KR100635370B1 - ＳｃＦｖ 형태의 항체 라이브러리를 제작하기 위한 항체 ＳｃＦｖ 발현벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ScFv 형태의 합성 항체 라이브러리를 발현시키기 위한 ScFv 발현 벡터에 관한 것으로서, 항체 ScFv 발현 벡터의 링커 유전자에 제한효소 자리를 형성시킴으로써, 다양한 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역을 각각 개별적으로 발현 벡터에 삽입하여 항체 라이브러리를 보다 쉽게 구축하기 위한 항체 ScFv 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 종래 항체 ScFv 자체를 발현벡터에 삽입하는 방법에 비하여 정량적인 항체 ScFv를 제공하며, 보다 효율적으로 항체 라이브러리를 제조하는 우수한 효과를 가진다.
ScFv, 항체, 항체 라이브러리, pCANTAB5E, 특정부위 돌연변이화(site-directed mutagenesis), 침묵 돌연변이(silent mutation), His-태그(His-tag)

Description

ＳｃＦｖ 형태의 항체 라이브러리를 제작하기 위한 항체 ＳｃＦｖ 발현벡터 {Vector DNA expressing ScFv for producing ScFv antibody library}
도 1은 본 발명의 ScFv 형태의 항체 라이브러리를 제작하기 위한 항체 ScFv 발현 벡터 제조과정을 도시한 진행도이고,
도 2는 항체 ScFv(VH-linker-VL)가 삽입된 pCANTAB5E (Amersham Pharmacia Biotech사, 스웨덴)의 유전자 지도이고,
도 3은 GeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega 사, 미국)을 이용한 특정부위 돌연변이화(Site-directed mutagenesis)의 진행과정을 도시한 진행도이고,
도 4는 본 발명의 ScFv의 링커유전자에 BspEI 제한 효소 자리가 형성된 pKS4H의 유전자 지도이고,
도 5는 ScFv의 링커유전자에 BspEI 제한효소자리를 특정부위 돌연변이화(Site-directed mutagenesis)를 통해 생성시킨 것을 BspEI 제한효소로 절단하여 선별한 것으로서 밴드 1, 4, 6, 7, 10, 12, 14, 15가 올바르게 생성된 것이고,
도 6은 ScFv의 링커유전자에 BspEI 제한효소 자리가 형성된 벡터가 정확한지 확인하기 위해 관련된 제한효소를 처리하여 절단된 밴드의 크기를 추정하여 벡터의 완전성을 확인한 것이고,
도 7은 확인된 벡터시스템(pKS4E)의 E-태그(E-tag)를 His-태그(His-tag)로 치환시켜주기 위해 pKS3C 벡터(도 10: 본 발명자 자체 제작)에서 이에 해당하는 부분을 절단하여 본 발명의 벡터(pKS4H)를 완성하기 위한 벡터유전자, 삽입유전자를 준비한 것이고,
도 8은 ScFv의 링커유전자에 BspEI 제한효소자리를 생성시키고 E-태그를 His-태그로 치환시킨 최종 pKS4H를 관련된 제한효소를 사용하여 절단된 밴드를 통해 확인한 것이고,
도 9는 구축된 pKS4H 벡터 시스템이 제대로 작동하는 것을 확인하기 위해 파상풍 항체 유전자를 도입하여 항체가 올바르게 발현되는지를 효소면역 측정법으로 측정하여 그 발현정도를 기존의 pCANTAB5E 벡터와 비교 확인한 것이고,
도 10은 E-태그를 His-태그로 치환시켜주기 위해 사용된 pKS3C 벡터의 유전자 지도이다.
본 발명은 ScFv(single chain variable fragment) 형태의 합성 항체 라이브러리를 발현시키기 위한 ScFv 발현 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항체 ScFv 발현 벡터의 링커유전자(linker gene)에 제한효소 자리를 형성시킴으로써, 다양한 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역을 각각 개별적으로 발현 벡터에 삽입하여 항체 라이브러리를 보다 쉽게 구축하기 위한 항체 ScFv 발현 벡터에 관한 것이다.
1975년 콜러(Kohler)와 밀스테인(Milstein)에 의해 종양세포와 생쥐의 B 세포간의 세포 융합기술이 도입된 이후로 단일클론항체 생산이 가능하게 되었다 (Stone MJ (2001): Monoclonal antibodies in the prehybridoma era: a brief historical perspective and personal reminiscence. Clin lymphoma, 2: 148-154). 이러한 하이브리도마(hybridoma) 기술의 발달로 특정한 항원에 반응하는 단일클론항체를 만들 수 있게 되어 종양 표적화를 위해 종양세포의 표면에 발현되는 특이 항원에 친화성을 가지는 단일클론항체의 제조가 가능하게 되었다. 생쥐 단일클론항체(murine monoclonal antibody)는 다양한 표적항원(target antigen)의 적용과 대량 생산이 가능하다는 장점을 가지며, 선택적 약제의 개념은 마법의 탄환이라는 표현으로 에일리히(Ehrlich)에 의해 제시되어 진단시약이나 기초연구에 매우 유용하게 사용되어 왔다 (Reilly RM, Sandhu J, Alvarez-Diez TM, Gallinger S, Kirsh J and Stern H (1995): Problems of delivery of monoclonal antibodies. Pharmaceutical and pharmacokinetic solutions. Clin Pharmacokinet, 28: 126-142).
항체 표적 치료는 암세포의 표면에 발현된 종양관련 항원에 특이 결합하는 항체의 능력에 의해 치료효과가 나타난다. 생쥐에서 유래하는 항체는 인체에 반복 투여될 경우 치명적인 체내 면역반응(HAMA, human anti-mouse antibody response)을 유발할 수 있기 때문에 인간 질환의 예방과 치료를 위한 치료제로 부적합한 단점을 가진다. 파지 디스플레이(phage display) 방법은 비용해성 섬유상 박테리오파지 M13 (filamentous bacteriophage M13) 표면에 특이 결합 펩티드 또는 항체를 전시 발현시키는 것이다. 바이오패닝(Biopanning)이라고 불리는 선택적 반응 과정을 수회 반복하여 특이 결합 물질이 다양하게 발현된 파지 중에서 특정 항원에 반응하는 파지만을 선별하게 된다. 이렇게 선택된 파지는 증식을 통해 다량 생산할 수 있다. 이러한 파지 디스플레이의 원리는 M13 박테리오파지의 유전자III가 인코드하는 마이너 코트 단백질(minor coat protein)인 pIII는 파지의 표면단백질로서 보통 3~5개가 발현되고, 박테리아 필루스(bacterial pilus)에 흡착하는 역할을 하는데, 파지 벡터를 사용하여 다양한 펩티드 또는 항체를 pIII와 연결되도록 발현시키면, 바이오패닝을 통해 특이 결합 물질과 반응하는 파지를 찾아내는 것이다. 이러한 파지 디스플레이 방법을 종양 특이 항원에 대한 재조합 항체를 만드는데 이용한 연구도 있다. 이 기술의 장점은 단지 몇개월 만에 특정 항원에 대한 단일클론항체를 분리할 수 있다는 것이다.
그러나, 이 기술은 항체 라이브러리가 대단히 크지 않으면 친화도가 높은 항체를 개발하기 어렵다는 단점이 있다. 현실적으로 유용한 재조합 항체를 만드는 것은 위와 같은 파지 디스플레이 방법을 이용하여 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마로부터 유전자 재조합 방법을 이용, 특이 결합부위인 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 일정 길이의 펩티드 링커로 연결하여 가변 부분으로 연결된 단일사슬항체(single chain variable fragment, ScFv)를 만드는 것이다. 이렇게 만들어진 단일사슬항체는 유래된 단일클론항체의 결합부위와 유사한 구조를 가지게 된다 (Thirion S, Motmans K, Heyligen H, Janssens J, Raus J and Vandevyver C (1996): Mono- and bispecific single-chain antibody fragments ofr cancer therapy. Eur J Cancer Prev, 5: 507-511).
이렇듯 종래의 합성 항체 라이브러리는 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 일일이 펩티드 링커로 연결하여 항체 ScFv를 제작하여 이를 발현 벡터에 삽입하여 완성시켜 왔다.
본 발명자는 이러한 종래 방법으로는 정량적으로 항체 유전자를 충분히 구축하기 어렵고 여러단계를 거쳐야 하는 번거로움이 있다는 것을 본 연구과정을 통해 알 수 있었다.
이에 본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 종래 링커 펩티드를 코딩하는 유전자로 연결된 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 ScFv 발현 벡터에 있어서, 상기 링커 펩티드를 코딩하는 유전자 염기서열에 제한효소 자리를 형성시킴으로써 다양한 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 각기 개별적으로 벡터 시스템에 도입하여 발현시킴으로써 항체 ScFv 라이브러리의 제작에 보다 편리한 항체 ScFv 발현 벡터를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 항체 ScFv 발현 벡터는 ScFv의 링커 유전자에 제한효소로 절단되는 자리를 가지고 있어서, 다양한 VH 및 VL 을 개별적으로 벡터 시스템에 도입함으로써 종래 항체 ScFv 자체를 발현벡터에 삽입하는 방법에 비하여 정량적인 항체 ScFv를 제공하며, 보다 효율적으로 항체 라이브러리를 제조하는 우수한 효과를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 링커 펩티드를 코딩하는 유전자로 연결된 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 ScFv 발현 벡터에 있어서, 상기 링커 펩티드를 코딩하는 유전자는 제한효소로 절단되는 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 링커 펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열(BspEI 제한효소 자리)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 링커 펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 ScFv 발현 벡터로 플라스미드 pKS4E를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 ScFv 발현 벡터는 His-태그를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ScFv 발현 벡터로 플라스미드 pKS4H 를 제공한다.
또한, 본 발명은 링커 펩티드를 코딩하는 유전자로 연결된 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 ScFv 발현 벡터의 링커 펩티드 코딩 유전자에 침묵 돌연변이(silent mutation)를 시켜 제한효소 자리를 형성하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터 제조방법을 제공한다. 상기 침묵 돌연변이는 특정부위 돌연변이화(site-directed mutagenesis)를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 제한효소 자리는 서열번호 1의 염기서열(BspEI 제한효소 자리)을 포함하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.
종래 합성 항체 라이브러리는 중쇄 가변영역(VH)와 경쇄 가변영역(VL)을 일일이 펩티드 링커로 연결하여 항체 ScFv를 제작하여 이를 발현 벡터에 삽입하여 완성시켜 왔다.
본 발명자는 이러한 종래 방법으로는 정량적으로 항체 유전자를 충분히 구축하기 어렵고, 여러단계를 거쳐야 하는 번거로움이 있다는 것을 본 연구과정을 통해 알 수 있었다.
이에, 본 발명자는 항체 라이브러리를 좀더 효율적으로 제작하기 위하여 새로운 시도를 하였다. 즉, 링커 펩티드를 코딩하는 유전자로 연결된 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 ScFv 발현 벡터의 링커 펩티드 코딩 유전자에 침묵 돌연변이를 시켜 제한효소 자리를 형성하게 되면, 각각의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 제한효소 영역에 삽입하게 됨으로써 보다 정량적이고 다양하며, 손쉽게 항체 라이브러리를 제작할 수 있었다.
특히, 본 발명에서 제한효소 영역으로는 BspEI 제한효소 자리를 형성하는 것이 바람직하며, 항체 라이브러리의 오리지날 벡터로 pCANTAB5E를 사용하는 경우 E-태그의 BspEI 제한효소 자리를 제거하는 것이 바람직하다. E-태그를 His-태그로 전환시켜 E-태그에 존재하는 BspEI 제한효소 자리를 제거하였다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 결코 아니다.
실험 재료(Materials)
오리지날 벡터 DNA는 pCANTAB5E를 사용하였다. 본 실험에서는 플라스미드 DNA를 얻기 위해 XLI-Blue 컴피턴트 세포(competent cell)를 사용하였다. 플라스미드 DNA를 분리하기 위해서 퀴아젠 플라스미드 미니 프렙 키트(QIAGEN plasmid mini prep kit)와 미디 프렙 키트(midi prep kit)를 사용하였다. 오리지날 벡터 DNA는 pCANTAB5E를 사용하였다. 특정부위 돌연변이화를 실시하기 위해 GeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System을 미국 프로메가(promega)사에서 구입하였다. 제한효소들은 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)사에서 구입하였다. 항체 발현을 유도하기 위해 이소프로필 β-D-1'-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 시그마(SIGMA)사에서 구입하였고, 항체 발현을 측정하기 위해 HRP/항-His 태그 컨쥬게이트(HRP/anti-His tag conjugate)를 퀴아젠(QIAGEN) 사에서 구입하였고, TMB 퍼옥시다제 기질(TMB peroxidase substrate)을 KPL사에서 구입하였다.
실시예 1 : 파상풍 항체 ScFv가 삽입된 pCANTAB5E의 특정부위 돌연변이화(SDM)
1) 파상풍 항체 ScFv가 삽입된 pCANTAB5E
본 실험실에서 확립한 파상풍 단일클론항체를 마우스 ScFv 모듈/재조합 파지 항체 시스템(mouse ScFv Module/Recombinant Phage Antibody System)(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 유전자를 ScFv 형태로 pCANTAB5E 벡터에 클로닝하였다.
도 1은 본 발명의 ScFv 형태의 항체 라이브러리를 제작하기 위한 항체 ScFv 발현 벡터 제조과정을 도시한 진행도이고,
도 2는 ScFv(VH-linker-VL)가 삽입된 pCANTAB5E의 유전자 지도이다.
2) 열변성(Heat denaturation) 및 올리고뉴클레오디드의 어닐링(Annealing Oligonucleotides)
도 3은 GeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(Promega 사)을 이용한 특정부위 돌연변이화의 진행과정을 도시한 진행도이다.
상기 파상풍 항체 ScFv가 도입된 플라스미드 벡터 pCANTAB5E(double strand DNA, dsDNA) 165ng(10㎕, 0.05p㏖/㎕)을 DNA 돌연변이 주형(DNA mutagenesis template)으로 하여 94℃로 가열하여 단일사슬 DNA(single strand DNA, ssDNA)로 분리시킨 다음(heat denaturation), 하기 표 1에 도시된 선택 올리고뉴클레오티드(selection oligonucleotide, phosphorylated Top 또는 Bottom primer) 1㎕ (0.25p㏖/㎕), 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드(mutagenic oligonucleotide, phosphorlylated) 1㎕ (1.25p㏖/㎕), 어닐링 10× 버퍼(Annealing 10× Buffer) 2㎕ 및 멸균 탈이온수(sterile deionized water) 6㎕를 첨가하여 반응 총액을 20㎕가 되게 한 후, 75℃로 5분 동안 가열하고, 얼음에서 5분간 식힌(quenching) 다음, 상온에서 30분간 반응시켰다(Oligonucleotide Annealing Step).
올리고뉴클레오티드 유형 크기 프라이머 서열 (5'→3')
선택 올리고뉴클레오티드, Phosphorylated (Top Strand) 35mer 5'd(pGATAAATCTGGAGCCTCCAAGGGTGGGTCTCGCGG)-3'
선택 올리고뉴클레오티드, Phosphorylated (Bottom Strand) 35mer 5'd(pCCGCGAGACCCACCCTTGGAGGCTCCAGATTTATC)-3'
돌연변이유발 올리고뉴클레오티드, phosphorlylated 60mer 5'd(pGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGATCG)-3'
도 3에 보이는 바와 같이, 선택 올리고뉴클레오티드는 Ampr 부위에 어닐링되어 결합되고, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드는 항체 ScFv의 링커 유전자 부위에 어닐링되어 결합된다.
3) 돌연변이 사슬 합성(Mutant strand synthesis) 및 결찰(ligation)
상기 어닐링된 항체 ScFv 도입 플라스미드 벡터 pCANTAB5E 혼합물에 멸균 탈이온수 5㎕, 합성 10× 버퍼(synthesis 10× buffer) 3㎕, T4 DNA 리가제(ligase) 1㎕, T4 DNA 폴리머라제 1㎕를 첨가하여 총액이 30㎕로 되게 한 후, 37℃에서 90분간 반응시켰다.
4) BMH71-18 mutS 컴피턴트 세포(competent cells)로 형질전환
상기 변이도입(mutegenesis) 효율을 증가시키기 위하여 E. coli BMH 71-18 mutS를 컴피턴트 세포로 하여 형질전환을 실시하였다.
E. coli BMH71-18 mutS는 mutS 세포[리페어 마이너스(repair minus)]로 DNA 미스매치(missmatch)의 리페어 능력이 저하되어 있어서, 특정부위 돌연변이화를 실시할 때에, 상기 BMH71-18 mutS를 숙주 세포로 사용하면, 변이도입 부분의 리페어를 억제하기 때문에, 도입하고자 하는 변이를 고정하기 쉬워 변이도입 효율이 상승된다.
상기 변이도입된 플라스미드 혼합물(SDM mixture) 5㎕과 E. coli BMH71-18 mutS 컴피턴트 세포 100㎕를 1.5ml 튜브에 첨가한 후, 얼음에서 10분간 인큐베이션시킨 후 42℃에서 45초 동안 반응시킨 후(heat-shock), 얼음에서 2분간 식히고(quenching) SB 1ml에 첨가한 후 37℃에서 250rpm으로 1시간 동안 인큐베이션시킨 후 SB 4ml, GeneEditor Antibiotic Selection mix. 100㎕를 첨가하여 37℃, 250rpm으로 16~18시간 동안 배양하였다.
도 3에 보이는 바와 같이, 선택 올리고뉴클레오티드가 도입되지 않은 E. coli BMH71-18 mutS 컴피턴트 세포는 GeneEditor Antibiotic Selection mix.에 의해 고사되고, 선택 올리고뉴클레오티드가 도입된 E. coli BMH71-18 mutS 컴피턴트 세포만이 콜로니를 형성하는 한편, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드가 리페어되지 않고 변이가 고정되었다.
5) JM109 컴피턴트 세포로 형질전환
상기 변이도입(mutegenesis)된 재조합 플라스미드를 선발하기 위하여 E. coli JM109를 컴피턴트 세포로 하여 형질전환을 실시하였다.
E. coli JM109는 pUC계 플라스미드 벡터의 형질전환이나 M13 파지 벡터 DNA의 형질도입 등을 실시하는 경우, 벡터 DNA로부터 발현하는 lacZα 펩티드(α절편) [lacZα peptide(α fragment)]와 JM109 F′가 코드하는 lacZ△M15(오메가 절편, omega fragment)에 의한 β-갈락토시다제(β-galactosidase)의 활성회복(α-상보성)을 이용함으로써 재조합체의 선발이 간편한 균주이다. F′플라스미드를 갖고 있기 때문에 유전자 라이브러리의 제작이나 서브클로닝(subcloning) 이외에 M13 벡터 DNA의 숙주로써 ssDNA의 제조에도 사용할 수 있다.
상기 E. coli BMH 71-18 mutS 컴피턴트 세포로 형질전환하여 배양한 세포에서 플라스미드 미니 프렙(plasmid mini prep)을 한 후 5~10ng 정도의 DNA, JM109 컴피턴트 세포 100㎕를 첨가하여 얼음에서 30분간 인큐베이션시킨 후 42℃에서 45초 동안 반응시킨 후 얼음에서 2분간 식힌 후(quenching), SB 1ml에 첨가한 후 37℃에서 250rpm으로 1시간 동안 인큐베이션시킨 후 SB/카베니실린 (SB/carbenicillin), GeneEditor Antibiotic Selection mix. 플레이트에 100㎕씩 도말하였다.
도 3에 보이는 바와 같이, 변이도입된 재조합 플라스미드 만이 콜로니를 형성하게 된다.
도 4는 본 발명의 ScFv의 링커유전자에 BspEI 제한 효소 자리가 형성된 pKS4H의 유전자 지도이다.
실시예 2 : 콜로니 선택 및 제한효소 매핑(Colony selection and enzyme mapping)
도 5는 ScFv의 링커유전자에 BspEI 제한효소자리를 특정부위 돌연변이화를 통해 생성시킨 것을 BspEI 제한효소로 절단하여 선별한 것으로서 밴드 1, 4, 6, 7, 10, 12, 14, 15가 올바르게 생성된 것이다.
플레이트에서 콜로니를 따서 2ml 컬쳐하여 플라스미드 미니 프렙(plasmid mini prep)을 한 후 ScFv 도입 플라스미드 벡터 pCANTAB5E의 E-태그의 BspEI 제한효소 자리를 제거하고, 특정부위 돌연변이화(SDM)를 이용하여 링커 부위에 생성시킨 BspEI 제한효소 자리가 제대로 형성된 것을 BspEI을 처리하여 확인하였다.(도 5)
그리고, 도 6은 ScFv의 링커 유전자에 BspEI 제한효소 자리가 형성된 벡터가 정확한지 확인하기 위해 관련된 제한효소를 처리하여 절단된 밴드의 크기를 추정하여 벡터의 완전성을 확인한 것이다.
실시예 3 : His-태그(His-tag)의 도입
상기 파상풍 항체 ScFv의 링커에 BspEI 제한효소를 도입시킨 플라스미드 벡터(pKS4E)의 E-태그는 ScFv의 링커에 형성된 BspEI 제한효소와 동일한 제한효소를 가지므로 상기 pKS4E의 NotI, EcoRI 위치의 E-태그를 잘라낸 다음, pKS3C(도 10)의 His-태그 절편을 NotI, EcoRI 제한효소로 잘라 삽입물(insert)로 준비하여 pKS4E에 삽입함으로써 BspEI 제한효소 자리를 제거하였다(pKS4H).
도 7은 확인된 벡터시스템(pKS4E)의 E-태그를 His-태그로 치환시켜주기 위해 pKS3C 벡터(도 10: 본 발명자 자체 제작)에서 이에 해당하는 부분을 절단하여 본 발명의 벡터(pKS4H)를 완성하기 위한 벡터유전자, 삽입유전자를 준비한 것으로 pKS4E 및 pKS3C를 NotI 및 EcoRI 제한효소로 자른 후 전기영동한 결과이다.
그리고, 도 8은 ScFv의 링커유전자에 BspEI 제한효소자리를 생성시키고 E-태그를 His-태그로 치환시킨 최종 pKS4H를 관련된 제한효소를 사용하여 절단된 밴드를 통해 확인한 것이다.
실시예 4 : IPTG induction 및 ELISA screening
pKS4H DNA를 XLI-Blue 컴피턴트 세포에 전기천공(electroporation)한 후 SB/카베니실린 플레이트(SB/carbenicillin plate)에 스프레딩(spreading)하여 37℃ 밤새 배양(overnight incubation)시킨 후 콜로니를 따서 2ml 컬쳐하여 OD600에서 0.8~1.0 정도까지 37℃ 250rpm에서 쉐이킹 배양(shaking incubation)한 후 IPTG를 1mM로 처리하고, 30℃ 250rpm으로 밤새 인덕션(overnight induction)시켰다. 이 반응물을 3000rpm, 5분간 원심 분리한 후 각각의 상층액 만을 파상풍(Tetanus) 항원이 깔려있는 ELISA 플레이트에 첨가한 후 2시간 동안 상온에서 반응한 후 PBST (1×PBS, 0.05% 트윈 20)로 5회 세척(washing) 후 HRP/항-his 태그 컨쥬케이트(HRP/anti-his tag conjugate)를 1% BSA/PBS로 1/500로 희석한 것을 첨가한 후 1시간 30분 동안 상온에서 반응한 후 다시 PBST로 5회 세척한 후 TMB 퍼옥시다제 기질 용액 A&B(TMB peroxidase substrate solution A&B)를 1:1로 섞은 반응물을 첨가한 후 5~10분간 인큐베이션시킨 후에 TECAN 선라이즈(sunrise)를 이용하여 405nm 측정 파장에서 그 값을 읽었다.
도 9는 구축된 pKS4H 벡터 시스템이 제대로 작동하는 것을 확인하기 위해 파상풍 항체 유전자를 도입하여 항체가 올바르게 발현되는지를 효소면역 측정법으로 측정하여 그 발현정도를 기존의 pCANTAB5E 벡터와 비교 확인한 것이다.
샘플은 ScFv 파상풍 항체 유전자를 포함하고 있는 pKS4H와 pCANTAB5E에서 항체를 발현하여 각각 His-태그 및 E-태그에 대한 항체로 측정하였고 PBS와 하이브리도마 배양액을 대조군으로 사용하였다.
상기 도 9에 보이는 바와 같이, 오리지날 벡터 pCANTAB5E에서 발현된 항체를 검출한 것과 동일한 정도의 OD 값을 획득하였음을 알 수 있다.
본 발명의 항체 ScFv 발현 벡터는 ScFv의 링커 유전자에 제한효소로 절단되는 자리를 가지고 있어서, 다양한 VH 및 VL을 개별적으로 벡터 시스템에 도입함으로써 종래 항체 ScFv 자체를 발현벡터에 삽입하는 방법에 비하여 정량적인 항체 ScFv 를 제공하며, 보다 효율적으로 항체 라이브러리를 제조하는 우수한 효과를 제공한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 링커(linker) 펩티드를 코딩하는 유전자로 연결된 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 ScFv 발현 벡터에 있어서,
    상기 링커 펩티드를 코딩하는 유전자는 제한효소로 절단되는 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv(single chain variable fragment) 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 링커 펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열(BspEI 제한효소 자리)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체 ScFv 발현 벡터는 pKS4E인 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 ScFv 발현 벡터의 태그(tag) 유전자는 서열번호 1의 염기서열(BspEI 제한효소 자리)이 없는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체 ScFv 발현 벡터의 태그(tag) 유전자는 His-태그 유전자인 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체 ScFv 발현 벡터는 pKS4H인 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터.
  8. 링커 펩티드를 코딩하는 유전자로 연결된 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 ScFv 발현 벡터의 링커 펩티드 코딩 유전자에 침묵 돌연변이(silent mutation)를 시켜 제한효소 자리를 형성하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 침묵 돌연변이는 특정부위 돌연변이화(site-directed mutagenesis)를 사용하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터 제조방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제한효소 자리는 서열번호 1의 염기서열(BspEI 제한효소 자리)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 ScFv 발현 벡터 제조방법.
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