KR20160083129A - 면역결합제의 용해도 최적화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역결합제, 특히 단일 사슬 항체(scFv)의 용해도를 개선하기 위하여 서열에 기초한 분석 및 합리적인 전략을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 면역결합제, 특히 scFv를 선택된 안정한 scFv 서열의 데이터베이스 분석으로 확인된 소수성 잔기로 하나 이상의 치환을 수행하여 변형하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 변형방법에 따라 제조되는 최적화된 용해도를 가지는 면역결합제를 제공한다.

Description

면역결합제의 용해도 최적화{SOLUBILITY OPTIMIZATION OF IMMUNOBINDERS}
관련 출원
본 출원은 2008년 6월 25일자 미국 특허출원 제61/075,692호, "면역결합제의 용해도 최적화"에 대하여 우선권을 주장한다.
발명의 배경
항체는 암, 자가면역 질환 및 기타 질병의 처치에서 매우 효과적이고 성공적인 치료제임이 입증되었다. 일반적으로 전체 길이의 항체가 임상적으로 사용되고 있지만, 항체 절편을 사용하는 것은 많은 이점을 제공할 수 있으며, 예를 들면 증가된 조직 투과성, 다른 이펙터 작용을 첨가하는 능력과 결합된 Fc-이펙터 작용의 부재 및 전신적으로 더 짧아진 생체 내 반감기로 인한 전신 부작용의 감소 가능성 등이다. 항체 절편의 약동학적 특성은 이들이 특히 국소적 치료 방법에 특히 적합한 것을 나타내고 있다. 또한, 항체 절편은 임의의 발현 시스템에서 전체 길이의 항체 보다 생산이 더 용이할 수 있다.
항체 절편의 한 종류로서 단일 사슬 항체(scFv)가 있으며, 링커 서열에 의해 경쇄 가변도메인(VL)에 컨쥬게이트된 중쇄 가변 도메인(VH)으로 이루어진다. 따라서 scFv는 모든 항체 정상 영역 도메인이 없고 scFv의 가변/정상 도메인 경계의 아미노산 잔기들(경계면 잔기)이 용매에 노출된다. scFv는 종래의 재조합 공학기술에 의해 전체 길이 항체(예를 들면, IgG 분자)로부터 제조할 수 있다. 그러나 전체 길이 항체를 scFv로 전환하는 것은 종종 단백질의 안정성과 용해도를 저하시키고 생산수율을 감소하며 응집 성향이 증가하여 면역원성의 위험도가 상승하게 된다.
따라서, scFv의 용해도 등의 특성을 개선하려는 시도들이 이루어져 왔다. 예를 들면, Nieba, L. 등 (Prot. Eng. (1997) 10:435-444)은 계면 잔기이며 이들의 돌연변이인 것으로 알려진 3개의 아미노산 잔기를 선택하였다. 열역학적 안정성과 용해도가 상당히 변화되지는 않았지만, 이들은 열적으로 유발된 응집의 감소율뿐만 아니라 박테리아 내에서 돌연변이된 scFv의 증가된 주변세포질 발현을 관찰하였다. 또한, 이들은 PEG 침전 방법에 의해 측정된 바와 같이 가공된 scFv의 천연 단백질 상태의 용해도 개선은 관찰하지 못했다고 그들의 문헌에서 서술하였다. 부위특이적 돌연변이가 scFv 내의 특정한 아미노산 잔기에서 수행되는 다른 연구들도 보고되었다(예를 들면, Tan, P.H. et al. (1988) Biophys . J. 75:1473-1482; Worn, A. and Pluckthun, A. (1998) Biochem. 37:13120-13127; Worn, A. and Pluckthun, A. (1999) Biochem . 38:8739-8750). 상기한 다양한 연구에서, 돌연변이를 위해 선택된 아미노산 잔기는 scFv 구조 내에서 이들의 알려진 위치에 기초하여 선택되었다(예를 들면, 분자 모델링 연구에서).
다른 접근방법에서는, 매우 불량하게 발현된 scFv의 상보성결정영역(CDR)을 유리한 특성을 가지는 것이 입증된 scFv의 프레임워크 영역에 이식하였다(Jung, S. and Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10:959-966). 얻어진 scFv는 개선된 가용성 발현과 열역학적 안정성을 나타냈다.
용해도와 다른 작용 특성을 개선하기 위한 scFv 가공방법의 진전을, 예를 들면 Worn, A. and Pluckthun, A. (2001) J. Mol . Biol . 305:989-1010에서 조사하였다. 그러나, 면역결합제, 특히 월등한 용해도를 가지는 scFv의 합리적인 설계를 위한 새로운 방법이 여전히 요구되고 있다. 또한, scFv와 다른 종류의 항체를 조작하여 개선된 용해도-특히 천연 단백질의 용해도-를 제공하는 방법도 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 개선된 용해도를 제공하는 scFv 항체와 같은 면역결합제를 조작하는 방법뿐만 아니라 가변 중쇄 영역 VH에 용해도 강화 모티프를 포함하는 면역결합제를 제공한다. 특별한 구현예에서, 본 발명의 방법은 용해도에 잠재적으로 문제가 있는 면역결합제의 가변 중쇄영역 및/또는 가변 경쇄영역의 서열 내의 아미노산을 개선된 용해도를 제공하는 바람직한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 예를 들면, 임의의 바람직한 구현예에서, 소수성 잔기는 친수성 잔기로 치환된다.
바람직하게는 본 발명의 제조방법에서 제공되거나, 사용되거나, 또는 그에 의해 생산된 면역결합제는 scFv이지만, 전장(full-length) 면역글로불린, Fab 절편, 단일 도메인 항체(예를 들면, Dab) 및 나노바디(Nanobody) 등의 다른 면역결합제들도 상기 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명은 또한 면역결합제와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물 및 상기 방법에 따라 제조된 면역결합제를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 중쇄 아미노산 위치 12, 103 및 144(AHo 넘버링)내에 다음의 용해도 인핸싱 모티프들 중 하나를 포함하는 면역결합제를 제공한다:
(a) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린(S);
(b) 중쇄 아미노산 위치 103의 세린(S); 및
(c) 중쇄 아미노산 위치 144의 트레오닌(T); 또는
(a1) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린(S);
(b1) 중쇄 아미노산 위치 103의 트레오닌(T); 및
(c1) 중쇄 아미노산 위치 144의 세린(S); 또는
(a2) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린(S);
(b2) 중쇄 아미노산 위치 103의 트레오닌(T); 및
(c2) 중쇄 아미노산 위치 144의 트레오닌(T); 또는
(a3) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린(S);
(b3) 중쇄 아미노산 위치 103의 세린(S); 및
(c3) 중쇄 아미노산 위치 144의 세린(S).
다른 양태에서, 본 발명은 면역결합제를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 면역결합제는 (i) 중쇄 가변영역 또는 이들의 절편, 상기 중쇄 가변영역은 VH 프레임워크 잔기를 포함하며 및/또는 (ii) 경쇄 가변영역 또는 이들의 절편, 상기 경쇄 가변영역은 VL 프레임워크 잔기를 포함하고, 상기 방법은
A) 돌연변이를 위해 VH 프레임워크 잔기, VL 프레임워크 잔기 또는 VH 및 VL 프레임워크 잔기 내에서 2개 이상의 아미노산 위치를 선택하고; 및
B) 돌연변이를 위해 선택된 2개 이상의 아미노산 위치를 돌연변이하는 것을 포함하고, 여기에서 돌연변이를 위해 선택된 2개 이상의 아미노산 위치가 VH 프레임워크 잔기 내에 있으면, 12, 103 및 144(AHo 넘버링 협약)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 아미노산 위치에서 치환되며, 및/또는
돌연변이를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 VL 프레임워크 잔기 내에 있으면, 15, 52 및 147(AHo 넘버링 협약에 따른 위치; Kabat 넘버링에 따르면 아미노산 위치 15, 44 및 106)로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 아미노산 위치에서 치환된다.
돌연변이를 위해 선택된 둘 이상의 아미노산 위치, 및 선택된 위치에 삽입된 아미노산 잔기는 하기에서 보다 상세히 기재한다. 이하에 열거한 아미노산 위치 넘버링은 AHo 넘버링 시스템을 사용한다: Kabat 넘버링 시스템을 사용한 상응하는 위치는 여기에 추가로 기술하였으며 AHo 및 Kabat 넘버링 시스템에 대한 변환표는 상세한 설명에 열거하였다. 아미노산 잔기는 표준 1 글자 약자 코드를 사용하여 기재하였다.
놀라웁게도, 표시된 위치에서의 표시된 돌연변이 존재가 단백질의 다른 작용 특성에 부정적인 영향을 미치지 않고 면역결합제의 전체 용해도를 증가시키는 것을 발견하였다. 예를 들면, scFv의 VH 내에서 3개의 용해도 인핸싱 돌연변이 V12S, L144S 및 V103T의 조합의 경우에 상기 치환이 전체 scFv의 용해도 약 60%에 해당하는 것을 발견하였다. 이는 면역결합제의 발현 수율을 증가시키는 종래 기술에 기재된 시도와는 다르다. 예를 들면, 미국 특허 제6,815,540호는 사슬내 도메인 간의 계면 영역에서 소수성을 감소시켜서 면역결합제를 변성하는 것을 기술하고 있다. 이를 위하여 가변 중쇄 프레임워크에서 16개의 위치를 확인하였고, 이들은 10개 아미노산 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산으로 각각 치환될 수 있다. 생성된 돌연변이체의 발현율이 증가된 것을 확인하였다. 또한, 동일한 연구그룹이 1999년, 즉 상기한 미국 특허의 우선권주장일 3년 후에 소수성인 표면 잔기를 보다 더 친수성인 잔기로 치환하는 것이 생산 수율을 개선하기 위한 몇몇의 연구에서 보고되었음을 기술한 논문(Jung, S., Honegger, A. and Pluckthun, A. (1997) Prot . Eng . 10:959-966)을 발행하였다. 저자들에 따르면, 제조 수율의 증가는 정확한 폴딩과 잘못 폴드된 물질의 응집 간의 개선된 운동 분할 때문인 반면, 천연 단백질의 용해도나 열역학적 안정성도 심각한 정도로 영향을 받지는 않았다. 따라서, Pluckthun 등이 지칭한 용해도 매개변수는 천연 단백질의 전체 용해도가 아니라 가용성 발현에 관한 것일 뿐이라는 것은 당업자에게 자명하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 면역결합제의 용해도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 면역결합제 내에 아미노산 치환체를 삽입하여 면역결합제의 용해도를 개선하는 면역결합제를 최적화하는 방법을 기술하고 있다. 본 발명은 또한 제조된 면역결합제, 예를 들면 본 발명의 방법에 따라 제조된 scFv에 관한 것이다.
본 발명이 보다 용이하게 이해되도록 하기 위해 용어를 먼저 정의한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 여기에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법과 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법과 물질을 이하에 기술한다. 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 여기에 언급된 기타 문헌들은 참조를 위해 그 전체가 통합되었다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조절하게 된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐으로 그로 인해 제한되지는 않는다.
여기에서 사용된 "항체"라는 용어는 "면역글로불린"의 동의어이다. 본 발명에 따른 항체는, 예를 들면 단일 가변 도메인, Fv(Skerra A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 또는 당업자에게 공지된 다른 절편 등의 면역글로불린의 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 전체 면역글로불린 또는 그의 절편일 수 있다.
여기에서 사용된 "항체 프레임워크" 또는 "프레임워크"는 가변 도메인의 일부, VL이거나 또는 VH를 지칭하며, 상기 가변 도메인의 항원 결합 루프에 대해 스캐폴드(scaffold)로서 작용한다(Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242).
여기에서 사용된 "항체 CDR" 또는 "CDR"은 Kabat 등(Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242)에 의해 정의된 항원 결합 루프로 이루어진 항체의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 항체 Fv 절편의 2개의 가변 도메인 각각은, 예를 들면 3개의 CDR을 포함한다.
"단일 사슬 항체" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된, 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 항체 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 다음과 같은 일반 구조를 가질 수 있다: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH.
여기에서 사용된 "동일성"이란 2개 폴리펩티드, 분자간 또는 2개 핵산 간의 서열 매칭(matching)을 지칭한다. 2개 비교 서열 모두의 한 위치에 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 서브유니트가 있으면(예를 들면, 2개의 DNA 분자 각각에서 어떤 위치에 아데닌이 있거나, 또는 2개의 폴리펩티드 각각에서 어떤 위치에 라이신이 있다면), 각각의 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개 서열 간의 "동일성 백분율"은 2개 서열에 의해 공유된 일치하는 위치의 수/비교 위치의 수 X 100의 함수이다. 예를 들면, 2개 서열에서 10개 위치 중 6이 일치되면, 2개 서열의 동일성은 60 %이다. 일 예로, DNA 서열 CTGACT와 CAGGTT는 50 %의 동일성을 가진다(총 6개 위치 중 3개가 일치). 일반적으로 2개 서열이 나란히 정렬된 경우의 비교에서 동일성은 최대가 된다. 이러한 정렬은, 예를 들면 Needleman 등, (1970) J MoI . Biol . 48: 443-453의 방법을 사용하여 제공되며 Align program(DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램으로 편리하게 시행될 수 있다.
"유사한" 서열이란 나란히 정렬되었을 때, 동일하고 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 서열이며, 여기에서 유사한 잔기는 정렬된 참조 서열 내에 상응하는 아미노산 잔기에 대한 보존적(conservative) 치환이다. 이와 관련하여, 참조 서열 내 에서 잔기의 "보존적 치환"이란 상응하는 참조 잔기와 물리적 또는 작용적으로 유사한, 예를 들면, 유사한 크기, 형태, 전하, 공유결합 또는 수소결합 형성능과 같은 화학적 특성을 가지는 잔기에 의한 치환이다. 따라서 "보존적 치환 변성된" 서열은 하나 이상의 보존적 치환이 있는 참조 서열 또는 야생형 서열과는 다른 것이다. 2개 서열 간의 "유사성 백분율"은 2개 서열에 의해 공유된 일치하는 잔기 또는 보존적 치환을 포함하는 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누어 100을 곱한 함수이다. 예를 들면 2개의 서열에서 10개 위치 중 6개가 일치하고 10개 중 2개가 보존적 치환을 포함하면 2개 서열은 80 %의 포지티브 유사성을 가진다.
여기에서 사용된 "아미노산 컨센서스 서열"은 둘 이상, 바람직하게는 더많은 정렬된 아미노산 서열의 매트릭스를 사용하고, 정렬 내에 갭을 만들어 각 위치에서 가장 빈번한 아미노산 잔기를 결정할 수 있도록 생성될 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 컨센서스 서열은 각 위치에서 가장 자주 나타나는 아미노산을 포함하는 서열이다. 두개 이상의 아미노산이 하나의 위치에 동등하게 나타나는 경우에, 컨센서스 서열은 이들 아미노산 둘다 또는 모두를 포함한다.
단백질의 아미노산 서열은 다양한 레벨에서 분석될 수 있다. 예를 들면, 보존성 또는 변이성은 단일 잔기 레벨, 다중 잔기 레벨, 갭을 가지는 다중 잔기 레벨로 나타낼 수 있다. 잔기들은 동일한 잔기의 보존을 나타내거나 또는 분류 레벨에서 보존될 수 있다. 아미노산 분류의 예로는, 극성이지만 전하를 띠지 않는 측쇄 또는 R 그룹을 가지는 아미노산(세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민); 양전하를 띠는 R 그룹을 가지는 아미노산(라이신, 아르기닌 및 히스티딘); 음전하를 띠는 R 그룹을 가지는 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산); 소수성 R 그룹을 가지는 아미노산(알라닌, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신); 및 특정한 아미노산(시스테인, 글리신 및 프롤린) 분류가 있다. 다른 분류들은 당업자에게 공지되어 있으며 구조적 결정이나 치환성을 평가하는 다른 데이터를 이용하여 정의될 수 있다. 이런 면에서, 치환가능한 아미노산이란 그 위치에서 치환될 수 있고 작용적 보존을 유지할 수 있는 아미노산이라 지칭할 수 있다.
그러나 동일한 분류의 아미노산은 그들의 생체물리적 특성에 의한 정도에 따라 변화될 수 있음을 인지하여야 한다. 예를 들면, 임의의 소수성 R 그룹(예를 들면, 알라닌, 세린 또는 트레오닌)은 다른 소수성 R 그룹(예를 들면, 발린 또는 루이신) 보다 더 친수성(즉, 더 높은 친수성 또는 더 낮은 소수성)인 것을 인식하여야 한다. 상대적 친수성 또는 소수성을 기술이 알려진 방법을 사용하여 결정할 수 있다(예를 들면, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) and Cornette et al., J Mol. Biol, 195: 659-685 (1987) 참조).
여기에서 사용된 바와 같이, 하나의 아미노산 서열(예를 들면, 첫 번째 VH 또는 VL 서열)이 하나 이상의 추가 아미노산 서열(예를 들면, 데이터베이스 중의 하나 이상의 VH 또는 VL 서열)과 정렬되었을 때, 하나의 서열(예를 들면, 상기 첫 번째 VH 또는 VL 서열) 내의 아미노산 위치는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열 중에서 "상응하는 위치"와 비교될 수 있다. 여기에서 사용된 "상응하는 위치"란 서열들이 최적으로 정렬되었을 때, 즉 서열들이 최고의 동일성 백분율 또는 유사성 백분율을 얻도록 정렬되었을 때 비교되는 서열(들) 내의 동등한 위치를 나타낸다.
여기에서 사용된 "항체 데이터베이스"는 2개 이상의 항체 아미노산 서열의 집합체(서열의 "다중성")를 지칭하며, 전형적으로 10개, 100개 또는 1000개까지의 항체 아미노산 서열의 집합체를 지칭한다. 항체 데이터베이스는, 예를 들면 항체 VH 영역, 항체 VL 영역 또는 둘 다의 집합체의 아미노산 서열을 저장하거나, 또는 VH 및 VL 영역으로 구성되는 scFv 서열의 집합체를 저장할 수 있다. 바람직하게, 상기 데이터베이스는 검색가능한 컴퓨터 프로그램 내에서 컴퓨터와 같은, 검색가능한 고정된 미디어에 저장한다. 한 구현예에서, 항체 데이터베이스는 생식 계열 항체 서열을 포함하는 또는 이것을 함유하는 데이터베이스이다. 다른 구현예에서, 항체 데이터베이스는 성숙한(즉, 발현된) 항체 서열을 포함하는 또는 이것을 함유하는 데이터베이스(예를 들면 성숙한 항체 서열의 Kabat 데이터베이스, 예를 들면 KBD 데이터베이스)이다. 또다른 구현예에서, 항체 데이터베이스는 작용적으로 선택된 서열(예를 들면, QC 분석에서 선택된 서열)을 포함하거나 또는 이것을 함유한다.
"면역결합제(immunobinder)"는 항체의 항원 결합부위의 일부 또는 전체, 예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 분자를 지칭하며, 상기 면역결합제는 특정하게 목적 항원을 인식한다. 면역결합제의 비제한적 예로는 항체 절편뿐만 아니라 전체 길이의 면역글로불린 분자 및 scFv를 포함하며, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 포함하는 일가 절편인 Fab 절편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 절편을 포함하는 2가 절편인 F(ab')2 절편; (iii) 힌지 영역의 일부를 가지는 본질적으로 Fab인 Fab' 절편(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993) 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인을 포함하는 Fd 절편; (v) 항체 싱글 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 절편; (vi) VH 또는 VL 도메인을 포함하는 Dab 절편(Ward et al, (1989) Nature 341 :544- 546), Camelid(Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), and Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)), 또는 Shark 항체(예를 들면, shark Ig-NARs Nanobodies®) 등의 단일 도메인 항체; 및 (vii) 1개의 가변 도메인과 2개의 정상 도메인을 함유하는 중쇄 가변영역인 나노바디(nanobody) 등이 있다.
여기에서 사용된, "작용 특성"이란, 예를 들면 폴리펩티드의 제조 특성 또는 치료학적 효능을 증진하기 위해서 당업자들에게 개선(예를 들면, 종래의 폴리펩티드와 관련하여)이 바람직하거나 및/또는 유리한 폴리펩티드(예를 들면, 면역결합제)의 특성이다. 일 구현예에서, 작용 특성은 안정성(예를 들면, 열적 안정성)이다. 다른 구현예에서, 작용 특성은 용해도(예를 들면, 세포 조건 하)이다. 다른 구현예에서, 작용 특성은 응집 형태이다. 다른 구현예에서, 작용 특성은 단백질 발현(예를 들면, 원핵 세포 내)이다. 다른 구현예에서, 작용 특성은 상응하는 정제공정에서 봉입체(inclusion body) 용해 이후의 리폴딩 효능이다. 임의의 구현예에서, 항원 결합 친화도는 개선이 필요한 작용 특성이 아니다. 다른 구현예에 있어서, 작용 특성의 개선은 항원 결합 친화도의 실질적인 변화와 연관되지 않는다.
여기에서 사용된 "용해도"는 천연 단백질, 즉 응집되지 않은, 작용성 모노머 면역결합제의 용해도를 지칭한다. "증강된 용해도"란 다음 방법 중 하나 이상에 의해 바람직하게 측정되는 천연 단백질의 용해도의 개선을 의미한다: PEG 침전법, 암모늄 설페이트 침전법, 리폴딩 수율 또는 당업자에게 알려진 용해도를 측정하는 기타의 방법. 상기 PEG 침전법은 Atha 등의 "Mechanism of Precipitation of Proteins by Polyethylene Glycols", JBC, 256: 12108- 12117 (1981)에 기술된 바에 따른 방법이다. 암모늄 설페이트 침전법은, 예를 들면 다음과 같이 수행할 수 있다: 20 mg/ml 단백질 용액의 분취물 10 μl를 제조하고, 상이한 포화 농도(예를 들면, 35%, 33%, 31%, 29%, 25%, 20% 및 15%)의 (NH4)2SO4 용액 10 μl를 각각 첨가하여 5초 동안 보텍스하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션 한다. 4 ℃에서 30분 동안 6000 rpm으로 원심분리한 후, 상징액 중의 단백질 농도를 측정한다. 이 방법에서, 상이한 단백질들에 대한 컴퍼레이터(comparator)는 V50값이며, 이 값은 50%의 단백질이 침전되는 (NH4)2SO4의 포화 비율이다. V50은 (NH4)2SO4 포화의 적용된 비율에 대해 상징액 중에서 측정된 가용성 단백질의 플롯으로부터 결정된다. 리폴딩 수율은 상응하는 제조/정제 공정에서 용해된 봉입체에서 얻어진 정확하게 폴드된 단백질의 비율에 해당한다. 여기서 사용된 용해도란 용어는 가용성 발현을 지칭하지 않는다.
용해도가 개선된 면역결합제
첫 번째 양태에서는, 중쇄 아미노산 위치 12, 103 및 144(AHo 넘버링)에 하기한 용해도 증강 모티프 중 하나를 포함하는 면역결합제가 제공된다:
(a) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린 (S);
(b) 중쇄 아미노산 위치 103의 세린 (S); 및
(c) 중쇄 아미노산 위치 144의 트레오닌 (T); 또는
(a1) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린 (S);
(b1) 중쇄 아미노산 위치 103의 트레오닌 (T); 및
(c1) 중쇄 아미노산 위치 144의 세린 (S); 또는
(a2) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린 (S);
(b2) 중쇄 아미노산 위치 103의 트레오닌 (T); 및
(c2) 중쇄 아미노산 위치 144의 트레오닌 (T); 또는
(a3) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린 (S);
(b3) 중쇄 아미노산 위치 103의 세린 (S); 및
(c3) 중쇄 아미노산 위치 144의 세린 (S)
놀라웁게도, 표시된 위치에 표시된 아미노산의 존재가 전체 면역결합제의 총 용해도를 증가시키는 것을 발견하였다. 예를 들면, scFv의 VH 내에서 3개의 용해도 증강 돌연변이 V12S, Ll44S 및 Vl03T의 조합물의 경우에, 상기 치환이 전체 scFv의 용해도 약 60%를 차지하는 것을 발견하였다. 소수성 패치는 모든 면역결합제들의 가변 도메인에서 보존되므로 표시된 위치에서의 하나 이상의 치환을 사용하여 면역결합제의 용해도를 개선할 수 있다.
면역결합제는 바람직하게는 scFv 항체, 전체 길이 면역글로불린, Fab 절편, Dab 또는 Nanobody이다.
바람직한 구현예에서, 상기 면역결합제는 (a) 경쇄 아미노산 위치 31의 아스파르트산(D), (b) 경쇄 아미노산 위치 83의 글루탐산(E), (c) 중쇄 아미노산 위치 43의 아르기닌(R), (d) 중쇄 아미노산 위치 67의 루이신(L) 및 (e) 중쇄 아미노산 위치 78의 알라닌(A)으로 이루어진 군 중의 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함한다. 상응하는 위치에서 표시된 아미노산 하나 이상의 존재는 면역결합제의 안정성을 증가시킨다.
여기에 표시된 아미노산은 자연적으로 발생하는 면역결합제 또는 그의 유도체 내에 존재하거나, 또는 상기 면역결합제가 상기한 아미노산 하나 이상을 결합하도록 제조될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 여기에 기술된 면역결합제는 특히 사람 TNFα 또는 사람 VEGF에 결합한다.
용해도가 개선된 면역결합제의 제조
실시예에서 상세하게 기술된 바와 같이, 여기에 기술된 서열에 기초한 접근 방법을 성공적으로 사용하여 용해도를 개선하는 특정한 아미노산 잔기 치환을 확인하였다. 실시예들은 VH 영역과 임의로 면역결합제(예를 들면, scFv)의 VL 영역 내에서 정의된 아미노산 위치의 예제 및 바람직한 아미노산 치환을 열거한 것이다. 모범적인 치환은 보다 친수성이고 데이터베이스(예를 들면, 성숙한 항체(KDB) 데이터베이스)에서 훨씬 자주 발생하는 아미노산 위치에서 문제 아미노산 잔기(예를 들면, 용매-노출된, 소수성 잔기)의 치환을 포함한다. 특히 바람직하게는 문제 잔기 보다 더 친수성인 가정 빈번하게 발생하는 잔기의 치환이다. 다른 구현예에서, 보다 친수성인 아미노산은 알라닌(A), 세린(S), 및 트레오닌(T)으로 이루어진 군에서 선택된다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 특정된 아미노산 치환을 scFv 항체와 같은 면역결합제에 삽입하는 조작(engineering) 방법을 제공한다. 이러한 치환은 부위 특이적 돌연변이, PCR 매개 돌연변이 등의 표준 분자 생물학적 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
실시예에서 열거된 바와 같이, 다음 아미노산 위치가 표시된 VH 또는 VL 서열에서의 변성에 대해 문제성 아미노산(즉, 소위 "소수성 패치"로 일컬어지는)으로서 확인되었다:
V H : 아미노산 위치 2, 4, 5, 12, 103과 144; 및
V L : 아미노산 위치 15, 52 및 147.
넘버링은 AHo 넘버링 시스템이 사용되었으며; AHo 넘버링 시스템을 Kabat 시스템 넘버링으로 전환하기 위한 전환표는 표 1과 2에 열거하였다.
놀라웁게도, 2개 이상의 VH 위치 12, 103, 144(AHo 넘버링 시스템에 따른)에서의 치환이 전체 면역결합제의 총 용해도에 영향을 미치는 것을 발견하였다. 소수성 패치는 모든 면역결합제의 가변성 도메인에서 보존되므로, 표시된 위치에서의 2개 이상의 치환은 면역결합제의 용해도를 개선하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에에서, 본 발명은 scFv 항체와 같은 면역결합제의 조작방법을 제공하는 것으로, 여기에서 2개 이상의 아미노산 치환은 위에서 확인된 하나 이상의 아미노산 위치에서 수행되어 변형된(즉, 변이된) 형태의 면역결합제를 생산한다.
그러므로, 다른 양태에서 본 발명은 면역결합제의 조작방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
A) 2개 이상의 아미노산 위치를 VH 영역, VL 영역 또는 VH 및 VL 영역 내에서 돌연변이를 위해 선택하고; 및
B) 돌연변이를 위해 선택된 2개 이상의 아미노산 위치를 돌연변이시키는 것을 포함하고, 여기에서 돌연변이를 위해 선택된 2개 이상의 아미노산 위치가 VH 영역 내에 있으면, 상기 치환은 12, 103 및 144 (AHo 넘버링 협약에 따른 위치; Kabat 넘버링을 사용할 경우 아미노산 위치 11, 89 및 108)로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 중쇄 아미노산 위치이고, 및/또는
여기에서 돌연변이를 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 위치가 VL 영역 내에 있으면, 상기 치환은 15, 52 및 147 (AHo 넘버링 협약에 따른 위치; Kabat 넘버링을 사용할 경우 아미노산 위치 15, 44 및 106)로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 아미노산 위치이다.
임의의 구현예에서, 상기 아미노산 위치는 소수성 아미노산(예를 들면, 루이신(L) 또는 발린(V))으로 채워진다. 일 구현예에서, 중쇄 아미노산 위치 12의 아미노산은 발린(V)이다. 다른 구현예에서, 중쇄 아미노산 위치 103의 아미노산은 발린(V)이다. 다른 구현예에서, 중쇄 아미노산 위치 144의 아미노산은 루이신(L)이다. 다른 구현예에서, 경쇄 아미노산 위치 15의 아미노산은 발린(V)이다. 다른 구현예에서, 경쇄 아미노산 위치 52의 아미노산은 페닐알라닌(F)이다. 다른 구현예에서, 경쇄 아미노산 위치 147의 아미노산은 발린(V)이다.
바람직하게, 돌연변이는 선택된 아미노산 위치의 상기 아미노산을 보다 친수성인 아미노산으로 치환하는 것이다. 다른 구현예에서, 보다 친수성인 아미노산은 세린(S) 또는 트레오닌(T)에서 선택된다.
임의의 구현예에서, 상기 방법은: a) 면역결합제 내에서 2개 이상의 아미노산 위치를 돌연변이를 위해 선택하고; 및 b) 돌연변이를 위해 선택된 2개 이상의 아미노산 위치를 돌연변이하는 것을 포함하고, 여기에서 돌연변이는
(i) AHo 넘버링을 사용한 중쇄 아미노산 위치 12(Kabat 넘버링을 사용한 11 위치)의 세린(S);
(ii) AHo 넘버링을 사용한 중쇄 아미노산 위치 103(Kabat 넘버링을 사용한 89 위치)의 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및
(iii) AHo 넘버링을 사용한 중쇄 아미노산 위치 144(Kabat 넘버링을 사용한 108 위치)의 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 치환을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 중쇄 아미노산 위치 12, 103 및 144 중 하나 이상이 트레오닌(T)이다.
다른 구현예에서, 돌연변이는 AHo 또는 Kabat 넘버링을 사용한 경쇄 아미노산 위치 15에서의 트레오닌(T) 치환을 포함하거나 및/또는 AHo 넘버링을 사용한 경쇄 아미노산 위치 147(Kabat 넘버링을 사용한 위치 106)에서의 알라닌(A)으로의 치환을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 돌연변이는 용해도를 2배 이상 증가시킨다(예를 들면, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배 또는 그 이상의 용해도 증가).
또다른 구현예에서, 면역결합제의 열적 안정성, 리폴딩, 발현율, 응집 및/또는 결합 활성은 돌연변이에 의해 불리하게 영향받지 않는다.
임의의 구현예에서, 상기 돌연변이는 또한 다음을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치(AHo 넘버링 협약)에서의 하나 이상의 안정화 돌연변이를 포함한다: (a) 경쇄 아미노산 위치 31의 아스파르트산(D); (b) 경쇄 아미노산 위치 83의 글루탐산(E); (c) 중쇄 아미노산 위치 43의 아르기닌(R); (d) 중쇄 아미노산 위치 67의 루이신(L); 및 (e) 중쇄 아미노산 위치 78의 알라닌(A). 이러한 돌연변이는 면역결합제의 안정성에 효과가 있는 것으로 입증되었다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조되는 면역결합제를 제공한다.
임의의 예시적 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 변형되는 면역결합제는 치료학적으로 중요한 표적 항원과 결합하는 공지의 면역결합제이거나 또는 상기 치료학적으로 중요한 상기 면역결합제로부터 유도된 가변영역(VL 및/또는 VH 영역) 또는 하나 이상의 CDR(예를 들면, CDRLl, CDRL2, CDRL3, CDRHl, CDRH2, 및/또는 CDRH3)을 포함하는 면역결합제이다. 예를 들면, 현재 FDA 또는 다른 감독기관에 의해 승인된 면역결합제는 본 발명의 방법에 따라 변형될 수 있다. 보다 구체적으로는 상기한 면역결합제 예시로는, 제한적인 것은 아니나 muromonab(Orthoclone® OKT3; Johnson&Johnson, Brunswick, NJ; Arakawa et al. J. Biochem, (1996) 120:657-662 참조; Kung and Goldstein et al., Science (1979), 206: 347-349)과 같은 안티-CD3 항체, efalizumab(Raptiva®, Genentech, South San Francisco, CA)과 같은 안티-CD11 항체, rituximab(Rituxan®/Mabthera®, Genentech, South San Francisco, CA), tositumomab (Bexxar®, GlaxoSmithKline, London) 또는 ibritumomab (Zevalin®, Biogen Idee, Cambridge MA)(미국 특허 제5,736,137호; 제6,455,043호; 및 제6,682,734호 참조)과 같은 안티-CD20 항체, daclizumab (Zenapax®, Roche, Basel, Switzerland) 또는 basiliximab(Simulect®, Novartis, Basel, Switzerland)과 같은 안티-CD25(IL2Rα) 항체, gemtuzumab(Mylotarg®, Wyeth, Madison, NJ-미국 특허 제5,714,350호와 제6,350,861호 참조)과 같은 안티-CD33 항체, alemtuzumab (Campath®, Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, MA)과 같은 안티-CD52 항체, abciximab (ReoPro®, Centocor, Horsham, PA)과 같은 안티-GpIIb/gIIa 항체, infliximab(Remicade®, Centocor, Horsham, PA) 또는 adalimumab(Humira®, Abbott, Abbott Park, IL-미국 특허 제6,258,562조 참조)과 같은 안티-TNFα 항체, omalizumab(Xolair®, Genentech, South San Francisco, CA)와 같은 안티-IgE 항체, palivizumab (Synagis®, Medimmune, Gaithersburg, MD -미국 특허 제5,824,307호 참조)과 같은 안티-RSV 항체, edrecolomab (Panorex®, Centocor)과 같은 안티-EpCAM 항체, cetuximab(Erbitux®, Imclone Systems, New York, NY) 또는 panitumumab (Vectibix®, Amgen, Thousand Oaks, CA)과 같은 안티-EGFR 항체, trastuzumab (Herceptin®, Genentech)과 같은 안티-HER2/neu 항체, natalizumab (Tysabri®, Biogenldec)과 같은 안티-α4 integrin 항체, eculizumab (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals, Chesire, CT)과 같은 안티-C5 항체 및 bevacizumab(Avastin®, Genentech-미국 특허 제6,884,879호 참조) 또는 ranibizumab (Lucentis®, Genentech)과 같은 안티-VEGF 항체 등이 있다.
임의의 예시적 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 변형된 면역결합제는 위에서 기술한 공지의 면역결합제이다. 바람직한 구현예에서, 상기 면역결합제는 scFv 항체이다. 다른 구현예에서, 상기 면역결합제는, 예를 들면 전체 길이의 면역글로불린, Dab, Nanobody 또는 Fab 절편이다.
상기한 사실에도 불구하고, 다양한 구현예에서, 임의의 면역결합제는 본 발명의 조작방법에서 사용되는 것으로부터 제외되고, 및/또는 상기 조작방법들에 의해 생산된 면역결합제 조성물이 되는 것으로부터 제외된다. 예를 들면, 다양한 구현예에서, 상기 면역결합제가 PCT 공개 제WO2006/131013호 및 제WO2008/006235호에 기술된 ESBA105 또는 그의 변이체와 같은 PCT 공개 제WO2006/131013호 및 제WO 2008/006235호에 기술된 scFv 항체 또는 이들의 변이체 중 어떤 것도 아닌 것임을 전제로 하며, 상기 문헌 각각의 내용은 참조용으로 여기에 통합되어 있다.
바람직하게, 여기에 기술된 방법에 사용되거나 또는 여기에 기술된 방법에 의해 생산된, 여기에서 기술된 면역결합제는 각각 scFv 항체이나, 전체 길이의 면역글로불린, Fab 절편 또는 여기에서 기술된 다른 종류의 면역결합제(예를 들면, Dab 또는 Nanobody) 등의 다른 면역결합제들도 포함된다.
바람직한 구현예에서, 여기에 기술된 방법을 위해 사용되거나 또는 여기에 기술된 방법에 의해 생산된, 여기에서 기술된 면역결합제는 각각 사람의 TNFα 또는 사람 VEGF에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 면역결합제와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
ScFv 조성물과 제제
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 방법에 따라 제조되는 scFv 조성물에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 관심있는 원래의 scFv와 비교하여 하나 이상의 용해도가 증가된 돌연변이가 아미노산 서열에 삽입된 변형된 scFv 조성물을 제공하는 것으로, 여기에서, 돌연변이는 소수성 아미노산 잔기 위치에 삽입된다. 일 구현예에서, scFv는 하나의 돌연변이된 아미노산 위치(예를 들면, 하나의 프레임워크 위치)를 포함하도록 변형된다. 다른 구현예에서, 상기 scFv는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10개 이상의 돌연변이된 아미노산 위치(예를 들면, 프레임워크 위치)를 포함하도록 변형된다.
임의의 구현예에서, 돌연변이는 또한, 2008년 6월 25일자로 출원된 "항체의 변성방법, 및 개선된 작용 특성을 가지는 변성된 항체"를 발명의 명칭으로 하는 PCT 출원 제PCT/CH2008/000285호 또는 2008년 3월 12일자로 출원된 "항체의 변성방법, 및 개선된 작용 특성을 가지는 변성된 항체"를 발명의 명칭으로 하는 미국 가특허출원 제61/069,056호에 기술된 하나 이상의 안정화 돌연변이를 포함하며, 상기한 특허출원은 참조를 위해 여기에 통합되어 있다. 예를 들면, 상기 면역결합제는 하기 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치(AHo 넘버링 협약)에서의 치환을 추가로 포함한다: (a) 경쇄 아미노산 위치 31의 아스파르트산(D); (b) 경쇄 아미노산 위치 83의 글루탐산(E); (c) 중쇄 아미노산 위치 43의 아르기닌(R); (d) 중쇄 아미노산 위치 67의 루이신(L); 및 (e) 중쇄 아미노산 위치 78의 알라닌(A). 표시된 위치에서의 하나 이상의 돌연변이는 전체 면역결합제의 총 안정성에 영향을 미친다. 다른 구현예에서, 상기 돌연변이는 하기의 안정화 돌연변이(AHo 넘버링 협약)를 추가로 포함한다: (a) 경쇄 아미노산 위치 31의 아스파르트산(D); (b) 경쇄 아미노산 위치 83의 글루탐산(E); (c) 중쇄 아미노산 위치 43의 아르기닌(R); (d) 중쇄 아미노산 위치 67의 루이신(L); 및 (e) 중쇄 아미노산 위치 78의 알라닌(A).
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 scFv 조성물의 약학적 제제에 관한 것이다. 상기한 제제는 전형적으로 scFv 조성물과 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함한다. 여기에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 첨가제"는 생리적으로 적합한, 모든 종류의 용매, 확산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 첨가제는, 예를 들면 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 비경구적 투여, 척수 투여, 표피 투여(예를 들면, 주사 또는 주입에 의해), 또는 국소(예를 들면, 눈 또는 피부) 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, scFv를 물질 내에 피복하여 산의 작용과 상기 화합물을 불활성화할 수 있는 다른 자연 조건으로부터 상기 화합물을 보호할 수 있다.
본 발명의 약학적 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"이란 모(母) 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 바람직하지 않은 어떠한 독성 효과도 부과하지 않는 염을 지칭한다(예를 들면, Berge, S. M., et al. (1977) J Pharm . Sci. 66:1-19 참조). 이러한 염의 예로는 산 부가염과 염기 부가염이 있다. 산 부가염은, 예를 들면 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐 치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 아로마틱산, 지방족 및 방향족 설폰산 등의 비독성 유기산뿐만 아니라 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬산, 요오드산, 아인산 등의 비독성 무기산으로부터 유도될 수 있다. 염기 부가염은, 예를 들면 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등의 비독성 유기 아민뿐만 아니라, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리 토금속으로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 산화방지제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산화방지제의 예는 다음과 같다: (1) 수용성 산화방지제, 예를 들면 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 유용성 산화방지제, 예를 들면 아스코르빌 팔미테이트, 부틸레이트된 히드록시아니솔(BHA), 부틸레이트된 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예를 들면 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 첨가제의 예로는, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 적합한 이들의 혼합물, 올리브 오일 등의 식물성 오일, 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르 등이 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면 레시틴과 같은 코팅 물질 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다.
상기한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 에멀젼화제 및 분산제 등의 보조제를 포함할 수 있다. 미생물은 멸균 공정에 의해서, 앞서 언급한 바와 같이 및, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 다양한 항세균제와 항진균제를 포함하여 방지할 수 있다. 또한, 바람직하게는 당, 염화나트륨 등의 등장화제를 조성물에 포함시킬 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 물질을 첨가하여 주사가능한 약학적 제형의 흡수를 연장할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 첨가제에는 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 임기 조제물을 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질과 제제의 사용은 당 분야에서는 공지되어 있다. 종래의 매질 또는 물질이 활성 화합물과 혼화될 수 없는 것이 아닌 한, 본 발명의 약학 조성물에서 이들의 사용은 고려될 수 있다. 보충적인 활성 화합물도 상기 조성물에 포함시킬 수 있다.
약학 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 안정해야만 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 고농도의 약물에 적합한 다른 주문된 구조로서 제형화될 수 있다. 상기 첨가제는 용매 또는 분산 매질일 수 있으며, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적합한 이들의 혼합물 등이 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 대부분의 경우에, 등장화제를 상기 조성물 중에 포함하는 것이 바람직하며, 등장화제의 예로는 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨 또는 염화나트륨 등이 있다. 모노스테아레이트염 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 물질을 조성물 중에 포함시켜서 주사가능한 조성물의 흡수를 연장할 수 있다.
멸균 주사용액은 적절한 용매 중에 있는 필요량의 활성 화합물을 상기한 성분들 중 하나 또는 그 조합물과 혼합하고, 필요하다면 이어서 멸균 미세여과하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본적인 분산 매질과 상기한 성분들 중으로부터의 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 비히클에 혼합하여 제조된다. 멸균성 주사 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 진공 건조법과 동결건조법(lyophilization)이 있으며, 미리 멸균 여과된 이들의 용액으로부터 활성 성분과 추가의 목적 성분의 분말을 얻는다.
단일 투약형태를 제조하기 위하여 첨가제 물질과 결합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료 대상과 특정한 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 첨가제 물질과 결합하여 단일 투약형태를 제조할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 얻는 조성물의 양이 된다. 일반적으로, 100 % 중에서, 상기 양은 약학적으로 허용가능한 첨가제와의 조합물 중에 약 0.01 % 내지 약 99 %의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1 % 내지 약 70 %, 가장 바람직하게는 약 1 % 내지 약 30 % 범위의 활성 성분이다.
투약 요법은 최적의 목적하는 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들면, 단일 볼루스(bolus)로 투여되거나, 수회로 분할된 투약량을 시간에 따라 투여하거나 또는 투약량을 치료 상황의 위급에 의해 표시되는 바에 따라 비율적으로 증감할 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성과 투약의 균일성을 위해 투약량 단위형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 여기에서 사용된 투약량 단위 형태는 치료 대상에게 단위 투약량으로 조정된 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약학적 첨가제와 관련하여 목적하는 치료 효과를 나타내기 위해 계산된 활성 화합물의 미리 정해진 양을 포함한다. 본 발명의 투약량 단위 형태에 대한 상세는 (a) 활성 화합물의 독특한 특성과 얻고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개인의 감수성 치료를 위한 상기한 활성 화합물을 혼합하는 기술에 내재하는 한계에 의해 결정되고 직접적으로 영향받는다.
항체 위치 넘버링 시스템
항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역에서 아미노산 잔기 위치를 확인하는데 사용하는 2개의 상이한 넘버링 시스템에 대한 변환표를 제공하였다. Kabat 넘버링 시스템은 Kabat et al.(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 상세히 기술되어 있다. AHo 넘버링 시스템은 Honegger, A. 및 Pluckthun, A. (2001) J Mol . Biol . 309:657-670에 상세히 기술되어 있다.
중쇄 가변영역 넘버링
Figure pat00001
Figure pat00002
컬럼 1, Kabat 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 2, 컬럼 1에 표시된 위치에 대한 AHo 넘버링 시스템에서의 대응 번호
컬럼 3, Kabat 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 4, 컬럼 3에 표시된 위치에 대한 AHo 넘버링 시스템에서의 대응 번호
컬럼 5, Kabat 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 6, 컬럼 5에 표시된 위치에 대한 AHo 넘버링 시스템에서의 대응 번호
경쇄 가변영역 넘버링
Figure pat00003
Figure pat00004
컬럼 1, Kabat 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 2, 컬럼 1에 표시된 위치에 대한 AHo 넘버링 시스템에서의 대응 번호
컬럼 3, Kabat 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 4, 컬럼 3에 표시된 위치에 대한 AHo 넘버링 시스템에서의 대응 번호
컬럼 5, Kabat 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 6, 컬럼 5에 표시된 위치에 대한 AHo 넘버링 시스템에서의 대응 번호
기타의 구현예
본 발명은 또한 미국 가특허출원 제60/905,365호(PCT 공개번호 제WO08/ 110348호의 우선권 출원)의 부록 (A-C)와 미국 가특허출원 제60/937,112호(PCT 공개번호 제WO 09/000098호의 우선권 출원)의 부록 (A-I)에 열거된, 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 확인된 데이터베이스, 생물정보학, 가상(in silico) 데이터 가공 및 해석 방법, 작용 에세이, 바람직한 서열, 바람직한 잔기 위치/변경, 프레임워크 확인 및 선택, 프레임워크 변경, CDR 정렬 및 통합, 및 바람직한 변경/돌연변이 등과 같은 방법, 참고 및/또는 조성물을 포함하고 있다
상기한 방법들 및 조성물과 관련한 추가 정보는 하기한 문헌에서 찾아볼 수 있다: "상피층 및/또는 내피층을 투과하는 scFv 항체"를 발명의 명칭으로 각각 2006년 7월과 2007년 2월 6일에 출원된 미국 특허출원 제60/819,378호; 제60/899,907호 및 PCT 공개번호 제WO2008/006235호; "TNFα를 억제하는 안정하고 가용성인 항체"를 발명의 명칭으로 하여 2006년 6월 6일자로 출원된 PCT 공개번호 제WO06131013A2호; "세포내 환경에서 안정성이 증강된 면역글로불린 프레임워크와 그의 확인방법"을 발명의 명칭으로 하여 2003년 5월 21일자로 출원된 유럽 특허출원 공개 제EP1506236A2호; "환원 환경에서 안정한 규명된 프레임워크를 가지는 체내 scFv"를 발명의 명칭으로 하여 2000년 12월 18일자로 출원된 유럽 특허출원 공개 제EP1479694A2호; "환원 환경에서 안정한 규명된 프레임워크를 가지는 인트라바디 및 그의 적용방법"을 발명의 명칭으로 하여 2000년 12월 18일자로 출원된 유럽 특허출원 공개 제EP1242457B1호; "세포 내 환경에서 안정성이 증강된 면역글로불린 프레임워크 및 이를 확인하는 방법"을 발명의 명칭으로 하여 2003년 5월 21일자로 출원된 PCT 공개번호 제WO03097697A2호; "환원 환경에서 안정한 규명된 프레임워크를 가지는 인트라바디 및 그의 적용방법"을 발명의 명칭으로 하여 2000년 12월 18일자로 출원된 PCT 공개번호 제WO0148017A1호; 및 Honegger et al., J. Mol Biol. 309:657-670 (2001).
또한 본 발명은 다른 항체 포맷, 예를 들면 Fab, Dab 등과 같은 전체 길이의 항체 또는 그의 절편의 발견 및/또는 개선에 적합한 방법과 조성물을 포함한다. 따라서, 상기 원리와 잔기들은 넓은 범위의 면역결합제에 적용할 수 있는 목적하는 생체물리학적 및/또는 치료학적 특성을 얻기 위한 선택 또는 변경에 적합한 것으로서 여기에서 확인되었다. 일 구현예에서, 치료학적으로 관련 있는 항체, 예를 들면 FDA 인증 항체는 여기에 기술된 하나 이상의 잔기 위치를 변성하여 개선된다.
그러나, 본 발명이 면역결합제의 제조에만 한정되지는 않는다. 예를 들면, 당업자라면 본 발명의 방법이 면역글로불린이 아닌, 다른 결합분자의 제조에도 적용될 수 있음을 알 수 있으며, 다른 결합분자로는 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 Adnectins(PCT 공개번호 제WO 01/64942호 및 미국 특허 제6,673,901호, 제6,703,199호, 제7,078,490호 및 제7,119,171호), Affibodies (미국 특허 제6,740,734호와 제6,602,977호, 및 PCT 공개번호 제WO 00/63243호), Anticalins (lipocalins) (PCT 공개번호 제WO 99/16873호 및 제WO 05/019254호 참조)와 같은 피브로넥틴 결합 분자, 도메인 단백질(PCT 공개번호 제WO 02/088171호 및 제WO 04/044011호 참조), 및 Darpins 또는 루이신 반복 단백질(PCT 공개번호 제WO 02/20565호와 제WO 06/083275호)과 같은 안카이린(ankyrin) 반복 단백질 등이 있다.
본 발명은 이하의 상세한 설명에 따라 보다 잘 이해되고 위에서 열거된 이외의 목적이 보다 명백해질 것이다. 이러한 상세한 설명은 하기와 같은 첨부된 도면을 참조한다:
도 1은 야생형 ESBA105(E105)와 그의 용해도 변이체의 PEG 침전 용해도 커브를 나타낸 것이다.
도 2는 넓은 온도 범위(25 내지 96 ℃)에서 온도시험을 실시한 후 측정된 야생형 ESBA105(E105) 및 그의 용해도 변이체에 대한 열분해 프로필을 나타낸 것이다.
도 3은 열적 스트레스 조건 하에서 2주 동안 인큐베이션한 후 다양한 ESBA105 용해도 돌연변이의 분해 형태를 나타낸 SDS-PAGE 겔을 나타낸 것이다.
도 4는 FT-IR 분석에 의해 측정된 EP43max와 그의 최적화된 변이체의 열 분해 커브를 나타낸 것이다.
도 5는 FT-IR 분석으로 측정된 578min-max 및 578min-max_DHP의 열 안정성을 나타낸 것이다.
도 6a와 6b는 암모늄 설페이트 침전에 의해 측정된 578min-max와 578min-max_DHP의 용해도를 나타낸 것이다.
본 발명을 이하의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하였으며, 하기 실시예는 추가의 제한으로 이해되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 도면과 참고문헌, 특허, 공개 및 미공개 특허출원의 내용은 참고를 위해 그 전체가 여기에 포함되었다.
실시예 1: 용해도가 개선된 scFv의 생성
본 실시예에서는 구조적 모델링과 서열 분석에 기초한 방법을 용해도를 개선하는 scFv 프레임워크 영역에서의 돌연변이를 확인하기 위해 사용하였다.
a) 구조 분석
ESBA105 scFv의 3D 구조를 ExPASy 웹 서버에 의해 접속가능한 자동화된 단백질 구조 상동성 모델링 서버를 사용하여 모델을 만들었다. 상기 구조를 용매에 대한 상대적 접근표면(rSAS)에 따라 분석하고 잔기들을 다음과 같이 분류하였다: (1) rSAS ≥ 50%를 나타내는 잔기에 대한 노출; 및 (2) 50% ≤ rSAS ≥ 25%를 가지는 잔기에 대한 부분적 노출. rSAS ≥ 25%인 소수성 잔기는 소수성 패치로 간주되었다. 확인된 소수성 패치 각각의 용매 접근면적을 입증하기 위해 ESBA105에 대한 높은 상동성과 2.7 Å 이상의 해상도를 가지는 27 PDB 파일로부터 계산을 실시하였다. 평균 rSAS와 표준 편차를 소수성 패치에 대하여 계산하고 각각에 대하여 상세히 시험하였다(표 3 참조)
Figure pat00005
컬럼 1, AHo 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 2, 컬럼 1에 표시된 위치에 대한 도메인
컬럼 3, 27 PDB 파일로부터의 평균 용매 접근표면 계산
컬럼 4, 컬럼 3의 표준 편차
컬럼 5 내지 9, AHo 넘버링 시스템에서 검색된 소수성 패치의 구조적 역할
ESBA105에서 확인된 소수성 패치 대부분이 가변성-정상 도메인(VH/CH) 계면에 상응하였다. 이는 scFv 포맷에서 용매 노출된 소수성 잔기의 이전의 발견(Nieba et al., 1997)과 연관된다. 2개의 소수성 패치(VH 2와 VH 5) 또한 VL-VH 상호작용에 기여하였으므로 다음 분석에서 제외되었다.
b) 용해도 돌연변이의 설계
총 122개의 VL과 137개의 VH 서열을 Annemarie Honegger의 항체 웹-페이지 (www.bioc.uzh.ch/antibody)에서 검색하였다. 이 서열들은 원래 Protein Data Bank (PDB) (www.rcsb.org/pdb/home/home.do)에서 추출된 Fv 또는 Fab 포맷의 393 항체 구조에 해당하였다. 원래의 잔기 보다 더 높은 친수성을 가지는 대체 아미노산을 찾을 가능성을 높이기 위하여 종 또는 서브그룹과 상관없이 서열들을 분석에 사용하였다. 데이터베이스 내의 다른 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 가지는 서열은 편견을 감소시키기 위하여 제외되었다. 상기 서열들을 정렬하고 잔기 빈도에 대해 분석하였다. 서열 분석 도구와 알고리즘을 친수성 돌연변이를 확인하고 선택하는데 적용하여 ESBA105에서 소수성 패치를 분해하였다. 상기 서열을 면역글로불린 가변 도메인에 대한 AHo 넘버링 시스템(Honegger and Pluckthun 2001)에 따라 정렬하였다. 프레임워크 영역에 대하여 분석을 실시하였다.
사용자 정의 데이터베이스에서 각 위치 i에 대한 잔기 빈도 f(r)을 서열의 전체 숫자로 나누어진 특정한 잔기가 데이터 세트 내에서 관찰된 시간 수에 의해 계산하였다. 제1 단계에서, 상이한 아미노산의 발생 빈도는 각각의 소수성 패치에 대해 계산되었다. ESBA105에서 확인된 각각의 소수성 패치에 대한 잔기 빈도는 상기한 사용자 정의 데이터베이스로부터 분석되었다. 표 4는 데이터베이스에 존재하는 잔기들의 총수에 의해 나누어진 소수성 패치에서의 잔기 빈도를 나타낸 것이다.
다음 표 4에는 ESBA105에서 확인된 소수성 패치에 대한 scFv 또는 Fab 포맷 내의 성숙한 항체의 259개 서열 중의 잔기 빈도를 기재하였다.
Figure pat00006
제2 단계에서, 소수성 패치에서의 친수성 잔기 빈도를 사용하여 각각의 소수성 패치에서 가장 많은 친수성 잔기를 선택하여 용해도 돌연변이를 설계하였다. 표 5는 상기한 방법을 사용하여 확인된 용해도 변이체들을 나타낸 것이다. 모(母)잔기와 변이된 잔기의 소수성을 몇몇 논문에서 공개된 값의 평균 소수성으로 계산하여 용매에 대한 측쇄의 노출농도의 함수로 표시하였다.
Figure pat00007
* 위치 144의 소수성 패치는 데이터베이스 중의 가장 많은 친수성 잔기에 의해서가 아니라 Ser로 교환되며, Ser이 ESBA105의 CDR 공여체 내에 이미 포함되어 있기 때문이다.
컬럼 1, AHo 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 2, 컬럼 1에서 표시된 위치에 대한 도메인
컬럼 3, 27 PDB 파일로부터의 평균 용매 접근표면 계산
컬럼 4, ESBA105 내의 모잔기
컬럼 5, AHo 넘버링 시스템에서 검색된, 컬럼 4의 평균 소수성
컬럼 6, 컬럼 1에 표시된 위치에서 가장 많은 친수성 잔기. AHo 넘버링 시스템으로부터 검색된 컬럼 6의 평균 소수성
c) 용해도 ESBA105 변이체의 시험
상기 용해도 돌연변이를 단독으로 또는 다중 조합물 내에 삽입하여 리폴딩 수율, 발현, 활성 및 안정성과 응집 패턴을 시험하였다. 표 6은 용해도에 대한 잠재적 기여와 돌연변이가 항원 결합을 변경시킬 위험성에 기초한 각각의 ESBA105로 최적화된 변이체에 삽입된 용해도 돌연변이의 다양한 조합물을 나타낸다.
Figure pat00008
컬럼 1, AHo 넘버링 시스템에서의 잔기 위치
컬럼 2, 컬럼 1에서 표시된 위치에 대한 도메인
컬럼 3, 상이한 소수성 패치에서 ESBA105 내의 모잔기
컬럼 4, 표시된 위치의 용해도 돌연변이를 함유하는 상이한 변이체
d) 용해도 측정
ESBA105와 변이체의 최대 용해도를 Atha et al.(JBC, 256: 12108-12117 (1981))에 의해 처음 기술된 PEG 침전방법에 의해 측정하였다. 이 방법에서는, 원심분리된 PEG-단백질 혼합물의 상징액 중의 단백질 농도를 측정하여 PEG 농도에 대하여 대수적으로 플롯하엿다. 20 mg/ml의 단백질 용액을 30 내지 50 % 포화 범위의 PEG 용액과 1 : 1로 혼합하였다. 상기한 조건은 Log S 대 Peg 농도 (w/v%)에 대한 일차 종속을 실험적으로 결정한 후에 야생형 ESBA105에 대해 관찰된 용해도 프로필에 기초하여 선택되었다. 매우 우수한 용해도를 나타내는 변이체 ESBA105의 실시예들에 대한 용해도 곡선을 도 1에 나타내었다. 또한 용해도 값의 전체 리스트는 표 7에 나타내었다.
Figure pat00009
e) 열적 안정성 측정
모ESBA105와 용해도 후속물들에 대한 열적 안정성 측정을 FT-IR ATR 분광법을 사용하여 수행하였다. 상기 분자들은 넓은 범위의 온도(25 내지 95 ℃)에 대해 시험하였다. Fourier 변형을 인터페로그램 시그널에 적용하여 변성 프로필을 얻었다(도 2 참조). 상기 변성 프로필을 사용하여 볼츠만(Boltzmann) 시그모이달 모델을 적용한 모든 ESBA105 변이체에 대한 열적 언폴딩 전이(TM)의 중간값을 근사하였다(표 8).
Figure pat00010
iii. 응집 측정
ESBA105와 그의 용해도 변이체를 시간 의존성 시험에 대해 분석하여 분해와 응집 특성을 평가하였다. 이를 위하여 가용성 단백질(20 mg/ml)을 상승된 온도(40 ℃)에서 인산염 완충액(pH 6.5) 중에서 인큐베이션하였다. 대조 샘플을 -80 ℃로 유지시켰다. 상기 샘플을 2주 동안의 인큐베이션 후에 분해(SDS-PAGE)와 응집(SEC)에 대해 분석하였다. 이 방법에 의해 분해되기 쉬운 변이체(도 3 참조) 또는, 가용성 또는 불용성 응집물을 형성하려는 경향을 나타내는 변이체(표 9 참조)를 폐기하게 된다.
Figure pat00011
iv. 용해도 변이체의 발현 및 리폴딩
용해도 돌연변이체를 모ESBA105 분자와 관련하여 발현율 및 리폴딩 수율에 대해 시험하였다. 시험 결과를 표 10에 기재하였다.
Figure pat00012
모든 친수성 용해도 돌연변이체들이 모ESBA105 분자와 비교하여 개선된 용해도를 나타냈지만, 상기 분자들 중 일부 만이 다른 생체물리학적 특성에 적합한 것으로 나타났다. 예를 들면, 많은 변이체들이 모ESBA105 분자와 관련하여 열적 안정성 및/또는 리폴딩 수율이 감소하였다. 특히, VL147 위치에서의 친수성 치환은 안정성을 심각하게 저하시켰다. 따라서, 열적 안정성에 심각하게 영향을 주지 않는 용해도 돌연변이를 조합하여 추가로 열적 스트레스를 실시하여 이들의 특성을 확인하였다.
4개의 상이한 용해도 돌연변이의 조합물을 함유하는 3개의 돌연변이체(Optl.O, Opt0.2 및 VH:V103T)는 재현성, 활성 또는 열적 안정성에 영향을 미치지 않고 ESBA105의 용해도를 상당히 개선하였다. 그러나, ESBA105 중의 Opt1.0 및 Opt0.2 (Opt 1_2)의 조합된 돌연변이를 가지는 돌연변이체는 2주 동안 40 ℃에서 인큐베이션한 후에 불용성 응집물의 양이 증가하는 것으로 나타났다(표 9 참조). 이것은 VL 15 위치에 있는 Val의 베타 시이트 회전에서의 역할로 설명될 수 있는데, Val은 아미노산 중 가장 큰 베타 시이트 경향을 가지기 때문이다. 상기 결과는 다른 소수성 패치를 분해하는 용해도 돌연변이체들의 조합에서가 아니라 VL 15 위치에서의 단일 용해도 돌연변이가 내성이 있음을 입증한다. 따라서, OptO_2 및 VH:V103T에 함유된 돌연변이를 scFv 분자의 용해도 특성을 개선하기 위한 가장 우수한 퍼포머로 선택하였다.
실시예 2: 용해도와 안정성이 증강된 scFv의 생성
용해도 설계에 의해 확인된 ESBA105 변이체를 품질관리(QC) 에세이로 확인된 안정화 돌연변이로 치환하여 추가로 최적화하였다. 총 4개 구조를 만들고 QC 7.1과 15.2에서 발견된 모든 안정화 돌연변이와 함께 상기 실시예 1에서 확인된 용해도 돌연변이 1과 3 사이에 포함시켰다(즉, VL 도메인 내의 D31N과 V83E 및, VH 도메인 내의 V78A, K43 및 F67L). 최적화된 구조물은 모두 야생형 scFv 보다 더 가용성인 단백질을 얻었다(표 11 참조). 가장 우수한 구조물은 용해도에서 야생형보다 2배 이상의 증가를 지속적으로 나타내었다. scFv 분자의 활성이나 안정성 중 어떤 것도 안정성과 용해도를 증강하는 돌연변이의 조합에 의해 심각하게 영향받지 않았다.
Figure pat00013
4개 변이체 모두에 대한 용해도 값을 사용하여 각각 돌연변이의 scFv 용해도에 대한 기여를 디콘볼루션(deconvolution)하였다. 상기한 잔기들 중 몇몇은 프라이머리 서열과 3D 구조 모두에서 상대적으로 서로에 근접하였음에도 불구하고 모든 돌연변이들이 scFv의 용해도에 첨가 방식으로 기여하는 것으로 나타났다. 이 분석에서 VH 도메인 내의 3개의 용해도 증강 돌연변이의 조합(V12S, L144S, V103T(또는 V103S))은 scFv 용해도의 ~60%를 차지하는 것으로 나타났다. 소수성 패치는 모든 면역결합제의 가변 도메인에서 보존되므로, 돌연변이의 이러한 최적 조합을 거의 모든 scFv 또는 다른 면역결합제 분자의 용해도를 개선하는데 사용할 수 있다.
실시예 3: 강력한 TNFα 결합제인 Epi43max의 용해도 최적화된 변이체
표 12에는 강력한 TNF 결합제인 Epi43max의 3개의 최적화된 변이체에 대한 특성화 데이터를 기재하였다. EP43_maxDHP는 Epi43max의 용해도가 증강된 변이체이며, 상기한 3개의 용해도 증강 돌연변이를 포함한다(AHo 위치 12에서 V ->S, AHo 위치 103에서 V ->T, 및 AHo 위치 144에서 L ->T). EP43_maxmin 및 EP43_minmax 변이체들을 "min"과 "max" 그래프트 사이에서 도메인 셔플링에 의해 생성하였다. 특히 "minmax" 변이체는 경쇄의 미니멀 그래프트(CDR-그래프트만) 버젼과 중쇄의 맥시멀 그래프트 버젼을 포함한다(즉, 그래프트된 래빗 CDR을 항원 결합과 연관된 래빗 프레임워크 잔기에 추가). 역으로, "maxmin" 변이체는 경쇄의 맥시멀 그래프트 버젼과 중쇄의 미니멀 그래프트 버젼을 포함하였다. EP43max와 그의 최적화된 변이체의 열 변성 곡선을 FTIR 분석에 의해 비교하였다(도 4 참조). Epi43minmax는 그 Epi43max를 언폴딩하는 더 낮은 중간점을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 mimax 변이체는 언폴딩 전이스텝을 나타내었으며, 2개 도메인이 매우 유사한 온도에서 언폴딩하는 것으로 나타났다.
Figure pat00014
실시예 4: VEGF 면역결합제의 용해도가 증강된 유도체
상기한 TNF 면역결합제(ESBA105와 Epi43max) 이외에 VEGF 면역결합제의 용해도 유도체 몇 종류를 본 발명의 방법에 따라 제조하였다. 특히 상기한 VEGF 면역결합제 변이체들을 조작하여 다음 잔기들에 대해 선택하여 분해된 소수성 패치("DHP")를 가지도록 하였다: (a) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린(S); (b) 중쇄 아미노산 위치 103의 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및 (c) 중쇄 아미노산 위치 144의 세린(S) 또는 트레오닌(T). 이들 DHP 변이체의 생물물리학적 특성을 그의 야생형과 비교하였다. 이러한 특성들로는 녹는점 또는 Tm (Bio-ATR로 측정), β-시이트 손실 60 ℃의 비율(AquaSpec으로 측정), 60 ℃에서의 침전 후에 단백질 손실 비율, 암모늄 설페이트 침전에 의한 용해도, 제조시 리폴딩 수율 및 E. coli에서의 발현 수준 등이 있다.
하기 표 14에 나타낸 바와 같이, VEGF 면역결합제들 중 하나(ESBA578minmax FWl.4 DHP)의 용해도는 DHP 모티프의 삽입으로 상당히 증가되었다. 또한, 다른 생체물리학적 특성(예를 들면, 열적 안정성)도 불리하게 영향받지 않거나 상기한 모티프의 삽입으로 개선되었다. 578min-max와 그의 용해도 최적화 변이체(578min-max_DHP)에 대한 녹는점을 결정하는데 사용되는 열적 안정성 곡선을 도 5와 표 13에 나타내었고, 용해도 값을 결정하는데 사용되는 암모늄 설페이트 침전 곡선은 도 6에 기재하였다.
Figure pat00015
Figure pat00016
동등한 구현예
당업자라면 일반적인 실험만으로 여기에 기술한 본 발명의 특정한 구현예와 동등한 예들을 이해하고 확인할 수 있다. 이러한 동등한 예들은 다음 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 간주된다.

Claims (11)

  1. A) 돌연변이를 위해 VH 영역 내에서 2개 이상의 아미노산 위치를 선택하고;
    B) 돌연변이를 위해 선택된 2개 이상의 아미노산 위치를 돌연변이하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 2개 이상의 아미노산 위치가 12, 103 및 144(AHo 넘버링 )로 구성되는 중쇄 아미노산 위치의 군에서 선택되고, 상기 돌연변이는 선택된 아미노산 위치에서의 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는, 중쇄 가변(VH)영역 또는 그의 절편을 포함하는 천연 상태의 면역결합제의 용해도를 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 친수성 아미노산이
    (a) 중쇄 아미노산 위치 12의 세린(S);
    (b) 중쇄 아미노산 위치 103의 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및/또는
    (c) 중쇄 아미노산 위치 144의 세린(S) 또는 트레오닌(T)인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 돌연변이를 위해 선택되는 아미노산 위치의 아미노산이 소수성 아미노산인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 소수성 아미노산이 루이신(L) 또는 발린(V)인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 돌연변이를 위해 선택된
    (a) 중쇄 아미노산 위치 12의 아미노산이 발린(V)이고;
    (b) 중쇄 아미노산 위치 103의 아미노산이 발린(V)이며;
    (c) 중쇄 아미노산 위치 144의 아미노산이 루이신(L)인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 면역결합제의 열적 안정성, 리폴딩, 발현수율, 응집 및/또는 결합 활성이 돌연변이에 의해 부정적으로 영향을 받지 않는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 돌연변이가 용해도를 2배 이상 증가시키는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 돌연변이가
    (a) 경쇄 아미노산 위치 31의 아스파르트산(D);
    (b) 경쇄 아미노산 위치 83의 글루탐산(E);
    (c) 중쇄 아미노산 위치 43의 아르기닌(R);
    (d) 중쇄 아미노산 위치 67의 루이신(L); 및
    (e) 중쇄 아미노산 위치 78의 알라닌(A)으로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 위치(AHo 넘버링)에서 하나 이상의 돌연변이를 삽입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항에 따른 방법으로 제조되는 면역결합제.
  10. 제9항에 있어서, scFv 항체, 전체 길이의 면역글로불린, Fab 절편, Dab 또는 Nanobody인 면역결합제.
  11. 제9항에 있어서, 사람 TNFα 또는 사람 VEGF에 특이적으로 결합하는 면역결합제.
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