ES2225269T3 - Intracuerpos con esqueleto definido que es estable en un ambiente reductor y aplicaciones de los mismos. - Google Patents

Intracuerpos con esqueleto definido que es estable en un ambiente reductor y aplicaciones de los mismos.

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ES2225269T3 ES00979875T ES00979875T ES2225269T3 ES 2225269 T3 ES2225269 T3 ES 2225269T3 ES 00979875 T ES00979875 T ES 00979875T ES 00979875 T ES00979875 T ES 00979875T ES 2225269 T3 ES2225269 T3 ES 2225269T3
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Abstract

Un método para la identificación de las redes de intracuerpos o intracuerpos donde las células huésped adecuadas son transformadas mediante una librería donde dicha librería es un producto de fusión de un intracuerpo con una proteína marcadora donde dicha proteína marcadora es solamente activa como parte de una proteína de fusión codificando una parte soluble y estable de un intracuerpo, entonces cultivando las mencionadas células bajo condiciones que permitan la identificación y la selección de aquellas células que expresen una red soluble y estable de intracuerpo por medio de la detección de la proteína marcadora.

Description

Intracuerpos con esqueleto definido que es estable en un ambiente reductor y aplicaciones de los mismos.
Campo técnico
La presente invención incumbe a fusiones de cadena simple de regiones variables de cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo (scFv), en particular tales scFv expresadas dentro de una célula (intracuerpos) con un esqueleto definido y estable.
Campo de la invención
Los anticuerpos son herramientas preferidas para la investigación biológica molecular y bioquímica, los diagnósticos y aplicaciones médicas debido a su elevada afinidad y especificidad al antígeno y debido a su estabilidad relativamente elevada in vitro e in vivo. Los anticuerpos constan de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, que contienen las regiones variables en su N-terminal y que están unidas por puentes disulfuro. Los anticuerpos de cadena simple han sido diseñados mediante la unión de los fragmentos de regiones de cadena ligera y pesada variables (scFv). Cada dominio variable contiene tres regiones determinantes complementarias (CDR) embebidas en un esqueleto. Estos CDRs son responsables de la interacción con el antígeno. Cada región ligera y pesada variable contiene un puente disulfuro intradominio, el cual se refirió ser crítico para la estabilidad del anticuerpo de cadena única (Biocca et al., 1995; Derman et al., 1993).
La técnica más comúnmente utilizada para identificar los anticuerpos de cadena simple que se unen a epítopos específicos mediante la presentación de un fago y variaciones del mismo (para revisión ver Hoogenboom et al., 1998). Este sistema de criba tiene grandes ventajas sobre técnicas convencionales como la inmunización o la técnica del hibridoma, concretamente permite descubrir anticuerpos monoclonales de cadena simple en un tiempo relativamente corto.
Se llama intracuerpos a aquellos anticuerpos de cadena simple expresados en el interior de la célula (pej. en el citoplasma o en el núcleo). Dado el ambiente reductor presente en el interior de la célula, los puentes disulfuro, los cuales se cree son críticos para la estabilidad de los anticuerpos, no se forman. De este modo, inicialmente se creyó que las aplicaciones con intracuerpos no serían apropiadas. Sin embargo, muchos casos que demuestran la viabilidad de los intracuerpos han sido descritos (Beerli et al., 1994; Biocca et al., 1994; Duan et al., 1994; Gargano y Cattaneo, 1997; Greenman. et al., 1996; Martineau et al., 1998; Mhashilkar et al., 1995; Taviadoraki et al., 1993). En estos casos, los intracuerpos actúan pej. bloqueando el antígeno citoplasmático y por lo tanto inhibiendo su actividad biológica.
Hasta ahora, los intracuerpos eran principalmente derivados de anticuerpos monoclonales los cuales habían sido previamente seleccionados mediante técnicas clásicas (pej. presentación de fago), y posteriormente testados para su actividad biológica como intracuerpos en el interior de la célula (Visintin et al., 1999). Aunque han sido descritos intracuerpos eficaces (véase arriba), a día de hoy todavía es totalmente impredecible si un intracuerpo será funcional en el interior de la célula (para revisión ver Cattaneo, 1998; Cattaneo y Biocca, 1999). La explicación más probable para ello es la diferencia en los entornos: la presentación de fago y otras técnicas clásicas se realizan en condiciones oxidantes, por lo tanto los puentes disulfuro están formados, mientras que los intracuerpos deben funcionar en condiciones reductoras. Este entorno reductor puede llevar a una solubilidad insuficiente del intracuerpo y, por lo tanto, a que formen agregados no funcionales. La solubilidad de un intracuerpo puede ser modificada por cambios en la red (Knappik y Pluckthun, 1995) o en las CDRs (Kipriyanov et al., 1997; Ulrich et al., 1995).
Sin embargo, los sistemas conocidos hasta ahora son limitados respecto a su aplicación en la detección de dianas intracelulares. Por lo tanto, hay una creciente necesidad de tener una tecnología fiable y un sistema para la búsqueda directa de intracuerpos específicos de un antígeno.
En WO 99/36569, Wittrup et al. describe un método para mostrar proteínas y scFv en la pared celular de la levadura utilizando una proteína endógena de la levadura derivada de Aga2p para localización en la pared celular. Librerías de proteínas y scFv pueden ser exploradas mediante la interacción con otras proteínas. Otros sistemas relacionados han sido descritos en EP 0 407 259 (Boquet et al., 1991). Estos sistemas son comparables a la criba por presentación de fago donde la proteína o librería de péptidos es también presentada en la superficie. Sin embargo, estas técnicas no pueden ser usadas para realizar cribas intracelulares para la identificación de intracuerpos.
La patente JP 11000174 (Kyoko, et al., 1999) describe el uso de la levadura Pichia pastoris para la expresión y secreción a alto nivel de fragmentos Fab de anticuerpo. Esta levadura es conocida por su elevado nivel de secreción siendo por lo tanto preferible su uso para esta aplicación. El anticuerpo secretado puede ser recogido por purificación del sobrenadante. Además, en EP 0 590 067, W092/22324, JP 060 30 778, US 569 8435, US 559 5889, JP 10313876 la levadura es utilizada para la producción de proteínas o anticuerpos secretados. En EP 0 698 097 y WO 94/25591 se revela la aplicación de la producción y secreción de solamente la cadena pesada o fragmentos de la misma para otras aplicaciones. En JP 0 902 0798; JP 051 05700; y JP 050 97704 se describen métodos de secreción mediante levaduras para la obtención de vacuna contra la hepatitis cuando se administra en el cuerpo humano o en organismos en general.
Es también ya conocido, a partir de WO 99/28502, el uso de levaduras para realizar cribas de anticuerpos de cadena simple. Dicha aplicación revela el uso de una librería de constructos de ADN para un reactivo de fusión de anticuerpo monoclonal de cadena sencilla. Esta librería de scFv (conocida como librería scFv) es usada posteriormente para realizar cribas. Sin embargo, ahora se ha descubierto que la estabilidad y la solubilidad de los intracuerpos puede variar dramáticamente a causa del uso de una red no especificada. Además, el uso de librerías derivadas de ARNm de diferentes fragmentos scFv es limitada en lo que respecta a la posibilidad de identificar aquellos CDRs que poseen gran afinidad hacia el antígeno porque, aunque los CDRs en principio mostrarían la alta afinidad requerida hacia el antígeno, la red correspondiente no es suficientemente soluble y por lo tanto se agrega, haciendo imposible la selección de estas scFv monoclonales. De este modo, existe todavía una necesidad de anticuerpos o intracuerpos mejorados, respectivamente.
En el artículo de Martineau P. et al., (J. Mol. Biol. (1998) 280, 117-127) se describe un sistema de selección genética para fragmentos de anticuerpo plegados y funcionales en E. coli. Dicho sistema se basa en mutantes AMEF del enzima \beta-galactosidasa la cual es inactiva pero es catalítica cuando es incubada en presencia de anticuerpos dirigidos contra \beta-galactosidasa salvaje. Los autores aislaron anticuerpos de cadena simple (scFv) contra \beta-galactosidasa a partir de una librería de fago y testaron la actividad intracelular de dichas scFv en bacterias.
En Antje Pörtner-Taliana et ate., (Journal of Immunological Methods 238 (2000), 161-172) se revela el uso del sistema del doble híbrido para la selección in vivo de anticuerpos de cadena sencilla en levadura. La viabilidad de este sistema está demostrada mediante la criba de una librería de scFv clonada en un vector doble híbrido de levadura para moléculas cuya diana es el ATF-2, un miembro de la familia de factores de transcripción CREB/ATF. El sistema se basa en la interacción específica entre una scFv y su antígeno.
Las crecientes aplicaciones de las scFv dirigidos contra dianas intracelulares hacen emerger la necesidad de sistemas fiables para la criba de anticuerpos. La unión a dianas citoplasmáticas de las scFv es la más exigente de las aplicaciones dada la inestabilidad de las scFv bajo condiciones reductoras y la impredecibilidad de la estabilidad de los anticuerpos. Estos problemas de estabilidad y solubilidad pueden ser resueltos mediante el uso de esqueletos definidos, optimizados para aplicaciones intracelulares.
Revelación de la invención
Por lo tanto, es objeto de la presente invención proporcionar métodos para el aislamiento de una scFv o intracuerpo con una red definida que sea estable y soluble en un ambiente reductor.
En una primera realización del método para la identificación de esqueletos de intracuerpos o intracuerpos comprende los siguientes pasos:
células huésped adecuadas son transformadas mediante una librería que es producto de una fusión de un intracuerpo con una proteína marcadora la cual es solamente activa como parte de una proteína de fusión que codifica la parte soluble y estable del intracuerpo, dichas células han de ser cultivadas bajo condiciones que permitan la identificación y selección de células que expresen un esqueleto soluble y estable de intracuerpos a través de la detección de la proteína marcadora (actividad).
Dicha proteína marcadora posee preferiblemente una actividad susceptible de ser seleccionada, en particular una actividad enzimática o actividad fluorescente.
Otra realización del método para la identificación de redes de intracuerpos o intracuerpos comprende los siguientes pasos:
transformación de células huésped adecuadas mediante una librería la cual es un producto de fusión de una librería de intracuerpos y una proteína de unión a ADN capaz de activar la transcripción, y un sistema marcador el cual se encuentra bajo el control de dicha proteína de unión a ADN, y el cultivo de dichas células bajo condiciones que permitan la identificación y la selección de aquellas células que expresen un intracuerpo soluble y estable mediante la detección de la señal de dicho sistema marcador.
Aún otra realización del método para la identificación de redes de intracuerpos o intracuerpos comprende los siguientes pasos:
transformación de células huésped adecuadas mediante una librería la cual codifica para proteínas que contienen un intracuerpo y una parte de un sistema de transactivación y además dichas células expresan una segunda proteína comprendiendo al menos la segunda parte del mencionado sistema de transactivación, donde el mencionado sistema de transactivación esta ligado a un marcador imprescindible para la supervivencia y dichas células solo pueden sobrevivir bajo condiciones selectivas en presencia de una interacción entre las dos proteínas mencionadas vía una región constante de la proteína codificada en la librería.
Dicha librería codifica proteínas que preferiblemente comprenden un dominio de activación transcripcional y dichas segundas proteínas comprenden un dominio de unión a ADN o dicha librería codifica proteínas que comprenden un dominio de unión a ADN y dichas segundas proteínas comprenden un dominio de activación transcripcional.
En una realización preferida dichas segundas proteínas comprenden un dominio de unión a ADN o un dominio de transactivación, respectivamente, y una proteína que interacciona con la región constante de dicha primera proteína codificada por la librería.
En una más preferible realización dicha librería codifica una proteína la cual comprende el dominio de activación de la transcripción de GAL4 y Gal11P y dicha segunda proteína comprende el dominio de unión a ADN de Gal4.
Otro objeto de la presente invención es un método para obtener una scFv con una red definida que es estable y soluble en un ambiente reductor, comprendiendo
a) aislamiento de una scFv de acuerdo con un método del primer objeto de la presente invención,
b) generación de una librería de scFv con esqueletos variadas y CDRs constantes mediante la mutación en la región de secuencia de ADN que codifique para un esqueleto de la scFv del paso a), y por introducción de tales mutaciones en los vectores de expresión adecuados,
b) transformación de células huésped capaces de expresar un antígeno específico y conocido que sobrevivan solo en presencia de la interacción antígeno-scFv con dicha librería de scFv,
c) Las células huésped así transformadas son cultivadas bajo condiciones adecuadas para expresar el antígeno y la scFv y permitiendo la supervivencia de la célula solo en presencia de la interacción antígeno-scFv.
d) la scFv expresada en las células supervivientes y teniendo una red definida que es estable y soluble en un ambiente reductor es aislada.
Los mismos métodos pueden ser también aplicados para la criba de cualquier librería de scFv para identificar esqueletos solubles y estables que pueden pej. ser usados como material de inicio para una librería de scFv o CDR.
Los intracuerpos de la presente invención pueden además ser usados como agentes en terapia, diagnosis o prevención de enfermedades y en múltiples aplicaciones en plantas, tales como knock out funcionales de una actividad proteica determinada. Los intracuerpos pueden ser utilizados como tales o como ADN codificante de tales scFv.
En el ámbito del presente texto, los términos scFv e intracuerpo son ampliamente usados como sinónimos, sin embargo, debe de ser entendido que, mientras que la estabilidad y la solubilidad de los intracuerpos (scFv) con un esqueleto definido de la presente invención en ambiente reductor, pej. dentro de una célula, es necesaria para la presente invención, la aplicación de tales intracuerpos (scFv) etc. no está restringida a aplicaciones dentro de una célula.
Solamente introduciendo cambios en los aminoácidos contenidos en los CRDs, tal esqueleto de acuerdo con la presente invención incrementa en gran medida la posibilidad de identificar anticuerpos monoclonales que presenten la función biológica deseada de reconocimiento de antígenos específicos. Tales cambios en los CDRs de las scFv pueden ser realizados como cambios aleatorios sin cambiar el esqueleto definido, adecuado para la aplicación citoplasmática de los intracuerpos.
Con la finalidad de realizar cribas de anticuerpos monoclonales de cadena sencilla dentro de la célula, se debe usar un esqueleto el cual sea adaptada al ambiente redox del citoplasma. Por lo tanto un esqueleto debe de ser suficientemente estable y soluble aún en la ausencia de puentes disulfuro. Sin embargo, es sabido que muchas de las scFv no se pliegan en la estructura apropiada bajo condiciones reductoras o en ausencia de cisteína, responsable de la formación de los puentes disulfuro intradominio. De este modo, en el ámbito de la presente invención varios esqueletos conteniendo CDRs idénticos han sido comparadas habiéndose observado dramáticas diferencias en la acción in vivo. mediante el método inventivo pueden seleccionarse aquellos esqueletos con mejor funcionamiento y conteniendo los CDRs definidos para reconocimiento de antígeno. Este método es realizado usando un intracuerpo con un antígeno conocido como material de inicio. El encadenador utilizado para conectar las regiones variables de las cadenas ligera y pesada no es crítico. Sin embargo, debe proporcionar suficiente solubilidad y flexibilidad para asegurar un contacto y un pliegue adecuados para la interacción de entre CDRs y antígeno. Encadenadores apropiados presentan una longitud típica de 5-60 aminoácidos, normalmente series regulares de glicina y, con la finalidad de potenciar la solubilidad, de 1 a 3 serinas.
Tal método para el aislamiento de un scFv con una red definida que es estable y soluble en un ambiente reductor es definido por los siguientes pasos:
a)
una librería de scFv con redes variadas y CDRs constantes es generada por mutación de al menos una región de secuencia de ADN codificante de red de una scFv con antígeno conocido y por la introducción de tales mutaciones en los vectores de expresión adecuados,
b)
células huésped capaces de expresar un antígeno específico y conocido y que sobrevivan solamente en presencia de la interacción antígeno-scFv son transformadas con las mencionadas librerías scFv,
c)
Las células huésped transformadas de esta manera son cultivadas bajo condiciones apropiadas para expresar el antígeno y la scFv, permitiendo solamente la supervivencia de las células en presencia de la interacción antígeno-scFv,
d)
La scFv expresada en las células supervivientes y teniendo una red definida que es estable y soluble en ambiente reductor es aislada.
En una realización preferible la célula huésped es una célula eucariota, concretamente una levadura.
Por el método descrito anteriormente una scFv con un esqueleto definido puede ser obtenible. Tal esqueleto puede ser modificado para contener sitios de restricción específicos que permitan el cambio selectivo de al menos un CDR. Preferiblemente dichos sitios de restricción están localizados en el esqueleto que flanquea un CDR.
Además, está descrito un método para la generación de un ADN codificante para una scFv con un esqueleto adecuado para alteraciones selectivas en la región CDR, en donde los sitios de restricción específicos son introducidos en una secuencia de ADN codificante para una scFv definida, estable y soluble a través de mutagénesis dirigida donde los mencionados sitios de restricción se encuentran preferiblemente localizados en el esqueleto y donde la sustitución de nucleótidos para generar los sitios de restricción no afecta la secuencia de aminoácidos.
Una scFv mejorada con un esqueleto definido que es estable y soluble en un ambiente reductor puede también ser obtenida a través de un método donde al menos dos variaciones de al menos dos diferentes esqueletos que son estables y solubles en un ambiente reductor, preferiblemente esqueletos de la presente invención son combinados para producir una scFv con un esqueleto definido.
En tal esqueleto es preferible que al menos una de las variaciones preceda el CDR1 de la cadena ligera variable y/o al menos una de las variaciones esté localizada entre el CDR2 y el CDR3 de la región pesada variable.
En una realización más preferible el scFv comprende al menos 2 variaciones precedentes al CDR1 del la cadena ligera variable y al menos 2, preferentemente al menos 4 variaciones localizadas entre el CDR2 y el CDR3 de la cadena pesada variable, en particular un scFv comprendiendo el esqueleto definido en ID. DE SEC. NO 1.
Con la finalidad de aleatorizar de forma específica los CDRs en tal esqueleto, cambios silenciosos, aquellos que codifican por las mismas secuencias de aminoácidos pero utilizando diferentes codones, pueden ser introducidos y llevar a la generación de sitios de restricción únicos (ver también más arriba). Mientras los sitios de restricción pueden estar localizados en cualquier lugar de las regiones que conectan los CDR con el esqueleto, es preferible que estos se localicen en el esqueleto que flanquea cada CDR individual. De esta manera, cada CDR individual puede ser reemplazado mediante la introducción de secuencias aleatorias o definidas. Esto permite seleccionar nuevos CDR con elevada afinidad por el antígeno en el intracuerpo.
Cuando secuencias adicionales, como señales de localización o dominios de activación son introducidos en una red no definida, procedente de una librería de scFv, es posible que debido a estas modificaciones, la actividad biológica - presente hasta aquel momento - sea perdida, pej. la scFv deviene insoluble. Por lo tanto, resulta ventajoso utilizar un esqueleto definido de la presente invención para un antígeno conocido y posteriormente introducir tales modificaciones en diferentes localizaciones en el intracuerpo (extremos N- y C- terminales o en la secuencia codificante para la scFv) y seleccionar por el mantenimiento de la función original. En WO 99/28502 se describen varias posibilidades para la introducción de una señal de localización. En WO 99/98502 ha sido descrita la introducción del dominio de activación utilizado para cribas de interacción para un antígeno en el extremo C-terminal de la librería de scFv. Ha sido descubierto que mediante el método de la presente invención también pueden ser seleccionados esqueletos que acepten secuencias adicionales en diferentes localizaciones pej. el dominio de activación en el extremo N-terminal, el cual todavía funciona de forma similar a sus scFv homologas, en la función antagónica. Por lo tanto, pej. en el esqueleto que será más profundamente descrito en siguientes ejemplos, la introducción de un dominio de activación N-terminal no perjudica a la función del anticuerpo.
Partiendo de un intracuerpo de la presente invención con un esqueleto definido que es estable y soluble en un ambiente reductor, scFv o intracuerpos, respectivamente, se pueden generar librerías conteniendo CDR.
Un método adecuado para la generación de una librería de CDR con un esqueleto definido, que es estable y soluble en un ambiente reductor es un método en el que las secuencias de ADN codificantes para una scFv de la presente invención es digerida para reemplazar al menos un CDR por secuencia por un CDR modificado. Preferiblemente el CDR modificado es generado por cambios aleatorios. A través de este método puede ser generada una librería de intracuerpos con al menos un CDR aleatorizado y con una red definida que es estable y soluble bajo condiciones reductoras.
Los intracuerpos de la presente invención conteniendo librerías de CDR pueden ser utilizados para cribar y seleccionar aquellos clones que tengan una elevada afinidad hacia el antígeno. Este método para la criba de CDRs que interaccionan con un antígeno específico comprende células huésped transformadas mediante una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia de ADN, que codifique un antígeno conocido y sean también transformadas mediante una librería de CDR aleatorizados con una red definida que es estable y soluble en un ambiente reductor, donde el antígeno y/o la scFv están ligados a un sistema marcador o parte del mismo y de este modo aquellas células cultivadas bajo condiciones selectivas solo puedan sobrevivir en presencia de la interacción antígeno/scFv, que las células transformadas de esta manera son cultivadas bajo condiciones selectivas, y que las células supervivientes son selecionadas y los intracuerpos recogidos.
En una realización preferida el esqueleto es un esqueleto de la presente invención y la célula es una célula eucariota, en particular una levadura.
En una realización más preferible tanto la secuencia de ADN que codifica el antígeno con la secuencia de ADN que codifica la scFv deben codificar para moléculas quiméricas con el antígeno o la scFv, respectivamente, ambas ligadas a una parte de un sistema de activación de la transcripción ligado un sistema que permita la supervivencia, es más preferible que el antígeno este fusionado a un dominio de unión a ADN y la scFv esté fusionada a un dominio activador de la transcripción o el antígeno sea fusionado a un dominio de activación de la transcripción y la scFv este fusionada a un dominio de unión a ADN.
Los intracuerpos conteniendo librerías de CDR pueden ser usados para la criba y selección de clones que tengan una gran afinidad para el antígeno. Esto puede ser conseguido mediante el bloqueo de la función biológica del antígeno localizado intracelularmente o bien intentando la interacción directa del CDR embebido en el esqueleto definido hacia el antígeno. La interacción directa puede ser preferiblemente monitorizada mediante una señal transcripcional, preferiblemente por la expresión del gen HIS3. Añadiendo 3-aminotriazol (3AT) al medio, permite la selección de aquellos CDRs de más alta afinidad hacia el antígeno bajo dichas condiciones predeterminadas. Las células huésped que sean capaces de expresar un antígeno específico conocido solo sobreviven en presencia de la interacción antígeno-scFv bajo dichas condiciones, preferiblemente en presencia de una interacción antígeno-scFv suficientemente fuerte. El término suficientemente fuerte aquí usado se define como interacciones proteína-proteína teniendo una K_{D}, medida por Biacore, la cual es > 1x10^{-6} M, preferiblemente una K_{D} > 1x10^{-8} M y más preferiblemente una K_{D} > 1x10^{-10} M. Tal paso de selección puede ser utilizado más allá aplicándolo a la realización de maduración de afinidad mediante cambios selectivos o aleatorios de los aminoácidos que constituyen los CDR (preferentemente CDR1 y CDR2 de las cadenas ligera y pesada) y posteriormente seleccionarlos a partir de este reservorio para el crecimiento en un medio con concentración de 3AT incrementada.
Como ya se ha mencionado más arriba, las librerías de scFv conocidas hasta el momento derivan del aislamiento de ARNm preferiblemente procedente de bazo del que se conoce que presenta una elevada acumulación de células B y por lo tanto anticuerpos reorganizados pueden ser expresados. Tal librería tiene el inconveniente de haber sido pre-seleccionada (selección positiva y negativa) para que no reaccione contra epítopos presentes en el organismo. Esto garantiza que solo maduren y sean activados aquellos anticuerpos que no pueden iniciar una reacción autoinmune. Sin embargo, debido a estos pasos de selección, no todas las posibles combinaciones de aminoácidos están presentes en esta librería de scFv "natural". Para varias aplicaciones diagnósticas e in vitro, se requiere que los anticuerpos interaccionen con proteínas las cuales son conservadas entre las especies. Para tales proteínas o péptidos, debe de ser muy difícil encontrar anticuerpos monoclonales que interaccionen fuertemente en librerías de scFv "naturales" debido a los pasos de pre-selección. Además, los esqueletos presentes en tales librerías "naturales" no están optimizadas, por lo tanto se generan problemas de insuficiente o variable solubilidad y/o estabilidad, respectivamente. Por lo tanto es una gran ventaja el usar solamente librerías de CDR randomizados comprendiendo un esqueleto de y/o obtenible mediante el método de la presente invención y, cubrir o, preferiblemente, todas las posibles combinaciones de secuencias de aminoácidos en estas regiones.
Con la finalidad de describir en mayor profundidad la presente invención, un esqueleto de intracuerpo estable y soluble con regiones determinantes complementarias (CDRs) definidas dirigidas contra el factor de transcripción intracelular Gcn4p de la levadura fue seleccionada. Este esqueleto definido fue utilizado para reemplazar los CDRs por secuencias aleatorias. Estas librerías de CDR son cribadas para identificar nuevos CDR que causen una actividad biológica demandada (efecto in vivo de los CDRs).
a)
interacciones moleculares las cuales ocurren naturalmente en la célula (pej. en células humanas o cualesquiera otras células heterólogas) son reconstruidas en una célula adecuada, preferiblemente una levadura, o interacciones endógenas de levadura son usadas. Una criba posterior identifica los CRDs de alta afinidad dada la interferencia de estos CDRs en la actividad biológica de las moléculas endógenas o reconstituidas. Tales CDRs antagonistas podrían pej. funcionar por bloqueo de dos proteínas implicadas en vías de transducción de señal.
b)
Son seleccionados los CDRs agonistas que inducen una función biológica demandada en las moléculas endógenas o reconstituidas.
Los CDRs aleatorios embebidos en el esqueleto estable pueden además ser utilizados para la identificación de interacciones de CDR con un antígeno en base a cribas de interacción:
a)
Puede ser demostrado que la red seleccionada puede ser fusionada a un dominio de activación de la transcripción conservando su función. Este intracuerpo quimérico es utilizado para la selección de CDRs de alta afinidad contra un antígeno dado fusionado a un dominio de unión a ADN o a un factor de transcripción que posea actividad de unión a ADN. Tras la interacción del antígeno con los CDRs, el dominio de activación transcripcional media la expresión génica de un gen marcador seleccionable que permita la supervivencia de esta célula bajo condiciones selectivas.
b)
Una interacción molecular reconstituida basada en una técnica híbrida (fusión de un acompañante a un dominio de activación, o en caso de que sea necesario a un dominio de unión a ADN) puede ser bloqueada por CDRs específicos de alta afinidad.
Fue también descubierto que diferentes mutaciones en el esqueleto conservando CDRs constantes en el intracuerpo tienen un efecto en su actividad in vivo a través de cambios en la estabilidad y solubilidad del intracuerpo. El esqueleto contribuye a la mayor parte de la estabilidad y la solubilidad de un intracuerpo. Sin embargo, ciertas mutaciones en los CDRs pueden también afectar la solubilidad y la estabilidad del intracuerpo. Por lo tanto puede ser ventajosa la preselección de CDRs aleatorios embebidos en un esqueleto definido a través de control de calidad funcional (ver más abajo).
Para todos los propósitos de la presente invención son preferibles las células eucariotas, donde las levaduras son células especialmente preferibles dadas sus especiales características que incluyen pej. crecimiento rápido, selección positiva, selección de crecimiento y transformación eficiente y selección del mismo.
Breve descripción de las figuras
Figura 1A muestra como se puede realizar un control de calidad de la librería de scFv o CDR.
Figura 1B muestra que la solubilidad de las proteínas de fusión está correlacionada con la activación génica del gen marcador.
Figura 2 muestra la mejor acción in vivo para el Ga14 AD-\Omega-injerto scFv optimizado en comparación con otra variante llamada \lambda-injerto.
Figura 3A muestra la acción in vivo de diferentes fragmentos de scFv en la expresión génica de un gen marcador Gcn4p dependiente de LacZ.
Figura 3B muestra la acción in vivo de diferentes fragmentos de scFv expresados en levadura, en un ensayo de doble híbrido.
Figura 4 muestra la selección de crecimiento en un ensayo de doble híbrido de las células que expresan diferentes fragmentos de scFv.
Figura 5A muestra que la fusión N-terminal de un dominio constante (Gal11P-Ga14AD) a un anticuerpo de cadena simple no afecta de forma significativa las propiedades de dicho fragmento de scFv en la expresión génica de un gen marcador Gcn4p dependiente de LacZ.
Figura 5B muestra que la introducción de solamente dos sitios de restricción en un anticuerpo de cadena simple no cambia las propiedades de este fragmento scFv en la expresión génica de un gen marcador LacZ.
Figura 6 muestra un análisis por Western blot de la solubilidad de diferentes fragmentos scFv de unión a Gcn4p expresados en levadura.
Modos para el desarrollo de la invención Control de calidad de las librerías de scFv y CDR
El término "control de calidad" define un ensayo que permite la selección de un intracuerpo estable y soluble a partir de una librería de scFv.
Con esta finalidad se genera una fusión de la librería de scFv a un dominio de activación de la transcripción (en este caso Gal4AD) y una región constante (en este caso Gal11P aminoácidos 263-352). La estabilidad de la proteína de fusión depende de la estabilidad y la solubilidad de la porción de scFv. El dominio constante Gal11P interacciona con el dominio de dimerización de Gal4 (residuos 58-97, parte del dominio de unión a ADN de Gal 4 (DBD) (Barberis et al., 1995)).
Esta librería es transformada en células de levadura que expresan el Ga14 DBD (residuos 1-100) que se une al promotor de un gen marcador seleccionable (pej. HIS3/LacZ). El crecimiento de esta célula huésped solamente se produce cuando el intracuerpo testado muestra la solubilidad y la estabilidad demandadas y por lo tanto puede interaccionar de forma suficiente vía Gal11P con el Gal4 DBD (ver Figura 1A).
La solubilidad se correlaciona con la activación génica
El principio del sistema de control de calidad descrito en la presente invención fue demostrado utilizando un número de scFv bien caracterizadas. Estas poseían propiedades de unión a antígeno esencialmente idénticas pero diferentes estabilidades in vitro. Los diferentes fragmentos scFv fueron expresados como proteínas de fusión Gal11P-Gal4AD. El dominio de dimerización de Gal4 (residuos 58-97) fue fusionado al extremo C-terminal de LexA y transformado en la cepa marcadora YDE173, que contiene genes marcadores bajo el control de sitios de unión 6x LexA (ver más abajo).
Como se ha enunciado más arriba, la estabilidad y solubilidad intracelulares de las proteínas de fusión Gal11P-Gal4AD-scFv depende la porción scFv. Por lo tanto, solamente aquellas proteínas de fusión scFv que sean estables y solubles que interaccionen suficientemente con LexA-Gal4 (58-97) son capaces de activar la expresión del gen marcador (pej. \beta-galactosidasa).
El alelo salvaje de Gal11 no interacciona con el dominio de dimerización Gal4 (residuos 58-97). Una fusión de cualquier cadena simple con el alelo salvaje Gal11 es por lo tanto incapaz de activar el gen marcador y sirve de control negativo. Esto fue demostrado utilizando un injerto constructo de fusión Gal11 salvaje - Gal4AD-\lambda (ver Figura 1B).
Ni el cebo (LexA-Gal4(58-97)) ni la proteína de fusión scFv pueden activar por si solos la expresión del gen marcador.
Solamente 2 de los 6 fragmentos scFv testados fueron suficientemente solubles y estables para activar la expresión génica del gen marcador en nuestro sistema de control de calidad. Los esqueletos estabilizado de injerto-\lambda e injerto-K son las variantes más estables. Este resultado correlaciona perfectamente con el análisis de fraccionamiento, donde solamente los injertos \lambda y K fueron encontrados en la fracción soluble. (ver Figura 6).
Fragmentos scFv expresados citoplasmáticamente en levadura
Son fragmentos scFv adecuados pej. el antiGCN4 scFv salvaje que fue originalmente obtenido mediante presentación de ribosoma procedente de una librería construida a partir de un ratón inmunizado (Hanes et al., 1998). El antígeno era un mutante doble prolina en la cremallera de leucina Gcn4p, llamado 7P14P (indicando que las posiciones 7 y 14 del dominio en cremallera están mutadas a residuos Pro), el cual forma una hélice aleatoria en solución (Leder et al., 1995). El fragmento scFv impide la dimerización in vitro del péptido salvaje Gcn4p plegado en hélice (Berger et al., 1999), ya que también se une al péptido salvaje como monómero en una conformación helicoidal aleatoria. El fragmento scFv anti-GCN4 referido como "salvaje" en conexión con la presente invención ha sido medido para tener una constante de disociación de 4\cdot10^{-11}M del péptido cremallera de leucina (Hanes et al., 1.998).
En el ámbito de la presente invención, varios mutantes diferentes de este scFv fueron investigados. Además del anti-GCN4 salvaje, una variante desestabilizada del anti-GCN4 salvaje, el cual es portador de la mutación H-R66K [llamado anti-GCN4(H-R66K)], sirvió como un ejemplo de fragmento scFv de unión a Gcn4p con propiedades de unión a antígeno esencialmente idénticas, aunque con una estabilidad in vitro ligeramente disminuida (ver más abajo). El residuo Arg en la posición H-66 (numeración de acuerdo con Kabat et al., 1991) se encuentra lejos del bolsillo de unión a antígeno y normalmente forma un puente de hidrógeno doble con la Asp H-86. Se demostró que la Arg en la posición H-66 proporciona una elevada estabilidad a la proteína comparada con Lys en el fragmento scFv levan de unión a A48 (Proba et al., 1998; Wörn y Plückthun, 1998a). Además una variante Val-Ala del fragmento scFv anti-GCN4 [llamado anti-GCN4(SS^{- -})] fue testada, donde ambos disulfuros intradominio fueron reemplazados por pares Val-Ala (LC23V, L-C88A, H-C22V, H-C92A). Se demostró que estas mutaciones inducen una ligera estabilización en comparación a la forma ditiol reducida del fragmento scFv p185HER2 de unión a 4D5, y se ha especulado que podrían mejorar la acción de los intracuerpos (Wörn y Plückthun, 1998b).
Dos variantes adicionales fueron diseñadas mediante injerto (Jones et al., 1986) de los lazos del CDR (región determinante complementaria) anti-GCN4 con otro esqueleto. Dado que el esqueleto receptor llamado scFv "híbrido" fue escogido (Wörn y Plückthun, 1999). Este esqueleto receptor se compone del dominio V_{L} del fragmento scFv 4D5 y el dominio V_{H} del fragmento scFv A48^{++} (H2). fue diseñado de manera racional a partir series de dominios estabilizados y sobresalía por su extraordinaria estabilidad, como se demostró mediante equilibrio desnaturalizante inducido de despliegue, y una gran producción de expresión (Wörn y Plückthun, 1999). Dos variantes con CDRs injertados conteniendo los CDRs del scFv anti-GCN4 y la red scFv "híbrido" fueron preparados a través de síntesis genética total. Como el donante de lazo anti-GCN4 salvaje era portador de la cadena ligera \lambda, mientras que el esqueleto "híbrido" receptor era portador de la cadena ligera K, el injerto del lazo no fue sencillo. Por lo tanto, dos variantes diferentes fueron diseñadas, una más "K-like" (llamada injerto-K), y la otra más "\lambda-like" (llamada injerto \lambda). Estas dos variantes se diferencian solamente en siete residuos en la región de acoplamiento V_{H}-V_{L}, influenciando potencialmente la orientación de los dos dominios uno respecto al otro. El fragmento scFv AL5 de unión a ampicilina (A. Krebber et al., no publicado) sirvió como control negativo para un fragmento scFv que no se une a Gcn4p.
Los intracuerpos scFv anti-GCN4 inhiben el potencial transactivador de Gcn4p
La scFv anti-GCN4 fue inicialmente testada para su actividad biológica a partir de varios vectores de levadura que contenían los promotores GAL1 y ADH. Adicionalmente, la señal de localización nuclear (NLS) procedente del antígeno T grande SV40 fue fusionado de forma N-terminal a la scFv anti-GCN. De las combinaciones testadas, el scFv anti-GCN4 mostró el mayor efecto biológico cuando se expresó a partir del promotor actina-1 sin ninguna NLS utilizando el vector de expresión pESBA-Act (ver ejemplos) con el marcador de selección TRP1 y un origen de 2\mu (datos no mostrados). Este vector fue después utilizado para todos los experimentos posteriores.
El efecto in vivo de la expresión de los diferentes fragmentos scFv en expresión GCN4 dependiente de LacZ se representa en la figura 3A. El constructo marcador (YAdM2xGCN4-150) contenía dos lugares de unión Gcn4p en la posición -150 respecto a la caja TATA y estaba integrada en el genoma de levadura. La actividad \beta-galactosidasa relativa (Actividad \beta-gal. Rel.) conducida por el Gcn4p endógeno fue arbitrariamente considerada como del 100%. AL5 es una scFv de unión a ampicilina y se utiliza como control negativo. Además del anti-GCN4 salvaje (wt), un mutante puntual desestabilizado [anti-GCN4(H-R66K)], una variante libre de cisteína del antiGCN4 salvaje [anti-GCN4(SS^{- -})], y dos variantes de red estabilizada del anti-GCN4 (injerto-K y injerto-\lambda) fueron testados. El injerto-\lambda fue el intracuerpo más activo, mientras que el mutante puntual desestabilizado H-R66K y la variante libre de cisteina del anti-GCN4 mostraron una actividad disminuida en comparación con el anti-GCN4 salvaje. La actividad disminuida del injerto-K se cree que es debida a su baja afinidad de unión (ver Tabla 1). El mutante puntual desestabilizado anti-GCN4 (H-R66K) fue menos eficiente en la inhibición del gen marcador dependiente de GCN4, en comparación con la scFv salvaje. El patrón de la inhibición de la transactivación de Gcn4p fue altamente reproducible y se confirmó también al usar un método se ensayo diferente, en el que la actividad \beta-galactosidasa del gen marcador fue medida después de la rotura de las células mediante cuentas de vidrio o mediante ciclos de congelación-descongelación para la lisis y normalizando la actividad \beta-galactosidasa a la concentración de proteína (Escher y Schaffner, 1997) (datos no mostrados).
1
La realización de proteínas de fusión Gal4 AD-scFv en un ensayo de doble híbrido según su estabilidad in vitro y su actividad in vivo
La exitosa interacción entre el antígeno y las regiones determinantes complementarias (CDRs) en el ensayo de doble híbrido monitorizado a través de LacZ como gen marcador se muestra en la Figura 3B. La cepa marcadora YDE173 fue utilizada. La cepa YDE173 fue depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSZM, Braunschweig Alemania, el 11 de febrero de 2000 bajo el número DSM 13333. YDE173 fue derivada de la cepa de levaduras JPY5 (Mat\alpha ura3-52 his3\Delta200 leu2\Deltal trp1\Delta63 lys2\Delta385) presentando integrado en su locus his3 genómico el plásmido marcador pDE200 que contiene seis sitios de unión LexA controlando los marcadores HIS3 y LacZ orientados de forma divergente.
Los mismos fragmentos scFv utilizados como para la Fig. 3ª, aunque fusionados con el dominio de activación transcripcional de Gal4 fueron coexpresados conjuntamente con la cremallera de leucina GCN4 (aa 245285) fusionada de forma C-terminal a LexA, sirviendo como cebo en el ensayo de doble híbrido. Al inespecífico constructo de fusión scFv control AL5 no le fue posible interaccionar con la cremallera de leucina LexA-GCN4 y por lo tanto no activó al gen marcador LacZ. El dominio de activación Gal4 fusionado a la variante injerto-\lambda de red estabilizada mostró el efecto más fuerte como intracuerpo activador, seguido por el anti-GCN4 salvaje, y el mutante puntual desestabilizado anti-GCN4 (H-R66K). En contraste con el altamente estable aunque de unión débil injerto-K y el anti-GCN4 libre de cisteína (SS^{- -}) no causó una expresión significativa del gen marcador en el formato de doble híbrido. Los mismos resultados fueron obtenidos en un ensayo de placa X-Gal (datos no mostrados). En resumen, la acción in vivo de las diferentes variantes de fusión Gal4 AD-scFv en la activación del gen marcador LacZ en el formato de doble híbrido se correlaciona recíprocamente con el patrón de inhibición de la expresión de LacZ dependiente de Gcn4p (comparar Figura 3A con 3B).
La interacción entre el antígeno y las diferentes scFvs fusionadas a un dominio de activación transcripcional permite la selección de crecimiento en un ensayo de doble híbrido
Puesto que el constructo marcador integrado no solamente contiene un gen marcador LacZ, sino que también el gen HIS3, es apropiado para la selección del crecimiento en placas en ausencia de histidina. Además, añadiendo diferentes concentraciones de 3-aminotriazol (3-AT), el cual es un inhibidor competitivo de del producto génico HIS3, es posible inhibir (suprimir) el crecimiento de las células de levadura dependiendo de la fuerza de la interacción cebo/antígeno y Gal4 AD-scFv.
El procedimiento que lleva a los resultados mostrados en la Figura 4 fue como sigue: un banco de 5 diluciones, partiendo de aproximadamente 10.000 células de levadura coexpresando la cremallera de leucina GCN4 (aa 245-285) fusionada a LexA y a la proteína de fusión Gal4-AD scFv, fueron sembradas en placas (-Trp/-Leu/-His) que contenían diferentes concentraciones de 3-AT. El crecimiento fue monitorizado después de 48 h, 72 h y 120 h.
Los carriles mostrados en la Figura 4 son como sigue:
1. Gal4-AD \lambda-injerto, 2. Gal4-AD AL5, 3. Gal4AD K injerto, 4. Gal4-AD anti-GCN4 (SS^{- -}), 5. Gal4-AD anti-GCN4 salvaje, 6. Gal4-AD Anti-GCN4 (H-R66K), 7. la Proteína de fusión LexA-Gal11 sirve de control positivo, 8. vectores vacíos.
El crecimiento de las cepas de levadura que coexpresan el cebo/antígeno (cremallera de leucina lexA-GCN4) de forma conjunta con una fusión Gal4 AD-scFv fue monitorizado durante cinco días. Como control en placas en ausencia de 3-AT, no se observaron diferencias obvias de crecimiento de las diferentes variantes de fusión Gal4 AD-scFv. 20 mM de 3-AT, fueron suficientes para suprimir el crecimiento de las células transformadas con el scFv control negativo (Gal4 AD-AL5). En correlación con los resultados de la monitorización de la expresión de \beta-galactosidasa, las fusiones de Gal4 AD con la variante K-injerto, anti-GCN4 (SS^{- -}), y anti-GCN4(H-R66K) no permitió el crecimiento en presencia de 20 mM de 3AT. Las células que expresaban la variante \lambda-injerto así como el anti-GCN4 salvaje les fue posible crecer en presencia de hasta 80 mM de 3-AT en 5 días con una clara ventaja del esqueleto estabilizado \lambda-injerto a lo largo del tiempo. Una concentración de 100 MM de 3-AT fue suficiente para abolir el crecimiento de las células que expresaban Gal4 AD-anti-GCN4 salvaje. Solamente después de 5 días, unas pocas aparecieron en la siembra de mayor concentración donde las células que expresaban la variante de fusión \lambda-injerto Gal4 AD-scFv crecieron claramente.
La fusión N-terminal de dominio(s) constante(s) a la scFv \lambda-injerto no interfiere con su actividad biológica
Gal11P (residuos 263-352) y el dominio de activación de Gal4 fueron fusionados con el extremo N-terminal de la scFv \lambda-injerto (Gal11P-Gal4AD \lambda-injerto). Su actividad biológica inhibiendo la activación el gen dependiente de Gcn4p fue comparada con la del \lambda-injerto en solitario. Como se muestra en la Figura 5A la fusión de un dominio constante a la scFv no interfirió con su actividad inhibitoria sobre la activación génica dependiente de Gcn4p.
Introducción de sitios de restricción específicos
Con la finalidad de cambiar el CDR3 V_{H} (GLFDY) con una librería de péptidos, dos sitios de restricción únicos (BglII y XhoI) flanqueando esta región hipervariable fueron introducidos por mutagénesis silente. Estos cambios silentes no afectaron la secuencia de aminoácidos del anticuerpo y además no alteró la acción in vivo de la variante \lambda-injerto (ver figura 5B).
La importancia de la región hipervariable CDR3 (de Wildt et al., 1997; Hemminki et al., 1.998) para el reconocimiento específico de su antígeno (la cremallera de leucina GCN4) se mostró introduciendo una alanina adicional N-terminal al CDR3 (AGLFDY) de la cadena pesada variable. Esta variante \lambda-injerto+Ala no fue capaz de inhibir la expresión de un gen marcador dependiente de Gcn4p en la cepa de levaduras YAdM 2xGCN4-150, y fue también incapaz de activar la expresión del gen marcador en el formato de doble híbrido utilizando la cepa YDE173 (datos no mostrados).
Ambas variantes de injerto son solubles en el citoplasma de la levadura
La solubilidad de los diferentes fragmentos scFv de unión a Gcn4p en levadura fue testada mediante Western blot. Solamente en los casos de las variantes injertos \lambda y K cantidades significativas de proteínas solubles pudieron ser testadas en extractos celulares brutos (Figura 6).
Todas los demás fragmentos scFv anti-GCN4 parecieron ser de forma esencial completamente insolubles, con una cantidad de scFv insoluble ligeramente incrementando con la decreciente estabilidad in vitro. Sin embargo, hay que ser cauto respecto a que la proporción exacta entre proteína soluble e insoluble para las diferentes variantes de scFv puede no necesariamente reflejar la proporción presente in vivo. No puede ser excluido que parte de las diferentes variantes anti-GCN4 podrían ser precipitadas durante la preparación de la muestra, aunque sea utilizada un método de disrupción celular suave, utilizando el Y-PER^{TM} Reactivo de extracción de proteínas de levadura de Pierce.
Mejora de la red
Variaciones en las redes preferiblemente aisladas mediante un método de acuerdo con la presente invención puede ser combinado para generar mas redes que son estables y solubles en un medio reductor. Las mencionadas redes resultantes muestran una actividad in vivo incrementada en comparación con redes portadoras solo de una variación. Una red combinando seis variaciones se define en ID. DE SEC. NO:1.
Ejemplos Diseño de fragmentos scFv CDR-injerto anti-GCN4 Clonaje, expresión y purificación de fragmentos scFv
Todos los fragmentos scFvs estaban en una orientación V_{L}-V_{H} con un encadenador 20-mero (GGGGSGGGGS-
GGGGSSGGGS) y una his_{5}-tag C-terminal.
Los fragmentos scFv expresados en levadura fueron clonados en el vector de expresión pESBA-Act. El vector pESBA-Act es un vector lanzadera Saccharomyces cerevisiae - E.coli. Contiene un origen de replicación bacteriano y el gen de resistencia a amp. Además contiene el gen TRP1 de la levadura para la selección de transformación en S. cerevisiae. Está diseñado para la elevada expresión de proteínas en levadura y por lo tanto posee el origen de replicación 2\mu que asegura un elevado número de copias en S.cerevisiae. Además, contiene el promotor constitutivo fuerte de la actina y la secuencia terminadora de la transcripción de GAL11 separada mediante un sitio de múltiple clonaje que contiene dianas de restricción para NcoI (cubriendo el codón ATG de inicio de traducción), ApaI, StuI, tres codones de fin de traducción en las tres posibles agrupaciones de las bases y una diana SaiI.
Todos los fragmentos scFvs fueron clonados vía dianas de restricción Bsp120I y StuI y llevaban una His_{5}-tag C-terminal. Dos aminoácidos (Gly-Pro) codificando la diana del sitio Bspl20I hubieron de ser incluidos en el extremo N-terminal, después del residuo iniciador Met.
Fusión del Gal4 AD N-terminal a varias variantes de anticuerpo
El dominio de activación Gal4 fue amplificado mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando pGAD424 (Clontech) como plantilla. Ambos cebadores [cebador anterior: 5'-CCATGGGCCCAAGCTTTGCAAAGATGGATAAAG-3' (Id. de Sec. No.2, cebador posterior: 5'-TTTGGGCCCGAAGAACCGCCACCACCAG-AACCGCCTCCACCAGAGCCACCACCACCAGGCCTGATCTCTTTTTTTGGGTTTGGTG-3', (Id. de Sec. No. 3)] contienen una diana ApaI adecuada para clonar el dominio de activación Gal4 (AD) polipéptido que incluye el antígeno T de SV40 señal de localización nuclear N-terminal a los diferentes scFvs en el contexto del pESBA Act. El dominio de activación y los anticuerpos de cadena sencilla están separados por un encadenador (GGGS)_{3} codificado por el cebador anterior.
Fusión N-terminal de Gal11wt y Gal11P a la fusión dominio de activación (AD)Gal4-scFv
Tanto Gal11wt como Gal11p fueron amplificados utilizando los siguientes cebadores: cebador anterior: 5'CATGCCATGGTTCCTCAACAGCAGCAAATGCAAC-3' (Id. de Sec. No.4), cebador posterior: 5'-CATGCCATGGCGCTAGCCAAAGCTTGGATTTTTCT-CAGG-3' (Id. de Sec. No.5), ambos conteniendo una diana NcoI. Los productos de PCR que codifican los aminoácidos 263-352 fueron insertados en el sitio NcoI del constructo de fusión pESBA-Act2 Gal4(AD)-scFv (descrito más arriba). Esto genera una fusión en el marco del respectivo alelo Gal11 con Gal4(AD)-scFv. La correcta orientación de los insertos Gal11 fueron testados por digestión con el enzima único NheI.
Fusión LexA
La cremallera de leucina GCN4 (aa 245-285) fue amplificada por PCR mediante cebadores que contenían una diana EcoRI adecuada para clonar corriente abajo de LexA aa 1-202. Esto resulta en pAdMO18, un plásmido Ars Cen con el marcador de selección LEU2 expresando la proteína de fusión bajo el control del promotor ADH.
Introducción de sitios BglII y XhoI flanqueando el CDR3 de V_{H}
Con la finalidad de cambiar fácilmente el CDR3 de la cadena variable pesada, dos únicas dianas de restricción fueron introducidas flanqueando el CDR3 V_{H} mediante mutagénesis dirigida, sin cambiar la estructura primaria de Gal4 AD-\lambda-injerto scFv. Estas mutaciones puntuales silenciosas fueron introducidas por PCR utilizando \lambda-injerto como plantilla. En una primera ronda, dos reacciones de PCR separadas fueron realizadas utilizando el cebador #2421 con #2487 y #2486 con #2488 generando dos productos de PCR solapados. Estos dos productos sirvieron como plantilla para una segunda ronda de PCR con cebadores externos #2421 y #2488 que contenían dianas SpeI y SalI. El producto final fue subclonado en un Gal4 AD-\lambda-injerto mediante SpeI y SalI.
Criba intracelular directa para nuevos CDRs que interaccionan con el antígeno
Los primeros tres aminoácidos (GLF) del CDR3 de la cadena pesada variable de la red estabilizada scFv \lambda-injerto fusionada con el dominio de activación Gal4 (\lambda-injerto scFv-Gal4 AD) fue aleatorizado mediante un método basado en PCR descrito por Reiter et al. Los dos últimos residuos (D y Y) del CDR3 no fueron aleatorizados dada su conservación y su importancia estructural (Chothia y Lesk, 1987). Se obtuvo una librería \lambda-injerto scFv-Gal4 AD que potencialmente codificaba 8000 variables diferentes de CDR3 de la cadena variable pesada. El análisis de la secuencia de seis clones escogidos al azar reveló la presencia de secuencias CDR3 aleatorias en las posiciones deseadas.
La cepa de levaduras YDE173, que contiene los genes marcadores HIS3 y LacZ bajo el control de 6 sitios de unión LexA (ver más arriba), fue cotransformada con el vector que expresaba la cremallera de leucina GCN4 (aa 245-285) fusionada a LexA y la librería y fue cultivada en placas con medio selectivo (-Trp/ -Leu/ -His) conteniendo 60 mM 3-AT para la selección del crecimiento. Si un fragmento scFv de la librería CDR3 con una secuencia adecuada de CDR3 se une al antígeno cremallera de leucina fusionada a LexA, se forma un complejo que activa la transcripción del gen marcador HIS3 y restaura el crecimiento independiente de histidina de la célula de levadura. Después de 3 días, las colonias que crecieron fueron recogidas y resembradas en el mismo tipo de placas selectivas. Para las células que siguieron creciendo posteriormente la segunda selección fue analizada mediante actividad \beta-galactosidasa en placas X-gal. ADN de los plásmidos de la librería procedentes de los clones \beta-gal positivos fue extraído y la región de los CDR3 de la cadena pesada variable fue secuenciada: nosotros encontramos 4 veces la secuencia de aminoácidos del CDR3 \lambda-injerto original y tres secuencias de CDR3 para unión a la cremallera de leucina GCN4 completamente nuevas específicas. Los cuatro clones de scFv identificados que contenían la secuencia original de CDR3 se comportaron de forma indistinguible al \lambda-injerto mientras que los tres clones con la secuencia CDR3 alterada fueron menos eficientes en la activación del gen marcador LacZ.
Estos resultados demuestran la posibilidad de realizar cribas directas intracelulares para nuevos CDRs embebidos en un esqueleto definido de scFv que es estable y soluble bajo condiciones reductoras.
La actividad in vivo de un intracuerpo definido puede ser optimizada mediante mutagénesis aleatoria
La variante de esqueleto estabilizada de \lambda-injerto fue mutagenizada al azar tal y como se describe en Sambrook et al. Con la finalidad de introducir estadísticamente cambios en los aminoácidos a lo largo de la red del intracuerpo. La cepa de levaduras YDE173 fue cotransformada con esta librería de scFv mutagenizadas aleatoriamente fusionada con el dominio de activación de Gal4 y el plásmido que expresa el antígeno específico (aa 245-258 de la cremallera de leucina GCN4) fusionada a LexA y cultivadas en placas de selección conteniendo 80 mM de 3-AT. Seis clones candidatos fueron seleccionados, cada uno llevaba un solo cambio de aminoácido en la red. Estas seis redes mutantes mostraron una acción in vivo mejorada en comparación con la variante \lambda-injerto, que fue confirmada y cuantificada midiendo la actividad \beta-galactosidasa. Asumiendo que diferentes cambios de aminoácidos que mejoran la actividad de un intracuerpo se comportan de forma aditiva, nosotros combinamos las seis mutaciones en un esqueleto que fue fusionado la dominio de activación Gal4 y comparado con la variante de esqueleto estabilizada de \lambda-injerto en la activación del gen marcador LacZ. La Figura 2 muestra que este nuevo esqueleto el cual contiene las seis mutaciones puntuales combinadas (\Omega-injerto) presenta una actividad de casi un 30% mejor en comparación con la variante original \lambda-injerto. Remarcablemente, estas seis sustituciones de aminoácidos están agrupadas; dos de ellas (E \rightarrow K y L \rightarrow R preceden al CDR1 de la cadena ligera variable y las cuatro restantes (N rightarrow D, G \rightarrow C, K \rightarrow E, T rightarrow S) están localizadas entre el CDR2 y el CDR3 de la cadena pesada variable.
Integración de un gen marcador en el cromosoma de Saccharomyces cerevisiae
El plásmido marcador de integración pAB183 se derivó de pJP161 (Barberis et al., 1995) mediante la clonación de dos sitios de unión a Gcn4p en la posición 150 anterior a la caja TATA del promotor GAL1. Los sitios de unión a Gcn4p fueron generados mediante el anillamiento de dos oligonucleótidos complementarios presentando secuencias compatibles 5' SphI and 3' SalI. Los oligonucleótidos son los siguientes: 5'-CCTATGACTCATCCAGTTATGACTCATCG-3' (Id. de Sec. No.6); 5' TCGACGATGAGTCATAACTGGAT GAGTCATAGGCATG-3' (Id. de Sec. No.7). Este plásmido marcador fue linearizado en la diana ApaI y integrado en el locus genómico ura3 de levadura de la cepa JPY5 (Barberis et al., 1995), resultando en YAdM2xGCN4-150. La cepa YAdM2xGCN4-150 fue depositada el 11 de febrero de 2000 con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSZM, Braunschweig Alemania, con el número DSM13332. Cuatro levaduras transformantes independientes fueron probadas en un ensayo funcional y todas mostraron la misma actividad génica del gen marcador dependiente de GCN4. Uno de los clones (YAdM2xGCN4-150) fue escogido para todos los experimentos posteriores y es llamado levadura de tipo salvaje.
La cepa marcadora utilizada para los experimentos de doble híbrido, presenta un constructo marcador integrado que posee un promotor bidireccional con seis sitios de unión a LexA conduciendo la expresión de LacZ e HIS3.
Dilución en serie y cultivo de las células de levadura
La células de levadura fueron transformadas a través del método del acetato de litio, siguiendo los protocolos estándar. Los transformantes fueron cultivados durante la noche a 30ºC en medio selectivo (-Trp/-Leu). Los cultivos saturados fueron diluidos en medio selectivo hasta OD_{600} = 0,7 e incubados de nuevo por al menos un ciclo de duplicación. Cada cultivo fue diluido en serie en agua (factor de dilución 5) empezando por una concentración aproximada de 10^{6} células/ml, y 10 \mul de cada dilución fueron sembrados en placas con medio selectivo (-Trp/-Leu/-His) conteniendo 0 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, or 100 mM of 3-aminotriazol. Seis diferentes diluciones de cada transformante fueron sembradas en placas con medio de cultivo selectivo. Las placas fueron incubadas a 30ºC y fueron revisadas después de 48h, 72h, y 120h.
Análisis in vivo de los fragmentos scFvs: Expresión de los fragmentos scFv en levaduras y el ensayo marcador \beta-galactosidasa
El ensayo \beta-galactosidasa en solución fue realizado utilizando células permeabilizadas como se describe en (Kaiser et al., 1994, Escher y Schaffner 1997). La actividad fue normalizada al número de células ensayadas.
Análisis de Western blot de los fragmentos scFv anti-GCN4
La solubilidad de los diferentes fragmentos scFv anti-GCN4 fue analizada mediante Western blot. Cultivos de cinco ml fueron incubados a 30ºC hasta una densidad óptica de alrededor de 2-3. Las células fueron normalizadas a las mismas densidades, precipitadas y sometidas a una extracción de proteínas celulares totales mediante Y-PERT^{TM} reactivo de extracción de proteínas de levadura de Pierce, el cual es una formulación detergente moderada que facilita el aislamiento suave de proteínas solubles. Las fracciones soluble e insoluble fueron separadas por centrifugación (13000 rpm, 10 min, 4ºC). Muestras del extracto crudo soluble e insoluble fueron sometidos a SDS-PAGE y fijados a membranas de PVDF, siguiendo protocolos standard. Los fragmentos scFv marcados con His5 fueron detectados mediante fusión anti-His_{5}scFv-AP como se describe en (Lindner et al., 1997), mediante el sustrato quimioluminiscente de la fosfatasa CSPD de Boehringer Mannheim. Para obtener intensidades razonables en los Western blots, una concentración de proteínas alrededor de 5 veces superior tuvo que ser usada en las fracciones solubles, en comparación con las fracciones insolubles y las manchas fueron expuestas a diferentes tiempos de recorrido. Por lo tanto, una comparación directa tiene sentido solamente entre todas las muestras solubles o entre todas las muestras insolubles, respectivamente.
Mientras han sido aquí mostrados y descritos las formas preferibles de llevar a cabo la presente invención, debe de ser comprendido que la invención no está limitada a ellas pudiéndose llevar a cabo y practicada de varias formas bajo el enfoque de las siguientes reivindicaciones.
Referencias citadas
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<110> ESBATech AG
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<120> Intracuerpos con esqueleto definido que es estable en un ambiente reductor y aplicaciones de los mismos
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<130> secuencia Omega injerto
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<140>
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<141>
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<150> PCT 02054
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<151> 1999-12-28
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<150> PCT 00218
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<151> 2000-03-01
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<160> 7
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 252
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> CADENA
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<222> (1)..(114)
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<223> Cadena ligera variable
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<220>
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<221> CADENA
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<222> (135)..(247)
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<223> cadena pesada variable
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<220>
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<221> REPETICION
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<222> (115)..(134)
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<223> Enlazante Glicina Serina
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<220>
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<221> PEPTIDO
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<222> (248)..(252)
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<223> His Tag
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<221> DOMINIO
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<222> (27)..(39)
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<223> CDR 1 VL
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<220>
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<221> DOMINIO
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<222> (56)..(62)
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<223> CDR 2 VL
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<220>
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<221> DOMINIO
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<222> (95)..(103)
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<223> CDR 3 VL
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<220>
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<221> DOMINIO
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<222> (165)..(169)
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<223> CDR 1 VH
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<220>
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<221> DOMINIO
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<222> (184)..(198)
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<223> CDR 2 VH
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<220>
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<221> DOMINIO
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<222> (232)..(236)
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<223> CDR 3 VH
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Esqueleto Intracuerpo
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<400> 1
2
3
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<210> 2
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<211> 33
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador de PCR
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccatgggccc aagctttgca aagatggata aag
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<210> 3
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<211> 83
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR
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<400> 3
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tttgggcccg aagaaccgcc accagaaccg cctccaccag agccaccacc
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accaaggcct gatctctttt tttgggtttg gtg
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83
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<210> 4
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<211> 34
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR
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<400> 4
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catgccatgg ttcctcaaca gcagcaaatg caac
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34
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<210> 5
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<211> 39
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR
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<400> 5
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catgccatgg cgctagccaa agcttggatt ttctcagg
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39
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<210> 6
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<211> 29
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR
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<400> 6
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cctatgactc atccagttat gactcatcg
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29
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<210> 7
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<211> 37
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR
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<400> 7
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tcgacgatga gtcataactg gatgagtcat aggcatg
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37
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Claims (11)

1. Un método para la identificación de las redes de intracuerpos o intracuerpos donde las células huésped adecuadas son transformadas mediante una librería donde dicha librería es un producto de fusión de un intracuerpo con una proteína marcadora donde dicha proteína marcadora es solamente activa como parte de una proteína de fusión codificando una parte soluble y estable de un intracuerpo, entonces cultivando las mencionadas células bajo condiciones que permitan la identificación y la selección de aquellas células que expresen una red soluble y estable de intracuerpo por medio de la detección de la proteína marcadora.
2. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína marcadora presenta una actividad seleccionable, en particular una actividad enzimática o actividad fluorescente.
3. Un método para la identificación de los intracuerpos o esqueletos de intracuerpos, comprendiendo la transformación de células huésped adecuadas con una librería la cual es un producto de fusión de una librería de intracuerpo y una proteína de unión a ADN que es capaz de activar la transcripción, y un sistema marcador donde dicho sistema marcador se encuentra bajo el control transcripcional de dicha proteína de unión a ADN, donde dicha proteína de unión a ADN que puede activar la transcripción es solamente activa como parte de una proteína de fusión que codifica una parte estable y soluble de un intracuerpo, y el cultivo de dichas células bajo condiciones que permitan la identificación y la selección de aquellas células que expresen un intracuerpo soluble y estable por detección de la señal de dicho sistema marcador.
4. Un método para la identificación de esqueletos de intracuerpo o intracuerpos, donde células huésped adecuadas son transformadas con una librería que codifica proteínas que comprendan un intracuerpo y una parte de un sistema de transactivación, donde dicha parte de un sistema de transactivación es solamente activa como parte de una proteína de fusión que codifique una parte estable y soluble de un intracuerpo, y dichas células además expresar una segunda proteína comprendiendo al menos la segunda parte de dicho sistema de transactivación, donde dicho sistema de transactivación está unido a un marcador que permita la supervivencia y dichas células solamente pueden sobrevivir bajo condiciones selectivas en presencia de la interacción entre dichas dos proteínas a través de una región constante de la proteína codificada por la librería.
5. El método de la reivindicación 4, donde las proteínas codificadas por dicha librería comprenden un dominio de activación transcripcional y dichas segundas proteínas comprenden un dominio de unión a ADN o dichas proteínas codificadas por la librería comprenden un dominio de unión a ADN y dichas segundas proteínas comprenden un dominio de activación transcripcional.
6. El método de las reivindicaciones 4 ó 5, donde dichas segundas proteínas comprenden un dominio de unión a ADN o un dominio de activación de la transcripción, respectivamente, y una proteína que interacciona con la región constante de dicha primera proteína codificada por la librería.
7. El método de las reivindicaciones 4 a la 6 donde dicha librería codifica una proteína que comprende el dominio de activación de la transcripción de GAL4 y Gal11P y dicha segunda proteína comprende el dominio de unión a ADN de Gal4.
8. El método de las reivindicaciones 1 a la 7, donde la célula huésped es una célula eucariota, preferiblemente una célula de levadura.
9. Un método para identificar una scFv con una red definida que es estable y soluble en un medio reductor, comprendiendo
a) aislamiento de la scFv de acuerdo con un método de las reivindicaciones de 1 a la 8,
b) producción de una librería de scFv con esqueletos variados y CDRs constantes por medio de la mutación de al menos una secuencia de ADN codificante para un esqueleto de la scFv del paso a), y por introducción de tales mutaciones en los vectores de expresión adecuados,
c) transformación de células huésped capaces de expresar un antígeno específico conocido y solamente sobreviviendo en presencia de la interacción antígeno-scFv con dicha librería de scFv,
d) Las por lo tanto transformadas células huésped son cultivadas bajo condiciones adecuadas para expresar el antígeno y el scFv y permitiendo la supervivencia celular solo en presencia de la interacción antígeno-scFv,
e) La scFv expresada en las células supervivientes y que tienen un esqueleto definido que es estable y soluble en un medio reductor es identificada.
10. El método de la reivindicación 9, donde la célula huésped es una célula eucariota.
11. El método de la reivindicación 9 ó 10 donde la célula huésped es una célula de levadura.
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