JP2014051508A - 単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化 - Google Patents

Abstract

【課題】単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化の提供。
【解決手段】本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の構造特性及び生物物理学的特性、例えば安定性、可溶性及び抗原結合親和性を改変及び改善するために配列に基づく分析及び合理的なストラテジーを使用する方法を提供する。これらの方法及びストラテジーは、個別にもしくは組み合わせて使用することができる。本発明の方法は、また、優れた可溶性及び安定性を有するものとして選択された抗体の実験的にスクリーニングされたｓｃＦｖライブラリーからのｓｃＦｖ配列を含むデータベースを使用することを含む。本発明は、また、ｓｃＦｖ抗体を再構築して単鎖抗体フラグメントの安定性及び可溶性の特性を改善するための一般的なアプローチにおいて、これらの選択された抗体について見出された特性を使用する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２００７年６月２５日に出願された"単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリ
ング及び最適化"というタイトルの米国仮出願第６０／９３７，１１２号に基づく優先権
を主張する。本出願は、また、２００８年５月１２日に出願された"単鎖抗体の配列に基
づくエンジニアリング及び最適化"というタイトルの米国仮出願第６１／０６９，０５７
号に基づく優先権を主張する。

発明の背景
抗体は、癌、自己免疫疾患及び他の疾病の処置における非常に有効かつ効果的な治療剤
であることが実証されている。全長抗体は、一般に臨床的に使用されているが、一方で、
抗体フラグメントの使用によりもたらされうる、高められた組織浸透性、Ｆｃ−エフェク
ター機能が存在しないことと他のエフェクター機能を付与する能力とを兼ね備えること、
より短い生体内半減期に由来する全身性副作用の見込みが殆どないことなどの多くの利点
がある。抗体フラグメントの薬物動力学的特性は、該フラグメントが、局所的な治療アプ
ローチのために特に良好に適合されうることを示している。更に、抗体フラグメントは、
ある一定の発現システムにおいては、全長抗体よりも生産が容易なことがある。

抗体フラグメントの１つの型は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、該抗体は、リンカー配
列を介して軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L）に結合された重鎖可変ドメイン（Ｖ_H）から構成され
ている。このように、ｓｃＦｖは、全ての抗体定常ドメインを欠損しており、先の可変／
定常ドメインのインターフェースのアミノ酸残基（インターフェース残基）は、溶媒曝露
となる。ｓｃＦｖは、全長抗体（例えばＩｇＧ分子）から、確立された組み換え工学技術
によって製造することができる。しかしながら、全長抗体のｓｃＦｖへの変換は、しばし
ば、該タンパク質の粗悪な安定性及び可溶性と、低い生産収率と、免疫原性の危険を生ず
る高い凝集傾向をもたらす。

従って、ｓｃＦｖの可溶性及び安定性などの特性を改善する多くの試みがなされてきて
いる。例えば、Ｎｉｅｂａ，Ｌ他（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９７）１０：４３５−４４
４）は、インターフェースの残基であることが知られている３つのアミノ酸残基を選択し
て、それらを突然変異させた。それらの突然変異によって、細菌中での突然変異されたｓ
ｃＦｖのペリプラズム内発現の増加が観察されることに加えて、熱力学的安定性及び可溶
性は大きく変化しないものの、熱的に誘発される凝集率の低下が観察された。ｓｃＦｖ内
の特定のアミノ酸残基に対して部位特異的突然変異誘発を行った他の研究も報告されてい
る（例えばＴａｎ，Ｐ．Ｈ．他（１９８８年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５：１４７３−１
４８２；Ｗｏｅｒｎ，Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９８年）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．３７：１３１２０−１３１２７；Ｗｏｒｎ，Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（
１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：８７３９−８７５０を参照のこと）。これらの様々
な研究において、突然変異誘発のために選択されたアミノ酸残基は、ｓｃＦｖ構造内のそ
れらの既知の位置に基づき（例えば分子モデリング研究から）選択された。

別のアプローチでは、非常に発現に乏しいｓｃＦｖからの相補性決定領域（ＣＤＲ）が
、好適な特性を有することが実証されたｓｃＦｖのフレームワーク領域に移植された（Ｊ
ｕｎｇ，Ｓ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：
９５９−９６６）。得られたｓｃＦｖは、改善された可溶性発現及び熱力学的安定性を示
した。

ｓｃＦｖにおける機能特性の改善のためのエンジニアリングにおける進展は、例えばＷ
ｏｅｒｎ，Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
３０５：９８９−１０１０で論評されている。しかしながら、優れた機能特性を有するｓ
ｃＦｖの合理的な設計を可能とする新たなアプローチ、特にエンジニアリングのために潜
在的に問題のあるアミノ酸残基の選択において専門家を補助するアプローチは、依然とし
て必要とされている。

発明の概要
本発明は、安定性及び／又は可溶性について潜在的に問題のあるｓｃＦｖ配列内のアミ
ノ酸残基の割り出しを、配列に基づく分析を使用して可能にする方法を提供する。更に、
本発明の方法により割り出されたアミノ酸残基は、突然変異のために選択することができ
、かつ突然変異されたエンジニアリングされたｓｃＦｖを製造し、それを安定性及び／又
は可溶性などの改善された機能特性についてスクリーニングすることができる。特に好ま
しい一実施態様において、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖのデータベースを使用
して、生殖細胞系の及び／又は成熟の抗体免疫グロブリン配列における相応の位置よりも
変動性に許容性が高いか低いかのいずれかのアミノ酸残基位置を割り出す方法を提供し、
これにより、斯かる割り出された残基位置は、安定性及び／又は可溶性などのｓｃＦｖ機
能性を改善するようにエンジニアリングするために適している可能性があることが示され
る。このように、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの使用の使
用に基づいて、"機能的コンセンサス"アプローチの利点を提供し、かつ実証している。

更に他の好ましい実施態様においては、本発明は、イムノバインダーにおける関連のア
ミノ酸位置（例えば、少なくとも１つの望ましい特性を有するｓｃＦｖ配列のデータベー
ス、例えばＱＣアッセイで選択されたデータベースと、成熟抗体配列のデータベース、例
えばＫａｂａｔデータベースとの比較によって割り出されたアミノ酸位置）で置換される
べき好ましいアミノ酸残基（又は選択的に、排除されるべきアミノ酸残基）を割り出すた
めの方法を提供する。このように、本発明は、更に、特定のアミノ酸残基を選択するため
の"濃縮／排除"方法を提供する。更になおも、本発明は、本願に記載される"機能的コン
センサス"アプローチを使用して割り出された特定のフレームワークアミノ酸位置を突然
変異させることによる、イムノバインダー（例えばｓｃＦｖ、全長免疫グロブリン、Ｆａ
ｂフラグメント、単独ドメイン抗体（例えばＤａｂ）及びナノボディー）のエンジニアリ
ングの方法を提供する。好ましい実施態様においては、フレームワークアミノ酸位置は、
存在するアミノ酸残基を、本願に記載される"濃縮／排除"分析法を使用して"濃縮された"
残基であると見出された残基によって置換することによって突然変異される。

一態様では、本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であって該ｓｃＦｖがＶ_H及びＶ_Lアミノ
酸配列を有するものにおける突然変異のためのアミノ酸位置を割り出す方法において、
ａ）ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を、多数の抗体のＶ_H、Ｖ_Lも
しくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を含むデータベースに入力して、該ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_L
もしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列とデータベースの該抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及び
Ｖ_Lのアミノ酸配列とをアラインメントさせることと、
ｂ）ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置と、データベースの抗体
のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸内の相応の位置とを比較することと、
ｃ）該ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置が、データベースの抗
体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されているアミノ酸残基によっ
て占められているかどうかを調べることと、
ｄ）該アミノ酸位置が、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸内の相応の位置
で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、該ｓｃＦｖのＶ_Hもし
くはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置を、突然変異のためのアミノ酸位置として割り
出すことと
を含む方法を提供する。

本発明の方法は、更に、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の突然変異のため
に割り出されたアミノ酸位置を突然変異させることを含んでよい。例えば、突然変異につ
いて割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_L内の相応の位置
で保存されているアミノ酸残基で置換することができる。加えて又は代わりに、突然変異
について割り出されたアミノ酸位置を無作為なもしくは指向的な突然変異誘発によって突
然変異させて、突然変異されたｓｃＦｖのライブラリーを作製し、引き続き前記の突然変
異されたｓｃＦｖのライブラリーをスクリーニングし、そして少なくとも１つの改善され
た機能特性を有するｓｃＦｖを選択する（例えば、酵母クオリティー・コントロールシス
テム（ＱＣシステム）を使用するライブラリーのスクリーニングによって）ことができる
。

様々な種類のデータベースを本発明の方法で使用できる。例えば、一実施態様において
は、データベースの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列は、生殖細胞系の
抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列である。もう一つの実施態様において
は、データベースの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列は、再配置され親
和性成熟した抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列である。更にもう一つの
特に好ましい実施態様においては、データベースの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lの
アミノ酸配列は、少なくとも１種の所望の機能特性（例えばｓｃＦｖ安定性もしくはｓｃ
Ｆｖ可溶性）を有するように選択されたｓｃＦｖ抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのア
ミノ酸配列である。更にもう一つの実施態様においては、１つより多くのデータベースを
比較目的のために使用することができる。例えば、特に好ましい一実施態様においては、
少なくとも１種の所望の機能特性を有するように選択されたｓｃＦｖのデータベース、並
びに１もしくはそれより多くの生殖細胞系データベース又は再配置され親和性成熟した抗
体データベースが使用され、その際、ｓｃＦｖデータベースからの配列比較結果は、他の
データベースからの結果と比較される。

本発明の方法を使用して、例えばｓｃＦｖのＶ_H領域、ｓｃＦｖのＶ_L領域又はその両方
を分析することができる。

本発明の方法を使用して関連のｓｃＦｖ内の関連の単独のアミノ酸位置を分析できるが
、一方で、より好ましくは、該方法を使用して、ｓｃＦｖ配列に沿った多重のアミノ酸位
置が分析される。このように、好ましい一実施態様においては、前記方法の工程ｂ）では
、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の多重のアミノ酸位置は、データベースの
抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置と比較される。例えば、好ましい一
実施態様において、ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列内の各フレー
ムワーク位置は、データベースの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列内の
それぞれの相応のフレームワーク位置で比較される。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖの１
もしくはそれより多くのＣＤＲ内の１もしくはそれより多くの位置を分析することができ
る。更にもう一つの実施態様においては、ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミ
ノ酸配列内のそれぞれのアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及
びＶ_Lのアミノ酸配列内のそれぞれの相応のアミノ酸位置と比較される。

データベースの配列のうち"保存"されているアミノ酸位置は、１もしくはそれより多く
の特定の型のアミノ酸残基によって占められていてよい。例えば、一実施態様においては
、"保存"されている位置は、その位置で非常に高い頻度で生ずる１つの特定のアミノ酸残
基によって占められている。すなわち、該方法の工程ｃ）で、データベースの抗体のＶ_H
もしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されるアミノ酸残基は、該データベー
スの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のその位置に最も頻度の高いアミノ酸残基も
しくは最も高く濃縮されているアミノ酸残基である。この状況では、エンジニアリングさ
れたｓｃＦｖを作製するためには、突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、デー
タベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最も頻繁に確認される
アミノ酸残基もしくは最も高く濃縮されているアミノ酸残基で置換されていてよい。もう
一つの実施態様においては、データベースの配列のうち"保存"されているアミノ酸位置は
、例えば、（ｉ）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結
合を形成できるアミノ酸残基又は（ｉｖ）β−シートを形成する性向を有するアミノ酸残
基によって占められていてよい。すなわち、該方法の工程ｃ）で、データベースの抗体の
Ｖ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置は、（ｉ）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）
親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結合を形成できるアミノ酸残基又は（ｉｖ）β−シ
ートを形成する性向を有するアミノ酸残基で保存される。

従って、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、データベースの抗体の
Ｖ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置が疎水性アミノ酸残基で保存されている場
合には、ｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗
体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最も最も頻出する疎水性アミノ酸残
基で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出さ
れたアミノ酸位置を、ｓｃＦｖ内のその位置で最適であると選択された疎水性アミノ酸残
基（例えば分子モデリング研究を基礎としてｓｃＦｖの構造と機能を最も維持しそうな疎
水性残基）で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について
割り出されたアミノ酸位置は、エンジニアリングされたｓｃＦｖのライブラリーの作製の
ために部位特異的突然変異誘発を介して１パネルの疎水性アミノ酸残基で置換されていて
よく、かつ最も好ましい置換は、所望の機能特性についてライブラリーをスクリーニング
する（例えば酵母ＱＣシステムで）ことによって選択することができる。

更に、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、データベースの抗体のＶ
_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置が親水性アミノ酸残基で保存されている場合
には、ｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体
のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最も最も頻出する親水性アミノ酸残基
で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出され
たアミノ酸位置を、ｓｃＦｖ内のその位置で最適であると選択された親水性アミノ酸残基
（例えば分子モデリング研究を基礎としてｓｃＦｖの構造と機能を最も維持しそうな親水
性残基）で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割
り出されたアミノ酸位置は、エンジニアリングされたｓｃＦｖのライブラリーの作製のた
めに部位特異的突然変異誘発を介して１パネルの親水性アミノ酸残基で置換されていてよ
く、かつ最も好ましい置換は、所望の機能特性についてライブラリーをスクリーニングす
る（例えば酵母ＱＣシステムで）ことによって選択することができる。

なおも更に、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、データベースの抗
体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置が水素結合を形成しうるアミノ酸残基
で保存されている場合には、ｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は
、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最も最も頻出す
る水素結合を形成しうるアミノ酸残基で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃ
Ｆｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置を、ｓｃＦｖ内のその位置で最適で
あると選択された水素結合を形成しうるアミノ酸残基（例えば分子モデリング研究を基礎
としてｓｃＦｖの構造と機能を最も維持しそうな残基）で置換されていてよい。加えて又
は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、エンジニアリ
ングされたｓｃＦｖのライブラリーの作製のために部位特異的突然変異誘発を介して１パ
ネルの水素結合を形成しうるアミノ酸残基で置換されていてよく、かつ最も好ましい置換
は、所望の機能特性についてライブラリーをスクリーニングする（例えば酵母ＱＣシステ
ムで）ことによって選択することができる。

なおも更に、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、データベースの抗
体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置がβ−シートを形成する性向を有する
アミノ酸残基で保存されている場合には、ｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたア
ミノ酸位置は、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最
も最も頻出するβ−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で置換されていてよい。
加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置を、ｓｃ
Ｆｖ内のその位置で最適であると選択されたβ−シートを形成する性向を有するアミノ酸
残基（例えば分子モデリング研究を基礎としてｓｃＦｖの構造と機能を最も維持しそうな
残基）で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り
出されたアミノ酸位置は、エンジニアリングされたｓｃＦｖのライブラリーの作製のため
に部位特異的突然変異誘発を介して１パネルのβ−シートを形成する性向を有するアミノ
酸残基で置換されていてよく、かつ最も好ましい置換は、所望の機能特性についてライブ
ラリーをスクリーニングする（例えば酵母ＱＣシステムで）ことによって選択することが
できる。

もう一つの実施態様においては、ｓｃＦｖにおける突然変異のためのアミノ酸位置を割
り出すための本発明の方法は、ｓｃＦｖ抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配
列と高い類似性を有するこれらの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列のみ
がデータベース中に含まれる制約されたデータベースであるデータベースを用いて実施す
ることができる。

好ましい一実施態様においては、分析されるアミノ酸位置（すなわちデータベースの抗
体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の"相応の位置"）の保存を定量化するために、アミ
ノ酸位置に、シンプソンの指数を使用して保存の度合いが割り当てられる。

本発明の方法は、また、ｓｃＦｖ配列内のアミノ酸位置のペアを決定するために使用で
き、これらの共変ペア位置の一方もしくは両方を突然変異のために割り出すことができる
ように互いに共変することができるアミノ酸位置を割り出すために使用することもできる
。このように、もう一つの実施態様においては、本発明は、以下の工程：
ａ）データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、
アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程；
ｂ）アミノ酸位置の共変ペアと、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位
置とを比較する工程；
ｃ）前記のｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの
抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸
残基によって占められているかどうかを決定する工程；及び
ｄ）前記のｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方
を、ｓｃＦｖ内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のＶ_Hもしくは
Ｖ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によっ
て占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む方法を提供する。

この共分散分析は、個々のアミノ酸位置の分析と組み合わせることができ、こうして、
工程ａ）〜ｄ）を有する前記のｓｃＦｖにおける突然変異のためのアミノ酸位置を割り出
す方法は、更に以下の工程：
ｅ）データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、
アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程；
ｆ）アミノ酸位置の共変ペアと、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位
置とを比較する工程；
ｇ）前記のｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの
抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸
残基によって占められているかどうかを決定する工程；及び
ｈ）前記のｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方
を、ｓｃＦｖ内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のＶ_Hもしくは
Ｖ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によっ
て占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含むことができる。

共変分析法は、単独の共変ペアに適用でき、又は選択的にアミノ酸位置の多重の共変ペ
アを、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内で割り出すことができ、か
つｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置と比較することができる。

該方法は、更に、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位
置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の一方
もしくは両方の相応の位置を突然変異することを含みうる。例えば、一実施態様において
、アミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃ
Ｆｖ内の相応の位置の一方は、アミノ酸位置の共変ペアで最も頻出するアミノ酸残基で置
換される。もう一つの実施態様において、アミノ酸位置の共変ペアで保存されていないア
ミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の相応の位置の両方は、アミノ酸位置の共
変ペアで最も頻出するアミノ酸残基で置換される。

ｓｃＦｖ配列での突然変異のためのアミノ酸位置の割り出しのための本発明の配列に基
づく方法は、ｓｃＦｖの構造分析を可能にする他の方法と組み合わせることができる。例
えば、一実施態様において、該配列に基づく方法は、ｓｃＦｖの構造を更に分析するため
に、分子モデリング法と組み合わせることができる。このように、一実施態様においては
、工程ａ）〜ｄ）を有する前記の方法は、更に、以下の工程、例えば：
ｅ）ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を分子モデリングに供する工
程；及び
ｆ）突然変異のための、ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列内の少な
くとも１つの付加的なアミノ酸位置を割り出す工程
を含んでよい。この方法は、更に、分子モデリングによって突然変異のために割り出され
たｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列内の少なくとも１つの付加的な
アミノ酸位置を突然変異することを含む。

もう一つの態様においては、本発明は、本発明の方法により製造されたｓｃＦｖ組成物
であって、突然変異のために割り出された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置で１も
しくはそれより多くの突然変異がなされているｓｃＦｖ組成物に関する。医薬品製剤であ
って、一般にｓｃＦｖ組成物と製剤学的に認容性の担体とを含む製剤も提供される。

更にもう一つの態様においては、本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であって該ｓｃＦｖ
がＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を有するものにおける突然変異のために１もしくはそれより
多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す方法において：
ａ）Ｖ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列の第一のデータベースを提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能的特性を有するものとして選択されたｓｃＦｖ抗体のＶ
_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースの各フレームワーク位置と第二のデータベースの各フレームワー
ク位置でのアミノ酸変動性を決定すること；
ｄ）アミノ酸の変動性の度合いが第一のデータベースと第二のデータベースとの間で異な
る１もしくはそれより多くのフレームワーク位置を割り出すことで、単鎖抗体（ｓｃＦｖ
）における突然変異のための１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割
り出すこと
を含む方法を提供する。

好ましくは、各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性は、シンプソンの指数を使用し
た保存の度合いの割り当てによって決定される。一実施態様においては、１もしくはそれ
より多くのフレームワークアミノ酸位置は、第一のデータベースと比較した場合により低
いシンプソンの指数値（ＳＩ）を第二のデータベース中で有する１もしくはそれより多く
のフレームワークアミノ酸位置に基づいて突然変異のために割り出される。もう一つの実
施態様においては、１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置は、第一のデ
ータベース（例えば生殖細胞系データベース）と比較した場合により高いシンプソンの指
数値を第二のデータベース中で有する１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸
位置に基づいて突然変異のために割り出される。好ましい一実施態様においては、第二の
データベース（例えばＱＣデータベース）のアミノ酸位置は、第一のデータベース（例え
ばＫａｂａｔデータベース）における相応のアミノ酸位置のＳＩ値よりも、少なくとも０
．０１小さいＳＩ値を有し、より好ましくは０．０５（例えば０．０６、０．０７、０．
０８、０．０９もしくは０．１）小さいＳＩ値を有する。より好ましい実施態様において
は、第二のデータベースのアミノ酸位置は、第一のデータベースにおける相応のアミノ酸
位置のＳＩ値よりも、少なくとも０．１小さい（例えば０．１、０．１５、０．２、０．
２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５もしくは０．５小さい）ＳＩ値を有する。

もう一つの実施態様においては、本発明は、イムノバインダーにおいて置換のために好
ましいアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）群分けされたＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔファミリーサブタイ
プにより群分けされた生殖細胞系及び／又は成熟抗体の配列）の第一のデータベースを提
供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして（例えばＱＣアッセイにより）
選択された群分けされたｓｃＦｖ抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列の第二のデータベ
ースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワ
ーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること；
ｄ）該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより高い頻度で第二
のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のた
めに好ましいアミノ酸残基（すなわち、濃縮された残基）として割り出すこと
を含む方法を提供する。

更にもう一つの態様においては、本発明は、イムノバインダーから排除されるべきアミ
ノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）群分けされたＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔファミリーサブタイ
プにより群分けされた生殖細胞系及び／又は成熟抗体の配列）の第一のデータベースを提
供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして（例えばＱＣアッセイにより）
選択された群分けされたｓｃＦｖ抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列の第二のデータベ
ースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワ
ーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること；
ｄ）該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより低い頻度で第二
のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のた
めに好ましくないアミノ酸残基として割り出すこと（その際、前記のアミノ酸残基の種類
は好ましくないアミノ酸残基（すなわち排除された残基）である）
を含む方法を提供する。ある特定の好ましい実施態様においては、好ましくないアミノ酸
残基は、濃縮係数（ＥＦ）が１未満である場合に割り出される。

ある特定の実施態様においては、第一のデータベースは、生殖細胞系のＶ_H、Ｖ_Lもしく
はＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を含む。他の実施態様においては、第一のデータベースは、
生殖細胞系のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列からなる。更にもう一つの実施
態様においては、第一のデータベースは、成熟のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸
配列を含む。もう一つの実施態様においては、第一のデータベースは、成熟のＶ_H、Ｖ_Lも
しくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列からなる。例示的な一実施態様においては、成熟のＶ_H
、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ）からで
ある。

ある特定の実施態様においては、第二のデータベースは、ＱＣアッセイから選択された
、ｓｃＦｖ抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を含む。もう一つの実施態
様においては、第二のデータベースは、ＱＣアッセイから選択された、ｓｃＦｖ抗体のＶ
_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列からなる。

一実施態様においては、望ましい機能特性は、改善された安定性である。もう一つの実
施態様においては、望ましい機能特性は、改善された可溶性である。更にもう一つの実施
態様において、望ましい機能特性は非凝集である。なおももう一つの実施態様において、
望ましい機能特性は発現での改善（例えば原核細胞において）である。更にもう一つの実
施態様において、機能特性は、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における
改善である。一定の実施態様において、望ましい機能特性は、抗原結合親和性の改善では
ない。もう一つの実施態様においては、１もしくはそれより多くの所望の機能の組合せが
達成される。

なおもう一つの態様において、本発明は、イムノバインダーのエンジニアリング方法に
おいて：
ａ）該イムノバインダー内で突然変異のための１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を
選択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させ
ること
を含み、
突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が重鎖アミノ酸位置
である場合に、前記のアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用した位置１、６、７、
１０、１２、１３、１４、１９、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８
２、８６、８７、８９、９０、９２、９５、９８、１０３及び１０７（Ｋａｂａｔナンバ
リングを使用したアミノ酸位置１、６、７、９、１１、１２、１３、１８、１９、２０、
３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６、７８、７９、８１、８２ｂ、
８４、８９及び９３）からなる群から選択され、かつ
突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が軽鎖アミノ酸位置
である場合に、前記のアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用した位置１、２、３、
４、７、１０、１１、１２、１４、１８、２０、２４、４６、４７、５０、５３、５６、
５７、７４、８２、９１、９２、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使
用したアミノ酸位置１、２、３、４、７、１０、１１、１２、１４、１８、２０、２４、
３８、３９、４２、４５、４８、４９、５８、６６、７３、７４、７６、８３及び８５）
からなる群から選択される前記方法を提供する。

一実施態様においては、本発明は、イムノバインダーをエンジニアリングする方法であ
って：
ａ）突然変異のためにイムノバインダー内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選
択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させ
ること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位
置は、
（ｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３
（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、７８及び８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、６、１２、１３、１
４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ
酸位置１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３
、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０
７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、
２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）；
（ｉｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、
５０、５７、９１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、
４、２４、３９、４２、４９、７３及び８５）；
（ｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、
２０、５６、７４、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ
酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３及び８５）；及び
（ｖｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１
４、４６、５３、８２、９２及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位
置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４及び８５）
からなる群から選択される前記方法を提供する。

もう一つの実施態様においては、前記突然変異は、更に、ＡＨｏナンバリングを使用し
たアミノ酸位置１２、１３及び１４４（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置
１２、８５及び１０３）からなる群から選択される重鎖アミノ酸位置の１もしくはそれよ
り多くの（好ましくは全ての）鎖置換を含む。

ある特定の好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれ
より多くのアミノ酸位置は、少なくとも１つの望ましい機能特性を有するとして（例えば
酵母ＱＣシステムにおいて）選択された抗体配列における相応のアミノ酸位置で見出され
たアミノ酸残基へと突然変異される。更に他の実施態様においては、突然変異のために選
択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、本発明の濃縮／排除分析の方法論に
従って割り出されたアミノ酸残基（例えば"濃縮されたアミノ酸残基"）へと突然変異され
る。

好ましくは、イムノバインダーはｓｃＦｖであるが、他のイムノバインダー、例えば全
長免疫グロブリン及び他の抗体フラグメント（例えばＦａｂもしくはＤａｂ）も、該方法
に従ってエンジニアリングすることができる。本発明は、また、当該エンジニアリング方
法に従って製造されたイムノバインダー並びに該イムノバインダーと製剤学的に認容性の
担体とを含む組成物を包含する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
イムノバインダーにおける特定の位置での置換のための１もしくはそれより多くのアミ
ノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）サブタイプにより群分けされたＶ _H 及び／又はＶ _L のアミノ酸配列の第一のデータベー
スを提供する工程；
ｂ）サブタイプにより群分けされ、かつ少なくとも１つの所望の機能特性を有するものと
して選択されたＶ _H 及び／又はＶ _L のアミノ酸配列の第二のデータベースを提供する工程；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワ
ーク位置でのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定する工程；
ｄ）該アミノ酸残基を、（ｉ）該アミノ酸が１より大きい濃縮係数を有する場合に、イム
ノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のための好ましいアミノ酸残基として割り出
し、又は（ｉｉ）該アミノ酸残基が１未満の濃縮係数を有する場合に、イムノバインダー
の相応のアミノ酸位置で排除されるべきアミノ酸残基として割り出す工程
を含む前記方法。
（項目２）
項目１に記載の方法において、工程ｄ）のアミノ酸残基が４〜６の濃縮係数を有する
前記方法。
（項目３）
項目１又は２に記載の方法において、第一のデータベースが、生殖細胞系のＶ _H 、Ｖ _L
もしくはＶ _H 及びＶ _L のアミノ酸配列を含む前記方法。
（項目４）
項目１から３までのいずれか１項に記載の方法において、第一のデータベースが、生
殖細胞系のＶ _H 、Ｖ _L もしくはＶ _H 及びＶ _L のアミノ酸配列からなる前記方法。
（項目５）
項目１から４までのいずれか１項に記載の方法において、第一のデータベースが、成
熟のＶ _H 、Ｖ _L もしくはＶ _H 及びＶ _L のアミノ酸配列を含む前記方法。
（項目６）
項目１から５までのいずれか１項に記載の方法において、第一のデータベースが、成
熟のＶ _H 、Ｖ _L もしくはＶ _H 及びＶ _L のアミノ酸配列からなる前記方法。
（項目７）
項目５又は６に記載の方法において、成熟のＶ _H 、Ｖ _L もしくはＶ _H 及びＶ _L のアミノ酸
配列が、Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ）からの配列である前記方法。
（項目８）
項目１から７までのいずれか１項に記載の方法において、第二のデータベースが、Ｑ
Ｃアッセイから選択されたｓｃＦｖ抗体のＶ _H 、Ｖ _L もしくはＶ _H 及びＶ _L のアミノ酸配列を
含む前記方法。
（項目９）
項目１から７までのいずれか１項に記載の方法において、第二のデータベースが、Ｑ
Ｃアッセイから選択されたｓｃＦｖ抗体のＶ _H 、Ｖ _L もしくはＶ _H 及びＶ _L のアミノ酸配列か
らなる前記方法。
（項目１０）
Ｖ _H 及び／又はＶ _L のアミノ酸配列を有するイムノバインダーを改善する方法であって：
ａ）突然変異のための１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す
工程；
ｂ）工程ａ）で割り出されたそれぞれの特定のフレームワーク位置について、置換のため
に好ましいアミノ酸残基を割り出す工程；及び
ｃ）それぞれの特定のフレームワーク位置のアミノ酸残基を、工程ｂ）で割り出された好
ましいアミノ酸残基へと突然変異させる工程
を含む前記方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法において、工程ａ）を、所定のフレームワーク位置での変動性
の度合いを決定することによって実施する前記方法。
（項目１２）
項目１０又は１１に記載の方法において、工程ａ）を、保存の度合いをシンプソンの
指数を使用して各フレームワーク位置に割り当てることによって実施する前記方法。
（項目１３）
項目１０から１２までのいずれか１項に記載の方法において、工程ｂ）の好ましいア
ミノ酸残基を、項目１から９までのいずれか１項に記載の方法により割り出す前記方法。
（項目１４）
重鎖可変領域もしくはそのフラグメント及び／又は軽鎖可変領域もしくはそのフラグメ
ントを含むイムノバインダーの機能特性を改善するための方法であって：
ａ）該イムノバインダー内で突然変異のための１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を
選択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させ
ること
を含み、
突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が重鎖アミノ酸位置
である場合に、前記のアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用した位置１、６、７、
１０、１２、１３、１４、１９、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８
２、８６、８７、８９、９０、９２、９５、９８、１０３及び１０７（Ｋａｂａｔナンバ
リングを使用したアミノ酸位置１、６、７、９、１１、１２、１３、１８、１９、２０、
３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６、７８、７９、８１、８２ｂ、
８４、８９及び９３）からなる群から選択され、かつ
突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が軽鎖アミノ酸位置
である場合に、前記のアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用した位置１、２、３、
４、７、１０、１１、１２、１４、１８、２０、２４、４６、４７、５０、５３、５６、
５７、７４、８２、９１、９２、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使
用したアミノ酸位置１、２、３、４、７、１０、１１、１２、１４、１８、２０、２４、
３８、３９、４２、４５、４８、４９、５８、６６、７３、７４、７６、８３及び８５）
からなる群から選択される前記方法。
（項目１５）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーが、ＶＨ３重鎖可変領域を含み、
かつ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナン
バリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３（Ｋａｂａｔナン
バリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、７８及び８９）からなる群から選択される
前記方法。
（項目１６）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーがＶＨ１ａ重鎖可変領域を含み、
かつ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナン
バリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９
０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、１１
、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）からなる群から選択される前
記方法。
（項目１７）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーがＶＨ１ｂ重鎖可変領域を含み、
かつ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナン
バリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、
４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０７（Ｋａｂａｔナンバ
リングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４
３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）からなる群から選択される前記方法。
（項目１８）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーがＶκ１軽鎖可変領域を含み、か
つ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバ
リングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１及び
１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、４、２４、３９、４２
、４９、７３及び８５）からなる群から選択される前記方法。
（項目１９）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーがＶκ３軽鎖可変領域を含み、か
つ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナンバ
リングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、
９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２、３、１０
、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３及び８５）からなる群から選択される前記
方法。
（項目２０）
項目１４に記載の方法において、突然変異のために選択された１もしくはそれより多
くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、
７、１１、１４、４６、５３、８２、９２及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用し
たアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４及び８５）からな
る群から選択される前記方法。
（項目２１）
項目１４から２０までのいずれか１項に記載の方法において、突然変異が、更に、Ａ
Ｈｏナンバリングを使用したアミノ酸位置１２、１３及び１４４（Ｋａｂａｔナンバリン
グを使用したアミノ酸位置１２、８５及び１０３）からなる群から選択される重鎖アミノ
酸位置の１もしくはそれより多くの（好ましくは全ての）鎖置換を含む前記方法。
（項目２２）
項目１４から２１までのいずれか１項に記載の方法において、突然変異のために選択
された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、ＱＣアッセイから選択された抗体配列
における相応のアミノ酸位置で見出されたアミノ酸残基へと突然変異させる前記方法。
（項目２３）
項目１４から２２までのいずれか１項に記載の方法において、突然変異のために選択
された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、項目１から９までのいずれか１項に
記載の方法により割り出されるアミノ酸残基へと突然変異させる前記方法。
（項目２４）
項目１から２３までのいずれか１項に記載の方法において、イムノバインダーが、ｓ
ｃＦｖ抗体、全長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂもしくはナノボディーで
ある前記方法。
（項目２５）
項目１から９又は項目１４から２４までのいずれか１項に記載の方法において、機
能特性が、改善された安定性、改善された可溶性、非凝集、発現の改善、封入体精製工程
に引き続く再フォールディング率における改善又は前記の改善の２もしくはそれより多く
の組み合わせである前記方法。
（項目２６）
項目２５に記載の方法において、発現の改善が原核細胞において確認される前記方法。
（項目２７）
項目１から９及び２５から２６までのいずれか１項に記載の方法において、機能特性
が抗原結合親和性における改善ではないことを条件とする前記方法。
（項目２８）
項目１から２７までのいずれか１項に記載の方法により製造されたイムノバインダー。
（項目２９）
項目２８に記載のイムノバインダーと、製剤学的に認容性の担体とを含む組成物。

図１は、本発明の方法によるｓｃＦｖの一般的な配列に基づく分析の概要を示すフローチャート図である。 図２は、ｓｃＦｖの配列に基づく分析に関する例示的な多工程法のフローチャート図である。 図３は、酵母における安定で可溶性のｓｃＦｖの選択のための例示的なクオリティー・コントロール（ＱＣ）システムの概略図である。 図４は、もう一つの例示的なクオリティー・コントロール（ＱＣ）システムの概略図である。 図５は、体細胞突然変異の前の本来の生殖細胞系の配列内の特定のフレームワーク（ＦＷ）位置での変動性と、ＱＣシステムで選択された体細胞突然変異の後の成熟抗体の配列内の相応するＦＷ位置での変動性の分析の概略図である。 図６は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘発ストレス後にＥＳＢＡ１０５変異体について観察された変性プロフィールを示している。 図７は、コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２、Ｄ−３）、アラニンへの突然変異（Ｄ−１）もしくはＱＣ残基（ＱＣ７．１、ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、ＱＣ２３．２）のいずれかを含む一組のＥＳＢＡ１０５変異体についての熱安定性の比較を示している。 図８は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘発ストレス後にＥＳＢＡ２１２変異体について観察された変性プロフィールを示している。 図９は、野生型ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体のＰＥＧ沈殿可溶性曲線を示している。 図１０は、広い温度範囲（２５〜９６℃）での熱負荷後に測定された、野生型ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体についての熱変性プロフィールを示している。 図１１は、熱ストレスの条件下で２週間インキュベートした後の、様々なＥＳＢＡ１０５可溶性突然変異体の分解挙動を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。

以下の発明の詳細な説明を考慮することで、本発明はより良好に理解され、かつ前記に
示されるもの以外の対象物も明らかになる。斯かる説明は、付随する図面について言及し
ている：
図１は、本発明の方法によるｓｃＦｖの一般的な配列に基づく分析の概要を示すフロー
チャート図である。

第一工程において、可溶性及び安定性を改善させるべきｓｃＦｖの配列を提供し（ボッ
クス１）、引き続き該配列を、抗体配列データベース（ボックス２）、例えばオープンソ
ースの生殖細胞系の配列データベース（例えばＶｂａｓｅ、ＩＭＧＴ；ボックス３）、オ
ープンソースの成熟抗体の配列データベース（例えばＫＤＢ；ボックス４）又は完全なヒ
トの安定かつ可溶性のｓｃＦｖフラグメントのデータベース（例えばＱＣ；ボックス５）
と比較する。

ボックス３に記載されるようなオープンソースの生殖細胞系の配列データベースを適用
することによって、進化の過程で淘汰されたため、全長抗体コンテクスト中の可変ドメイ
ンの安定性に寄与すると思われる、高度に保存された位置の割り出しが可能となる（ボッ
クス３′）。オープンソースの成熟抗体の配列データベース４との比較によって、それぞ
れのＣＤＲとは無関係の安定性、可溶性及び／又は結合性の改善を表すパターンの割り出
しが可能となる（ボックス４′）。更に、完全にヒトの安定かつ可溶性のｓｃＦｖフラグ
メントのデータベース（ボックス５）との比較によって、特にｓｃＦｖの形式で安定性及
び／又は可溶性に決定的な残基の割り出しに加えて、特にｓｃＦｖの形式、例えばＶ_L及
びＶ_Hの組み合わせで、それぞれのＣＤＲとは無関係な安定性、可溶性及び／又は結合性
の改善を示すパターンの割り出しがもたらされる（ボックス５′）。

後続工程（ボックス６）において、決定的な残基は、それぞれのデータベースで割り出
される最も頻出する好適なアミノ酸によって置換がなされる。

最後に（ボックス７）、決定的な残基の無作為なもしくは指向的な突然変異誘発と、そ
れに引き続く酵母のＱＣ−システムにおける改善された安定性及び／又は可溶性について
のスクリーニングが実施されうる。それらの突然変異体は、再び上述の手順に供してよい
（ボックス２への矢印）。

図２は、ｓｃＦｖの配列に基づく分析に関する例示的な多工程法のフローチャート図で
ある。

第一工程（ボックス１）において、フレームワーク中の全ての残基の頻度が、各位置で
の種々のアミノ酸の出現率をバイオインフォマティックツールによって提供された結果に
基づき比較することによって決定される。第二工程において、各位置での保存の度合いが
、例えばシンプソンの指数を使用することによって式Ｄ＝Σｎｉ（ｎｉ−１）／Ｎ（Ｎ−
１）を用いて定義される。第三工程において、全体の自由エネルギーを最小にする最良の
置換が決定される（例えばボルツマンの法則：ΔΔＧｔｈ＝−ＲＴｌｎ（ｆ_親／ｆ_{コンセ
ンサス}）に当てはめることによって）。最後に（工程４）、潜在的な安定化突然変異の役
割が確かめられる。このために、局所的な及び非局所的な相互作用、カノニカル残基、イ
ンターフェース、曝露度及びβ−ターン性などの要因を考慮することができる。

図３は、酵母における安定で可溶性のｓｃＦｖの選択のための例示的なクオリティー・
コントロール（ＱＣ）システムの概略図である。このシステムで、還元性環境において安
定で可溶性のｓｃＦｖを発現可能な宿主細胞が、安定で可溶性のｓｃＦｖ−ＡＤ−Ｇａｌ
１１ｐ融合タンパク質の存在に依存して発現される誘導性のリポーター構築物の存在によ
り選択される。該融合タンパク質とＧａｌ４（１−１００）との相互作用は、機能的な転
写因子を形成し、それにより選択可能なマーカーの発現が活性化される（図３Ａを参照の
こと）。不安定な及び／又は不溶性のｓｃＦｖは、機能的な転写因子の形成と選択可能な
マーカーの発現の誘導をすることができず、従って選択から排除される（図３Ｂ）。選択
されたｓｃＦｖは、安定で可溶性のタンパク質を、ジスルフィド結合が折り畳まれない還
元性条件下でさえも、折り畳まれて得ることができるが、一方で、不安定な及び／又は不
溶性のｓｃＦｖは、折り畳まれず、凝集し、かつ／又は分解する傾向がある。酸化性条件
下では、選択されたｓｃＦｖは、依然として優れた可溶性と安定性という特性を呈する。

図４は、もう一つの例示的なクオリティー・コントロール（ＱＣ）システムの概略図で
ある。可溶性のｓｃＦｖを選択するための全体的なコンセプトは、この場合でも図３に記
載したものと同じであるが、ｓｃＦｖは、活性化ドメイン（ＡＤ）及びＤＮＡ結合ドメイ
ン（ＤＢＤ）を含む機能的な転写因子に直接的に融合されている。図４Ａは、機能的な転
写因子に融合された場合に、選択可能なマーカーの転写を妨げない、例示的な可溶性で安
定なｓｃＦｖを図示している。それに対して、図４Ｂは、不安定なｓｃＦｖが転写因子に
融合されることで、選択可能なマーカーの転写を活性化することができない非機能的な融
合構築物をもたらすというシナリオを示している。

図５は、体細胞突然変異の前の本来の生殖細胞系の配列内の特定のフレームワーク（Ｆ
Ｗ）位置での変動性と、ＱＣシステムで選択された体細胞突然変異の後の成熟抗体の配列
内の相応するＦＷ位置での変動性の分析の概略図である。種々の変動性値が、生殖細胞系
とＱＣ配列内のそれぞれのＦＷ位置（例えば高度に変動性のフレームワーク残基（"ｈｖ
ＦＲ"））に割り当てられうる（すなわち、それぞれ"Ｇ"値及び"Ｑ"値）。ある特定の位
置についてＧ＞Ｑである場合には、その位置には、限られた数で好適な安定なＦＷ残基が
存在する。ある特定の位置についてＧ＜Ｑである場合には、このことは、その残基が最適
な可溶性及び安定性について自然淘汰されていることを示しうる。

図６は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘発ストレス後にＥＳＢＡ１０５変異体につい
て観察された変性プロフィールを示している。生殖細胞系コンセンサス残基への逆突然変
異（Ｖ３Ｑ、Ｒ４７ＫもしくはＶ１０３Ｔ）を有するＥＳＢＡ−１０５変異体は、点線で
示されている。本発明の方法によって割り出された好ましい置換を含む変異体（ＱＣ１１
．２、ＱＣ１５．２及びＱＣ２３．２）は、実線によって示されている。

図７は、コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２、Ｄ−３）、アラニンへの突然変異
（Ｄ−１）もしくはＱＣ残基（ＱＣ７．１、ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、ＱＣ２３．２
）のいずれかを含む一組のＥＳＢＡ１０５変異体についての熱安定性の比較を示している
。各変異体の熱安定性（任意のアンフォールディング単位で）が提供される。

図８は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘発ストレス後にＥＳＢＡ２１２変異体につい
て観察された変性プロフィールを示している。生殖細胞系コンセンサス残基への逆突然変
異（Ｖ３ＱもしくはＲ４７Ｋ）を有するＥＳＢＡ２１２変異体は、点線で示されている。
ＥＳＢＡ２１２親分子は、実線によって示されている。

図９は、野生型ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体のＰＥＧ沈殿可溶性曲線を示して
いる。

図１０は、広い温度範囲（２５〜９６℃）での熱負荷後に測定された、野生型ＥＳＢＡ
１０５及びその可溶性変異体についての熱変性プロフィールを示している。

図１１は、熱ストレスの条件下で２週間インキュベートした後の、様々なＥＳＢＡ１０
５可溶性突然変異体の分解挙動を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。

発明の詳細な説明
本発明は、安定性、可溶性及び親和性を制限されることなく含む、イムノバインダーの
特性、特にｓｃＦｖの特性を、配列に基づきエンジニアリングして、最適化するための方
法に関する。より具体的には、本発明は、突然変異させることで、ｓｃＦｖの１もしくは
それより多くの物理的特性が改善されるｓｃＦｖ内のアミノ酸位置を割り出す抗体配列分
析を用いてｓｃＦｖ抗体を最適化するための方法を開示している。本発明は、また、本発
明の方法により製造された、エンジニアリングされたイムノバインダー、例えばｓｃＦｖ
に関する。

本発明は、少なくとも部分的に、複数の抗体配列のデータベースにおける、重鎖と軽鎖
のそれぞれのフレームワーク位置でのアミノ酸の頻度の分析に基づいている。特に、生殖
細胞系データベース及び／又は成熟抗体データベースの頻度の分析は、所望の機能特性を
有するものとして選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの頻度分析と比較されている。
変動性の度合いを各フレームワーク位置に割り当て（例えばシンプソンの指数を用いて）
、そしてその各フレームワーク位置での変動性の度合いを種々のタイプの抗体配列データ
ベース内で比較することによって、目下、ｓｃＦｖの機能特性（例えば安定性、可溶性）
に重要なフレームワーク位置を割り出すことができた。これは、目下、フレームワークの
アミノ酸位置に対する"機能的コンセンサス"を定義することを可能にする。その際、生殖
細胞系及び／又は成熟の抗体免疫グロブリン配列における相応の位置よりも変動性に許容
性が高いか低いかのいずれかであるフレームワーク位置が割り出されている。このように
、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの使用の使用に基づいて、
"機能的コンセンサス"アプローチの利点を提供し、かつ実証している。更になおも、本発
明は、本願に記載される"機能的コンセンサス"アプローチを使用して割り出された特定の
フレームワークアミノ酸位置を突然変異させることによる、イムノバインダー（例えばｓ
ｃＦｖ）のエンジニアリングの方法を提供する。

本発明をより容易に理解できるようにするために、特定の用語をまず定義する。特に定
義がなされない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する
技術分野における通常の知識を有するものによって通常理解されるのと同じ意味を有する
。本願に記載されるのと類似のもしくは同等の方法及び材料を本発明の実施もしくは試験
において使用できるが、好適な方法及び材料は、以下に記載される。本願に挙げられる全
ての文献、特許出願、特許及び他の参考資料は、参照をもってその全体が開示されたもの
とする。抵触の場合には、本願明細書が、それらの定義を含めて支配することとなる。更
に、材料、方法及び実施例は、説明的なものにすぎず、限定を意図するものではない。

本願で使用される用語"抗体"は、"免疫グロブリン"と同義である。本発明による抗体は
、全体の免疫グロブリン又は単独の可変ドメインなどの免疫グロブリンの少なくとも１種
の可変ドメインを含むそのフラグメント、つまり当業者によく知られるＦｖ（Ｓｋｅｒｒ
ａ Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０３
８−４１）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．他（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：
４２３−２６；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．他（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ′）２もしくは他のフラ
グメントであってよい。

本願で使用される用語"抗体フレームワーク"とは、ＶＬもしくはＶＨのいずれかの可変
ドメインの部分であって、この可変ドメインの抗原結合ループのための足場としてはたら
くものを指す（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨＰｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎ ９１−３２４２）。

本願で使用される用語"抗体ＣＤＲ"とは、抗体の相補性決定領域であって、Ｋａｂａｔ
，Ｅ．Ａ．他（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１−３２４
２によって定義される抗原結合ループからなるものを指す。抗体Ｆｖフラグメントの２つ
の可変ドメインのそれぞれは、例えば３つのＣＤＲを含む。

用語"単鎖抗体"又は"ｓｃＦｃ"は、抗体重鎖可変領域（Ｖ_H）及び抗体軽鎖可変領域（
Ｖ_L）を含み、それらがリンカーによって連結合されている分子を指すことが意図される
。斯かるｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ₂−Ｖ_L−リンカー−Ｖ_H−ＣＯＯＨ又はＮＨ₂−
Ｖ_H−リンカー−Ｖ_L−ＣＯＯＨを有してよい。

本願で使用される場合、"同一性"とは、２種のポリペプチド、分子又は２種の核酸の間
の配列の一致を指す。２つの比較された配列の両者のある位置が同じ塩基もしくはアミノ
酸モノマーサブユニットによって占められている場合に（例えば、２つのポリペプチドの
それぞれのある位置がリジンによって占められている場合に）、それぞれの分子は、その
位置で同一である。２種の配列の間の"パーセンテージの同一性"は、２種の配列によって
共有される一致した位置の数を比較された位置の数によって除算したものに１００を乗算
した関数である。例えば、２種の配列における１０個の位置の６個が一致している場合に
、それらの２種の配列は６０％の同一性を有する。一般に、２種の配列を最大の同一性と
なるようにアラインメントして比較がなされる。斯かるアラインメントは、例えばＮｅｅ
ｄｌｅｍａｎ他（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の方法を用
いて、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラ
ムによって適宜実行されて提供することができる。

"類似の"配列は、アライメントされた場合に、同一の及び類似のアミノ酸残基を共有す
るものであり、その際、類似の残基は、アライメントされた参照配列中の相応のアミノ酸
残基についての保存的置換である。この点に関しては、参照配列中の残基の"保存的置換"
は、相応の参照残基と物理的にもしくは機能的に類似の残基、例えば類似の大きさ、形状
、電荷、共有結合もしくは水素結合の形成能を含む化学特性などを有する残基による置換
である。このように、"保存的置換により修飾された"配列は、参照配列もしくは野生型配
列とは異なるものであり、１もしくはそれより多くの保存的置換が存在する配列である。
２種の配列の間の"パーセンテージの類似性"は、２種の配列によって共有される一致した
残基もしくは保存的置換を含む位置の数を比較された位置の数によって除算したものに１
００を乗算した関数である。例えば、２種の配列における１０個の位置の６個が一致し、
かつ１０個の位置の２個が保存的置換を含む場合に、それらの２種の配列は、８０％の正
の類似性を有する。

本願で使用される"アミノ酸コンセンサス配列"とは、少なくとも２種の、好ましくはそ
れより多くのアライメントされたアミノ酸配列の行列を用いて、かつそれぞれの位置での
最も頻出するアミノ酸を決定できるようなアライメントでギャップを許容して生成できる
アミノ酸配列を指す。コンセンサス配列は、それぞれの位置で最も頻出するアミノ酸を含
む配列である。２もしくはそれより多くのアミノ酸が単独の位置で等しく現れる場合に、
コンセンサス配列は、これらのアミノ酸の両方もしくは全てを含む。

タンパク質のアミノ酸配列は、様々なレベルで解析することができる。例えば、保存も
しくは変動は、単一残基レベル、多重残基レベル、ギャップありの多重残基などで表現す
ることができる。残基は、同一の残基の保存を表すか、又はクラスレベルで保存されるこ
とがある。アミノ酸クラスの例は、極性であるが、非荷電のＲ基（セリン、トレオニン、
アスパラギン及びグルタミン）；正に荷電したＲ基（リジン、アルギニン及びヒスチジン
）；負に荷電したＲ基（グルタミン酸及びアスパラギン酸）；疎水性のＲ基（アラジン、
イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン及び
チロシン）；並びに特殊なアミノ酸（システイン、グリシン及びプロリン）を含む。他の
クラスは、当業者に公知であり、かつ構造決定又は置換可能性を評価する他のデータを用
いて定義されることがある。その意味で、置換可能なアミノ酸とは、置換することができ
、その位置で機能的保存を維持できる任意のアミノ酸を指すことができる。

本願で使用される場合に、１つのアミノ酸配列（例えば第一のＶ_HもしくはＶ_L配列）を
１もしくはそれより多くの追加のアミノ酸配列（例えばデータベース中の１もしくはそれ
より多くのＶ_HもしくはＶ_L配列）とアラインメントする場合に、１つの配列（例えば第一
のＶ_HもしくはＶ_L配列）中のアミノ酸配列は、その１もしくはそれより多くの追加のアミ
ノ酸配列中の"相応の位置"と比較されうる。本願で使用される場合に、"相応の位置"は、
配列が最適にアラインメントされた場合、すなわち配列が最も高いパーセントの同一性も
しくはパーセントの類似性を達成するようにアラインメントされた場合、比較される配列
中の対応位置を表す。

本願で使用される場合に、用語"抗体データベース"とは、２もしくはそれより多くの抗
体アミノ酸配列のコレクションを指し、一般に、何十種、何百種、あるいは何千種に及ぶ
抗体アミノ酸配列のコレクションを指す。抗体データベースは、抗体Ｖ_H領域、抗体Ｖ_L領
域又はその両方のアミノ酸配列、例えばそのコレクションを蓄積するか、又はＶ_H及びＶ_L
領域を含むｓｃＦｖ配列のコレクションを蓄積しうる。好ましくは、該データベースは、
検索可能な固定化された媒体、例えば検索可能なコンピュータプログラム内のコンピュー
タに蓄積される。一実施態様においては、抗体データベースは、生殖細胞系の抗体配列を
含む又はそれらからなるデータベースである。もう一つの実施態様においては、抗体デー
タベースは、成熟（すなわち発現される）抗体配列を含むもしくはそれらからなるデータ
ベース（例えば成熟抗体配列のＫａｂａｔデータベース、例えばＫＢＤデータベース）で
ある。更にもう一つの実施態様においては、抗体データベースは、機能的に選択された配
列（例えばＱＣアッセイから選択された配列）を含むかあるいはそれらからなる。

用語"イムノバインダー"とは、イムノバインダーが特異的に標的抗原を認識する、抗体
の抗原結合部位の全てもしくは部分を含む分子、例えば重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメイ
ンの全てもしくは部分を含む分子を指す。イムノバインダーの限定されない例には、全長
免疫グロブリン分子及びｓｃＦｖ並びに抗体フラグメント、例えば限定されないが、（ｉ
）Ｆａｂフラグメント、つまりＶ_L、Ｖ_H、Ｃ_L及びＣ_H１ドメインからなる一価のフラグメ
ント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ′）₂フラグメント、つまり２つのＦａｂフラグメントを含みヒ
ンジ領域でジスルフィド橋によって連結された二価のフラグメント；（ｉｉｉ）実質的に
ヒンジ領域の部分を有するＦａｂであるＦａｂ′フラグメント（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ
ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ編、第三版、１９９３年）を参照）；（ｉｖ）Ｖ_H及び
Ｃ_H１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖｉ）Ｄａｂなどの単一ドメイン抗体（Ｗ
ａｒｄ他（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）であって、Ｖ_Hもしくは
Ｖ_Lドメインからなる抗体、つまりカメリド抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ他
、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）及びＤｕｍｏｕｌｉｎ他、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１：５００−５１５（２００２）を参照）もしくはサメ抗体
（例えばサメＩｇ−ＮＡＲ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））並びに（ｖｉｉ）ナノ
ボディー、つまり単独の可変ドメインと２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域が含まれ
る。

本願で使用される場合に、用語"機能特性"は、例えばポリペプチドの製造特性もしくは
治療効力を改善するために、当業者に改善（例えば従来のポリペプチドに対して）が望ま
れる及び／又は好ましい、ポリペプチド（例えばイムノバインダー）の特性である。一実
施態様において、機能特性は、改善された安定性（例えば熱安定性）である。もう一つの
実施態様において、機能特性は、改善された可溶性（例えば細胞条件下で）である。更に
もう一つの実施態様において、機能特性は非凝集である。なおももう一つの実施態様にお
いて、機能特性は発現での改善（例えば原核細胞において）である。更にもう一つの実施
態様において、機能特性は、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改
善である。一定の実施態様において、機能特性は、抗原結合親和性の改善ではない。

ｓｃＦｖの配列に基づく分析
本発明は、突然変異について選択されるｓｃＦｖ配列内でのアミノ酸位置の割り出しを
可能にするｓｃＦｖ配列の分析のための方法を提供する。突然変異について選択されたア
ミノ酸位置は、ｓｃＦｖの機能特性、例えば可溶性、安定性及び／又は抗原結合性に影響
することが予測されるものであって、その際、斯かる位置での突然変異が、ｓｃＦｖの性
能を改善すると予測されるものである。このように、本発明は、ｓｃＦｖ配列内でアミノ
酸位置を単純に無作為に突然変異するよりも焦点が絞られたｓｃＦｖのエンジニアリング
をして性能を最適化することができる。

ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析の一定の態様は、図１のフローチャートに図示されて
いる。この図に示されるように、最適化されるべきｓｃＦｖの配列は、安定で可溶性であ
ると選択されたｓｃＦｖ配列から構成される抗体データベースを含む１もしくはそれより
多くの抗体データベース中の配列と比較される。これは、特にｓｃＦｖの形式で安定性及
び／又は可溶性に決定的な残基の割り出し、並びに特にｓｃＦｖの形式で（例えばＶ_L及
びＶ_Hの組み合わせ）それぞれのＣＤＲとは独立した安定性、可溶性及び／又は結合性の
改善を示すパターンの割り出しを可能にしうる。決定的な残基が割り出されたら、それら
の残基は、例えばそれぞれのデータベース中で割り出された最も頻度の高い好適なアミノ
酸によって及び／又は無作為なもしくは指向的な突然変異誘発によって置換されうる。

このように、一態様では、本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であって該ｓｃＦｖがＶ_H
及びＶ_Lアミノ酸配列を有するものにおける突然変異のためのアミノ酸位置を割り出す方
法において、
ａ）ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を、多数の抗体のＶ_H、Ｖ_Lも
しくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を含むデータベースに入力して、該ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_L
もしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列とデータベースの該抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及び
Ｖ_Lのアミノ酸配列とをアラインメントさせることと、
ｂ）ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置と、データベースの抗体
のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸内の相応の位置とを比較することと、
ｃ）該ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置が、データベースの抗
体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されているアミノ酸残基によっ
て占められているかどうかを調べることと、
ｄ）該アミノ酸位置が、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸内の相応の位置
で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、該ｓｃＦｖのＶ_Hもし
くはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置を、突然変異のためのアミノ酸位置として割り
出すことと
を含む方法に関する。

このように、本発明の方法においては、関連するｓｃＦｖの配列（すなわちＶH、ＶLも
しくは両方の配列）は、抗体データベースの配列と比較され、その関連のｓｃＦｖ中のア
ミノ酸位置が、データベース中の配列の相応の位置において"保存"されているアミノ酸残
基によって占められているかどうかが調べられる。前記のｓｃＦｖ配列のアミノ酸位置が
、データベースの配列内の相応の位置で"保存"されていないアミノ酸残基によって占めら
れている場合に、そのｓｃＦｖのアミノ酸位置が、次いで突然変異のために選択される。
好ましくは、分析されるアミノ酸位置は、関連のｓｃＦｖ内のフレームワークのアミノ酸
位置である。更により好ましくは、関連のｓｃＦｖ内のすべてのフレームワークのアミノ
酸位置が分析されうる。選択的な一実施態様において、関連のｓｃＦｖの１もしくはそれ
より多くのＣＤＲ内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が分析されうる。更にもう
一つの実施態様において、関連のｓｃＦｖでの各アミノ酸位置が分析されうる。

アミノ酸残基が抗体データベースの配列内の特定のアミノ酸位置（例えばフレームワー
クの位置）で"保存"されているかどうかを調べるためには、特定の位置での保存度が計算
されうる。所定の位置でのアミノ酸多様度を定量できる、当該技術分野において知られる
種々の様式の選択肢が存在し、その全ては、本発明の方法に適用することができる。好ま
しくは、保存度は、多様度の尺度であるシンプソン多様度指数を使用して計算される。各
位置に存在するアミノ酸の数に加えて、各アミノ酸の相対存在度が考慮される。シンプソ
ン指数（Ｓ．Ｉ．）は、２種の無作為に選択された抗体配列が、ある位置に同じアミノ酸
を含む確率を表す。シンプソン指数は、保存度を測定する場合には、豊富さ及び均等度と
いった２つの主要な係数が考慮される。本願で使用される場合に、"豊富さ"は、特定の位
置に存在する異なるアミノ酸種の数の尺度である（すなわち、その位置でデータベースに
表される種々のアミノ酸残基の数が豊富さの尺度である）。本願で使用される場合に、"
均等度"は、特定の位置に存在する各アミノ酸の存在度の尺度である（すなわち、データ
ベースの配列内のその位置でアミノ酸残基が生ずる頻度が、均等度の尺度である）。

残基の豊富さは、それ自身で、特定の位置での保存度を調べるための尺度として使用で
きる一方で、ある位置に存在する各アミノ酸残基の相対頻度は考慮されない。それは、デ
ータベースの配列内の特定の位置で非常にまれに生ずるアミノ酸残基について、その同じ
位置で非常に頻繁に生ずるのと同等の重みづけとなることを示している。均等度は、ある
位置の豊富さを形作る種々のアミノ酸の相対存在度の尺度である。シンプソン指数は、豊
富さと均等度の両方を考慮に入れるので、それが、本発明により保存度を定量化する好ま
しい方法である。特に、非常に保存された位置での低い頻度の残基は、潜在的に問題があ
るものと見なされるため、突然変異のために選択されうる。

シンプソン指数のための式は、Ｄ＝Σｎ_i（ｎ_i−１）／Ｎ（Ｎ−１）であり、その際、
Ｎは、調査における（例えばデータベースにおける）配列の全数であり、かつｎは、分析
される位置での各アミノ酸残基の頻度である。データベースにおけるアミノ酸事象（ｉ）
の頻度は、該データベースで生ずるアミノ酸の回数（ｎ_i）である。回数ｎ_iそれ自身は、
相対頻度で示される。つまり、それらは事象の全数によって正規化される。最大多様度が
生ずる場合に、Ｓ．Ｉ．値はゼロであり、かつ最小多様度が生ずる場合に、Ｓ．Ｉ．値は
１である。このように、Ｓ．Ｉ．範囲は０〜１であり、多様度と指数値との間は逆数の関
係である。

データベースの配列内のフレームワークのアミノ酸位置の分析のための多重の工程をま
とめたフローチャートは、図２に更に詳細に記載される。

従って、前記方法の好ましい一実施態様においては、データベースの抗体のＶ_Hもしく
はＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置には、シンプソンの指数を使用して保存度が割り当
てられる。その相応の位置のＳ．Ｉ．値は、その位置の保存の指標として使用されうる。

他の実施態様において、密接に関連した抗体配列の信頼性のあるアラインメント（すな
わち、タンパク質構造の類似性が考慮される配列アラインメント）が、本発明において、
調べられた位置でのアミノ酸の相対存在度と保存度との行列の生成のために使用される。
これらの行列は、抗体−抗体データベース比較での使用のために設計される。それぞれの
残基の観察された頻度が計算され、期待された頻度（それは各位置についてのデータセッ
トにおける各残基の頻度である）と比較される。

所定のｓｃＦｖ抗体の記載された方法による分析は、所定のｓｃＦｖ抗体におけるある
特定の位置での生物学的に許容される突然変異及び普通でない残基についての情報を提供
し、かつこのフレームワーク内での潜在的な弱点の予測を可能にする。Ｓ．Ｉ．値と相対
頻度を基準として使用して、アミノ酸頻度データのセットに"最良に"当てはまるアミノ酸
置換のエンジニアリングには、定型作業を使用することができる。

前記の配列に基づく分析は、ｓｃＦｖのＶ_H領域か、ｓｃＦｖのＶ_L領域か、又はその両
方に適用することができる。このように、一実施態様においては、ｓｃＦｖのＶ_Hのアミ
ノ酸配列は、データベースに入力され、そして該データベースの抗体のＶ_Hのアミノ酸配
列とアラインメントされる。もう一つの実施態様においては、ｓｃＦｖのＶ_Lのアミノ酸
配列は、データベースに入力され、そして該データベースの抗体のＶ_Lのアミノ酸配列と
アラインメントされる。更にもう一つの実施態様においては、ｓｃＦｖのＶ_H及びＶ_Lのア
ミノ酸配列は、データベースに入力され、そして該データベースの抗体のＶ_H及びＶ_Lのア
ミノ酸配列とアラインメントされる。ある配列とデータベースにおける他の配列のコレク
ションとをアラインメントさせるためのアルゴリズムは、当該技術分野では十分に確立さ
れている。それらの配列は、配列間で最高のパーセントの同一性もしくは類似性が達成さ
れるようにアラインメントされる。

本発明の方法は、ｓｃＦｖ配列内の関連の１つのアミノ酸位置を分析するために使用す
ることができるか、又はより好ましくは、関連の多重のアミノ酸位置を分析するために使
用することができる。このように、前記方法の工程ｂ）では、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_L
のアミノ酸配列内の多重のアミノ酸位置を、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミ
ノ酸配列内の相応の位置と比較することができる。分析するのに好ましい位置は、ｓｃＦ
ｖのＶ_H及び／又はＶ_Lの配列内のフレームワーク位置である（例えば各Ｖ_H及びＶ_Lのフレ
ームワーク位置を分析することができる）。加えてあるいは択一的に、ｓｃＦｖの１もし
くはそれより多くのＣＤＲ内の１もしくはそれより多くの位置を分析することができる（
しかし、それはＣＤＲに関するアミノ酸位置を突然変異させるのに好ましくないことがあ
る。それというのも、ＣＤＲ内の突然変異は、フレームワーク領域内の突然変異よりも恐
らく抗原結合活性に影響するからである）。なおも更に、本発明の方法は、ｓｃＦｖのＶ
_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列内の各アミノ酸位置の分析を可能にする。

本発明の方法では、関連のｓｃＦｖの配列を、多様な異なる種類の抗体の配列データベ
ースの１もしくはそれより多くの中の配列と比較することができる。例えば、一実施態様
においては、データベースの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列は、生殖
細胞系の抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列である。もう一つの実施態様
においては、データベースの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列は、再配
置され親和性成熟した抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列である。更にも
う一つの好ましい実施態様においては、データベースの抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及び
Ｖ_Lのアミノ酸配列は、ｓｃＦｖ安定性もしくはｓｃＦｖ可溶性などの少なくとも１種の
所望の機能特性を有するように選択されたｓｃＦｖ抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lの
アミノ酸配列である（更に以下で議論される）。

抗体配列情報は、生殖細胞系の配列の配列アラインメントから、あるいは天然に存在す
る生殖細胞系の配列から得ること、収集すること、及び／又は生成することができる。そ
れらの配列のソースは、制限されないが、以下の１もしくはそれより多くのデータベース
を含むことができる：
・ Ｋａｂａｔデータベース（．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．Ｅｄｕ（２００７年
１０月現在）；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ（２００１年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．２９：２０５−２０６；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ（２０００年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１４−２１８）。２０００年からの生データは、米国のＦＴＰに
よって入手でき、かつ英国にミラーリングされている。

・ Ｋａｂａｔｍａｎは、利用者に配列の普通でない特徴についてＫａｂａｔ配列を検
索することを可能にし、かつ利用者に特定の抗体配列中のＣＤＲに関するカノニカルな割
り当ての発見を可能にするデータベースを含む。

・ ＡＡＡＡＡウェブサイト（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ（２００７年１０月現在））、Ａｎｎｅｍａｒｉｅ Ｈｏｎｅｇｇｅｒによって作製さ
れた抗体のページであり、抗体についての配列情報と構造データを提供している。

・ ＡＢＧ： 抗体の３Ｄ構造のディレクトリ − ＡｎｔｉｂｏｄｙＧｒｏｕｐ（
ＡＢＧ）によって作製されたディレクトリであり、それは利用者にタンパク質データバン
ク（ＰＤＢ）に収集された抗体構造へのアクセスを可能にする。該ディレクトリにおいて
、各ＰＤＢエントリは、全情報を回復容易にするためにオリジナルのソースへとハイパー
リンクを有している。

・ ＡＢＧ： マウスのＶH及びＶKの生殖細胞系セグメントの生殖細胞系の遺伝子ディ
レクトリ、それはメキシコ自治大学生物工学研究所ＵＮＡＭ（メキシコ国立大学）の抗体
グループのウェブページの一部である。

・ ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商
標）（Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ（モンペリエ第二大学、ＣＮＲＳ）によ
って１９８９年に作製）ＩＭＧＴは、ヒト及び他の脊椎動物種に関する免疫グロブリン、
Ｔ細胞受容体及び免疫系の関連タンパク質に特化した統合知識リソースである。ＩＭＧＴ
は、配列データベース（ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ、全て注釈付の配列についての翻訳を
有するヒト及び他の脊椎動物由来のＩＧ及びＴＲの包括的データベース、ＩＭＧＴ／ＭＨ
Ｃ−ＤＢ、ＩＭＧＴ／ＰＲＩＭＥＲ−ＤＢ）、ゲノムデータベース（ＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ
−ＤＢ）、構造データベース（ＩＭＧＴ／３Ｄ構造−ＤＢ）、ウェブリソース（ＩＭＧＴ
レパートリ）（ＩＭＧＴ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）
；ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ（２００７年１０月現在）；Ｌｅｆｒａｎｃ他（１９９９
年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２；Ｒｕｉｚ他（２０００
年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１；Ｌｅｆｒａｎｃ他（２
００１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：２０７−２０９；Ｌｅｆｒａｎｃ
他（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３０７−３１０）からなる
。

・ Ｖ ＢＡＳＥ − Ｇｅｎｂａｎｋ及びＥＭＢＬデータライブラリの最新リリース
中の配列を含む千種類の公表された配列から収集された全てのヒト生殖細胞系可変領域配
列の包括的ディレクトリ。

好ましい一実施態様においては、抗体配列情報は、還元性環境における高められた安定
性及び可溶性に関して選択された定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖライブラリ
ーから得られる。より好ましくは、還元性環境における高められた安定性及び可溶性を有
するｓｃＦｖフレームワークの細胞内選択を可能にする酵母クオリティー・コントロール
（ＱＣ）−システム（例えばＰＣＴ出願ＷＯ２００１／４８０１７号；米国出願番号２０
０１／００２４８３１号及びＵＳ２００３／００９６３０６号；米国特許第７，２５８，
９８５号及び第７，２５８，９８６号）が記載されている。このシステムにおいて、ｓｃ
Ｆｖライブラリーは、特定の公知の抗原を発現できる宿主細胞中に形質転換され、抗原−
ｓｃＦｖ相互作用の存在でのみ生存する。形質転換された宿主細胞は、抗原とｓｃＦｖの
発現に適していて、抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在でのみ細胞の生存が可能な条件下で培
養される。このように、生存している細胞で発現され、かつ還元性環境において安定で可
溶性の定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離することができる。従って、Ｑ
Ｃ−システムは、大きなｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングをして、それにより還元
性環境中で安定で可溶性のフレームワークを有するこれらの好ましいｓｃＦｖを単離する
ために使用することができ、かつこれらの選択されたｓｃＦｖの配列は、ｓｃＦｖ配列デ
ータベース中に収集することができる。斯かるｓｃＦｖデータベースは、次いで、関連の
他のｓｃＦｖ配列との本発明の方法を使用した比較のために使用することができる。ＱＣ
−システムを使用して事前に選択され定義された好ましいｓｃＦｖフレームワーク配列は
、更に詳細に、ＰＣＴ出願ＷＯ２００３／０９７６９７号及び米国出願第２００６００３
５３２０号に記載されている。

本来のＱＣ−システムの別形は、当該技術分野で公知である。図３に図解される一つの
例示的実施態様において、ｓｃＦｖライブラリーは、Ｇａｌ４酵母転写因子の活性化ドメ
イン（ＡＤ）に融合され、それはまたいわゆるＧａｌ１１ｐタンパク質（１１ｐ）の一部
に融合されている。そのｓｃＦｖ−ＡＤ−Ｇａｌ１１ｐ融合構築物は、次いで、宿主細胞
中に形質転換され、それは、Ｇａｌ４の最初の１００個のアミノ酸を発現し、こうしてＧ
ａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ；Ｇａｌ４（１−１００））を含む。Ｇａｌ１１ｐ
は、Ｇａｌ４（１−１００）に直接的に結合することが知られる点突然変異である（Ｂａ
ｒｂｅｒｉｓ他．Ｃｅｌｌ，８１：３５９（１９９５））。形質転換された宿主細胞は、
ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現に適しており、かつｓｃＦｖ融合タンパク質がＧａｌ４（
１−１００）と相互作用するのに十分に安定で可溶性であり、それによりＤＢＤに結合さ
れたＡＤを含む機能的転写因子を形成する（図３Ａ）場合にのみ細胞の生存が可能である
条件下で培養される。このように、生存している細胞で発現され、かつ還元性環境におい
て安定で可溶性の定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離することができる。
この例示的なＱＣシステムの更なる説明は、Ａｕｆ ｄｅｒＭａｕｅｒ他のＭｅｔｈｏｄ
ｓ，３４：２１５−２２４（２００４）に記載されている。

もう一つの例示的な実施態様において、本発明の方法で使用されるＱＣシステムを、図
４に示す。このバージョンのＱＣシステムでは、ｓｃＦｖもしくはｓｃＦｖライブラリー
が、機能的転写因子に直接的に融合され、そして選択可能なマーカーを含む酵母菌株で発
現される。その選択可能なマーカーは、機能的なｓｃＦｖ−転写因子融合物の存在下で活
性化されるだけである。それは、該構築物が全体として安定かつ可溶性である必要がある
ことを意味する（図４Ａ）。ｓｃＦｖが不安定である状況では、それは凝集物を形成し、
場合により分解され、それによりそこに融合された転写因子の分解も引き起こされること
で、選択可能なマーカーの発現をもはや活性化できなくなる（図４Ｂを参照）。

本発明の方法では、関連のｓｃＦｖの配列を、抗体データベース内の全ての配列と比較
することができるか、又は択一的に、データベース中の配列の選択された部分のみを比較
目的に使用することができるに過ぎない。すなわち、該データベースは、関連のｓｃＦｖ
との高い割合の類似性もしくは同一性を有するこれらの配列のみに限定又は制約すること
ができる。このように、本発明の方法の一実施態様においては、該データベースは、ｓｃ
Ｆｖ抗体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列と高い類似性を有するこれらの抗
体のＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列のみが含まれる制約されたデータベース
である。

関連のｓｃＦｖを該データベースに入力して、該データベース内の抗体の配列と比較さ
れると、配列情報が解析されて、所定の位置のアミノ酸の頻度と変動性についての情報が
提供され、そして潜在的に問題のあるアミノ酸位置、特にｓｃＦｖのフレームワーク内の
潜在的に問題のあるアミノ酸位置が予測される。斯かる情報は、また、ｓｃＦｖの特性を
改善する突然変異の設計にも使用できる。例えば、抗体可溶性は、溶媒曝露される疎水性
残基を、この位置にしばしば存在する親水性残基に置き換えることによって改善できる。

本発明の方法では、データベースの抗体の配列内の特定の位置で"保存"されうるアミノ
酸残基の多くの考えられる種類がある。例えば、１つの特定のアミノ酸残基は、その位置
で非常に高い頻度で見出されることがあり、それは、前記の特定のアミノ酸残基がその特
定の位置で好ましいことを示している。従って、該方法の一実施態様においては、工程ｃ
）で、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で保存される
アミノ酸残基は、該データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のその位置に
最も頻度の高いアミノ酸残基である。他の実施態様においては、その位置は、特定の種類
もしくはクラスのアミノ酸残基で"保存"されうる（すなわち、その位置は、単独の特定の
アミノ酸残基のみによって優先的に占められずに、むしろ、それぞれ同じ種類もしくはク
ラスの残基である幾つかの異なるアミノ酸残基によって優先的に占められる。例えば、工
程ｃ）で、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置は、（ｉ
）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結合を形成できる
アミノ酸残基又は（ｉｖ）β−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で保存されう
る。

該方法の工程ｄ）では、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置は
、該アミノ酸位置が、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位
置で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのア
ミノ酸位置として割り出される。あるアミノ酸位置を、"保存されていない"アミノ酸残基
によって占められているので、潜在的に問題があるとして割り出す状況は多数考えられる
。例えば、データベース内の相応のアミノ酸位置が疎水性残基で保存され、かつｓｃＦｖ
内の位置が親水性残基によって占められている場合に、この位置は、ｓｃＦｖにおいては
潜在的に問題となることがあり、その位置は突然変異のために選択することができる。同
様に、データベース内の相応のアミノ酸位置が親水性残基で保存され、かつｓｃＦｖ内の
位置が疎水性残基によって占められている場合に、この位置は、ｓｃＦｖにおいては潜在
的に問題となることがあり、その位置は突然変異のために選択することができる。このよ
うに、本願に開示される方法の好ましい一実施態様においては、疎水性アミノ酸残基は、
親水性残基によって置換され、又はその逆もある。更に他の場合には、データベース内の
相応のアミノ酸位置が水素結合を形成できるアミノ酸残基又はβシートを形成する性向を
有するアミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦｖ内の位置が、それぞれ水素結合を形成でき
ないアミノ酸残基又はβシートを形成する性向を有さないアミノ酸残基によって占められ
ている場合に、この位置は、ｓｃＦｖにおいては潜在的に問題となることがあり、その位
置は突然変異のために選択することができる。従って、本発明の方法のもう一つの好まし
い実施態様においては、水素結合を形成しうるアミノ酸残基は、β−シートを形成する性
向を有するアミノ酸残基によって置換され、又はその逆もある。

好ましい一実施態様においては、本発明で記載される方法は、単独で又は組み合わせて
使用することで、抗体の単鎖フラグメントの安定性及び／又は可溶性を改善するためのア
ミノ酸置換の組み合わせリストを作製することができる。

共分散分析
本発明は、また、データベース内の抗体の配列と比較した場合の、ｓｃＦｖの配列内で
の共分散を分析するための方法に関する。共変する残基は、例えば（ｉ）フレームワーク
領域（ＦＲ）中の残基及びＣＤＲ中の残基；（ｉｉ）あるＣＤＲ中の残基及び別のＣＤＲ
中の残基；（ｉｉｉ）あるＦＲ中の残基及び別のＦＲ中の残基；又は（ｉｖ）Ｖ_H中の残
基及びＶ_L中の残基であってよい。抗体の三次構造で互いに相互作用する残基は、好まし
いアミノ酸残基が、共変ペアの両方の位置で保存されうるように共変することができ、一
方の残基が変化したら他方の残基も抗体構造の位置のために同様に変化せねばならない。
一組のアミノ酸配列における共分散分析の実施方法は当業者に公知である。例えば、Ｃｈ
ｏｕｌｉｅｒ，Ｌ他（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ ４１：４７５−４８４は、ヒト及び
マウスの生殖細胞系のＶ_L及びＶ_Hの配列アラインメントに共分散分析を適用することを記
載している。

共分散分析は、保存されたアミノ酸位置を分析するための前記方法（前記方法中の工程
ａ）〜ｄ））と組み合わせることができ、こうして、該方法は更に、以下の工程：
ｅ）データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、
アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程；
ｆ）アミノ酸位置の共変ペアと、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位
置とを比較する工程；
ｇ）前記のｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの
抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸
残基によって占められているかどうかを決定する工程；及び
ｈ）前記のｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方
を、ｓｃＦｖ内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のＶ_Hもしくは
Ｖ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によっ
て占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む。

加えて又は選択的に、共分散分析は、それ自身で実施でき、こうして本発明は、以下の
工程：
ａ）データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、
アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程；
ｂ）アミノ酸位置の共変ペアと、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位
置とを比較する工程；
ｃ）前記のｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの
抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸
残基によって占められているかどうかを決定する工程；及び
ｄ）前記のｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方
を、ｓｃＦｖ内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のＶ_Hもしくは
Ｖ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によっ
て占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む方法を提供する。

本発明の共分散分析方法を使用して、１つの共変ペア又は１つより多くの共変ペアを分
析することができる。このように、該方法の一実施態様においては、アミノ酸位置の複数
の共変ペアがデータベースの抗体のＶ_H及び／又はＶ_Lのアミノ酸配列内で割り出され、そ
れは、ｓｃＦｖのＶ_H及び／又はＶ_Lのアミノ酸配列内で相応の位置と比較される。

該方法は、更に、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内のアミノ酸位
置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の一方
もしくは両方の相応の位置を突然変異することを含みうる。一実施態様において、アミノ
酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の
相応の位置の一方は、アミノ酸位置の共変ペアで最も頻出するアミノ酸残基で置換される
。もう一つの実施態様において、アミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残
基によって占められているｓｃＦｖ内の相応の位置の両方は、アミノ酸位置の共変ペアで
最も頻出するアミノ酸残基で置換される。

分子モデリング
潜在的に問題のある残基についてｓｃＦｖを分析するための本発明の配列に基づく方法
は、抗体の構造／機能の関連性を分析するための当業者に公知の他の方法と組み合わせる
ことができる。例えば、好ましい一実施態様においては、本発明の配列に基づく分析方法
は、付加的な潜在的に問題のある残基を割り出すために分子モデリングと組み合わされる
。ｓｃＦｖを含む抗体構造のコンピュータモデリングのための方法とソフトウェアは、当
該技術分野で確立されており、かつ本発明の配列に基づく方法と組み合わせることができ
る。このように、もう一つの実施態様においては、工程ａ）〜ｄ）で示される残基の配列
に基づく方法は、更に、以下の工程：
ｅ）ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を分子モデリングに供する工
程；及び
ｆ）突然変異のための、ｓｃＦｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列内の少な
くとも１つの付加的なアミノ酸位置を割り出す工程
を含む。該方法は、更に、分子モデリングによって突然変異のために割り出されたｓｃＦ
ｖのＶ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列内の少なくとも１つの付加的なアミノ酸
位置を突然変異することを含む。

"機能的コンセンサス"対"従来型コンセンサス"分析
特に好ましい一実施態様において、１もしくはそれより多くのフレームワーク位置での
変動性の度合いは、抗体の配列の第一のデータベース（例えば生殖細胞系データベース、
例えばＶｂａｓｅ及び／又はＩＭＧＴ）もしくは成熟抗体データベース（例えばＫＢＤ）
と、１もしくはそれより多くの所望の特性を有するものとして選択されたｓｃＦｖの第二
のデータベース、例えば酵母でのＱＣスクリーニングにより選択されたｓｃＦｖのデータ
ベース、すなわちＱＣデータベースとの間で比較される。図５で図説されるように、変動
性値（例えばシンプソンの指数値）を、第一の（例えば生殖細胞系）データベース内のフ
レームワーク位置に割り当てることができ、それは図５では"Ｇ"値と呼ばれ、かつ変動性
値（例えばシンプソンの指数値）を、第二のデータベース（例えばＱＣデータベース）内
の相応のフレームワーク位置に割り当てることができ、それは図５では"Ｑ"値として呼ば
れる。Ｇ値が特定の位置でＱ値よりも大きい場合に（すなわち、生殖細胞系配列において
その位置で選択されたｓｃＦｖの配列におけるよりも変動性が高い場合に）、これは、そ
の位置には制限された数の安定なｓｃＦｖフレームワークアミノ酸残基が存在することを
示しており、その安定なｓｃＦｖフレームワークアミノ酸残基は、任意のＣＤＲで使用す
るために好適なことがある。選択的に、Ｇ値が特定の位置でＱ値よりも小さい場合に（す
なわち、選択されたｓｃＦｖの配列においてその位置で生殖細胞系配列におけるよりも変
動性が高い場合に）、これは、その特定の位置がｓｃＦｖにおいて変動性の許容性が高い
ことを示し、こうしてその位置は、アミノ酸置換によってｓｃＦｖの安定性及び／又は可
溶性が最適化されうる位置を表すことがある。表Ａは、アミノ酸位置の番号と、高度に変
動性のフレームワーク残基（ｈｖＦＲ）であってＧがＱより大きいかＧがＱより小さいか
のいずれかである残基のまとめ表である。表Ａに示されるように、アミノ酸の全番号（Ａ
ａ＃）における変動性と、高度に変動性のフレームワーク残基（ｈｖＦＲ）における変動
性は、生殖細胞系とＱＣ−ＦＷとの間で大きく高まった。表Ａの作製のために分析された
配列は、ＱＣアッセイ（ＷＯ０３０９７６９７号に記載される；ここでは"Ｑ"として呼称
される）を使用して選択された約９０のｓｃＦｖの配列と、２００７年１０月にｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／
ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌから検索された全ての生殖細胞系のＶ_H及びＶ_Lの配列であった。表
Ａの分析のためには、Ｖ_H及びＶ_Lのドメインは、そのサブタイプによって群分けしなかっ
た。

表Ａ：まとめ表

上記を考慮すると、更にもう一つの態様においては、本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）
であって該ｓｃＦｖがＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列を有するものにおける突然変異のために
１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す方法において：
ａ）Ｖ_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列（例えば生殖細胞系及び／又は成熟の抗
体の配列）の第一のデータベースを提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能的特性を有するものとして選択されたｓｃＦｖ抗体のＶ
_H、Ｖ_LもしくはＶ_H及びＶ_Lのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースの各フレームワーク位置と第二のデータベースの各フレームワー
ク位置でのアミノ酸変動性を決定すること；
ｄ）アミノ酸の変動性の度合いが第一のデータベースと第二のデータベースとの間で異な
る１もしくはそれより多くのフレームワーク位置を割り出すことで、単鎖抗体（ｓｃＦｖ
）における突然変異のための１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割
り出すこと
を含む方法を提供する。

好ましくは、各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性は、シンプソンの指数を使用し
た保存の度合いの割り当てによって決定される。一実施態様においては、１もしくはそれ
より多くのフレームワークアミノ酸位置は、第一のデータベースと比較した場合により低
いシンプソンの指数値を第二の（ｓｃＦｖ）データベース中で有する１もしくはそれより
多くのフレームワークアミノ酸位置に基づいて突然変異のために割り出される。もう一つ
の実施態様においては、１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置は、第一
のデータベース（例えば生殖細胞系データベースもしくは成熟抗体データベース）と比較
した場合により高いシンプソンの指数値を第二のデータベース中で有する１もしくはそれ
より多くのフレームワークアミノ酸位置に基づいて突然変異のために割り出される。

３種のヒトのＶ_Hファミリーと３種のヒトのＶ_Lファミリーについての、変動性分析及び
突然変異のための残基の割り出しは、更に詳細に実施例２及び３で以下に記載する。

濃縮／排除分析
もう一つの態様においては、本発明は、（例えば安定性及び／又は可溶性などの機能特
性を改善するために）イムノバインダー内の関連のフレームワーク位置で好ましいアミノ
酸残基置換を選択するための（又は選択的に、特定のアミノ酸置換を排除するための）方
法を提供する。本発明の方法は、抗体配列の第一のデータベース（例えばＶｂａｓｅ及び
／又はＩＭＧＴなどの生殖細胞系データベースもしくは、より好ましくはＫａｂａｔデー
タベース（ＫＢＤ）などの成熟抗体データベース）における関連のフレームワーク位置で
のアミノ酸残基の頻度と、１もしくはそれより多くの所望の特性を有するものとして選択
されたｓｃＦｖの第二のデータベース、例えば酵母におけるＱＣスクリーニングによって
選択されたｓｃＦｖのデータベース、すなわちＱＣデータベースにおける相応のアミノ酸
位置でのアミノ酸残基の頻度とを比較する。

所定の位置のアミノ酸残基を、コンセンサス配列のアミノ酸残基に対して突然変異させ
るために確立された方法に反して、驚くべきことに、"機能的コンセンサス"アプローチは
、改善された所望の機能特性を有する抗体をもたらすことが判明した。これは、選択され
たフレームワーク中で一定の変動性の度合いを本来示す高度に保存された位置が、無作為
突然変異誘発に許容性であるべきであり、かつｓｃＦｖ形式の本来の残基より優れた代替
アミノ酸を見出す確率の増大を表すという事実によることがある。更に、稀なアミノ酸に
ついての顕著な優先性は、一定の残基に対する自然選択の指標である。これらの２つの統
計的指針に基づき、重鎖と軽鎖の中の種々の残基を、浮動性位置（変動許容性）もしくは
好ましい置換（普通でない残基）のいずれかとして選択できる。

ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、第一のデータベース、すなわち生殖細胞系デー
タベース及び／又は成熟抗体データベースに対して望ましい機能的特徴を有する配列を含
む第二のデータベースにおいて増大する場合に、それぞれの残基は、所定の位置で、ｓｃ
Ｆｖの安定性及び／又は可溶性を改善するために好ましい残基であると見なされる。その
反対に、ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、第二のデータベースにおいて第一のデー
タベースと比較して低下した場合に、そのそれぞれの残基を、その位置でのｓｃＦｖ形式
の状況で好ましくないものと見なす。

以下の実施例４に詳細に説明されるように、第一のデータベース（例えば成熟抗体配列
のデータベース）からの抗体配列（例えばＶ_HもしくはＶ_L配列）は、それらのＫａｂａｔ
ファミリーサブタイプ（例えばＶＨ１ｂ、ＶＨ３など）により群分けされうる。各配列サ
ブタイプ（すなわちサブファミリー）内で、各アミノ酸位置での各アミノ酸残基（例えば
Ａ、Ｖなど）の頻度は、そのサブタイプの全ての分析された配列のパーセンテージとして
決定される。同じことが、第二のデータベース（すなわち、１もしくはそれより多くの所
望の特性を有するものとして、例えばＱＣスクリーニングによって選択されたｓｃＦｖの
データベース）の全ての配列について行われる。各サブタイプについて、特定の位置での
各アミノ酸残基型について得られたパーセンテージ（相対頻度）は、第一のデータベース
と第二のデータベースとの間で比較される。ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、第二
のデータベース（例えばＱＣデータベース）において第一のデータベース（例えばＫａｂ
ａｔデータベース）に対して高められている場合に、これは、それぞれの残基が有利に選
択され（すなわち"濃縮された残基"）、該配列に好ましい特性を付与することを示してい
る。反対に、該アミノ酸残基の相対頻度が第二のデータベースにおいて第一のデータベー
スに対して低下されている場合に、これは、それぞれの残基が有利ではない（すなわち"
排除された残基"）ことを示している。従って、濃縮された残基は、イムノバインダーの
機能特性（例えば安定性及び／又は可溶性）を改善するために好ましい残基である一方で
、排除された残基は、好ましくは回避される。

前記を考慮して、一実施態様においては、本発明は、イムノバインダーの特定の位置に
おける置換のためのアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）群分けされたＶ_H及び／又はＶ_Lのアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔファミリーサブタ
イプにより群分けされた生殖細胞系及び／又は成熟抗体の配列）の第一のデータベースを
提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして（例えばＱＣアッセイにより）
選択された群分けされたｓｃＦｖ抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列の第二のデータベ
ースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワ
ーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること；
ｄ）該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより高い頻度で第二
のデータベースに出現する場合に（すなわち、濃縮された残基）、イムノバインダーの相
応のアミノ酸位置での置換のために好ましいアミノ酸残基として割り出すこと
を含む方法を提供する。

第二の（ｓｃＦｖ）データベース（例えばＱＣデータベース）におけるアミノ酸残基の
濃縮は、定量することができる。例えば、第二のデータベース内の残基の相対頻度（ＲＦ
２）を第一のデータベース内の残基の相対頻度（ＲＦ１）との間の比率を測定することが
できる。この比率（ＲＦ２：ＲＦ１）を、"濃縮係数"（ＥＦ）と呼ぶことがある。従って
、ある特定の実施態様においては、工程（ｄ）でのアミノ酸残基は、第一のデータベース
と第二のデータベースとの間のアミノ酸残基の相対頻度の比率（ここでは、"濃縮係数"）
が少なくとも１（例えば１〜１０）である場合に割り出される。好ましい一実施態様にお
いては、濃縮係数は、１．０より大きいもしくは約１．０（例えば、１．０、１．１、１
．２、１．３、１．４もしくは１．５）である。なおももう一つの好ましい実施態様にお
いては、濃縮係数は、約４．０〜約６．０である（例えば、４．０、４．１、４．２、４
．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５
．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９もしくは６．０）。もう一つの
実施態様においては、濃縮係数は、約６．０〜約８．０である（例えば、６．０、６．１
、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１
、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９もしくは８．０）。他の実
施態様においては、濃縮係数は、１０より大きい（例えば、１０、１００、１０００、１
０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹もしくはそれより大きい）。ある一定の実施態
様においては、無限大の濃縮係数が達成されることがある。

もう一つの実施態様においては、本発明は、イムノバインダーから特定の位置で排除さ
れるべきアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）群分けされたＶ_H及び／又はＶ_Lのアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔファミリーサブタ
イプにより群分けされた生殖細胞系及び／又は成熟抗体の配列）の第一のデータベースを
提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして（例えばＱＣアッセイにより）
選択された群分けされたｓｃＦｖ抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列の第二のデータベ
ースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワ
ーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること；
ｄ）該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより低い頻度で第二
のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のた
めに好ましくないアミノ酸残基として割り出すこと（その際、前記のアミノ酸残基の種類
は好ましくないアミノ酸残基（すなわち排除された残基）である）
を含む方法を提供する。

ある特定の好ましい実施態様においては、前記の工程ｄ）における好ましくないアミノ
酸残基は、濃縮係数（ＥＦ）が１未満である場合に割り出される。更に、本発明は、Ｖ_H
及び／又はＶ_Lのアミノ酸配列を有するイムノバインダーを改善する方法であって：
ａ）突然変異のための１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す
工程；
ｂ）工程ａ）で割り出されたそれぞれの特定のフレームワーク位置について、置換のため
に好ましいアミノ酸残基を割り出す工程；及び
ｃ）それぞれの特定のフレームワーク位置のアミノ酸残基を、工程ｂ）で割り出された好
ましいアミノ酸残基へと突然変異させる工程
を含む方法を提供する。好ましくは、工程ａ）は、所定のフレームワーク位置での変動性
の度合いを、本願に開示される方法に従って決定することによって、すなわち保存の度合
いをシンプソンの指数を使用してそれぞれのフレームワーク位置に割り当てることによっ
て実施される。置換に適したアミノ酸は、好ましくは、前記に開示された方法に従って割
り出される。それは、少なくとも１の濃縮係数、より好ましくは少なくとも４〜６の濃縮
係数を有する。イムノバインダーの相応のアミノ酸残基を次いで、当該技術分野で公知の
分子生物学的方法を使用して好ましいアミノ酸残基に突然変異させる。該イムノバインダ
ーは、好ましくはｓｃＦｖ抗体、全長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂもし
くはナノボディーである。

ｓｃＦｖの突然変異
本発明の方法において、ｓｃＦｖ内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置がｓｃＦ
ｖの機能特性に関して潜在的に問題があるものと割り出された場合に、該方法は、更に、
これらの１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、ｓｃＦｖのＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ
酸配列内で突然変異することを含むことができる。例えば、突然変異について割り出され
たアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_L内の相応の位置で保存もしくは
濃縮されているアミノ酸残基で置換することができる。

突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、当該技術分野で十分に確立された幾つ
かの考えられる突然変異誘発法の１つを使用して突然変異することができる。例えば、部
位特異的突然変異誘発を用いて、関連のアミノ酸位置での特定のアミノ酸置換をすること
ができる。また、部位特異的突然変異誘発を用いて、限られたレパートリーのアミノ酸置
換が関連のアミノ酸位置に導入された突然変異されたｓｃＦｖ一組を作製することもでき
る。

加えて又は代わりに、突然変異について割り出されたアミノ酸位置を無作為なもしくは
指向的な突然変異誘発によって突然変異させて、突然変異されたｓｃＦｖのライブラリー
を作製し、引き続き前記の突然変異されたｓｃＦｖのライブラリーをスクリーニングし、
そしてｓｃＦｖを選択する、好ましくは少なくとも１つの改善された機能特性を有するｓ
ｃＦｖを選択することができる。好ましい一実施態様においては、該ライブラリーは、還
元性の環境において高められた安定性及び／又は可溶性を有するｓｃＦｖフレームワーク
の選択を可能にする、酵母クオリティー・コントロールシステム（ＱＣシステム）（前記
にさらに詳細に記載される）を使用してスクリーニングされる。

ｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングするための他の好適な選択技術は、制限されな
いが、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ及び酵母ディスプレイ（Ｊｕｎｇ
他（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１６３−１８０；Ｗｕ他（１９９９年
）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｓｃｈｉｅｒ他（１９９６年）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３）などのディスプレイ技術を含む、当該技術分野
で記載されている。

一実施態様においては、突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、データベース
の抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されているアミノ
酸残基で置換されている。もう一つの実施態様において、データベースの抗体のＶ_Hもし
くはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置は、疎水性アミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦ
ｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶ_Hもしく
はＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されている疎水性アミノ酸残基で置
換されている。なおももう一つの実施態様において、データベースの抗体のＶ_Hもしくは
Ｖ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置は、親水性アミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦｖ内
で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_L
のアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されている親水性アミノ酸残基で置換され
ている。なおももう一つの実施態様において、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのア
ミノ酸配列内の相応の位置は、水素結合を形成可能なアミノ酸残基で保存され、かつｓｃ
Ｆｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶ_Hもし
くはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されている水素結合を形成可能な
アミノ酸残基で置換されている。更にもう一つの実施態様において、データベースの抗体
のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置は、β−シートを形成する性向を有する
アミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置
は、データベースの抗体のＶ_HもしくはＶ_Lのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮
されているβ−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で置換されている。

一実施態様においては、全体の自由エネルギーを最小化する最良の置換は、１もしくは
それより多くの関連のアミノ酸位置でなされるべき突然変異として選択される。全体の自
由エネルギーを最小化する最良の置換は、ボルツマンの法則を用いて決定できる。ボルツ
マンの法則のための式は、ΔΔＧth＝ＲＴｌｎ（ｆ_親／ｆ_{コンセンサス}）である。

潜在的に安定化する突然変異の役割は、更に、例えば局所的な及び非局所的な相互作用
、カノニカル残基、インターフェース、曝露度及びβ−ターン性の調査によって決定でき
る。当該技術分野で知られる分子モデリング方法は、例えば、潜在的に安定化する突然変
異の役割を更に調査するにあたり適用できる。また、１パネルの考えられる置換が考慮さ
れる場合に、分子モデリング方法を用いて、"最適な"アミノ酸置換を選択することができ
る。

特定のアミノ酸位置に依存して、更なる分析を保証することができる。例えば、残基は
、重鎖と軽鎖との間の相互作用に関連することがあり、又は塩橋もしくは水素結合により
他の残基と相互作用することがある。これらの場合に、特定の分析が必要となることがあ
る。本発明のもう一つの実施態様においては、安定性のための潜在的に問題のある残基は
、共変ペア中のカウンターパートと適合性のあるものと変更することができる。選択的に
、そのカウンターパートの残基を突然変異させて、問題があるものとして最初に割り出さ
れたアミノ酸と適合させることができる。

可溶性最適化
ｓｃＦｖ抗体中の可溶性について潜在的に問題のある残基は、ｓｃＦｖ中の溶媒曝露さ
れる疎水性アミノ酸を含むが、それは、全長抗体の場合には、可変ドメインと定常ドメイ
ンとの間のインターフェースで覆い隠されている。定常ドメインを欠くエンジニアリング
されたｓｃＦｖにおいては、可変ドメインと定常ドメインとの間の相互作用に関与する疎
水性残基は、溶媒曝露されることとなる（例えばＮｉｅｂａ他（１９９７年）Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｅｎｇ．１０：４３５−４４を参照）。ｓｃＦｖの表面上のこれらの残基は、凝集
を生ずるので、可溶性の問題を引き起こす傾向にある。

ｓｃＦｖ抗体で溶媒曝露される疎水性アミノ酸を交換することについて多くのストラテ
ジーが記載されている。当業者によく知られているように、ある特定の位置での残基の改
変は、安定性、可溶性及び親和性などの抗体の生物物理的特性に影響する。多くの場合に
、これらの特性は相互関係を有する。それは、１つの単独アミノ酸の変化が、幾つかの前
記の特性に影響しうることを意味する。従って、溶媒曝露される疎水性残基を非保存的に
突然変異させることによって、安定性が低下し、かつ／又はその抗原に対する親和性が失
われることがある。

他のアプローチは、タンパク質ディスプレイ技術の徹底した使用及び／又はスクリーニ
ングの労力によって可溶性の問題を解決することを意図している。しかし、斯かる方法は
時間を費やすものであり、しばしば、可溶性タンパク質を得ることに失敗するか、又は抗
体のより低い安定性又はその親和性の低下が生ずる。本発明においては、溶媒曝露される
疎水性残基を、配列に基づく分析を用いて、より高い親水性を有する残基へと突然変異す
ることを設計する方法が開示される。潜在的に問題のある残基は、特定の位置で最も頻出
する親水性アミノ酸を選択することによって交換することができる。ある残基が、抗体中
の任意の他の残基と相互作用することが判明したら、その潜在的に問題のある残基は、最
も頻出する残基ではなく、共変ペアの第二のアミノ酸と適合しうるものへと突然変異させ
ることができる。選択的に、共変ペアの第二のアミノ酸は、アミノ酸の組み合わせの復元
のために突然変異させることもできる。更に、配列間の類似性のパーセンテージは、２つ
の相互関係を有するアミノ酸の最適な組み合わせを見出すのを補助するために考慮するこ
とができる。

ｓｃＦｖの表面上の疎水性アミノ酸は、制限されないが、溶媒曝露、実験情報及び配列
情報並びに分子モデリングを基礎とするアプローチを含む幾つかのアプローチを使用して
割り出される。

本発明の一実施態様においては、可溶性は、ｓｃＦｖ抗体の表面上の曝露される疎水性
残基と、データベース中のこれらの位置に存在する最も頻出する親水性残基とを交換する
ことによって改善される。この根拠は、その頻出する残基が恐らく問題がないということ
による。当業者に認められているように、保存的置換は、通常は、分子の脱安定化への影
響は小さいが、一方で、非保存的置換は、ｓｃＦｖの機能的特性に有害なことがある。

時として、抗体の表面上の疎水性残基は、重鎖と軽鎖との間の相互作用に関連すること
があり、又は塩橋もしくは水素結合により他の残基と相互作用することがある。これらの
場合に、特定の分析が必要となることがある。本発明のもう一つの実施態様においては、
安定性について潜在的に問題のある残基は、最も頻出する残基へではなく、共変ペアと適
合性のものへと突然変異できるか、又は第二の突然変異は、共変アミノ酸の組み合わせの
復元のために実施することができる。

付加的な方法は、溶媒曝露される疎水性位置での突然変異の設計に使用することができ
る。本発明のもう一つの実施態様においては、改変されるべきｓｃＦｖに最も高い類似性
を表す配列へのデータベースの制約を使用する方法が開示される（更に前記で議論した）
。斯かる制約された参照データベースを適用することによって、該突然変異は、最適化さ
れるべき抗体の特定の配列の点で最適であるように設計される。この状況で、選択された
親水性残基は、多数の配列（すなわち、制約されないデータベース）と比較した場合に、
実際は、それぞれの位置で十分に現れないことがある。

安定性最適化
単鎖抗体フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを共有結合で連結す
るペプチドリンカーを含む。斯かるリンカーは可変ドメインがばらばらになることを回避
するのに効果的であり、それによりｓｃＦｖはＦｖフラグメントより優れたものとなるが
、ｓｃＦｖフラグメントは、依然として、Ｆａｂフラグメント又は全長抗体（その両者に
おいて、Ｖ_H及びＶ_Lは、定常ドメインを介して間接的に結合されているにすぎない）と比
較してよりアンフォールディング及び凝集の傾向にある。

ｓｃＦｖにおけるもう一つの共通の問題は、分子間凝集をもたらすｓｃＦｖの表面上の
疎水性残基の曝露である。更に、時として、親和性成熟のプロセスの間に獲得される体細
胞突然変異は、β−シートのコアに親水性残基を配置する。斯かる突然変異は、ＩｇＧ形
式であるいはＦａｂフラグメントでさえも十分に許容できるが、ｓｃＦｖにおいては、こ
れは明らかに脱安定化と結果としてのアンフォールディングの原因となる。

ｓｃＦｖ脱安定化の原因となる公知の要因には、ｓｃＦｖ抗体の表面上にある溶媒曝露
される疎水性残基、該タンパク質のコアに覆い隠された普通でない親水性残基、並びに重
鎖と軽鎖との間の疎水性インターフェースに存在する親水性残基が含まれる。更に、コア
内の非極性残基間でのファン・デル・ワールス充填相互作用は、タンパク質安定性に重要
な役割を担うことは知られている（ＭｏｎｓｅｌｌｉｅｒＥ．及びＢｅｄｏｕｅｌｌｅ
Ｈ．（２００６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６２：５８０−９３、Ｔａｎ他（１９９８
年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５：１４７３−８２；ＷｏｅｒｎＡ．及びＰｌｕｅｃｋｔ
ｈｕｎ Ａ．（１９９８年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１３１２０−７）。

このように、一実施態様においては、ｓｃＦｖ抗体の安定性を高めるために、非常に保
存された位置での普通でない及び／又は好ましくないアミノ酸が割り出され、そしてこれ
らの保存された位置でより一般的なアミノ酸へと突然変異される。斯かる普通でない及び
／又は好ましくないアミノ酸には、（ｉ）ｓｃＦｖ抗体の表面上の溶媒曝露される疎水性
残基；（ｉｉ）タンパク質中で覆い隠された普通でない親水性残基；（ｉｉｉ）重鎖と軽
鎖との間の疎水性インターフェース中に存在する親水性残基；及び（ｉｖ）Ｖ_H／Ｖ_Lイン
ターフェースＶ_H／Ｖ_Lを立体障害によって妨害する残基が含まれる。

このように、本発明の一実施態様においては、安定性の増加は、その位置で出現の乏し
いアミノ酸を、これらの位置で最も頻出するアミノ酸によって置換することによって達成
できる。出現頻度は、一般に、生物学的許容性の指標を提供する。

残基は、重鎖と軽鎖との間の相互作用に関連することがあり、又は塩橋、水素結合もし
くはジスルフィド結合により他の残基と相互作用することがある。これらの場合に、特定
の分析が必要となることがある。本発明のもう一つの実施態様においては、安定性のため
の潜在的に問題のある残基は、共変ペア中のカウンターパートと適合性のあるものと変更
することができる。選択的に、そのカウンターパートの残基を突然変異させて、問題があ
るものとして最初に割り出されたアミノ酸と適合させることができる。

付加的な方法を用いて、安定性の改善のために突然変異を設計することができる。本発
明のもう一つの実施態様においては、改変されるべきｓｃＦｖに最も高い類似性を表す配
列へのデータベースの制約を使用する方法が開示される（更に前記で議論した）。斯かる
制約された参照データベースを適用することによって、該突然変異は、最適化されるべき
抗体の特定の配列の点で最適であるように設計される。該突然変異は、データベース配列
の選択されたサブセットに存在する最も頻出するアミノ酸を使用する。この状況で、選択
された残基は、多数の配列（すなわち、制約されないデータベース）と比較した場合に、
実際は、それぞれの位置で十分に現れないことがある。

ｓｃＦｖ組成物及び製剤
本発明のもう一つの態様は、本発明の方法により製造されたｓｃＦｖ組成物に関する。
このように、本発明は、エンジニアリングされたｓｃＦｖ組成物であって、関連の当初の
ｓｃＦｖと比較して１もしくはそれより多くの突然変異が導入されている組成物を提供し
、その際、前記突然変異は、１もしくはそれより多くの生物学的特性、例えば安定性もし
くは可溶性に影響することが予測される位置、特に１もしくはそれより多くのフレームワ
ーク位置に導入される。一実施態様においては、ｓｃＦｖは、１つの突然変異されたアミ
ノ酸位置（例えば、１つのフレームワーク位置）を含むようにエンジニアリングされてい
る。他の実施態様においては、ｓｃＦｖは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ
、９つ、１０つもしくは１０つより多くの突然変異されたアミノ酸位置（例えば、フレー
ムワーク位置）を含むようにエンジニアリングされている。

本発明のもう一つの態様は、本発明のｓｃＦｖ組成物の医薬品製剤に関する。斯かる製
剤は、一般に、ｓｃＦｖ組成物と製剤学的に認容性の担体を含む。本願で使用される"製
剤学的に認容性の担体"には、生理学的に適合可能な、いずれかの及びあらゆる溶剤、分
散媒、コーティング、抗微生物剤及び抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好
ましくは、担体は、例えば静脈内の、筋内の、皮下の、非経口の、脊髄の、表皮の投与（
例えば、注射もしくは点滴による）又は局所（例えば目もしくは皮膚への）に適している
。投与経路に応じて、ｓｃＦｖは、該化合物を、酸の作用と、該化合物を不活性化しうる
他の中性条件から保護するための材料でコーティングされてよい。

本発明の医薬化合物には、１もしくはそれより多くの製剤学的に認容性の塩が含まれう
る。"製剤学的に認容性の塩"とは、親化合物の所望の生物学的活性を保ち、いかなる不所
望な毒性学的作用を付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．他（１９７７年
）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。斯かる塩の例には、酸付加塩及び
塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、非毒性の無機酸、例えば塩化水素酸、硝酸、リン
酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、並びに非毒性の有機酸、例えば脂
肪族のモノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシア
ルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族のスルホン酸などから誘導される塩が含まれる。
塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カル
シウムなど、並びに非毒性の有機アミン、例えばＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン
、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジ
アミン、プロカインなどから誘導される塩が含まれる。

また、本発明の医薬組成物は、製剤学的に認容性の酸化防止剤を含んでよい。製剤学的
に認容性の酸化防止剤の例には、（１）水溶性の酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、シ
ステイン塩酸、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（
２）油溶性の酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソ
ール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル
、α−トコフェロールなど、並びに（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。

本発明の医薬組成物で使用できる好適な水性の及び非水性の担体の例には、水、エタノ
ール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ルなど）、及びそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油及び注入可能な有機エ
ステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、レシチンなどのコーティ
ング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒度の維持によって、かつ界面活性剤
の使用によって維持することができる。

また、これらの組成物は、助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有して
もよい。微生物の存在の抑制は、滅菌手法（上記）によって、かつ様々な抗微生物剤及び
抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによ
って保証することができる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを該組成物
に含ませることも望ましいことがある。更に、注入可能な医薬品形の延長された吸収は、
モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる剤を含むことによっ
てもたらすことができる。

製剤学的に認容性の担体には、滅菌の水溶液もしくは水性分散液及び滅菌の注射可能な
溶液もしくは分散液の即時調製物用の滅菌の粉末が含まれる。かかる媒体及び剤の製剤学
的に有効な物質のための使用は、当該技術分野で公知である。任意の慣用の媒体もしくは
剤が該有効化合物と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物でのその使用が検討
される。補助的な有効化合物を該組成物に導入することもできる。

治療用組成物は、一般に、滅菌されており、かつ製造及び貯蔵の条件下で安定でなけれ
ばならない。該組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム又は高い薬剤濃度に
適した他の規則構造物として製剤化することができる。担体は、溶剤もしくは分散媒であ
って、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール
及び液状ポリエチレングリコールなど）を含有するもの、並びにそれらの好適な混合物で
あってよい。適切な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場
合には必要な粒度の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持することができる
。多くの場合に、等張剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビト
ールもしくは塩化ナトリウムが該組成物中に含まれることが好ましい。注射可能な組成物
の延長された吸収は、該組成物中に、吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸塩及び
ゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。

滅菌の注射可能な溶液は、有効化合物を必要量で好適な溶剤中に前記列挙した成分１種
もしくはその組み合わせと共に導入し、所望であれば、引き続き滅菌精密濾過を行うこと
によって製造することができる。一般に、分散液は、有効化合物を、基礎分散媒と前記列
挙したものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって製
造される。滅菌の注射可能な溶液の製造のための滅菌粉末の場合には、好ましい製造方法
は、真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）であり、それにより事前に滅菌濾過された溶液か
ら有効成分と任意の付加的な所望の成分との粉末が得られる。

担体材料と組み合わせて単独の剤形を生成できる有効成分の量は、処置される被験体と
、特定の投与様式とに応じて変動する。担体材料と組み合わせて単独の剤形を生成できる
有効成分の量は、一般に、治療効果を生ずる組成物の量である。一般に、１００パーセン
トから外れて、この量は、製剤学的に認容性の担体と組み合わせて、約０．０１パーセン
トないし約９９パーセントの有効成分、好ましくは約０．１パーセントないし約７０パー
セント、最も好ましくは約１パーセントないし約３０パーセントの有効成分である。

投与計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）が提供されるように調節される。例
えば、単独のボーラスを投与してよく、幾つかの分割された用量を経時的に投与してよく
、あるいは治療状況の緊急性によって指示される場合にはその用量は比例的に低減もしく
は増加させてよい。特に、投与を容易にし、かつ投薬を均一にするために、非経口組成物
を投与単位剤形で製剤化することが特に好ましい。本願で使用される投与単位剤形とは、
処置されるべき被験体のために単位投与量として適合された物理的に別個の単位を指す；
それぞれの単位は、必要な医薬品担体と組み合わせて所望の治療効果をもたらすように計
算された予め決められた量の有効化合物を含有する。本発明の投与単位剤形についての仕
様は、（ａ）有効化合物の独特の特徴及び達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体
における感受性の処置のためにかかる有効化合物を配合する技術につきものの制限とによ
って規定され、かつそれらに直接的に依存する。

"機能的コンセンサス"アプローチを基礎とするイムノバインダーエンジニアリング
実施例２及び３で詳細に説明されるように、本願に記載される"機能的コンセンサス"ア
プローチは、改善された特性について選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースを使用して
フレームワーク位置の変動性を分析するものであるが、それは、生殖細胞系データベース
及び／又は成熟抗体データベースにおける同じ位置での変動性と比較することで、変動性
に許容性が高いか低いかのいずれかであるアミノ酸位置の割り出しを可能にする。実施例
５及び６で詳細に説明されるように、サンプルのｓｃＦｖ内のある特定のアミノ酸位置を
生殖細胞系のコンセンサス残基に逆突然変異させることで、中性のもしくは有害な作用が
奏され、その一方で、"機能的コンセンサス"を含むｓｃＦｖ変異体は、野生型のｓｃＦｖ
分子と比較して高められた熱安定性を示す。従って、ここで機能的コンセンサスアプロー
チを通じて割り出されたフレームワーク位置は、ｓｃＦｖの機能特性を変更する、好まし
くは改善するための、ｓｃＦｖ改変のための好ましい位置である。本願で使用される場合
に、用語"機能特性"とは、例えば改善された安定性、改善された可溶性、非凝集、発現の
改善、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善又は前記の改善の２
もしくはそれより多くの組み合わせを指す。好ましくは、ｓｃＦｖの機能特性の改善は、
抗原結合親和性の改善を含まない。

実施例３で第３表〜第８表に示されるように、以下のフレームワーク位置が、示された
Ｖ_HもしくはＶ_L配列における改変のために好ましい位置として割り出された（以下に使用
される番号付けは、ＡＨｏナンバリングシステムである；ＡＨｏナンバリングをＫａｂａ
ｔシステムのナンバリングに変換する変換表は、実施例１の第１表及び第２表に示される
）：
ＶＨ３：アミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３；
ＶＨ１ａ：アミノ酸位置１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５及
び９８；
ＶＨ１ｂ：アミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０
、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０７；
Ｖκ１：アミノ酸位置１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１及び１０３；
Ｖκ３：アミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１及
び１０３；並びに
Ｖλ１：アミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２及び１０
３。

従って、これらのアミノ酸位置の１もしくはそれより多くを、ｓｃＦｖ分子などのイム
ノバインダーにおけるエンジニアリングのために選択して、それにより該イムノバインダ
ーの変異体（すなわち変異された）形を生成できる。好ましくは、該エンジニアリングは
、抗原結合親和性に影響を及ぼすことなく、１もしくはそれより多くの改善された機能特
性を有するイムノバインダーをもたらす。好ましい一実施態様において、得られたイムノ
バインダーは、改善された安定性及び／又は可溶性の特徴を有する。このように、なおも
もう一つの態様においては、本発明は、イムノバインダーをエンジニアリングする方法、
特に（ｉ）ＶＨ３、ＶＨ１ａもしくはＶＨ１ｂのドメインタイプの重鎖可変領域もしくは
それらのフラグメントであってＶ_Hフレームワーク残基を含む領域及び／又は（ｉｉ）Ｖ
κ１、Ｖκ３もしくはＶλ１のドメインタイプの軽鎖可変領域もしくはそれらのフラグメ
ントであってＶ_Lフレームワーク残基を含む領域を含むイムノバインダーの１もしくはそ
れより多くの機能特性を改善するための方法であって：
ａ）突然変異のためにイムノバインダー内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選
択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させ
ること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位
置は、
（ｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３
（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、７８及び８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、６、１２、１３、１
４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ
酸位置１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３
、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０
７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、
２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）；
（ｉｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、
５０、５７、９１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、
４、２４、３９、４２、４９、７３及び８５）；
（ｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、
２０、５６、７４、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ
酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３及び８５）；及び
（ｖｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１
４、４６、５３、８２、９２及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位
置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４及び８５）
からなる群から選択される前記方法を提供する。

好ましい一実施態様においては、該方法は、イムノバインダーの１もしくはそれより多
くの機能特性を改善するが、但し、ｓｃＦｖの１もしくはそれより多くの機能特性は、抗
原結合親和性における改善を含まない。

もう一つの好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれ
より多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、６
、７、８９及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、７
８及び８９）からなる群から選択される。

もう一つの好ましい一実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそ
れより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１
、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリ
ングを使用したアミノ酸位置１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２
ｂ及び８４）からなる群から選択される。

もう一つの好ましい一実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそ
れより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１
、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、
８６、８７及び１０７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、
１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び
９３）からなる群から選択される。

もう一つの好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれ
より多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３
、４、２４、４７、５０、５７、９１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したア
ミノ酸位置１、３、４、２４、３９、４２、４９、７３及び８５）からなる群から選択さ
れる。

もう一つの好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれ
より多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３
、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリ
ングを使用したアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３
及び８５）からなる群から選択される。

もう一つの好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれ
より多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２
、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを
使用したアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４及び８５）
からなる群から選択される。

様々な実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２０より多くの前記のアミノ
酸位置が突然変異のために選択される。

なおももう一つの態様においては、本発明は、（ｉ）ＶＨ３、ＶＨ１ａもしくはＶＨ１
ｂのドメインタイプの重鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶ_Hフレーム
ワーク残基を含む領域及び／又は（ｉｉ）Ｖκ１、Ｖκ３もしくはＶλ１のドメインタイ
プの軽鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶ_Lフレームワーク残基を含む
領域を含むイムノバインダーの安定性及び／又は可溶性の特性を改善する方法であって：
ａ）突然変異のためにイムノバインダー内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選
択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させ
ること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位
置は、
（ｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、８９及び１０３（Ｋａｂ
ａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、７８及び８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、１２、１３、１４、
１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位
置１、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３
、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０
７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、
２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）；
（ｉｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、
５０、５７及び９１（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、４、２４
、３９、４２、４９及び７３）；
（ｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、
２０、５６、７４、９４及び１０１（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２
、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６及び８３）；及び
（ｖｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１
４、４６、５３、８２及び９２（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２
、４、７、１１、１４、３８、４５、６６及び７４）
からなる群から選択される前記方法を提供する。

このように、なおももう一つの態様においては、本発明は、（ｉ）ＶＨ３、ＶＨ１ａも
しくはＶＨ１ｂのドメインタイプの重鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであって
Ｖ_Hフレームワーク残基を含む領域及び／又は（ｉｉ）Ｖκ１、Ｖκ３もしくはＶλ１の
ドメインタイプの軽鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶ_Lフレームワー
ク残基を含む領域を含むイムノバインダーの安定性及び／又は可溶性を、イムノバインダ
ーの抗原結合親和性に影響を及ぼすことなく改善するための方法であって：
ａ）突然変異のためにイムノバインダー内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選
択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させ
ること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位
置は、
（ｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１及び１０３（Ｋａｂａｔナ
ンバリングを使用したアミノ酸位置１及び８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、１２、１３、１４、
１９、２１、９０、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、
１１、１２、１３、１８、２０、７９、８２ｂ及び８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３
、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５及び７７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用
したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８及び
６６）；
（ｉｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１及び３（Ｋａｂａｔナン
バリングを使用したアミノ酸位置１及び３）；
（ｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、
２０、９４及び１０１（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２、３、１０、
１２、１８、２０、７６及び８３）；及び
（ｖｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１
４、８２及び９２（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、４、７、１
１、１４、６６及び７４）
からなる群から選択される前記方法を提供する。

好ましくは、イムノバインダーはｓｃＦｖであるが、他のイムノバインダー、例えば全
長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂ、ナノボディー又は本願に記載される任
意の他の種類のイムノバインダーも該方法に従ってエンジニアリングすることができる。
本発明は、また、当該エンジニアリング方法に従って製造されたイムノバインダー並びに
該イムノバインダーと製剤学的に認容性の担体とを含む組成物を包含する。

ある特定の例示的な実施態様においては、本発明の方法によりエンジニアリングされた
イムノバインダーは、当該技術分野で認められる治療的に重要な標的抗原を結合するイム
ノバインダー又は治療的に重要なイムノバインダーから誘導された可変領域（ＶＬ及び／
又はＶＬ領域）もしくは１もしくはそれより多くのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲ
Ｌ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３）を含むイムノバイン
ダーである。例えば、ＦＤＡもしくは他の規制当局によって現在承認されているイムノバ
インダーを、本発明による方法に従ってエンジニアリングすることができる。より具体的
には、これらの例示的なイムノバインダーは、それらに制限されないが、抗ＣＤ３抗体、
例えばムロモナブ（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（登録商標）ＯＫＴ３；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ，Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ；Ａｒａｋａｗａ他のＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，（１
９９６）１２０：６５７−６６２；Ｋｕｎｇ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ他のＳｃｉｅｎｃｅ
（１９７９），２０６：３４７−３４９を参照）、抗ＣＤ１１抗体、例えばエファリズマ
ブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＳｏｕｔｈＳａｎ Ｆｒａｎｃ
ｉｓｃｏ，ＣＡ）、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）
／Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＳｏｕｔｈＳａｎ Ｆｒａｎｃ
ｉｓｃｏ，ＣＡ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫ
ｌｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ）もしくはイブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｂｉ
ｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）（米国特許第５，７３６，１３７；第６
，４５５，０４３；及び第６，６８２，７３４を参照）、抗ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα）抗体
、例えばダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ）もしくはバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖａ
ｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、抗ＣＤ３３抗体、例えばゲムツズマ
ブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ−米国特許第５
，７１４，３５０及び第６，３５０，８６１を参照）、抗ＣＤ５２抗体、例えばアレムツ
ズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、抗ＧｐＩＩｂ／ｇＩＩａ抗体、例えばアブシキ
シマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）、抗Ｔ
ＮＦα抗体、例えばインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏ
ｒ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）もしくはアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ａｂｂ
ｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ−米国特許第６，２５８，５６２を参照）、抗Ｉ
ｇＥ抗体、例えばオマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏ
ｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、抗ＲＳＶ抗体、例えばパリビズマブ（Ｓｙ
ｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ−米国
特許第５，８２４，３０７を参照）、抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えばエドレコロマブ（Ｐａｎ
ｏｒｅｘ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ（Ｅ
ｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）
もしくはパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ
Ｏａｋｓ，ＣＡ）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、例えばトランスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐ
ｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、抗α４インテグリン抗体、例えばナタリズ
マブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）、ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ）、抗Ｃ５抗体、例えばエク
リズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）、ＡｌｅｘｉｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌｓ，Ｃｈｅｓｉｒｅ，ＣＴ）及び抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉ
ｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−米国特許第６，８８４，８７９を参照）もしくは
ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含む。

上記にもかかわらず、様々な実施態様において、ある特定のイムノバインダーは、本発
明のエンジニアリング方法での使用から排除され、かつ／又は該エンジニアリング方法に
よって製造されたイムノバインダー組成物から排除される。例えば、様々な実施態様にお
いて、イムノバインダーがＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号及びＷＯ２００８／
００６２３５号に開示されるいずれかのｓｃＦｖ抗体もしくはその変異体、例えばＥＳＢ
Ａ１０５又はＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号及びＷＯ２００８／００６２３５
号に開示されるその変異体ではないという条件がある。前記の公報のそれぞれの内容は、
参照をもって本願明細書に明白に開示されたものとする。

他の様々な実施態様においては、前記方法によりエンジニアリングされるべきイムノバ
インダーがＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号もしくはＷＯ２００８／００６２３
５号に開示されるいずれかのｓｃＦｖ抗体もしくはその変異体である場合に、該エンジニ
アリング方法により置換のために選択されうる考えられるアミノ酸位置のリストが以下の
アミノ酸位置：Ｖκ１もしくはＶλ１のＡＨｏ位置４（Ｋａｂａｔ４）；Ｖκ３のＡＨｏ
位置１０１（Ｋａｂａｔ８３）；ＶＨ１ａもしくはＶＨ１ｂのＡＨｏ位置１２（Ｋａｂａ
ｔ１１）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ位置５０（Ｋａｂａｔ４３）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置
７７（Ｋａｂａｔ６６）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置７８（Ｋａｂａｔ６７）；ＶＨ１
ｂに関するＡＨｏ位置８２（Ｋａｂａｔ７１）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８６（Ｋａ
ｂａｔ７５）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８７（Ｋａｂａｔ７６）；ＶＨ３に関するＡ
Ｈｏ位置８９（Ｋａｂａｔ７８）；ＶＨ１ａに関するＡＨｏ位置９０（Ｋａｂａｔ７９）
；及び／又はＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置１０７（Ｋａｂａｔ９３）のいずれかもしくは
全てを含まないという条件がありうる。

さらに他の様々な実施態様において、前記方法によりエンジニアリングされるべき任意
のイムノバインダー及び／又は前記方法により製造された任意のイムノバインダーに関し
ては、該エンジニアリング方法により置換のために選択されうる考えられるアミノ酸位置
のリストが、以下のアミノ酸位置：Ｖκ１もしくはＶλ１のＡＨｏ位置４（Ｋａｂａｔ４
）；Ｖκ３のＡＨｏ位置１０１（Ｋａｂａｔ８３）；ＶＨ１ａもしくはＶＨ１ｂのＡＨｏ
位置１２（Ｋａｂａｔ１１）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ位置５０（Ｋａｂａｔ４３）；ＶＨ１ｂ
に関するＡＨｏ位置７７（Ｋａｂａｔ６６）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置７８（Ｋａｂ
ａｔ６７）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８２（Ｋａｂａｔ７１）；ＶＨ１ｂに関するＡ
Ｈｏ位置８６（Ｋａｂａｔ７５）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８７（Ｋａｂａｔ７６）
；ＶＨ３に関するＡＨｏ位置８９（Ｋａｂａｔ７８）；ＶＨ１ａに関するＡＨｏ位置９０
（Ｋａｂａｔ７９）；及び／又はＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置１０７（Ｋａｂａｔ９３）
のいずれかもしくは全てを含まないという条件がありうる。

他の実施態様
本発明は、また、米国仮特許出願第６０／９０５，３６５の添付（Ａ−Ｃ）及び米国仮
特許出願第６０／９３７，１１２の添付（Ａ−Ｉ）に示される方法論、参考資料及び／又
は組成物のいずれをも含むが、それらに制限されないが、割り出されるデータベース、バ
イオインフォマティクス、インシリコデータ操作及び解釈方法、機能的アッセイ、好まし
い配列、好ましい残基の位置／変更、フレームワークの割り出しと選択、フレームワーク
の変更、ＣＤＲアラインメント及び統合並びに好ましい変更／突然変異を含むと解される
。

これらの方法論及び組成に関する更なる情報は、米国第６０／８１９，３７８号；及び
同第６０／８９９，９０７号及びＰＣＴ公報ＷＯ２００８／００６２３５（発明の名称"
ｓｃＦｖ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｈｉｃｈ ＰａｓｓＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ａｎｄ／
Ｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｌａｙｅｒｓ"、それぞれ２００６年７月と２００７年２
月２日出願）；Ｗ００６１３１０１３号Ａ２（発明の名称"Ｓｔａｂｌｅ Ａｎｄ Ｓｏｌ
ｕｂｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＩｎｈｉｂｉｔｉｎｇＴＮＦａ"、２００６年６月６日
出願）；ＥＰ１５０６２３６号Ａ２（発明の名称"Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｒａ
ｍｅｗｏｒｋｓ Ｗｈｉｃｈ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ＥｎｈａｎｃｅｄＳｔａｂｉｌｉ
ｔｙ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＡｎｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｓａｍｅ"、２００３年５月２１日出願）；ＥＰ
１４７９６９４号Ａ２（発明の名称"Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ＳｃＦｖ ｗｉｔｈ ｄｅｆ
ｉｎｅｄ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｔｈａｔ ｉｓ ｓｔａｂｌｅｉｎ ａ ｒｅｄｕｃｉｎｇ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ"、２０００年１２月１８日出願）；ＥＰ１２４２４５７号Ｂ１
（発明の名称"ＩｎｔｒａｂｏｄｉｅｓＷｉｔｈ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ
Ｔｈａｔ Ｉｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎ Ａ ＲｅｄｕｃｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎ
ｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ"、２０００年１２月１８日出願）；Ｗ０
０３０９７６９７号Ａ２（発明の名称"Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｒａｍｅｗｏｒ
ｋｓ Ｗｈｉｃｈ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ＥｎｈａｎｃｅｄＳｔａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎ
Ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＡｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｓａｍｅ"、２００３年５月２１日出願）；及びＷ００１
４８０１７号Ａ１（発明の名称"Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆｒ
ａｍｅｗｏｒｋ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎ ＡＲｅｄｕｃｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏ
ｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ"、２０００年１２月１８
日出願）；並びにＨｏｎｅｇｇｅｒ他のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０
（２００１）に見出すことができる。

更に、本発明は、また、他の抗体形式、例えば全長抗体もしくはそのフラグメント、例
えばＦａｂ、Ｄａｂなどの発見及び／又は改善に適した方法論及び組成を含むものと解さ
れる。従って、ここで割り出された原理と残基は、広範なイムノバインダーに適用できる
所望の生物物理学的及び／又は治療的な特性を達成するため選択もしくは変更に適してい
る。一実施態様においては、治療的に関連する抗体、例えばＦＤＡ承認抗体は、ここに開
示される１もしくはそれより多くの残基位置の改変によって改善される。

しかしながら、本発明は、イムノバインダーのエンジニアリングに制限されない。例え
ば、当業者は、本発明が、他の非免疫グロブリンの結合分子、例えばそれらに制限されな
いが、フィブロネクチン結合分子、例えばアドネクチン（ＷＯ０１／６４９４２号及び米
国特許第６，６７３，９０１号、同第６，７０３，１９９号、同第７，０７８，４９０号
及び同第７，１１９，１７１号を参照）、アフィボディ（例えば米国特許第６，７４０，
７３４号及び同第６，６０２，９７７号及びＷＯ００／６３２４３号を参照）、アンチカ
リン（リポカリンとしても公知）（ＷＯ９９／１６８７３号及びＷＯ０５／０１９２５４
号を参照）、Ａドメインタンパク質（ＷＯ０２／０８８１７１号及びＷＯ０４／０４４０
１１号を参照）及びアンキリン反復タンパク質、例えばダルピンもしくはロイシン反復タ
ンパク質（ＷＯ０２／２０５６５号及びＷＯ０６／０８３２７５号を参照）のエンジニア
リングに適用できると認識している。

本願開示を、以下の実施例によって更に概説するが、それは更なる限定と解釈されるべ
きでない。本願を通して引用されている全ての図面及び全ての参考文献、特許及び公開特
許出願の内容は、参照をもって本願明細書に明白に開示されたものとする。

例１： 抗体位置ナンバリングシステム
この例では、抗体重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基位置を特定するた
めに使用される２つの異なるナンバリングシステムに関する変換表を提供する。Ｋａｂａ
ｔナンバリングシステムは、更にＫａｂａｔ他（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１年）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔ
ｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍ
ａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２）に説
明されている。ＡＨｏナンバリングシステムは、更にＨｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ及びＰｌｕｅ
ｃｋｔｈｕｎ，Ａ（２００１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０で更に
説明されている。

重鎖可変領域ナンバリング
第１表： 重鎖可変ドメイン中の残基位置に関する変換表

１列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示された
位置についてのＡＨｏのナンバリングシステムにおける相応の番号。３列目、Ｋａｂａｔ
のナンバリングシステムでの残基位置。４列目、３列目に示された位置についてのＡＨｏ
のナンバリングシステムにおける相応の番号。５列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステ
ムでの残基位置。６列目、５列目に示された位置についてのＡＨｏのナンバリングシステ
ムにおける相応の番号。

軽鎖可変領域ナンバリング
第２表： 軽鎖可変ドメイン中の残基位置に関する変換表

１列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示された
位置についてのＡＨｏのナンバリングシステムにおける相応の番号。３列目、Ｋａｂａｔ
のナンバリングシステムでの残基位置。４列目、３列目に示された位置についてのＡＨｏ
のナンバリングシステムにおける相応の番号。５列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステ
ムでの残基位置。６列目、５列目に示された位置についてのＡＨｏのナンバリングシステ
ムにおける相応の番号。

例２： ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析
この例においては、ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析を詳細に説明する。分析方法をま
とめたフローチャートを図１に示す。

ヒト免疫グロブリン配列の収集及びアラインメント
ヒトの成熟抗体及び生殖細胞系の可変ドメインの配列を、種々のデータベースから収集
し、カスタマイズされたデータベースに一文字コードのアミノ酸配列として入力した。抗
体配列を、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ配列アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅ
ｄｌｅｍａｎ他，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，４８（３）：４４３−５３（１９７０））のＥ
ＸＣＥＬ実装を使用してアラインメントした。該データベースを、次いで、後続の分析と
比較を容易にするために、以下のように、４つのアレイ（当初のデータソースにより）に
細分した：
ＶＢａｓｅ： ヒト生殖細胞系配列
ＩＭＧＴ： ヒト生殖細胞系配列
ＫＤＢデータベース： 成熟抗体
ＱＣデータベース： クオリティー・コントロールスクリーニングによって選択された
選択ｓｃＦｖフレームワークを含むＥＳＢＡＴｅｃｈの内部データベース
ＱＣスクリーニングシステムと、それから選択される望ましい機能特性を有するｓｃＦ
ｖフレームワーク配列は、更に、例えばＰＣＴ公報ＷＯ ２００１／４８０１７号；米国
出願第２００１００２４８３１号；ＵＳ２００３００９６３０６号；米国特許第７，２５
８，９８５号及び同第７，２５８，９８６号；ＰＣＴ公報ＷＯ２００３／０９７６９７号
及び米国出願第２００６００３５３２０号に記載されている。

ギャップの導入及び残基位置の命名法は、免疫グロブリン可変ドメインに関してはＡＨ
ｏナンバリングシステムによって行った（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈ
ｕｎ，Ａ．（２００１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０）。引き続き
、フレームワーク領域とＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ他（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９
１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２
）に従って特定される。ＫＤＢデータベースにおいて７０％未満の一致を有するか又はフ
レームワーク領域に多重の未定の残基を含む配列を破棄した。データベース内の任意の他
の配列と９５％より高い同一性を有する配列も、分析における不規則ノイズを回避するた
めに排除した。

配列のサブグループへの割り当て
抗体配列を、別個のファミリーへと、配列ホモロジーに基づく分類法に従って抗体をク
ラスタ化することによって分類した（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．他（１９９２年）Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｃ．及びＷｉｎ
ｔｅｒ．Ｇ．（１９９３年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１４５６−１４６１）
；Ｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．他（１９９４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３
６）。ファミリーコンセンサスに対するホモロジーのパーセンテージを、７０％の類似性
に制約した。示された配列が２もしくはそれより多くの種々の生殖細胞系ファミリーの間
で不一致であるか、もしくはホモロジーのパーセンテージが７０％（任意のファミリーに
対して）未満であった場合に、最も近い生殖細胞系のカウンターパートを決定し、ＣＤＲ
長さ、カノニカルなクラス及び定義しているサブタイプ残基を詳細に分析して、該ファミ
リーを正しく割り当てた。

統計的分析
ファミリークラスタが定義されたら、"クオリティー・コントロール（"ＱＣ"）スクリ
ーニング"（斯かるＱＣスクリーニングはＰＣＴ公報ＷＯ２００３／０９７６９７号に詳
細に説明される）において割り出されたヒットについて統計的分析を実施した。分析は、
該分析のために最小の数の配列が必要とされるので、最も代表的なファミリー（ＶＨ３、
ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、Ｖκ１、Ｖκ３及びＶλ１）について可能であるに過ぎなかった。
各位置ｉについての残基頻度ｆｉ（ｒ）を、特定の残基型がデータセット内で確認された
回数を配列の全数で除算することによって計算した。位置的エントロピーＮ（ｉ）を、全
ての位置の変動性の尺度として（Ｓｈｅｎｋｉｎ，Ｐ．Ｓ．他（１９９１年）Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ １１：２９７−３１３；Ｌａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．及びＤａｖｉｄｓｏｎ，Ａ．Ｒ
．（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：２１７０−２１８０；Ｄｅｍａｒｅｓｔ
，Ｓ．Ｊ．他（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１−４８）、単純な豊富さ
よりもより多くのアミノ酸組成についての情報を提供するシステムにおける多様性の数学
的尺度であるシンプソンの指数を用いて計算した。各位置ｉについての多様性の度合いを
、存在する異なるアミノ酸の数と、各残基の相対存在度を考慮して計算した。

前記式中：Ｄは、シンプソンの指数であり、Ｎは、アミノ酸の全数であり、ｒは、各位
置に存在する異なるアミノ酸の数であり、かつｎは、特定のアミノ酸型の残基の数である
。

選択されたＦｖフレームワークのＱＣデータベース（ＱＣスクリーニングによって選択
された）を、種々の基準を用いてスクリーニングして、ユニークな特徴を定義した。該配
列データベース中の種々のアレイを使用して、Ｆｖフレームワーク内の残基位置の変動性
の度合いを定義し、選択されたＦｖフレームワーク中に存在する本来一般的でない変動許
容な位置を割り出した。１０％と等しいかそれより高い位置的エントロピースコアの差を
、閾値として定義した。付加的な位置を、所定の位置の残基が他の配列アレイに稀に確認
されるアミノ酸、すなわち生殖細胞系データベース（ＶＢａｓｅ及びＩＭＧＴ）及びＫＤ
Ｂデータベースに稀に確認されるアミノ酸によって占められている場合に選択した。ある
残基の挙動が真に異なることが見出された（他の配列アレイのいずれかで低いか現れない
）場合に、その残基位置をユニークとして定義した。

選択されたＦｖフレームワーク配列のユニークな特徴の割り出しの背後にある原理的説
明は、フレームワークの証明された優れた特性と、これらの知見の改善された足場のため
の潜在的な使用である。選択されたフレームワーク中で一定の変動性の度合いを本来示す
高度に保存された位置は、無作為突然変異誘発に許容性であるべきであり、かつｓｃＦｖ
形式の本来の残基より優れた代替アミノ酸を見出す確率の増大を表すことが見込まれる。
更に、稀なアミノ酸についての顕著な優先性は、一定の残基に対する自然選択の指標であ
る。これらの２つの統計的指針に基づき、重鎖と軽鎖の中の種々の残基を、浮動性位置（
変動許容性）もしくは好ましい置換（普通でない残基）のいずれかとして選択した。

例３： 変動許容性の残基位置と普通でない残基の位置の割り出し
例２で上述した配列に基づくｓｃＦｖ分析アプローチを使用して、３種の重鎖可変領域
ファミリー（ＶＨ３、ＶＨ１ａ及びＶＨ１ｂ）及び３種の軽鎖可変領域ファミリー（Ｖκ
１、Ｖκ３及びＶλ１）を分析して、変動許容性のアミノ酸位置を割り出した。特に、シ
ンプソンの指数を使用して計算された多様性の度合いを、前記のＶｂａｓｅ、ＩＭＧＴ、
ＫＤＢ及びＱＣ（選択されたｓｃＦｖ）の４種のデータベース内の配列についての各アミ
ノ酸位置について決定した。変動許容性のアミノ酸位置と普通でない残基のアミノ酸位置
を、Ｖｂａｓｅ及びＩＭＧＴの生殖細胞系データベースについてのこれらの位置でのシン
プソンの指数値における、ＱＣの選択されたｓｃＦｖデータベースと比較した差異に基づ
き割り出した。付加的に、関連の割り出された位置について、生殖細胞系コンセンサス残
基を割り出し、そのコンセンサス残基のＱＣ及びＫＤＢのデータベースにおける頻度を決
定した。

重鎖可変領域ファミリーのＶＨ３、ＶＨ１ａ及びＶＨ１ｂについての変動性の分析結果
を、それぞれ第３表、第４表及び第５表に以下に示す。各表に関して、それぞれの列は以
下の通りである：第１列：ＡＨｏナンバリングシステムを用いたアミノ酸残基位置（Ｋａ
ｂａｔナンバリングシステムへの変換は、例１の第１表として示された変換表を用いて行
うことができる）；第２列ないし第５列：第１列に示された残基位置についてのデータベ
ース中の各抗体アレイに関して計算された多様性；第６列：相応の生殖細胞系ファミリー
及びＫＤＢのコンセンサス残基；第７列：第６列におけるコンセンサス残基に関するＫＤ
Ｂデータベースにおける相対残基頻度；並びに第８列：第６列におけるコンセンサス残基
に関するＱＣの選択されたｓｃＦｖデータベースにおける相対残基頻度。

第３表： ＶＨ３ファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサス
アミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度

第４表： ＶＨ１ａファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサ
スアミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度

第５表： ＶＨ１ｂファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサ
スアミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度

軽鎖可変領域ファミリーのＶκ１、Ｖκ３及びＶλ１についての変動性の分析結果を、
それぞれ第６表、第７表及び第８表に以下に示す。各表に関して、それぞれの列は以下の
通りである：第１列：ＡＨｏナンバリングシステムを用いたアミノ酸残基位置（Ｋａｂａ
ｔナンバリングシステムへの変換は、例１の第１表として示された変換表を用いて行うこ
とができる）；第２列ないし第５列：第１列に示された残基位置についてのデータベース
中の各抗体アレイに関して計算された多様性；第６列：相応の生殖細胞系ファミリー及び
ＫＤＢのコンセンサス残基；第７列：第６列におけるコンセンサス残基に関するＫＤＢデ
ータベースにおける相対残基頻度；並びに第８列：第６列におけるコンセンサス残基に関
するＱＣの選択されたｓｃＦｖデータベースにおける相対残基頻度。

第６表： Ｖκ１ファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサス
アミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度

第７表： Ｖκ３ファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサス
アミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度

第８表： Ｖλ１ファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサス
アミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度

前記の第３表〜第８表に示されるように、ＱＣシステム選択されたｓｃＦｖフレームワ
ークにおける残基位置のサブセットは、生殖細胞系（ＶＢａｓｅ及びＩＭＧＴ）及び成熟
抗体（ＫＤＢ）に存在しないか又は出現が不十分なある特定の残基に対して強く偏ってい
るものと判明し、ｓｃＦｖの安定性が、クオリティー・コントロール酵母スクリーニング
システムで選択されたフレームワーク配列のユニークな特徴に基づき合理的に改善されう
ることが示唆された。

例４： 好ましい残基の選択
ｓｃＦｖの機能特性（例えば安定性及び／又は可溶性）を改善することが知られる特定
のアミノ酸位置での好ましいアミノ酸残基を選択（又は選択的にアミノ酸残基を排除）す
るために、成熟抗体配列のＫａｂａｔ配列からのＶＨ配列とＶＬ配列とを、そのファミリ
ーサブタイプ（例えばＶＨ１ｂ、ＶＨ３など）によって群分けした。配列の各サブファミ
リー内で、各アミノ酸位置での各アミノ酸残基の頻度を、１群のサブタイプの分析された
全ての配列のパーセンテージとして決定した。いわゆるＱＣシステムによって増大された
安定性及び／又は可溶性について予め選択された抗体からなるＱＣデータベースの配列全
てについても同じことを行った。各サブタイプに関して、Ｋａｂａｔ配列及びＱＣ配列に
ついて得られた各アミノ酸残基について得られたパーセンテージ（相対頻度）を、それぞ
れの相応の位置で比較した。ある特定のアミノ酸残基の相対頻度がＱＣデータベースにお
いてＫａｂａｔデータベースと比較して高まった場合に、そのそれぞれの残基を、所定の
位置でのｓｃＦｖの安定性及び／又は可溶性を改善するために好ましい残基と見なした。
その反対に、ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、ＱＣデータベースにおいてＫａｂａ
ｔデータベースと比較して低下した場合に、そのそれぞれの残基を、その位置でのｓｃＦ
ｖ形式の状況で好ましくないものと見なした。

第９表は、種々のデータベースにおけるＶＨ１ｂサブタイプに関するアミノ酸位置Ｈ７
８（ＡＨｏナンバリング；Ｋａｂａｔ位置Ｈ６７）での残基頻度の例示的分析を示す。第
９表における列は、以下の通りである：第１列：残基型；第２列：ＩＭＧＴ生殖細胞系デ
ータベースにおける残基頻度；第３列：Ｖｂａｓｅ生殖細胞系データベースにおける残基
頻度；第４列：ＱＣデータベースにおける残基頻度；第５列：Ｋａｂａｔデータベースに
おける残基頻度。

第９表： ２種の生殖細胞系データベース、ＱＣデータベース及び成熟抗体のＫａｂａ
ｔデータベースにおけるＶＨ１ｂサブタイプに関する位置７８（ＡＨｏナンバリング）で
の相対残基頻度

ＱＣデータベースにおいて、アラニン（Ａ）残基は、２４％の頻度で確認され、それは
成熟Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ＿ＶＨ１Ｂ）における同じ残基について確認される
２％の頻度の１２倍である。従って、位置Ｈ７８（ＡＨｏナンバリング）でのアラニン残
基は、その位置で、ｓｃＦｖの機能特性（例えば安定性及び／又は可溶性）を増大させる
ために好ましい残基と見なされる。反対に、バリン（Ｖ）残基は、ＱＣデータベースにお
いて４７％の相対頻度で確認され、それは、成熟Ｋａｂａｔデータベースで確認される８
６％よりもかなり低く、かつ生殖細胞系データベースで同じ残基について確認される９０
％より大（ＩＭＧＴ−ｇｅｒｍで９１％及びＶｂａｓｅ ｇｅｒｍで１００％）よりもか
なり低い。従って、バリン残基（Ｖ）は、位置Ｈ７８でｓｃＦｖ形式の状況では好ましく
ない残基であると見なされた。

例５： ２つの異なるアプローチからのＥＳＢＡ１０５ｓｃＦｖ変異体の比較
この例では、２つの異なるアプローチによって製造されたｓｃＦｖ変異体の安定性を比
較した。親のｓｃＦｖ抗体は、今までに記載されていた（例えばＰＣＴ公報ＷＯ２００６
／１３１０１３号及びＷＯ２００８／００６２３５号を参照）ＥＳＢＡ１０５であった。
１セットのＥＳＢＡ１０５変異体は、クオリティー・コントロール酵母スクリーニングシ
ステムを用いて選択した（"ＱＣ変異体"）。その変異体も、今までに記載されていた（例
えばＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号及びＷＯ２００８／００６２３５号を参照
）。他の変異体のセットは、ある特定のアミノ酸位置を、前記の例２及び３で記載された
配列分析によって割り出された好ましい生殖細胞系コンセンサス配列へと逆突然変異させ
ることによって製造した。その逆突然変異は、アミノ酸配列内で、生殖細胞系配列で保存
されているが、選択されたｓｃＦｖにおいて普通でないもしくは低い頻度のアミノ酸を含
む位置について調査することによって選択した（生殖細胞系コンセンサスエンジニアリン
グアプローチと呼ぶ）。

全ての変異体を、安定性について、該分子を熱誘発ストレスにかけることによって試験
した。広範囲の温度（２５〜９５℃）での負荷によって、全ての変異体について、熱的ア
ンフォールディング転移の大まかな中心点（ＴＭ）を決定することができた。野生型分子
とその変異体についての熱安定性の測定は、ＦＴ−ＩＲ ＡＴＲ分光分析法によって、Ｉ
Ｒ光を干渉計中に案内して実施した。測定された信号は、インターフェログラムであり、
この信号でフーリエ変換を行うと、最終スペクトルは、慣用の（分散型）赤外分光分析法
からのスペクトルと同一である。

熱的アンフォールディングの結果を、以下の第１０表にまとめ、図６で図示する。第１
０表中の列は、以下の通りである：第１列：ＥＳＢＡ１０５変異体；第２列：突然変異を
含むドメイン；第３列：ＡＨｏナンバリング中の突然変異；第４列：図６における熱的ア
ンフォールディング曲線から計算されたＴＭ中心点；第５列：親のＥＳＢＡ１０５と比較
した相対活性；第６列：第１列で特定された変異体についての突然変異誘発ストラテジー
。

第１０表： ２つの異なるアプローチからのＥＳＢＡ１０５変異体の比較と、ＦＴ−Ｉ
Ｒで測定された全体の安定性へのそれらの寄与（熱的アンフォールディング転移について
計算された中心点）

ＱＣ変異体と比較すると、生殖細胞系コンセンサスへの逆突然変異は、ＥＳＢＡ１０５
の熱安定性と活性に対して悪影響を有しているか、又はそれらに対して影響を有さない。
このように、これらの結果は、種々の抗体及び形式において安定性を改善するために他で
使用されていたコンセンサスエンジニアリングアプローチと食い違っている（例えばＳｔ
ｅｉｐｅ，Ｂ他（１９９４年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４０：１８８−１９２；Ｏｈａ
ｇｅ，Ｅ．及びＳｔｅｉｐｅ，Ｂ．（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：１１
１９−１１２８；Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．他（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６
：５７−８６，Ｅｗｅｒｔ，Ｓ．他（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４２：１
５１７−１５２８；並びにＭｏｎｓｅｌｌｉｅｒ，Ｅ．及びＢｅｄｏｕｅｌｌｅ，Ｈ．（
２００６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６２：５８０−５９３を参照）。

別個の実験において、前記のＱＣ変異体（ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２及びＱＣ２３．
２）及び追加のＱＣ変異体（ＱＣ７．１）を、コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２
及びＤ−３）か又はアラニンへの逆突然変異（Ｄ−１）のいずれかを有する第二の変異体
のセットと比較した（第１１表を参照）。選択されたフレームワーク位置での残基の個性
を第１１表に示し、測定された熱安定性（任意のアンフォールディング単位で）を、図７
に示す。幾つかのコンセンサス変異体（Ｓ−２及びＤ−１）が、熱安定性において顕著な
増大を示すものの、この増大は、４種のＱＣ変異体のそれぞれによって達成される熱安定
性における増大よりも小さかった。

第１１表： コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２、Ｄ−３）、アラニンへの突然
変異（Ｄ−１）もしくはＱＣ残基（ＱＣ７．１、ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、ＱＣ２３
．２）のいずれかを含む一組のＥＳＢＡ１０５変異体の選択されたフレームワーク位置で
のフレームワーク残基の個性を提供する。親のＥＳＢＡ１０５抗体と異なる残基を、太字
のイタリック体で示している。アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングで提供される。

従って、ここにある結果は、"クオリティー・コントロール酵母スクリーニングシステ
ム"で加えられた選択圧が、本来（まだ依然としてヒトで）めったに確認されず、恐らく
、これらのフレームワークの優れた生物物理学的特性の原因となる共通の特徴を含む足場
の分集合をもたらすことを裏付けている。６０℃で種々のＥＳＢＡ１０５変異体を負荷す
ることによって、選択されたｓｃＦｖフレームワークデータベースで割り出された好まし
い置換の優れた特性を再確認することができた。このように、本願に記載される、ＱＣ酵
母スクリーニングシステムから得られた選択されたｓｃＦｖ配列を基礎とする"機能的コ
ンセンサス"アプローチは、生殖細胞系コンセンサスアプローチを用いて製造された変異
体よりも優れた熱安定性を有するｓｃＦｖ変異体をもたらすことが裏付けられている。

例６： ＥＳＢＡ２１２ ｓｃＦｖ変異体
この例では、ＥＳＢＡ１０５と異なる結合特異性を有するｓｃＦｖ抗体の生殖細胞系コ
ンセンサス変異体（ＥＳＢＡ２１２）の安定性を比較した。全てのＥＳＢＡ２１２変異体
は、ある特定のアミノ酸位置を、前記の例２及び３で記載された配列分析によって割り出
された好ましい生殖細胞系コンセンサス配列へと逆突然変異させることによって製造した
。その逆突然変異は、アミノ酸配列内で、生殖細胞系配列で保存されているが、選択され
たｓｃＦｖにおいて普通でないもしくは低い頻度のアミノ酸を含む位置について調査する
ことによって選択した（生殖細胞系コンセンサスエンジニアリングアプローチと呼ぶ）。
図５と同様に、全ての変異体を、安定性について、該分子を熱誘発ストレスにかけること
によって試験した。

ＥＳＢＡ２１２変異体についての熱的アンフォールディングの結果を、以下の第１２表
にまとめ、図８で図示する。第１２表中の列は、以下の通りである：第１列：ＥＳＢＡ２
１２変異体；第２列：突然変異を含むドメイン；第３列：ＡＨｏナンバリング中の突然変
異；第４列：図７における熱的アンフォールディング曲線から計算されたＴＭ中心点；第
５列：親のＥＳＢＡ２１２と比較した相対活性；第６列：第１列で特定された変異体につ
いての突然変異誘発ストラテジー。

第１２表： 生殖細胞系コンセンサス残基へと逆突然変異されたＥＳＢＡ２１２変異体
の比較と、ＦＴ−ＩＲで測定された全体の安定性へのそれらの寄与（熱的アンフォールデ
ィング転移について計算された中心点）

無関係のＥＳＢＡ１０５ ｓｃＦｖ抗体について確認されたのと同様に、生殖細胞系コ
ンセンサスへの逆突然変異は、ＥＳＢＡ２１２の熱安定性及び活性に悪影響を有するか、
又は影響を有さなかった。このように、これらの結果は、慣用のコンセンサスに基づくア
プローチの不備を更に強調するのに役立つ。これらの不具合は、本発明の機能的コンセン
サス方法論の使用によって対処できる。

例７： 改善された可溶性を有するｓｃＦｖの生成
この例においては、構造モデリングと配列分析に基づくアプローチを使用して、改善さ
れた可溶性をもたらすｓｃＦｖフレームワーク領域における突然変異を割り出した。

ａ） 構造分析
ＥＳＢＡ１０５ ｓｃＦｖの３Ｄ構造を、ＥｘＰＡＳｙウェブサーバを介してアクセス
可能な、自動化されたタンパク質構造ホモロジーモデリングサーバを用いてモデリングし
た。その構造を、相対的な溶媒到達可能表面（ｒＳＡＳ）により分析し、残基を以下のよ
うに分類した：（１）ｒＳＡＳ≧５０％を示す残基については曝露；及び（２）５０≦ｒ
ＳＡＳ≧２５％を有する残基については部分曝露。ｒＳＡＳ≧２５％を有する疎水性残基
は、疎水性パッチとして見なされた。見出された各疎水性パッチの溶媒到達可能領域を確
認するために、ＥＳＢＡ１０５に対する高いホモロジーと、２．７Åより高い解像度とを
有する２７のＰＤＢファイルから計算を行った。その平均ｒＳＡＳ及び標準偏差を、それ
らの疎水性パッチについて計算し、そのそれぞれについて詳細に調査した（第１３表を参
照）。

第１３表： 疎水性パッチの評価

１列目、ＡＨｏナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示される位置の
ドメイン。３列目、２７個のＰＤＢファイルから計算された平均溶媒到達可能領域。４列
目、３列目の標準偏差。５列目〜９列目、ＡＨｏから検索された疎水性パッチの構造的役
割。

ＥＳＢＡ１０５で割り出された疎水性パッチの殆どは、可変−定常ドメイン（ＶＨ／Ｃ
Ｈ）インターフェースと一致していた。このことは、ｓｃＦｖ形式における溶媒曝露され
る疎水性残基の今までの知見と相関していた（Ｎｉｅｂａ他、１９９７年）。２つの疎水
性パッチ（ＶＨ２及びＶＨ５）は、ＶＬ−ＶＨ相互作用にも寄与するので、後続の分析か
ら排除した。

ｂ） 可溶性突然変異の設計
１２２個のＶＬ配列と１３７個のＶＨ配列の全体は、ＡｎｎｅｍａｒｉｅＨｏｎｅｇ
ｇｅｒの抗体ウェブページ（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ）から
検索した。それらの配列は、本来、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｒｃｓ
ｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）から抽出されたＦｖもしくはＦａｂの
形式の３９３個の抗体構造と一致していた。それらの配列は、分析のために、種もしくは
亜群にもかかわらず、本来の残基よりも高い親水性を有する代替アミノ酸を見出す確率を
高めるために使用した。データベース内の任意の他の配列と９５％より高い同一性を有す
る配列は、偏りを減らすために排除した。それらの配列をアラインメントさせ、残基頻度
について分析した。配列分析ツールとアルゴリズムを適用し、ＥＳＢＡ１０５における疎
水性パッチを撹乱する親水性突然変異を割り出して選択した。それらの配列を、免疫グロ
ブリン可変ドメイン（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ ２００１年）に関し
てＡＨｏナンバリングシステムに従ってアラインメントさせた。その分析は、フレームワ
ーク領域に限定された。

カスタマイズされたデータベースにおける、各位置ｉについての残基頻度ｆ（ｒ）を、
特定の残基がデータセット内で確認された回数を配列の全数で除算することによって計算
した。第一ステップで、種々のアミノ酸の出現頻度を、各疎水性パッチについて計算した
。ＥＳＢＡ１０５で割り出された各疎水性パッチについての残基頻度は、前記のカスタマ
イズされたデータベースから分析した。第１４表は、疎水性パッチでの残基頻度をデータ
ベースに存在する残基の全体で割ったものを報告している。

第１４表： ＥＳＢＡ１０５で割り出された疎水性パッチについてのｓｃＦｖもしくは
Ｆａｂ形式における成熟抗体からの２５９個の配列の残基頻度

第１列、残基型。第２列ないし第５列、重鎖における疎水性パッチについての残基の相
対頻度。第６列及び第７列、軽鎖における疎水性パッチについての残基の相対頻度。

第二ステップにおいて、疎水性パッチでの親水性残基の頻度を用いて、各疎水性パッチ
での最も豊富な親水性残基を選択することによって可溶性突然変異を設計した。第１５表
は、このアプローチを使用して割り出された可溶性突然変異体を報告している。親の残基
と突然変異体の残基の疎水性を、幾つかの論文で公表された値の平均疎水性として計算し
、側鎖の溶媒への曝露のレベルの関数で表現した。

第１５表： 疎水性パッチを撹乱するＥＳＢＡ１０５に導入された種々の可溶性突然変
異

* 位置１４４での疎水性パッチは、データベース中に最も豊富な親水性残基によって
交換されないが、Ｓｅｒについては、これは既にＥＳＢＡ１０５のＣＤＲのドナー中に含
まれていたからである。

１列目、ＡＨｏナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示される位置の
ドメイン。３列目、２７個のＰＤＢファイルから計算された平均溶媒到達可能領域。４列
目、ＥＳＢＡ１０５における親の残基。５列目、ＡＨｏから検索された４列目の平均疎水
性。６列目、１列目に示される位置での最も豊富な親水性残基。７列目、ＡＨｏから検索
された６列目の平均疎水性。

ｃ） 可溶性ＥＳＢＡ１０５変異体の試験
可溶性突然変異を、単独で又は多重の組み合わせで導入し、そして再フォールディング
率、発現、活性及び安定性並びに凝集パターンについて試験した。第１６表は、可溶性へ
の潜在的な寄与と、突然変異が抗原結合を変更する危険性のレベルとに基づいて最適化さ
れた各ＥＳＢＡ１０５変異体に導入される可溶性突然変異の様々な組合せを示している。

第１６表： ＥＳＢＡ１０５に関する可溶性変異体の設計

* 別個に第二回目で試験した。

** 下線は、軽鎖と重鎖のそれぞれに含まれる突然変異の数を隔てている。

１列目、ＡＨｏナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示される位置の
ドメイン。３列目、ＥＳＢＡ１０５における種々の疎水性パッチでの親の残基。４列目、
示された位置に可溶性突然変異を含む種々の突然変異。

ｉ． 可溶性測定
ＥＳＢＡ１０５及び変異体の最大可溶性を、遠心分離されたＰＥＧ−タンパク質混合物
の上清中のタンパク質濃度を測定することによって決定した。２０ｍｇ／ｍｌの出発濃度
を、３０〜５０％の飽和度の範囲のＰＥＧ溶液と１：１で混合した。これらの条件を、Ｌ
ｏｇ ＳのＰｅｇ濃度（％ｗ／ｖ）に対する線形依存性の実験的な測定後に野生型ＥＳＢ
Ａ１０５について確認された可溶性プロフィールに基づき選択した。優れた可溶性を示し
た変異体ＥＳＢＡ１０５の幾つかの例の可溶性曲線を、図９に示す。可溶性値の完全なリ
ストを、また第１７表にも提供する。

第１７表： 該突然変異を親のＥＳＢＡ１０５と比較して推定される最大可溶性及び活
性

ｉｉ． 熱安定性測定
親のＥＳＢＡ１０５についての熱安定性測定と可溶性の再調査を、ＦＴ−ＩＲＡＴＲ
分光分析法を用いて実施した。それらの分子を、広範な温度（２５〜９５℃）に熱負荷し
た。変性プロフィールは、インターフェログラム信号にフーリエ変換をかけることによっ
て得られた（図１０を参照）。該変性プロフィールを用いて、ボルツマンシグモイドモデ
ルを適用することで、全てのＥＳＢＡ１０５変異体について熱的アンフォールディング転
移の中心点（ＴＭ）を見積もった（第１８表）。

第１８表： 全ての可溶性変異体についての熱的アンフォールディング転移の中心点（
ＴＭ）

ｉｉｉ． 凝集測定
ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体を、また時間依存性試験で分析して、分解挙動と
凝集挙動を評価した。この目的のために、可溶性タンパク質（２０ｍｇ／ｍｌ）を、高め
られた温度（４０℃）でリン酸緩衝液中でｐＨ６．５でインキュベートした。対照サンプ
ルを、−８０℃に保持した。それらのサンプルを、２週間のインキュベート期間の後に、
分解（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び凝集（ＳＥＣ）について分析した。これにより、分解を受
けやすい変異体（図１１を参照）又は可溶性もしくは不溶性の凝集物を形成する傾向を示
す変異体（第１９表を参照）の破棄が可能となった。

第１９表： 不溶性凝集測定

ｉｖ． 可溶性変異体の発現及び再フォールディング
それらの可溶性変異体を、また親のＥＳＢＡ１０５分子と比較して、発現及び再フォー
ルディング率について試験した。これらの研究結果を、第２０表に示す。

第２０表： 可溶性変異体の発現及び再フォールディング

全ての親水性の可溶性突然変異体は親のＥＳＢＡ１０５分子と比較して改善された可溶
性を示したが、これらの分子の幾つかだけが他の生物物理学的特性について好適であるこ
とが示された。例えば、多くの変異体は、親のＥＳＢＡ１０５分子と比較して、低減され
た熱安定性及び／又は再フォールディング率を有した。特に、位置ＶＬ１４７での親水性
置換は、安定性をひどく低下させた。従って、熱安定性に大きな影響を及ぼさない可溶性
突然変異を組み合わせて、それらの特性の確認のために更なる熱ストレスを受けさせた。

４種の異なる可溶性突然変異の組み合わせを含む３種の突然変異体（Ｏｐｔ１．０、Ｏ
ｐｔ０．２及びＶＨ：Ｖ１０３Ｔ）は、再現性、活性もしくは熱安定性に影響を及ぼすこ
となく、ＥＳＢＡ１０５の可溶性を大きく改善した。しかしながら、ＥＳＢＡ１０５にお
いてＯｐｔ１．０とＯｐｔ０．２の組み合わされた突然変異を有する突然変異体（Ｏｐｔ
１＿２）は、４０℃で２週間インキュベートした後に、高められた量の不溶性の凝集物を
示した（第１９表を参照）。これは、β−シートターンにおける位置ＶＬ１５でのＶａｌ
の役割によって説明できる。それというのも、Ｖａｌは、全てのアミノ酸のうちで最も高
いβ−シート傾向を有するからである。この結果は、位置ＶＬ１５での単独の可溶性突然
変異が許容されるが、他の疎水性パッチを撹乱する可溶性突然変異体との組み合わせにお
いては許容されないことを裏付けている。従って、Ｏｐｔ０＿２及びＶＨ：Ｖ１０３Ｔに
含まれる突然変異は、ｓｃＦｖ分子の可溶性特性を改善するために最良の性能を有するも
のとして選択された。

例８： ｓｃＦｖの増強された可溶性及び安定性の生成
可溶性設計によって割り出されたＥＳＢＡ１０５変異体を、更に、クオリティー・コン
トロール（ＱＣ）アッセイによって割り出された安定化突然変異と置き換えることによっ
て最適化した。前記の例７で割り出された可溶性突然変異の１〜３つを、ＱＣ７．１及び
１５．２で見出された全ての安定化突然変異（すなわちＶＬドメインにおけるＤ３１Ｎ及
びＶ８３Ｅ並びにＶＨドメインにおけるＶ７８Ａ、Ｋ４３及びＦ６７Ｌ）と組み合わされ
て含む全部で４つの構築物を作製した。全ての最適化された構築物により、野生型ｓｃＦ
ｖよりも高い可溶性を有するタンパク質が得られた（第２０表を参照）。最良の構築物は
、一貫して、野生型に対して可溶性について２倍より高い増大を示した。ｓｃＦｖ分子の
活性と安定性のいずれも、安定化突然変異と可溶性増強突然変異との組み合わせによって
大きな影響を受けなかった。

第２１表： 最適化された可溶性及び安定性を有するｓｃＦｖ

全ての４つの変異体についての可溶性値を、ｓｃＦｖの可溶性に対する各突然変異の寄
与の分析のために使用した。全ての突然変異は、これらの残基の幾つかが一次配列と３Ｄ
構造の両者において互いに比較的近いにもかかわらず、ｓｃＦｖの可溶性に相加的に寄与
すると思われた。その分析は、ＶＨドメイン中の３つの可溶性増強突然変異（Ｖ１２Ｓ、
Ｌ１４４Ｓ、Ｖ１０３Ｔ（もしくはＶ１０３Ｓ））の組み合わせが、ｓｃＦｖ可溶性の６
０％までの原因となることを示している。疎水性パッチは全てのイムノバインダーの可変
ドメインで保存されているので、前記の最適な突然変異の組み合わせを使用して、事実上
いかなるｓｃＦｖも又は他のイムノバインダー分子の可溶性をも向上させることができる
。

等価物
当業者は、単に通常の実験を用いて、本願に記載される本発明の特定の実施態様に対す
る多くの等価物を認識し、又は確認することができる。斯かる等価物は、特許請求の範囲
によって含まれると意図される。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。

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