ES2225269T3 - Intracuerpos con esqueleto definido que es estable en un ambiente reductor y aplicaciones de los mismos. - Google Patents
Intracuerpos con esqueleto definido que es estable en un ambiente reductor y aplicaciones de los mismos.Info
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Abstract
Un método para la identificación de las redes de intracuerpos o intracuerpos donde las células huésped adecuadas son transformadas mediante una librería donde dicha librería es un producto de fusión de un intracuerpo con una proteína marcadora donde dicha proteína marcadora es solamente activa como parte de una proteína de fusión codificando una parte soluble y estable de un intracuerpo, entonces cultivando las mencionadas células bajo condiciones que permitan la identificación y la selección de aquellas células que expresen una red soluble y estable de intracuerpo por medio de la detección de la proteína marcadora.
Description
Intracuerpos con esqueleto definido que es
estable en un ambiente reductor y aplicaciones de los mismos.
La presente invención incumbe a fusiones de
cadena simple de regiones variables de cadenas ligeras y pesadas de
un anticuerpo (scFv), en particular tales scFv expresadas dentro de
una célula (intracuerpos) con un esqueleto definido y estable.
Los anticuerpos son herramientas preferidas para
la investigación biológica molecular y bioquímica, los diagnósticos
y aplicaciones médicas debido a su elevada afinidad y especificidad
al antígeno y debido a su estabilidad relativamente elevada in
vitro e in vivo. Los anticuerpos constan de dos cadenas
pesadas y dos cadenas ligeras, que contienen las regiones variables
en su N-terminal y que están unidas por puentes
disulfuro. Los anticuerpos de cadena simple han sido diseñados
mediante la unión de los fragmentos de regiones de cadena ligera y
pesada variables (scFv). Cada dominio variable contiene tres
regiones determinantes complementarias (CDR) embebidas en un
esqueleto. Estos CDRs son responsables de la interacción con el
antígeno. Cada región ligera y pesada variable contiene un puente
disulfuro intradominio, el cual se refirió ser crítico para la
estabilidad del anticuerpo de cadena única (Biocca et al.,
1995; Derman et al., 1993).
La técnica más comúnmente utilizada para
identificar los anticuerpos de cadena simple que se unen a epítopos
específicos mediante la presentación de un fago y variaciones del
mismo (para revisión ver Hoogenboom et al., 1998). Este
sistema de criba tiene grandes ventajas sobre técnicas
convencionales como la inmunización o la técnica del hibridoma,
concretamente permite descubrir anticuerpos monoclonales de cadena
simple en un tiempo relativamente corto.
Se llama intracuerpos a aquellos anticuerpos de
cadena simple expresados en el interior de la célula (pej. en el
citoplasma o en el núcleo). Dado el ambiente reductor presente en
el interior de la célula, los puentes disulfuro, los cuales se cree
son críticos para la estabilidad de los anticuerpos, no se forman.
De este modo, inicialmente se creyó que las aplicaciones con
intracuerpos no serían apropiadas. Sin embargo, muchos casos que
demuestran la viabilidad de los intracuerpos han sido descritos
(Beerli et al., 1994; Biocca et al., 1994; Duan et
al., 1994; Gargano y Cattaneo, 1997; Greenman. et al.,
1996; Martineau et al., 1998; Mhashilkar et al.,
1995; Taviadoraki et al., 1993). En estos casos, los
intracuerpos actúan pej. bloqueando el antígeno citoplasmático y
por lo tanto inhibiendo su actividad biológica.
Hasta ahora, los intracuerpos eran principalmente
derivados de anticuerpos monoclonales los cuales habían sido
previamente seleccionados mediante técnicas clásicas (pej.
presentación de fago), y posteriormente testados para su actividad
biológica como intracuerpos en el interior de la célula (Visintin
et al., 1999). Aunque han sido descritos intracuerpos
eficaces (véase arriba), a día de hoy todavía es totalmente
impredecible si un intracuerpo será funcional en el interior de la
célula (para revisión ver Cattaneo, 1998; Cattaneo y Biocca, 1999).
La explicación más probable para ello es la diferencia en los
entornos: la presentación de fago y otras técnicas clásicas se
realizan en condiciones oxidantes, por lo tanto los puentes
disulfuro están formados, mientras que los intracuerpos deben
funcionar en condiciones reductoras. Este entorno reductor puede
llevar a una solubilidad insuficiente del intracuerpo y, por lo
tanto, a que formen agregados no funcionales. La solubilidad de un
intracuerpo puede ser modificada por cambios en la red (Knappik y
Pluckthun, 1995) o en las CDRs (Kipriyanov et al., 1997;
Ulrich et al., 1995).
Sin embargo, los sistemas conocidos hasta ahora
son limitados respecto a su aplicación en la detección de dianas
intracelulares. Por lo tanto, hay una creciente necesidad de tener
una tecnología fiable y un sistema para la búsqueda directa de
intracuerpos específicos de un antígeno.
En WO 99/36569, Wittrup et al. describe un
método para mostrar proteínas y scFv en la pared celular de la
levadura utilizando una proteína endógena de la levadura derivada de
Aga2p para localización en la pared celular. Librerías de proteínas
y scFv pueden ser exploradas mediante la interacción con otras
proteínas. Otros sistemas relacionados han sido descritos en EP 0
407 259 (Boquet et al., 1991). Estos sistemas son comparables
a la criba por presentación de fago donde la proteína o librería de
péptidos es también presentada en la superficie. Sin embargo, estas
técnicas no pueden ser usadas para realizar cribas intracelulares
para la identificación de intracuerpos.
La patente JP 11000174 (Kyoko, et al.,
1999) describe el uso de la levadura Pichia pastoris para la
expresión y secreción a alto nivel de fragmentos Fab de anticuerpo.
Esta levadura es conocida por su elevado nivel de secreción siendo
por lo tanto preferible su uso para esta aplicación. El anticuerpo
secretado puede ser recogido por purificación del sobrenadante.
Además, en EP 0 590 067, W092/22324, JP 060 30 778, US 569 8435, US
559 5889, JP 10313876 la levadura es utilizada para la producción
de proteínas o anticuerpos secretados. En EP 0 698 097 y WO 94/25591
se revela la aplicación de la producción y secreción de solamente
la cadena pesada o fragmentos de la misma para otras aplicaciones.
En JP 0 902 0798; JP 051 05700; y JP 050 97704 se describen métodos
de secreción mediante levaduras para la obtención de vacuna contra
la hepatitis cuando se administra en el cuerpo humano o en
organismos en general.
Es también ya conocido, a partir de WO 99/28502,
el uso de levaduras para realizar cribas de anticuerpos de cadena
simple. Dicha aplicación revela el uso de una librería de
constructos de ADN para un reactivo de fusión de anticuerpo
monoclonal de cadena sencilla. Esta librería de scFv (conocida como
librería scFv) es usada posteriormente para realizar cribas. Sin
embargo, ahora se ha descubierto que la estabilidad y la
solubilidad de los intracuerpos puede variar dramáticamente a causa
del uso de una red no especificada. Además, el uso de librerías
derivadas de ARNm de diferentes fragmentos scFv es limitada en lo
que respecta a la posibilidad de identificar aquellos CDRs que
poseen gran afinidad hacia el antígeno porque, aunque los CDRs en
principio mostrarían la alta afinidad requerida hacia el antígeno,
la red correspondiente no es suficientemente soluble y por lo tanto
se agrega, haciendo imposible la selección de estas scFv
monoclonales. De este modo, existe todavía una necesidad de
anticuerpos o intracuerpos mejorados, respectivamente.
En el artículo de Martineau P. et al., (J.
Mol. Biol. (1998) 280, 117-127) se describe un
sistema de selección genética para fragmentos de anticuerpo
plegados y funcionales en E. coli. Dicho sistema se basa en
mutantes AMEF del enzima \beta-galactosidasa la
cual es inactiva pero es catalítica cuando es incubada en presencia
de anticuerpos dirigidos contra
\beta-galactosidasa salvaje. Los autores aislaron
anticuerpos de cadena simple (scFv) contra
\beta-galactosidasa a partir de una librería de
fago y testaron la actividad intracelular de dichas scFv en
bacterias.
En Antje Pörtner-Taliana et ate.,
(Journal of Immunological Methods 238 (2000),
161-172) se revela el uso del sistema del doble
híbrido para la selección in vivo de anticuerpos de cadena
sencilla en levadura. La viabilidad de este sistema está demostrada
mediante la criba de una librería de scFv clonada en un vector
doble híbrido de levadura para moléculas cuya diana es el
ATF-2, un miembro de la familia de factores de
transcripción CREB/ATF. El sistema se basa en la interacción
específica entre una scFv y su antígeno.
Las crecientes aplicaciones de las scFv dirigidos
contra dianas intracelulares hacen emerger la necesidad de sistemas
fiables para la criba de anticuerpos. La unión a dianas
citoplasmáticas de las scFv es la más exigente de las aplicaciones
dada la inestabilidad de las scFv bajo condiciones reductoras y la
impredecibilidad de la estabilidad de los anticuerpos. Estos
problemas de estabilidad y solubilidad pueden ser resueltos mediante
el uso de esqueletos definidos, optimizados para aplicaciones
intracelulares.
Por lo tanto, es objeto de la presente invención
proporcionar métodos para el aislamiento de una scFv o intracuerpo
con una red definida que sea estable y soluble en un ambiente
reductor.
En una primera realización del método para la
identificación de esqueletos de intracuerpos o intracuerpos
comprende los siguientes pasos:
células huésped adecuadas son transformadas
mediante una librería que es producto de una fusión de un
intracuerpo con una proteína marcadora la cual es solamente activa
como parte de una proteína de fusión que codifica la parte soluble y
estable del intracuerpo, dichas células han de ser cultivadas bajo
condiciones que permitan la identificación y selección de células
que expresen un esqueleto soluble y estable de intracuerpos a través
de la detección de la proteína marcadora (actividad).
Dicha proteína marcadora posee preferiblemente
una actividad susceptible de ser seleccionada, en particular una
actividad enzimática o actividad fluorescente.
Otra realización del método para la
identificación de redes de intracuerpos o intracuerpos comprende los
siguientes pasos:
transformación de células huésped adecuadas
mediante una librería la cual es un producto de fusión de una
librería de intracuerpos y una proteína de unión a ADN capaz de
activar la transcripción, y un sistema marcador el cual se encuentra
bajo el control de dicha proteína de unión a ADN, y el cultivo de
dichas células bajo condiciones que permitan la identificación y la
selección de aquellas células que expresen un intracuerpo soluble y
estable mediante la detección de la señal de dicho sistema
marcador.
Aún otra realización del método para la
identificación de redes de intracuerpos o intracuerpos comprende los
siguientes pasos:
transformación de células huésped adecuadas
mediante una librería la cual codifica para proteínas que contienen
un intracuerpo y una parte de un sistema de transactivación y
además dichas células expresan una segunda proteína comprendiendo
al menos la segunda parte del mencionado sistema de
transactivación, donde el mencionado sistema de transactivación esta
ligado a un marcador imprescindible para la supervivencia y dichas
células solo pueden sobrevivir bajo condiciones selectivas en
presencia de una interacción entre las dos proteínas mencionadas vía
una región constante de la proteína codificada en la librería.
Dicha librería codifica proteínas que
preferiblemente comprenden un dominio de activación transcripcional
y dichas segundas proteínas comprenden un dominio de unión a ADN o
dicha librería codifica proteínas que comprenden un dominio de unión
a ADN y dichas segundas proteínas comprenden un dominio de
activación transcripcional.
En una realización preferida dichas segundas
proteínas comprenden un dominio de unión a ADN o un dominio de
transactivación, respectivamente, y una proteína que interacciona
con la región constante de dicha primera proteína codificada por la
librería.
En una más preferible realización dicha librería
codifica una proteína la cual comprende el dominio de activación de
la transcripción de GAL4 y Gal11P y dicha segunda proteína comprende
el dominio de unión a ADN de Gal4.
Otro objeto de la presente invención es un método
para obtener una scFv con una red definida que es estable y soluble
en un ambiente reductor, comprendiendo
a) aislamiento de una scFv de acuerdo con un
método del primer objeto de la presente invención,
b) generación de una librería de scFv con
esqueletos variadas y CDRs constantes mediante la mutación en la
región de secuencia de ADN que codifique para un esqueleto de la
scFv del paso a), y por introducción de tales mutaciones en los
vectores de expresión adecuados,
b) transformación de células huésped capaces de
expresar un antígeno específico y conocido que sobrevivan solo en
presencia de la interacción antígeno-scFv con dicha
librería de scFv,
c) Las células huésped así transformadas son
cultivadas bajo condiciones adecuadas para expresar el antígeno y
la scFv y permitiendo la supervivencia de la célula solo en
presencia de la interacción antígeno-scFv.
d) la scFv expresada en las células
supervivientes y teniendo una red definida que es estable y soluble
en un ambiente reductor es aislada.
Los mismos métodos pueden ser también aplicados
para la criba de cualquier librería de scFv para identificar
esqueletos solubles y estables que pueden pej. ser usados como
material de inicio para una librería de scFv o CDR.
Los intracuerpos de la presente invención pueden
además ser usados como agentes en terapia, diagnosis o prevención
de enfermedades y en múltiples aplicaciones en plantas, tales como
knock out funcionales de una actividad proteica determinada. Los
intracuerpos pueden ser utilizados como tales o como ADN
codificante de tales scFv.
En el ámbito del presente texto, los términos
scFv e intracuerpo son ampliamente usados como sinónimos, sin
embargo, debe de ser entendido que, mientras que la estabilidad y
la solubilidad de los intracuerpos (scFv) con un esqueleto definido
de la presente invención en ambiente reductor, pej. dentro de una
célula, es necesaria para la presente invención, la aplicación de
tales intracuerpos (scFv) etc. no está restringida a aplicaciones
dentro de una célula.
Solamente introduciendo cambios en los
aminoácidos contenidos en los CRDs, tal esqueleto de acuerdo con la
presente invención incrementa en gran medida la posibilidad de
identificar anticuerpos monoclonales que presenten la función
biológica deseada de reconocimiento de antígenos específicos. Tales
cambios en los CDRs de las scFv pueden ser realizados como cambios
aleatorios sin cambiar el esqueleto definido, adecuado para la
aplicación citoplasmática de los intracuerpos.
Con la finalidad de realizar cribas de
anticuerpos monoclonales de cadena sencilla dentro de la célula, se
debe usar un esqueleto el cual sea adaptada al ambiente redox del
citoplasma. Por lo tanto un esqueleto debe de ser suficientemente
estable y soluble aún en la ausencia de puentes disulfuro. Sin
embargo, es sabido que muchas de las scFv no se pliegan en la
estructura apropiada bajo condiciones reductoras o en ausencia de
cisteína, responsable de la formación de los puentes disulfuro
intradominio. De este modo, en el ámbito de la presente invención
varios esqueletos conteniendo CDRs idénticos han sido comparadas
habiéndose observado dramáticas diferencias en la acción in
vivo. mediante el método inventivo pueden seleccionarse aquellos
esqueletos con mejor funcionamiento y conteniendo los CDRs
definidos para reconocimiento de antígeno. Este método es realizado
usando un intracuerpo con un antígeno conocido como material de
inicio. El encadenador utilizado para conectar las regiones
variables de las cadenas ligera y pesada no es crítico. Sin embargo,
debe proporcionar suficiente solubilidad y flexibilidad para
asegurar un contacto y un pliegue adecuados para la interacción de
entre CDRs y antígeno. Encadenadores apropiados presentan una
longitud típica de 5-60 aminoácidos, normalmente
series regulares de glicina y, con la finalidad de potenciar la
solubilidad, de 1 a 3 serinas.
Tal método para el aislamiento de un scFv con una
red definida que es estable y soluble en un ambiente reductor es
definido por los siguientes pasos:
- a)
- una librería de scFv con redes variadas y CDRs constantes es generada por mutación de al menos una región de secuencia de ADN codificante de red de una scFv con antígeno conocido y por la introducción de tales mutaciones en los vectores de expresión adecuados,
- b)
- células huésped capaces de expresar un antígeno específico y conocido y que sobrevivan solamente en presencia de la interacción antígeno-scFv son transformadas con las mencionadas librerías scFv,
- c)
- Las células huésped transformadas de esta manera son cultivadas bajo condiciones apropiadas para expresar el antígeno y la scFv, permitiendo solamente la supervivencia de las células en presencia de la interacción antígeno-scFv,
- d)
- La scFv expresada en las células supervivientes y teniendo una red definida que es estable y soluble en ambiente reductor es aislada.
En una realización preferible la célula huésped
es una célula eucariota, concretamente una levadura.
Por el método descrito anteriormente una scFv con
un esqueleto definido puede ser obtenible. Tal esqueleto puede ser
modificado para contener sitios de restricción específicos que
permitan el cambio selectivo de al menos un CDR. Preferiblemente
dichos sitios de restricción están localizados en el esqueleto que
flanquea un CDR.
Además, está descrito un método para la
generación de un ADN codificante para una scFv con un esqueleto
adecuado para alteraciones selectivas en la región CDR, en donde los
sitios de restricción específicos son introducidos en una secuencia
de ADN codificante para una scFv definida, estable y soluble a
través de mutagénesis dirigida donde los mencionados sitios de
restricción se encuentran preferiblemente localizados en el
esqueleto y donde la sustitución de nucleótidos para generar los
sitios de restricción no afecta la secuencia de aminoácidos.
Una scFv mejorada con un esqueleto definido que
es estable y soluble en un ambiente reductor puede también ser
obtenida a través de un método donde al menos dos variaciones de al
menos dos diferentes esqueletos que son estables y solubles en un
ambiente reductor, preferiblemente esqueletos de la presente
invención son combinados para producir una scFv con un esqueleto
definido.
En tal esqueleto es preferible que al menos una
de las variaciones preceda el CDR1 de la cadena ligera variable y/o
al menos una de las variaciones esté localizada entre el CDR2 y el
CDR3 de la región pesada variable.
En una realización más preferible el scFv
comprende al menos 2 variaciones precedentes al CDR1 del la cadena
ligera variable y al menos 2, preferentemente al menos 4 variaciones
localizadas entre el CDR2 y el CDR3 de la cadena pesada variable, en
particular un scFv comprendiendo el esqueleto definido en ID. DE
SEC. NO 1.
Con la finalidad de aleatorizar de forma
específica los CDRs en tal esqueleto, cambios silenciosos, aquellos
que codifican por las mismas secuencias de aminoácidos pero
utilizando diferentes codones, pueden ser introducidos y llevar a la
generación de sitios de restricción únicos (ver también más arriba).
Mientras los sitios de restricción pueden estar localizados en
cualquier lugar de las regiones que conectan los CDR con el
esqueleto, es preferible que estos se localicen en el esqueleto que
flanquea cada CDR individual. De esta manera, cada CDR individual
puede ser reemplazado mediante la introducción de secuencias
aleatorias o definidas. Esto permite seleccionar nuevos CDR con
elevada afinidad por el antígeno en el intracuerpo.
Cuando secuencias adicionales, como señales de
localización o dominios de activación son introducidos en una red no
definida, procedente de una librería de scFv, es posible que debido
a estas modificaciones, la actividad biológica - presente hasta
aquel momento - sea perdida, pej. la scFv deviene insoluble. Por lo
tanto, resulta ventajoso utilizar un esqueleto definido de la
presente invención para un antígeno conocido y posteriormente
introducir tales modificaciones en diferentes localizaciones en el
intracuerpo (extremos N- y C- terminales o en la secuencia
codificante para la scFv) y seleccionar por el mantenimiento de la
función original. En WO 99/28502 se describen varias posibilidades
para la introducción de una señal de localización. En WO 99/98502
ha sido descrita la introducción del dominio de activación utilizado
para cribas de interacción para un antígeno en el extremo
C-terminal de la librería de scFv. Ha sido
descubierto que mediante el método de la presente invención también
pueden ser seleccionados esqueletos que acepten secuencias
adicionales en diferentes localizaciones pej. el dominio de
activación en el extremo N-terminal, el cual
todavía funciona de forma similar a sus scFv homologas, en la
función antagónica. Por lo tanto, pej. en el esqueleto que será más
profundamente descrito en siguientes ejemplos, la introducción de un
dominio de activación N-terminal no perjudica a la
función del anticuerpo.
Partiendo de un intracuerpo de la presente
invención con un esqueleto definido que es estable y soluble en un
ambiente reductor, scFv o intracuerpos, respectivamente, se pueden
generar librerías conteniendo CDR.
Un método adecuado para la generación de una
librería de CDR con un esqueleto definido, que es estable y soluble
en un ambiente reductor es un método en el que las secuencias de ADN
codificantes para una scFv de la presente invención es digerida para
reemplazar al menos un CDR por secuencia por un CDR modificado.
Preferiblemente el CDR modificado es generado por cambios
aleatorios. A través de este método puede ser generada una librería
de intracuerpos con al menos un CDR aleatorizado y con una red
definida que es estable y soluble bajo condiciones reductoras.
Los intracuerpos de la presente invención
conteniendo librerías de CDR pueden ser utilizados para cribar y
seleccionar aquellos clones que tengan una elevada afinidad hacia el
antígeno. Este método para la criba de CDRs que interaccionan con un
antígeno específico comprende células huésped transformadas mediante
una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia de ADN,
que codifique un antígeno conocido y sean también transformadas
mediante una librería de CDR aleatorizados con una red definida que
es estable y soluble en un ambiente reductor, donde el antígeno y/o
la scFv están ligados a un sistema marcador o parte del mismo y de
este modo aquellas células cultivadas bajo condiciones selectivas
solo puedan sobrevivir en presencia de la interacción antígeno/scFv,
que las células transformadas de esta manera son cultivadas bajo
condiciones selectivas, y que las células supervivientes son
selecionadas y los intracuerpos recogidos.
En una realización preferida el esqueleto es un
esqueleto de la presente invención y la célula es una célula
eucariota, en particular una levadura.
En una realización más preferible tanto la
secuencia de ADN que codifica el antígeno con la secuencia de ADN
que codifica la scFv deben codificar para moléculas quiméricas con
el antígeno o la scFv, respectivamente, ambas ligadas a una parte
de un sistema de activación de la transcripción ligado un sistema
que permita la supervivencia, es más preferible que el antígeno
este fusionado a un dominio de unión a ADN y la scFv esté fusionada
a un dominio activador de la transcripción o el antígeno sea
fusionado a un dominio de activación de la transcripción y la scFv
este fusionada a un dominio de unión a ADN.
Los intracuerpos conteniendo librerías de CDR
pueden ser usados para la criba y selección de clones que tengan
una gran afinidad para el antígeno. Esto puede ser conseguido
mediante el bloqueo de la función biológica del antígeno localizado
intracelularmente o bien intentando la interacción directa del CDR
embebido en el esqueleto definido hacia el antígeno. La interacción
directa puede ser preferiblemente monitorizada mediante una señal
transcripcional, preferiblemente por la expresión del gen HIS3.
Añadiendo 3-aminotriazol (3AT) al medio, permite la
selección de aquellos CDRs de más alta afinidad hacia el antígeno
bajo dichas condiciones predeterminadas. Las células huésped que
sean capaces de expresar un antígeno específico conocido solo
sobreviven en presencia de la interacción
antígeno-scFv bajo dichas condiciones,
preferiblemente en presencia de una interacción
antígeno-scFv suficientemente fuerte. El término
suficientemente fuerte aquí usado se define como interacciones
proteína-proteína teniendo una K_{D}, medida por
Biacore, la cual es > 1x10^{-6} M, preferiblemente una K_{D}
> 1x10^{-8} M y más preferiblemente una K_{D} >
1x10^{-10} M. Tal paso de selección puede ser utilizado más allá
aplicándolo a la realización de maduración de afinidad mediante
cambios selectivos o aleatorios de los aminoácidos que constituyen
los CDR (preferentemente CDR1 y CDR2 de las cadenas ligera y
pesada) y posteriormente seleccionarlos a partir de este reservorio
para el crecimiento en un medio con concentración de 3AT
incrementada.
Como ya se ha mencionado más arriba, las
librerías de scFv conocidas hasta el momento derivan del aislamiento
de ARNm preferiblemente procedente de bazo del que se conoce que
presenta una elevada acumulación de células B y por lo tanto
anticuerpos reorganizados pueden ser expresados. Tal librería tiene
el inconveniente de haber sido pre-seleccionada
(selección positiva y negativa) para que no reaccione contra
epítopos presentes en el organismo. Esto garantiza que solo maduren
y sean activados aquellos anticuerpos que no pueden iniciar una
reacción autoinmune. Sin embargo, debido a estos pasos de selección,
no todas las posibles combinaciones de aminoácidos están presentes
en esta librería de scFv "natural". Para varias aplicaciones
diagnósticas e in vitro, se requiere que los anticuerpos
interaccionen con proteínas las cuales son conservadas entre las
especies. Para tales proteínas o péptidos, debe de ser muy difícil
encontrar anticuerpos monoclonales que interaccionen fuertemente en
librerías de scFv "naturales" debido a los pasos de
pre-selección. Además, los esqueletos presentes en
tales librerías "naturales" no están optimizadas, por lo tanto
se generan problemas de insuficiente o variable solubilidad y/o
estabilidad, respectivamente. Por lo tanto es una gran ventaja el
usar solamente librerías de CDR randomizados comprendiendo un
esqueleto de y/o obtenible mediante el método de la presente
invención y, cubrir o, preferiblemente, todas las posibles
combinaciones de secuencias de aminoácidos en estas regiones.
Con la finalidad de describir en mayor
profundidad la presente invención, un esqueleto de intracuerpo
estable y soluble con regiones determinantes complementarias (CDRs)
definidas dirigidas contra el factor de transcripción intracelular
Gcn4p de la levadura fue seleccionada. Este esqueleto definido fue
utilizado para reemplazar los CDRs por secuencias aleatorias. Estas
librerías de CDR son cribadas para identificar nuevos CDR que
causen una actividad biológica demandada (efecto in vivo de
los CDRs).
- a)
- interacciones moleculares las cuales ocurren naturalmente en la célula (pej. en células humanas o cualesquiera otras células heterólogas) son reconstruidas en una célula adecuada, preferiblemente una levadura, o interacciones endógenas de levadura son usadas. Una criba posterior identifica los CRDs de alta afinidad dada la interferencia de estos CDRs en la actividad biológica de las moléculas endógenas o reconstituidas. Tales CDRs antagonistas podrían pej. funcionar por bloqueo de dos proteínas implicadas en vías de transducción de señal.
- b)
- Son seleccionados los CDRs agonistas que inducen una función biológica demandada en las moléculas endógenas o reconstituidas.
Los CDRs aleatorios embebidos en el esqueleto
estable pueden además ser utilizados para la identificación de
interacciones de CDR con un antígeno en base a cribas de
interacción:
- a)
- Puede ser demostrado que la red seleccionada puede ser fusionada a un dominio de activación de la transcripción conservando su función. Este intracuerpo quimérico es utilizado para la selección de CDRs de alta afinidad contra un antígeno dado fusionado a un dominio de unión a ADN o a un factor de transcripción que posea actividad de unión a ADN. Tras la interacción del antígeno con los CDRs, el dominio de activación transcripcional media la expresión génica de un gen marcador seleccionable que permita la supervivencia de esta célula bajo condiciones selectivas.
- b)
- Una interacción molecular reconstituida basada en una técnica híbrida (fusión de un acompañante a un dominio de activación, o en caso de que sea necesario a un dominio de unión a ADN) puede ser bloqueada por CDRs específicos de alta afinidad.
Fue también descubierto que diferentes mutaciones
en el esqueleto conservando CDRs constantes en el intracuerpo
tienen un efecto en su actividad in vivo a través de cambios
en la estabilidad y solubilidad del intracuerpo. El esqueleto
contribuye a la mayor parte de la estabilidad y la solubilidad de
un intracuerpo. Sin embargo, ciertas mutaciones en los CDRs pueden
también afectar la solubilidad y la estabilidad del intracuerpo.
Por lo tanto puede ser ventajosa la preselección de CDRs aleatorios
embebidos en un esqueleto definido a través de control de calidad
funcional (ver más abajo).
Para todos los propósitos de la presente
invención son preferibles las células eucariotas, donde las
levaduras son células especialmente preferibles dadas sus especiales
características que incluyen pej. crecimiento rápido, selección
positiva, selección de crecimiento y transformación eficiente y
selección del mismo.
Figura 1A muestra como se puede realizar un
control de calidad de la librería de scFv o CDR.
Figura 1B muestra que la solubilidad de las
proteínas de fusión está correlacionada con la activación génica
del gen marcador.
Figura 2 muestra la mejor acción in vivo
para el Ga14 AD-\Omega-injerto
scFv optimizado en comparación con otra variante llamada
\lambda-injerto.
Figura 3A muestra la acción in vivo de
diferentes fragmentos de scFv en la expresión génica de un gen
marcador Gcn4p dependiente de LacZ.
Figura 3B muestra la acción in vivo de
diferentes fragmentos de scFv expresados en levadura, en un ensayo
de doble híbrido.
Figura 4 muestra la selección de crecimiento en
un ensayo de doble híbrido de las células que expresan diferentes
fragmentos de scFv.
Figura 5A muestra que la fusión
N-terminal de un dominio constante
(Gal11P-Ga14AD) a un anticuerpo de cadena simple no
afecta de forma significativa las propiedades de dicho fragmento de
scFv en la expresión génica de un gen marcador Gcn4p dependiente de
LacZ.
Figura 5B muestra que la introducción de
solamente dos sitios de restricción en un anticuerpo de cadena
simple no cambia las propiedades de este fragmento scFv en la
expresión génica de un gen marcador LacZ.
Figura 6 muestra un análisis por Western blot de
la solubilidad de diferentes fragmentos scFv de unión a Gcn4p
expresados en levadura.
El término "control de calidad" define un
ensayo que permite la selección de un intracuerpo estable y soluble
a partir de una librería de scFv.
Con esta finalidad se genera una fusión de la
librería de scFv a un dominio de activación de la transcripción (en
este caso Gal4AD) y una región constante (en este caso Gal11P
aminoácidos 263-352). La estabilidad de la proteína
de fusión depende de la estabilidad y la solubilidad de la porción
de scFv. El dominio constante Gal11P interacciona con el dominio de
dimerización de Gal4 (residuos 58-97, parte del
dominio de unión a ADN de Gal 4 (DBD) (Barberis et al.,
1995)).
Esta librería es transformada en células de
levadura que expresan el Ga14 DBD (residuos 1-100)
que se une al promotor de un gen marcador seleccionable (pej.
HIS3/LacZ). El crecimiento de esta célula huésped solamente se
produce cuando el intracuerpo testado muestra la solubilidad y la
estabilidad demandadas y por lo tanto puede interaccionar de forma
suficiente vía Gal11P con el Gal4 DBD (ver Figura 1A).
El principio del sistema de control de calidad
descrito en la presente invención fue demostrado utilizando un
número de scFv bien caracterizadas. Estas poseían propiedades de
unión a antígeno esencialmente idénticas pero diferentes
estabilidades in vitro. Los diferentes fragmentos scFv fueron
expresados como proteínas de fusión Gal11P-Gal4AD.
El dominio de dimerización de Gal4 (residuos 58-97)
fue fusionado al extremo C-terminal de LexA y
transformado en la cepa marcadora YDE173, que contiene genes
marcadores bajo el control de sitios de unión 6x LexA (ver más
abajo).
Como se ha enunciado más arriba, la estabilidad y
solubilidad intracelulares de las proteínas de fusión
Gal11P-Gal4AD-scFv depende la
porción scFv. Por lo tanto, solamente aquellas proteínas de fusión
scFv que sean estables y solubles que interaccionen suficientemente
con LexA-Gal4 (58-97) son capaces
de activar la expresión del gen marcador (pej.
\beta-galactosidasa).
El alelo salvaje de Gal11 no interacciona con el
dominio de dimerización Gal4 (residuos 58-97). Una
fusión de cualquier cadena simple con el alelo salvaje Gal11 es por
lo tanto incapaz de activar el gen marcador y sirve de control
negativo. Esto fue demostrado utilizando un injerto constructo de
fusión Gal11 salvaje - Gal4AD-\lambda (ver Figura
1B).
Ni el cebo
(LexA-Gal4(58-97)) ni la
proteína de fusión scFv pueden activar por si solos la expresión
del gen marcador.
Solamente 2 de los 6 fragmentos scFv testados
fueron suficientemente solubles y estables para activar la
expresión génica del gen marcador en nuestro sistema de control de
calidad. Los esqueletos estabilizado de
injerto-\lambda e injerto-K son
las variantes más estables. Este resultado correlaciona
perfectamente con el análisis de fraccionamiento, donde solamente
los injertos \lambda y K fueron encontrados en la fracción
soluble. (ver Figura 6).
Son fragmentos scFv adecuados pej. el antiGCN4
scFv salvaje que fue originalmente obtenido mediante presentación de
ribosoma procedente de una librería construida a partir de un ratón
inmunizado (Hanes et al., 1998). El antígeno era un mutante
doble prolina en la cremallera de leucina Gcn4p, llamado 7P14P
(indicando que las posiciones 7 y 14 del dominio en cremallera están
mutadas a residuos Pro), el cual forma una hélice aleatoria en
solución (Leder et al., 1995). El fragmento scFv impide la
dimerización in vitro del péptido salvaje Gcn4p plegado en
hélice (Berger et al., 1999), ya que también se une al
péptido salvaje como monómero en una conformación helicoidal
aleatoria. El fragmento scFv anti-GCN4 referido como
"salvaje" en conexión con la presente invención ha sido medido
para tener una constante de disociación de 4\cdot10^{-11}M del
péptido cremallera de leucina (Hanes et al., 1.998).
En el ámbito de la presente invención, varios
mutantes diferentes de este scFv fueron investigados. Además del
anti-GCN4 salvaje, una variante desestabilizada del
anti-GCN4 salvaje, el cual es portador de la
mutación H-R66K [llamado
anti-GCN4(H-R66K)], sirvió
como un ejemplo de fragmento scFv de unión a Gcn4p con propiedades
de unión a antígeno esencialmente idénticas, aunque con una
estabilidad in vitro ligeramente disminuida (ver más abajo).
El residuo Arg en la posición H-66 (numeración de
acuerdo con Kabat et al., 1991) se encuentra lejos del
bolsillo de unión a antígeno y normalmente forma un puente de
hidrógeno doble con la Asp H-86. Se demostró que la
Arg en la posición H-66 proporciona una elevada
estabilidad a la proteína comparada con Lys en el fragmento scFv
levan de unión a A48 (Proba et al., 1998; Wörn y Plückthun,
1998a). Además una variante Val-Ala del fragmento
scFv anti-GCN4 [llamado
anti-GCN4(SS^{- -})] fue testada, donde
ambos disulfuros intradominio fueron reemplazados por pares
Val-Ala (LC23V, L-C88A,
H-C22V, H-C92A). Se demostró que
estas mutaciones inducen una ligera estabilización en comparación a
la forma ditiol reducida del fragmento scFv p185HER2 de unión a
4D5, y se ha especulado que podrían mejorar la acción de los
intracuerpos (Wörn y Plückthun, 1998b).
Dos variantes adicionales fueron diseñadas
mediante injerto (Jones et al., 1986) de los lazos del CDR
(región determinante complementaria) anti-GCN4 con
otro esqueleto. Dado que el esqueleto receptor llamado scFv
"híbrido" fue escogido (Wörn y Plückthun, 1999). Este
esqueleto receptor se compone del dominio V_{L} del fragmento
scFv 4D5 y el dominio V_{H} del fragmento scFv A48^{++} (H2).
fue diseñado de manera racional a partir series de dominios
estabilizados y sobresalía por su extraordinaria estabilidad, como
se demostró mediante equilibrio desnaturalizante inducido de
despliegue, y una gran producción de expresión (Wörn y Plückthun,
1999). Dos variantes con CDRs injertados conteniendo los CDRs del
scFv anti-GCN4 y la red scFv "híbrido" fueron
preparados a través de síntesis genética total. Como el donante de
lazo anti-GCN4 salvaje era portador de la cadena
ligera \lambda, mientras que el esqueleto "híbrido" receptor
era portador de la cadena ligera K, el injerto del lazo no fue
sencillo. Por lo tanto, dos variantes diferentes fueron diseñadas,
una más "K-like" (llamada
injerto-K), y la otra más
"\lambda-like" (llamada injerto \lambda).
Estas dos variantes se diferencian solamente en siete residuos en
la región de acoplamiento V_{H}-V_{L},
influenciando potencialmente la orientación de los dos dominios uno
respecto al otro. El fragmento scFv AL5 de unión a ampicilina (A.
Krebber et al., no publicado) sirvió como control negativo
para un fragmento scFv que no se une a Gcn4p.
La scFv anti-GCN4 fue
inicialmente testada para su actividad biológica a partir de varios
vectores de levadura que contenían los promotores GAL1 y
ADH. Adicionalmente, la señal de localización nuclear (NLS)
procedente del antígeno T grande SV40 fue fusionado de forma
N-terminal a la scFv anti-GCN. De
las combinaciones testadas, el scFv anti-GCN4 mostró
el mayor efecto biológico cuando se expresó a partir del promotor
actina-1 sin ninguna NLS utilizando el vector de
expresión pESBA-Act (ver ejemplos) con el marcador
de selección TRP1 y un origen de 2\mu (datos no
mostrados). Este vector fue después utilizado para todos los
experimentos posteriores.
El efecto in vivo de la expresión de los
diferentes fragmentos scFv en expresión GCN4 dependiente de LacZ se
representa en la figura 3A. El constructo marcador
(YAdM2xGCN4-150) contenía dos lugares de unión Gcn4p
en la posición -150 respecto a la caja TATA y estaba integrada en
el genoma de levadura. La actividad
\beta-galactosidasa relativa (Actividad
\beta-gal. Rel.) conducida por el Gcn4p endógeno
fue arbitrariamente considerada como del 100%. AL5 es una scFv de
unión a ampicilina y se utiliza como control negativo. Además del
anti-GCN4 salvaje (wt), un mutante puntual
desestabilizado
[anti-GCN4(H-R66K)], una
variante libre de cisteína del antiGCN4 salvaje
[anti-GCN4(SS^{- -})], y dos variantes de
red estabilizada del anti-GCN4
(injerto-K y injerto-\lambda)
fueron testados. El injerto-\lambda fue el
intracuerpo más activo, mientras que el mutante puntual
desestabilizado H-R66K y la variante libre de
cisteina del anti-GCN4 mostraron una actividad
disminuida en comparación con el anti-GCN4 salvaje.
La actividad disminuida del injerto-K se cree que es
debida a su baja afinidad de unión (ver Tabla 1). El mutante
puntual desestabilizado anti-GCN4
(H-R66K) fue menos eficiente en la inhibición del
gen marcador dependiente de GCN4, en comparación con la scFv
salvaje. El patrón de la inhibición de la transactivación de Gcn4p
fue altamente reproducible y se confirmó también al usar un método
se ensayo diferente, en el que la actividad
\beta-galactosidasa del gen marcador fue medida
después de la rotura de las células mediante cuentas de vidrio o
mediante ciclos de congelación-descongelación para
la lisis y normalizando la actividad
\beta-galactosidasa a la concentración de proteína
(Escher y Schaffner, 1997) (datos no mostrados).
La exitosa interacción entre el antígeno y las
regiones determinantes complementarias (CDRs) en el ensayo de doble
híbrido monitorizado a través de LacZ como gen marcador se muestra
en la Figura 3B. La cepa marcadora YDE173 fue utilizada. La cepa
YDE173 fue depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen DSZM, Braunschweig Alemania, el 11 de febrero de
2000 bajo el número DSM 13333. YDE173 fue derivada de la cepa de
levaduras JPY5 (Mat\alpha ura3-52 his3\Delta200
leu2\Deltal trp1\Delta63 lys2\Delta385) presentando integrado
en su locus his3 genómico el plásmido marcador pDE200 que
contiene seis sitios de unión LexA controlando los marcadores HIS3
y LacZ orientados de forma divergente.
Los mismos fragmentos scFv utilizados como para
la Fig. 3ª, aunque fusionados con el dominio de activación
transcripcional de Gal4 fueron coexpresados conjuntamente con la
cremallera de leucina GCN4 (aa 245285) fusionada de forma
C-terminal a LexA, sirviendo como cebo en el ensayo
de doble híbrido. Al inespecífico constructo de fusión scFv control
AL5 no le fue posible interaccionar con la cremallera de leucina
LexA-GCN4 y por lo tanto no activó al gen marcador
LacZ. El dominio de activación Gal4 fusionado a la variante
injerto-\lambda de red estabilizada mostró el
efecto más fuerte como intracuerpo activador, seguido por el
anti-GCN4 salvaje, y el mutante puntual
desestabilizado anti-GCN4 (H-R66K).
En contraste con el altamente estable aunque de unión débil
injerto-K y el anti-GCN4 libre de
cisteína (SS^{- -}) no causó una expresión significativa del gen
marcador en el formato de doble híbrido. Los mismos resultados
fueron obtenidos en un ensayo de placa X-Gal (datos
no mostrados). En resumen, la acción in vivo de las
diferentes variantes de fusión Gal4 AD-scFv en la
activación del gen marcador LacZ en el formato de doble híbrido se
correlaciona recíprocamente con el patrón de inhibición de la
expresión de LacZ dependiente de Gcn4p (comparar Figura 3A con
3B).
Puesto que el constructo marcador integrado no
solamente contiene un gen marcador LacZ, sino que también el gen
HIS3, es apropiado para la selección del crecimiento en placas en
ausencia de histidina. Además, añadiendo diferentes concentraciones
de 3-aminotriazol (3-AT), el cual es
un inhibidor competitivo de del producto génico HIS3, es posible
inhibir (suprimir) el crecimiento de las células de levadura
dependiendo de la fuerza de la interacción cebo/antígeno y Gal4
AD-scFv.
El procedimiento que lleva a los resultados
mostrados en la Figura 4 fue como sigue: un banco de 5 diluciones,
partiendo de aproximadamente 10.000 células de levadura
coexpresando la cremallera de leucina GCN4 (aa
245-285) fusionada a LexA y a la proteína de fusión
Gal4-AD scFv, fueron sembradas en placas
(-Trp/-Leu/-His) que contenían diferentes concentraciones de
3-AT. El crecimiento fue monitorizado después de 48
h, 72 h y 120 h.
Los carriles mostrados en la Figura 4 son como
sigue:
1. Gal4-AD
\lambda-injerto, 2. Gal4-AD AL5,
3. Gal4AD K injerto, 4. Gal4-AD
anti-GCN4 (SS^{- -}), 5. Gal4-AD
anti-GCN4 salvaje, 6. Gal4-AD
Anti-GCN4 (H-R66K), 7. la Proteína
de fusión LexA-Gal11 sirve de control positivo, 8.
vectores vacíos.
El crecimiento de las cepas de levadura que
coexpresan el cebo/antígeno (cremallera de leucina
lexA-GCN4) de forma conjunta con una fusión Gal4
AD-scFv fue monitorizado durante cinco días. Como
control en placas en ausencia de 3-AT, no se
observaron diferencias obvias de crecimiento de las diferentes
variantes de fusión Gal4 AD-scFv. 20 mM de
3-AT, fueron suficientes para suprimir el
crecimiento de las células transformadas con el scFv control
negativo (Gal4 AD-AL5). En correlación con los
resultados de la monitorización de la expresión de
\beta-galactosidasa, las fusiones de Gal4 AD con
la variante K-injerto, anti-GCN4
(SS^{- -}), y
anti-GCN4(H-R66K) no permitió
el crecimiento en presencia de 20 mM de 3AT. Las células que
expresaban la variante \lambda-injerto así como
el anti-GCN4 salvaje les fue posible crecer en
presencia de hasta 80 mM de 3-AT en 5 días con una
clara ventaja del esqueleto estabilizado
\lambda-injerto a lo largo del tiempo. Una
concentración de 100 MM de 3-AT fue suficiente para
abolir el crecimiento de las células que expresaban Gal4
AD-anti-GCN4 salvaje. Solamente
después de 5 días, unas pocas aparecieron en la siembra de mayor
concentración donde las células que expresaban la variante de
fusión \lambda-injerto Gal4
AD-scFv crecieron claramente.
Gal11P (residuos 263-352) y el
dominio de activación de Gal4 fueron fusionados con el extremo
N-terminal de la scFv
\lambda-injerto (Gal11P-Gal4AD
\lambda-injerto). Su actividad biológica
inhibiendo la activación el gen dependiente de Gcn4p fue comparada
con la del \lambda-injerto en solitario. Como se
muestra en la Figura 5A la fusión de un dominio constante a la scFv
no interfirió con su actividad inhibitoria sobre la activación
génica dependiente de Gcn4p.
Con la finalidad de cambiar el CDR3 V_{H}
(GLFDY) con una librería de péptidos, dos sitios de restricción
únicos (BglII y XhoI) flanqueando esta región
hipervariable fueron introducidos por mutagénesis silente. Estos
cambios silentes no afectaron la secuencia de aminoácidos del
anticuerpo y además no alteró la acción in vivo de la
variante \lambda-injerto (ver figura 5B).
La importancia de la región hipervariable CDR3
(de Wildt et al., 1997; Hemminki et al., 1.998) para
el reconocimiento específico de su antígeno (la cremallera de
leucina GCN4) se mostró introduciendo una alanina adicional
N-terminal al CDR3 (AGLFDY) de la cadena pesada
variable. Esta variante \lambda-injerto+Ala no
fue capaz de inhibir la expresión de un gen marcador dependiente de
Gcn4p en la cepa de levaduras YAdM 2xGCN4-150, y fue
también incapaz de activar la expresión del gen marcador en el
formato de doble híbrido utilizando la cepa YDE173 (datos no
mostrados).
La solubilidad de los diferentes fragmentos scFv
de unión a Gcn4p en levadura fue testada mediante Western blot.
Solamente en los casos de las variantes injertos \lambda y K
cantidades significativas de proteínas solubles pudieron ser
testadas en extractos celulares brutos (Figura 6).
Todas los demás fragmentos scFv
anti-GCN4 parecieron ser de forma esencial
completamente insolubles, con una cantidad de scFv insoluble
ligeramente incrementando con la decreciente estabilidad in
vitro. Sin embargo, hay que ser cauto respecto a que la
proporción exacta entre proteína soluble e insoluble para las
diferentes variantes de scFv puede no necesariamente reflejar la
proporción presente in vivo. No puede ser excluido que parte
de las diferentes variantes anti-GCN4 podrían ser
precipitadas durante la preparación de la muestra, aunque sea
utilizada un método de disrupción celular suave, utilizando el
Y-PER^{TM} Reactivo de extracción de proteínas de
levadura de Pierce.
Variaciones en las redes preferiblemente aisladas
mediante un método de acuerdo con la presente invención puede ser
combinado para generar mas redes que son estables y solubles en un
medio reductor. Las mencionadas redes resultantes muestran una
actividad in vivo incrementada en comparación con redes
portadoras solo de una variación. Una red combinando seis
variaciones se define en ID. DE SEC. NO:1.
Todos los fragmentos scFvs estaban en una
orientación V_{L}-V_{H} con un encadenador
20-mero (GGGGSGGGGS-
GGGGSSGGGS) y una his_{5}-tag C-terminal.
GGGGSSGGGS) y una his_{5}-tag C-terminal.
Los fragmentos scFv expresados en levadura fueron
clonados en el vector de expresión pESBA-Act. El
vector pESBA-Act es un vector lanzadera
Saccharomyces cerevisiae - E.coli. Contiene un origen
de replicación bacteriano y el gen de resistencia a amp. Además
contiene el gen TRP1 de la levadura para la selección de
transformación en S. cerevisiae. Está diseñado para la
elevada expresión de proteínas en levadura y por lo tanto posee el
origen de replicación 2\mu que asegura un elevado número de
copias en S.cerevisiae. Además, contiene el promotor
constitutivo fuerte de la actina y la secuencia terminadora de la
transcripción de GAL11 separada mediante un sitio de múltiple
clonaje que contiene dianas de restricción para NcoI
(cubriendo el codón ATG de inicio de traducción), ApaI,
StuI, tres codones de fin de traducción en las tres posibles
agrupaciones de las bases y una diana SaiI.
Todos los fragmentos scFvs fueron clonados vía
dianas de restricción Bsp120I y StuI y llevaban una
His_{5}-tag C-terminal. Dos
aminoácidos (Gly-Pro) codificando la diana del
sitio Bspl20I hubieron de ser incluidos en el extremo
N-terminal, después del residuo iniciador Met.
El dominio de activación Gal4 fue amplificado
mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando pGAD424
(Clontech) como plantilla. Ambos cebadores [cebador anterior:
5'-CCATGGGCCCAAGCTTTGCAAAGATGGATAAAG-3'
(Id. de Sec. No.2, cebador posterior:
5'-TTTGGGCCCGAAGAACCGCCACCACCAG-AACCGCCTCCACCAGAGCCACCACCACCAGGCCTGATCTCTTTTTTTGGGTTTGGTG-3',
(Id. de Sec. No. 3)] contienen una diana ApaI adecuada para
clonar el dominio de activación Gal4 (AD) polipéptido que incluye
el antígeno T de SV40 señal de localización nuclear
N-terminal a los diferentes scFvs en el contexto
del pESBA Act. El dominio de activación y los anticuerpos de cadena
sencilla están separados por un encadenador (GGGS)_{3}
codificado por el cebador anterior.
Tanto Gal11wt como Gal11p fueron amplificados
utilizando los siguientes cebadores: cebador anterior:
5'CATGCCATGGTTCCTCAACAGCAGCAAATGCAAC-3' (Id. de Sec.
No.4), cebador posterior:
5'-CATGCCATGGCGCTAGCCAAAGCTTGGATTTTTCT-CAGG-3'
(Id. de Sec. No.5), ambos conteniendo una diana NcoI. Los
productos de PCR que codifican los aminoácidos
263-352 fueron insertados en el sitio NcoI
del constructo de fusión pESBA-Act2
Gal4(AD)-scFv (descrito más arriba). Esto
genera una fusión en el marco del respectivo alelo Gal11 con
Gal4(AD)-scFv. La correcta orientación de
los insertos Gal11 fueron testados por digestión con el enzima
único NheI.
La cremallera de leucina GCN4 (aa
245-285) fue amplificada por PCR mediante cebadores
que contenían una diana EcoRI adecuada para clonar corriente
abajo de LexA aa 1-202. Esto resulta en pAdMO18, un
plásmido Ars Cen con el marcador de selección LEU2 expresando la
proteína de fusión bajo el control del promotor ADH.
Con la finalidad de cambiar fácilmente el CDR3 de
la cadena variable pesada, dos únicas dianas de restricción fueron
introducidas flanqueando el CDR3 V_{H} mediante mutagénesis
dirigida, sin cambiar la estructura primaria de Gal4
AD-\lambda-injerto scFv. Estas
mutaciones puntuales silenciosas fueron introducidas por PCR
utilizando \lambda-injerto como plantilla. En una
primera ronda, dos reacciones de PCR separadas fueron realizadas
utilizando el cebador #2421 con #2487 y #2486 con #2488 generando
dos productos de PCR solapados. Estos dos productos sirvieron como
plantilla para una segunda ronda de PCR con cebadores externos #2421
y #2488 que contenían dianas SpeI y SalI. El producto
final fue subclonado en un Gal4
AD-\lambda-injerto mediante
SpeI y SalI.
Los primeros tres aminoácidos (GLF) del CDR3 de
la cadena pesada variable de la red estabilizada scFv
\lambda-injerto fusionada con el dominio de
activación Gal4 (\lambda-injerto
scFv-Gal4 AD) fue aleatorizado mediante un método
basado en PCR descrito por Reiter et al. Los dos últimos
residuos (D y Y) del CDR3 no fueron aleatorizados dada su
conservación y su importancia estructural (Chothia y Lesk, 1987).
Se obtuvo una librería \lambda-injerto
scFv-Gal4 AD que potencialmente codificaba 8000
variables diferentes de CDR3 de la cadena variable pesada. El
análisis de la secuencia de seis clones escogidos al azar reveló la
presencia de secuencias CDR3 aleatorias en las posiciones
deseadas.
La cepa de levaduras YDE173, que contiene los
genes marcadores HIS3 y LacZ bajo el control de 6 sitios de
unión LexA (ver más arriba), fue cotransformada con el vector que
expresaba la cremallera de leucina GCN4 (aa
245-285) fusionada a LexA y la librería y fue
cultivada en placas con medio selectivo (-Trp/ -Leu/ -His)
conteniendo 60 mM 3-AT para la selección del
crecimiento. Si un fragmento scFv de la librería CDR3 con una
secuencia adecuada de CDR3 se une al antígeno cremallera de leucina
fusionada a LexA, se forma un complejo que activa la transcripción
del gen marcador HIS3 y restaura el crecimiento
independiente de histidina de la célula de levadura. Después de 3
días, las colonias que crecieron fueron recogidas y resembradas en
el mismo tipo de placas selectivas. Para las células que siguieron
creciendo posteriormente la segunda selección fue analizada
mediante actividad \beta-galactosidasa en placas
X-gal. ADN de los plásmidos de la librería
procedentes de los clones \beta-gal positivos fue
extraído y la región de los CDR3 de la cadena pesada variable fue
secuenciada: nosotros encontramos 4 veces la secuencia de
aminoácidos del CDR3 \lambda-injerto original y
tres secuencias de CDR3 para unión a la cremallera de leucina GCN4
completamente nuevas específicas. Los cuatro clones de scFv
identificados que contenían la secuencia original de CDR3 se
comportaron de forma indistinguible al
\lambda-injerto mientras que los tres clones con
la secuencia CDR3 alterada fueron menos eficientes en la activación
del gen marcador LacZ.
Estos resultados demuestran la posibilidad de
realizar cribas directas intracelulares para nuevos CDRs embebidos
en un esqueleto definido de scFv que es estable y soluble bajo
condiciones reductoras.
La variante de esqueleto estabilizada de
\lambda-injerto fue mutagenizada al azar tal y
como se describe en Sambrook et al. Con la finalidad de
introducir estadísticamente cambios en los aminoácidos a lo largo
de la red del intracuerpo. La cepa de levaduras YDE173 fue
cotransformada con esta librería de scFv mutagenizadas
aleatoriamente fusionada con el dominio de activación de Gal4 y el
plásmido que expresa el antígeno específico (aa
245-258 de la cremallera de leucina GCN4) fusionada
a LexA y cultivadas en placas de selección conteniendo 80 mM de
3-AT. Seis clones candidatos fueron seleccionados,
cada uno llevaba un solo cambio de aminoácido en la red. Estas seis
redes mutantes mostraron una acción in vivo mejorada en
comparación con la variante \lambda-injerto, que
fue confirmada y cuantificada midiendo la actividad
\beta-galactosidasa. Asumiendo que diferentes
cambios de aminoácidos que mejoran la actividad de un intracuerpo
se comportan de forma aditiva, nosotros combinamos las seis
mutaciones en un esqueleto que fue fusionado la dominio de
activación Gal4 y comparado con la variante de esqueleto
estabilizada de \lambda-injerto en la activación
del gen marcador LacZ. La Figura 2 muestra que este nuevo esqueleto
el cual contiene las seis mutaciones puntuales combinadas
(\Omega-injerto) presenta una actividad de casi un
30% mejor en comparación con la variante original
\lambda-injerto. Remarcablemente, estas seis
sustituciones de aminoácidos están agrupadas; dos de ellas (E
\rightarrow K y L \rightarrow R preceden al CDR1 de la cadena
ligera variable y las cuatro restantes (N rightarrow D, G
\rightarrow C, K \rightarrow E, T rightarrow S) están
localizadas entre el CDR2 y el CDR3 de la cadena pesada
variable.
El plásmido marcador de integración pAB183 se
derivó de pJP161 (Barberis et al., 1995) mediante la
clonación de dos sitios de unión a Gcn4p en la posición 150
anterior a la caja TATA del promotor GAL1. Los sitios de unión a
Gcn4p fueron generados mediante el anillamiento de dos
oligonucleótidos complementarios presentando secuencias compatibles
5' SphI and 3' SalI. Los oligonucleótidos son los
siguientes:
5'-CCTATGACTCATCCAGTTATGACTCATCG-3'
(Id. de Sec. No.6); 5' TCGACGATGAGTCATAACTGGAT
GAGTCATAGGCATG-3' (Id. de Sec. No.7). Este plásmido
marcador fue linearizado en la diana ApaI y integrado en el
locus genómico ura3 de levadura de la cepa JPY5 (Barberis
et al., 1995), resultando en YAdM2xGCN4-150.
La cepa YAdM2xGCN4-150 fue depositada el 11 de
febrero de 2000 con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH DSZM, Braunschweig Alemania, con el número
DSM13332. Cuatro levaduras transformantes independientes fueron
probadas en un ensayo funcional y todas mostraron la misma
actividad génica del gen marcador dependiente de GCN4. Uno de los
clones (YAdM2xGCN4-150) fue escogido para todos los
experimentos posteriores y es llamado levadura de tipo salvaje.
La cepa marcadora utilizada para los experimentos
de doble híbrido, presenta un constructo marcador integrado que
posee un promotor bidireccional con seis sitios de unión a LexA
conduciendo la expresión de LacZ e HIS3.
La células de levadura fueron transformadas a
través del método del acetato de litio, siguiendo los protocolos
estándar. Los transformantes fueron cultivados durante la noche a
30ºC en medio selectivo (-Trp/-Leu). Los cultivos saturados fueron
diluidos en medio selectivo hasta OD_{600} = 0,7 e incubados de
nuevo por al menos un ciclo de duplicación. Cada cultivo fue diluido
en serie en agua (factor de dilución 5) empezando por una
concentración aproximada de 10^{6} células/ml, y 10 \mul de
cada dilución fueron sembrados en placas con medio selectivo
(-Trp/-Leu/-His) conteniendo 0 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, or
100 mM of 3-aminotriazol. Seis diferentes diluciones
de cada transformante fueron sembradas en placas con medio de
cultivo selectivo. Las placas fueron incubadas a 30ºC y fueron
revisadas después de 48h, 72h, y 120h.
El ensayo \beta-galactosidasa
en solución fue realizado utilizando células permeabilizadas como
se describe en (Kaiser et al., 1994, Escher y Schaffner
1997). La actividad fue normalizada al número de células
ensayadas.
La solubilidad de los diferentes fragmentos scFv
anti-GCN4 fue analizada mediante Western blot.
Cultivos de cinco ml fueron incubados a 30ºC hasta una densidad
óptica de alrededor de 2-3. Las células fueron
normalizadas a las mismas densidades, precipitadas y sometidas a
una extracción de proteínas celulares totales mediante
Y-PERT^{TM} reactivo de extracción de proteínas de
levadura de Pierce, el cual es una formulación detergente moderada
que facilita el aislamiento suave de proteínas solubles. Las
fracciones soluble e insoluble fueron separadas por centrifugación
(13000 rpm, 10 min, 4ºC). Muestras del extracto crudo soluble e
insoluble fueron sometidos a SDS-PAGE y fijados a
membranas de PVDF, siguiendo protocolos standard. Los fragmentos
scFv marcados con His5 fueron detectados mediante fusión
anti-His_{5}scFv-AP como se
describe en (Lindner et al., 1997), mediante el sustrato
quimioluminiscente de la fosfatasa CSPD de Boehringer Mannheim.
Para obtener intensidades razonables en los Western blots, una
concentración de proteínas alrededor de 5 veces superior tuvo que
ser usada en las fracciones solubles, en comparación con las
fracciones insolubles y las manchas fueron expuestas a diferentes
tiempos de recorrido. Por lo tanto, una comparación directa tiene
sentido solamente entre todas las muestras solubles o entre todas
las muestras insolubles, respectivamente.
Mientras han sido aquí mostrados y descritos las
formas preferibles de llevar a cabo la presente invención, debe de
ser comprendido que la invención no está limitada a ellas
pudiéndose llevar a cabo y practicada de varias formas bajo el
enfoque de las siguientes reivindicaciones.
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<110> ESBATech AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Intracuerpos con esqueleto definido
que es estable en un ambiente reductor y aplicaciones de los
mismos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> secuencia Omega injerto
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT 02054
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-12-28
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT 00218
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-03-01
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(114)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera variable
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (135)..(247)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena pesada variable
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICION
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (115)..(134)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazante Glicina Serina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (248)..(252)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His Tag
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR 1 VL
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (56)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR 2 VL
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (95)..(103)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR 3 VL
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (165)..(169)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR 1 VH
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (184)..(198)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR 2 VH
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (232)..(236)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR 3 VH
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Esqueleto Intracuerpo
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador de PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgggccc aagctttgca aagatggata aag
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgggcccg aagaaccgcc accagaaccg cctccaccag agccaccacc
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaaggcct gatctctttt tttgggtttg gtg
\hfill83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgccatgg ttcctcaaca gcagcaaatg caac
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgccatgg cgctagccaa agcttggatt ttctcagg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctatgactc atccagttat gactcatcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgacgatga gtcataactg gatgagtcat aggcatg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Un método para la identificación de las redes
de intracuerpos o intracuerpos donde las células huésped adecuadas
son transformadas mediante una librería donde dicha librería es un
producto de fusión de un intracuerpo con una proteína marcadora
donde dicha proteína marcadora es solamente activa como parte de una
proteína de fusión codificando una parte soluble y estable de un
intracuerpo, entonces cultivando las mencionadas células bajo
condiciones que permitan la identificación y la selección de
aquellas células que expresen una red soluble y estable de
intracuerpo por medio de la detección de la proteína marcadora.
2. El método de la reivindicación 1, donde dicha
proteína marcadora presenta una actividad seleccionable, en
particular una actividad enzimática o actividad fluorescente.
3. Un método para la identificación de los
intracuerpos o esqueletos de intracuerpos, comprendiendo la
transformación de células huésped adecuadas con una librería la
cual es un producto de fusión de una librería de intracuerpo y una
proteína de unión a ADN que es capaz de activar la transcripción, y
un sistema marcador donde dicho sistema marcador se encuentra bajo
el control transcripcional de dicha proteína de unión a ADN, donde
dicha proteína de unión a ADN que puede activar la transcripción es
solamente activa como parte de una proteína de fusión que codifica
una parte estable y soluble de un intracuerpo, y el cultivo de
dichas células bajo condiciones que permitan la identificación y la
selección de aquellas células que expresen un intracuerpo soluble y
estable por detección de la señal de dicho sistema marcador.
4. Un método para la identificación de esqueletos
de intracuerpo o intracuerpos, donde células huésped adecuadas son
transformadas con una librería que codifica proteínas que
comprendan un intracuerpo y una parte de un sistema de
transactivación, donde dicha parte de un sistema de transactivación
es solamente activa como parte de una proteína de fusión que
codifique una parte estable y soluble de un intracuerpo, y dichas
células además expresar una segunda proteína comprendiendo al menos
la segunda parte de dicho sistema de transactivación, donde dicho
sistema de transactivación está unido a un marcador que permita la
supervivencia y dichas células solamente pueden sobrevivir bajo
condiciones selectivas en presencia de la interacción entre dichas
dos proteínas a través de una región constante de la proteína
codificada por la librería.
5. El método de la reivindicación 4, donde las
proteínas codificadas por dicha librería comprenden un dominio de
activación transcripcional y dichas segundas proteínas comprenden un
dominio de unión a ADN o dichas proteínas codificadas por la
librería comprenden un dominio de unión a ADN y dichas segundas
proteínas comprenden un dominio de activación transcripcional.
6. El método de las reivindicaciones 4 ó 5, donde
dichas segundas proteínas comprenden un dominio de unión a ADN o un
dominio de activación de la transcripción, respectivamente, y una
proteína que interacciona con la región constante de dicha primera
proteína codificada por la librería.
7. El método de las reivindicaciones 4 a la 6
donde dicha librería codifica una proteína que comprende el dominio
de activación de la transcripción de GAL4 y Gal11P y dicha segunda
proteína comprende el dominio de unión a ADN de Gal4.
8. El método de las reivindicaciones 1 a la 7,
donde la célula huésped es una célula eucariota, preferiblemente
una célula de levadura.
9. Un método para identificar una scFv con una
red definida que es estable y soluble en un medio reductor,
comprendiendo
a) aislamiento de la scFv de acuerdo con un
método de las reivindicaciones de 1 a la 8,
b) producción de una librería de scFv con
esqueletos variados y CDRs constantes por medio de la mutación de al
menos una secuencia de ADN codificante para un esqueleto de la scFv
del paso a), y por introducción de tales mutaciones en los vectores
de expresión adecuados,
c) transformación de células huésped capaces de
expresar un antígeno específico conocido y solamente sobreviviendo
en presencia de la interacción antígeno-scFv con
dicha librería de scFv,
d) Las por lo tanto transformadas células huésped
son cultivadas bajo condiciones adecuadas para expresar el antígeno
y el scFv y permitiendo la supervivencia celular solo en presencia
de la interacción antígeno-scFv,
e) La scFv expresada en las células
supervivientes y que tienen un esqueleto definido que es estable y
soluble en un medio reductor es identificada.
10. El método de la reivindicación 9, donde la
célula huésped es una célula eucariota.
11. El método de la reivindicación 9 ó 10 donde
la célula huésped es una célula de levadura.
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