유익한 것인 상기 폴리펩티드의 특성이다. 하나의 실시태양에서, 기능적 특성은 개선된 안정성 (예로서, 열적 안정성)이다. 또다른 실시태양에서, 기능적 특성은 (예로서, 세포 조건하의) 개선된 가용성이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 기능적 특성은 응집이 일어나지 않는 것이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 기능적 특성은 (예로서, 원핵 세포에서의) 발현 개선이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 기능적 특성은 봉입체 정제 공정 이후의 리폴딩 수율의 개선이다. 특정 실시태양에서, 기능적 특성은 항원 결합 친화성이 개선되지 않는 것이다.
서열에 기초한 scFv 분석
본 발명은 돌연변이화를 위해 선택되는 scFv 서열 내의 아미노산 위치를 동정할 수 있도록 하는 scFv 서열 분석 방법을 제공한다. 돌연변이화를 위해 선택되는 아미노산 위치는 scFv의 기능적 특성, 예를 들면 가용성, 안정성 및/또는 항원 결합에 영향을 줄 것으로 예측되는 아미노산 위치이며, 여기서, 상기 위치에서의 돌연변이화가 scFv의 성능을 개선시킬 것으로 예측된다. 따라서, 본 발명을 통해scFv 서열 내의 아미노산 위치를 단순히 무작위적으로 돌연변이화시키는 것보다는 성능을 최적화시키도록 보다 더 집중적으로 scFv를 공학처리할 수 있다.
서열에 기초한 scFv 서열 분석에 관한 특정 측면을 도 1의 흐름도에 개략적으로 도시한다. 상기 도면에 나타낸 바와 같이, 최적화시키고하는 하는 scFv의 서열을, 안정적이며 가용성인 것으로서 선택된 scFv 서열로 구성되어 있는 항체 데이타베이스를 비롯한 하나 이상의 항체 데이타베이스 중의 서열과 비교한다. 이를 통해 특히 scFv 포맷 중 안정성 및/또는 가용성에 중요한 잔기를 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 특히 scFv 포맷 (예로서, VL 및 VH 조합) 중에서, 각각의 CDR과는 무관하게, 안정성, 가용성 및/또는 결합 개선을 보이는 패턴을 동정할 수 있다. 일단 중요한 잔기를 동정하고 나면, 상기 잔기를 각 데이타베이스에서 동정된 바 가장 빈번하게 존재하는 적합한 아미노산으로 치환할 수 있거나, 무작위 또는 편향된 돌연변이 유발법에 의해 치환시킬 수 있다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은
a) scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을, 다수의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 데이타베이스로 입력하여 상기 scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열과 함께 정렬시키는 단계;
b) 상기 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치를 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교하는 단계;
c) scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치가, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 아미노산 잔기로 점유되어 있는지 여부를 측정하는 단계; 및
d) scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치가, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있을 때에 상기 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치를 돌연변이화를 위한 아미노산 위치로서 동정하는 단계를 포함하는, VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 항체(scFv) 중 돌연변이화를 위한 아미노산 위치를 동정하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 방법에서 관심의 대상이 되는 scFv의 서열 (즉, VH, VL 서열 또는 둘 모두)을 항체 데이타베이스의 서열과 비교하고, 관심의 대상이 되는 scFv 중의 아미노산 위치가 데이타베이스 중의 상응하는 위치에서 "보존되는" 아미노산 잔기로 점유되어 있는지 여부를 측정한다. scFv 서열의 아미노산 위치가 데이타베이스의 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있을 경우에는 scFv의 상기 아미노산 위치를 돌연변이화를 위해 선택한다. 바람직하게, 분석되는 아미노산 위치는 관심의 대상이 되는 scFv 내의 프레임워크 아미노산 위치이다. 더욱더 바람직하게, 관심의 대상이 되는 scFv 내의 모든 프레임워크 아미노산 위치가 분석될 수 있다. 대체 실시태양에서, 관심의 대상이 되는 scFv의 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산 위치가 분석될 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, 관심의 대상이 되는 scFv 내의 각 아미노산 위치가 분석될 수 있다.
아미노산 잔기가 항체 데이타베이스의 서열 내의 특정 아미노산 위치 (예로서, 프레임워크 위치)에서 "보존되는지" 여부를 측정하기 위해서 특정 위치에서의 보존도를 계산할 수 있다. 주어진 위치에서의 아미노산 다양성을 정량할 수 있는 각종의 상이한 방법들이 당업계에 알려져 있으며, 이들 모두가 본 발명의 방법에 적용될 수 있다. 바람직하게, 보존도는 다양성의 척도인 심슨 다양성 지수(Simpson's diversity index)를 사용함으로써 계산한다. 각 위치에 존재하는 아미노산의 갯수 뿐만 아니라, 각 아미노산의 상대 존재비를 고려한다. 심슨 지 수(S.I.)란, 무작위로 선택된 2개의 항체 서열이 특정 위치에서 동일한 아미노산을 포함할 수 있는 확률을 나타낸다. 심슨 지수는 보존성 측정시에 풍부도 및 균등도라는 2가지 주요 인자를 고려한다. 본원에서 사용되는 바, "풍부도"란 특정 위치에 존재하는 상이한 아미노산 종류의 갯수에 관한 척도이다 (즉, 데이타베이스 중 상기 위치에서 표시되는 상이한 아미노산 잔기의 갯수가 풍부도의 척도가 된다). 본원에서 사용되는 바, "균등도"란 특정 위치에 존재하는 각 아미노산의 존재비에 관한 척도이다 (즉, 아미노산 잔기가 데이타베이스의 서열 내의 상기 위치에 존재하게 되는 빈도가 균등도의 척도가 된다).
잔기 풍부도는 특정 위치에서의 보존도를 조사하기 위한 그 자신의 척도로서 사용될 수 있지만, 특정 위치에 존재하는 각 아미노산 잔기의 상대 빈도는 고려되지 않는다. 데이타베이스의 서열 내의 특정 위치에 매우 빈번하게 존재하는 상기 아미노산 잔기를 중요시하는 것만큼 상기와 동일한 위치에 매우 드물게 존재하는 상기 잔기도 중요시한다. 균등도는 위치의 풍부도를 보충해주는 상이한 아미노산의 상대 존재비에 관한 척도가 된다. 심슨 지수는 풍부도 및 균등도, 둘 모두를 고려하는 바, 따라서, 이는 본 발명에 따른 보존도를 정량하는데 있어 바람직한 방법이다. 특히, 매우 보존적인 위치에 존재하는 빈도가 낮은 잔기는 잠재적으로 개연성을 지닌 것으로서 간주되며, 따라서, 돌연변이화를 위해 선택될 수 있다.
심슨 지수에 관한 수학식은, D = ∑ni(ni-1)/N(N-l) (여기서, N은 조사표 중 (예로서, 데이타베이스 중)의 서열의 총 갯수이고, ni은 분석되는 위치에서의 각 아 미노산 잔기의 빈도이다)이다. 데이타베이스 중 아미노산 이벤트(i)의 빈도란 데이타베이스 중에 아미노산이 존재하는 횟수의 갯수(ni)이다. 계수인 ni 그 자체가 상대 빈도로 주어지는데, 이는 이벤트 총 갯수로 정규화되어 있는 것이다. 최대 다양성이 존재하는 경우, S.I. 값은 0이고, 최소 다양성이 존재하는 경우, S.I. 값은 1이 된다. 따라서, S.I. 범위는 0-1이며, 다양성과 지수 값 사이에는 반비례 관계가 성립한다.
데이타베이스의 서열 내의 프레임워크 아미노산 위치 분석을 위한 다단계를 요약한 흐름도는 도 2에 추가로 상세히 기술되어 있다.
따라서, 상기 기술한 방법의 바람직한 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치는 심슨 지수의 사용으로 보존도를 할당받는다. 상기 상응하는 위치의 S.I. 값이 상기 위치의 보존성에 대한 지표로서 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, 밀접한 관련이 있는 항체 서열에 대하여 신뢰성이 있는 정렬 (즉, 단백질 구조가 유사한 것으로 간주되어 서열 정렬)은 본 발명에서 결정된 위치의 보존도와 아미노산의 상대 존재비에 관한 행렬을 작성하는데 사용된다. 이러한 행렬은 항체-항체 데이타베이스 비교용으로 디자인된 것이다. 각 잔기에서 관찰되는 빈도를 계산하고, (본질적으로 각 위치에 대한 데이타 세트 중의 각 잔기의 빈도인) 예측된 빈도와 비교한다.
기술된 방법을 사용하여 주어진 scFv 항체를 분석함으로써 주어진 scFv 항체 중의 특정 위치에 존재하는 생물학적으로 허용되는 돌연변이화 및 독특한 잔기에 관한 정보를 제공하고, 그의 프레임워크 내의 잠재적인 취약성을 예측할 수 있다. 기준으로서 S.I. 값과 상대 빈도를 사용하여, 아미노산-빈도 데이타 세트와 "최대"로 일치하도록 아미노산 치환을 공학처리하는데에 통상의 방법이 사용될 수 있다.
상기 기술된, 서열에 기초한 분석은 scFv의 VH 영역에, scFv의 VL 영역에, 또는 그 둘 모두에 적용될 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, scFv VH 아미노산 서열을 데이타베이스 내로 입력하고, 데이타베이스의 항체 VH 아미노산 서열과 함께 정렬시킨다. 또다른 실시태양에서, scFv VL 아미노산 서열을 데이타베이스 내로 입력하고, 데이타베이스의 항체 VL 아미노산 서열과 함께 정렬시킨다. 추가의 또다른 실시태양에서, scFv VH 및 VL 아미노산 서열을 데이타베이스 내로 입력하고, 데이타베이스의 항체 VH 및 VL 아미노산 서열과 함께 정렬시킨다. 하나의 서열을 데이타베이스 중의 다른 서열의 집합과 함께 정렬하는 알고리즘은 당업계에 잘 확립되어 있다. 서열 간의 동일성(%) 또는 유사성(%) 값이 최고값에 도달하도록 서열을 정렬한다.
본 발명의 방법을 사용하여 scFv 서열 내의 관심의 대상이 되는 하나의 아미노산 위치를 분석할 수 있거나, 더욱 바람직하게는 본 방법을 사용하여 관심의 대상이 되는 다수의 아미노산 위치를 분석할 수 있다. 따라서, 상기 기술된 방법의 단계 b)에서, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 다수의 아미노산 위치를 데이타 베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교할 수 있다. 분석하고자 하는 바람직한 위치는 scFv의 VH 및/또는 VL 서열 내의 프레임워크 위치이다 (예로서, 각 VH 및 VL 프레임워크 위치가 분석될 수 있다). 추가로 또는 별법으로, (비록 CDR을 포함하는 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 것이 바람직하지 않을 수도 있지만, CDR 내의 돌연변이화가 프레임워크 영역 내의 돌연변이화보다는 항원 결합 활성에 영향을 줄 수 있는 가능성이 더 크기 때문에) scFv의 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 위치가 분석될 수 있다. 또한 추가로, 본 발명의 방법을 통해 scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 각 아미노산 위치를 분석할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 관심의 대상이 되는 scFv의 서열을 하나 이상의 각종 상이한 유형의 항체 서열 데이타베이스 내의 서열과 비교할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열은 생식계열 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열이다. 또다른 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열은 재배열된 친화성 성숙된 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열이다. 추가의 또다른 바람직한 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열은 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성, 예를 들면 scFv 안정성 또는 scFv 가용성 (하기에 추가로 논의 됨)을 갖는 것으로서 선택된 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열이다.
항체 서열 정보는 생식계열 서열 또는 자연 상태에 존재하는 임의의 다른 항체 서열로부터의 서열 정렬로부터 수득, 수집 및/또는 작성될 수 있다. 서열 공급원으로는 하기 데이타베이스 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
● 카바트 데이타베이스 (.immuno.bme.nwu.Edu (2007년 10월 현재); 문헌 ([Johnson & Wu (2001) Nucleic Acids Res. 29: 205-206]; [Johnson & Wu (2000) Nucleic Acids Res . 28: 214-218])). 2000년도에 얻은 미가공 데이타는 미국에서는 FTP에 의해 이용할 수 있으며, 영국에서는 반영되고 있다.
● 카바트맨(Kabatman)은, 사용자가 서열의 독특한 특성에 대해 카바트 서열을 검색할 수 있도록 하고, 특정 항체 서열 중의 CDR에 대한 정규 배정을 찾을 수 있도록 하는 데이타베이스를 포함한다.
● AAAAA 웹사이트 (www.bioc.unizh.ch/antibody/ (2007년 10월 현재)) (안네마리 호네거(Annemarie Honegger)가 제작한 항체 페이지로, 이는 서열 정보와 항체의 구조 데이타를 제공한다).
● ABG: 항체의 3D 구조에 관한 디렉토리 - 안티바디 그룹(ABG: Antibody Group)에 의해 작성된 디렉토리를 통해 사용자는 단백질 데이타 뱅크(PDB)에서 수집된 항체 구조에 액세스할 수 있다. 상기 디렉토리에서 각 PDB 엔트리는 원래의 공급원으로 하이퍼링크되어 있으며, 이를 통해 완전한 정보를 쉽게 검색할 수 있 다.
● ABG: 마우스 VH 및 Vκ 생식계열 세그먼트의 생식계열 유전자 디렉토리 (UNAM (내셔날 유니버시티 오브 멕시코)(National University of Mexico) 인스티튜트 드 바이오테크놀로지아(Institute de Biotecnologia) 산하에 있는 안티바디 그룹의 웹페이지 중의 일부).
● IMGT® (인터내셔날 이뮤노제네틱스 임포메이션 시스템(international ImMunoGeneTics information system)® - 1989년에 마리-폴 르프랑(Marie-Paule Lefranc) (유니베르시떼 몽펠리에 II(Universite Montpellier II), CNRS)에 의해 작성된 것으로, IMGT는 인간 및 기타 다른 척추동물 종의 면역계에 있는 면역글로불린, T 세포 수용체, 및 관련 단백질에 대한 통합 전문 자원이다. IMGT는 서열 데이타베이스 (IMGT/LI GM-DB (인간 및 기타 다른 척추동물로부터 얻은 IG 및 TR과 함께, 완전한 주석이 달린 서열에 대한 번역물로 이루어진 종합 데이타베이스), IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMER-DB), 게놈 데이타베이스 (IMGT/GENE-DB), 구조 데이타베이스 (IMGT/3D 구조-DB), 웹 리소스 (IMGT 레퍼토리)로 구성된다 (IMGT, 인터내셔날 이뮤노제네틱스 임포메이션 시스템®; imgt.cines.fr (2007년 10월 현재); 문헌 ([Lefranc et al (1999) Nucleic Acids Res. 27:209-212]; [Ruiz et al. (2000) Nucleic Acids Res . 28: 219-221]; [Lefranc et al. (2001) Nucleic Acids Res . 29: 207-209]; [Lefranc et al. (2003) Nucleic Acids Res . 31:307-310])).
● V BASE - 진뱅크(Genbank) 및 EMBL 데이타 라이브러리에서 최근 공개된 것을 비롯한, 일천여개 이상의 공개된 서열로부터 수집된 모든 인간 생식계열 가변 영역 서열의 종합 디렉토리.
바람직한 실시태양에서, 항체 서열 정보는 환원 환경하에서 증진된 안정성 및 가용성에 대해 선택되어진 정의된 프레임워크를 갖는 scFv 라이브러리로부터 수득한다. 더욱 특히, 환원 환경하에서 안정성 및 가용성이 증진된 scFv 프레임워크를 세포내에서 선택할 수 있도록 하는 효모 품질 관리(QC)-시스템이 기술되어 있다 (예로서, PCT 공보 WO 2001/48017; 미국 출원 번호 2001/0024831 및 미국 2003/0096306; 미국 특허 번호 제7,258,985호 및 제7,258,986호 참조). 상기 시스템에서 scFv 라이브러리는, 특정의 공지 항원을 발현시킬 수 있고, 오직 항원-scFv 상호작용의 존재하에서만 생존할 수 있는 숙주 세포로 형질전환된다. 항원과 scFv의 발현에 적합하고, 오직 항원-scFv 상호작용의 존재하에서만 생존할 수 있게 하는 조건하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양한다. 따라서, 생존 세포에서 발현되고, 환원 환경하에서 안정적이며 가용성인 정의된 프레임워크를 갖는 scFv를 단리시킬 수 있다. 따라서, QC-시스템을 사용하여 대규모 scFv 라이브러리를 스크리닝함으로써 환원 환경하에서 안정적이며 가용성인 프레임워크를 갖는 바람직한 scFv를 단리시킬 수 있고, 상기의 선택된 scFv 서열을 scFv 서열 데이타베이스로 수집할 수 있다. 이어서, 상기 scFv 데이타베이스는 본 발명의 방법을 사용하여 이루어지는 관심의 대상이 되는 다른 scFv 서열과의 비교 목적을 위해 사용될 수 있다. 앞서 QC-시스템을 사용하여 선택되고 정의된 바람직한 scFv 프레임워크 서열은 PCT 공보 WO 2003/097697 및 미국 출원 번호 제20060035320호에 추가로 상세히 기재되어 있다.
원 QC-시스템의 변형 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 한 일례의 실시태양에서, 이는 도 3에 개략적으로 도시되어 있는 것으로, scFv 라이브러리는 Gal4 효모 전사 인자의 활성화 도메인(AD)에 융합되고, 이는 다시 소위 말하는 Gal11p 단백질 (11p)의 일부분에 융합된다. 이어서, scFv-AD-Gal11p 융합 작제물은, Gal4의 처음 100개의 아미노산을 발현하는 숙주 세포로 형질전환됨으로써, 이에 Gal4 DNA-결합 도메인 (DBD; Gal4(1-100))을 포함하게 된다. Gal11p는 Gal4(1-100)에 직접 결합하는 것으로 알려져 있는 점 돌연변이이다(문헌 [Barberis et al., Cell, 81: 359 (1995)] 참조). 형질전환된 숙주 세포를, scFv 융합 단백질 발현에 적합하고, 오직 scFv 융합 단백질이 Gal4(1-100)과 상호작용함으로써 DBD에 연결된 AD를 포함하는 기능적 전사 인자를 형성할 수 있을 정도로 충분히 안정적이며 가용성인 경우에만 세포가 생존할 수 있게 하는 조건하에서 배양한다 (도 3A). 따라서, 생존 세포에서 발현되고, 환원 조건하에서 안정적이며 가용성인 정의된 프레임워크를 갖는 scFv를 단리시킬 수 있다. 이러한 예시적인 QC 시스템에 관한 추가 설명은 문헌 [Auf der Maur et al., Methods, 34: 215-224 (2004)]에 기재되어 있다.
또다른 일례의 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 QC-시스템은 도 4에 도시되어 있다. QC-시스템의 이러한 변형 시스템에서 scFv 또는 scFv 라이브러리는 기능적 전사 인자에 직접 융합되고, 선별가능한 마커를 함유하는 효모 균주에서 발현된다. 선별가능한 마커는 오직 기능적 scFv-전사 인자 융합의 존재하에서만 활성화될 수 있는데, 이는 작제물이 전체적으로 안정적이며 가용성이어야 한다는 것을 의미한다 (도 4A). scFv가 불안정한 경우에는 응집체가 형성될 수 있 고, 결국에는 분해됨으로써 이는 또한 scFv에 융합되어 있는 전사 인자를 분해시킴으로써 더 이상은 선별가능한 마커의 발현을 활성화시킬 수 없게 된다 (도 4B 참조).
본 발명의 방법에서, 관심의 대상이 되는 scFv의 서열을 데이타베이스 내의 모든 서열과 비교할 수 있거나, 별법으로, 데이타베이스 중의 서열 중 오직 선택된 부분만을 사용하여 비교 목적으로 사용할 수 있다. 즉, 데이타베이스는 관심의 대상이 되는 scFv에 대해 높은 유사성(%) 또는 동일성(%)을 갖는 서열로만 제한되거나, 한정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 하나의 실시태양에서, 데이타베이스는, scFv 항체 VVH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열에 대해 높은 유사성(%)을 갖는 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열만이 데이타베이스에 포함되어 있는 한정된 데이타베이스이다.
일단, 관심의 대상이 되는 scFv의 서열을 데이타베이스 내로 입력하고, 데이타베이스 내의 항체 서열과 비교하고 나면, 서열 정보를 분석하여 주어진 위치에 있는 아미노산의 빈도와 가변성에 대한 정보를 제공하고, 잠재적으로 개연성을 지닌 아미노산 위치, 특히, scFv의 프레임워크 내의 잠재적으로 개연성을 지닌 아미노산 위치를 예측한다. 상기 정보는 또한 scFv의 특성을 개선시키는 돌연변이화를 디자인하는데에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 용매에 노출된 소수성 잔기를, 다르게는 상기 위치에 빈번하게 존재하는 친수성 잔기로 대체함으로써 항체 가용성을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서, 데이타베이스의 항체 서열 내의 특정 위치에서 "보존"될 수 있는 가능성을 가진 아미노산 잔기 유형은 다수 존재한다. 예를 들어, 하나의 특정 아미노산 잔기가 매우 높은 빈도로 상기 위치에서 발견될 수 있는데, 이는 상기의 특정 아미노산 잔기가 상기의 특정 위치에서 바람직하다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에 있어 단계 c)에서 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 아미노산 잔기는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상기 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산 잔기이다. 다른 실시태양에서, 상기 위치는 특정 유형 또는 부류의 아미노산 잔기로 "보존"될 수 있다 (즉, 상기 위치가 오직 단일의 특정 아미노산 잔기로만 우선적으로 점유된다기 보다는, 각각이 동일 유형 또는 부류의 잔기인 수개의 상이한 아미노산 잔기로 우선적으로 점유되는 것이다). 예를 들어, 단계 c)에서 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치는 (i) 소수성 아미노산 잔기, (ii) 친수성 아미노산 잔기, (iii) 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기 또는 (iv) β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기로 보존될 수 있다.
본 발명의 단계 d)에서, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 아미노산 위치는, 상기 아미노산 위치가 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있을 경우에는 돌 연변이를 위한 아미노산 위치로서 동정되는 것이다. 아미노산 위치가 "보존되지 않는" 아미노산 잔기로 점유되는 것으로서 동정되며, 따라서, 잠재적으로 개연성을 지닌 것으로서 동정될 수 있는 가능성이 있는 상황들은 다수 존재한다. 예를 들어, 데이타베이스 내의 상응하는 아미노산 위치가 소수성 잔기로 보존되고, scFv 중의 상기 위치가 친수성 잔기로 점유될 경우, 이러한 위치는 scFv 중 잠재적으로 개연성을 지닌 위치가 될 수 있으며, 상기 위치는 돌연변이화를 위해 선택될 수 있다. 유사하게, 데이타베이스 내의 상응하는 아미노산 위치가 친수성 잔기로 보존되고, scFv 중의 상기 위치가 소수성 잔기로 점유될 경우, 이러한 위치는 scFv 중 잠재적으로 개연성을 지닌 위치가 될 수 있으며, 상기 위치는 돌연변이화를 위해 선택될 수 있다. 추가의 다른 경우에서, 데이타베이스 내의 상응하는 아미노산 위치가 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기 또는 β 쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기로 보존되고, scFv 중의 상기 위치가 각각 수소 결합을 형성할 수 없는 잔기 또는 β 쉬트를 형성하는 성향을 갖지 않는 잔기로 점유될 경우, 이러한 위치는 scFv 중 잠재적으로 개연성을 지닌 위치가 될 수 있으며, 상기 위치는 돌연변이화를 위해 선택될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명에 기술되어 있는 방법은 단독으로 사용될 수 있거나, 항체 단일 쇄 단편의 안정성 및/또는 가용성을 개선시키는 아미노산 치환에 관한 조합 목록을 생성시키기 위해 조합하여 사용될 수 있다.
공변이 분석
본 발명은 또한 데이타베이스 내의 항체 서열과의 비교로서 scFv의 서열 내 의 공변이를 분석하는 방법에 관한 것이다. 공변하는 잔기는 예를 들어, (i) 프레임워크 영역(FR) 중의 잔기와 CDR 중의 잔기; (ii) 하나의 CDR 중의 잔기와 또다른 CDR 중의 잔기; 또는 (iii) VH 도메인 중의 잔기와 VL 도메인 중의 잔기일 수 있다. 항체의 3차 구조에서 서로서로 상호작용하는 잔기는 공변함으로써 바람직한 아미노산 잔기가 공변이 쌍의 두 위치 모두에서 보존될 수 있으며, 하나의 잔기가 변경된다면, 항체 구조를 유지시키기 위해서는 나머지 하나의 잔기도 역시 변경되어야 한다. 한 세트의 아미노산 서열에 대한 공변이 분석을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Choulier, L. et al. (2000) Protein 41:475-484]에는 인간 및 마우스 생식계열 Vκ 및 VH 서열 정렬에 공변이 분석을 적용시키는 것이 기재되어 있다.
공변이 분석은 상기 기술된, 보존되는 아미노산 위치를 분석하는 방법 (상기 방법에서 단계 a) - d))과 조합될 수 있으며, 이로써 상기 방법은 추가로
e) 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열에 대한 공변이 분석을 수행하여 공변이 쌍의 아미노산 위치를 동정하는 단계;
f) 공변이 쌍의 아미노산 위치를, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교하는 단계;
g) scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치가 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 아미노 산 잔기로 점유되었는지 여부를 측정하는 단계; 및
h) scFv 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두가, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있을 때에 상기 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두를 돌연변이화를 위한 아미노산 위치로서 동정하는 단계를 포함하게 된다.
추가로 또는 별법으로, 공변이 분석은 단독으로 수행될 수 있으며, 이로써 본 발명은
a) 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열에 대한 공변이 분석을 수행하여 공변이 쌍의 아미노산 위치를 동정하는 단계;
b) 공변이 쌍의 아미노산 위치를, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교하는 단계;
c) scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치가 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 아미노산 잔기로 점유되었는지 여부를 측정하는 단계; 및
d) scFv 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두가, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있을 때에 상기 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내 의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두를 돌연변이화를 위한 아미노산 위치로서 동정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 공변이 분석 방법을 사용하여 하나의 공변이 쌍, 또는 1 초과의 공변이 쌍을 분석할 수 있다. 따라서, 본 방법의 하나의 실시태양에서는 다수의 공변이 쌍의 아미노산 위치를 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내에서 동정하고, scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치와 비교한다.
본 발명은 추가로 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있는 scFv 내의 상응하는 위치 중 하나 또는 그 둘 모두를 돌연변이화시키는 단계를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있는 scFv 내의 상응하는 위치 중 하나는 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산 잔기로 치환된다. 또다른 실시태양에서, 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 보존되는 것이 아닌 아미노산 잔기로 점유되어 있는 scFv 내의 상응하는 위치 중 그 둘 모두는 공변이 쌍의 아미노산 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산 잔기로 치환된다.
분자 모델링
서열에 기초하여 잠재적으로 개연성을 지닌 잔기에 대해 scFv를 분석하는 본 발명의 방법은 당업계에 공지된 항체 구조/기능 관계를 분석하는 다른 방법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시태양에서, 서열에 기초한 본 발명의 분석 방법은 추가의 잠재적으로 개연성을 지닌 잔기를 동정하기 위해 분자 모델링과 조합된다. scFv 구조를 비롯한, 항체 구조의 컴퓨터 모델링 방법과 소프트웨어가 당업계에 확립되어 있으며, 이는 서열에 기초한 본 발명의 방법과 조합될 수 있다. 따라서, 또다른 실시태양에서, 단계 a) - d)로 설명되어 있는 바와 같이 상기 기술된 서열에 기초한 방법은
e) scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 분자 모델링하는 단계; 및
f) 돌연변이화를 위해 scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 추가의 아미노산 위치를 동정하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은 분자 모델링에 의해서 돌연변이화를 위한 것으로 동정된 scFv VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 추가의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
"기능적 칸센서스 " 대 "종래 칸센서스 " 분석
특히 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 프레임워크 위치에서의 가변도는 제1의, 항체 서열의 데이타베이스 (예로서, 생식계열 데이타베이스(들)(예로서, Vbase 및/또는 IMGT) 또는 성숙 항체 데이타베이스 (예로서, KBD)와 제2의, 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는 것으로서 선택된 scFv의 데이타베이스, 예로서 효모에서의 QC 스크리닝에 의해 선택된 scFv의 데이타베이스, 즉, QC 데이타베이스 사이에서 비교한다. 도 5에 도시되어 있는 바와 같이, 가변성 값 (예로서, 심슨 지수 값)을 제1 (예로서, 생식계열) 데이타베이스 내의 프레임워크 위치에 할당할 수 있는데, 이는 도 5에서 "G" 값으로 지칭될 수 있고, 가변성 값 (예로서, 심슨 지수 값)을 제2 데이타베이스 (예로서, QC 데이타베이스) 내의 상응하는 프레임워크 위치에 할당할 수 있는데, 이는 도 5에서 "Q" 값으로 지칭될 수 있다. 특정 위치에서 G 값이 Q 값보다 더 클 경우 (즉, 상기 위치의 생식계열 서열에서가 선택된 scFv 서열에서보다 가변성이 더 클 경우), 상기 위치에서 안정적인 scFv 프레임워크 아미노산 잔기의 갯수는 제한되어 있으며, 안정적인 scFv 프레임워크 아미노산 잔기는 임의의 CDR과 함께 사용되는 것이 적합할 수 있다는 것을 시사한다. 별법으로, 특정 위치에서 G 값이 Q 값보다 더 작을 경우 (즉, 상기 위치의 선택된 scFv 서열에서가 생식계열 서열에서보다 가변성이 더 클 경우), 이는 이러한 특정 위치가 scFv에서는 가변성에 대해 더 큰 내성을 갖고 있는 바, 따라서, 이는 scFv의 안정성 및/또는 가용성을 최적화시킬 수 있는 아미노산 치환 위치를 나타낼 수 있다는 것을 시사한다. 표 A는 아미노산 위치의 갯수, 및 고도로 가변적인 프레임워크 잔기(hvFR)를 요약한 표를 나타내며, 상기에서 G는 Q보다 더 크거나, G는 Q보다 더 작다. 표 A에 나타낸 바와 같이, 아미노산의 총 갯수 (Aa #)에서의 가변성과 고도로 가변적인 프레임워크 잔기(hvFR)에서의 가변성은 생식계열과 QC-FW 사이에서 유의적으로 증가하였다. 표 A를 작성하는데 분석된 서열은 QC 분석을 사용하여 선택된 약 90 여개의 scFv 서열 (WO 03097697에 기재되어 있음; 본원에서는 "Q"로 지칭됨) 및 2007년 10월에 http://www.bioc.unizh.ch/antibody/sequence/index.html로부터 검색된 모든 생식계열 VH 및 VL 서열 (본원에서 "G"로 지칭됨)이었다. 표 A (요약표)의 분석을 위해서 VH 및 VL 도메인을 그의 하위유형에 따라 분류하지는 않았다.
Figure 112009080201824-PCT00001
상기를 고려하여 추가의 또다른 측면에서 본 발명은
a) VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열 (예로서, 생식계열 및/또는 성숙 항체 서열)의 제1 데이타베이스를 제공하는 단계;
b) 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열의 제2 데이타베이스를 제공하는 단계;
c) 제1 데이타베이스의 각 프레임워크 위치에서의 아미노산 가변성과, 제2 데이타베이스의 각 프레임워크 위치에서의 아미노산 가변성을 측정하는 단계;
d) 제1 데이타베이스와 제2 데이타베이스 간에 아미노산 가변도가 차이가 나는 하나 이상의 프레임워크 위치를 동정함으로써 단일 쇄 항체(scFv) 중 돌연변이화를 위한 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정하는 단계를 포함하는, VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 항체(scFv) 중 돌연변이화를 위한 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 각 프레임워크 위치에서의 아미노산 가변성은 심슨 지수를 사용하여 보존도를 할당함으로써 측정된다. 하나의 실시태양에서, 제1 데이타베이스와 비교하였을 때 제2 (scFv) 데이타베이스에서 더 낮은 심슨 지수 값을 갖는 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치에 기초하여 돌연변이화를 위한 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정한다. 또다른 실시태양에서, 제1 데이타베이스 (예로서, 생식계열 데이타베이스 또는 성숙 항체 데이타베이스)와 비교하였을 때 제2 (scFv) 데이타베이스에서 더 높은 심슨 지수 값을 갖는 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치에 기초하여 돌연변이화를 위한 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정한다.
3개의 인간 VH 패밀리 및 3개의 인간 VL 패밀리에 관한 가변성 분석, 및 돌연변이화를 위한 잔기의 동정은 하기 실시예 2 및 3에 추가로 상세히 기술되어 있다.
강화/배제 분석
또다른 측면에서, 본 발명은 (예로서, 기능적 특성, 예를 들면 안정성 및/또는 가용성을 개선시키기 위해) 면역결합제 내의 관심의 대상이 되는 프레임워크 위치에서의 바람직한 아미노산 잔기 치환을 선택하는 방법 (또는 별법으로, 특정 아미노산 치환을 배제시키는 방법)을 제공한다. 본 발명의 방법은 제1의, 항체 서열의 데이타베이스 (예로서, 생식계열 데이타베이스(들), 예로서 Vbase 및/또는 IMGT, 또는 더욱 바람직하게, 성숙 항체 데이타베이스, 예를 들면 카바트 데이타베이스(KBD)) 중 관심의 대상이 되는 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기의 빈도와 제2의, 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는 것으로서 선택된 scFv의 데이타베이스, 예로서 효모에서의 QC 스크리닝에 의해 선택된 scFv의 데이타베이스, 예로서 QC 데이타베이스 중 상응하는 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기의 빈도를 비교한다.
주어진 위치에서의 아미노산 잔기를 칸센서스 서열의 아미노산 잔기로 돌연변이화시키는 확립된 방법과는 달리, "기능적 칸센서스" 접근법을 통해서는 놀랍게도 바람직한 기능적 특성이 개선된 항체를 수득하였다는 것이 발견되었다. 이는 선택된 프레임워크 중에서 특정의 가변도를 보이는 것으로서 자연 상태에서 고도로 보존적인 위치는 무작위 돌연변이 유발법에 대한 내성을 띠어야 하며, scFv 포맷 중 천연 잔기보다 우수한 대체 아미노산이 발견될 수 있는 가능성이 증가한 것으로 나타나야 한다는 사실에 기인하는 것일 수 있다. 또한, 드문 아미노산을 현저히 선호하는 것이 특정 잔기에 대한 자연 선택을 지시하는 것이다. 이러한 2개의 통계학적 가이드라인에 기초하여 중쇄 및 경쇄 내의 상이한 잔기를 유동적 위치 (가변성에 대하여 내성을 띠는 위치) 또는 바람직한 치환 (독특한 잔기)로서 선택할 수 있다.
특정 아미노산 잔기의 상대 빈도가 제1 데이타베이스, 즉, 생식계열 데이타베이스(들) 및/또는 성숙 항체 데이타베이스에 비해, 바람직한 기능적 특성을 갖는 서열을 포함하는 제2 데이타베이스에서 증가된 경우, 각 잔기는 scFv의 안정성 및/또는 가용성을 개선시키는데 있어 주어진 위치에서 바람직한 잔기인 것으로서 간주된다. 역으로, 특정 아미노산 잔기의 상대 빈도가 제1 데이타베이스와 비교하여 제2 데이타베이스에서 감소된 경우, 각 잔기는 scFv 포맷과 관련하여 상기 위치에서 바람직하지 못한 것으로서 간주된다.
하기 실시예 4에서 상세히 기술되는 바와 같이, 제1 데이타베이스 (예로서, 성숙 항체 서열의 데이타베이스)로부터의 항체 서열 (예로서, VH 또는 VL 서열)을 그의 카바트 패밀리 하위유형 (예로서, Vh1b, VH3 등)에 따라 분류할 수 있다. 각 서열 하위유형 (즉, 하위패밀리) 내의 각 아미노산 위치에 있는 각 아미노산 잔기 (예로서, A, V 등)의 빈도는 상기 하위유형 중 모든 분석된 서열의 백분율로서 측정된다. 제2 데이타베이스 (하나 이상의 바람직한 특성을 갖는 것으로서 선택된 scFv의 데이타베이스, 예로서 QC 스크리닝에 의해 선택된 scFv의 데이타베이스)의 모든 서열에 대해서도 상기와 동일하게 수행한다. 각 하위유형에서 특정 위치에 존재하는 각 아미노산 잔기에 대해 생성된 백분율 (상대 빈도)을 제1 데이타베이스와 제2 데이타베이스 간에 비교를 한다. 특정 아미노산 잔기의 상대 빈도가 제1 데이타베이스 (예로서, 카바트 데이타베이스)에 비해 제2 데이타베이스 (예로서, QC 데이타베이스)에서 증가된 경우, 이는 각 잔기가 바람직하게 선택되어 (즉, "강화된 잔기") 상기 서열에 바람직한 특성을 부여하였다는 것을 시사한다. 역으로, 아미노산 잔기의 상대 빈도가 제1 데이타베이스에 비해 제2 데이타베이스에서 감소된 경우, 이는 각 잔기가 바람직하지 못한 것 (즉, "배제된 잔기")으로 간주된다는 것을 시사한다. 따라서, 면역결합제의 기능적 특성 (예로서, 안정성 및/또는 가용성)을 개선시키는데는 강화된 잔기가 바람직한 잔기인 반면, 배제된 잔기는 바람직하게 기피되고 있다.
상기를 고려하여 하나의 실시태양에서, 본 발명은
a) 분류된 VH 또는 VL 아미노산 서열 (예로서, 카바트 패밀리 하위유형에 따라 분류된 생식계열 및/또는 성숙 항체 서열)의 제1 데이타베이스를 제공하는 단계;
b) (예로서, QC 분석에 따라) 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된, 분류된 scFv 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열의 제2 데이타베이스를 제공하는 단계;
c) 제1 데이타베이스의 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도 및 제2 데이타베이스의 상응하는 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도를 측정하는 단계;
d) 아미노산 잔기가 제1 데이타베이스에 비해 제2 데이타베이스에서 더 높은 빈도로 존재하는 경우 (즉, 강화된 잔기), 상기 아미노산 잔기를 면역결합제의 상응하는 아미노산 위치에서의 치환에 바람직한 아미노산 잔기로서 동정하는 단계를 포함하는, 면역결합제에서 치환시키는데 바람직한 아미노산 잔기를 동정하는 방법을 제공한다.
제2 (scFv) 데이타베이스 (예로서, QC 데이타베이스)에서 아미노산 잔기의 강화를 정량할 수 있다. 예를 들어, 제2 데이타베이스 내의 잔기의 상대 빈도(RF2)와 제1 데이타베이스 내의 잔기의 상대 빈도(RF1) 사이의 비를 측정할 수 있다. 이러한 비 (RF2:RF1)를 "강화 인자"(EF)라고 명명할 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 제1 데이타베이스와 제2 데이타베이스 간의 아미노산 잔기의 상대 빈도의 비 (본원에서 "강화 인자")가 적어도 1 (예로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)이라면, 단계 (d)에서 아미노산 잔기가 동정된다. 바람직한 실시태양에서, 강화 인자는 약 1.0 이상이다 (예로서 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 또는 1.5). 추가의 또다른 바람직한 실시태양에서, 강화 인자는 약 4.0 내지 약 6.0 (예로서, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0)이다. 또다른 실시태양에서, 강화 인자는 약 6.0 내지 약 8.0 (예로서, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0)이다. 다른 실시태양에서, 강화 인자는 10 이상이다 (예로서, 10, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109 이상). 특정 실시태양에서, 무한대 값의 강화 인자를 얻을 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은
a) 분류된 VH 또는 VL 아미노산 서열 (예로서, 카바트 패밀리 하위유형에 따라 분류된 생식계열 및/또는 성숙 항체 서열)의 제1 데이타베이스를 제공하는 단계;
b) (예로서, QC 분석에 따라) 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된, 분류된 scFv 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열의 제2 데이타베이스를 제공하는 단계;
c) 제1 데이타베이스의 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도 및 제2 데이타베이스의 상응하는 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도를 측정하는 단계;
d) 아미노산 잔기가 제1 데이타베이스에 비해 제2 데이타베이스에서 더 낮은 빈도로 존재하는 경우에 아미노산 잔기를 면역결합제의 상응하는 아미노산 위치에서의 치환에 바람직하지 못한 아미노산 잔기로서 동정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 아미노산 잔기 유형은 바람직하지 못한 아미노산 잔기 (즉, 배제된 잔기)인 것인, 면역결합제로부터의 특정 위치에서 배제되는 아미노산 잔기를 동정하는 방법을 제공한다.
특정의 바람직한 실시태양에서, 강화 인자(EF)가 1 미만이라면 상기 단계 (d)에서 바람직하지 못한 아미노산 잔기가 동정된다.
추가로, 본 발명은
a) 돌연변이화를 위해 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정하는 단계;
b) 단계 a)에서 동정된 각각의 특정 프레임워크 아미노산 위치에 대해, 치환에 바람직한 아미노산 잔기를 동정하는 단계; 및
c) 각각의 특정 프레임워크 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기를, 단계 b)에서 동정된 바람직한 아미노산 잔기로 돌연변이화시키는 단계를 포함하는, VH 및/또는 VL 아미노산 잔기를 갖는 면역결합제를 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게, 단계 a)는 본원에 개시된 방법에 따라 주어진 프레임워크 위치에서의 가변도를 측정하여, 즉, 심슨 지수를 사용하여 각 프레임워크 위치에 가변도를 할당함으로써 실시한다. 치환에 적합한 아미노산은 바람직하게는 적어도 1, 더욱 바람직하게는 적어도 4 내지 6의 강화 인자를 갖는, 상기 개시된 방법에 따라 동정된다. 이어서, 면역결합제의 상응하는 아미노산 잔기를 당업계에 공지된 분자 생물학 방법을 사용하여 바람직한 아미노산 잔기로 돌연변이화시킨다. 면역결합제는 바람직하게 scFv 항체, 전장의 면역글로불린, Fab 단편, Dab 또는 나노바디이다.
scFv 의 돌연변이화
본 발명의 방법에서, 일단 scFv 내의 하나 이상의 아미노산 위치가 scFv의 기능적 특성과 관련하여 잠재적으로 개연성을 지닌 것으로서 동정되었으면, 본 방법은 추가로 scFv VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 이들 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 보존되거나 강화된 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 당업계에 잘 확립되어 있는 수개의 가능한 돌연변이 유발 방법들 중 하나를 사용하여 돌연변이화될 수 있다. 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 관심의 대상이 되는 아미노산 위치에서 특정 아미노산을 치환시킬 수 있다. 또한, 부위 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 관심의 대상이 되는 아미노산 위치에서 제한된 레파토리의 아미노산 치환이 도입된 한 세트의 돌연변이화된 scFv를 생성할 수 있다.
추가로 또는 별법으로, 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치(들)는 무작위 또는 편향된 돌연변이 유발법에 의해 돌연변이화되어 돌연변이화된 scFv의 라이브러리를 생성할 수 있고, 이어서, 돌연변이화된 scFv의 라이브러리는 스크리닝되고, scFv의 선택, 바람직하게는, 적어도 하나의 개선된 기능적 특성을 갖는 scFv의 선택이 이루어질 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 환원 환경하에서 안정성 및/또는 가용성이 증진된 scFv 프레임워크를 선택할 수 있도록 하는 효모 품질 관리-시스템 (QC-시스템) (상기에 추가로 상세히 기술되어 있는)을 사용하여 라이브러리를 스크리닝한다.
scFv 라이브러리를 스크리닝하는 다른 적합한 선택 기술은 당업계에 기술되어 있는데, 이는 디스플레이 기술, 예를 들면 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 효모 디스플레이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (문헌 ([Jung et al. (1999) J. Mol . Biol . 294: 163-180]; [Wu et al. (1999) J. Mol . Biol . 294: 151-162]; [Schier et al. (1996) J. Mol . Biol . 255: 28-43])).
하나의 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 유의적으로 강화된 아미노산 잔기로 치환된다. 또다른 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치는 소수성 아미노산 잔기로 보존되고, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 유의적으로 강화된 소수성 아미노산 잔기로 치환된다. 추가의 또다른 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치는 친수성 아미노산 잔기로 보존되고, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 유의적으로 강화된 친수성 아미노산 잔기로 치환된다. 추가의 또다른 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치는 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기로 보존되고, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 유의적으로 강화된, 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기로 치환된다. 추가의 또다른 실시태양에서, 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치는 β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기로 보존되고, scFv 내의 돌연변이화를 위해 동정된 아미노산 위치는 데이타베이스의 항체 VH 또는 VL 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 가장 유의적으로 강화된, β-쉬트를 형성하는 성향을 갖는 아미노산 잔기로 치환된다.
하나의 실시태양에서, 전체 자유 에너지를 최소화시키는 최적의 치환이, 관심의 대상이 되는 아미노산 위치(들)에서 이루고자 하는 돌연변이로서 선택된다. 전체 자유 에너지를 최소화시키는 최적의 치환은 볼츠만 법칙(Boltzmann's Law)을 사용하여 결정될 수 있다. 볼츠만 법칙의 식은 ΔΔGth = RTln(f모체/f칸센서스)이다.
잠재적인 안정화 돌연변이의 역할은 예를 들어, 국소 및 비-국소 상호작용, 정규 잔기, 경계면, 노출 정도 및 β-회전 성향을 조사함으로써 추가로 결정될 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 안정화 돌연변이의 역할을 추가로 조사하는데 당업계에 공지된 분자 모델링 방법을 적용시킬 수 있다. 분자 모델링 방법은 또한 가능한 치환으로 이루어진 패널이 고려 중에 있다면 "최적합" 아미노산 치환을 선택하는데 사용될 수 있다.
특정 아미노산 위치에 따라 추가로 분석하는 것이 확실할 수 있다. 예를 들어, 잔기는 중쇄와 경쇄 간의 상호작용에 관여할 수 있거나, 염 브릿지 또는 H 결합을 통해 다른 잔기와 상호작용할 수 있다. 이러한 경우, 특별한 분석이 필요할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 안정성에 대한 잠재적으로 개연성을 지닌 잔기는 공변이 쌍에서 그의 대응물과 화합성인 잔기로 교체될 수 있다. 별법으로, 대응물 잔기는 개연성을 지닌 것으로서 초기에 동정된 아미노산과 화합성을 갖도록 돌연변이화될 수 있다.
가용성 최적화
scFv 항체에서 가용성에 대해 잠재적으로 개연성을 지닌 잔기로는 scFv 중 용매에 노출되는 소수성 아미노산이지만, 이는 전장의 항체에 관해서는 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 경계면에 포매되어 있을 것이다. 불변 도메인이 없는 공학처리된 scFv에서는 가변 도메인과 불변 도메인 간의 상호작용에 관여하는 소수성 잔기가 용매에 노출되게 된다 (예로서, 문헌 [Nieba et al (1997) Protein Eng . 10: 435-44] 참조). scFv 표면 상의 이들 잔기는 응집을 일으켜 가용성에 관한 문제를 일으키는 경향이 있다.
scFv 항체 상의 용매에 노출되는 소수성 아미노산을 대체시키는 다수의 전략법이 기술되어 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 특정 위치에 있는 잔기를 변형시키는 것이 안정성, 가용성, 및 친화성과 같은 항체의 생체물리학적 특성에 영향을 준다. 다수의 경우에서 이러한 특성은 서로 밀접한 관련이 있는데, 이는 하나의 단일 아미노산을 교체하는 것이 수개의 상기 언급한 특성에 영향을 줄 수 있다는 것을 의미한다. 그러므로, 용매에 노출된 소수성 잔기를 비-보존적인 방식으로 돌연변이화시키는 것이 안정성을 감소시키고/거나, 그의 항원에 대한 친화성을 상실시킬 수 있다.
다른 접근법에서는 단백질 디스플레이 기술의 철저한 사용 및/또는 스크리닝한 노력의 성과로 가용성에 관한 문제를 해소시키고자 한다. 그러나, 그러한 방법은 시간이 많이 소요되고, 종종은 가용성 단백질을 수득하는데 있어 실패하거나, 항체의 안정성을 저하시키거나 친화성을 감소시킬 수 있다. 본 발명에서는 서열에 기초한 분석을 사용하여 용매에 노출된 소수성 잔기를 친수성이 더 높은 잔기로 돌연변이화시키는 돌연변이 디자인 방법이 개시되어 있다. 잠재적으로 개연성을 지닌 잔기는 정의된 위치에서 가장 빈번하게 나타나는 친수성 아미노산을 선택함으로서 대체될 수 있다. 잔기가 항체 중 임의의 다른 잔기와 상호작용하는 것으로 밝혀질 경우, 잠재적으로 개연성을 지닌 잔기는 가장 빈번하게 존재하는 잔기가 아닌, 공변이 쌍의 제2 아미노산과 화합성인 잔기로 돌연변이화될 수 있다. 별법으로, 공변이 쌍의 제2 아미노산은 또한 아미노산의 조합을 복원시키기 위해서 돌연변이화될 수 있다. 추가로, 서로 밀접한 관련이 있는 2개의 아미노산의 최적의 조합을 찾는데 도움이 될 수 있도록 하는데는 서열 간의 유사성(%)이 고려시 될 수 있다.
scFv의 표면 상에 있는 소수성 아미노산은, 용매 노출, 실험상의 정보 및 서열 정보에 기초한 접근법을 포함하나, 이에 한정되지 않은 수개의 접근법 뿐만 아니라, 분자 모델링을 사용하여 동정된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, scFv 항체의 표면 상에 노출된 소수성 잔기를 데이타베이스 중의 이러한 위치에 가장 빈번하게 존재하는 친수성 잔기로 교체함으로써 가용성이 개선된다. 이러한 이론적 원리는 빈번하게 존재하는 잔기는 문제될 가능성이 없다는 사실에 기초한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 보존적 치환은 보통 분자를 탈안정화시키는데에 작은 영향을 미치는 반면, 비-보존적 치환은 scFv의 기능적 특성에 유해할 수 있다.
종종, 항체의 표면 상에 존재하는 소수성 잔기는 중쇄와 경쇄 간의 상호작용에 관여할 수 있거나, 염 브릿지 또는 H 결합을 통해 다른 잔기와 상호작용할 수 있다. 이러한 경우, 특별한 분석이 필요할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 가용성에 대한 잠재적으로 개연성을 지닌 잔기는 가장 빈번하게 존재하는 잔기가 아닌, 공변이 쌍과 화합성인 잔기로 돌연변이화될 수 있으며, 공변이 아미노산의 조합을 복원시키기 위해 제2 돌연변이화가 수행될 수 있다.
추가의 방법을 사용하여 용매에 노출된 소수성 위치에서의 돌연변이화를 디자인할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, (상기에 추가로 논의된 바 있는) 변형시키고자 scFv에 대해 가장 높은 유사성을 나타내는 서열로 데이타베이스를 한정시키는 것을 사용하는 방법을 개시한다. 그러한 한정된 참조 데이타베이스를 적용시킴으로써 최적화시키고자 하는 항체의 특정 서열과 관련하여 최적합화되도록 돌연변이를 디자인한다. 이러한 상황하에서 선택된 친수성 잔기는 실제로는 다수의 서열 (즉, 비한정 데이타베이스)과 비교하였을 때 그의 각 위치에서 불충분하게 존재할 수 있다.
안정성 최적화
단일-쇄 항체 단편은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 공유 결합시키는 펩티드 링커를 함유한다. 그러한 링커는 가변 도메인이 산산히 흩어지지 못하게 하여 scFv가 Fv 단편보다 우수한 성질을 띠도록 하는데 효과적이지만, scFv 단편은 여전히, Fab 단편 또는 전장의 항체, 둘 모두에서 VH 및 VL이 오직 불변 도메인을 통해 간접적으로 연결되어 있는 Fab 단편 또는 전장의 항체와 비교할 때 언폴딩되고 응집되기가 더 쉽다.
scFv에 있어 또다른 공통된 문제점은 scFv 표면 상에 존재하는 소수성 잔기가 노출되어 있다는 점인데, 이로 인해 분자 간의 응집이 일어난다. 추가로, 때때로 친화성 성숙 과정시에 획득한 체세포 돌연변이는 β-쉬트 중심부에 친수성 잔기를 배치한다. 그러한 돌연변이는 IgG 포맷 또는 심지어는 Fab 단편에서는 우수한 내성을 띨 수 있지만, scFv에서 상기 돌연변이는 분명 탈안정화와, 이어서는 언폴딩의 원인이 된다.
scFv 탈안정화의 원인이 되는 것으로 알려진 인자로는 scFv 항체의 표면 상에 존재하는 용매에 노출된 소수성 잔기; 단백질의 중심부에 포매된 독특한 친수성 잔기 뿐만 아니라, 중쇄와 경쇄 사이의 소수성 경계면에 존재하는 친수성 잔기를 포함한다. 추가로, 상기 중심부의 비극성 잔기 간의 반데르발스 패킹 상호작용이 단백질 안정성에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (문헌 ([Monsellier E. and Bedouelle H. (2006) J. Mol . Biol. 362:580-93], [Tan et al. (1998) Biophys. J. 75:1473-82]; [Worn A. and Pluckthun A. (1998) Biochemistry 37:13120-7])).
따라서, 하나의 실시태양에서, scFv 항체의 안정성을 증가시키기 위해서 매우 보존적인 위치에 존재하는 독특하고/거나 바람직하지 못한 아미노산을 동정하고, 이들 보존적인 위치에서 더 보편적인 아미노산으로 돌연변이화시킨다. 그러한 독특하고/거나 바람직하지 못한 아미노산으로는 (i) scFv 항체의 표면 상에 존재하는 용매에 노출된 소수성 잔기; (ii) 단백질의 중심부에 포매된 독특한 친수성 잔기; (iii) 중쇄와 경쇄 사이의 소수성 경계면에 존재하는 친수성 잔기; 및 (iv) 입체 장애에 의해 VH/VL 경계면 VH/VL를 방해하는 잔기를 포함한다.
따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 그의 위치에서 불충분하게 존재하는 아미노산을 이들 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산으로 치환시킴으로써 안정성을 증가시킬 수 있다. 일반적으로 출현 빈도는 생물학적으로 수용됨을 지시한다.
잔기는 중쇄와 경쇄 간의 상호작용에 관여할 수 있거나, 염 브릿지, H 결합 또는 디설피드 결합을 통해 다른 잔기와 상호작용할 수 있다. 이러한 경우, 특별한 분석이 필요할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 안정성에 대한 잠재적으로 개연성을 지닌 잔기는 공변이 쌍에서 그의 대응물과 화합성인 잔기로 교체될 수 있다. 별법으로, 대응물 잔기는 개연성을 지닌 것으로서 초기에 동정된 아미노산과 화합성을 갖도록 돌연변이화될 수 있다.
추가의 방법을 사용하여 안정성을 개선시키는 돌연변이화를 디자인할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, (상기에 추가로 논의된 바 있는) 변형시키고자 하는 scFv에 대해 가장 높은 유사성을 나타내는 서열로 데이타베이스를 한정시키는 것을 사용하는 방법을 개시한다. 그러한 한정된 참조 데이타베이스를 적용시킴으로써 최적화시키고자 하는 항체의 특정 서열과 관련하여 최적합화되도록 돌연변이를 디자인한다. 상기 돌연변이는 데이타베이스 서열의 선택된 하위세트 중 가장 빈번하게 존재하는 아미노산을 사용한다. 이러한 상황하에서 선택된 잔기는 실제로는 다수의 서열 (즉, 비한정 데이타베이스)과 비교하였을 때 그의 각 위치에서 불충분하게 존재할 수 있다.
ScFv 조성물 및 제제
본 발명의 또다른 측면은 본 발명에 따라 제조된 scFv 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은, 관심의 대상이 되는 원래의 scFv와 비교하여 하나 이상의 돌연변이가 아미노산 서열 내로 도입되어 있으며, 여기서, 상기 돌연변이(들)는 하나 이상의 생물학적 특성, 예를 들면 안정성 또는 가용성에 영향을 미치는 것으로 예측되는 위치(들), 특히, 하나 이상의 프레임워크 위치 내로 도입된 것인, 공학처리된 scFv 조성물에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, scFv는 하나의 돌연변이화된 아미노산 위치 (예로서, 하나의 프레임워크 위치)를 포함하도록 공학처리된 것이다. 다른 실시태양에서, scFv는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 돌연변이화된 아미노산 위치 (예로서, 프레임워크 위치)를 포함하도록 공학처리된 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 scFv 조성물의 제약 제제에 관한 것이다. 그러한 제제는 전형적으로 scFv 조성물 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "제약상 허용되는 담체"로는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 및 생리학적으로 화합성을 띠는 것 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는 (예로서, 주사 또는 주입에 의한) 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수, 표피 투여용으로, 또는 (예로서, 눈 또는 피부로의) 국소용으로 적합하다. scFv는 투여 경로에 따라 scFv를 불활성화시킬 수 있는 산성 및 다른 중성 조건의 작용으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"이란 모체 화합물의 바람직한 생물학적 활성은 보유하며, 바람직하지 못한 어떤 독성 효과도 보유하지 않는 염을 지칭한다 (예로서, 문헌 [Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm . Sci. 66:1-19] 참조). 그러한 염의 예로는 산성 부가염 및 염기성 부가염을 포함한다. 산성 부가염으로는 비독성 무기산, 예를 들면 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 비독성 유기산, 예를 들면 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알카노산, 하이드록시 알카노산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유도된 것들을 포함한다. 염기성 부가염으로는 알칼리토 금속, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 비독성 유기 아민, 예를 들면 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유도된 것들을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들면 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨 및 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들면 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들면 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을포함한다.
본 발명의 제약 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 혼합물, 식물성 오일, 예를 들면 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레이트를 포함한다. 예를 들면, 렉시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우에는 입자의 크기를 유지시키거나, 그리고, 계면활성제를 사용함으로써 유동성을 적절하게 유지시킬 수 있다.
이들 조성물은 또한 애주번트, 예를 들면 방부제, 습윤제, 유화제, 및 분산제를 함유할 수 있다. 상기 멸균 방법, 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등을 포함시키는 방법, 둘 모두에 의해 미생물이 존재하는 것을 방지할 수 있다. 등장화제, 예를 들면 당 및 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 주사용 약제 제형의 흡수를 지연시킬 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 제약상 활성인 물질을 위한 상기와 같은 매질 및 제제의 용도는 당업계에 알려져 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비화합성이라는 것에 한한다는 것을 제외하면, 본 발명의 제약 조성물에 있어서의 그의 용도가 주시된다. 보충적인 활성 화합물 또한 조성물내 혼입될 수 있다.
치료학적 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건하에서는 멸균성을 띠며 안정적이어야 한다. 조성물은 액제, 미세에멀젼, 리포좀, 또는 고농도의 약물에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 예를 들면, 렉시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우에는 입자의 크기를 유지시키거나, 그리고, 계면활성제를 사용함으로써 유동성을 적절하게 유지시킬 수 있다. 다수의 경우에는 등장화제, 예를 들면 당, 폴리알코올, 예를 들면 만닛톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 주사용 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
적절한 용매 중 필요량의 활성 화합물을, 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 그의 조합물과 혼합한 후, 필요에 따라, 멸균 미세여과하여 멸균 주사액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 기본 분산액 매질과, 상기 열거한 성분들로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클로 활성 화합물을 혼입시켜 분산액을 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 앞서 멸균 여과된 그의 용액으로부터 활성 성분 분말과 함께 임의의 추가적인 바람직한 성분을 수득할 수 있는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)가 바람직한 제조 방법이다.
단일 투여 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받을 피험체, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료학적 효과를 가져올 수 있는 조성물의 양일 수 있다. 일반적으로, 제약상 허용되는 담체와 조합된 활성 성분의 양의 범위는 100% 중 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게, 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게, 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분이 될 것이다.
투여 요법을 조정하여 최적의 바람직한 반응 (예로서, 치료학적 반응)을 제공한다. 예를 들어, 치료 상황하의 요건에 따라 지시되는 바와 같이, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 시간 경과에 따라 수개의 분할 투여량을 투여할 수 있거나, 또는 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 일정하게 하기 위해 비경구용 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료받을 피험체를 위한 단위 용량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 바람직한 치료학적 효과를 나타내도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부 사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료학적 효과, 및 (b) 개체에서의 감응성 치료를 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 기술에 있어서 당업계에서의 고유한 제한에 의해 지시되며, 이들에 직접적으로 의존한다.
"기능적 칸센서스 " 접근법에 기초한 면역결합제 공학처리
실시예 2 및 3에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 개선된 특성에 대해 선택된 scFv 서열의 데이타베이스를 사용하여 프레임워크 위치의 가변성을 분석하는 것인 본원에 기술된 "기능적 칸센서스" 접근법을 통해 생식계열 데이타베이스 중 동일 위치에서의 가변성과 비교하여 가변성에 대해 대해 더 크거나 더 작은 내성을 띠는 아미노산 위치를 동정할 수 있다. 실시예 5 및 6에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 샘플 scFv 내의 특정 아미노산 위치를 생식계열 칸센서스 잔기로 역돌연변이화시키는 것은 중립적 효과 또는 유해한 효과를 갖는 반면, "기능적 칸센서스" 잔기를 포함하는 scFv 변이체는 야생형 scFv 분자와 비교하여 증가된 열적 안정성을 나타낸다. 따라서, 본원에서 기능적 칸센서스 접근법을 통해 동정된 프레임워크 위치는 scFv의 기능적 특성을 변경, 및 바람직하게는 개선시키기 위해 scFv를 변형시키는데 있어서의 바람직한 위치가 된다.
실시예 3에서 표 3-8에 기술되어 있는 바와 같이, 하기 프레임워크 위치가 지시된 VH 또는 VL 서열 중 변형시키는데 있어서의 바람직한 위치로서 동정되었다 (하기 사용된 번호화는 AHo 번호화 체계에 의해 이루어진 것이다; AHo 번호화를 카바트 시스템 번호화로 변환시키는 변환표는 실시예 1의 표 1 및 2에 기재되어 있다):
VH3: 아미노산 위치 1, 6, 7, 89 및 103;
VH1a: 아미노산 위치 1, 6, 12, 13, 14, 19, 21, 90, 92, 95 및 98;
VH1b: 아미노산 위치 1, 10, 12, 13, 14, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87 및 107;
Vκ1: 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 47, 50, 57, 91 및 103;
Vκ3: 2, 3, 10, 12, 18, 20, 56, 74, 94, 101 및 103; 및
Vλ1: 1, 2, 4, 7, 11, 14, 46, 53, 82, 92 및 103.
따라서, 면역결합제, 예를 들면 scFv 분자를 공학처리함으로써 면역결합제의 변이체 (즉, 돌연변이화된) 형태를 생산하는데 이들 아미노산 위치들 중 하나 이상이 선택될 수 있다. 바람직하게, 공학처리를 통해 항원 결합 친화성에는 영향을 주지 않으면서, 하나 이상의 개선된 기능적 특성을 갖는 면역결합제를 수득하게 된다. 바람직한 실시태양에서, 생성된 면역결합제는 개선된 안정성 및/또는 가용성 특징을 갖는다.
따라서, 추가의 또다른 측면에서 본 발명은
a) 돌연변이화를 위한 면역결합제 내의 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계;
b) 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계
를 포함하며, 여기서 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는
(i) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH3의 아미노산 위치 1, 6, 7, 89 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 7, 78 및 89)
(ii) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1a의 아미노산 위치 1, 6, 12, 13, 14, 19, 21, 90, 92, 95 및 98 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 11, 12, 13, 18, 20, 79, 81, 82b 및 84);
(iii) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1b의 아미노산 위치 1, 10, 12, 13, 14, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87 및 107 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 9, 11, 12, 13, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76 및 93);
(iv) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ1의 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 47, 50, 57, 91 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 39, 42, 49, 73 및 85);
(v) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ3의 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 56, 74, 94, 101 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 48, 58, 76, 83 및 85); 및
(vi) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vλ1의 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 46, 53, 82, 92 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 38, 45, 66, 74 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, (i) VH 프레임워크 잔기를 포함하는, VH3, VH1a 또는 VH1b 도메인 유형의 중쇄 가변 영역, 또는 그의 단편, 및/또는 (ii) VL 프레임워크 잔기를 포함하는, Vκ1, Vκ3 또는 Vλ1 도메인 유형의 경쇄 가변 영역, 또는 그의 단편을 포함하는 면역결합제를 공학처리하는 방법, 특히, 면역결합제의 하나 이상의 기능적 특성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, scFv의 하나 이상의 기능적 특성이 항원 결합 친화성의 개선을 포함하지 않는 것을 조건으로 하여, 본 방법은 면역결합제의 하나 이상의 기능적 특성을 개선시킨다.
바람직한 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, VH3의 아미노산 위치 1, 6, 7, 89 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 7, 78 및 89)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1a의 아미노산 위치 1, 6, 12, 13, 14, 19, 21, 90, 92, 95 및 98 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 11, 12, 13, 18, 20, 79, 81, 82b 및 84)로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1b의 아미노산 위치 1, 10, 12, 13, 14, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87 및 107 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 9, 11, 12, 13, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76 및 93)로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ1의 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 47, 50, 57, 91 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 39, 42, 49, 73 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ3의 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 56, 74, 94, 101 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 48, 58, 76, 83 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, Vλ1의 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 46, 53, 82, 92 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 38, 45, 66, 74 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 실시태양에서, 상기 기술된 아미노산 위치들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과가 돌연변이화를 위해 선택된다.
추가의 또다른 측면에서, 본 발명은
a) 돌연변이화를 위해 면역결합제 내의 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계; 및
b) 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계
를 포함하며, 여기서 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는
(i) AHo 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 89 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 78 및 89)
(ii) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1a의 아미노산 위치 1, 12, 13, 14, 19, 21, 90, 92, 95 및 98 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 11, 12, 13, 18, 20, 79, 81, 82b 및 84);
(iii) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1b의 아미노산 위치 1, 10, 12, 13, 14, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87 및 107 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 9, 11, 12, 13, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76 및 93);
(iv) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ1의 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 47, 50, 57 및 91 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 39, 42, 49 및 73);
(v) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ3의 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 56, 74, 94 및 101 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 48, 58, 76 및 83); 및
(vi) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vλ1의 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 46, 53, 82 및 92 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 38, 45, 66 및 74)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, (i) VH 프레임워크 잔기를 포함하는, VH3, VH1a 또는 VH1b 도메인 유형의 중쇄 가변 영역, 또는 그의 단편, 및/또는 (ii) VL 프레임워크 잔기를 포함하는, Vκ1, Vκ3 또는 Vλ1 도메인 유형의 경쇄 가변 영역, 또는 그의 단편을 포함하는 면역결합제의 안정성 및/또는 가용성 특성을 개선시키는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은
a) 돌연변이화를 위해 면역결합제 내의 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계; 및
b) 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계
를 포함하며, 여기서 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치는
(i) AHo 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1 및 89)
(ii) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1a의 아미노산 위치 1, 12, 13, 14, 19, 21, 90, 95 및 98 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 11, 12, 13, 18, 20, 79, 82b 및 84);
(iii) AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1b의 아미노산 위치 1, 10, 12, 13, 14, 20, 21, 45, 47, 50, 55 및 77 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 9, 11, 12, 13, 19, 20, 38, 40, 43, 48 및 66);
(iv) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ1의 아미노산 위치 1 및 3 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1 및 3);
(v) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ3의 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 94 및 101 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 76 및 83); 및
(vi) AHo 번호화를 사용하였을 때, Vλ1의 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 82 및 92 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 66 및 74)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, (i) VH 프레임워크 잔기를 포함하는, VH3, VH1a 또는 VH1b 도메인 유형의 중쇄 가변 영역, 또는 그의 단편, 및/또는 (ii) VL 프레임워크 잔기를 포함하는, Vκ1, Vκ3 또는 Vλ1 도메인 유형의 경쇄 가변 영역, 또는 그의 단편을 포함하는 면역결합제의 항원 결합 친화성에는 영향을 주지 않으면서, 면역결합제의 안정성 및/또는 가용성 특성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게, 면역결합제는 scFv이지만, 다른 면역결합제, 예를 들면 전장의 면역글로불린, Fab 단편, Dab, 나노바디 또는 본원에 기술된 임의의 다른 유형의 면역결합제 또한 본 발명에 따라 공학처리될 수 있다. 본 발명은 또한 공학처리 방법에 따라 제조된 면역결합제 뿐만 아니라, 면역결합제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
특정 일례의 실시태양에서, 본 발명에 따라 공학처리된 면역결합제는 당업계에서 인정받은, 치료학적으로 중요한 것으로서 표적 항원에 결합하는 면역결합제, 또는 치료학적으로 중요한 면역결합제로부터 유래된 가변 영역 (VL 및/또는 VL 영역) 또는 하나 이상의 CDR (예로서, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, 및/또는 CDRH3)을 포함하는 면역결합제이다. 예를 들어, FDA 또는 다른 규제 당국으로부터 승인받은 현 면역결합제도 본 발명의 방법에 따라 공학처리될 수 있다. 더욱 특히, 이러한 일례의 면역결합제로는 항-CD3 항체, 예를 들면 뮤로모납(muromonab) 오르토클론(Orthoclone)® OKT3 (뉴저지주 브런즈윅 소재의 존슨 앤드 존슨(Johnson&Johnson); 문헌 ([Arakawa et al. J. Biochem, (1996) 120:657-662]; [Kung and Goldstein et al., Science (1979), 206: 347-349]) 참조), 항-CD11 항체, 예를 들면 에팔리주마브(efalizumab) (랍티바(Raptiva)® (캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재의 제넨테크(Genentech))), 항-CD20 항체, 예를 들면 리툭시마브 (리툭산(Rituxan)®/마브테라(Mabthera)® (캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재의 제넨테크)), 토시투모마브 (벡사르(Bexxar)®, 런던 소재의 글락소 스미스클라인(GlaxoSmithKline)) 또는 이브리투모마브 (제바린(Zevalin)® (매사추세츠주 캠브리지 소재의 바이오겐 아이디(Biogen Idee))) (미국 특허 번호 제5,736,137호; 제6,455,043호; 및 제6,682,734호 참조), 항-CD25 (IL2Rα) 항체, 예를 들면 다클리주마브 (제나팍스(Zenapax)® (스위스 바젤 소재의 로슈(Roche))) 또는 바실릭시마브 (시뮬렉트(Simulect)® (스위스 바젤 소재의 노바티스(Novartis))), 항-CD33 항체, 예를 들면 겜투주마브 (마이로타그(Mylotarg)® (뉴저지주 매디슨 소재의 와이어스(Wyeth) - 미국 특허 번호 제5,714,350호 및 제6,350,861호 참조), 항-CD52 항체, 예를 들면 알렘투주마브 (캠패스(Campath)®, 매사추세츠주 캠브리지 소재의 밀레니엄 파마슈티칼즈(Millennium Pharmaceuticals)), 항-GpIIb/gIIa 항체, 예를 들면 압시씨마브 (리오프로(ReoPro)®, 펜실베니아주 호샴 소재의 센토코(Centocor)), 항-TNFα 항체, 예를 들면 인플릭시마브 (레미케이드(Remicade)®, 펜실베니아주 호샴 소재의 센토코) 또는 아달리무마브 (휴미라(Humira)®, 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트(Abbott) - 미국 특허 번호 제6,258,562호 참조), 항-IgE 항체, 예를 들면 오말리주마브 (졸레어(Xolair)®, 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재의 제넨테크), 항-RSV 항체, 예를 들면 팔리비주마브 (시나지스(Synagis)®, 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메디뮨(Medimmune) - 미국 특허 번호 제5,824,307호 참조), 항-EpCAM 항체, 예를 들면 에드레콜로마브 (파노렉스(Panorex)®, 센토코), 항-EGFR 항체, 예를 들면 세툭시마브 (얼비툭스(Erbitux)®, 뉴욕주 뉴욕 소재의 임클론 시스템즈(Imclone Systems)) 또는 파니튜무마브 (벡티빅스(Vectibix)®, 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재의 암젠(Amgen)), 항-HER2/neu 항체, 예를 들면 트라스투주마브 (허셉틴(Herceptin)®, 제넨테크), 항-α4 인테그린 항체, 예를 들면 나탈리주마브 (타이사브리(Tysabri)®, 바이오겐아이데크(BiogenIdec)), 항-C5 항체, 예를 들면 에쿨리주마브 (소리리스(Soliris)®, 코네티컷 체셔 소재의 알렉시온 파마슈티칼즈(Alexion Pharmaceuticals)) 및 항-VEGF 항체, 예를 들면 베바시주마브 (아바스틴(Avastin)®, 제넨테크 - 미국 특허 번호 제6,884,879호 참조) 또는 라니비즈마브 (루센티스(Lucentis)®, 제넨테크)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기한 것에도 불구하고, 다양한 실시태양에서, 특정 면역결합제는 본 발명의 공학처리 방법에서 사용되는 것으로부터 배제되고/거나, 공학처리 방법에 의해 생산된 면역결합제 조성물로부터 배제된다. 예를 들어, 다양한 실시태양에서, 면역결합제는, PCT 공보 WO 2006/131013 및 WO 2008/006235에 개시되어 있는 것과 같은 scFv 항체 또는 그의 변이체, 예를 들면 PCT 공보 WO 2006/131013 및 WO 2008/006235 (이들 각각의 내용이 본원에서 참고로 명확하게 인용된다)에 개시되어 있는 scFv 항체 항체 또는 그의 변이체 중 어느 것도 아닌 것을 조건으로 한다.
다양한 다른 실시태양에서, 상기 기술된 방법에 따라 공학처리되는 면역결합제가 PCT 공보 WO 2006/131013 및 WO 2008/006235에 개시되어 있는 scFv 항체 중 어느 것, 또는 그의 변이체일 경우, 이때는 공학처리 방법에 따른 치환을 위해 선택될 수 있는 가능성을 지닌 아미노산 위치에 관한 목록은 하기 아미노산 위치들 중 어느 것 또는 그 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 할 수 있다: Vκ1 또는 Vλ1의 경우, AHo 위치 4 (카바트 4); Vκ3의 경우, AHo 위치 101 (카바트 83); VH1a 또는 VH1b의 경우, AHo 위치 12 (카바트 11); VH1b의 경우, AHo 위치 50 (카바트 43); VH1b의 경우, AHo 위치 77 (카바트 66); VH1b의 경우, AHo 위치 78 (카바트 67); VH1b의 경우, AHo 위치 82 (카바트 71); VH1b의 경우, AHo 위치 86 (카바트 75); VH1b의 경우, AHo 위치 87 (카바트 76); VH3의 경우, AHo 위치 89 (카바트 78); VH1a의 경우, AHo 위치 90 (카바트 79); 및/또는 VH1b의 경우, AHo 위치 107 (카바트 93).
추가의 다양한 다른 실시태양에서, 상기 기술된 방법에 따라 공학처리되는 임의의 면역결합제, 및/또는 상기 기술된 방법에 따라 생산된 임의의 면역결합제의 경우, 공학처리 방법에 따른 치환을 위해 선택될 수 있는 가능성을 지닌 아미노산 위치에 관한 목록은 하기 아미노산 위치들 중 어느 것 또는 그 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 할 수 있다: Vκ1 또는 Vλ1의 경우, AHo 위치 4 (카바트 4);Vκ3의 경우, AHo 위치 101 (카바트 83); VH1a 또는 VH1b의 경우, AHo 위치 12 (카바트 11); VH1b의 경우, AHo 위치 50 (카바트 43); VH1b의 경우, AHo 위치 77 (카바트 66); VH1b의 경우, AHo 위치 78 (카바트 67); VH1b의 경우, AHo 위치 82 (카바트 71); VH1b의 경우, AHo 위치 86 (카바트 75); VH1b의 경우, AHo 위치 87 (카바트 76); VH3의 경우, AHo 위치 89 (카바트 78); VH1a의 경우, AHo 위치 90 (카바트 79); 및/또는 VH1b의 경우, AHo 위치 107 (카바트 93).
다른 실시태양
본 발명은 또한 동정된 데이타베이스, 생물 정보학, 인 실리코 데이타 조작 방법 및 해석 방법, 기능 분석, 바람직한 서열, 바람직한 잔기(들) 위치/변경, 프레임워크 동정 및 선택, 프레임워크 변경, CDR 정렬 및 통합, 및 바람직한 변경/돌연변이화를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 미국 가특허 출원 제60/905,365호의 첨부물 (A-C) 및 미국 가특허 출원 제60/937,112호의 첨부물 (A-I)에 기재되어 있는 방법론, 참고 문헌, 및/또는 조성물을 포함하는 것을 이해하여야 한다.
이들 방법론 및 조성물에 관한 추가 정보는 각각 2006년 6월과, 2007년 2월 6일 출원된 U.S.S.N. 60/819,378; 및 60/899,907, 및 PCT 공보 WO 2008/006235 (발명의 명칭 "scFv Antibodies Which Pass Epithelial And/Or Endothelial Layers"); 2006년 6월 6일 출원된 WO 06131013A2 (발명의 명칭 "Stable And Soluble Antibodies Inhibiting TNFα"); 2003년 3월 21일 출원된 EP1506236A2 (발명의 명칭 "Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods Of Identifying Same"); 2000년 12월 18일 출원된 EP1479694A2 (발명의 명칭 "Intrabodies ScFv with defined framework that is stable in a reducing environment"); 2000년 12월 18일 출원된 EP1242457B1 (발명의 명칭 "Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof"); 2003년 3월 21일 출원된 WO 03097697A2 (발명의 명칭 "Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods Of Identifying Same"); 및 2000년 12월 18일 출원된 WO O148017A1 (발명의 명칭 "Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof"); 및 [Honegger et al., J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)]에서 살펴볼 수 있다.
추가로, 본 발명은 또한 다른 항체 포맷, 예로서 전장의 항체 또는 그의 단편, 예를 들어, Fab, Dab 등의 발견 및/또는 개선에도 적합한 방법론 및 조성물을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 원하는 생체물리학적 및/또는 치료학적 특성을 달성하기 위한 선택 또는 변경에 적합한 것으로서 본원에서 동정된 잔기 및 원리가 광범위한 면역결합제에 적용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 치료학적으로 관련된 항체, 예를 들어, FDA 승인을 받은 항체는 본원에서 논의된 하나 이상의 잔기 위치를 변형시킴으로써 개선될 수 있다.
그러나, 본 발명은 면역결합제를 공학처리하는 것으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 당업자는, 피브로넥틴 결합 분자, 예를 들면 어드넥틴(Adnectin) (WO 01/64942 및 미국 특허 번호 제6,673,901호, 제6,703,199호, 제7,078,490호, 및 제7,119,171호 참조), 어피바디(Affibody) (예로서, 미국 특허 6,740,734호, 및 제6,602,977호 및 WO 00/63243 참조), 안티칼린(Anticalin) (리포칼린으로서 공지됨) (WO 99/16873 및 WO 05/019254 참조), A 도메인 단백질 (WO 02/088171 및 WO 04/044011 참조) 및 앵키린 반복 단백질, 예를 들면 다르핀(Darpin) 또는 류신 반복 단백질 (WO 02/20565 및 WO 06/083275 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다른 비-면역글로불린 결합 분자의 공학처리에 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 개시 내용은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되는데, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 모든 도면 및 본 출원 전체에서 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용 전문이 본원에서 명확하게 참고로 인용된다.
실시예 1: 항체 위치 번호화 체계
본 실시예에서는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기 위치를 동정하는데 사용되는 2개의 상이한 번호화 체계에 대한 변환표를 제공한다. 카바트 번호화 체계는 카바트 등 (문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242])에 의해 기재된 바 있다. AHo 번호화 체계는 문헌 [Honegger, A. and Pluckthun, A. (2001) J Mol . Biol . 309:657-670]에 추가로 기재되어 있다.
중쇄 가변 영역 번호화
Figure 112009080201824-PCT00002
Figure 112009080201824-PCT00003
경쇄 가변 영역 번호화
Figure 112009080201824-PCT00004
Figure 112009080201824-PCT00005
실시예 2: 서열에 기초한 scFv 서열 분석
본 실시예에서는 서열에 기초한 scFv 서열 분석을 상세히 설명한다. 상기 분석 과정을 요약한 흐름도를 도 1에 제시한다.
인간 면역글로불린 서열의 수집 및 정렬
인간 성숙 항체 및 생식계열의 가변 도메인 서열을 다른 데이타베이스로부터 수집하고, 1문자 코드 아미노산 서열로서 맞춤형 데이타베이스 내로 입력하였다. 니들먼-운쉬(Needleman-Wunsch) 서열 정렬 알고리즘 (문헌 [Needleman et al., J Mol Biol., 48(3):443-53 (1970)])에 관해 엑셀을 실행시켜 항체 서열을 정렬시켰다. 이어서, 데이타베이스를 (원래의 데이타 공급원에 따라) 4개의 상이한 어레이로 세분하여 하기의 추후 분석과 비교를 용이하게 수행할 수 있도록 하였다:
VBase: 인간 생식계열 서열
IMGT: 인간 생식계열 서열
KDB 데이타베이스: 성숙 항체
QC 데이타베이스: 품질 관리 스크리닝에 의해 선택되어진, 선택된 scFv 프레임워크를 포함하는 ESBA 테크(Tech's) 내부 데이타베이스
QC 스크리닝 시스템, 및 그로부터 선택되어진, 바람직한 기능적 특성을 갖는 scFv 프레임워크 서열은 예를 들어, PCT 공보 WO 2001/48017; 미국 출원 번호 제20010024831호; 미국 20030096306; 미국 특허 번호 제7,258,985호 및 제7,258,986호; PCT 공보 WO 2003/097697 및 미국 출원 번호 제20060035320호에 추가로 기재되어 있다.
면역글로불린 가변 도메인에 대한 AHo 번호화 체계에 따라 갭을 도입하고 잔기 위치를 명명하였다 (문헌 Honegger, A. and Pluckthun, A. (2001) J Mol . Biol. 309:657-670]). 이어서, 카바트 등 (문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242])에 따라 프레임워크 영역 및 CDR 영역을 동정하였다. KDB 데이타베이스 중의 서열이 프레임워크 영역 중 70% 미만으로 완전하거나, 다수의 미결정 잔기를 함유하는 경우, 상기 서열은 폐기하였다. 데이타베이스 내의 임의의 다른 서열에 대해 95% 초과로 동일한 서열 또한 본 분석에 있어 무작위 잡음을 피하기 위해 배제시켰다.
하위군으로의 서열 배정
서열 상동성에 기초하는 분류 방법에 따라 항체를 군집화하여 항체 서열을 다른 패밀리로 분류하였다 (문헌 ([Tomlinson, I.M. et al (1992) J. Mol . Biol . 227:776-798]; [Williams, S.C. and Winter, G. (1993) Eur . J. Immunol . 23:1456-1461)]; [Cox, J.P. et al. (1994) Eur . J. Immunol . 24:827-836])). 패밀리 칸센서스에 대한 상동성(%)을 70% 유사성으로 한정하였다. 2개 이상의 상이한 생식계열 패밀리 간에 서열이 불일치하는 것으로 나타난 경우, 또는 상동성(%)이 (임의의 패밀리에 대해) 70% 미만인 경우에는, 가장 근접한 생식계열 대응물을 결정하고, CDR 길이, 정규 부류 및 규정짓는 하위유형 잔기를 상세히 분석하여 패밀리를 정확하게 배정하였다.
통계학적 분석
일단 패밀리 군집을 정의하고 나면, "품질 관리("QC") 스크리닝"에서 동정된 히트에 대한 통계학적 분석을 실시하였다 (상기 QC 스크리닝은 PCT 공보 WO 2003/097697에 상세히 기재되어 있다). 분석을 위해서는 최소 한도의 서열 갯수가 필요하기 때문에 가장 대표적인 패밀리 (VH3, VH1a, VH1b, Vκ1, Vκ3 및 Vλ1)에 대해서만 유일하게 분석할 수 있었다. 데이타 내에서 특정 잔기 유형이 관찰되는 횟수를 총 서열 갯수로 나누어 각 위치(i)의 잔기 빈도(fi(r))를 계산하였다. 단순히 풍부도보다는 아미노산 조성물에 대한 더 많은 정보를 제공하는, 시스템에서의 다양성에 관한 수학적 척도인 심슨 지수를 사용하여 모든 잔기 위치의 가변성의 척도로서 위치 엔트로피(N(i))를 계산하였다 (문헌 ([Shenkin, P. S. et al. (1991) Proteins 11:297-313]; [Larson, S.M. and Davidson, A.R. (2000) Protein Sci . 9:2170-2180]; [Demarest, S.J. et al. (2004) J. Mol Biol. 335:41-48])). 존재하는 상이한 아미노산의 갯수 뿐만 아니라, 각 잔기의 상대 존재비를 고려하여 각 위치(i)에 대한 다양도를 계산하였다.
Figure 112009080201824-PCT00006
여기서, D는 심슨 지수이고, N은 아미노산의 총 갯수이고, r은 각 위치에 존재하는 상이한 아미노산의 갯수이고, n은 특정 아미노산 유형의 잔기의 갯수이다.
(QC 스크리닝에 의해 선택되어진) 선택된 Fv 프레임워크의 QC 데이타베이스는, 독특한 특성을 정의하는 상이한 기준을 사용하여 스크리닝하였다. 서열 데이타베이스 중 상이한 어레이를 사용하여 Fv 프레임워크 내의 잔기 위치의 가변도를 정의하고, 선택된 Fv 프레임워크 중에는 존재하나, 자연 상태에서는 흔하지 않은 것으로 변이에 대해 내성을 띠는 위치를 동정하였다. 위치 엔트로피 점수에서 10% 이하의 차이를 임계치로 정의한다. 주어진 위치에 존재하는 잔기가 다른 서열 어레이에서 드물게 관찰되는 아미노산, 즉, 생식계열 데이타베이스 (Vbase 및 IMGT) 및 KDB 데이타베이스에서 드물게 관찰되는 아미노산에 의해 점유되었다면 추가의 위치를 선택하였다. 잔기의 양상이 실제로 상이한 것으로 관찰되었다면 (다른 서열 어레이들 중 어느 것에서도 나타나지 않거나, 낮게 나타났다면), 상기 잔기 위치를 독특한 것으로서 정의하였다.
선택된 Fv 프레임워크 서열 중의 독특한 서열을 동정하는 것을 지지하는 것에 관한 이론적 근거는 입증된 프레임워크의 우수한 특성과, 개선된 스캐폴딩에 대한 이러한 관찰 결과들을 잠재적으로 사용할 수 있다는 점이다. 본 발명자들은 선택된 프레임워크 중에서 특정의 가변도를 보이는 것으로서 자연 상태에서 고도로 보존적인 위치는 무작위 돌연변이 유발법에 대한 내성을 띠어야 하며, scFv 포맷 중 천연 잔기보다 우수한 대체 아미노산이 발견될 수 있는 가능성이 증가한 것으로 나타나야 한다고 가정하였다. 또한, 드문 아미노산을 현저히 선호하는 것이 특정 잔기에 대한 자연 선택을 지시하는 것이다. 이러한 2개의 통계학적 가이드라인에 기초하여 중쇄 및 경쇄 내의 상이한 잔기를 유동적 위치 (가변성에 대하여 내성을 띠는 위치) 또는 바람직한 치환 (독특한 잔기)로서 선택하였다.
실시예 3: 가변성에 대하여 내성을 띠는 잔기 위치 및 독특한 잔기 위치 동정
상기 실시예 2에서 기술된 서열에 기초한 scFv 분석 접근법을 사용하여, 3개의 중쇄 가변 영역 패밀리 (VH3, VH1a 및 VH1b) 및 3개의 경쇄 가변 영역 패밀리 (Vκ1, Vκ3 및 Vλ1)를 분석함으로써 가변성에 대하여 내성을 띠는 아미노산 위치를 동정하였다. 특히, 상기 기술된 바와 같이, 심슨 지수를 사용하여 계산된 다양도를 4개의 상이한 데이타베이스인, Vbase, IMGT, KDB 및 QC (선택된 scFv) 내의 서열에 대한 각 아미노산 위치에 대하여 측정하였다. QC 선택된 scFv 데이타베이스와 비교된 Vbase 및 IMGT 생식계열 데이타베이스에 대한 상기 위치에서의 심슨 지수 값의 차이에 기초하여 변이체에 대하여 내성을 띠는 아미노산 위치 및 독특한 잔기 아미노산 위치를 동정하였다. 추가로, 관심의 대상이 되는 동정된 위치에 대한 생식계열 칸센서스 잔기를 동정하고, QC 및 KDB 데이타베이스 중 상기 칸센서스 잔기의 빈도를 측정하였다.
중쇄 가변 영역 패밀리 VH3, VH1a 및 VH1b에 대한 가변성 분석 결과는 각각, 표 3, 4, 및 5에 제시한다. 각 표의 열은 다음과 같다: 1열: AHo 번호화 체계를 사용하였을 때의 아미노산 잔기 위치 (실시예 1의 표 1에 기재되어 있는 변환표를 사용하여 카바트 번호화 체계로 변환시킬 수 있다); 2열 내지 5열: 1열에 표시된 잔기 위치에 대한 데이타베이스 중 각 항체 어레이에 관하여 계산된 다양성; 6열: 상응하는 생식계열 패밀리 및 KDB의 칸센서스 잔기; 7열: 6열의 칸센서스 잔기에 대한 KDB 데이타베이스 중의 상대 잔기 빈도; 및 8열: 6열의 칸센서스 잔기에 대한 QC 선택된 scFv 데이타베이스 중의 상대 잔기 빈도.
Figure 112009080201824-PCT00007
Figure 112009080201824-PCT00008
Figure 112009080201824-PCT00009
Figure 112009080201824-PCT00010
경쇄 가변 영역 패밀리 Vκ1, Vκ3 및 Vλ1에 대한 가변성 분석 결과를 각각 표 6, 7 및 8에 제시한다. 각 표의 열은 다음과 같다: 1열: AHo 번호화 체계를 사용하였을 때의 아미노산 잔기 위치 (실시예 1의 표 1에 기재되어 있는 변환표를 사용하여 카바트 번호화 체계로 변환시킬 수 있다); 2열 내지 5열: 1열에 표시된 잔기 위치에 대한 데이타베이스 중 각 항체 어레이에 관하여 계산된 다양성; 6열: 상응하는 생식계열 패밀리 및 KDB의 칸센서스 잔기; 7열: 6열의 칸센서스 잔기에 대한 KDB 데이타베이스 중의 상대 잔기 빈도; 및 8열: 6열의 칸센서스 잔기에 대한 QC 선택된 scFv 데이타베이스 중의 상대 잔기 빈도.
Figure 112009080201824-PCT00011
Figure 112009080201824-PCT00012
Figure 112009080201824-PCT00013
상기 표 3-8에 기재된 바와 같이, QC 시스템 선택된 scFv 프레임워크 중 잔기 위치의 하위세트는 생식계열 (Vbase 및 IMGT) 및 성숙 항체 (KDB) 중에 존재하지 않거나, 과소하게 나타나는 특정 잔기로 강하게 편향된 성향을 나타내는 것으로 관찰되었으며, 이는 scFv의 안정성이 품질 관리 효모 스크리닝 시스템에서 선택된 프레임워크 서열의 독특한 특성에 기초하여 합리적으로 개선될 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 4: 바람직한 잔기 선택
scFv의 기능적 특성 (예로서, 안정성 및/또는 가용성)을 개선시키는 것으로 알려진 특정 아미노산 위치에 존재하는 바람직한 아미노산 잔기 치환를 선택하기 위해 (또는 별법으로 아미노산 잔기를 배제시키기 위해), 성숙된 항체 서열의 카바트 데이타베이스로부터의 VH 및 VL 서열을 그의 패밀리 하위유형 (예로서, VH1b, VH3 등)에 따라 분류하였다. 서열의 각 하위패밀리 내의 각 아미노산 위치에서의 각 아미노산 잔기의 빈도는 1군의 하위유형 중 분석된 서열 모두에 대한 백분율(%)로서 측정하였다. 소위 말하는 QC 시스템에 의해서 증진된 안정성 및/또는 가용성에 대해 미리선택된 항체로 구성되어진 QC 데이타베이스의 서열 모두에 대해서도 동일하게 수행하였다. 각 하위유형의 경우, 카바트 서열 및 QC 서열에 대해 수득된 각 아미노산 잔기에 관한 생성된 백분율(%) (상대 빈도)을 각각의 상응하는 위치에서 비교하였다. 특정 아미노산 잔기의 상대 빈도가 카바트 데이타베이스와 비교하여 QC 데이타베이스에서 증가된 경우, 각 잔기를 scFv의 안정성 및/또는 가용성을 개선시키는 것으로, 주어진 위치에서 바람직한 잔기로 간주하였다. 역으로, 특정 아미노산 잔기의 상대 빈도가 카바트 데이타베이스와 비교하여 QC 데이타베이스에서 감소된 경우, 각 잔기는 scFv 포맷과 관련하여 상기 위치에서 바람직하지 못한 것으로 간주하였다.
표 9는 상이한 데이타베이스 중 VH1b 하위유형에 대한 아미노산 위치 H78 (AHo 번호화; 카바트 위치 H67)에서의 잔기 빈도에 관한 일례의 분석을 도시한다. 표 9의 열은 다음과 같다: 1열: 잔기 유형; 2열: IMGT 생식계열 데이타베이스에서의 잔기 빈도; 3열: Vbase 생식계열 데이타베이스에서의 잔기 빈도; 4열: QC 데이타베이스에서의 잔기 빈도; 5열: 카바트 데이타베이스에서의 잔기 빈도.
Figure 112009080201824-PCT00014
QC 데이타베이스에서 알라닌(A) 잔기는 24%의 빈도로 관찰되었는데, 이는 성숙 카바트 데이타베이스 (KDB_VH1B)에서 같은 잔기에 대해 2%의 빈도로 관찰된 값의 12배가 되는 값이다. 따라서, 위치 H78 (AHo 번호화)의 알라닌 잔기는 scFv의 기능적 특성 (예로서, 안정성 및/또는 가용성)을 증진시키는데 있어 상기 위치에서의 바람직한 잔기로서 간주된다. 대조적으로, 발린(V) 잔기는 QC 데이타베이스에서 상대 빈도가 47%인 것으로 관찰되었는데, 이는 성숙 카바트 데이타베이스에서 관찰된 86%의 빈도, 및 생식계열 데이타베이스 (IMGT-생식계열에서 91% 및 Vbase 생식계열에서 100%)에서 같은 잔기에 대해 관찰된 90% 초과의 빈도보다는 훨씬 더 낮은 값이었다. 그러므로, 발린 잔기(V)는 scFv 포맷과 관련하여 위치 H78에서 바람직하지 못한 잔기인 것으로 간주되었다.
실시예 5: 2개의 상이한 접근법으로부터의 ESBA105 scFv 변이체 비교
본 실시예에서는 2개의 상이한 접근법에 의해 제조된 scFv 변이체의 안정성을 비교하였다. 모체 scFv 항체는 ESBA105였으며, 이는 종래에 기술된 바 있다 (예로서, PCT 공보 WO 2006/131013 및 WO 2008/006235 참조). 품질 관리 효모 스크리닝 시스템을 사용하여 1종의 ESBA105 변이체 세트 ("QC 변이체")를 선택하였는데, 상기 변이체 또한 종래에 기술된 바 있다 (예로서, PCT 공보 WO 2006/131013 및 WO 2008/006235 참조). 상기 실시예 2 및 3에 기술된 서열 분석에 의해 동정된 바람직한 생식계열 칸센서스 서열로 특정의 아미노산 위치를 역돌연변이화시켜 다른 1종의 변이체 세트를 제조하였다. 생식계열 서열 중에서는 보존되지만, 선택된 scFv에서는 독특하거나, 낮은 빈도로 나타나는 아미노산을 함유한, 아미노산 서열 내의 위치에 대하여 검색함으로써 역돌연변이를 선택하였다 (생식계열 칸센서스 공학처리 접근법으로서 지칭됨).
분자에 열 유도성 스트레스를 가하여 모든 변이체의 안정성에 대하여 시험하였다. 광범위한 온도 범위 (25-95℃)에서 검사함으로써 모든 변이체에서의 열적 언폴딩 전이 온도 (TM)의 대략적인 중간점을 측정할 수 있었다. 야생형 분자 및 변이체의 열적 안정성 측정은, IR 광이 간섭계를 통해 유도되는 FT-IR ATR 분광법을 사용하여 실시하였다. 측정된 신호는 인터페로그램으로서, 상기 신호에 대해 푸리에 변환을 실시할 때 최종 스펙트럼은 종래 (분산형) 적외선 분광법으로부터 얻은 것과 일치한다.
열적 언폴딩 결과는 하기 표 10에 요약하고, 도 6에 그래프로 도시한다. 표 10의 열은 하기와 같다: 1열: ESBA105 변이체; 2열: 돌연변이를 포함하는 도메인; 3열: AHo 번호화에서의 돌연변이(들); 4열: 도 6의 열적 언폴딩 곡선으로부터 계산된 TM 중간점; 5열: 모체 ESBA105와 비교한 상대 활성; 5열: 1열에서 구체화된 변이체에 대한 돌연변이 유발 전략법.
Figure 112009080201824-PCT00015
QC 변이체와 비교하여 생식계열 칸센서스로의 역돌연변이화는 ESBA105의 열적 안정성 및 활성에 부정적인 효과를 미치거나, 어떤 효과도 미치지 않았다. 따라서, 이러한 결과는, 다른 발명자들이 상이한 항체 및 포맷에서 안정성을 개선시키기 위해서 사용하였던 칸센서스 공학처리 접근법을 부정하는 것이다 (예로서, 문헌 ([Steipe, B et a (1994) J. Mol. Biol. 240:188-192]; [Ohage, E. and Steipe, B. (1999) J Mol. Biol. 291:1119-1128]; [Knappik, A. et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86], [Ewert, S. et al. (2003) Biochemistry 42:1517-1528]; 및 [Monsellier, E. and Bedouelle, H. (2006) J. Mol. Biol. 362:580-593]) 참조).
별도의 실험에서 상기 QC 변이체 (QC11.2, QC15.2, 및 QC23.2)와 추가의 QC 변이체 (QC7.1)를 칸센서스 역돌연변이들 (S-2, D-2, 및 D-3) 또는 알라닌으로의 역돌연변이 (D-1)를 갖는 제2 세트 돌연변이와 비교하였다 (표 11 참조). 선택된 프레임워크 위치에 있는 잔기의 동일성을 표 11에 나타내고, 측정된 열적 안정성 (임의의 언폴딩 단위로)을 도 7에 도시한다. 비록 몇몇 칸센서스 변이체들 (S-2 및 D-1)에서는 열적 안정성이 현저히 증진된 것으로 나타났지만, 이러한 증진은 상기 4개의 QC 변이체들 각각에 의해 이루어진 열적 안정성 증진보다는 작았다.
Figure 112009080201824-PCT00016
따라서, 본원의 결과는, 자연 상태에서는 (여전히 인간에서도) 좀처럼 관찰되지 않으면서 가정컨대, 이들 프레임워크의 우수한 생체물리학적 특성의 원인이 되는 것인 공통된 특성을 갖는 스캐폴드의 하위 군집을 "품질 관리 효모 스크리닝 시스템"에 적용된 선택압을 통해 얻을 수 있다는 것을 입증한다. 60℃에서 ESBA105의 상이한 변이체에 대해 검사함으로써 선택된 scFv 프레임워크 데이타베이스에서 동정된 바람직한 치환의 우수한 특성을 재확인할 수 있었다. 따라서, QC 효모 스크리닝 시스템으로부터 수득한 선택된 scFv 서열에 기초하는, 본원에 기술된 "기능적 칸센서스" 접근법을 통해서 생식계열 칸센서스 접근법을 사용하여 제조된 변이체보다 우수한 열적 안정성을 갖는 scFv 변이체를 수득할 수 있다는 것이 입증되었다.
실시예 6 : ESBA212 scFv 변이체
본 실시예에서는 ESBA105와 상이한 결합 특이성을 갖는 scFv 항체의 생식계열 칸센서스 변이체 (ESBA212)의 안정성을 비교하였다. 상기 실시예 2 및 3에 기술된 서열 분석에 의해 동정된 바람직한 생식계열 칸센서스 서열로 특정의 아미노산 위치를 역돌연변이화시켜 모든 ESBA212 변이체를 제조하였다. 생식계열 서열 중에서는 보존되지만, 선택된 scFv에서는 독특하거나, 낮은 빈도로 나타나는 아미노산을 함유한, 아미노산 서열 내의 위치에 대하여 검색함으로써 역돌연변이를 선택하였다 (생식계열 칸센서스 공학처리 접근법으로서 지칭됨). 실시예 5에서와 같이 분자에 열 유도성 스트레스를 가하여 모든 변이체에서 안정성에 대하여 시험하였다.
ESBA212 변이체에 대한 열적 언폴딩 결과는 표 11에 요약하고, 도 8에 그래프로 도시한다. 표 11의 열은 하기와 같다: 1열: ESBA212 변이체; 2열: 돌연변이를 포함하는 도메인; 3열: AHo 번호화에서의 돌연변이(들); 4열: 도 6의 열적 언폴딩 곡선으로부터 계산된 TM 중간점; 5열: 모체 ESBA212와 비교한 상대 활성; 5열: 1열에서 구체화된 변이체에 대한 돌연변이 유발 전략법.
Figure 112009080201824-PCT00017
비관련 ESBA105 scFv 항체에 대해 관찰된 바와 같이, 생식계열 칸센서스로의 역돌연변이는 ESBA212의 열적 안정성 및 활성에 부정적인 효과를 미치거나, 어떤 효과도 미치지 않았다. 따라서, 이러한 결과는 종래 칸센서스에 기초한 접근법이 부적합하다는 것을 추가로 강조하는 역할을 한다. 이러한 결함은 본 발명의 기능적 칸센서스 방법론을 사용함으로써 처리될 수 있다.
실시예 7 : 가용성이 개선된 scFv 생성
본 실시예에서는 구조 모델링 및 서열 분석에 기초한 접근법을 사용하여 가용성을 개선시킨 scFv 프레임워크 영역 중의 돌연변이를 동정하였다.
a) 구조 분석
익스패시(ExPASy) 웹 서버를 통해 액세스할 수 있는, 자동화 단백질 구조 상동성-모델링 서버를 사용하여 ESBA105 scFv의 3D 구조를 모델링하였다. 용매에 접근가능한 상대 표면적 (rSAS)에 따라 구조를 분석하고, 잔기를 하기와 같이 분류하였다: (1) rSAS ≥ 50%를 보이는 노출된 잔기; 및 (2) 50% ≤rSAS ≥ 25%를 보이는 부분적으로 노출된 잔기. rSAS ≥ 25%인 소수성 잔기는 소수성 패치로서 간주하였다. 발견된 각 소수성 패치의 용매에 접근가능한 면적을 확인하기 위하여 ESBA105와 고도의 상동성을 갖는 27개의 PDB 파일과 2.7 Å 초과의 해상도로부터 계산하였다. 소수성 패치에 대한 평균 rSAS 및 표준 편차를 계산하고, 그들 각각에 대해 상세히 조사하였다 (표 13 참조)
Figure 112009080201824-PCT00018
ESBA105 중에서 동정된 대부분의 소수성 패치는 가변 도메인-불변 도메인 (VH/CH) 경계면에 상응하였다. 이는 scFv 포맷 중 용매에 노출된 소수성 잔기에 관한 이전 관찰 결과와 관련이 있었다 ([Nieba et al., 1997]). 소수성 패치들 중 2개 (VH 2 및 VH 5)의 소수성 패치는 또한 VL-VH 상호작용의 원인이 되며, 이에 추후 분석으로부터 배제시켰다.
b) 가용성 돌연변이의 디자인
안네마리 호네거 항체 웹페이지 (www.bioc.uzh.ch/antibody)로부터 총 122개의 VL과 137개의 VH 서열을 검색하였다. 서열은 원래 단백질 데이타 뱅크(PDB) (www.rcsb.org/pdb/home/home.do)로부터 발췌된 Fv 또는 Fab 포맷 중 393개의 항체 구조물과 상응하였다. 천연 잔기보다 고도한 친수성을 갖는 대체 아미노산이 발견될 수 있는 가능성을 증가시키기 위하여 종 또는 하위군과는 상관없이 서열을 사용하여 분석하였다. 데이타베이스 내의 임의의 다른 서열에 대하여 95% 초과의 동일성을 갖는 서열은 편향되는 성향을 감소시키기 위하여 배제시켰다. 서열을 정렬하고, 잔기 빈도에 대해 분석하였다. 서열 분석 도구 및 알고리즘을 적용시켜 ESBA105 중 소수성 패치를 파괴하는 친수성 돌연변이를 동정하고 선택하였다. AHo 번호화 체계에 따라 면역글로불린 가변 도메인 서열을 정렬하였다 (문헌 [Honegger and Pliickthun 2001]). 프레임워크 영역으로 한정하여 분석하였다.
맞춤형 데이타베이스 중의 각 위치 (i)에 대한 잔기 빈도 (f(r))는 데이타 내에서 특정 잔기가 관찰되는 횟수를 총 서열 갯수로 나누어 계산하였다. 제1 단계에서 상이한 아미노산의 출현 빈도를 각 소수성 패치에 대하여 계산하였다. ESBA105에서 동정된 각 소수성 패치에 대한 잔기 빈도를 상기 기술된 바와 같이 맞춤형 데이타베이스로부터 분석하였다. 표 14에는 데이타베이스에 존재하는 전체 잔기로 나눈 소수성 패치에서의 잔기 빈도를 기록하였다.
Figure 112009080201824-PCT00019
제2 단계에서, 소수성 패치에서의 친수성 잔기 빈도를 사용하여 각 소수성 패치에서 가장 풍부하게 존재하는 친수성 잔기를 선택함으로써 가용성 돌연변이를 디자인하였다. 표 15에는 이러한 접근법을 사용하여 동정된 가용성 돌연변이체를 기록하였다. 모체 잔기 및 돌연변이체 잔기의 소수성은 몇몇 논문에서 발표된 바 있는 평균 소수성 값으로서 계산하고, 측쇄의 용매에의 노출 수준에 관한 함수로서 나타내었다.
Figure 112009080201824-PCT00020
c) 가용성 ESBA105 변이체의 시험
가용성 돌연변이를 단독으로, 또는 조합하여 도입하고, 리폴딩율, 발현, 활성 및 안정성 및 응집 패턴에 대하여 시험하였다. 표 16은 가용성과, 돌연변이가 항원 결합을 변경시키게 될 수 있는 위험 수준에 대한 잠재적인 원인에 기초하여 각 ESBA105의 최적화된 변이체에 도입된 가용성 돌연변이의 다양한 조합을 나타낸다.
Figure 112009080201824-PCT00021
i. 가용성 측정
원심분리된 PEG-단백질 혼합물의 상등액 중 단백질 농도를 측정하여 ESBA105 및 변이체의 최대 가용성을 측정하였다. 출발 농도 20 mg/ml를 포화도 범위를 30 내지 50%로 하는 PEG 용액과 1:1로 혼합하였다. 이들 조건은 Log S 대 Peg 농도 (% w/v)의 1차 종속에 관해 실험적으로 측정한 후 야생형 ESBA105에 관하여 관찰된 가용성 프로파일에 기초하여 선택하였다. 우수한 가용성을 보인 변이체 ESBA105의 몇몇 일례에 관한 가용성 곡선은 도 9에 도시되어 있다. 가용성 값에 관한 완전한 목록 또한 표 17에서 제공한다.
Figure 112009080201824-PCT00022
ii. 열적 안정성 측정
모체 ESBA105 및 가용성 후속물에 대한 열적 안정성 측정은 FT-IR ATR 분광법을 사용하여 실시하였다. 광범위한 온도 범위 (25-95℃)에서 분자에 관한 열적 검사를 실시하였다. 인터페로그램 신호에 대해 푸리에 변환을 적용시켜 변성 프로파일을 수득하였다 (도 10 참조). 변성 프로파일을 사용하여 볼츠만 S자형 모델을 적용시킴으로써 모든 ESBA105 변이체에 대한 열적 언폴딩 전이 온도 (TM)의 대략적인 중간점의 근사치를 구하였다 (표 18).
Figure 112009080201824-PCT00023
iii . 응집 측정
또한, 분해 및 응집 양상에 관해 평가하기 위하여 시간 의존형 시험으로 ESBA105 및 그의 가용성 변이체를 분석하였다. 이러한 목적을 위해 가용성 단백질 (20 mg/ml)을 인산염 완충액 (pH 6.5) 중 승온 (40℃)하에 인큐베이션시켰다. 대조군 샘플은 -80℃에서 보관하였다. 2주간의 인큐베이션 기간이 경과된 후 샘플을 분해 (SDS-PAGE) 및 응집 (SEC)에 대하여 분석하였다. 상기 분석을 통해, 쉽게 분해된 변이체 (도 11 참조) 또는 가용성 또는 불용성 응집물을 형성하는 경향을 보인 변이체 (표 19 참조)는 폐기할 수 있도록 하였다.
Figure 112009080201824-PCT00024
iv. 가용성 변이체의 발현 및 리폴딩
또한, 모체 ESBA105 분자와 비교하여 가용성 돌연변이체를 발현 및 리폴딩율에 대하여 시험하였다. 이들 연구 결과는 표 20에 제시되어 있다.
Figure 112009080201824-PCT00025
모체 ESBA105 분자와 비교하여 모든 친수성 가용성 돌연변이체가 개선된 가용성을 나타내었지만, 이들 분자들 중 유일하게 몇몇 분자는 다른 생체물리학적 특성에 적합한 것으로 나타났다. 예를 들어, 모체 ESBA105 분자와 비교하여 다수의 변이체는 열적 안정성 및/또는 리폴딩율이 감소된 것으로 나타났다. 특히, 위치 VL 147에서의 친수성 치환은 안정성을 현저히 감소시켰다. 이에, 열적 안정성에 유의적인 영향을 미치지 못한 가용성 돌연변이를 조합하고, 추가로 열적 스트레스를 가하여 그의 특성을 확인하였다.
4개의 상이한 가용성 돌연변이의 조합을 포함하는 3개의 돌연변이체 (Opt1.0, Opt0.2 및 VH:V103T)는 재현성, 활성, 또는 열적 안정성에는 별 영향을 미치지 않으면서 ESBA105의 가용성을 현저히 개선시켰다. 그러나, ESBA105 중 Opt1.0 및 Opt0.2의 조합 돌연변이를 갖는 돌연변이체 (Opt 1_2)에서는 40℃에서 2주간 인큐베이션시킨 후에 불용성 응집물의 양이 증가한 것으로 나타났다 (표 19 참조). Val은 모든 아미노산 중 가장 큰 베타 쉬트 성향을 갖고 있는 바, 상기는 베타 쉬트 회전 중 위치 VL 15에서의 Val의 역할에 의해 설명될 수 있을 것이다. 이러한 결과는, 위치 VL 15에서의 단일 가용성 돌연변이는 내성을 띠지만, 소수성 패치를 파괴시키는 가용성 돌연변이체와의 조합에서는 내성을 띠지 않는다는 것을 입증하였다.
그러므로, OptO_2 및 VH:V103T에 포함된 돌연변이를 scFv 분자의 가용성 특성을 개선시키는 최고의 실행자로서 선택하였다.
실시예 8 : 가용성 및 안정성이 증진된 scFvs 생성
가용성 디자인에 의해 동정된 ESBA105 변이체를 품질 관리 (QC) 분석에 의해 동정된 안정화 돌연변이로 치환시켜 추가로 최적화시켰다. QC 7.1 및 15.2에서 발견된 모든 안정화 돌연변이 (즉, VL 도메인 중 D31N 및 V83E 및 VH 도메인 중 V78A, K43 및 F67L)와 조합된, 상기 실시예 7에서 동정된 1 내지 3개의 가용성 돌연변이를 포함하는 총 4개의 작제물을 생성하였다. 최적화된 작제물 모두 야생형 scFv보다 가용성이 더 큰 단백질을 생산하였다 (표 20 참조). 최고의 작제물은 일관되게 야생형보다 2배 초과로 증가된 가용성을 나타내었다. 안정화 돌연변이 및 가용성 증진 돌연변이의 조합에 의해서는 scFv 분자의 활성 또는 안정성 어느 것도 유의적인 영향을 받지 않았다.
Figure 112009080201824-PCT00026
4개의 변이체 모두의 가용성 값을 사용하여 scFv의 가용성에 기여한 각 돌연변이의 기여도를 보정하였다. 이들 잔기들 중 몇몇 잔기는 1차 서열과 3D 구조 내에서 모두 서로서로 상대적으로 근접해 있지만, 모든 돌연변이는 부가적인 방식으로 scFv의 가용성에 기여하는 것으로 보였다. 상기 분석은, VH 도메인 중 3개의 가용성 증진 돌연변이 (V12S, L144S, V103T (또는 V103S))의 조합이 scFv 가용성 중 ~60%를 차지한다는 것을 시사한다. 소수성 패치는 모든 면역결합제의 가변 도메인에서 보존되기 때문에 이러한 돌연변이의 최적의 조합을 사용하여 사실상 임의의 scFv 또는 다른 면역결합제의 가용성을 개선시킬 수 있다.
등가물
당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시태양에 대한 많은 등가물을 이해할 수 있거나, 단지 통상의 실험만을 사용해도 상기를 확인할 수 있다. 그러한 등가물을 하기 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

Claims (29)

  1. a) 하위유형에 따라 분류된 VH 및/또는 VL 아미노산 서열의 제1 데이타베이스를 제공하는 단계;
    b) 하위유형에 따라 분류되고, 적어도 하나의 바람직한 기능적 특성을 갖는 것으로서 선택된, VH 및/또는 VL 아미노산 서열의 제2 데이타베이스를 제공하는 단계;
    c) 제1 데이타베이스의 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도 및 제2 데이타베이스의 상응하는 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기에 대한 아미노산 빈도를 측정하는 단계;
    d) i) 아미노산이 1 초과의 강화 인자를 가질 경우에 아미노산 잔기를 면역결합제의 상응하는 아미노산 위치에서의 치환에 바람직한 아미노산 잔기로서 동정하거나, ii) 아미노산 잔기가 1 미만의 강화 인자를 가질 경우에 아미노산 잔기를 면역결합제의 상응하는 아미노산 위치에서 배제시키고자 하는 아미노산 잔기로서 동정하는 단계
    를 포함하는, 면역결합제 중 특정 위치에서의 치환을 위한 하나 이상의 아미노산 잔기를 동정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 d)의 아미노산 잔기가 4 내지 6의 강화 인자를 갖는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 데이타베이스가 생식계열 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 데이타베이스가 생식계열 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열로 구성된 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 데이타베이스가 성숙 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 데이타베이스가 성숙 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열로 구성된 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 성숙 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열이 카바트 데이타베이스(KDB)로부터의 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 데이타베이스가 QC 분석으로 부터 선택된 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 데이타베이스가 QC 분석으로부터 선택된 scFv 항체 VH, VL 또는 VH 및 VL 아미노산 서열로 구성된 것인 방법.
  10. a) 돌연변이화를 위해 하나 이상의 프레임워크 아미노산 위치를 동정하는 단계;
    b) 단계 a)에서 동정된 각각의 특정 프레임워크 위치에 대해, 치환에 바람직한 아미노산 잔기를 동정하는 단계; 및
    c) 각각의 특정 프레임워크 위치에 있는 아미노산 잔기를, 단계 b)에서 동정된 바람직한 아미노산 잔기로 돌연변이화시키는 단계
    를 포함하는, VH 및/또는 VL 아미노산 서열을 갖는 면역결합제를 개선시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 a)가 주어진 프레임워크 위치에서의 가변도를 측정함으로써 실시되는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 단계 a)가 심슨(Simpson) 지수를 사용하여 각 프레임워크 위치에 보존도를 할당함으로써 실시되는 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 바람직한 아미노산 잔기가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 동정되는 것인 방법.
  14. a) 돌연변이화를 위한 면역결합제 내의 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계;
    b) 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이화시키는 단계
    를 포함하며, 여기서 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 중쇄 아미노산 위치일 경우, 상기 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, 1, 6, 7, 10, 12, 13, 14, 19, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87, 89, 90, 92, 95, 98, 103 및 107 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 18, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76, 78, 79, 81, 82b, 84, 89 및 93)로 구성된 군으로부터 선택되고,
    돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 경쇄 아미노산 위치일 경우, 상기 아미노산 위치는 AHo 번호화를 사용하였을 때, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 12, 14, 18, 20, 24, 46, 47, 50, 53, 56, 57, 74, 82, 91, 92, 94, 101 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 12, 14, 18, 20, 24, 38, 39, 42, 45, 48, 49, 58, 66, 73, 74, 76, 83 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인,
    중쇄 가변 영역 또는 그의 단편, 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 면역결합제의 기능적 특성을 개선시키는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 면역결합제가 VH3 중쇄 가변 영역을 포함하고, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 AHo 번호화를 사용하였을 때, VH3의 아미노산 위치 1, 6, 7, 89 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 7, 78 및 89)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 면역결합제가 VH1a 중쇄 가변 영역을 포함하고, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1a의 아미노산 위치 1, 6, 12, 13, 14, 19, 21, 90, 92, 95 및 98 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 6, 11, 12, 13, 18, 20, 79, 81, 82b 및 84)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 면역결합제가 VH1b 중쇄 가변 영역을 포함하고, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 AHo 번호화를 사용하였을 때, VH1b의 아미노산 위치 1, 10, 12, 13, 14, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87 및 107 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 9, 11, 12, 13, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76 및 93)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 면역결합제가 Vκ1 경쇄 가변 영역을 포함하고, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ1의 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 47, 50, 57, 91 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 3, 4, 24, 39, 42, 49, 73 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 면역결합제가 Vκ3 경쇄 가변 영역을 포함하고, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 AHo 번호화를 사용하였을 때, Vκ3의 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 56, 74, 94, 101 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 2, 3, 10, 12, 18, 20, 48, 58, 76, 83 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 AHo 번호화를 사용하였을 때, Vλ1의 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 46, 53, 82, 92 및 103 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 1, 2, 4, 7, 11, 14, 38, 45, 66, 74 및 85)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이화시키는 것이 AHo 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 12, 13 및 144 (카바트 번호화를 사용하였을 때, 아미노산 위치 12, 85 및 103)로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 아미노산 위치에서의 하나 이상의 (바람직하게는 모든) 쇄의 치환을 더 포함하는 것인 방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 QC 분석으로부터 선택된 항체 서열 중의 상응하는 아미노산 위치에서 발견되는 아미노산 잔기로 돌연변이화되는 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이화를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 동정될 수 있는 아미노산 잔기로 돌연변이화되는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역결합제가 scFv 항체, 전장의 면역글로불린, Fab 단편, Dab 또는 나노바디인 방법.
  25. 제1항 내지 제9항 및 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 특성이 개선된 안정성, 개선된 가용성, 응집이 일어나지 않는 것, 발현 개선, 봉입체 정제 공정 이후의 리폴딩 수율의 개선, 또는 상기 개선들 중 둘 이상의 조합인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 발현 개선이 원핵 세포에서 관찰되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제9항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 특성이 항원 결합 친화성의 개선은 아닌 것을 조건으로 하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 면역결합제.
  29. 제28항의 면역결합제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
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