KR102110736B1 - Viii 인자 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드, 그리고 이들의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 VIII 인자(처리된 FVIII, 단쇄 FVIII 또는 이의 조합)를 투여하는 방법; VIII 인자를 포함하는 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드를 투여하는 방법; VIII 인자를 포함하는 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드; 이러한 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포; 및 이러한 세포를 사용하여 이러한 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
Description
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(파일명: sequencelisting_ascii.txt; 크기: ____ 바이트; 및 생성일: ____)로 전자로 제출된 서열 목록의 내용은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 지혈 장애에 대한 치료제 분야에 관한 것이다.
A형 혈우병은 VIII 인자(FVIII) 유전자에서의 돌연변이 및/또는 결실로 인한 FVIII 활성 결핍에 의해 야기되는 X 염색체 관련 출혈 장애이다[Peyvandi, F. et al. Haemophilia 12:82-89 (2006)]. 이 질환은 외상 후 자발적인 출혈 및 과도한 출혈을 특징으로 한다. 시간이 지나면서, 유아기에 대개 시작하는 근육 및 관절로의 반복 출혈은 혈우병성 관절증 및 비가역적 관절 손상을 발생시킨다. 이 손상은 진행성이고, 매우 제한된 관절 이동, 근육 위축증 및 만성 통증을 야기할 수 있다[Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)].
A2 도메인은 VIII 인자 분자의 응혈원 활성에 필요하다. 연구에 의하면 돼지 VIII 인자가 인간 VIII 인자보다 응혈원 활성이 6배 높고[Lollar, P., and E. T. Parker, J. Biol. Chem. 266:12481-12486 (1991)], 인간과 돼지 VIII 인자 사이의 응혈 활성의 차이가 인간 및 돼지 A2 도메인에서의 1개 이상의 잔기 사이의 아미노산 서열 차이에 기초한다는 것을 보여준다[Lollar, P., et al., J. Biol. Chem. 267:23652-23657 (1992))(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]는 것을 나타낸다.
A형 혈우병의 치료는 자발적인 출혈을 예방하기 위해 정상 수준의 1 내지 5%로의 FVIII 활성의 복원을 표적화하는 대체 치료에 의한다[Mannucci, P.M., et al., N. Engl. J. Med. 344:1773-1779 (2001)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]. 출혈 삽화를 온디맨드식(on-demand)으로 치료하거나, 예방학적 치료에 의해 출혈 삽화의 발생을 예방하기 위해 이용 가능한 혈장 유래 및 재조합 FVIII 제품이 존재한다. 그러나, 8시간 내지 12시간과 같은 이 제품의 짧은 반감기에 기초하여, 치료 섭생은 빈번한 정맥 주사 투여를 요한다. 이러한 반복 투여는 통증스럽고 불편하다.
혈장 유래 및 재조합 FVIII의 개발로 인해 사망률 감소, 관절 손상 예방 및 삶의 질 개선이 중요한 업적이다. 출혈로부터의 장기간 보호는 A형 혈우병 환자의 치료에서 다른 중요한 업적을 나타낸다. 그러나, 장기간 지혈 보호를 허용하는 제품이 현재까지 개발되지 않았다. 따라서, 현재의 치료보다 더 관용성이고 더 오래 지속되며 더 효과적인 VIII 인자 결핍증으로 인한 혈우병을 치료하는 개선된 방법에 대한 수요가 존재한다.
본 발명은 VIII 인자를 투여하는 방법; VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드 및 이러한 키메라 폴리펩타이드의 하이브리드를 투여하는 방법; VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드 및 이러한 키메라 폴리펩타이드의 하이브리드; 이러한 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포; 및 이러한 세포를 사용하여 이러한 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 VIII 인자를 필요로 하는 피험체에게 VIII 인자를 투여하는 방법으로서, 상기 피험체에게 치료학적 용량의 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드, 예를 들면 키메라 VIII 인자-Fc 폴리펩타이드를 비-VIII 인자 부분이 없는(상기 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드), 예를 들면 Fc 부분이 없는 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배 긴 투약 간격으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
투약 간격은 비-VIII 인자 부분이 없는(상기 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드), 예를 들면 Fc 부분이 없는 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배 내지 6배 길거나, 1½배 내지 5배 길거나, 1½배 내지 4배 길거나, 1½배 내지 3배 길거나, 1½배 내지 2배 길 수 있다. 투약 간격은 비-VIII 인자 부분이 없는(상기 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드), 예를 들면 Fc 부분이 없는 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배, 2배, 2½배, 3배, 3½배, 4배, 4½배, 5배, 5½배 또는 6배 길 수 있다. 투약 간격은 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 또는 더 긴 기간마다일 수 있다.
투약 간격은 적어도 약 1½일 내지 5일, 1½일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 또는 더 긴 기간일 수 있다.
본 발명은 또한 VIII 인자를 필요로 하는 피험체에게 VIII 인자를 투여하는 방법으로서, 상기 피험체에게 치료학적 용량의 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드, 예를 들면 키메라 VIII 인자-Fc 폴리펩타이드를 투여하여 비-VIII 인자 부분이 없는(상기 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드), 예를 들면 Fc 부분이 없는 상기 VIII 인자의 등가 용량에 의해 얻은 시간 대 혈장농도곡선하 면적(area under the plasma concentration versus time curve: AUC)보다 적어도 약 1¼배 높은 AUC를 얻는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 VIII 인자를 필요로 하는 피험체에게 VIII 인자를 투여하는 방법으로서, 상기 피험체에게 VIII 인자 및 Fc를 포함하는 치료학적 용량의 폴리펩타이드를 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 또는 더 긴 기간마다의 투약 간격으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
예방학적 치료 또는 온디맨드식 치료를 필요로 하는 피험체에서 본 발명의 방법을 실행할 수 있다.
온디맨드식 치료는 출혈 삽화, 관절혈증, 근육 출혈, 경구 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구내 출혈, 외상, 두근 외상(trauma capitis)(두부 외상), 위장 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강내 출혈, 복막후강내 출혈 또는 장요근초내 출혈의 치료를 포함한다. 피험체는 수술적 예방, 수술후 관리 또는 수술 치료를 필요로 할 수 있다. 이러한 수술은 예를 들면 소수술, 대수술, 발치, 편도선 수술, 서혜부 절제술, 활막절제술(synovectomy), 슬관절 전치환술, 개두술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술 또는 관절 대체 수술을 포함한다.
온디맨드식 치료의 경우, 상기 키메라 폴리펩타이드의 투약 간격은 24시간 내지 36시간, 24시간 내지 48시간, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 96시간, 24시간 내지 120시간, 24시간 내지 144시간, 24시간 내지 168시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간, 40시간, 41시간, 42시간, 43시간, 44시간, 45시간, 46시간, 47시간, 48시간, 49시간, 50시간, 51시간, 52시간, 53시간, 54시간, 55시간, 56시간, 57시간, 58시간, 59시간, 60시간, 61시간, 62시간, 63시간, 64시간, 65시간, 66시간, 67시간, 68시간, 69시간, 70시간, 71시간 또는 72시간 또는 더 긴 기간마다 약 1회이다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 치료학적 용량은 약 10 내지 약 100IU/㎏, 더 구체적으로, 약 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90 또는 90 내지 100IU/㎏, 더 구체적으로, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100IU/㎏이다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 치료학적 용량은 약 10 내지 약 150IU/㎏, 더 구체적으로, 약 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150IU/㎏, 더 구체적으로, 약 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 또는 150IU/㎏이다.
본 발명의 방법에서 피험체는 인간 피험체이다. 단일 피험체 또는 피험체 집단에서 투약 간격 및 AUC의 결정을 수행할 수 있다.
VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 인간 VIII 인자이다. VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 B 도메인의 완전 또는 부분 결실을 가질 수 있다.
VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1457번 아미노산 또는 서열 번호 6의 4번 내지 2351번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일할 수 있다. VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1457번 아미노산 또는 서열 번호 6의 20번 내지 2351번 아미노산)과 동일할 수 있다.
VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1457번 아미노산 또는 서열 번호 6의 1번 내지 2351번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일할 수 있다. VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1457번 아미노산 또는 서열 번호 6의 1번 내지 2351번 아미노산)과 동일할 수 있다.
Fc 부분(또는 키메라 폴리펩타이드의 Fc 부분)은 표 2에 기재된 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 1458번 내지 1684번 아미노산 또는 서열 번호 6의 2352번 내지 2578번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일할 수 있다. Fc 부분(또는 키메라 폴리펩타이드의 Fc 부분)은 표 2에 기재된 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 1458번 내지 1684번 아미노산 또는 서열 번호 6의 2352번 내지 2578번 아미노산)과 동일할 수 있다.
키메라 폴리펩타이드는 신호 서열 없이 표 2A(ⅰ)에 기재된 VIII 인자 및 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1684번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일하거나 신호 서열 없이 표 2A(ⅰ)에 기재된 VIII 인자 및 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1684번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 키메라 폴리펩타이드는 신호 서열 없이 표 2A(ⅰ)에 기재된 VIII 인자 및 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1684번 아미노산)과 동일하거나 신호 서열 없이 표 2A(ⅰ)에 기재된 VIII 인자 및 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1684번 아미노산)과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
키메라 폴리펩타이드는 상기 키메라 폴리펩타이드와 회합된 제2 폴리펩타이드를 포함하는 하이브리드 형태일 수 있고, 상기 제2 폴리펩타이드는 Fc로 본질적으로 이루어지거나 이를 포함한다.
제2 폴리펩타이드는 신호 서열 없이 표 2A(ⅱ)에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 4의 21번 내지 247번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일하거나 신호 서열 없이 표 2A(ⅱ)에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 4의 1번 내지 247번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열로 본질적으로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다. 제2 폴리펩타이드는 신호 서열 없이 표 2A(ⅱ)에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 4의 21번 내지 247번 아미노산)과 동일하거나 신호 서열 없이 표 2A(ⅱ)에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 4의 1번 내지 247번 아미노산)과 동일한 서열로 본질적으로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.
키메라 폴리펩타이드 또는 하이브리드를 적어도 1종의 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드 그 자체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 배양된 인간 배아 세포 및 이러한 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드를 제조하는 방법 및 이러한 방법에 의해 제조된 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 VIII 인자 부분 및 제2 부분을 포함하는 VIII 인자 활성을 갖는 키메라 폴리펩타이드로서, VIII 인자 부분은 중쇄를 포함하는 제1 사슬 및 경쇄를 포함하는 제2 사슬의 2개의 사슬을 포함하는 처리된 VIII 인자이고, 상기 제1 사슬 및 상기 제2 사슬은 금속 결합에 의해 회합된 키메라 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들면, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%는 처리된 VIII 인자이다.
또한, 본 발명은 VIII 인자 부분이 단쇄 VIII 인자인 VIII 인자 활성을 갖는 키메라 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 단쇄 VIII 인자는 온전한 세포내 처리 자리를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20% 또는 약 25%는 단쇄 VIII 인자이다. 다른 실시양태에서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%는 단쇄 VIII 인자이다. 다른 양태에서, 단쇄 FVIII는 세포내 처리 자리를 포함하지 않는다. 예를 들면, SCFVIII는 전장 VIII 인자에서 1645번 아르기닌에 해당하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이, 1648번 아르기닌에 해당하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이 또는 1645번 아르기닌 및 1648번 아르기닌에 해당하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이를 포함한다. 1645번 아르기닌에 해당하는 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 1648번 아르기닌에 해당하는 아미노산 위치에서 치환된 아미노산과 다르다. 특정한 양태에서, 치환 또는 돌연변이는 아르기닌 이외의 아미노산, 예를 들면 알라닌이다.
몇몇 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는, VIII 인자 활성을 발색 검정(chromogenic assay)에 의해 실험실내 측정할 때, 2개의 Fc 부분 및 2개의 Fc 부분 중 1개에 융합된 처리된 VIII 인자로 이루어진 키메라 폴리펩타이드에 필적하는 수준으로 VIII 인자 활성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 2개의 Fc 부분 및 2개의 Fc 부분 중 1개에 융합된 처리된 VIII 인자로 이루어진 키메라 폴리펩타이드에 필적하는 생체내 VIII 인자 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 2개의 Fc 부분 및 2개의 Fc 부분 중 1개에 융합된 처리된 VIII 인자로 이루어진 키메라 폴리펩타이드에 필적하는 Xa 인자 생성률을 갖는다. 특정한 양태에서, 키메라 폴리펩타이드 내의 단쇄 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어진 키메라 폴리펩타이드 내의 처리된 VIII 인자에 필적하는 수준으로 활성화 C 단백질에 의해 활성화된다. 또 다른 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드 내의 단쇄 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어진 키메라 폴리펩타이드 내의 처리된 VIII 인자에 필적하는 IXa 인자 상호작용률을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드 내의 단쇄 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어진 키메라 폴리펩타이드 내의 처리된 VIII 인자에 필적하는 수준으로 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)에 결합한다.
본 발명은 VIII 인자 활성을 갖는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리펩타이드의 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%는 단쇄 VIII 인자인 VIII 인자 부분 및 제2 부분을 포함하고, 상기 단쇄 VIII 인자는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1457번 아미노산 또는 서열 번호 6의 20번 내지 2351번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일한 조성물을 추가로 제공한다. 일 실시양태에서, 제2 부분은 Fc일 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩타이드는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 하이브리드 형태이고, 상기 제2 폴리펩타이드는 Fc로 본질적으로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 폴리펩타이드는 반감기가 상기 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드보다 적어도 1½배 내지 6배 길거나, 1½배 내지 5배 길거나, 1½배 내지 4배 길거나, 1½배 내지 3배 길거나, 1½배 내지 2배 길다.
치료학적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 출혈 상태를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 치료는 예방학적 치료 또는 온디맨드식 치료 또는 수술전후 치료일 수 있다. 출혈 응고 질환은 혈우병일 수 있다. 일 실시양태에서, 치료되는 피험체는 소아 피험체이다.
본 발명은 또한 피험체에게 유효량의 지속성 VIII 인자(FVIII) 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 출혈 삽화를 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법으로서, 상기 피험체는 혈장에서 고수준의 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 나타내는 방법에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 상기 피험체는 혈장에서 고수준의 VWF를 발현하는 것으로 확인된다. 본 발명은 또한 피험체에서 출혈 삽화를 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법으로서, (a) 상기 피험체의 혈장에서 VWF 수준을 측정하여 고수준의 VWF를 갖는 피험체를 확인하는 단계(적어도 약 100IU/dL의 VWF 수준은 상기 피험체를 고수준의 VWF를 갖는 것으로 확인함); 및 (b) 상기 피험체에게 유효량의 지속성 FVIII 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 상기 피험체는 인간이다. 다른 실시양태에서, 상기 피험체는 소아 피험체이다. 다른 실시양태에서, 상기 피험체는 A형 혈우병을 앓는다.
일 실시양태에서, 고수준의 VWF는 적어도 약 100IU/dL이다. 다른 실시양태에서, 고수준의 VWF는 약 100IU/dL 내지 약 200IU/dL이다. 다른 실시양태에서, 고수준의 VWF는 약 110IU/dL, 약 120IU/dL, 약 130IU/dL, 약 140IU/dL, 약 150IU/dL, 약 160IU/dL, 약 170IU/dL, 약 180IU/dL, 약 190IU/dL 또는 약 200IU/dL이다.
일 실시양태에서, 피험체는 A, B 또는 AB 혈액 혈청형을 갖는다.
일 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 상기 피험체에서 반감기가 약 20 내지 약 40시간이다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 반감기가 약 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간 또는 40시간이다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 반감기가 약 20시간 내지 27시간이다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 평균 수준의 VWF를 갖는 개체에게 투여될 때 반감기가 상기 지속성 FVIII 단백질의 반감기보다 적어도 약 1.2배 길다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 평균 수준의 VWF를 갖는 개체에게 투여될 때 반감기가 상기 지속성 FVIII 단백질의 반감기보다 적어도 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배 길다.
일 실시양태에서, 투여되는 지속성 FVIII 단백질의 유효량은 적어도 약 20IU/㎏, 적어도 약 25IU/㎏, 적어도 약 30IU/㎏, 적어도 약 35IU/㎏, 적어도 약 40IU/㎏, 적어도 약 45IU/㎏, 적어도 약 50IU/㎏, 적어도 약 55IU/㎏, 적어도 약 60IU/㎏, 적어도 약 65IU/㎏, 적어도 약 70IU/㎏, 적어도 약 75IU/㎏, 적어도 약 80IU/㎏, 적어도 약 85IU/㎏ 또는 적어도 약 90IU/㎏이다. 다른 실시양태에서, 유효량은 적어도 약 65IU/㎏ 내지 적어도 약 90IU/㎏이다. 다른 실시양태에서, 유효량은 80IU/㎏이다.
일 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질을 72시간 또는 더 긴 기간마다 투여한다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질을 1주 또는 더 긴 기간마다 약 1회 투여한다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질을 10일마다 약 1회, 2주마다 약 1회, 15일마다 약 1회, 20일마다 약 1회, 3주마다 약 1회, 25일마다 약 1회, 4주마다 약 1회 또는 1개월마다 약 1회 투여한다.
일 실시양태에서, 지속성 FVIII을 72시간마다 1회 80IU/㎏의 용량으로 투여한다. 추가의 실시양태에서, 지속성 FVIII을 소아 피험체에게 72시간마다 1회 80IU/㎏의 용량으로 투여한다.
일 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질의 투여는 출혈 삽화를 5% 초과 내지 20%, 5% 초과 내지 15%, 5% 초과 내지 10%, 10% 초과 내지 20% 또는 10% 초과 내지 15%로 해소한다. 일 실시양태에서, 상기 피험체에서 혈장 VIII 인자:C의 최저혈중농도(trough level)를 1IU/dl 초과 내지 3IU/dl 또는 3IU/dl 초과 내지 5IU/dl로 유지시킨다. 일 실시양태에서, 투여는 상기 피험체에서 출혈 삽화를 예방한다. 다른 실시양태에서, 출혈 삽화는 자발적이다. 다른 실시양태에서, 투여는 출혈 삽화를 80% 초과 내지 100%, 80% 초과 내지 90%, 85% 초과 내지 90%, 90% 초과 내지 100%, 90% 초과 내지 95% 또는 95% 초과 내지 100%로 해소한다.
일 실시양태에서, 투여는 수술을 필요로 하는 피험체의 집단에서 항상성을 유지시킨다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질을 수술 전에, 동안에 또는 후에 투여한다. 다른 실시양태에서, 수술은 소수술, 대수술, 발치, 편도선 수술, 서혜부 절제술, 활막절제술, 슬관절 전치환술, 개두술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술 또는 관절 대체 수술이다. 다른 실시양태에서, 수술은 응급 수술이다.
일 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 반감기가 FVIII로 이루어진 폴리펩타이드보다 길다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 페길화, 헤실레이트화 또는 폴리사이알릴화된다.
일 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 FVIII 부분 및 제2 부분을 포함하는 키메라 단백질이다. 다른 실시양태에서, 제2 부분은 Fc 영역, 알부민, PAS 서열, 트랜스페린, CTP(4 O-글라이칸을 갖는 hCG의 28개의 아미노산 C 말단 펩타이드(CTP)), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 알부민 결합 폴리펩타이드, 알부민 결합 소분자 또는 이들의 2 이상의 조합이다. 다른 실시양태에서, 제2 부분은 FVIII 부분의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 융합된다. 다른 실시양태에서, 제2 부분은 FVIII 부분 내의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 다른 실시양태에서, 키메라 단백질은 FVIIIFc 단량체 이합체 하이브리드이다. 다른 실시양태에서, FVIII 부분은 단쇄이다. 다른 실시양태에서, FVIII 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, FVIII 부분은 전장 VIII 인자, 성숙 VIII 인자 또는 B 도메인의 완전 또는 부분 결실을 갖는 VIII 인자를 포함한다. 다른 실시양태에서, FVIII 부분은 서열 번호 2의 1번 내지 1438번 아미노산 또는 서열 번호 6의 1번 내지 2332번 아미노산과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, FVIII 부분은 서열 번호 2의 1번 내지 1438번 아미노산 또는 서열 번호 6의 1번 내지 2332번 아미노산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드는 서열 번호 2의 1439번 내지 1665번 아미노산 또는 서열 번호 6의 2333번 내지 2559번 아미노산과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 Fc 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제2 부분은 서열 번호 2의 1439번 내지 1665번 아미노산 또는 서열 번호 6의 2333번 내지 2559번 아미노산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 폴리펩타이드를 적어도 1종의 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서 투여한다.
본 발명은 또한 출혈 장애를 진단받은 피험체에서 FVIII-Fc의 반감기를 측정하는 단계 및 적어도 3일의 투약 간격으로 유효량의 FVIII-Fc 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 상기 피험체를 치료하는 방법으로서, 정상 피험체에서의 FVIII-Fc의 반감기보다 적어도 약 1.2배 긴 반감기는 상기 피험체가 긴 간격 투약에 대한 후보자라는 것을 나타내는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 출혈 장애를 진단받은 피험체에게 적어도 3일의 투약 간격으로 유효량의 FVIII-Fc 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 상기 피험체를 치료하는 방법으로서, 상기 피험체에서의 FVIII-Fc의 반감기는 평균 수준의 VWF를 갖는 피험체에게 투여될 때 FVIII-Fc의 반감기보다 적어도 약 1.2배 긴 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 상기 피험체에서의 FVIII-Fc의 혈장 반감기는 평균 수준의 VWF를 갖는 피험체에게 투여될 때 FVIII-Fc의 혈장 반감기보다 적어도 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배 길다. 다른 실시양태에서, FVIII-Fc 혈장 반감기는 20시간 내지 40시간이다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 반감기가 약 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간 또는 40시간이다. 다른 실시양태에서, 지속성 FVIII 단백질은 반감기가 약 20시간 내지 27시간이다.
본 발명은 또한 출혈 장애를 진단받은 피험체에게 투여된 속효성 FVIII의 반감기를 측정하는 단계 및 적어도 3일의 투약 간격으로 유효량의 지속성 FVIII-Fc 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 상기 피험체를 치료하는 방법으로서, 평균 VWF 수준을 갖는 피험체에서의 상기 속효성 FVIII의 반감기보다 적어도 약 1.2배 긴 반감기는 상기 피험체가 긴 간격 투약에 대한 후보자라는 것을 나타내는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 피험체에서의 속효성 FVIII의 반감기는 평균 VWF 수준을 갖는 피험체에게 투여될 때 속효성 FVIII의 반감기보다 적어도 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배 길다.
일 실시양태에서, 상기 피험체는 인간이다. 다른 실시양태에서, 상기 피험체는 소아 피험체이다. 다른 실시양태에서, 상기 피험체는 A형 혈우병을 앓는다. 다른 실시양태에서, 상기 피험체는 A, B 또는 AB 혈액 혈청형을 갖는다.
일 실시양태에서, 지속성 FVIII-Fc를 적어도 약 20IU/㎏, 적어도 약 25IU/㎏, 적어도 약 30IU/㎏, 적어도 약 35IU/㎏, 적어도 약 40IU/㎏, 적어도 약 45IU/㎏, 적어도 약 50IU/㎏, 적어도 약 55IU/㎏, 적어도 약 60IU/㎏, 적어도 약 65IU/㎏, 적어도 약 70IU/㎏, 적어도 약 75IU/㎏, 적어도 약 80IU/㎏, 적어도 약 85IU/㎏ 또는 적어도 약 90IU/㎏인 유효량으로 투여한다. 다른 실시양태에서, 유효량은 적어도 약 65IU/㎏ 내지 적어도 약 90IU/㎏이다.
일 실시양태에서, 유효량의 FVIII-Fc 단백질을 1주마다 약 1회, 10일마다 약 1회, 2주마다 약 1회, 15일마다 약 1회, 20일마다 약 1회, 3주마다 약 1회, 25일마다 약 1회, 4주마다 약 1회 또는 1개월마다 약 1회 투여한다.
일 실시양태에서, 투여는 출혈 삽화를 5% 초과 내지 20%, 5% 초과 내지 15%, 5% 초과 내지 10%, 10% 초과 내지 20% 또는 10% 초과 내지 15%로 해소한다. 일 실시양태에서, 상기 피험체에서 혈장 VIII 인자:C의 최저혈중농도를 1 초과 내지 3IU/dl 또는 3 초과 내지 5IU/dl로 유지시킨다.
일 실시양태에서, 투여는 상기 피험체에서 출혈 삽화를 예방한다. 일 실시양태에서, 출혈 삽화는 자발적이다. 일 실시양태에서, 투여는 출혈 삽화를 80% 초과 내지 100%, 80% 초과 내지 90%, 85% 초과 내지 90%, 90% 초과 내지 100%, 90% 초과 내지 95% 또는 95% 초과 내지 100%로 해소한다. 일 실시양태에서, 투여는 수술을 필요로 하는 피험체의 집단에서 항상성을 유지시킨다. 일 실시양태에서, FVIII-Fc 단백질을 수술 전에, 동안에 또는 후에 투여한다. 일 실시양태에서, 수술은 소수술, 대수술, 발치, 편도선 수술, 서혜부 절제술, 활막절제술, 슬관절 전치환술, 개두술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술 또는 관절 대체 수술이다. 일 실시양태에서, 수술은 응급 수술이다.
일 실시양태에서, FVIII-Fc 단백질은 반감기가 FVIII로 이루어진 폴리펩타이드보다 길다. 일 실시양태에서, FVIII-Fc 단백질은 페길화, 헤실레이트화 또는 폴리사이알릴화된다. 일 실시양태에서, FVIII-Fc 단백질은 FVIIIFc 단량체 이합체 하이브리드이다. 일 실시양태에서, FVIII 부분은 단쇄이다. 일 실시양태에서, FVIII 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시양태에서, FVIII 부분은 전장 VIII 인자, 성숙 VIII 인자 또는 B 도메인의 완전 또는 부분 결실을 갖는 VIII 인자를 포함한다. 일 실시양태에서, FVIII 부분은 서열 번호 2의 1번 내지 1438번 아미노산 또는 서열 번호 6의 1번 내지 2332번 아미노산과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, FVIII 부분은 서열 번호 2의 1번 내지 1438번 아미노산 또는 서열 번호 6의 1번 내지 2332번 아미노산을 포함한다. 일 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드의 제2 부분은 서열 번호 2의 1439번 내지 1665번 아미노산 또는 서열 번호 6의 2333번 내지 2559번 아미노산과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 Fc 영역을 포함한다. 일 실시양태에서, 제2 부분은 서열 번호 2의 1439번 내지 1665번 아미노산 또는 서열 번호 6의 2333번 내지 2559번 아미노산을 포함한다.
일 실시양태에서, FVIII-Fc 폴리펩타이드를 적어도 1종의 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서 투여한다.
본 발명은 또한 혈장 VWF의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 출혈 장애를 진단받은 피험체가 지속성 FVIII 폴리펩타이드에 의한 긴 간격 투약에 대한 후보자인지를 결정하는 방법으로서, 적어도 100IU/dL의 VWF 발현 수준은 상기 피험체가 지속성 FVIII 폴리펩타이드를 사용하는 긴 간격 투약에 대한 후보자라는 것을 나타내는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, VWF 발현 수준은 적어도 약 110IU/dL, 약 120IU/dL, 약 130IU/dL, 약 140IU/dL, 약 150IU/dL, 약 160IU/dL, 약 170IU/dL, 약 180IU/dL, 약 190IU/dL 또는 약 200IU/dL이다.
본 발명은 또한 출혈 장애를 진단받은 피험체에서 FVIII-Fc의 반감기를 측정하는 단계를 포함하는 상기 피험체가 지속성 FVIII 폴리펩타이드의 긴 간격 투약에 대한 후보자인지를 결정하는 방법으로서, 평균 VWF 수준을 갖는 피험체에게 투여될 때 FVIII-Fc의 반감기보다 적어도 약 1.2배 긴 반감기는 상기 피험체가 긴 간격 투약에 대한 후보자라는 것을 나타내는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, FVIII-Fc의 반감기는 평균 VWF 수준을 갖는 피험체에게 투여될 때 FVIII-Fc의 반감기보다 적어도 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배 길다.
본 발명은 또한 출혈 장애를 진단받은 피험체에서 속효성 FVIII의 반감기를 측정하는 단계를 포함하는 상기 피험체가 지속성 FVIII 폴리펩타이드의 긴 간격 투약에 대한 후보자인지를 결정하는 방법으로서, 평균 VWF 수준을 갖는 피험체에게 투여될 때 속효성 FVIII의 반감기보다 적어도 약 1.2배 긴 반감기는 상기 피험체가 긴 간격 투약에 대한 후보자라는 것을 나타내는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 반감기는 평균 VWF 수준을 갖는 피험체에게 투여될 때 FVIII-Fc의 반감기보다 적어도 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배 길다.
도 1. rFVIIIFc 단량체의 모식도.
도 2a 내지 도 2e. a 내지 b. rFVIIIFc(처리된 또는 단쇄)의 비환원 및 환원 SDS-PAGE 분석. c. LC/UV 및 LC/MS에 의해 분석된 rFVIIIFc 구조. d. 트롬빈 절단 후 rFVIIIFc의 전체 이온 전류(TIC) 크로마토그램(LC/MS 맵). 분해 주생성물이 표시되어 있다. e. rFVIIIFc 및 rBDDFVIII의 A2 도메인의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼. 트롬빈 절단 A2 도메인(S373 내지 R740) 및 2개의 절두 생성물인 S373 내지 Y729 및 S373 내지 E720에 상응하는 주생성물 및 이의 동족체 질량이 표시되어 있다.
도 3a 내지 도 3c. rFVIII-Fc의 생화학적 규명: a. 인지질 소포 농도의 함수로서의 X 인자의 활성화; b. FX 농도의 함수로서의 X 인자의 활성화. c. IXa 인자 농도의 함수로서의 X 인자의 활성화.
도 4. 활성화 C 단백질에 의한 절단 후 X 인자의 활성화.
도 5a 내지 도 5d. 시간에 대한 화합물에 의해 그룹화된 용량 수준(1단계 검정, 25IU/㎏(a) 또는 65IU/㎏(b); 및 발색 검정, 25IU/㎏(c) 또는 65IU/㎏(d))에 의해 분류된 시간에 대한 관찰된 그룹 평균 FVIII 활성(±SE)의 프로필.
도 6a 내지 도 6b. 시간에 대한 용량 수준 및 화합물에 의해 그룹화(1단계 검정(a) 또는 발색 검정(b))된 시간에 대한 관찰된 그룹 평균 FVIII 활성(±SE)의 프로필.
도 7a 내지 도 7c. HemA 마우스 꼬리 정맥 절제 모델에서 단쇄 FVIII:Fc의 생체내 효율. (a) 단쇄 rFVIII:Fc 용량은 사각형으로 표시되어 있고, 처리된 rFVIII:Fc 용량은 원형으로 표시되어 있다. (b) 4.6㎍/㎏, 1.38㎍/㎏ 및 0.46㎍/㎏의 rFVIIIFc 또는 SC rFVIIIFc의 꼬리 정맥 절제 후 생존율(%). (c) 각각 rFVIIIFc 또는 SC rFVIIIFc의 4.6㎍/㎏(흑색 원형 또는 역삼각형), 1.38㎍/㎏(삼각형 또는 마름모꼴형) 및 0.46㎍/㎏(사각형 및 회색 원형)의 꼬리 정맥 절제 후 비출혈자(%).
도 8. 연구 설계. 도 8은 25IU/㎏(저용량 A 집단) 또는 65IU/㎏(고용량 B 집단)의 단일 정맥 투약 후 애드베이트(ADVATE)(등록 상표)와 비교하여 rFVIIIFc의 안전성 및 PK를 평가하기 위한 순차적 용량 증가 설계인 1/2a 상 연구의 연구 설계를 도시한 것이다.
도 9. 1단계(aPTT) 및 발색 검정에 의한 rFVIII 활성의 상관관계. 애드베이트(등록 상표)(◆) 및 rFVIIIFc(□)의 주사 후 FVIII 활성(IU/㎖)을 측정하는 1단계 응고(aPTT)와 발색 검정 결과 사이의 상관관계.
도 10a 내지 도 10b. 저용량 및 고용량 집단에 대한 그룹 평균 혈장 FVIII 활성 약물동태학적 프로필. (A) 25IU/㎏(저용량 집단, n=6); 및 (B) 65IU/㎏(고용량 집단, n=10[애드베이트(등록 상표)]; n=9[rFVIIIFc])에 대한 rFVIIIFc 또는 애드베이트(등록 상표)의 단일 정맥 주사 후 시간에 대한 혈장 FVIII 활성(1단계 aPTT 검정)의 곡선을 나타낸다. 제시된 결과는 그룹 평균±평균의 표준 오차(SEM)이다.
도 11a 내지 도 11b. 애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 주사 후 FVIII 활성의 t1/2 및 Cl에 미치는 VWF 항원 수준의 효과. VWF 항원 수준과, (a) 애드베이트(등록 상표)(R2=0.5415 및 p=0.0012) 및 rFVIIIFc(R2=0.5492 및 p=0.0016)의 중량 조정 Cl; 및 (b) 애드베이트(등록 상표)(R2=0.7923 및 p<0.0001) 및 rFVIIIFc(R2=0.6403 및 p=0.0003)의 t1/2 사이의 상관관계. 각각의 점은 각각의 피험체를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12b. 애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 주사 후 각각의 피험체에 대한 생체외 전혈 로템(Ex Vivo Whole Blood ROTEM)(등록 상표) 결과. 기재된 시점에서 (a) 25IU/㎏의 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc; 및 (b) 65IU/㎏의 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량에서 치료 전에 및 후에 피험체로부터 혈액을 샘플링하였다. 로템(등록 상표) 장치에서 Ca++에 의해 개시된 나템에 의해 응고 시간을 결정하였다. 제시된 결과는 각각의 개별 샘플에 대한 3회 채널 판독로부터의 평균±평균의 표준 오차(SEM)이다.
도 13a 내지 도 13b. 트롬빈 생성 검정(TGA)의 활성 비교. (a) SC rFVIIIFc는 내생 트롬빈 전위(ETP) 감소 및 (b) rFVIIIFc와 비교하여 피크 트롬빈 감소를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c: 실험실내 로템 데이터. 나이브 HemA 마우스로부터 얻은 풀에 있는 전혈에 스파이킹된 다양한 농도의 진타(XYNTHA), 애드베이트< 및 rFVIIIFc에 대한 로템(나템) 결과(평균±SD). (a). 평균 응고 시간(CT)(도 14a), (b). 혈전 형성 시간(CFT) 및 (c). 알파각.
도 15a 내지 도 15c. 생체외 로템 데이터. 투약 5분, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 후 50IU/㎏의 진타, 애드베이트 또는 rFVIIIFc의 단일 정맥 투여 후 HemA 마우스로부터의 로템(나템) 결과(평균±SD). (a). 평균 응고 시간(CT), (b). 혈전 형성 시간(CFT) 및 (c). 알파각.
도 16a 내지 도 16e: rFVIIIFc 및 단쇄(SC) rFVIIIFc와 vWF의 상호작용의 실시간 평가 및 vWF로부터 rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc의 트롬빈 매개 방출의 실시간 평가. (a). vWF에 대한 rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc 친화도의 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 분석. 결합 곡선 및 1:1 일치 상호작용 모델이 도시되어 있다. x축은 초의 시간을 나타내고, y축은 반응 단위(response unit: RU)의 반응을 나타낸다. (b). 25℃(상부) 및 37℃(하부)에서 활성화된 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 B 도메인 결핍 rFVIII 결여 Fc 모이어티(rBDD FVIII)의 트롬빈 매개 방출의 표준품 공제된 센소그램. x축은 초의 시간을 나타내고, y축은 반응 단위(RU)의 반응을 나타낸다. 각각의 라인은 상이한 α-트롬빈 농도에서의 반응을 나타낸다. 가장 위의 라인은 0U/㎖의 α-트롬빈에서의 반응이고, 각각의 후속하는 라인은 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.3, 2.5, 5, 10 및 20U/㎖의 α-트롬빈 농도의 순서로 진행된다. (c). 25℃(상부) 및 37℃(하부)에서 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 rBDD FVIII에 대한 트롬빈 매개 방출 단계의 이중 표준품 공제 센소그램. x축은 초의 시간을 나타내고, y축은 반응 단위(RU)의 반응을 나타낸다. 각각의 라인은 상이한 α-트롬빈 농도에서의 반응을 나타낸다. 가장 위의 라인은 0U/㎖의 α-트롬빈에서의 반응이고, 각각의 후속하는 라인은 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.3, 2.5, 5.0, 10 및 20U/㎖의 α-트롬빈 농도의 순서로 진행된다. (d). 25℃(상부) 및 37℃(하부)에서 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 rBDD FVIII에 대한 시간의 함수로서의 트롬빈 매개 방출률. x축은 초의 시간을 나타내고, y축은 반응 단위(RU)의 반응을 나타낸다. 각각의 라인은 상이한 α-트롬빈 농도에서의 반응을 나타낸다. 가장 위의 라인은 20U/㎖의 α-트롬빈에서의 반응이고, 각각의 후속하는 라인은 10, 5, 2.5, 1.3, 0.63, 0.31, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 및 0.005U/㎖의 α-트롬빈 농도의 순서로 진행된다. (e). 25℃(상부) 및 37℃(하부)에서 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 rBDD FVIII에 대한 트롬빈 농도의 함수로서의 피크 트롬빈 매개 방출률. EC50은 최대반 유효 농도이다. x축은 U/㎖ 단위의 α-트롬빈 농도이고, y축은 RU/초 단위의 최대 방출률이다.
도 2a 내지 도 2e. a 내지 b. rFVIIIFc(처리된 또는 단쇄)의 비환원 및 환원 SDS-PAGE 분석. c. LC/UV 및 LC/MS에 의해 분석된 rFVIIIFc 구조. d. 트롬빈 절단 후 rFVIIIFc의 전체 이온 전류(TIC) 크로마토그램(LC/MS 맵). 분해 주생성물이 표시되어 있다. e. rFVIIIFc 및 rBDDFVIII의 A2 도메인의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼. 트롬빈 절단 A2 도메인(S373 내지 R740) 및 2개의 절두 생성물인 S373 내지 Y729 및 S373 내지 E720에 상응하는 주생성물 및 이의 동족체 질량이 표시되어 있다.
도 3a 내지 도 3c. rFVIII-Fc의 생화학적 규명: a. 인지질 소포 농도의 함수로서의 X 인자의 활성화; b. FX 농도의 함수로서의 X 인자의 활성화. c. IXa 인자 농도의 함수로서의 X 인자의 활성화.
도 4. 활성화 C 단백질에 의한 절단 후 X 인자의 활성화.
도 5a 내지 도 5d. 시간에 대한 화합물에 의해 그룹화된 용량 수준(1단계 검정, 25IU/㎏(a) 또는 65IU/㎏(b); 및 발색 검정, 25IU/㎏(c) 또는 65IU/㎏(d))에 의해 분류된 시간에 대한 관찰된 그룹 평균 FVIII 활성(±SE)의 프로필.
도 6a 내지 도 6b. 시간에 대한 용량 수준 및 화합물에 의해 그룹화(1단계 검정(a) 또는 발색 검정(b))된 시간에 대한 관찰된 그룹 평균 FVIII 활성(±SE)의 프로필.
도 7a 내지 도 7c. HemA 마우스 꼬리 정맥 절제 모델에서 단쇄 FVIII:Fc의 생체내 효율. (a) 단쇄 rFVIII:Fc 용량은 사각형으로 표시되어 있고, 처리된 rFVIII:Fc 용량은 원형으로 표시되어 있다. (b) 4.6㎍/㎏, 1.38㎍/㎏ 및 0.46㎍/㎏의 rFVIIIFc 또는 SC rFVIIIFc의 꼬리 정맥 절제 후 생존율(%). (c) 각각 rFVIIIFc 또는 SC rFVIIIFc의 4.6㎍/㎏(흑색 원형 또는 역삼각형), 1.38㎍/㎏(삼각형 또는 마름모꼴형) 및 0.46㎍/㎏(사각형 및 회색 원형)의 꼬리 정맥 절제 후 비출혈자(%).
도 8. 연구 설계. 도 8은 25IU/㎏(저용량 A 집단) 또는 65IU/㎏(고용량 B 집단)의 단일 정맥 투약 후 애드베이트(ADVATE)(등록 상표)와 비교하여 rFVIIIFc의 안전성 및 PK를 평가하기 위한 순차적 용량 증가 설계인 1/2a 상 연구의 연구 설계를 도시한 것이다.
도 9. 1단계(aPTT) 및 발색 검정에 의한 rFVIII 활성의 상관관계. 애드베이트(등록 상표)(◆) 및 rFVIIIFc(□)의 주사 후 FVIII 활성(IU/㎖)을 측정하는 1단계 응고(aPTT)와 발색 검정 결과 사이의 상관관계.
도 10a 내지 도 10b. 저용량 및 고용량 집단에 대한 그룹 평균 혈장 FVIII 활성 약물동태학적 프로필. (A) 25IU/㎏(저용량 집단, n=6); 및 (B) 65IU/㎏(고용량 집단, n=10[애드베이트(등록 상표)]; n=9[rFVIIIFc])에 대한 rFVIIIFc 또는 애드베이트(등록 상표)의 단일 정맥 주사 후 시간에 대한 혈장 FVIII 활성(1단계 aPTT 검정)의 곡선을 나타낸다. 제시된 결과는 그룹 평균±평균의 표준 오차(SEM)이다.
도 11a 내지 도 11b. 애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 주사 후 FVIII 활성의 t1/2 및 Cl에 미치는 VWF 항원 수준의 효과. VWF 항원 수준과, (a) 애드베이트(등록 상표)(R2=0.5415 및 p=0.0012) 및 rFVIIIFc(R2=0.5492 및 p=0.0016)의 중량 조정 Cl; 및 (b) 애드베이트(등록 상표)(R2=0.7923 및 p<0.0001) 및 rFVIIIFc(R2=0.6403 및 p=0.0003)의 t1/2 사이의 상관관계. 각각의 점은 각각의 피험체를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12b. 애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 주사 후 각각의 피험체에 대한 생체외 전혈 로템(Ex Vivo Whole Blood ROTEM)(등록 상표) 결과. 기재된 시점에서 (a) 25IU/㎏의 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc; 및 (b) 65IU/㎏의 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량에서 치료 전에 및 후에 피험체로부터 혈액을 샘플링하였다. 로템(등록 상표) 장치에서 Ca++에 의해 개시된 나템에 의해 응고 시간을 결정하였다. 제시된 결과는 각각의 개별 샘플에 대한 3회 채널 판독로부터의 평균±평균의 표준 오차(SEM)이다.
도 13a 내지 도 13b. 트롬빈 생성 검정(TGA)의 활성 비교. (a) SC rFVIIIFc는 내생 트롬빈 전위(ETP) 감소 및 (b) rFVIIIFc와 비교하여 피크 트롬빈 감소를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c: 실험실내 로템 데이터. 나이브 HemA 마우스로부터 얻은 풀에 있는 전혈에 스파이킹된 다양한 농도의 진타(XYNTHA), 애드베이트< 및 rFVIIIFc에 대한 로템(나템) 결과(평균±SD). (a). 평균 응고 시간(CT)(도 14a), (b). 혈전 형성 시간(CFT) 및 (c). 알파각.
도 15a 내지 도 15c. 생체외 로템 데이터. 투약 5분, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 후 50IU/㎏의 진타, 애드베이트 또는 rFVIIIFc의 단일 정맥 투여 후 HemA 마우스로부터의 로템(나템) 결과(평균±SD). (a). 평균 응고 시간(CT), (b). 혈전 형성 시간(CFT) 및 (c). 알파각.
도 16a 내지 도 16e: rFVIIIFc 및 단쇄(SC) rFVIIIFc와 vWF의 상호작용의 실시간 평가 및 vWF로부터 rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc의 트롬빈 매개 방출의 실시간 평가. (a). vWF에 대한 rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc 친화도의 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 분석. 결합 곡선 및 1:1 일치 상호작용 모델이 도시되어 있다. x축은 초의 시간을 나타내고, y축은 반응 단위(response unit: RU)의 반응을 나타낸다. (b). 25℃(상부) 및 37℃(하부)에서 활성화된 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 B 도메인 결핍 rFVIII 결여 Fc 모이어티(rBDD FVIII)의 트롬빈 매개 방출의 표준품 공제된 센소그램. x축은 초의 시간을 나타내고, y축은 반응 단위(RU)의 반응을 나타낸다. 각각의 라인은 상이한 α-트롬빈 농도에서의 반응을 나타낸다. 가장 위의 라인은 0U/㎖의 α-트롬빈에서의 반응이고, 각각의 후속하는 라인은 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.3, 2.5, 5, 10 및 20U/㎖의 α-트롬빈 농도의 순서로 진행된다. (c). 25℃(상부) 및 37℃(하부)에서 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 rBDD FVIII에 대한 트롬빈 매개 방출 단계의 이중 표준품 공제 센소그램. x축은 초의 시간을 나타내고, y축은 반응 단위(RU)의 반응을 나타낸다. 각각의 라인은 상이한 α-트롬빈 농도에서의 반응을 나타낸다. 가장 위의 라인은 0U/㎖의 α-트롬빈에서의 반응이고, 각각의 후속하는 라인은 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.3, 2.5, 5.0, 10 및 20U/㎖의 α-트롬빈 농도의 순서로 진행된다. (d). 25℃(상부) 및 37℃(하부)에서 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 rBDD FVIII에 대한 시간의 함수로서의 트롬빈 매개 방출률. x축은 초의 시간을 나타내고, y축은 반응 단위(RU)의 반응을 나타낸다. 각각의 라인은 상이한 α-트롬빈 농도에서의 반응을 나타낸다. 가장 위의 라인은 20U/㎖의 α-트롬빈에서의 반응이고, 각각의 후속하는 라인은 10, 5, 2.5, 1.3, 0.63, 0.31, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 및 0.005U/㎖의 α-트롬빈 농도의 순서로 진행된다. (e). 25℃(상부) 및 37℃(하부)에서 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 rBDD FVIII에 대한 트롬빈 농도의 함수로서의 피크 트롬빈 매개 방출률. EC50은 최대반 유효 농도이다. x축은 U/㎖ 단위의 α-트롬빈 농도이고, y축은 RU/초 단위의 최대 방출률이다.
본 발명은 현재 공지된 VIII 인자 제품에 의해 가능한 것보다 긴 투약 간격 및/또는 높은 AUC를 이용하여 VIII 인자(처리된, 단쇄 또는 이의 조합)로 A형 혈우병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개선된 VIII 인자 키메라 폴리펩타이드 및 제조 방법을 제공한다.
A형 혈우병의 치료는 자발적인 출혈을 예방하기 위해 정상 수준의 1 내지 5%로의 FVIII 활성의 복원을 표적화하는 대체 치료에 의한다[Mannucci, P.M. et al., N. Engl. J. Med. 344:1773-9 (2001)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]. 출혈 삽화를 온디맨드식으로 치료하거나, 예방학적 치료에 의해 출혈 삽화의 발생을 예방하기 위해 이용 가능한 혈장 유래 및 재조합 FVIII 제품이 존재한다. 그러나, 이 제품의 짧은 반감기(8시간 내지 12시간)에 기초하여[White G.C., et al., Thromb. Haemost. 77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (suppl 1):94-99; discussion 100 (2003)], 치료 섭생은 예방의 경우 보통 주마다 2회 내지 3회 및 온디맨드식 치료의 경우 매일 1회 내지 3회의 빈번한 정맥 주사 투여를 요한다[Manco-Johnson, M.J., et al., N. Engl. J. Med. 357:535-544 (2007)(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]. 이러한 반복 투여는 통증스럽고 불편하다.
본 발명은 VIII 인자를 필요로 하는 인간 피험체(예를 들면, 인간 환자)에게 VIII 인자를 투여하는 방법으로서, 상기 피험체에게 치료학적 용량의 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드, 예를 들면 키메라 VIII 인자-Fc 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 하이브리드를 비-VIII 인자 부분이 없는(상기 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드), 예를 들면 Fc 부분이 없는 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배 긴 투약 간격으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 VIII 인자를 필요로 하는 인간 피험체에서 VIII 인자 투여의 투약 간격을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
투약 간격은 비-VIII 인자 부분이 없는(상기 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드), 예를 들면 Fc 부분이 없는 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배 내지 6배 길거나, 1½배 내지 5배 길거나, 1½배 내지 4배 길거나, 1½배 내지 3배 길거나, 1½배 내지 2배 길 수 있다. 투약 간격은 비-VIII 인자 부분이 없는(상기 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드), 예를 들면 Fc 부분이 없는 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배, 2배, 2½배, 3배, 3½배, 4배, 4½배, 5배, 5½배 또는 6배 길 수 있다. 투약 간격은 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 또는 더 긴 기간마다일 수 있다.
투약 간격은 적어도 약 1½일 내지 5일, 1½일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 또는 더 긴 기간일 수 있다.
본 발명은 또한 VIII 인자를 필요로 하는 피험체에게 VIII 인자를 투여하는 방법으로서, 치료학적 용량의 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드, 예를 들면 키메라 VIII 인자-Fc 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 하이브리드를 상기 피험체에게 투여하여 비-VIII 인자 부분이 없는(상기 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드), 예를 들면 Fc 부분이 없는 상기 VIII 인자의 등가 용량에 의해 얻은 시간 대 혈장농도곡선하 면적(AUC)보다 적어도 약 1¼배 높은 AUC를 얻는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 VIII 인자를 필요로 하는 인간 환자에서 VIII 인자 활성의 AUC를 증가시키거나 연장시키는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 VIII 인자를 필요로 하는 피험체에게 VIII 인자를 투여하는 방법으로서, 상기 피험체에게 VIII 인자 및 Fc를 포함하는 치료학적 용량의 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 하이브리드를 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 또는 더 긴 기간마다의 투약 간격으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
예방학적 치료 또는 온디맨드식 치료를 필요로 하는 피험체에서 본 발명의 방법을 실행할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "투여하는"은 약제학적으로 허용되는 경로를 통해 피험체에게 본 발명의 약제학적으로 허용되는 VIII 인자 폴리펩타이드를 제공하는 것을 의미한다. 투여 경로는 정맥, 예를 들면 정맥 주사 및 정맥 점적일 수 있다. 추가의 투여 경로는 예를 들면 피하, 근육내, 경구, 비강 및 폐 투여를 포함한다. 키메라 폴리펩타이드 및 하이브리드 단백질을 적어도 1종의 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서 투여할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "시간 대 혈장농도곡선하 면적(AUC)"은 약리학의 분야의 용어와 동일하고, 투여 후 VIII 인자의 흡수율 및 흡수 정도에 기초한다. 곡선 기울기에 기초하여 외삽을 이용하여 기재된 기간, 예컨대 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 72시간에 걸쳐 또는 무한대로 AUC를 결정한다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않은 한, 무한대로 AUC를 결정한다. 평균을 계산한 단일 피험체 또는 피험체 집단에서 AUC의 결정을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 VIII 인자의 "B 도메인"은 전장 인간 VIII 인자의 Ser741-Arg1648 잔기와 같은 내부 아미노산 서열 동일성 및 트롬빈에 의한 단백질분해 절단 자리에 의해 정의된 당해 분야에서 공지된 B 도메인과 동일하다. 다른 인간 VIII 인자 도메인은 A1, Ala1-Arg372 잔기; A2, Ser373-Arg740 잔기; A3, Ser1690-Ile2032 잔기; C1, Arg2033-Asn2172 잔기; C2, Ser2173-Tyr2332 잔기의 아미노산 잔기에 의해 정의된다. A3-C1-C2 서열은 Ser1690-Tyr2332 잔기를 포함한다. Glu1649-Arg1689 잔기인 남은 서열은 일반적으로 VIII 인자 경쇄 활성화 펩타이드라 칭한다. 돼지, 마우스 및 개과 VIII 인자에 대한 B 도메인을 포함하는 모든 도메인에 대한 경계 위치가 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 일 실시양태에서, VIII 인자의 B 도메인이 결핍된다("B 도메인 결핍 VIII 인자" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 예는 표 2A(ⅰ)에서의 서열의 VIII 인자 부분과 동일한 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1457번 또는 20번 내지 1457번 아미노산)을 갖는 레팍토(REFACTO)(등록 상표)(재조합 BDD FVIII)이다. 다른 실시양태에서, B 도메인 결핍 VIII 인자는 서열 번호 2의 773번 아르기닌 잔기에 상응하는 B 도메인 결핍 VIII 인자의 754번 잔기 또는 서열 번호 6의 1667번 아르기닌 잔기에 상응하는 전장 VIII 인자의 1648번 잔기에서의 아르기닌에 상응하는 온전한 세포내 처리 자리를 포함한다. 임의의 서열 번호 숫자를 언급함이 없이 본 명세서에서 사용되는 서열 잔기 숫자는 달리 언급되지 않은 한 신호 펩타이드 서열 없는 VIII 인자 서열(19개의 아미노산)에 상응한다. 예를 들면, 전장 VIII 인자의 S743/Q1638은 19개의 아미노산 신호 펩타이드 서열로 인해 서열 번호 6의 S762/Q1657에 상응한다. 다른 실시양태에서, B 도메인 결핍 FVIII는 전장 VIII 인자에서 1645번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이, 1648번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이 또는 1645번 및 1648번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 1645번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 1648번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 아미노산과 다른 아미노산이다. 특정한 양태에서, 치환 또는 돌연변이는 아르기닌 이외의 아미노산, 예를 들면 알라닌이다.
"B 도메인 결핍 VIII 인자"는 미국 특허 제6,316,226호, 제6,346,513호, 제7,041,635호, 제5,789,203호, 제6,060,447호, 제5,595,886호, 제6,228,620호, 제5,972,885호, 제6,048,720호, 제5,543,502호, 제5,610,278호, 제5,171,844호, 제5,112,950호, 제4,868,112호 및 제6,458,563호(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 개시된 완전 또는 부분 결실을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 B 도메인 결핍 VIII 인자 서열은 미국 특허 제6,316,226호(또한 US 제6,346,513호)의 4행 4줄 내지 5행 28줄 및 실시예 1 내지 실시예 5에 개시된 임의의 하나의 결실을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 B 도메인 결핍 VIII 인자는 특허 제5,789,203호(또한 US 제6,060,447호, US 제5,595,886호 및 US 제6,228,620호)의 2행 26줄 내지 51줄 및 실시예 5 내지 실시예 8에 개시된 결실을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, B 도메인 결핍 VIII 인자는 미국 특허 제5,972,885호의 1행 25줄 내지 2행 40줄; 미국 특허 제6,048,720호의 6행 1줄 내지 22줄 및 실시예 1; 미국 특허 제5,543,502호의 2행 17줄 내지 46줄; 미국 특허 제5,171,844호의 4행 22줄 내지 5행 36줄; 미국 특허 제5,112,950호의 2행, 55줄 내지 68줄, 도 2 및 실시예 1; 미국 특허 제4,868,112호의 2행 2줄 내지 19행 21줄 및 표 2; 미국 특허 제041,635호의 2행 1줄 내지 3행 19줄, 3행 40줄 내지 4행 67줄, 7행 43줄 내지 8행 26줄 및 11행 5줄 내지 13행 39줄; 또는 미국 특허 제6,458,563호의 4행 25줄 내지 53줄에 기재된 결실을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, B 도메인 결핍 VIII 인자는 대부분의 B 도메인의 결실을 갖지만, 여전히 WO 제91/09122호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 개시된 바대로 2개의 폴리펩타이드 사슬(즉, 세포내 처리 자리)로의 1차 번역 생성물의 생체내 단백질분해 처리에 필수적인 B 도메인의 아미노 말단 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, B 도메인 결핍 VIII 인자는 747번 내지 1638번 아미노산의 결실, 즉 B 도메인의 실질적인 완전 결실로 구성된다. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨). B 도메인 결핍 VIII 인자는 또한 VIII 인자의 771번 내지 1666번 아미노산 또는 868번 내지 1562번 아미노산의 결실을 포함할 수 있다[Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]. 본 발명의 일부인 추가의 B 도메인 결실은 예를 들면 982번 내지 1562번 또는 760번 내지 1639번[Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5939-5942 (1986)], 797번 내지 1562번[Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)], 741번 내지 1646 번(Kaufman(PCT 공개 출원 WO 제87/04187호)), 747번 내지 1560번[Sarver et al., DNA 6:553-564 (1987)], 741번 내지 1648번(Pasek(PCT 출원 제88/00831호)), 816번 내지 1598번 또는 741번 내지 1689번[Lagner(Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 제295597호)](이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 아미노산의 결실을 포함한다. 임의의 VIII 인자 서열에서 각각의 상기 결실이 만들어 질 수 있다.
일 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드 내의 B 도메인 결핍 VIII 인자 부분은 중쇄(A1-A2-부분 B)를 포함하는 제1 사슬 및 경쇄(A3-C1-C2)를 포함하는 제2 사슬인 금속 결합에 의해 연결된(또는 회합된) 2개의 사슬로 처리된다. 다른 실시양태에서, B 도메인 결핍 VIII 인자 부분은 단쇄 VIII 인자이다. 단쇄 VIII 인자는 B 도메인 결핍 VIII 인자의 754번 잔기(서열 번호 2의 773번 잔기) 또는 전장 VIII 인자의 1648번 잔기(서열 번호 6의 1657번 잔기)에서의 아르기닌에 상응하는 세포내 처리 자리를 포함할 수 있다.
중쇄와 경쇄 사이의 금속 결합은 당해 분야에 공지된 임의의 금속일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 유용한 금속은 2가 금속 이온일 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 회합하기 위해 사용될 수 있는 금속은 Ca2+, Mn2+ 또는 Cu2+를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다[Fatouros et al., Intern. J. Pharm. 155(1): 121-131 (1997); Wakabayashi et al., JBC. 279(13): 12677-12684 (2004)].
본 명세서에서 사용되는 "키메라 폴리펩타이드"는 상이한 공급원으로부터 적어도 2개의 폴리펩타이드(또는 하위서열 또는 펩타이드)를 내부에 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 키메라 폴리펩타이드는 상이한 공급원, 예컨대 상이한 유전자, 상이한 cDNA, 또는 상이한 동물 또는 다른 종으로부터 예를 들면 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 키메라 폴리펩타이드는 예를 들면 상이한 하위서열을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 따라서, 하위서열은 직접적으로 연결될 수 있거나, 단일 키메라 폴리펩타이드 내에 간접적으로, 링커를 통해 또는 둘 다에 의해 연결될 수 있다. 키메라 폴리펩타이드는 단백질 정제 또는 검출을 돕는 예를 들면 신호 서열과 같은 추가의 펩타이드 및 6His 및 FLAG와 같은 서열을 포함할 수 있다. 또한, 키메라 폴리펩타이드는 N 및/또는 C 말단에 대한 아미노산 또는 펩타이드 부가를 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드는 VIII 인자 부분 및 비-VIII 인자 부분을 포함한다. 예시적인 비-VIII 인자 부분은 예를 들면 Fc, XTEN, 알부민, PAS 서열, 트랜스페린, CTP(4 O-글라이칸을 갖는 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)의 28개의 아미노산 C 말단 펩타이드(CTP)), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 알부민 결합 폴리펩타이드 및 알부민 결합 소분자를 포함한다. 예시적인 본 발명의 키메라 폴리펩타이드는 예를 들면, 키메라 VIII 인자-Fc 폴리펩타이드, 키메라 VIII 인자-XTEN 폴리펩타이드, 키메라 VIII 인자-알부민 폴리펩타이드, 키메라 VIII 인자-PAS 폴리펩타이드, 키메라 VIII 인자-트랜스페린 폴리펩타이드, 키메라 VIII 인자-CTP 폴리펩타이드, 키메라 VIII 인자-PEG 폴리펩타이드, 키메라 VIII 인자-HES 폴리펩타이드, 키메라 VIII 인자-알부민 결합 폴리펩타이드 폴리펩타이드 및 키메라 VIII 인자-알부민 결합 소분자 폴리펩타이드를 포함한다.
예시적인 키메라 VIII 인자-Fc 폴리펩타이드는 예를 들면 이의 신호 서열과 함께 또는 이것 없이 서열 번호 2 또는 서열 번호 6(표 2) 및 서열 번호 4의 키메라 Fc 폴리펩타이드(표 2)를 포함한다.
키메라 폴리펩타이드는 신호 서열 없이 표 2A(ⅰ)에 기재된 VIII 인자 및 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1684번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일하거나 신호 서열 없이 표 2A(ⅰ)에 기재된 VIII 인자 및 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1684번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함할 수 있고, 서열은 VIII 인자 활성을 갖는다. 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated Partial Thromboplastin Time: aPPT) 검정, 발색 검정 또는 다른 공지된 방법에 의해 VIII 인자 활성을 측정할 수 있다. 키메라 폴리펩타이드는 신호 서열 없이 표 2A(ⅰ)에 기재된 VIII 인자 및 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1684번 아미노산)과 동일하거나 신호 서열 없이 표 2A(ⅰ)에 기재된 VIII 인자 및 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1684번 아미노산)과 동일한 서열을 포함할 수 있다.
상기 기재된 바대로, 예시적인 키메라 폴리펩타이드는 하나 이상의 XTEN 폴리펩타이드에 융합된 VIII 인자를 포함한다. Schellenburger et al., Nat. Biotech. 27:1186-90 (2009)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨). XTEN 폴리펩타이드는 FVIII의 N 말단 끝 또는 FVIII의 C 말단 끝에 융합될 수 있다. XTEN 부분과 VIII 인자 부분 사이에 프로테아제 자리가 포함되어 이러한 처리가 허용될 수 있다. XTEN 폴리펩타이드는 예를 들면 WO 제2009/023270호, WO 제2010/091122호, WO 제2007/103515호, US 제2010/0189682호 및 US 제2009/0092582호(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 개시된 것을 포함한다.
상기 기재된 바대로, 예시적인 키메라 폴리펩타이드는 또한 1종 이상의 알부민 폴리펩타이드, 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 알부민 결합 소분자에 융합된 VIII 인자를 포함한다. 일 실시양태에서, 알부민은 인간 알부민이다. 알부민 또는 알부민 결합 단백질은 FVIII의 N 말단 끝 또는 FVIII의 C 말단 끝에 융합될 수 있거나, FVIII에서 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 알부민, 예를 들면 이의 단편의 예가 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제7,592,010호; 미국 특허 제6,686,179호; 및 Schulte, Thrombosis Res. 124 Suppl. 2:S6-S8 (2009)(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨).
알부민 결합 폴리펩타이드는, 제한함이 없이, 알부민에 결합할 수 있는, 박테리아 알부민 결합 도메인, 알부민 결합 펩타이드 또는 알부민 결합 항체 단편을 포함할 수 있다. 문헌[Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) 및 Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)]에 개시된 바와 같은 스트렙토코커스 단백질 G로부터의 도메인 3은 박테리아 알부민 결합 도메인의 예이다. 알부민 결합 펩타이드의 예는 코어 서열 DICLPRWGCLW(서열 번호 7)를 갖는 일련의 펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 문헌[Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)]을 참조한다. 알부민 결합 항체 단편의 예는 문헌[Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Rooverset et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), 및 Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]에 개시되어 있다.
특정한 양태에서, 본 발명의 재조합 FVIII 폴리펩타이드는 이의 알부민에 결합할 수 있는 비폴리펩타이드 소분자, 변이체 또는 유도체에 대한 적어도 1의 부착 자리를 포함한다. 이러한 알부민 결합 모이어티의 예는 문헌[Trusselet et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)]에 개시된 바대로 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-요오도페닐)부탄아미도)헥사노에이트("Albu" 태그)이다.
상기 기재된 바대로, 예시적인 키메라 폴리펩타이드는 또한 인간 융모성 고나도트로핀 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 C 말단 펩타이드(CTP)의 적어도 1개의 β 서브유닛에 융합된 VIII 인자를 포함한다. CTP는 VIII 인자에 FVIII N 말단 끝 또는 FVIII의 C 말단 끝에 융합될 수 있거나, FVIII에서 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 재조합 단백질에 융합되거나 삽입된 1개 이상의 CTP 펩타이드는 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,712,122호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다. 예시적인 CTP 펩타이드는 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(서열 번호 8) 또는 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(서열 번호 9)를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제US 2009/0087411 A1호(참조문헌으로 포함됨)를 참조한다.
상기 기재된 바대로, 예시적인 키메라 폴리펩타이드는 또한 적어도 1개의 PAS 서열 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 융합된 VIII 인자를 포함한다. PAS 서열은 FVIII의 N 말단 끝 또는 FVIII의 C 말단 끝에 융합될 수 있거나, FVIII에서 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 PAS 펩타이드 또는 PAS 서열은 알라닌 및 세린 잔기를 주로 포함하거나 알라닌, 세린 및 프롤린 잔기를 주로 포함하는 아미노산 서열을 의미하고, 이 아미노산 서열은 생리학적 상태 하에 랜덤 코일 입체형태를 형성한다. 따라서, PAS 서열은 키메라 단백질에서 비상동성 모이어티의 일부로서 사용될 수 있는 알라닌, 세린 및 프롤린을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 빌딩 블록, 아미노산 중합체 또는 서열 카세트이다. 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 잔기가 PAS 서열에서 부성분으로서 첨가될 때, 아미노산 중합체는 또한 랜덤 코일 입체형태를 형성할 수 있다. "부성분"이란 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 아미노산이 예를 들면 아미노산의 약 12%(즉, PAS 서열의 약 12개 내지 100개의 아미노산), 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 즉 약 2% 또는 약 1%까지의 특정 정도로 PAS 서열에 첨가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린 및 프롤린과 다른 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생리학적 상태 하에, PAS 펩타이드는 랜덤 코일 입체형태를 형성하여 본 발명의 재조합 단백질에 대한 증가된 생체내 및/또는 실험실내 안정성을 중재할 수 있고, 응혈원 활성을 갖는다.
PAS 펩타이드의 비제한적인 예는 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(서열 번호 10), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(서열 번호 11), APSSPSPSAPSSPSPASPSS(서열 번호 12), APSSPSPSAPSSPSPASPS(서열 번호 13), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(서열 번호 14), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(서열 번호 15), ASAAAPAAASAAASAPSAAA(서열 번호 16) 또는 이의 임의의 변이체, 유도체, 단편 또는 조합을 포함한다. PAS 서열의 추가의 예는 예를 들면 미국 특허 공보 제2010/0292130호 A1 및 PCT 출원 공보 WO 제2008/155134 A1호, 유럽 등록 특허 제EP2173890호로부터 공지되어 있다.
상기 기재된 바대로, 예시적인 키메라 폴리펩타이드는 또한 적어도 1개의 트랜스페린 펩타이드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에 융합된 VIII 인자를 포함한다. 적어도 1개의 트랜스페린 펩타이드는 FVIII의 N 말단 끝 또는 FVIII의 C 말단 끝에 융합될 수 있거나, FVIII에서 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 임의의 트랜스페린은 본 발명의 재조합 FVIII 단백질로 융합되거나 삽입될 수 있다. 예로서, 야생형 인간 Tf(Tf)는 유전자 중복으로부터 생기는 것으로 보이는 N(약 330개의 아미노산) 및 C(약 340개의 아미노산)의 2개의 주요 도메인을 갖는 대략 75KDa(글라이코실화의 원인이 아님)의 679개의 아미노산 단백질이다. 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 및 S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)(이들 모두 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함된다)를 참조한다.
트랜스페린은 트랜스페린 수용체(TfR) 매개 엔도사이토시스를 통해 철을 수송한다. 철이 엔도솜 구획으로 방출되고 Tf-TfR 복합체가 세포 표면으로 재순환된 후, Tf는 다음의 철 수송 사이클을 위해 세포외 공간으로 다시 방출된다. Tf는 14일 내지 17일을 넘는 긴 반감기를 보유한다[Li et al., Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002)]. 반감기 연장, 암 치료에 대한 표적화된 전달, 경구 전달 및 지속적인 프로인슐린 활성화에 대해 트랜스페린 융합 단백질이 연구되었다[Brandsma et al., Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011); Bai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005); Kim et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010); Wang et al., J. Controlled Release 155:386-392 (2011)].
상기 기재된 바대로, 예시적인 키메라 폴리펩타이드는 또한 적어도 1개의 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 모이어티에 융합된 VIII 인자를 포함한다.
PEG화 FVIII는 FVIII와 적어도 1개의 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 분자 사이에 형성된 접합체를 의미할 수 있다. PEG는 매우 다양한 분자량 및 평균 분자량 범위로 상업적으로 구입 가능하다. PEG 평균 분자량 범위의 통상적인 예는 약 200, 약 300, 약 400, 약 600, 약 1000, 약 1300 내지 1600, 약 1450, 약 2000, 약 3000, 약 3000 내지 3750, 약 3350, 약 3000 내지 7000, 약 3500 내지 4500, 약 5000 내지 7000, 약 7000 내지 9000, 약 8000, 약 10000, 약 8500 내지 11500, 약 16000 내지 24000, 약 35000, 약 40000, 약 60000 및 약 80000달톤을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 평균 분자량은 단지 예로서 제공되고, 임의의 방식으로 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 재조합 FVIII 단백질은 페길화되어 모노- 또는 폴리-(예를 들면, 2개 내지 4개의) PEG 모이어티를 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 PEG화 반응에 의해 PEG화를 수행할 수 있다. 페길화 단백질 생성물을 제조하는 방법은 일반적으로 (ⅰ) 본 발명의 펩타이드가 1개 이상의 PEG 기에 부착되는 상태 하에 폴리펩타이드를 폴리에틸렌 글라이콜(예컨대, PEG의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체)과 반응시키는 것; 및 (ⅱ) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함한다. 일반적으로, 공지된 매개변수 및 원하는 결과에 기초하여 사례별로 반응에 대한 최적 반응 상태를 결정한다.
Malik F et al., Exp. Hematol. 20:1028-35 (1992); Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); 유럽 특허 공보 제EP0401384호, 제EP0154316호 및 제EP0401384호; 및 국제 특허 출원 공보 제WO92/16221호 및 제WO95/34326호와 같은 당해 분야의 당업자에게 이용 가능한 다수의 PEG 부착 방법이 있다. 비제한적인 예로서, FVIII 변이체는 FVIII에서 1개 이상의 삽입 자리에서 시스테인 치환을 포함할 수 있고, 시스테인은 PEG 중합체로 추가로 접합될 수 있다. 문헌[Mei et al., Blood 116:270-279 (2010)] 및 미국 특허 제7,632,921호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다.
상기 기재된 바대로, 예시적인 키메라 폴리펩타이드는 또한 적어도 1개의 하이드록시에틸 전분(HES) 중합체에 융합된 VIII 인자를 포함한다. HES는 천연 아밀로펙틴의 유도체이고, 체내에서 알파-아밀라제에 의해 분해된다. HES는 유리한 생물학적 특성을 나타내고, 클리닉에서 혈액 용적 대체 물질로서 및 혈액희석 치료에서 사용된다. 예를 들면 문헌[Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987); 및 Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res. 41: 494-498 (1991)]을 참조한다.
HES는 분자량 분포 및 치환도를 주로 특징으로 한다. HES는 1 내지 300kD, 2 내지 200kD, 3 내지 100kD 또는 4 내지 70kD의 평균 분자량(중량 평균)을 갖는다. 하이드록시에틸 전분은 0.1 내지 3, 0.1 내지 2, 0.1 내지 0.9 또는 0.1 내지 0.8의 몰 치환도, 및 하이드록시에틸 기와 관련하여 2 내지 20의 범위의 C2:C6 치환 사이의 비율을 추가로 나타낼 수 있다. 평균 분자량이 약 130kD인 HES는 프레제니우스(Fresenius)사의 볼루벤(Voluven)(등록 상표)이다. 볼루벤(등록 상표)은 예를 들면 저혈량증의 치료 및 예방을 위한 치료학적 적응증에서 사용되는 용적 대체에 이용된 인공 콜로이드이다. 상기 기재된 동일한 PEG 부착 방법과 같은 당해 분야의 당업자에게 이용 가능한 다수의 HES 부착 방법이 존재한다.
몇몇 실시양태에서, VIII 인자 부분을 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 비-VIII 인자 부분이 없는 동일한 VIII 인자 부분으로 이루어진 폴리펩타이드에 비해 반감기(t1/2)가 증가한다. t1/2가 증가된 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드를 본 명세서에서 지속성 VIII 인자라 칭할 수 있다. 지속성 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드는 예를 들면 Fc에 융합된 VIII 인자(예를 들면, 하이브리드, 예컨대 FVIIIFc 단량체 이합체 하이브리드 형태의 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드 포함; 실시예 1, 도 1 및 표 2A 참조; 및 미국 특허 제7,404,956호 및 제7,348,004호 참조), XTEN에 융합된 VIII 인자 및 알부민에 융합된 VIII 인자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "배양", "배양한다" 및 "배양하는"은 세포 성장 또는 분열을 허용하거나 세포를 살아 있는 상태로 유지시키는 실험실내 상태 하에 세포를 항온처리하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "배양된 세포"는 실험실내 증식하는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "VIII 인자"는 달리 언급되지 않은 한 응고에서 이의 정상 역할을 하는 기능적 VIII 인자 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 용어 VIII 인자는 기능적인 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. VIII 인자 단백질은 인간, 돼지, 개과 및 쥣과 VIII 인자 단백질일 수 있다. 배경 기술 섹션에 기재된 바대로, 많은 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형 버전에서와 같이 전장 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열이 공지되어 있다. 인간 VIII 인자 서열의 예는 서열 번호 2 또는 서열 번호 6에서 하위서열로 기재되어 있다(표 2). VIII 인자 폴리펩타이드는 예를 들면 전장 VIII 인자, N 말단에서의 Met를 갖지 않는 전장 VIII 인자, 성숙 VIII 인자(신호 서열을 갖지 않음), N 말단에서의 추가의 Met를 갖는 성숙 VIII 인자 및/또는 B 도메인의 완전 또는 부분 결실을 갖는 VIII 인자를 포함한다. VIII 인자 변이체는 부분 또는 완전 결실이든 B 도메인 결실을 포함한다.
상기 및 하기 기재된 것처럼, 매우 많은 기능적 VIII 인자 변이체가 공지되어 있다. 또한, 혈우병 환자에서 VIII 인자에서의 수백개의 비기능적 돌연변이가 확인되었고, VIII 인자 기능에 미치는 이 돌연변이의 효과는 치환 성질보다는 VIII 인자의 3차원 구조 내 어디 있는지에 따라 더 달라지는 것으로 결정되었다[Cutler et al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]. 또한, 인간 및 다른 종으로부터의 VIII 인자 사이의 비교는 기능에 더 필요할 것 같은 보존된 잔기를 확인하였다[Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 제6,251,632호; US 제6,251,632호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)].
인간 VIII 인자 유전자는 포유동물 세포에서 단리되고 발현되며[Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 제87/04187호; WO 제88/08035호; WO 제88/03558호; 미국 특허 제4,757,006호(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨], 아미노산 서열은 cDNA로부터 추론되었다. 카폰(Capon) 등의 미국 특허 제4,965,199호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)은 포유동물 숙주 세포에서 VIII 인자를 제조하기 위한 재조합 DNA 방법 및 인간 VIII 인자의 정제를 개시한다. CHO(Chinese hamster ovary: 중국 햄스터 난소) 세포 및 BHKC(baby hamster kidney cell: 베이비 햄스터 신장 세포)에서의 인간 VIII 인자 발현이 보고되었다. 인간 VIII 인자는 B 도메인의 일부 또는 전부를 결실시키도록 변형되고(미국 특허 제4,994,371호 및 제4,868,112호(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)), 인간 V 인자 B 도메인에 의한 인간 VIII 인자 B 도메인의 대체를 수행하였다(미국 특허 제5,004,803호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)). 인간 VIII 인자를 코딩하는 cDNA 서열 및 예상된 아미노산 서열은 각각 미국 출원 공보 제2005/0100990호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)의 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재되어 있다.
미국 특허 제5,859,204호(Lollar, J. S.)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)는 감소된 항원성 및 감소된 면역반응성을 갖는 VIII 인자의 기능적 돌연변이체를 보고하고 있다. 미국 특허 제6,376,463호(Lollar, J. S.)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)는 또한 감소된 면역반응성을 갖는 VIII 인자의 돌연변이체를 보고하고 있다. 미국 출원 공보 제2005/0100990호(Saenko 등)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)는 VIII 인자의 A2 도메인에서 기능적 돌연변이를 보고하고 있다.
B 도메인 결실을 포함하는 다수의 기능적 VIII 인자 분자가 US 제6,316,226 및 US 제6,346,513호(둘 다 박스터(Baxter)에 양도); US 제7,041,635호(인투젠(In2Gen)에 양도); US 제5,789,203호, US 제6,060,447호, US 제5,595,886호 및 US 제6,228,620호(키론(Chiron)에 양도); US 제5,972,885호 및 US 제6,048,720호(바이오비트룸(Biovitrum)에 양도), US 제5,543,502호 및 US 제5,610,278호(노보 노르디스크(Novo Nordisk)에 양도); US 제5,171,844호(이뮤노 아게(Immuno Ag)에 양도); US 제5,112,950호(트랜스진 에스.에이.(Transgene S.A.)에 양도); US 제4,868,112호(제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)에 양도)(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)의 특허에 개시되어 있다.
돼지 VIII 인자 서열은 공개되어 있고(Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986))(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨), 돼지 비장 cDNA 라이브러리로부터 VIII 인자 서열의 PCR 증폭으로부터 얻은 완전 돼지 cDNA 서열이 보고되어 있다[Healey, J. F. et al., Blood 88:4209-4214 (1996)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]. 모든 도메인, 모든 하부단위 및 특이적 아미노산 서열의 치환을 갖는 하이브리드 인간/돼지 VIII 인자가 미국 특허 제5,364,771호(Lollar 및 Runge) 및 WO 제93/20093호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다. 더 최근에는, 뉴클레오타이드 및 돼지 VIII 인자의 A1 및 A2 도메인의 상응하는 아미노산 서열 및 돼지 A1 및/또는 A2 도메인이 상응하는 인간 도메인으로 치환된 키메라 VIII 인자가 WO 제94/11503호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 보고되어 있다. 미국 특허 제5,859,204호(Lollar, J. S.)는 또한 돼지 cDNA 및 추론된 아미노산 서열을 개시한다. 에모리(Emory)에 양도된 미국 특허 제6,458,563호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)는 B 도메인 결핍 돼지 VIII 인자를 개시한다.
VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1457번 아미노산; 및 서열 번호 6의 20번 내지 2351번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일할 수 있고, 상기 VIII 인자 부분은 VIII 인자 활성을 갖는다. VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 20번 내지 1457번 아미노산; 및 서열 번호 6의 20번 내지 2351번 아미노산)과 동일할 수 있다.
VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1457번 아미노산 및 서열 번호 6의 1번 내지 2351번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일할 수 있고, 상기 VIII 인자 부분은 VIII 인자 활성을 갖는다. VIII 인자(또는 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분)는 신호 서열 없이 표 2에 기재된 VIII 인자 아미노산 서열(서열 번호 2의 1번 내지 1457번 아미노산 및 서열 번호 6의 1번 내지 2351번 아미노산)과 동일할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "등가 용량"은 당해 폴리펩타이드의 분자량과 무관한 국제 단위로 표시되는 VIII 인자 활성의 동일 용량을 의미한다. VIII 인자 활성의 1 국제 단위(IU)는 대략 정상 인간 혈장의 1밀리리터에서의 VIII 인자의 분량에 해당한다. 유럽 약전 발색 기질 검정 및 1단계 응고 검정을 비롯한 VIII 인자 활성을 측정하기 위한 여러 검정이 이용 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 "Fc"는 달리 언급되지 않은 한 기능적 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 파트너를 의미한다. FcRn 결합 파트너는 FcRn 결합 파트너의 FcRn 수용체에 의한 결과에 따른 활성 수송을 갖는 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 분자이다. 따라서, 용어 Fc는 기능적인 IgG Fc의 임의의 변이체를 포함한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X선 결정학[Burmeister et al., Nature 372:379 (1994)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]에 기초하여 기재되어 있다. Fc와 FcRn과의 주요 접촉 면적은 CH2 및 CH3 도메인의 연접 주위에 있다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 파트너는 예를 들면 FcRn의 완전 결합 영역을 포함하는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편 및 IgG의 다른 단편을 포하한다. 주요 접촉 자리는 CH2 도메인의 248번, 250번 내지 257번, 272번, 285번, 288번, 290번 내지 291번, 308번 내지 311번 및 314번 아미노산 잔기 및 CH3 도메인의 385번 내지 387번, 428번 및 433번 내지 436번 아미노산 잔기를 포함한다. 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편 또는 영역의 아미노산 넘버링과 관련한 참조문헌은 모두 문헌[Kabat et al. 1991, 면역학적 관심 대상의 단백질 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest), 미국 메릴랜드주 베데스다에 소재하는 미국 보건부(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]에 기초한다. (FcRn 수용체는 인간을 비롯한 여러 포유동물 종으로부터 단리된다. 인간 FcRn, 래트 FcRn 및 마우스 FcRn의 서열이 공지되어 있다[Story et al., J. Exp. Med. 180: 2377 (1994)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]). Fc는 면역글로불린의 힌지 영역 없이 또는 이와 함께 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 Fc 변이체는 WO 제2004/101740호 및 WO 제2006/074199호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 제공된다.
Fc(또는 키메라 폴리펩타이드의 Fc 부분)는 1 이상의 돌연변이 및 돌연변이의 조합을 포함할 수 있다. Fc(또는 키메라 폴리펩타이드의 Fc 부분)는 문헌[Oganesyan et al., Mol. Immunol. 46:1750 (2009){본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]에 개시된 M252Y, S254T, T256E 및 이의 조합; 문헌[Vaccaro et al., Nat. Biotechnol. 23:1283 (2005)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]에 개시된 H433K, N434F 및 이의 조합; US 제2009/0264627호 A1(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)의 [0012] 문단 1쪽 내지 2쪽 및 실시예 9 및 10에 개시된 돌연변이체; 및 US 제20090163699호 A1(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)의 [0014] 내지 [0021] 문단 2쪽에 개시된 돌연변이체와 같은 증가된 반감기를 부여하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
Fc(또는 키메라 폴리펩타이드의 Fc 부분)는 또한 예를 들면 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 자리 지정 돌연변이유발 등과 같은 완전히 인식된 절차에 따라 IgG의 Fc 영역을 변형하여 FcRn에 의해 결합된 변형된 IgG 또는 Fc 단편 또는 이의 부분을 생성할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면 FcRn 접촉 자리로부터 먼 변형 및 FcRn에 대한 결합을 보존하거나 심지어 증대시키는 결합 자리 내의 변형을 포함한다. 예를 들면, 인간 IgG1 Fc(Fcy1) 내의 하기 단일 아미노산 잔기는 상당한 Fc 결합 친화도 손실 없이 FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A 및 K447A에 대해 치환될 수 있고, 예를 들면 P238A는 238번 위치에서 알라닌에 의해 치환된 야생형 프롤린을 나타낸다. 알라닌 이외에, 다른 아미노산이 상기 기재된 위치에서 야생형 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 돌연변이를 단독으로 Fc로 도입하여 네이티브 Fc로부터 명확한 100개 초과의 FcRn 결합 파트너를 생성할 수 있다. 추가로, 이러한 2, 3 이상의 개체 돌연변이의 조합을 함께 도입하여 수백개 초과의 FcRn 결합 파트너를 생성할 수 있다. 이러한 특정한 돌연변이는 FcRn 결합 파트너에 대해 새로운 기능성을 부여할 수 있다. 예를 들면, 일 실시양태는 N297A를 도입하여 매우 보존된 N-글라이코실화 자리를 제거한다. 이 돌연변이의 효과는 면역원성을 감소시켜, FcRn 결합 파트너의 순환 반감기를 증대시키고, FcRn에 대한 친화도를 손상시키지 않으면서 FcRn 결합 파트너가 FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB 및 FcyRIIIA에 대해 결합할 수 없게 한다[Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨); Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨); Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]. 추가로, 적어도 3개의 인간 Fc 감마 수용체는 더 낮은 힌지 영역, 일반적으로 234번 내지 237번 아미노산 내에 IgG에서 결합 자리를 인식하는 것으로 보인다. 따라서, 예를 들면 인간 IgG1 "ELLG"의 233번 내지 236번 아미노산을 (1개의 아미노산 결실을 갖는) IgG2 "PVA"로부터의 상응하는 서열로 대체함으로써 새로운 기능성 및 잠재적인 감소된 면역원성의 다른 예가 이 영역의 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 이러한 돌연변이가 도입될 때 다양한 이팩터 기능을 중재하는 FcyRI, FcyRII 및 FcyRIII가 IgG1에 결합하지 않는 것으로 나타났다[Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77 (1995)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨); 및 Armour et al., Eur. J. Immunol. 29:2613 (1999)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]. 상기 기재된 돌연변이로부터 생기는 새로운 기능성의 추가의 예로서 FcRn에 대한 친화도는 몇몇 경우에 야생형보다 증가할 수 있다. 이러한 친화도 증가는 "결합" 속도 증가, "분해" 속도 감소 또는 "결합" 속도 증가 및 "분해" 속도 감소 둘 다를 반영할 수 있다. FcRn에 대한 친화도 증가를 부여하는 것으로 생각되는 돌연변이는 예를 들면 T256A, T307A, E380A 및 N434A를 포함한다[Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591 (2001)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)].
Fc(또는 키메라 폴리펩타이드의 Fc 부분)는 표 2에 기재된 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 1458번 내지 1684번 아미노산 또는 서열 번호 6의 2352번 내지 2578번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일할 수 있다. Fc(또는 키메라 폴리펩타이드의 Fc 부분)는 표 2에 기재된 Fc 아미노산 서열(서열 번호 2의 1458번 내지 1684번 아미노산 및 서열 번호 6의 2352번 내지 2578번 아미노산)과 동일할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "하이브리드" 폴리펩타이드 및 단백질은 키메라 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드의 조합을 의미한다. 하이브리드 내의 키메라 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 전하-전하 또는 소수성 상호작용을 통해 서로에 회합될 수 있다. 하이브리드 내의 키메라 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 이황화 또는 다른 공유 결합(들)을 통해 서로에 회합될 수 있다. 하이브리드는 WO 제2004/101740호 및 WO 제2006/074199호(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 또한 미국 특허 제7,404,956호 및 제7,348,004호(이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다. 제2 폴리펩타이드는 동일한 키메라 폴리펩타이드의 제2 카피일 수 있거나, 비동일한 키메라 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들면, 도 1, 실시예 1 및 표 2를 참조한다. 일 실시양태에서, 제2 폴리펩타이드는 Fc를 포함하는 폴리펩타이드이다. 다른 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드는 키메라 VIII 인자-Fc 폴리펩타이드이고, 제2 폴리펩타이드는, 링커 서열을 개재함이 없이 인간 IgG1의 이합체 Fc 도메인에 융합된 재조합 B 도메인 결핍 인간 FVIII(BDD-rFVIII)의 단일 분자로 이루어진 rFVIIIFc 재조합 융합 단백질인, 실시예 1의 하이브리드 폴리펩타이드와 같은 Fc로 본질적으로 이루어진다. 이 하이브리드 폴리펩타이드는 본 명세서에서 FVIIIFc 단량체 Fc 융합 단백질, FVIIIFc 단량체 하이브리드, 단량체 FVIIIIFc 하이브리드 및 FVIIIFc 단량체-이합체라 칭한다. 실시예 1, 도 1 및 표 2A를 참조한다. 실시예는 이 하이브리드 폴리펩타이드에 대한 전임상 및 임상 데이터를 제공한다.
하이브리드 내의 제2 폴리펩타이드는 신호 서열 없이 표 2A(ⅱ)에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 4의 21번 내지 247번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일하거나 신호 서열 없이 표 2A(ⅱ)에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 4의 1번 내지 247번 아미노산)과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어질 수 있다. 제2 폴리펩타이드는 신호 서열 없이 표 2A(ⅱ)에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 4의 21번 내지 247번 아미노산)과 동일하거나 신호 서열 없이 표 2A(ⅱ)에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 4의 1번 내지 247번 아미노산)과 동일한 서열을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어질 수 있다.
도 1은 B 도메인 결핍 VIII 인자-Fc 키메라 폴리펩타이드의 구조 및 Fc 폴리펩타이드인 제2 폴리펩타이드와의 이의 회합을 보여주는 도식이다. 이 하이브리드를 얻기 위해, FVIII 특이적 프라이머를 사용하여 인간 간 폴리 A RNA(Clontech(클론테크))로부터 역전사 중합효소 사슬 반응(RT-PCR)에 의해 인간 재조합 B 도메인 결핍 FVIII의 코딩 서열을 얻었다. FVIII 서열은 FVIII에 대한 네이티브 신호 서열을 포함한다. B 도메인 결실은 2682bp의 전체 결실에 대해 743번 세린(S743; 2287bp)으로부터 1638번 글루타민(Q1638; 4969bp)이다. 이어서, Fc 특이적 프라이머를 사용하여 인간 백혈구 cDNA 라이브러리(클론테크)로부터 RT-PCR에 의해 인간 재조합 Fc에 대한 코딩 서열을 얻었다. B 도메인 결핍 FVIII 서열이 링커를 개재함이 없이 Fc 서열의 N 말단에 직접적으로 융합되도록 프라이머를 설계하였다. CMV 프로모터의 제어 하에 FVIIIFc DNA 서열을 포유동물 이중 발현 벡터 pBUDCE4.1(Invitrogen(인비트로겐))로 클로닝하였다. 마우스 Igk 신호 서열을 포함하는 동일한 제2 Fc 서열을 RT-PCR에 의해 얻고, 발현 벡터 pBUDCE4.1 내에서 EF1α인 제2 프로모터의 하류에서 클로닝하였다.
리포펙타민(Lipofectamine) 2000 형질감염 시약(인비트로겐)을 사용하여 인간 배아 신장 293 세포(HEK293H; 인비트로겐)로 rFVIIIFc 발현 벡터를 형질감염시켰다. 제오신(Zeocin)(인비트로겐)에 의해 선택하여 안정한 클론 세포주를 생성하였다. 생체내 규명을 위해 FVIIIFc를 생성하기 위해 3C4-22인 하나의 클론 세포주를 사용하였다. 바이오겐 이덱(Biogen Idec)(미국 마이애미주 캠브리지)에서 재조합 FVIIIFc를 제조하고 정제하였다[McCue et al. 2009]. 상기 기재된 형질감염 전략은 3종의 생성물, 즉 단량체 rFVIIIFc 하이브리드, 이합체 rFVIIIFc 하이브리드 및 이합체 Fc를 생성시키는 것으로 예상되었다. 그러나, 순화 배지 내에 이 세포로부터 검출된 이합체 rFVIIIFc가 실질적으로 없었다. 오히려, 순화 배지는 Fc 및 단량체 rFVIIIFc를 포함하였다. 이합체 rFVIIIFc의 크기가 너무 커서 이 세포로부터 효과적인 분비를 막을 수 있다. 이러한 결과는 모든 3종의 단백질이 존재하는 것보다 단량체 정제를 덜 복잡하게 하므로 유리하다. 이 연구에서 사용된 물질은 대략 9000IU/㎎의 비활성(specific activity)을 갖는다.
일 실시양태에서, 고수준의 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 발현하는 환자에게 본 발명의 폴리펩타이드를 투여한다. 본 명세서에서 사용되는 "피험체" 또는 "환자"는 인간 개체를 의미한다. 피험체는 출혈 장애를 현재 앓고 있거나 이러한 치료를 필요로 하는 것으로 예상되는 환자일 수 있다. "피험체"는 성인 또는 소아 피험체를 포함할 수 있다. 소아 피험체는 12살 이하의 소아 환자일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "소아"는 유소아 관리 및 이 질환의 치료를 다루는 약제 종류이다. 일 실시양태에서, 피험체는 중증 A형 혈우병을 진단받은 소아 환자이다. 특정한 양태에서, 본 발명의 지속성 VIII 인자 폴리펩타이드로 소아 피험체를 치료한다.
VWF는 다양한 형태의 분자량이 각각의 단량체 하부단위의 경우 대략 230kDa로부터 더 높은 분자량의 다합체 형태의 경우 20백만 Da 초과까지 변하여, 가장 큰 공지된 가용성 단백질을 형성하는 다합체 구조를 갖는 혈장 단백질이다. 이의 혈장 농도는 대략 약 5 내지 10㎍/㎖[Siedlecki et al., Blood, vol 88: 2939-2950 (1996)]이고, 더 작은 크기의 혈장 형태는 500kDa의 근사 크기를 갖는 이합체에 상응하는 것이다.
VWF는 일차 지혈에서 중요한 역할을 하여, 손상된 맥관 표면에 대한 혈소판의 접착을 담당하며 따라서 혈전 형성을 담당한다(피브린 혈전 형성에 대한 기전이 전개됨). 더 높은 분자량의 다합체가 더 높은 효율로 내피하층에 대한 혈소판 접착 기전을 지원하고, VWF 농축물의 임상 효율은 더 높은 분자량의 이 다합체의 농도와 관련되는 것으로 제안된다[Metzner et al., Haemophilia 4:25-32 (1998)].
따라서, 고수준의 VWF를 발현하는 피험체는 더 낮은 또는 정상 수준의 VWF를 발현하는 피험체와 비교하여 덜 빈번한 FVIII 투약을 요한다. 혈장 내 VWF의 평균 범위는 약 50IU/dL 내지 약 200IU/dL이다. 일 실시양태에서, 혈장 내 VWF의 평균 수준은 약 50IU/dL이다. 다른 실시양태에서, 혈장 내 적어도 약 100IU/dL의 VWF 수준은 높은 VWF 수준으로 생각된다. 다른 실시양태에서, 혈장 내 고수준의 VWF는 약 100IU/dL 내지 약 200IU/dL이다. 다른 실시양태에서, 혈장 내 고수준의 VWF는 적어도 약 110IU/dL, 약 120IU/dL, 약 130IU/dL, 약 140IU/dL, 약 150IU/dL, 약 160IU/dL, 약 170IU/dL, 약 180IU/dL, 약 190IU/dL 또는 약 200IU/dL이다.
따라서, 일 실시양태에서, 적어도 약 100IU/dL의 혈장 VWF를 발현하는 피험체에게 긴 간격 투약 섭생으로 본 발명의 지속성 FVIII 폴리펩타이드를 투여한다. 일 실시양태에서, 적어도 약 3일의 투약 간격으로 지속성 FVIII 폴리펩타이드를 투여한다. 다른 실시양태에서, 적어도 1주마다 약 1회, 2주마다 약 1회, 15일마다 약 1회, 20일마다 약 1회, 3주마다 약 1회, 25일마다 약 1회, 4주마다 약 1회 또는 1개월마다 약 1회의 투약 간격으로 지속성 FVIII 폴리펩타이드를 투여한다.
일 실시양태에서, 피험체는 고수준의 VWF를 갖는 것으로 이전에 확인된다. 특정한 양태에서, O 이외의 혈액 혈청형(즉, A, B 또는 AB)을 갖는 피험체는 덜 빈번한 지속성 FVIII 투약을 요하는데, 왜냐하면 지속성 FVIII가 이 피험체에서 반감기가 더 길기 때문이다. 이 피험체에서, 반감기 증가는 이의 VWF 수준 증가로 인한 것이다.
더구나, 본 발명의 지속성 FVIII 폴리펩타이드를 사용하는 더 길거나 짧은 투약 간격에 적격인 피험체의 식별자로서 약물 흡수, 분포, 대사 및 배설의 시간 경과의 연구로 정의되는 약물동태학적 데이터를 이용할 수 있다. 임상 약물동태학은 각각의 환자에서 약물의 안전하고 효과적인 치료학적 관리에 대한 약물동태학적 원칙의 적용이다. 임상 약물동태학의 일차 목표는 환자의 약물 치료의 효율 증대 및 독성 감소를 포함한다. 약물 농도와 이의 약리학적 반응 사이의 강한 상관관계의 전개는 임상의가 약물동태학적 원칙을 실제 환자 상황에 적용하게 한다.
따라서, 일 실시양태에서, 고수준의 VWF를 발현하는 환자를 확인하기 위해 FVIII-Fc 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기를 이용한다. FVIII-Fc의 반감기 범위는 또한 존재하는 VWF의 수준에 적어도 부분적으로 의존하여 약 10시간 내지 약 40시간이다. 그러나, 평균적으로 FVIII-Fc의 반감기는 약 18시간이다. 일반적으로, FVIII-Fc는 평균 수준의 VWF를 갖는 개체에게 투여될 때 FVIII-Fc의 반감기와 비교하여 고수준의 VWF를 갖는 환자에서 적어도 약 1.2배의 반감기 증가를 나타낸다. 일 실시양태에서, FVIII-Fc는 평균 수준의 VWF를 갖는 개체에게 투여될 때 FVIII-Fc의 반감기와 비교하여 적어도 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배의 반감기 증가를 나타낸다. 일 실시양태에서, 고수준의 VWF를 발현하는 피험체에서, FVIII-Fc의 반감기는 적어도 약 20시간 내지 약 40시간이다. 다른 실시양태에서, FVIII-Fc의 반감기는 적어도 약 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간 또는 40시간이다. 일 실시양태에서, FVIII-Fc의 반감기는 고수준의 VWF를 갖는 피험체에서 약 20시간 내지 약 27시간이다. 따라서, 일 실시양태에서, 평균 값과 비교하여 FVIII-Fc의 반감기 증가는 본 발명의 지속성 FVIII 폴리펩타이드에 의한 더 긴 투약 간격에 적격인 피험체를 나타낸다.
다른 실시양태에서, 고수준의 VWF를 발현하는 환자를 확인하기 위해 속효성 FVIII 폴리펩타이드의 반감기를 이용한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "속효성 FVIII"는 반감기의 증가제가 첨가되지 않은 FVIII 폴리펩타이드를 의미한다. 일 실시양태에서, 속효성 FVIII 폴리펩타이드는 전장 또는 B 도메인 결핍 FVIII로 이루어진다. 속효성 FVIII 폴리펩타이드의 예는 애드베이트(등록 상표) 및 레팍토(ReFacto)(등록 상표)이다.
속효성 FVIII의 반감기가 또한 적어도 부분적으로 VWF 수준에 따라 변하므로, 본 발명의 지속성 FVIII 폴리펩타이드의 더 긴 투약 간격에 적격인 환자를 확인하기 위해 속효성 FVIII 폴리펩타이드를 또한 이용할 수 있다. 일 실시양태에서, 속효성 FVIII는 평균 수준의 VWF를 갖는 개체에게 투여될 때 속효성 FVIII의 반감기와 비교하여 고수준의 VWF를 발현하는 개체에서 적어도 약 1.2배의 반감기 증가를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 속효성 FVIII는 평균 수준의 VWF를 갖는 개체에게 투여될 때 속효성 FVIII의 반감기와 비교하여 고수준의 VWF를 발현하는 개체에서 적어도 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배의 반감기 증가를 나타낸다. 따라서, 속효성 FVIII가 투여될 때 적어도 약 1.2배의 반감기 증가를 나타내는 개체는 본 발명의 지속성 FVIII 폴리펩타이드에 의한 더 긴 투약 간격에 적격이다.
본 명세서에서 사용되는 "투약 간격"은 피험체에게 투여되는 다회 용량 사이에 경과한 시간을 의미한다. 단일 피험체 또는 피험체 집단에서 투약 간격 비교를 수행할 수 있고, 이후 집단에서 얻은 평균을 계산할 수 있다.
본 발명의 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드, 예를 들면 키메라 VIII 인자-Fc 폴리펩타이드(VIII 인자 또는 하이브리드로 이루어진 폴리펩타이드)를 투여할 때 투약 간격은 비-VIII 인자 부분이 없는, 예를 들면 Fc 부분이 없는(상기 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드) 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배 길 수 있다. 투약 간격은 비-VIII 인자 부분이 없는, 예를 들면 Fc 부분이 없는(상기 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드) 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배 내지 6배 길거나, 1½배 내지 5배 길거나, 1½배 내지 4배 길거나, 1½배 내지 3배 길거나, 1½배 내지 2배 길 수 있다. 투약 간격은 비-VIII 인자 부분이 없는, 예를 들면 Fc 부분이 없는(상기 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드) 상기 VIII 인자의 등가 용량에 필요한 투약 간격보다 적어도 약 1½배, 2배, 2½배, 3배, 3½배, 4배, 4½배, 5배, 5½배 또는 6배 길 수 있다. 투약 간격은 매 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 또는 더 긴 기간마다일 수 있다. 투약 간격은 적어도 약 1½일 내지 5일, 1½일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 또는 더 긴 기간일 수 있다. 온디맨드식 치료의 경우, 상기 키메라 폴리펩타이드 또는 하이브리드의 투약 간격은 24시간 내지 36시간, 24시간 내지 48시간, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 96시간, 24시간 내지 120시간, 24시간 내지 144시간, 24시간 내지 168시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간, 40시간, 41시간, 42시간, 43시간, 44시간, 45시간, 46시간, 47시간, 48시간, 49시간, 50시간, 51시간, 52시간, 53시간, 54시간, 55시간, 56시간, 57시간, 58시간, 59시간, 60시간, 61시간, 62시간, 63시간, 64시간, 65시간, 66시간, 67시간, 68시간, 69시간, 70시간, 71시간 또는 72시간 또는 더 긴 기간마다 약 1회이다.
일 실시양태에서, 효과 용량은 25 내지 80IU/㎏(25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80IU/㎏)이고, 투약 간격은 3일 내지 5일, 3일 내지 6일, 3일 내지 7일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일 또는 더 긴 기간마다 1회 또는 1주 3회 또는 1주 3회 이상이다. 일 실시양태에서, 효과 용량은 80IU/㎏이고, 투약 간격은 3일마다 1회이다. 추가의 실시양태에서, 3일마다의 투약 간격으로 제공되는 80IU/㎏의 효과 용량을 소아 피험체에게 투여한다. 다른 실시양태에서, 효과 용량은 65IU/㎏이고, 투약 간격은 1주 1회 또는 6일 내지 7일마다 1회이다. 필요한 만큼 길게(예를 들면, 적어도 10주, 20주, 28주, 30주, 40주, 50주, 52주 또는 57주, 적어도 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년 또는 10년) 반복하여 용량을 투여할 수 있다.
특정한 양태에서, 온디맨드식 치료에 효과 용량은 20 내지 50IU/㎏(20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50IU/㎏)이다. 온디맨드식 치료는 1회 투약 또는 반복 투약일 수 있다. 반복 투약의 경우, 투약 간격은 12시간 내지 24시간, 24시간 내지 36시간, 24시간 내지 48시간, 36시간 내지 48시간 또는 48시간 내지 72시간마다일 수 있다.
"지속성 VIII 인자"는 기준 VIII 인자에 비해 반감기(또한 본 명세서에서 t1/2, t1/2 베타, 제거 반감기 및 HL이라 칭함)가 증가된 VIII 인자이다. 지속성 VIII 인자의 반감기 증가는 예를 들면 Fc, XTEN, 알부민, PAS 서열, 트랜스페린, CTP(4 O-글라이칸을 갖는 hCG의 28개의 아미노산 C 말단 펩타이드(CTP)), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 알부민 결합 폴리펩타이드, 알부민 결합 소분자 또는 이들의 2 이상의 조합과 같은 하나 이상의 비-VIII 인자 폴리펩타이드에 대한 융합 때문일 수 있다. 반감기 증가는 예를 들면 PEG화와 같은 1 이상의 변형 때문일 수 있다. 예시적인 지속성 VIII 인자 폴리펩타이드는 예를 들면 Fc를 포함하는 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드, XTEN을 포함하는 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드 및 알부민을 포함하는 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 예시적인 지속성 VIII 인자 폴리펩타이드는 예를 들면 페길화 VIII 인자를 포함한다.
"기준" 폴리펩타이드는, 지속성 키메라 VIII 인자 폴리펩타이드의 경우, Fc 부분이 없는, XTEN 부분 또는 알부민 부분이 없는 동일한 VIII 인자 부분과 같은 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분으로 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 마찬가지로, 기준 폴리펩타이드는 변형 VIII 인자의 경우 변형이 없는 동일한 VIII 인자, 예를 들면 PEG화가 없는 VIII 인자이다.
몇몇 실시양태에서, 지속성 VIII 인자는 피험체에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
상기 피험체에서 약 14 내지 41.3시간의 평균체류시간(MRT)(활성);
상기 피험체에서 약 1.22 내지 5.19㎖/시간/㎏ 이하의 청소율(CL)(활성);
상기 피험체에서 약 11 내지 26.4시간의 t1/2베타(활성);
상기 피험체에서 1IU/㎏당 약 1.38 내지 2.88IU/dL의 증분 회수율(K값)(활성; 관찰치);
상기 피험체에서 약 37.7 내지 79.4㎖/㎏의 Vss(활성); 및
상기 피험체에서 1IU/㎏당 약 19.2 내지 81.7IU*h/dL의 AUC/용량.
몇몇 실시양태에서, 지속성 VIII 인자는 환자 집단에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
1IU/㎏당 1.38IU/dL 초과의 평균 증분 회수율(K값)(활성; 관찰치);
1IU/㎏당 적어도 약 1.5, 적어도 약 1.85 또는 적어도 약 2.46IU/dL의 평균 증분 회수율(K값)(활성; 관찰치);
상기 환자 집단에서 약 2.33±1.08㎖/시간/㎏ 이하의 평균 청소율(CL)(활성);
상기 환자 집단에서 약 1.8 내지 2.69㎖/시간/㎏의 평균 청소율(CL)(활성);
상기 환자 집단에서 변형 없이 상기 VIII 인자를 포함하는 폴리펩타이드의 청소율의 약 65%인 평균 청소율(CL)(활성);
상기 환자 집단에서 적어도 약 26.3±8.33시간의 평균 평균체류시간(MRT)(활성);
상기 환자 집단에서 약 25.9 내지 26.5시간의 평균 MRT(활성);
상기 환자 집단에서 변형 없이 상기 VIII 인자를 포함하는 폴리펩타이드의 평균 MRT보다 약 1.5배 긴 평균 MRT(활성);
상기 환자 집단에서 약 18.3±5.79시간의 평균 t1/2베타(활성);
상기 환자 집단에서 약 18 내지 18.4시간의 평균 t1/2베타(활성);
상기 환자 집단에서 변형 없이 상기 VIII 인자를 포함하는 폴리펩타이드의 평균 t1/2베타보다 약 1.5배 긴 평균 t1/2베타(활성);
상기 환자 집단에서 1IU/㎏당 약 2.01±0.44IU/dL의 평균 증분 회수율(K값)(활성; 관찰치);
상기 환자 집단에서 1IU/㎏당 약 1.85 내지 2.46IU/dL의 평균 증분 회수율(K값)(활성; 관찰치);
상기 환자 집단에서 변형 없이 상기 VIII 인자를 포함하는 폴리펩타이드의 평균 증분 회수율의 약 90%인 평균 증분 회수율(K값)(활성; 관찰치);
상기 환자 집단에서 약 55.1±12.3㎖/㎏의 평균 Vss(활성);
상기 환자 집단에서 약 45.3 내지 56.1㎖/㎏의 평균 Vss(활성);
상기 환자 집단에서 1IU/㎏당 약 49.9±18.2IU*h/dL의 평균 AUC/용량(활성);
상기 환자 집단에서 1IU/㎏당 약 44.8 내지 57.6IU*h/dL의 평균 AUC/용량(활성).
다른 실시양태에서, 지속성 VIII 인자는 환자 집단에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
1단계(aPTT) 검정 또는 2단계(발색) 검정에 의해 측정할 때, 동량의 전장, 성숙 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드가 투여된 피험체에서의 Cmax_OBS에 필적하는 키메라 폴리펩타이드가 투여된 상기 피험체에서의 Cmax_OBS;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 60.5IU/dL, 약 60.5±1IU/dL, 약 60.5±2IU/dL, 약 60.5±3IU/dL, 약 60.5±4IU/dL, 약 60.5±5IU/dL, 약 60.5±6IU/dL, 약 60.5±7IU/dL, 약 60.5±8IU/dL, 약 60.5±9IU/dL 또는 약 60.5±10IU/dL의 Cmax_OBS;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 53.1 내지 69IU/dL의 Cmax_OBS;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 119IU/dL, 약 119±1IU/dL, 약 119±2IU/dL, 약 119±3IU/dL, 약 119±4IU/dL, 약 119±5IU/dL, 약 119±6IU/dL, 약 119±7IU/dL, 약 119±8IU/dL, 약 119±9IU/dL, 약 119±10IU/dL, 약 119±11IU/dL, 약 119±12IU/dL, 약 119±13IU/dL, 약 119±14IU/dL, 약 119±15IU/dL, 약 119±16IU/dL, 약 119±17IU/dL 또는 약 119±18IU/dL의 Cmax_OBS;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 103 내지 136IU/dL의 Cmax_OBS;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 76.5IU/dL, 약 76.5±1IU/dL, 약 76.5±2IU/dL, 약 76.5±3IU/dL, 약 76.5±4IU/dL, 약 76.5±5IU/dL, 약 76.5±6IU/dL, 약 76.5±7IU/dL, 약 76.5±8IU/dL, 약 76.5±9IU/dL, 약 76.5±10IU/dL, 약 76.5±11IU/dL, 약 76.5±12IU/dL, 약 76.5±13IU/dL, 약 76.5±14IU/dL 또는 약 76.5±15IU/dL의 Cmax_OBS;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 64.9 내지 90.1IU/dL의 Cmax_OBS;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 182IU/dL, 약 182±2IU/dL, 약 182±4IU/dL, 약 182±6IU/dL, 약 182±8IU/dL, 약 182±10IU/dL, 약 182±12IU/dL, 약 182±14IU/dL, 약 182±16IU/dL, 약 182±18IU/dL 또는 약 182±20IU/dL의 Cmax_OBS; 또는
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 146 내지 227IU/dL, 약 146±5IU/dL, 약 146±10IU/dL, 약 227±5IU/dL 또는 약 146±10IU/dL의 Cmax_OBS.
특정한 양태에서, 지속성 VIII 인자는 환자 집단에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
1단계(aPTT) 검정 또는 2단계(발색) 검정에 의해 측정할 때, 동량의 전장, 성숙 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드가 투여된 피험체에서의 t1/2베타(활성)보다 적어도 1.48배, 1.49배, 1.50배, 1.51배, 1.52배, 1.53배, 1.54배, 1.55배, 1.56배, 1.57배, 1.58배, 1.59배, 1.60배, 1.61배, 1.62배, 1.63배, 1.64배, 1.65배, 1.66배, 1.67배, 1.68배, 1.69배, 1.70배, 1.71배, 1.72배, 1.73배, 1.74배, 1.75배, 1.76배, 1.77배, 1.78배, 1.79배, 1.80배, 1.81배, 1.82배, 1.83배, 1.84배, 1.85배, 1.86배, 1.87배, 1.88배, 1.89배 또는 1.90배 높은 상기 피험체에서의 t1/2베타(활성);
상기 피험체에서 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 18.8시간, 18.8±1시간, 18.8±1시간, 18.8±2시간, 18.8±3시간, 18.8±4시간, 18.8±5시간, 18.8±6시간, 18.8±7시간, 18.8±8시간, 18.8±9시간, 18.8±10시간 또는 18.8±11시간의 t1/2베타(활성);
상기 피험체에서 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 14.3 내지 24.5시간의 t1/2베타(활성);
상기 피험체에서 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 16.7시간, 16.7±1시간, 16.7±2시간, 16.7±3시간, 16.7±4시간, 16.7±5시간, 16.7±6시간, 16.7±7시간, 16.7±8시간, 16.7±9시간, 16.7±10시간 또는 16.7±11시간의 t1/2베타(활성);
상기 피험체에서 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 13.8 내지 20.1시간의 t1/2베타(활성);
상기 피험체에서 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 19.8시간, 19.8±1시간, 19.8±2시간, 19.8±3시간, 19.8±4시간, 19.8±5시간, 19.8±6시간, 19.8±7시간, 19.8±8시간, 19.8±9시간, 19.8±10시간 또는 19.8±11시간의 t1/2베타(활성); 또는
상기 피험체에서 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 14.3 내지 27.5시간의 t1/2베타(활성).
특정한 양태에서, 지속성 VIII 인자는 환자 집단에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
1단계(aPTT) 검정 또는 2단계(발색) 검정에 의해 측정할 때, 동량의 전장, 성숙 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드가 투여된 피험체에서의 청소율보다 0.51배, 0.52배, 0.53배, 0.54배, 0.55배, 0.56배, 0.57배, 0.58배, 0.59배, 0.60배, 0.61배, 0.62배, 0.63배, 0.64배, 0.65배, 0.66배, 0.67배, 0.68배, 0.69배 또는 0.70배 낮은 상기 피험체에서의 청소율(CL)(활성);
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 1.68㎖/시간/㎏, 1.68±0.1㎖/시간/㎏, 1.68±0.2㎖/시간/㎏, 1.68±0.3㎖/시간/㎏, 1.68±0.4㎖/시간/㎏, 1.68±0.5㎖/시간/㎏, 1.68±0.6㎖/시간/㎏ 또는 1.68±0.7㎖/시간/㎏의 청소율(CL)(활성);
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 1.31-2.15㎖/시간/㎏의 청소율(CL)(활성);
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 2.32㎖/시간/㎏, 2.32±0.1㎖/시간/㎏, 2.32±0.2㎖/시간/㎏, 2.32±0.3㎖/시간/㎏, 2.32±0.4㎖/시간/㎏, 2.32±0.5㎖/시간/㎏, 2.32±0.6㎖/시간/㎏ 또는 2.32±0.7㎖/시간/㎏의 청소율(CL)(활성);
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 1.64 내지 3.29㎖/시간/㎏의 청소율(CL)(활성);
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 1.49㎖/시간/㎏, 1.49±0.1㎖/시간/㎏, 1.49±0.2㎖/시간/㎏, 1.49±0.3㎖/시간/㎏, 1.49±0.4㎖/시간/㎏, 1.49±0.5㎖/시간/㎏, 1.49±0.6㎖/시간/㎏ 또는 1.49±0.7㎖/시간/㎏의 청소율(CL)(활성);
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 1.16 내지 1.92㎖/시간/㎏의 청소율(CL)(활성);
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 1.52㎖/시간/㎏, 1.52±0.1㎖/시간/㎏, 1.52±0.2㎖/시간/㎏, 1.52±0.3㎖/시간/㎏, 1.52±0.4㎖/시간/㎏, 1.52±0.5㎖/시간/㎏, 1.52±0.6㎖/시간/㎏ 또는 1.52±0.7㎖/시간/㎏의 청소율(CL)(활성); 또는
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 1.05 내지 2.20㎖/시간/㎏의 청소율(CL)(활성).
몇몇 실시양태에서, 지속성 VIII 인자는 환자 집단에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
1단계(aPTT) 검정 또는 2단계(발색) 검정에 의해 측정할 때, 동량의 전장, 성숙 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드가 투여된 피험체에서의 MRT보다 적어도 1.46배, 1.47배, 1.48배, 1.49배, 1.50배, 1.51배, 1.52배, 1.53배, 1.54배, 1.55배, 1.56배, 1.57배, 1.58배, 1.59배, 1.60배, 1.61배, 1.62배, 1.63배, 1.64배, 1.65배, 1.66배, 1.67배, 1.68배, 1.69배, 1.70배, 1.71배, 1.72배, 1.73배, 1.74배, 1.75배, 1.76배, 1.77배, 1.78배, 1.79배, 1.80배, 1.81배, 1.82배, 1.83배, 1.84배, 1.85배, 1.86배, 1.87배, 1.88배, 1.89배, 1.90배, 1.91배, 1.92배 또는 1.93배 높은 상기 피험체에서의 MRT;
0상기 피험체에서 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 27시간, 27±1시간, 27±2시간, 27±3시간, 27±4시간, 27±5시간, 27±6시간, 27±7시간, 27±8시간, 27±9시간 또는 27±10시간의 MRT(활성);
상기 피험체에서 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 20.6 내지 35.3시간의 MRT(활성);
상기 피험체에서 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 23.9 내지 28.5시간의 MRT(활성);
상기 피험체에서 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 19.8 내지 28.9시간의 MRT(활성); 또는
상기 피험체에서 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 20.5 내지 39.6시간의 MRT(활성).
다른 실시양태에서, 지속성 VIII 인자는 환자 집단에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
1단계(aPTT) 검정 또는 2단계(발색) 검정에 의해 측정할 때, 동량의 전장, 성숙 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드가 투여된 피험체에서의 증분 회수율에 필적하는 상기 피험체에서의 증분 회수율;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 2.44IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.1IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.2IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.3IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.4IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.5IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.6IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.7IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.8IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±0.9IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±1.0IU/dL, 1IU/㎏당 2.44±1.1IU/dL 또는 1IU/㎏당 2.44±1.2IU/dL의 증분 회수율;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 2.12 내지 2.81IU/dL의 증분 회수율;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 1.83IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.1IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.2IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.3IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.4IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.5IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.6IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.7IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.8IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±0.9IU/dL, 1IU/㎏당 1.83±1.0IU/dL 또는 1IU/㎏당 1.83±1.1IU/dL의 증분 회수율;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 1.59 내지 2.10IU/dL의 증분 회수율;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 3.09IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.1IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.2IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.3IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.4IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.5IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.6IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.7IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.8IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±0.9IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±1.0IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±1.1IU/dL, 1IU/㎏당 3.09±1.2IU/dL 또는 1IU/㎏당 3.09±1.3IU/dL의 증분 회수율;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 2.80IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.1IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.2IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.3IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.4IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.5IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.6IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.7IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.8IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±0.9IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±1.0IU/dL, 1IU/㎏당 2.80±1.1IU/dL 또는 1IU/㎏당 2.80±1.2IU/dL의 증분 회수율;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 2.61 내지 3.66IU/dL의 증분 회수율; 또는
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 2.24 내지 3.50IU/dL의 증분 회수율.
또 다른 실시양태에서, 지속성 VIII 인자는 환자 집단에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
1단계(aPTT) 검정 또는 2단계(발색) 검정에 의해 측정할 때, 동량의 전장, 성숙 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드가 투여된 피험체에서의 Vss(활성)에 필적하는 상기 피험체에서의 증분 회수율;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 45.5㎖/㎏, 45.5±1㎖/㎏, 45.5±2㎖/㎏, 45.5±3㎖/㎏, 45.5±4㎖/㎏, 45.5±5㎖/㎏, 45.5±6㎖/㎏, 45.5±7㎖/㎏, 45.5±8㎖/㎏, 45.5±9㎖/㎏, 45.5±10㎖/㎏ 또는 45.5±11㎖/㎏의 Vss(활성);
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 39.3 내지 52.5㎖/㎏의 Vss(활성);
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 62.8㎖/㎏, 62.8±1㎖/㎏, 62.8±2㎖/㎏, 62.8±3㎖/㎏, 62.8±4㎖/㎏, 62.8±5㎖/㎏, 62.8±6㎖/㎏, 62.8±7㎖/㎏, 62.8±8㎖/㎏, 62.8±9㎖/㎏, 62.8±10㎖/㎏, 62.8±11㎖/㎏, 62.8±12㎖/㎏, 62.8±13㎖/㎏, 62.8±14㎖/㎏, 62.8±15㎖/㎏ 또는 62.8±16㎖/㎏의 Vss(활성);
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 약 55.2 내지 71.5㎖/㎏의 Vss(활성);
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 35.9㎖/㎏, 35.9±1㎖/㎏, 35.9±2㎖/㎏, 35.9±3㎖/㎏, 35.9±4㎖/㎏, 35.9±5㎖/㎏, 35.9±6㎖/㎏, 35.9±7㎖/㎏, 35.9±8㎖/㎏, 35.9±9㎖/㎏, 35.9±10㎖/㎏, 35.9±11㎖/㎏, 35.9±12㎖/㎏ 또는 35.9±13㎖/㎏의 Vss(활성);
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 30.4 내지 42.3㎖/㎏의 Vss(활성);
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 43.4㎖/㎏, 43.4±1㎖/㎏, 43.4±2㎖/㎏, 43.4±3㎖/㎏, 43.4±4㎖/㎏, 43.4±5㎖/㎏, 43.4±6㎖/㎏, 43.4±7㎖/㎏, 43.4±8㎖/㎏, 43.4±9㎖/㎏, 43.4±10㎖/㎏, 43.4±11㎖/㎏, 43.4±12㎖/㎏, 43.4±13㎖/㎏, 43.4±14㎖/㎏, 43.4±15㎖/㎏ 또는 43.4±16㎖/㎏의 Vss(활성); 또는
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 약 38.2 내지 49.2㎖/㎏의 Vss(활성).
또 다른 실시양태에서, 지속성 VIII 인자는 환자 집단에게 투여될 때 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:
1단계(aPTT) 검정 또는 2단계(발색) 검정에 의해 측정할 때, 동량의 전장, 성숙 VIII 인자로 이루어진 폴리펩타이드가 투여된 피험체에서의 AUCINF보다 적어도 1.45배, 1.46배, 1.47배, 1.48배, 1.49배, 1.50배, 1.51배, 1.52배, 1.53배, 1.54배, 1.55배, 1.56배, 1.57배, 1.58배, 1.59배, 1.60배, 1.61배, 1.62배, 1.63배, 1.64배, 1.65배, 1.66배, 1.67배, 1.68배, 1.69배, 1.70배, 1.71배, 1.72배, 1.73배, 1.74배, 1.75배, 1.76배, 1.77배, 1.78배, 1.79배, 1.80배, 1.81배, 1.82배, 1.83배, 1.84배, 1.85배, 1.86배, 1.87배, 1.88배, 1.89배, 1.90배 높은 상기 피험체에서의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 1440±316시간*IU/dL의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 1160 내지 1880시간*IU/dL의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 1480시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±100시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±200시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±300시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±400시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±500시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±600시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±700시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±800시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1480±900시간*IU/dL 또는 1IU/㎏당 1480±1000시간*IU/dL의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 2910±1320시간*IU/dL의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 1980 내지 3970시간*IU/dL의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 1단계(aPTT) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 2800시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±100시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±200시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±300시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±400시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±500시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±600시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±700시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±800시간*IU/dL, 1IU/㎏당 2800±900시간*IU/dL 또는 1IU/㎏당 2800±1000시간*IU/dL의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 1660시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±100시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±200시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±300시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±400시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±500시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±600시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±700시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±800시간*IU/dL, 1IU/㎏당 1660±900시간*IU/dL 또는 1IU/㎏당 1660±1000시간*IU/dL의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 25IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 1300 내지 2120시간*IU/dL의 AUCINF;
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 4280시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±100시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±200시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±300시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±400시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±500시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±600시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±700시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±800시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±900시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±1000시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±1100시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±1200시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±1300시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±1400시간*IU/dL, 1IU/㎏당 4280±1500시간*IU/dL 또는 1IU/㎏당 4280±1600시간*IU/dL의 AUCINF; 또는
상기 피험체에서 약 65IU/㎏의 키메라 폴리펩타이드를 투여할 때 2단계(발색) 검정에 의해 측정된 1IU/㎏당 약 2960 내지 6190시간*IU/dL의 AUCINF.
본 명세서에서 사용되는 "온디맨드식 치료"는 짧은 시간 과정에 발생하도록 의도되고 출혈 삽화와 같은 기존의 병증 또는 계획된 수술과 같은 인지된 필요성에 반응하는 치료를 의미한다. 온디맨드식 치료를 요할 수 있는 병증은 예를 들면 출혈 삽화, 관절혈증, 근육 출혈, 경구 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구내 출혈, 외상, 두근 외상, 위장 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강내 출혈, 복막후강내 출혈 또는 장요근초내 출혈을 포함한다. 피험체는 수술적 예방, 수술후 관리 또는 수술 치료를 요할 수 있다. 이러한 수술은 예를 들면, 소수술, 대수술, 발치, 편도선 수술, 서혜부 절제술, 활막절제술, 슬관절 전치환술, 개두술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술 또는 관절 대체 수술을 포함한다.
일 실시양태에서, 온디맨드식 치료는 단일 용량에서 출혈(예를 들면, 자발적인 출혈)을 80% 초과(80% 초과, 81%초과, 82%초과, 83%초과, 84%초과, 85%초과, 86%초과, 87%초과, 88%초과, 89%초과, 90%초과, 91%초과, 92%초과, 93%초과, 94%초과, 95%초과, 96%초과, 97%초과, 98%초과, 99% 초과 또는 100%) 또는 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 85% 내지 90%, 90% 내지 100%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 100%로 해소한다. 다른 실시양태에서, 온디맨드식 치료 후 전문의는 출혈 삽화의 80% 초과(81% 초과, 82% 초과, 83% 초과, 84% 초과, 85% 초과, 86% 초과, 87% 초과, 88% 초과, 89% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 100%) 또는 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 85% 내지 90%, 90% 내지 100%, 90% 내지 95% 또는 95% 내지 100%를 훌륭하거나 우수하다고 평가한다. 다른 실시양태에서, 온디맨드식 치료 후 전문의는 출혈 삽화의 5% 초과(6% 초과, 7% 초과, 8% 초과, 9% 초과, 10% 초과, 11% 초과, 12% 초과, 13% 초과, 14% 초과, 15% 초과, 16% 초과, 17% 초과, 18% 초과, 19% 초과, 20% 초과) 또는 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20% 또는 10% 내지 15%%를 온당하다고 평가한다.
"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 상호 교환되어 사용되고, 공유 결합된 아미노산 잔기로 이루어진 중합체 화합물을 의미한다.
"폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 상호 교환되어 사용되고, 공유 결합된 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 중합체 화합물을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA, cDNA, RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 벡터, 플라스미드, 파지 또는 바이러스일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 표 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 표 1에서의 것을 포함한다(표 1 참조). 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들면 표 1의 폴리뉴클레오타이드의 단편, 예를 들면 표 2의 폴리펩타이드의 단편, 예컨대 VIII 인자, Fc, 신호 서열, 6His 및 표 2의 폴리펩타이드의 다른 단편을 코딩하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "예방학적 치료"는 피험체의 혈장에서 VIII 인자 활성의 수준을 증가시키기 위해 시간 경과에 걸쳐 피험체에게 다회 용량으로 VIII 인자 폴리펩타이드를 투여하는 것을 의미한다. 증가된 수준은 예를 들면 예상되지 못한 손상의 경우 자발적인 출혈의 발생률을 감소시키거나 출혈을 예방하기 위해 충분할 수 있다. 예방학적 치료 동안, 피험체에서의 혈장 단백질 수준은 피험체에 대한 기준치 수준보다 낮지 않거나, 중증 혈우병(1IU/dl[1%] 미만)을 규명하는 VIII 인자의 수준보다 낮지 않을 수 있다.
일 실시양태에서, 예를 들면 각각의 환자에 대한 PK 데이터를 결정하고 1% 내지 3%의 FVIII 활성의 최저혈중농도를 유지시키는 투약 간격으로 본 발명의 VIII 인자를 투여함으로써 각각의 환자에 예방 섭생을 "맞춘다". 피험체가 규칙적인 2달 기간에 걸쳐 2 이상의 자발적인 출혈 삽화로 정의된 허용되지 않는 출혈 삽화를 겪을 때 조정할 수 있다. 이런 경우, 조정은 3% 내지 5%의 최저혈중농도를 표적화한다. 다른 실시양태에서, 예방학적 치료는 출혈의 예방 및 조절, 지속적인 출혈 조절, 지속적인 출혈 보호 및/또는 지속적인 이익을 발생시킨다. 속효성 FVIII에 비해 말단 t1/2를 증가시키는, 마지막 측정된 시점에 대한 AUC(AUC-LAST) 증가 및 청소율 감소에 의해 지속적인 보호와 같은 예방이 확인될 수 있다. 속효성 FVIII에 비해 더 우수한 Cmax, 더 우수한 Tmax 및/또는 더 긴 평균체류시간에 의해 예방이 확인될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 예방은 주사(예를 들면, 마지막 주사) 후 약 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간(예를 들면, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간, 40시간, 41시간, 42시간, 43시간, 44시간, 45시간, 46시간, 47시간, 48시간, 49시간, 50시간, 51시간, 52시간, 53시간, 54시간, 55시간, 56시간, 57시간, 58시간, 59시간, 60시간, 61시간, 62시간, 63시간, 64시간, 65시간, 66시간, 67시간, 68시간, 69시간, 70시간, 71시간, 72시간, 73시간, 74시간, 75시간, 76시간, 77시간, 78시간, 79시간, 80시간, 81시간, 82시간, 83시간, 84시간, 85시간, 96시간, 87시간, 88시간, 89시간, 90시간, 91시간, 92시간, 93시간, 94시간, 95시간 또는 96시간) 내에 자발적인 출혈 삽화를 발생시키지 않는다. 특정한 양태에서, 예방은 (예를 들면, 65IU/㎏에서) 매주 1회 투약에 의해 매년 출혈 삽화를 평균 30% 초과(예를 들면, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89 또는 90% 초과, 예를 들면 50% 초과)로 감소시킨다. 본 명세서에서 사용되는 "치료학적 용량"은 본 명세서에 기재된 치료학적 목적을 성취하는 용량을 의미한다. 필요한 VIII 인자의 용량 계산은 평균적으로 체중 1㎏당 1IU의 VIII 인자가 혈장 VIII 인자 활성을 대략 2IU/dL로 증가시킨다는 경험적인 발견에 기초한다. 하기 식을 이용하여 필요한 용량을 결정한다:
필요한 단위 = 체중(㎏) x 원하는 VIII 인자 상승(IU/dL 또는 정상(%)) x 0.5(1IU/dL당 IU/㎏)
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 치료학적 용량은 약 10 내지 100IU/㎏, 더 구체적으로, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90 또는 90 내지 100IU/㎏, 더 구체적으로, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100IU/㎏이다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 추가의 치료학적 용량은 약 10 내지 약 150IU/㎏, 더 구체적으로, 약 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150IU/㎏, 더 구체적으로, 약 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 또는 150IU/㎏이다.
본 명세서에서 사용되는 "변이체"는 원래의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 다르지만, VIII 인자 응혈 활성 또는 Fc(FcRn 결합) 활성과 같은 이의 본질적인 특성을 보유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 일반적으로, 변이체는 전체적으로 밀접하게 유사하고, 많은 영역에서, 원래의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 동일하다. 변이체는 예를 들면 원래의 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 단편, 결실, 삽입 및 변형된 버전을 포함한다.
변이체 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5에서의 뉴클레오타이드 코딩 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열(개별적으로 또는 함께, VIII 인자 부분, Fc 부분) 또는 이에 대한 상보성 가닥, 공지된 돌연변이체 및 재조합 VIII 인자 또는 Fc의 뉴클레오타이드 코딩 서열, 예컨대 본 명세서에서 인용된 공보 및 특허에 개시된 것 또는 이에 대한 상보성 가닥, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(개별적으로 또는 함께, VIII 인자 부분, Fc 부분) 및/또는 임의의 이 핵산 분자의 폴리뉴클레오타이드 단편(예를 들면, 본 명세서에서 기재된 단편)을 포함하거나, 대안적으로 이것으로 이루어질 수 있다. 엄격한 하이브리드화 상태 또는 낮은 엄격도 상태 하에 이 핵산 분자에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한, 이 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드가 기능적인 한, 이것에서처럼 변이체로서 포함된다.
변이체 폴리펩타이드는 예를 들면 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 폴리펩타이드 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열(개별적으로 또는 함께, VIII 인자 부분, Fc 부분) 및/또는 임의의 이 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 단편(예를 들면, 본 명세서에서 기재된 단편)을 포함하거나, 대안적으로 이것으로 이루어질 수 있다.
기준 뉴클레오타이드 서열과 적어도, 예를 들면 95% "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산이란, 뉴클레오타이드 서열이 기준 뉴클레오타이드 서열의 각각의 100개의 뉴클레오타이드마다 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 기준 서열과 동일한 것으로 의도된다. 즉, 기준 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 얻기 위해, 기준 서열에서의 뉴클레오타이드의 5% 이하가 다른 뉴클레오타이드로 결실 또는 치환될 수 있거나, 기준 서열에서의 전체 뉴클레오타이드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오타이드가 기준 서열로 삽입될 수 있다. 질의 서열은 예를 들면 본 명세서에 기재된 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 전체 서열, ORF(open reading frame: 오픈 리딩 프레임) 또는 임의의 단편일 수 있다.
실질적인 문제로서, 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 임의의 특정한 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지를 결정할 수 있다. 일 실시양태에서, 문헌[Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 질의 서열(기준 또는 원래의 서열)과 전체 서열 정렬이라고도 칭하는 대상 서열 사이의 최고의 전체 일치율을 결정하는 방법을 결정할 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 대상 서열은 둘 다 DNA 서열이다. U를 T로 변환하여 RNA 서열을 비교할 수 있다. 상기 전체 서열 정렬의 결과는 동일성(%)이다. 다른 실시양태에서, 정체성(%)를 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTDB 정렬에서 이용되는 매개변수는 매트릭스 = 유니터리(Unitary), k 투플(k-tuple) = 4, 미스매치 패널티(Mismatch Penalty) = 1, 조이닝 패널티(Joining Penalty) = 30, 랜도미제이션 그룹 길이(Randomization Group Length) = 0, 컷오프 스코어(Cutoff Score) = 1, 갭 패널티(Gap Penalty) = 5, 갭 크기 패널티(Gap Size Penalty) 0.05, 윈도우 크기(Window Size) = 500 또는 대상 뉴클레오타이드 서열의 길이(어느 것이든 적은 것)이다.
대상 서열이 내부 결실이 아니라 5' 또는 3' 결실 때문에 질의 서열보다 짧기 때문에, 이 결과를 수동으로 보정해야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 동일성(%)을 계산할 때 대상 서열의 5' 및 3' 절두를 확인하지 않기 때문이다. 질의 서열에 비해 5' 또는 3' 말단에서 절두된 대상 서열의 경우, 질의 서열의 전체 염기의 퍼센트로서 일치/정렬되지 않은 대상 서열의 5' 및 3'인 질의 서열의 염기 수를 계산하여 동일성(%)을 보정한다. FASTDB 서열 정렬 결과에 의해 뉴클레오타이드가 일치/정렬되는지를 결정한다. 이후, 기재된 매개변수를 이용하여 상기 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성(%)으로부터 이 퍼센트를 빼서 최종 동일성(%) 스코어에 이른다. 이 보정된 스코어는 본 발명의 목적에 사용되는 것이다. 동일성(%) 스코어를 수동으로 조정할 목적으로, 질의 서열과 일치/정렬되지 않은, FASTDB 정렬에 의해 표시된 대상 서열의 5' 및 3' 염기 이외의 염기만을 계산한다.
동일성(%)을 결정하기 위해 예를 들면 90개의 염기 대상 서열을 100개의 염기 질의 서열에 정렬한다. 결실은 대상 서열의 5' 말단에서 발생해서, FASTDB 정렬은 5' 말단에서 처음 10개의 염기의 일치/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 않은 염기는 서열의 10%(일치되지 않은 5' 및 3' 말단에서의 염기 수/질의 서열에서의 전체 염기 수)를 나타내므로 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성(%) 스코어로부터 10%를 뺀다. 남은 90개의 염기가 완전히 일치하면, 최종 동일성(%)은 90%이다. 다른 예에서, 90개의 염기 대상 서열을 100개의 염기 질의 서열과 비교한다. 이때, 결실은 내부 결실이어서, 질의 서열과 일치/정렬되지 않은 대상 서열의 5' 또는 3'에서 염기가 없다. 이런 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성(%)을 수동으로 보정한다. 다시 한번, 질의 서열과 일치/정렬되지 않은 대상 서열의 5' 및 3' 염기만을 수동으로 보정한다. 본 발명의 목적을 위해 다른 수동 보정을 하지 않는다.
본 발명의 질의 아미노산 서열에 적어도, 예를 들면 95% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드란, 대상 폴리펩타이드 서열이 질의 아미노산 서열의 각각의 100개의 아미노산마다 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 대상 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 질의 서열과 동일한 것으로 의도된다. 즉, 질의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 얻기 위해, 대상 서열에서의 아미노산 잔기의 5% 이하가 다른 아미노산으로 삽입, 결실, (인델(indel)) 또는 치환될 수 있다. 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 또는, 기준 서열 내의 잔기 중에 개별적으로 또는 기준 서열 내의 1 이상의 인접 그룹 내에 배치된, 이 말단 위치 사이의 어느 곳에서도 기준 서열에서의 이러한 변경이 발생할 수 있다.
실질적인 문제로서, 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 임의의 특정한 폴리펩타이드가 예를 들면 서열 번호 2(개별적으로 또는 함께, VIII 인자 부분, Fc 부분) 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 공지된 VIII 인자 또는 Fc 폴리펩타이드 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지를 관습적으로 결정할 수 있다. 일 실시양태에서, 문헌[Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 질의 서열(기준 또는 원래의 서열)과 전체 서열 정렬이라고도 칭하는 대상 서열 사이의 최고의 전체 일치율을 결정하는 방법을 결정할 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 대상 서열은 뉴클레오타이드 서열 둘 다 또는 아미노산 서열 둘 다이다. 상기 전체 서열 정렬의 결과는 동일성(%)이다. 다른 실시양태에서, FASTDB 아미노산 정렬에서 이용되는 매개변수는 매트릭스 = PAM 0, k 투플 = 2, 미스매치 패널티 = 1, 조이닝 패널티 = 20, 랜도미제이션 그룹 길이 = 0, 컷오프 스코어 = 1, 윈도우 크기 = 서열 길이, 갭 패널티 = 5, 갭 크기 패널티 0.05, 윈도우 크기 = 500 또는 대상 아미노산 서열의 길이(어느 것이든 적은 것)이다.
대상 서열이 내부 결실이 아니라 N 또는 C 말단 결실 때문에 질의 서열보다 짧기 때문에, 이 결과를 수동으로 보정해야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 전체 동일성(%)을 계산할 때 대상 서열의 N 및 C 말단 절두를 확인하지 않기 때문이다. 질의 서열에 비해 N 및 C 말단에서 절두된 대상 서열의 경우, 질의 서열의 전체 염기의 퍼센트로서 상응하는 대상 잔기와 일치/정렬되지 않은 대상 서열의 N 및 C 말단인 질의 서열의 잔기 수를 계산하여 동일성(%)을 보정한다. FASTDB 서열 정렬 결과에 의해 잔기가 일치/정렬되는지를 결정한다. 이후, 기재된 매개변수를 이용하여 상기 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성(%)으로부터 이 퍼센트를 빼서 최종 동일성(%) 스코어에 이른다. 이 최종 동일성(%) 스코어는 본 발명의 목적에 사용되는 것이다. 질의 서열과 일치/정렬되지 않은, 대상 서열의 N 및 C 말단 이외의 잔기만이 동일성(%) 스코어를 수동으로 조정할 목적으로 고려된다. 즉, 질의 잔기만이 대상 서열의 가장 먼 N 및 C 말단 잔기 밖에 위치한다.
동일성(%)을 결정하기 위해 예를 들면 90개의 아미노산 잔기 대상 서열을 100개의 잔기 질의 서열에 정렬한다. 결실은 대상 서열의 N 말단에서 발생해서, FASTDB 정렬은 N 말단에서 처음 10개의 잔기의 일치/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 않은 잔기는 서열의 10%(일치되지 않은 N 및 C 말단에서의 잔기 수/질의 서열에서의 전체 잔기 수)를 나타내므로 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성(%) 스코어로부터 10%를 뺀다. 남은 90개의 잔기가 완전히 일치하면, 최종 동일성(%)은 90%이다. 다른 예에서, 90개의 잔기 대상 서열을 100개의 잔기 질의 서열과 비교한다. 이때, 결실은 내부 결실이어서, 질의 서열과 일치/정렬되지 않은 대상 서열의 N 또는 C 말단에서 염기가 없다. 이런 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성(%)을 수동으로 보정한다. 다시 한번, 질의 서열과 일치/정렬되지 않은, FASTDB 정렬에서 나타난, 대상 서열의 N 및 C 말단 끝만을 수동으로 보정한다. 본 발명의 목적을 위해 다른 수동 보정을 하지 않는다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 코딩 영역, 비코딩 영역 또는 둘 다의 변경을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 침묵 치환, 부가 또는 결실을 생성하지만, 코딩된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성을 변경하지 않는 변경을 포함한다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오타이드 변이체는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 침묵 치환에 의해 제조된다. 다른 실시양태에서, 변이체에서 5개 내지 10개, 1개 내지 5개 또는 1개 내지 2개의 아미노산이 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 부가된다. 예를 들면, 특정한 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해(인간 mRNA에서 코돈을 다른 것, 예를 들면 박테리아 숙주 예컨대 이. 콜라이로 변경하는 것) 다양한 이유로 폴리뉴클레오타이드 변이체를 제조할 수 있다.
천연 변이체를 "대립형질 변이체"이라 칭하고, 유기체의 염색체에서 소정의 유전좌위를 점유하는 유전자의 여러 교대 형태를 의미한다[Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)]. 이 대립형질 변이체는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 수준에서 변할 수 있고, 본 발명에 포함된다. 대안적으로, 돌연변이유발 기법 또는 직접 합성에 의해 비천연 변이체를 제조할 수 있다.
단백질 조작 및 재조합 DNA 기술의 공지된 방법을 이용하여, 폴리펩타이드의 특성을 개선하거나 변경하기 위해 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 실질적인 생물학적 기능 손실 없이 분비된 단백질의 N 말단 또는 C 말단으로부터 1개 이상의 아미노산이 결실될 수 있다. 문헌[Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993)](본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)은 3개, 8개 또는 27개의 아미노 말단 아미노산 잔기를 결실시킨 후에도 헤파린 결합 활성을 갖는 변이체 KGF 단백질을 보고하고 있다. 유사하게, 인터페론 감마는 이 단백질의 카복시 말단으로부터 8개 내지 10개의 아미노산 잔기를 결실시킨 후 10배 이하의 높은 활성을 나타낸다[Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)].
더구나, 충분한 근거가 변이체가 천연 단백질과 유사한 생물학적 활성을 대개 보유한다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 게일(Gayle) 및 동료[J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]는 인간 사이토카인 IL-1a의 광범위한 돌연변이 분석을 수행하였다. 이들은 랜덤 돌연변이유발을 이용하여 전체 분자 길이에 걸쳐 변이체마다 평균 2.5개의 아미노산이 변경된 3,500개 초과의 각각의 IL-1a 돌연변이체를 생성하였다. 가능한 아미노산 위치에서마다 여러 돌연변이를 조사하였다. 조사자는 "대부분의 분자가 [결합 또는 생물학적 활성]에 영향을 거의 주지 않으면서 변경된다."(요약 참조)는 것을 발견하였다. 사실, 시험된 3,500개 초과의 뉴클레오타이드 서열 중에서 23개의 독특한 아미노산 서열만이 야생형으로부터 활성이 유의적으로 다른 단백질을 제조하였다.
상기 기재된 바대로, 폴리펩타이드 변이체는 예를 들면 변형된 폴리펩타이드를 포함한다. 변형은 예를 들면 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, gpa 모이어티의 공유 결합, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 가교결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포밀화, 감마-카복실화, 글라이코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, PEG화[Mei et al., Blood 116:270-79 (2010)(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)], 단백질분해 처리, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미체화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 운반 RNA 매개 첨가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, VIII 인자는 임의의 편리한 자리에서 변형, 예를 들면 페길화된다. 몇몇 실시양태에서, VIII 인자는 VIII 인자의 표면 노출 아미노산, 예를 들면 조작된 시스테인일 수 있는 표면 노출 시스테인에서 페길화된다. Id. 몇몇 실시양태에서, 변형된 VIII 인자, 예를 들면 페길화 VIII 인자는 지속성 VIII 인자이다.
본 명세서에서 사용되는 "정상 상태에서의 분포 용적(Vss)"은 약물이 분포하는 명확한 공간(용적)인 약리학에서 사용되는 용어와 동일한 의미를 갖는다. Vss = 정상 상태에서 혈장 농도로 나눈 신체에서의 약물의 양.
본 명세서에서 사용되는 범위에서의 "약"은 범위의 끝 둘 다를 변경한다. 따라서, "약 10개 내지 20개"는 "약 10개 내지 약 20개"를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 키메라 폴리펩타이드는 처리된 VIII 인자 또는 단쇄 VIII 인자 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "처리된 VIII 인자"는 1648번 아르기닌(전장 VIII 인자의 경우) 또는 754번 아르기닌(B 도메인 결핍 VIII 인자의 경우), 즉 세포내 처리 자리에서 절단된 VIII 인자를 의미한다. 세포내 처리 자리에서의 절단으로 인해, 처리된 VIII 인자는 중쇄인 제1 사슬 및 경쇄인 제2 사슬의 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 예를 들면, 처리된 VIII 인자-Fc 융합 단백질(즉, Fc에 융합된 중쇄 및 경쇄)은 비환원 SDS-PAGE에서 각각 대략 90kDa 및 130kDa가 되고, 환원 SDS-PAGE에서 각각 90kDa 및 105kDa가 된다. 따라서, 일 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드 내의 VIII 인자 부분의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%는 처리된 VIII 인자이다. 다른 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드 내의 VIII 인자 부분의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%는 처리된 VIII 인자이다. 특정한 실시양태에서, 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드로부터 정제(또는 단리)되고, 키메라 폴리펩타이드 내의 VIII 인자 부분의 적어도 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%는 처리된 VIII 인자이다.
본 명세서에서 사용되는 "단쇄 VIII 인자", "SC VIII 인자" 또는 "SCFVIII"는 아르기닌 자리(전장 VIII 인자의 경우 1648번 잔기(즉, 서열 번호 6의 1667번 잔기) 또는 B 도메인 결핍 VIII 인자의 경우 754번 잔기(즉, 서열 번호 2의 773번 잔기))에서 절단되지 않은 VIII 인자를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 키메라 폴리펩타이드 내의 단쇄 VIII 인자는 단쇄를 포함한다. 일 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자는 온전한 세포내 처리 자리를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 단쇄 VIII 인자는 전장 VIII 인자에서 1645번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이, 1648번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이, 1645번 아르기닌 및 1648번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서의 치환 또는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 1645번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 1648번 아르기닌에 상응하는 아미노산 위치에서 치환된 아미노산과 다른 아미노산이다. 특정한 양태에서, 치환 또는 돌연변이는 아르기닌 이외의 아미노산, 예를 들면 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 티로신, 히스티딘, 오르니틴, 피롤라이신 또는 타우린이다. 단쇄 VIII 인자-Fc 융합 단백질은 비환원 SDS-PAGE에서 대략 220kDa가 되고, 환원 SDS-PAGE에서 대략 195kDa가 될 수 있다.
일 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드로부터 정제(또는 단리)되고, 본 명세서에서 사용되는 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100%는 단쇄 VIII 인자이다. 다른 실시양태에서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30% 또는 약 35%는 단쇄 VIII 인자이다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에서 사용되는 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 40%는 단쇄 VIII 인자이다. 특정한 실시양태에서, 본 명세서에서 사용되는 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20% 약 25%, 약 30%, 약 35%는 단쇄 VIII 인자이다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에서 사용되는 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%는 단쇄 VIII 인자이다. 몇몇 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드의 처리된 VIII 인자에 대한 단쇄 VIII 인자의 비율은 (a) 단쇄 VIII 인자의 약 25% 및 처리된 VIII 인자의 약 75%; (b) 단쇄 VIII 인자의 약 20% 및 처리된 VIII 인자의 약 80%; (c) 단쇄 VIII 인자의 약 15% 및 처리된 VIII 인자의 약 85%; (d) 단쇄 VIII 인자의 약 10% 및 처리된 VIII 인자의 약 90%; (e) 단쇄 VIII 인자의 약 5% 및 처리된 VIII 인자의 약 95%; (f) 단쇄 VIII 인자의 약 1% 및 처리된 VIII 인자의 약 99%; (g) 처리된 VIII 인자의 약 100%, (h) 단쇄 VIII 인자의 약 30% 및 처리된 VIII 인자의 약 70%, (i) 단쇄 VIII 인자의 약 35% 및 처리된 VIII 인자의 약 65% 또는 (j) 단쇄 VIII 인자의 약 40% 및 처리된 VIII 인자의 약 60%이다. 다른 실시양태에서, 키메라 폴리펩타이드의 처리된 VIII 인자에 대한 단쇄 VIII 인자의 비율은 (a) 단쇄 VIII 인자의 약 30% 및 처리된 VIII 인자의 약 70%; (b) 단쇄 VIII 인자의 약 40% 및 처리된 VIII 인자의 약 60%; (c) 단쇄 VIII 인자의 약 50% 및 처리된 VIII 인자의 약 50%; (d) 단쇄 VIII 인자의 약 60% 및 처리된 VIII 인자의 약 40%; (e) 단쇄 VIII 인자의 약 70% 및 처리된 VIII 인자의 약 30%; (f) 단쇄 VIII 인자의 약 80% 및 처리된 VIII 인자의 약 20%; (g) 단쇄 VIII 인자의 약 90% 및 처리된 VIII 인자의 약 10%; (h) 단쇄 VIII 인자의 약 95% 및 처리된 VIII 인자의 약 5%; (i) 단쇄 VIII 인자의 약 99% 및 처리된 VIII 인자의 약 1%; 또는 (j) 단쇄 VIII 인자의 약 100%이다.
본 명세서에서 사용되는 키메라 폴리펩타이드 내의 VIII 인자 부분은 VIII 인자 활성을 갖는다. 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 VIII 인자 활성을 측정할 수 있다. 예를 들면, 이 방법 중 하나는 발색 검정일 수 있다. 발색 검정 기전은 혈액 응고 케스케이드의 원칙에 기초하고, 여기서 활성화된 VIII 인자는 활성화된 IX 인자, 인지질 및 칼슘 이온의 존재 하에 X 인자의 Xa 인자로의 전환을 촉진한다. Xa 인자에 특이적인 p-나이트로아닐리드(pNA) 기질의 가수분해에 의해 Xa 인자 활성을 평가한다. 405nM에서 측정된 p-나이트로아닐린의 초기 방출 속도는 Xa 인자 활성에 직접적으로 비례하고, 따라서 샘플에서 VIII 인자 활성에 직접적으로 비례한다. 국제 혈전 지혈 학회(International Society on Thrombosis and Hemostatsis: ISTH)의 과학 및 표준화 위원회(Scientific and Standardization Committee: SSC)의 VIII 인자 및 IX 인자 소위원회는 발색 검정을 추천한다. 1994년부터, 발색 검정은 또한 FVIII 농축물 효능의 임무에 대한 유럽 약전의 표준 방법이다. 따라서, 일 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는, VIII 인자 활성을 발색 검정에 의해 실험실내 측정할 때, 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개에 융합됨)에 필적하는 VIII 인자 활성을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 Xa 인자 생성률을 갖는다.
X 인자를 Xa 인자로 활성화하기 위해, 활성화된 IX 인자(IXa 인자)는 X 인자에서 1개의 아르기닌-아이소류신 결합을 가수분해하여 Ca2+, 막 인지질 및 VIII 인자 보조인자의 존재 하에 Xa 인자를 형성한다. 따라서, VIII 인자와 IX 인자의 상호작용은 응고 경로에서 중요하다. 특정한 양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 속도에서 IXa 인자와 상호작용할 수 있다.
또한, VIII 인자는 순환 시 불활성되면서 폰 빌레브란트 인자에 결합한다. VIII 인자는 vWF에 결합하지 않을 때 신속히 분해되고 트롬빈의 작용에 의해 vWF로부터 방출된다. 몇몇 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 속도에서 폰 빌레브란트 인자에 결합한다.
VIII 인자는 칼슘 및 인지질의 존재 하에 활성화 C 단백질에 의해 불활성화될 수 있다. 활성화 C 단백질은 A1 도메인에서 336번 아르기닌 후 VIII 인자 중쇄를 절단하고, 이 도메인은 X 인자 기질 상호작용 자리를 파괴하고 A2 도메인에서 562번 아르기닌 후 절단(A2 도메인의 해리를 증대시킴)할 뿐만 아니라, IXa 인자와의 상호작용 자리를 파괴한다. 이 절단은 또한 A2 도메인(43kDa)을 이등분하고 A2-N(18kDa) 및 A2-C(25kDa) 도메인을 생성한다. 따라서, 활성화 C 단백질은 중쇄에서 여러 절단 자리를 촉매화할 수 있다. 일 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 수준으로 활성화 C 단백질에 의해 불활성화된다.
다른 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 생체내 VIII 인자 활성을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 HemA 마우스 꼬리 정맥 절제 모델에서 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 수준으로 HemA 마우스를 보호할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "필적하는"은 키메라 폴리펩타이드를 사용하여 얻은 비교된 속도 또는 수준이 기준 속도 또는 수준과 동일하거나, 실질적으로 동일하거나, 유사하다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유사한"은 비교된 속도 또는 수준이 기준 속도 또는 수준(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드에 의한 FXa 생성률, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)과 10% 이하 또는 15% 이하의 차이를 갖는다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로 동일한"은 비교된 속도 또는 수준이 기준 속도 또는 수준과 0.01%, 0.5% 또는 1% 이하의 차이를 갖는다는 것을 의미한다.
본 발명은 VIII 인자 활성을 갖는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 추가로 포함하고, 키메라 폴리펩타이드의 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%는 단쇄 VIII 인자인 VIII 인자 부분 및 제2 부분을 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물 내의 키메라 폴리펩타이드의 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%는 단쇄 VIII 인자이다. 다른 실시양태에서, 제2 부분은 Fc, XTEN, 알부민, PAS 서열, 트랜스페린, CTP(4 O-글라이칸을 갖는 hCG의 28개의 아미노산 C 말단 펩타이드(CTP)), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 알부민 결합 폴리펩타이드, 알부민 결합 소분자 또는 이들의 2 이상의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 처리된 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드 및 단쇄 VIII 인자를 포함하는 키메라 폴리펩타이드의 조합을 포함하고, (a) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 30%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 70%는 처리된 VIII 인자이거나; (b) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 40%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 60%는 처리된 VIII 인자이거나; (c) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 50%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 50%는 처리된 VIII 인자이거나; (d) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 60%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 40%는 처리된 VIII 인자이거나; (e) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 70%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 30%는 처리된 VIII 인자이거나; (f) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 80%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 20%는 처리된 VIII 인자이거나; (g) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 90%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 10%는 처리된 VIII 인자이거나; (h) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 95%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 5%는 처리된 VIII 인자이거나; (i) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 99%는 단쇄 VIII 인자이고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 1%는 처리된 VIII 인자이거나; (j) 상기 키메라 폴리펩타이드의 VIII 인자 부분의 약 100%는 단쇄 VIII 인자이다.
특정한 양태에서, 본 발명의 조성물은, VIII 인자 활성을 발색 검정에 의해 실험실내 측정할 때, 처리된 VIII 인자를 포함하는 조성물(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개에 융합됨)에 필적하는 VIII 인자 활성을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 처리된 VIII 인자를 포함하는 조성물(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 Xa 인자 생성률을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 조성물은 처리된 VIII 인자를 포함하는 조성물(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 속도로 IXa 인자와 상호작용할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 조성물의 키메라 폴리펩타이드 내의 단쇄 VIII 인자는 조성물(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)의 키메라 폴리펩타이드 내 처리된 VIII 인자에 필적하는 수준으로 활성화 C 단백질에 의해 불활성화된다. 특정한 실시양태에서, 단쇄 VIII 인자를 포함하는 조성물은 처리된 VIII 인자를 포함하는 조성물(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 생체내 VIII 인자 활성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 단쇄 VIII 인자를 포함하는 조성물은 HemA 마우스 꼬리 정맥 절제 모델에서 처리된 VIII 인자를 포함하는 조성물(예를 들면, 2개의 Fc 부분 및 처리된 VIII 인자로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 상기 처리된 VIII 인자는 2개의 Fc 부분 중 1개의 Fc에 융합됨)에 필적하는 수준으로 HemA 마우스를 보호할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 조성물을 사용하여 인간 피험체에서 출혈 상태를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 방법은 VIII 인자를 필요로 하는 피험체에게 VIII 인자 활성을 갖는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물/제제를 투여하는 단계를 포함하고, 키메라 폴리펩타이드의 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%는 단쇄 VIII 인자인 VIII 인자 부분 및 제2 부분을 포함한다.
출혈 상태는 혈액 응고 장애에 의해 야기될 수 있다. 혈액 응고 장애는 또한 응고장애라 칭할 수 있다. 일례에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 혈액 응고 장애는 혈우병 또는 폰빌레브란트 질환(vWD)이다. 다른 예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 혈액 응고 장애는 A형 혈우병이다.
몇몇 실시양태에서, 출혈 상태과 관련된 출혈의 유형은 관절혈증, 근육 출혈, 경구 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구내 출혈, 외상, 두근 외상, 위장 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강내 출혈, 복막후강내 출혈 및 장요근초내 출혈로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 출혈 상태를 앓는 피험체는 예를 들면 수술적 예방 또는 수술후 관리를 비롯한 수술 치료를 필요로 한다. 일례에서, 수술은 소수술 및 대수술로부터 선택된다. 예시적인 수술 절차는 발치, 편도선 수술, 서혜부 절제술, 활막절제술, 개두술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술, 관절 대체 수술(예를 들면, 슬관절 전치환술, 고관절 치환술 등), 심장 수술 및 제왕절개 수술을 포함한다.
다른 예에서, FIX로 피험체를 부수적으로 치료된다. 본 발명의 화합물은 FIXa를 활성화할 수 있으므로, 피험체에게 FIXa를 투여하기 전에 FIXa 폴리펩타이드를 예비활성화하기 위해 이것을 사용한다.
예방학적 치료 또는 온디맨드식 치료를 필요로 하는 피험체에서 본 발명의 방법을 실행할 수 있다.
예를 들면, 국소(예를 들면, 경피 또는 안과), 경구, 협측, 비강, 질내, 직장 또는 비경구 투여를 비롯한 임의의 적절한 투여 방식에 대해 단쇄 VIII 인자의 적어도 30%를 포함하는 약제학적 조성물을 제제화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 비경구는 피하, 피내, 맥관내(예를 들면, 정맥), 근육내, 척추, 두개내, 척추강내, 안내, 안주위, 안와하강, 활액내 및 복강내 주사, 및 임의의 유사한 주사 또는 점적 기법을 포함한다. 조성물은 또한 예를 들면 현탁액, 에멀션, 지속 방출 제제, 크림, 겔 또는 산제일 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트라이글라이세라이드와 같은 담체와 좌제로서 제제화될 수 있다.
일례에서, 약제학적 제제는 액체 제제, 예를 들면 완충 등장성 수용액이다. 다른 예에서, 약제학적 조성물은 생리학적 pH이거나, 생리학적 pH에 가깝다. 다른 예에서, 수성 제제는 생리학적 오스몰농도 및 염도를 갖거나 생리학적 오스몰농도 및 염도에 가깝다. 이것은 염화나트륨 및/또는 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명의 조성물을 동결건조한다.
본 발명이 자세히 기재되어 있고, 하기 실시예에 대한 참조문헌으로 동일사항이 더 명확히 이해되고, 이 실시예는 오직 예시 목적으로 본 명세서에 포함되고, 본 발명의 제한으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공보는 참조문헌으로 명확히 포함된다.
실시예
실시예 1
rFVIIIFc의 클로닝, 발현 및 정제
표준 기법에 따라 모든 분자 생물학 절차를 수행하였다. 인간 간 폴리A RNA로부터 역전사 중합효소 사슬 반응(RT-PCR)에 의해 이의 네이티브 신호 서열을 포함하는 인간 FVIII(진뱅크 수탁 번호 NM_000132)의 코딩 서열을 얻었다. FVIII의 큰 크기로 인해, 여러 섹션에서 별개의 RT-PCR 반응으로부터 코딩 서열을 얻고, 743번 세린(S743)을 1638번 글루타민(Q1638)에 융합하고, 전장 FVIII의 B 도메인으로부터 2682bp를 제거하여, 일련의 PCR 반응, 제한 분해 및 결찰을 통해 B 도메인 결핍(BDD) FVIII 코딩 영역을 포함하는 중간 클로닝 벡터로 조립하였다. 인간 IgG1 Fc 서열(예를 들면, 진뱅크 수탁 번호 Y14735)을 백혈구 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 얻고, BDD FVIII 서열이 개재 링커 없이 Fc 서열의 N 말단(힌지, CH2 및 CH3 도메인, IgG1 서열의 D221에서 시작함, EU 넘버링)에 직접적으로 융합되는 방식으로 최종 발현 카세트를 제조하였다. Fc 사슬 단독의 발현을 위해, 마우스 Igκ(카파) 경쇄 신호 서열을 합성 올리고뉴클레오타이드로 생성하고, PCR을 이용하여 Fc 코딩 서열에 부가하여 이 단백질 생성물을 분비시켰다. FVIIIFc 및 Fc 사슬 코딩 서열을 pBudCE4.1(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드)인 이중 발현 벡터로 클로닝하였다.
리포펙타민 형질감염 시약(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드))을 사용하여 HEK 293H 세포(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드)를 pSYN-FVIII-013 플라스미드로 형질감염시키고, 안정한 세포주를 제오신으로 선택하였다. 세포를 혈청 비함유 현탁액 배양물에서 성장시키고, FVIII 특이적 친화도 정제 단계[McCue J. et al., J. Chromatogr. A., 1216(45): 7824-30 (2009)]를 포함하는 4개의 컬럼 정제 공정, 이어서 음이온 교환 컬럼 및 소수성 상호작용 컬럼의 조합을 이용하여 투명한 수확 배지로부터 rFVIIIFc 단백질을 정제하였다.
실시예 2
생화학적 규명
처리된 재조합 FVIII-Fc(rFVIIIFc)를 2개의 폴리펩타이드 사슬로서 합성하고, BDD-FVIII(S743-Q1638 융합, 1438개의 아미노산)로 이루어진 1개의 사슬은 1664개의 아미노산의 전체 사슬 길이에 대해 IgG1(D221로부터 G456으로 연장되는 226개의 아미노산, EU 넘버링)의 Fc 도메인(힌지, CH2 및 CH3 도메인)에 융합되고, 다른 사슬은 동일한 Fc 영역 단독(226개의 아미노산)으로 이루어진다. FVIIIFc/Fc로 형질감염된 세포를 통해, 이중 발현 플라스미드는 3종의 생성물(FVIIIFc 이합체, FVIIIFc 단량체 및 Fc 이합체)을 분비하는 것으로 예상되었고, 오직 FVIIIFc 단량체 및 Fc 이합체만이 순화 배지에서 검출되었다. 비환원 및 환원 SDS-PAGE 분석(도 2a 및 도 2b)에 의해 정제된 FVIIIFc를 분석하였다. 비환원 SDS-PAGE의 경우, 밴드가 FVIIIFc 중쇄(HC) 및 경쇄-이합체 Fc 융합(LCFc2)(도 2a, 3 레인)의 예상된 분자량과 일치하는 대략 90kDa 및 130kDa에서 이동하는 것으로 발견되었다. 단쇄 FVIIIFc(SC FVIIIFc; HC+LCFc2)에 대해 예상된 분자량과 일치하는 대략 220kDa에서 제3 밴드가 또한 검출되었고, 754번(전장 서열과 관련하여 1648번) 위치에서의 아르기닌 잔기는 분비 동안 절단되지 않았다. 환원 SDS-PAGE 분석의 경우, 주요 밴드가 단쇄 Fc, HC, LCFc 및 SC FVIIIFc(도 2b, 3 레인)에 대한 예상된 분자량과 일치하는 대략 25kDa, 90kDa, 105kDa 및 195kDa에서 이동하는 것으로 나타났다. 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신(PCSK) 타입 프로테아제의 구성원인 인간 PC5에 의한 동시형질감염은 rFVIIIFc 생성물(도 2a, 도 2b, 2 레인)을 완전 처리시켰다.
SDS-PAGE 후 rFVIIIFc의 여러 배취(batch)의 농도계 분석은 98% 초과의 순도의 예상된 밴드를 나타냈다. 존재하는 응고 정도를 평가하기 위해 또한 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC)를 사용하고, 모든 배취는 0.5% 이하에서 응고 수준을 갖는 것으로 발견되었다.
LC/UV 및 LC/MS에 의해 트롬빈 절단, 환원 및 분석에 의해 rFVIIIFc 구조를 추가로 분석하였다. Fc(피크 1), 경쇄-Fc(피크 2); 중쇄로부터의 A1 도메인(피크 3) 및 중쇄로부터의 A2 도메인(피크 4)의 단백질의 세그먼트에 상응하는, (372번, 740번 및 795번(795번은 전장 FVIII 서열과 관련하여 1689번에 상응함) 위치에서 3개의 아르기닌 잔기에서의 절단에 의해) 트롬빈에 의해 생성된 4개의 VIII 인자 단편을 UV 흡광도(도 2c)에 의해 검출할 수 있다. 이의 작은 크기로 인해 UV 흡광도에 의해 14개의 아미노산 B 도메인 링커 및 약 6kD의 a3 연관 펩타이드가 검출되지 않았다.
HPLC/MS에 의한 rFVIIIFc의 트롬빈 분해의 분석은 4개의 주요 도메인 및 약 6kDa의 a3 연관 펩타이드의 상세한 설명을 추가로 제공하고, 동일한 방법을 이용하여 CHO 유래 재조합 BDD-FVIII 단백질(rBDD FVIII)인 레팍토(등록 상표)와 비교하였다. FVIII 샘플을 트윈의 제거(Tween)를 위해 디터전트(Detergent)-OUTDTG-100X 컬럼(쥐바이오사이언스(GBioscience), 미국 미주리주 메릴랜드 하이라이츠)을 통과시키고, 트롬빈으로 완전 분해시키고, 환원시키고, 물 + 0.1% 포름산 중의 아세토나이트릴의 구배를 이용하여 RP-HPLC-UV(POROS R1/10, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 또는 RP-HPLC-MS(애질런트(Agilent) 6210TOF 질량 분광계에 커플링된 애질런트 1200)에 의해 분석하였다. 펩타이드 서열을 또한 LysC 펩타이드 맵핑에 의해 확인하고, RP-HPLC/MS(써모 피닌간(Thermo Finnigan) LTQ-XL-ETD)에 의해 분석하였다.
예상된 바대로, rFVIIIFc의 전체 이온 전류(TIC) 크로마토그램(도 2d)은 UV 크로마토그램(도 2c)과 유사하게 보였다. 처리된 및 단쇄 아이소폼으로부터 생성된 a3 산성 영역의 2개의 형태를 포함하는 예상된 6종의 생성물 중 5종, 및 분해를 위해 사용된 트롬빈을 LC/MS에 의해 검출할 수 있다. a3 산성 영역의 추가의 절두 형태가 또한 관찰되었고, 하기 더 완전히 기재되어 있다. rBDD FVIII는 유사한 TIC 크로마토그램을 생성하였지만, 유리 Fc 사슬이 없고, Fc 영역(데이터 비기재) 결여와 일치하는 rFVIIIFc LC-Fc와 비교하여 LC에 상이한 질량을 가졌다.
많은 단백질에 대한 글라이코실화의 이질성으로 인해, A1, LC-Fc 및 Fc 영역에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼은 복잡하고, 따라서 모든 분자 이온의 정체성이 확립되지 않았다. 그러나, Fc 영역으로부터의 3개의 주요 피크에 대해 관찰된 질량은 0개, 1개 또는 2개의 갈락토스 잔기에서 끝나는 비안테나리(biantennary) 올리고사카라이드에 상응하는 IgG 분자에서 발견된 G0, G1 및 G2 아이소폼과 일치하는 것으로 발견되었다. a3 연관 펩타이드 및 A2 도메인의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼은, 이 영역에서 번역후 변형에 이질성이 없어, 예상된 질량이 분명하게 확인되므로, 대부분의 한정적인 데이터를 제공한다.
R1689 절단 후 LC로부터 방출된 6kDa의 N 말단 펩타이드는 처리된 아이소폼으로부터 유래하는 경우 a3 산성 영역(E1649 내지 R1689 아미노산)을 포함하고, 14개의 아미노산 절두 B 도메인은 단쇄 아이소폼으로부터 유래하는 경우 a3 산성 영역에 융합되는 것으로 예상된다. rFVIIIFc 및 rBDD FVIII 둘 다는 SDS-PAGE 분석에 기초한 예상된 수준에 비례하여 a3 영역의 형태 둘 다를 포함하는 것으로 관찰되었다. 또한, 단백질 둘 다 다른 FVIII 생성물에 보고된 것처럼 D1658-R1689 아미노산에 상응하는 a3 영역의 절두 형태를 포함하지만, rFVIIIFc에서보다 rBDD FVIII에서 더 풍부한 것으로 발견되었다.
A2 도메인은 3개의 잠재적 티로신 황산화 자리를 포함하지만, 복잡한 이질성을 발생시키는 글라이코실화 자리를 포함하지 않고, 따라서 이 영역의 정확한 질량을 계산할 수 있었다. S373 내지 R740 서열의 질량과 관련되는 rFVIIIFc의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼에서의 1차 예상된 피크 이외에(도 2e), E720 및 Y729에서 절두된 A2 도메인과 관련되는 FVIII HC의 공지된 절두에 상응하는 2개의 추가의 형태가 확인되었다. 이 보고된 절두 형태는 rBDD FVIII A2의 디콘볼루션된 스펙트럼에서 직접적으로 또한 관찰되었다(도 2e). rFVIIIFc 및 rBDD FVIII A2 둘 다 Y729에서 절두된 형태의 유사한 상대량을 포함하지만, rBDD FVIII A2 도메인은, rFVIIIFc에서의 동일한 형태(도 2e)와 비교하여, E720에서 절두된 형태의 특히 높은 수준을 포함하였다.
라이실 엔도펩티다제(Lys-C) 분해, 이어서 UV 및 질량 분광계 검출에 의해 펩타이드 맵핑에 의해 rFVIIIFc의 1차 서열을 확인하였다. rFVIIIFc로부터 제조된 99개의 이론적 펩타이드 중, 전체 서열의 98%에 상응하는 81개가 검출되었다. 이 방법에 의해 rFVIIIFc의 번역후 변형을 또한 규명하였다. FVIII는 346번, 718번, 719번, 723번, 1664번 및 1680번 위치에 상응하는 6개의 잠재적 티로신 황산화 자리를 포함하였다. 이 6개의 자리에 상응하는 완전 황산화 펩타이드가 발견되었고, 1680번 위치에 상응하는 미량의 비황산화 펩타이드를 질량 스펙트럼에서 전체 이온 크로마토그램의 통합에 의해 평가하고, 다른 위치에 상응하는 비황산화 펩타이드가 검출 가능하지 않았다. BDD FVIII는 또한 6개의 잠재적 N-글라이코실화 자리를 포함하고, 이들 중 4개는 재조합 FVIII 생성물에서 글라이코실화되는 것으로 보고되었다. 이와 일치하게, rFVIIIFc는 글라이코실화된 동일한 4개의 자리를 갖는 것으로 발견되었고; N239 및 N2118은 높은 만노스 구조를 포함하는 것으로 발견되었고, N41 및 N1810은 rBDD FVIII에서 발견되는 것과 유사한 더 복잡한 탄수화물을 포함하는 것으로 발견되었다. Fc 영역 N 연결 글라이코실화는 LC/MS에 의해 트롬빈 맵에 의해 발견된 G0, G1 및 G2 아이소폼과 일치하는 것으로 발견되었다. FVIII는 부분 점유된 741번 및 743번 Ser에서 O-글라이코실화 자리를 갖는 것으로 보고되었고, 이것이 또한 rFVIIIFc에 의해 그 경우인 것으로 발견되었다.
동시형질감염된 처리 효소 없이 제조된 rFVIIIFc 폴리펩타이드는 R754와 E755(전장 FVIII와 관련하여 R1648/E1649) 사이의 단일 펩타이드 결합에 의해 처리된 rFVIIIFc와 다른 15% 내지 25%의 단쇄 FVIIIFc(SC FVIIIFc)를 나타냈다. 상기 기재된 모든 생화학적 검정에서 이 아이소폼을 정제하고 규명하고, 하기 기재된 rFVIIIFc와 필적하는 것으로 발견되었다. 정제된 단쇄 FVIIIFc의 활성은 발색 검정 및 하기 기재된 다양한 기능적 검정에서 rFVIIIFc와 유사한 것으로 발견되었다.
발색 및 1단계 aPTT 검정에 의한 FVIII 활성의 측정
FVIII 발색 검정에 의해 FVIII 활성을 측정하였다. rFVIIIFc의 4개의 별개의 배취의 평균 비활성은 발색 검정에 의해 2148±99IU/nmol에 상응하는 9762±449IU/㎎인 것으로 발견되었다. rFVIIIFc의 14개의 별개의 배취로부터의 평균 비활성은, 각각 1861±154 및 2057±298IU/nmol에 상응하는, aPTT 검정에 의해 8460±699IU/㎎이고, 발색 검정에 의해 9348±1353IU/㎎인 것으로 발견되었다. 단쇄 FVIII:Fc의 FVIII 활성을 발색 검정에 의해 또한 측정하고 완전 처리된 rFVIII:Fc 또는 rFVIII:Fc DS(약 25%의 단쇄 rFVIII:Fc 포함)와 비교하였다. 표 3A가 나타낸 바대로, 단쇄 rFVIIIFc는 폰 빌레브란트 인자(VWF)의 부재 및 존재 둘 다 하에 발색 검정에 의해 완전 처리된 FVIIIFc 또는 rFVIIIFc DS의 VIII 인자 활성과 비교하여 FVIII 활성에서 유의차를 나타내지 않았다. 표 3B는 1단계 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정에 의해 측정된 SCrFVIIIFc의 완전 활성이 VWF의 부재 하에 관찰된다는 것을 나타낸다.
1단계 응고 검정(APTT)에서, SC rFVIIIFc는 혈장이 정상 VWF 수준을 가질 때 60% 활성 증가를 나타내어, SC rFVIIIFc의 활성화에서 VWF의 잠재적 역할을 제시한다. 다시 FVIII/VWF 결핍 혈장(표 3)에 인간 VWF의 첨가에 의해 이 관찰을 추가로 확인하고, SC rFVIIIFc의 응혈 활성은 FVIII 결핍 혈장에서와 동일한 수준으로 감소하였다.
Xase 복합체에서의 활성
칼슘의 존재 하에 인지질 표면에서 활성화된 FIX 및 트롬빈 활성화 레팍토(등록 상표) 또는 rFVIIIFc 단백질을 항온처리하고, 발색 또는 형광원 기질의 절단에 의해 측정(이로부터 FXa 생성률을 결정함)된 FX의 FXa로의 전환율을 모니터링하여, Xase 복합체와 관련하여 FVIII 활성을 또한 측정하였다. 이후, 검정의 다양한 1종의 성분에 의해 이 검정을 변형시키면서, 각각의 개별 성분과의 상호작용을 검사하기 위해 다른 상수를 유지시켰다.
합성 인지질 소포(25%의 포스포타딜 세린/75%의 포스포타딜 콜린)를 사용하여 rFVIIIFc DS, rBDD FVIII 및 단쇄 rFVIIIFc(도 3a)에 대한 다양한 인지질 농도의 함수로서 FXa 생성률을 결정하였다. 단백질 둘 다 대략 156μM 인지질에서 피크 활성인 유사한 활성 프로필을 갖는 것으로 발견되었다.
이후, 다양한 FX 농도 및 계산된 Km 및 Vmax 값의 함수로서 FXa 생성률을 결정하였다(도 3b). rFVIIIFc DS, rBDD FVIII 및 단쇄 rFVIIIFc에 대한 활성 프로필은 유사한 Km 및 Vmax로 유사한 것으로 발견되었다(표 4). 마지막으로, 다양한 FIX 농도의 함수로서 FXa 생성률을 결정하였다(도 3c). 활성 프로필은 유사한 Kd 및 Vmax로 유사한 것으로 보였다(표 4). 인지질원으로서 혈소판을 사용하여 유사한 결과를 얻었다(비공개 데이터, 2009년 6월).
APC에 의한 불활성화
활성이면, 활성화 C 단백질(APC)에 의한 절단, 및 A2 도메인의 해리에 의해 FVIII를 불활성화하였다. rFVIIIFc 및 rBDD FVIII를 둘 다 트롬빈에 의해 활성화한 후, 상이한 시간 동안 APC와 항온처리하고, FXa 생성 검정에서 활성을 결정하였다(도 4). 트롬빈 활성화의 부재 하에, 적은 FXa 생성이 검출되었고, 이는 트롬빈 분해로 유의적으로 증가하였다. 90분 동안 APC로 처리하면 비활성화 샘플과 유사하게 FXa 생성률이 유의적으로 감소하였고, 이 결과는 rFVIIIFc DS, rBDD FVIII 및 단쇄 rFVIIIFc에 대한 것과 유사하였다.
vWF에 대한 친화도
표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 기초하여 실시간 생체분자 상호작용 분석(바이아코어(BIAcore))에 의해 FVIII와 폰 빌레브란트 인자(vWF)와의 상호작용을 측정하여 vWF에 대한 rFVIIIFc 및 rBDD FVIII의 결합의 동력학을 결정하였다(표 6). 동일한 조건 하에 각각의 FVIII 상호작용에 대해 Ka(결합속도) 및 Kd(분해속도) 및 친화도 KD(Kd/Ka)의 운동률 매개변수를 결정하였다. rFVIIIFc 및 rBDD FVIII 둘 다 vWF에 대해 각각 1.64±0.37 및 0.846±0.181nM의 낮은 nM 결합 친화도(KD)를 갖는 것으로 발견되었다. 단백질은 유사한 분해속도를 갖고, 결합속도의 2배 차이는 친화도의 2배 차이를 발생시켰다.
표 6에 기재된 바대로, vWF와의 rFVIII:Fc DS 또는 단쇄 rFVIIIFc의 친화도는 BDD FVIII 단독보다 대략 2배 높은 낮은 nM 범위에서 발견되었다. 생리학적 농도에서, 이는 유리 FVIII와 비교하여 vWF와 복합체화된 rFVIIIFc(처리된 또는 단쇄)의 백분율을 약간 감소시켰지만, 생체내 연구는 rFVIIIFc의 반감기가 이의 약간 낮은 친화도에도 불구하고 전장 또는 BDD FVIII에 유의적으로 연장된다는 것을 나타내고, 따라서 이는 분자의 반감기를 손상시키는 것으로 보이지 않았다. 유리 rFVIIIFc가 FcRn 경로를 통해 더 효과적으로 재순환될 수 있고, 따라서 이는 더 긴 반감기 연장에 기여할 수 있다.
vWF에 대한 친화도 및 vWF로부터의 트롬빈 매개 방출
재조합 B 도메인 결핍 VIIIFc 인자(rFVIIIFc)는 HEK293 세포에서 발현되었다. HEK293 세포에서의 생체합성 동안, 대부분의 rFVIIIFc를 제한된 단백질분해에 의해 처리하여 Fc 모이어티가 부착된 FVIII 경쇄(LC) 및 FVIII 중쇄(HC)를 생성하였다. FVIII 약물 생성물의 저장 동안 혈장에서 자발적인 HC 및 LC 해리는 FVIII 활성 손실에 기여하는 것으로 생각된다. 처리되지 않은 생합성된 rFVIIIFc의 남은 부분은 처리된 rFVIIIFc와 비교하여 증대된 제조성 및 안정성을 제공할 수 있는 rFVIIIFc(SC rFVIIIFc)의 단쇄 아이소폼을 형성하였다.
이 예는 rFVIIIFc와 vWF와의 상호작용과 관련하여 SC rFVIIIFc와 폰 빌레브란트 인자(vWF)와의 상호작용을 비교하는 검정을 기재하고 있다. vWF와의 상호작용을 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 기초하여 실시간 생체분자 상호작용 분석(바이아코어)에 의해 측정하여 vWF에 대한 rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc의 결합의 동력학을 결정하였다(표 11 및 도 16a). 질량 수송 제한을 막기에 충분히 낮은 수준에서 바이오센서의 표면에 아민 커플링하여 FVIII 유리 인간 혈장 유래 vWF를 부동화하였다. 단일 사이클 동력학 모드에서 0.13 내지 5.0nM 범위의 농도에서 rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc를 순차적으로 주사하였다. 센서그램(Sensorgram) 데이터를 1:1 상호작용 모델로 일치시켰다.
동일한 조건 하에 각각의 FVIII 상호작용에 대해 Ka(결합속도) 및 Kd(분해속도) 및 친화도 KD(Kd/Ka)의 운동률 매개변수를 결정하였다. rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc 둘 다 vWF에 대해 각각 0.34±0.1 및 0.31±0.1nM의 낮은 nM 결합 친화도(KD)를 갖는 것으로 발견되었다. 아이소폼 둘 다 또한 유사한 결합속도 및 분해속도를 가졌다.
다음에, rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 B 도메인 결핍 rFVIII 결여 Fc 모이어티(rBDD FVIII)의 트롬빈 매개 방출을 25℃ 및 37℃ 둘 다에서 측정한다. 바이오센서 표면에 3종의 유세포에 대한 유사한 수준에서 아민 커플링하여 인간 vWF를 부동화하였다. 남은 유세포는 참조 목적을 위해 블랭크로서 작용하였다. rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc 단백질을 vWF에 의해 포획하고, 서서히 해리시키고, 해리 단계의 종료 시 등몰 포획 수준을 얻기 위해 rFVIIIFc 및 SC rFVIIIFc의 농도를 조정하였다. 인간 α-트롬빈 용액을 2배 연속 희석에 의해 제조하고, 0.005 내지 20U/㎖ 범위의 농도에서 적용하여 vWF로부터 FVIIIa 종을 단백질분해 방출시켰다. SPR 기반 광학 바이오센서를 사용하여 vWF로부터의 활성화된 rFVIIIFc, SC rFVIIIFc 및 rBDD FVIII의 트롬빈 매개 방출을 실시간으로 모니터링하였다(도 16b). 블랭크 표준품 공제 후(도 16c), α-트롬빈 농도의 함수로서 방출 속도를 결정하였다(도 16d). SC rFVIIIFc에 대한 트롬빈 최대 반 유효 농도(EC50)는 25℃에서 rFVIIIFc에 대한 3.9±0.3U/㎖와 비교하여 12±1U/㎖였고, 37℃에서 rFVIIIFc에 대한 4.8±0.2U/㎖와 비교하여 SC rFVIIIFc에 대해 15±1U/㎖였다(도 16e). rFVIIIFc는 rBDD FVIII와 비교하여 유사한 트롬빈 EC50 값을 갖고, 25℃에서 각각 3.9±0.3U/㎖ 및 3.3±0.3U/㎖의 값 및 37℃에서 각각 4.8±0.2U/㎖ 및 4.0±0.2U/㎖의 값을 가졌다. SC rFVIIIFc는 rFVIIIFc보다 대략 3배 높은 트롬빈 EC50 값을 가졌다. vWF로부터의 트롬빈 매개 방출의 이러한 손상은 vWF가 존재하는 aPTT 검정에서 관찰된 SC rFVIIIFc에 대한 비활성의 특정 감소의 기초가 될 수 있다(표 3B).
실시예 3
중증(1IU/dL[1%] 미만의 내생 VIII 인자 [FVIII]로 정의) A형 혈우병을 앓는 피험체에서 rFVIIIFc의 단일 용량의 안전성, 관용성 및 약물동태학을 평가하기 위해 I/IIa상 오픈 라벨, 크로스오버, 용량 증가, 다기관 및 인간 우선 연구를 설계하였다. 이전에 치료된 대략 전체 12명의 환자가 등록하였고, 25 또는 65IU/㎏에서 rFVIIIFc를 투약하였다. 스크리닝(애드베이트(등록 상표)[rFVIII](기준 경쟁자 물질)의 제1 용량 전 28일 내로 스케쥴링) 및 제1 주사 전 FVIII 치료 없이 최소 4일(96시간) 경과 후, 대략 6명의 피험체는 애드베이트(등록 상표)의 단일 25IU/㎏ 용량을 받고, 이후 3일(72시간) 약물동태학적(PK) 프로필, 이어서 크로스오버를 받고, 7일(168시간) PK 프로파일링을 위해 rFVIIIFc의 25IU/㎏ 단일 오픈 라벨 용량을 받았다. 처음의 3명의 피험체에게 순차적으로 투약하였다. 25IU/㎏의 rFVIIIFc가 투약된 처음의 세명(3명)의 피험체의 경우, 각각의 피험체는 rFVIIIFc 주사후 14일(336시간)에 억제제 평가를 받았다. 억제제 시험을 완료하면 다음의 피험체(오직 처음의 3명의 피험체의 경우)에 투약하였다. 제3 피험체가 14일 억제제 평가를 완료한 후, 25IU/㎏에서의 남은 3명의 피험체 및 65IU/㎏에서의 6명의 피험체는 각각의 용량군 내에 적어도 1일 간격으로 순차적으로 등록을 시작하였다.
마지막 피험체가 rFVIIIFc의 25IU/㎏ 용량을 받은 1주일 후, 대략 6명의 특별한 피험체가 65IU/㎏ 집단에 모집되었다. 65IU/㎏ 집단에서의 각각의 피험체는 애드베이트(등록 상표)의 단일 65IU/㎏ 용량을 받고, 이후 4일(96시간) PK 프로파일링, 이어서 크로스오버를 받고, 10일(240시간) 프로파일링 동안 rFVIIIFc의 65IU/㎏ 단일 오픈 라벨 용량을 받았다. 임의의 집단에서 rFVIIIFc의 제1 주사 전에 출혈 삽화가 발생하는 경우, 치료를 위해 피험체의 예비연구 FVIII 생성물을 사용하고, PK 프로필에 대한 rFVIIIFc의 제1 주사를 받기 전에 적어도 4일의 간격이 경과해야 한다.
안전성에 대해 rFVIIIFc 25IU/㎏ 또는 65IU/㎏의 투여 후 모든 피험체가 14일(336시간) 및 28일 안전성 평가 기간을 따랐다. 모든 피험체는 설계된 시점에서 FVIII 활성의 분석을 위해 혈액 샘플과 함께 투약전 및 투약후 약물동태학적 샘플링을 받았다.
I/IIa상 임상 실험에 대한 약물동태학적 데이터는 FVIIIFc에 대해 하기 결과를 나타냈다. FVIIIFc는 애드베이트(등록 상표)(전장 rFVIII)와 비교하여 약 50% 전신 노출(AUCINF) 증가, 약 50% 청소율(Cl) 감소 및 약 50% 내지 70% 제거 반감기 및 MRT 증가를 가졌다. 또한, FVIIIFc는 애드베이트(등록 상표)와 비교하여 C168, TBLP1, TBLP3 및 TBLP5 값 증가를 나타냈다.
AUCINF 0에서 무한으로 시간 대 농도곡선하 면적
베타 HL 제거 단계 반감기; t1/2β라고도 칭함
C168 투약 후 대략 168시간에 기준치 초과의 예상 FVIIIFc 활성
Cl 청소율
MRT 평균체류시간
TBLP1 FVIIIFc 활성이 기준치의 대략 1IU/dL 초과로 감소할 때
투약 후 모델 예측 시간
TBLP3 FVIIIFc 활성이 기준치의 대략 3IU/dL 초과로 감소할 때
투약 후 모델 예측 시간
TBLP5 모델 FVIIIFc 활성이 기준치의 대략 5IU/dL 초과로 감소할 때
투약 후 모델 예측 시간
실시예 4
FVIII의 반감기를 연장하기 위한 접근법으로서 재조합 B 도메인 결핍 VIII 인자-Fc(rFVIIIFc) 융합 단백질을 생성하였다. rFVIIIFc의 약물동태학(PK)을 A형 혈우병 마우스에서 rFVIII와 비교하였다. 본 발명자들은 최종 반감기가 rFVIII에 비해 rFVIIIFc에 2배 길다는 것을 발견하였다. 반감기 연장에 대한 기본 기전이 FcRn에 의한 rFVIIIFc의 보호로 인한 것이라는 것을 확인하기 위해, FcRn 넛아웃 및 인간 FcRn 형질전환 마우스에서 PK를 평가하였다. 단일 정맥 용량(125IU/㎏)을 투여하고, 발색 활성 검정을 이용하여 혈장 농도를 측정하였다. Cmax는 마우스 균주 둘 다에서 rFVIIIFc와 rFVIII(진타(등록 상표)) 사이에 유사하였다. 그러나, rFVIIIFc에 대한 반감기가 FcRn 넛아웃 마우스에서의 rFVIII에 필적하는 반면, rFVIIIFc에 대한 반감기는 hFcRn 형질전환 마우스에서의 rFVIII보다 대략 2배 길게 연장되었다. 이 결과는 FcRn이 rFVIII와 비교하여 rFVIIIFc의 반감기 연장을 중재하고 이의 원인이 된다는 것을 확인시켜준다. 회전 혈전탄성측정(rotation thromboelastometry)(로템(등록 상표))에 의해 측정된 전혈의 지혈이 혈우병 마우스의 출혈 모델 및 임상 적용에서 응고 효율과 상관되는 것으로 보이므로, 본 발명자들은 로템(등록 상표)을 사용하여 A형 혈우병 마우스에서 rFVIIIFc의 생체외 효율을 평가하려 하였다. 혈우병 마우스에게 50IU/㎏의 rFVIIIFc, 진타(등록 상표)(FVIII) 또는 애드베이트(등록 상표)(FVIII)의 단일 정맥 용량을 투여하였다. 투약 5분 후, 혈전 형성은 응고 시간(CT), 혈전 형성 시간(CFT) 및 α각과 관련하여 유사하였다. 그러나, rFVIIIFc는 투약 72시간 및 96시간 후 유의적으로 개선된 CT를 나타내고, CFT 및 α각은 또한 96시간에 rFVIIIFc의 연장된 PK와 일치하게 진타(등록 상표)(FVIII) 및 애드베이트(등록 상표)(FVIII) 둘 다와 비교하여 개선되었다. 따라서, FVIII의 Fc 융합 구축은 증가된 반감기 및 출혈로부터 연장된 보호를 제공할 가능성을 갖는 한정된 작용 기전을 갖는 분자를 생성시켰다.
실시예 5
이 실시예는 25 및 65IU/㎏의 FVIII 생성물로 치료된 16명의 환자로부터 FVIII 활성에 대한 최종 분석 결과를 제시한다. 실시예 3을 참조한다.
이 실시예에서, rFVIIIFc는 개재 링커 서열 없이 인간 IgG1의 이합체 Fc 도메인에 융합된 재조합 B 도메인 결핍 인간 FVIII(BDD-rFVIII)의 단일 분자로 이루어진 재조합 융합 단백질이다. 이 단백질 구성체는 또한 본 명세서에서 rFVIIIFc 이종이합체 하이브리드 단백질, FVIIIFc 단량체 Fc 융합 단백질, FVIIIFc 단량체 하이브리드, 단량체 FVIIIIFc 하이브리드 및 FVIIIFc 단량체-이합체라 칭한다. 실시예 1, 도 1 및 표 2A를 참조한다.
rFVIIIFc에 의한 전임상 연구는 상업적으로 구입 가능한 rFVIII 생성물과 비교하여 rFVIII 활성의 반감기의 대략 2배 연장을 나타냈다. 이 연구에 대한 이유는 냉동된 액체 제제에서 rFVIIIFc의 단일 용량의 안전성 및 관용성을 평가하고 중증 A형 혈우병 피험체에서 PK에 대한 데이터를 제공하는 것이다. 이 연구의 경우, PK 평가에 16명의 평가 가능한 피험체가 이용 가능하였다. 25(n=6) 및 65IU/체중(㎏)(n=10)의 명칭 용량에서 rFVIIIFc 및 애드베이트(등록 상표) 둘 다의 2 용량의 단일 투여를 대략 10분 동안 정맥내로 점적하였다. 점적 전에 및 투약 10일 후까지 혈장 PK 평가를 위해 혈액 샘플을 얻었다. 모델 의존 방법을 이용하여 이 연구에서 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc 둘 다에 대한 FVIII 활성의 PK를 규명하였다.
목적
이 연구의 1차 목적은 이전에 치료된 중증 A형 혈우병을 앓는 12세 이상의 환자(PTP)에서 rFVIIIFc(25 및 65IU/㎏)의 2 용량의 단일 투여의 안전성 및 관용성을 평가하는 것이다.
2차 목적은 1단계 응고 및 발색 검정에서 애드베이트(등록 상표)와 비교하여 rFVIIIFc의 25 또는 65IU/㎏의 단일 투여 후 일정 시간에 걸쳐 FVIII의 약물학적(PD) 활성에 의해 결정된 약물동태학(PK) 매개변수를 결정하는 것이다.
연구 설계(실시예 3 참조)
스크리닝 방문에(애드베이트(등록 상표) 투약 28일 내); 주사전 0일(애드베이트(등록 상표)의 주사)에 및 주사후 10분 및 30분 및 1시간, 3시간, 6시간 및 9시간에; 애드베이트(등록 상표)의 주사후 1일째인 24시간에; 애드베이트(등록 상표)의 주사후 2일째인 48시간에; 애드베이트(등록 상표)의 주사후 3일째인 72시간에; 및 애드베이트(등록 상표)(B 집단 단독)의 고용량의 주사후 4일째인 96시간에 FVIII 활성 PK 평가를 위해 혈액 샘플을 수집하였다.
rFVIIIFc의 투여 직전의 rFVIIIFc 주사일에, rFVIIIFc의 주사후 10분 및 30분 및 1시간, 3시간, 6시간 및 9시간에; rFVIIIFc의 주사후 1일째인 24시간에; rFVIIIFc의 주사후 2일 내지 5일인 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간에; rFVIIIFc의 주사후 7일째인 168시간에; rFVIIIFc(B 집단 단독)의 고용량의 주사후 8일, 9일 및 10일째인 192시간, 216시간 및 240시간에 FVIII 활성 PK 평가를 위해 혈액 샘플을 수집하였다. rFVIIIFc의 주사후 672시간에 최종 연구 방문(주사후 28일) 시 FVIII 활성을 또한 측정하였다.
약물동태학적 모델링 및 계산
약어
TBLP1 = FVIII 활성이 기준치의 대략 1IU/dL 초과로 감소할 때
투약 후 모델 예측 시간
TBLP3 = FVIII 활성이 기준치의 대략 3IU/dL 초과로 감소할 때
투약 후 모델 예측 시간
KV_M = Cmax_M/실제 용량(IU/㎏)
KV_OB = Cmax_OB/실제 용량(IU/㎏)
IVR_M = 100 x Cmax_M x 혈장 용적(dL)/전체 용량(IU); 여기서, 혈장 용적(㎖) = (23.7 x Ht(㎝)) + (9.0 x 체중(㎏)) - 1709.
IVR_OB = 100 x Cmax_OB x 혈장 용적(dL)/전체 용량(IU); 여기서, 혈장 용적(㎖) = (23.7 x Ht(㎝)) + (9.0 x 체중(㎏)) - 1709.
결과
단일 용량 약물동태학(1단계 검정)
애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 짧은 IV 점적 후 관찰된 FVIII 활성은, 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 56.6±4.74 및 121±28.2IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 55.6±8.18 및 108±16.9IU/dL의 평균(±SD) 모델 예측 Cmax 값으로, 급격히 증가하였다. 모든 애드베이트(등록 상표)- 및 rFVIIIFc 치료 환자는 FVIII 활성에서 용량 관련 증가를 가졌다. Cmax 및 AUCINF 둘 다에서 관찰된 증가는 평가된 용량 범위에 걸쳐 용량에 비례량보다 약간 작았다.
점적 종료 후, 관찰된 FVIII 활성 감소는 기준치 수준이 도달할 때까지 단일지수 감소 특성을 나타냈다. FVIII 활성의 감소 속도는 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 11.9±2.98 및 10.4±3.03시간 및 rFVIIIFc의 경우 18.0±3.88 및 18.4±6.99시간의 평균(±SD) 모델 예측 제거 반감기 값으로 rFVIIIFc의 경우 애드베이트(등록 상표)보다 느렸다. 제거 반감기 값은 FVIII 생성물 둘 다에 평가된 용량 범위에 걸쳐 용량 의존적인 것으로 나타났다.
전체 전신 FVIII 노출(AUCINF로 평가)은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량 수준에서 애드베이트(등록 상표)보다 rFVIIIFc 투여 후 약 48% 및 61% 높았다. 평균(±SD) 모델 예측 AUCINF 값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 974±259 및 1810±606시간*IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 1440±316 및 2910±1320시간*IU/dL였다.
제거 반감기와 유사하게, MRT는 rFVIIIFc의 경우 애드베이트(등록 상표)에 비해 연장되었다. 평균(±SD) 모델 예측 MRT 값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 17.1±4.29 및 14.9±4.38시간 및 rFVIIIFc의 경우 25.9±5.60 및 26.5±10.1시간이었다. MRT 값은 FVIII 생성물 둘 다에 평가된 용량 범위에 걸쳐 용량 의존적인 것으로 나타났다.
또한, CL 및 V에 대한 1차 PK 매개변수 값을 결정하였다. rFVIIIFc에 대한 CL 값은 등가 용량에서 애드베이트(등록 상표)에 관찰된 것의 약 66%를 설명할 뿐이다. 평균(±SD) 모델 예측 CL 값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 2.70±0.729 및 4.08±1.69㎖/시간/㎏ 및 rFVIIIFc의 경우 1.80±0.409 및 2.69±1.25㎖/시간/㎏이었다. V 값은, 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 43.9±4.27 및 56.1±13.4㎖/㎏ 및 rFVIIIFc의 경우 45.3±7.23 및 61.6±10.6㎖/㎏의 평균(±SD) 모델 예측 V 값으로, 애드베이트(등록 상표)와 rFVIIIFc 사이에 필적하였다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량이 증가하면서 약간의 평균 CL 및 V 값 증가가 보고되었지만; 제한된 용량 수준과 커플링된 65IU/㎏ 용량에서의 표준 편차의 증가는 이 매개변수의 용량 의존성의 평가를 혼란시켰다. 예를 들면, rFVIIIFc 치료군에 대한 CV% 기하 평균 CL 값은 23.0%(25IU/㎏) 내지 48.6%(65IU/㎏)으로부터 증가하였다.
1차 PK 매개변수 이외에, FVIII 효과 기간을 평가하기 위해 2차 PK 매개변수(예를 들면 K값, IVR, 등)를 결정하였다. PK 차이의 근거는 또한 등가 용량에서 애드베이트(등록 상표)와 비교하여 TBLP1 및 TBLP3 값 증가를 나타내는 rFVIIIFc로 관찰되었다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc에 대한 IVR 및 K값은 필적하는 것으로 보였다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량이 증가하면서 약간의 TBLP1 및 TBLP3 값의 증가가 관찰되었다. 반대로, 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량이 증가하면서 약간의 평균 IVR 및 K값의 감소가 보고되었다. 이전에 기재된 바대로, 제한된 용량 수준에 의해 이 매개변수의 용량 의존성의 평가를 혼란시켰다.
관찰된 평균(±SD) TBLP1은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 1IU/㎏당 2.88±0.733 및 2.93±0.848IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 1IU/㎏당 4.28±0.873 및 5.16±2.02IU/dL였다. 관찰된 평균(±SD) TBLP3은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 1IU/㎏당 2.06±0.527 및 2.26±0.666IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 1IU/㎏당 3.09±0.623 및 3.93±1.59IU/dL였다.
관찰된 Cmax 값(모델 내 기준치 및 잔류 약물 공제)을 이용하여 계산된 평균 IVR 및 K값은 일반적으로 모델 예측 Cmax 값을 이용하여 결정된 값보다 크고; 1구획 모델을 이용하여 관찰된 피크 활성의 약간의 과소평가와 일치하였다. 관찰된 평균(±SD) K값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 1IU/㎏당 2.57±0.198 및 2.13±0.598IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 1IU/㎏당 2.46±0.330 및 1.85±0.332IU/dL였다. 관찰된 평균(±SD) IVR 값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 94.1±15.6 및 85.8±16.5% 및 rFVIIIFc의 경우 89.5±11.9 및 74.8±6.72%였다.
단일 용량 약물동태학(발색 검정)
애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 짧은 IV 점적 후 관찰된 FVIII 활성은, 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 70.2±9.60 및 157±38.6IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 70.3±10.0 및 158±34.7IU/dL의 평균(±SD) 모델 예측 Cmax 값으로, 급격히 증가하였다. 모든 애드베이트(등록 상표)- 및 rFVIIIFc 치료 환자는 FVIII 활성에서 용량 관련 증가를 가졌다. Cmax 및 AUCINF 둘 다에서 관찰된 증가는 평가된 용량 범위에 걸쳐 용량에 비례량보다 약간 작았다.
점적 종료 후, 관찰된 FVIII 활성 감소는 기준치 수준이 도달할 때까지 단일지수 감소 특성을 나타냈다. FVIII 활성의 감소 속도는 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 10.7±1.98 및 10.3±3.27시간 및 rFVIIIFc의 경우 16.2±2.92 및 19.0±7.94시간의 평균(±SD) 모델 예측 제거 반감기 값으로 rFVIIIFc의 경우 애드베이트(등록 상표)보다 느렸다. 제거 반감기 값은 FVIII 생성물 둘 다에 평가된 용량 범위에 걸쳐 용량 의존적인 것으로 나타났다.
전체 전신 FVIII 노출(AUCINF로 평가)은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량 수준에서 애드베이트(등록 상표)보다 rFVIIIFc 투여 후 약 53% 및 84% 높았다. 평균(±SD) 모델 예측 AUCINF 값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 1080±236 및 2320±784시간*IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 1650±408 및 4280±1860시간*IU/dL였다.
제거 반감기와 유사하게, MRT는 rFVIIIFc의 경우 애드베이트(등록 상표)에 비해 연장되었다. 평균(±SD) 모델 예측 MRT 값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 15.3±2.86 및 14.8±4.72시간 및 rFVIIIFc의 경우 23.4±4.22 및 27.3±11.4시간이었다. MRT 값은 FVIII 생성물 둘 다에 평가된 용량 범위에 걸쳐 용량 의존적인 것으로 나타났다.
또한, CL 및 V에 대한 1차 PK 매개변수 값을 결정하였다. rFVIIIFc에 대한 CL 값은 등가 용량에서 애드베이트(등록 상표)에 관찰된 것의 약 58% 내지 66%를 설명할 뿐이다. 평균(±SD) 모델 예측 CL 값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 2.39±0.527 및 3.21±1.40㎖/시간/㎏ 및 rFVIIIFc의 경우 1.57±0.349 및 1.86±0.970㎖/시간/㎏이었다. V 값은, 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 35.8±5.52 및 43.6±11.2㎖/㎏ 및 rFVIIIFc의 경우 35.9±6.65 및 42.7±8.91㎖/㎏의 평균(±SD) 모델 예측 V 값으로, 애드베이트(등록 상표)와 rFVIIIFc 사이에 필적하였다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량이 증가하면서 평균 CL 및 V 값 증가가 보고되었지만; 제한된 용량 수준과 커플링된 65IU/㎏ 용량에서의 표준 편차의 증가는 이 매개변수의 용량 의존성의 평가를 혼란시켰다.
1차 PK 매개변수 이외에, FVIII 효과 기간을 평가하기 위해 2차 PK 매개변수(예를 들면 K값, IVR, 등)를 결정하였다. PK 차이의 근거는 또한 등가 용량에서 애드베이트(등록 상표)와 비교하여 TBLP1 및 TBLP3 값 증가를 나타내는 rFVIIIFc로 관찰되었다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc에 대한 IVR 및 K값은 필적하는 것으로 보였다.
애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량이 증가하면서 TBLP1 및 TBLP3 값의 약간의 증가가 관찰되었다. 반대로, 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량이 증가하면서 약간의 평균 IVR 및 K값의 감소가 보고되었다. 이전에 기재된 바대로, 제한된 용량 수준에 의해 이 매개변수의 용량 의존성의 평가를 혼란시켰다.
관찰된 평균(±SD) TBLP1은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 1IU/㎏당 2.70±0.511 및 3.09±0.978IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 1IU/㎏당 4.06±0.798 및 5.66±2.38IU/dL였다. 관찰된 평균(±SD) TBLP3은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 1IU/㎏당 1.98±0.377 및 2.39±0.718IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 1IU/㎏당 3.04±0.598 및 4.44±1.84IU/dL였다.
관찰된 Cmax 값(모델 내 기준치 및 잔류 약물 공제)을 이용하여 계산된 평균 IVR 및 K값은 일반적으로 모델 예측 Cmax 값을 이용하여 결정된 값보다 크고; 1구획 모델을 이용하여 관찰된 피크 활성의 약간의 과소평가와 일치하였다. 관찰된 평균(±SD) K값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 1IU/㎏당 3.08±0.429 및 2.85±0.721IU/dL 및 rFVIIIFc의 경우 1IU/㎏당 3.12±0.451 및 2.92±0.985IU/dL였다. 관찰된 평균(±SD) IVR 값은 각각 25 및 65IU/㎏ 용량군에 대해 애드베이트(등록 상표)의 경우 112±14.5 및 116±26.9% 및 rFVIIIFc의 경우 113±16.3 및 117±33.6%였다.
결론
모든 애드베이트(등록 상표)- 및 rFVIIIFc 치료 환자는 평가된 용량 범위에 걸쳐 필적하는 Cmax 및 AUCINF의 용량 관련 증가를 가졌다. 피크 혈장 수준의 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc 활성은 점적 종료 후 제1 시간 내에 일반적으로 관찰되었고, 투약 후 몇일 동안 관찰될 수 있었다. 점적 종료 후, 기준치 보정 FVIII 활성 감소는 기준치 수준이 생성물 둘 다에 도달할 때까지 단일지수 감소 특성을 나타냈다. 제거 반감기 및 MRT에 대한 매개변수 값은 FVIII 생성물 둘 다에 평가된 용량 범위에 걸쳐 용량 의존적인 것으로 나타났다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 용량이 증가하면서 약간의 평균 CL 및 V 값의 증가가 보고되었지만; 제한된 용량 수준과 커플링된 65IU/㎏ 용량에서의 피험체간 변동성 증가는 이 매개변수의 용량 의존성의 평가를 혼란시켰다.
rFVIIIFc 및 애드베이트(등록 상표) 활성 PK의 비교는, 필적하는 용량에서 애드베이트(등록 상표)와 관련하여, rFVIIIFc의 경우 전신 노출에서 근사치 48% 내지 61%(1단계 검정) 또는 53% 내지 84%(발색 검정) 증가, 청소율에서 근사치 30% 내지 40% 감소 및 제거 반감기 및 MRT 둘 다에서 근사치 50% 내지 80% 증가를 나타냈다. PK 차이의 근거는 또한 등가 용량에서 애드베이트(등록 상표)와 비교하여 TBLP1 및 TBLP3 값 증가를 나타내는 rFVIIIFc로 관찰되었다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc에 대한 IVR 및 K값은 필적하는 것으로 보였다.
발색 검정이 노출 매개변수(예를 들면, Cmax, AUCINF 등)의 더 높은 평가치를 생성한다는 점을 제외하고는, 발색 검정으로부터 얻은 PK 매개변수는 1단계 검정으로부터 얻은 것과 일반적으로 일치하게 생성되었다.
관찰된 PK 개선으로, rFVIIIFc는 출혈로부터 연장된 보호를 제공하여, A형 혈우병을 앓는 개체에 덜 빈번한 주사를 허용할 수 있다.
실시예 6
rFVIII:Fc(실시예 3)의 인간 우선 연구로부터의 중간 PK 분석에 기초하여, A-LONG 연구를 설계하였다. A-LONG은 이전에 치료된 중증 A형 혈우병(1IU/dL[1%] 미만의 내생 FVIII로 정의됨)을 앓는 피험체에서 출혈의 예방 및 치료에서 재조합 VIII 인자 Fc 융합(FVIII:Fc)의 안전성, 약물동태학 및 효율의 오픈 라벨 다기관 평가이다.
대략 106명의 피험체는 테일러드 예방 섭생(1암), 매주 투약 섭생(2암) 및 온디맨드식 섭생(3암)의 3가지 섭생 중 하나에 등록하였다.
1암: 테일러드 예방 섭생
1암은 전체 그룹 및 PK 하위그룹을 포함하였다. 대략 66명의 피험체가 등록하였다. 초기 섭생은 1주 2회 1일에 25IU/㎏, 이어서 그 주의 4일에 50IU/㎏이다. rFVIIIFc에 대한 PK 결과가 이용 가능할 때까지 이 매주 예방 섭생으로 피험체에게 rFVIIIFc를 투여하였다. 이 결과에 기초하여, 각각의 개체에 대해 테일러드 예방 섭생을 확립하고, 1% 내지 3%의 FVIII 활성의 최저혈중농도를 유지시키기 위해 용량 및 간격을 결정하였다. 이후, 각각의 피험체에게 연구에 걸쳐 개별적으로 테일러드 예방 섭생을 투여하였다.
연구에 걸쳐 피험체를 모니터링하고, 진행 중인 투약 및 간격을 조정하였다. 피험체가 연속 2달 기간에 걸쳐 자발적인 2 이상의 출혈 삽화로 정의되는 허용되지 않는 출혈 삽화를 경험할 때에만 조정하였다. 이런 경우, 조정은 3% 내지 5%의 최저혈중농도를 표적화하는 것이다.
2암: 매주 투약 섭생
대략 20명의 피험체는 등록/랜덤화하고 하기와 같이 생략된 rFVIIIFc PK 프로파일링을 겪었다: 적어도 96시간 세척; rFVIIIFc 65IU/㎏의 단일 용량; rFVIIIFc로 주사전 및 주사 시작으로부터 10(±2)분, 3시간(±15분), 72(±2)시간[3일] 및 96(±2)시간[4일]을 포함하여 0일에 시작하는 생략된 샘플링. 생략된 PK 프로파일링에 따라, 피험체에게 적어도 28주 동안 7일마다 52주까지 65IU/㎏의 rFVIIIFc의 고정 용량을 투여하였다.
3암: 온디맨드식 섭생
연구에서 적어도 5명의 피험체에서 최소 10회 대수술을 평가하였다. 대수술은 주요 신체 체강이 관통되고 노출되거나, 신체적 또는 생리학적 기능의 실질적인 손상이 생성되는 (예를 들면, 개복술, 개흉술, 개두술, 관절 대체 및 사지 절단) 일반 마취 및/또는 호흡 보조를 수반하는 임의의 수술 절차(비긴급 또는 긴급)로 정의된다.
수술 동안 예방을 위해, 12시간 내지 24시간마다 20 내지 50IU/㎏의 rFVIIIFc로 피험체를 치료하였다. 수술 전에, 전문의는 피험체의 rFVIIIFc PK 프로필을 검토하고, 피험체의 계획된 수술 유형 및 임상 상태에 일반적으로 필요한 VIII 인자 대체의 용량 섭생을 평가하였다. 임의의 재활 시간을 비롯하여 수술 치료 기간에 rFVIIIFc의 적절한 투약에 대한 권고는 이 인자를 고려한다.
이 연구의 1차 목적은 (a) 예방, 온디맨드식 및 수술 치료 섭생으로 투여된 rFVIIIFc의 안전성 및 관용성을 평가하고; (b) 예방, 온디맨드식 및 수술 치료 섭생으로 투여된 rFVIIIFc의 효율을 평가하는 것이다. 이 연구의 2차 목적은 (a) rFVIIIFc의 PK 프로필을 규명하고 FVIIIFc의 PK를 애드베이트(등록 상표)인 현재 시판되는 제품과 비교하고; (b) FVIIIFc와의 각각의 반응을 평가하고; (c) FVIIIFc 소비를 평가하는 것이다.
1차 목적
2차 목적
예방 섭생에서 출혈을 적절히 예방하기 위해 필요한 용량 범위 및 스케쥴을 규명하거나; 수술 세팅에서 항상성을 유지하거나; 온디맨드식 매주 치료 또는 예방 세팅에서 출혈 삽화를 치료하는 것
실시예 7
임상 로템(등록 상표) 평가
2명의 피험체, 구체적으로 저용량 집단에서 1명 및 고용량 집단에서 1명에서 rFVIIIFc 및 애드베이트(등록 상표)에 의한 전체 지혈에서 개선을 평가하기 위해 실시예 7에서 연구에서, 1단계 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정에 의한 혈장 FVIII 활성의 측정 이외에, 전혈 회전 혈전탄성측정(로템(등록 상표))을 또한 조사하였다.
rFVIIIFc 및 애드베이트(등록 상표)는 rFVIIIFc 치료 전에 피험체의 혈액으로 스파이킹될 때 혈전 형성에서 상당히 활성인 것으로 나타났다. 응고 시간(CT)는 정상의 대략 1% 내지 100%의 범위에서 rFVIIIFc 및 애드베이트(등록 상표)의 용량과 직선이고, 용량 반응은 동일한 피험체에서 rFVIIIFc와 애드베이트(등록 상표) 사이에 필적하였다.
애드베이트(등록 상표) 및 후속하여 rFVIIIFc에 의한 투약 후, 시트레이트화 전혈을 다양한 시점에서 샘플링하고, 로템(등록 상표)에 의해 재석회화 후 혈전 형성을 모니터링하였다. 애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc 투약 전의 잔기 FVIII 수준으로 인한 다양한 기준치 CT에도 불구하고, 생성물 둘 다 주사 30분 후 CT를 필적하는 수준으로 효과적으로 보정하였다. 또한, 이 저용량이 투약된 피험체에서 애드베이트(등록 상표)에 비해 25IU/㎏의 rFVIIIFc 주사 시 및 주사 3시간 후 CT 개선이 더 잘 지속되었다. 그러나, 애드베이트(등록 상표)에 대한 rFVIIIFc의 차등 개선이 65IU/㎏ 용량에서 훨씬 덜 뚜렷하였다.
실시예 8
꼬리 클립 연구에 HemA 마우스를 사용하였다. 마우스를 처음에 마취시키고, 이후 4.6㎍/㎏, 1.38㎍/㎏ 또는 0.46㎍/㎏의 처리된 rFVIIIFc(약 75% 내지 85%의 처리된 rFVIIIFc를 포함하는 약물 물질) 및 정제된 단쇄 rFVIIIFc를 주사하였다. 주사 후, 끝에서 꼬리를 자르고 관에 즉시 위치시켜 혈액을 수집하였다. 표 7 및 도 7에 기재된 바대로 처리된 rFVIIIFc(약물 물질) 및 단쇄 FVIIIFc에 대해 생존에 대한 보호(%)를 측정하였다.
표 7 및 도 7에 기재된 바대로, 단쇄 rFVIIIFc에 의한 생존에 대한 보호는 처리된 rFVIIIFc(DS)에 필적하였다.
실험실내 로템에 의한 응고 활성
전혈 회전 혈전탄성측정(로템)에서 농도 범위에 걸쳐 rFVIIIFc의 응고 효능을 추가로 조사하고, rBDD FVIII(진타) 및 재조합 전장 FVIII(rflFVIII; 애드베이트) 둘 다와 비교하였다. 실험실내 로템의 경우, rFVIII 단백질을 5마리 또는 6마리의 수컷 HemA 마우스의 대정맥으로부터 수집된 풀에 있는 시트레이트화 혈액으로 정상 혈장 FVIII 수준의 0, 0.1, 1, 10 및 100%의 최종 농도로 3회 스파이킹하였다. CaCl2(나템) 첨가에 의해 응고가 개시하였고, 로템 시스템(펜타팜 게엠베하(Pentapharm GmbH), 독일 뮌헨)에서 응고 시간(CT), 혈전 형성 시간(CFT), 알파각 및 최대 응고 경도(MCF)를 기록하였다. 정상 FVIII 수준의 0.1% 내지 100%로부터 증가하는 용량에서 HemA 마우스 혈액에서 스파이킹된 3종의 단백질에 대한 응고 시간(CT), 혈전 형성 시간(CFT) 및 알파각이 도 14에 도시되어 있다. 정상의 0.1 내지 100%의 광범위에서, rFVIIIFc, rBDD FVIII 및 rflFVIII 중에서 CT 및 CFT는 필적하였다. 알파각은 rFVIIIFc과 rBDD FVIII 사이에 10%에서 오직 유의적으로 상이하였다(p<0.05).
생체외 로템에 의한 응고 활성
로템에 의해 측정된 rFVIIIFc의 약물학을 A형 혈우병 마우스에 단일 정맥 주사 후 rBDD FVIII 및 rflFVIII와 비교하였다. 생체외 로템의 경우, 수컷 HemA 마우스에 50IU/㎏의 rFVIIIFc, 애드베이트(등록 상표) 또는 진타(등록 상표)의 단일 용량을 정맥내로 주사하고, 5마리의 마우스를 각각의 시점(투약 5분, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 후)에서 희생시켰다. 대정맥으로부터 수집된 각각의 시트레이트화 전혈을 로템 시스템에서 나템에 의해 즉시 분석하고, 매개변수를 상기한 바대로 측정하였다. CT, CFT 및 알파각을 투약 후 5분 내지 96시간으로부터 채취한 샘플에 대해 결정하고, 이는 도 15에 도시되어 있다. 5분에, 모두 동등하게 효과적이여서 유사한 CT, CFT 및 알파각을 생성시켰다(도 15a 내지 도 15c). 그러나, rFVIIIFc는, rBDD FVIII 및 rflFVIII에 비해, 72시간 및 96시간에 유의적으로 개선된(p<0.05) CT, CFT 및 96시간에서 알파각을 나타냈다(도 15a 내지 도 15c).
실시예 9
재조합 VIIIFc 인자(rFVIIIFc)는 인간 면역글로불린 G1(IgG1)의 Fc 도메인에 유전적으로 융합된 B 도메인 결핍(BDD) rFVIII 단백질로 이루어졌다. HEK 293 세포로부터의 분비 전에, 대부분의 rFVIIIFc를 FVIII 중쇄(HC) 및 경쇄(LC+Fc)로 처리하였다. 순환 시, rFVIIIFc는 폰 빌레브란트 인자(VWF)와 복합체되고, 네이티브 FVIII와 구분이 안 되는 방식으로 활성화 시 방출되었다. HC 및 LC의 자발적인 해리는 FVIII 약물 생성물의 저장 동안 혈장에서 FVIII 활성 소실에 기여하는 것으로 생각되었다. 여기서, 본 발명자들은 네이티브 FVIII와 비교하여 더 우수한 생성능 및 증대된 안정성을 제공할 수 있는 rFVIIIFc(SC rFVIIIFc)의 단쇄 비처리된 아이소폼을 기재하고 있다.
비처리된 아이소폼의 분획을 포함하는 rFVIIIFc로부터 SC rFVIIIFc를 정제하였다. rFVIIIFc와 비교하여, SC rFVIIIFc는 동등한 발색 활성, 그러나 1단계(aPTT) 검정(표 3A 및 표 3B)에 의해 대략 60% 감소된 활성을 나타냈다. (트롬비노스코프(등록 상표)로부터) 보정 자동화 트롬보그램을 이용하여 트롬빈 생성 검정(thrombin generation assay: TGA)을 수행하였다. 트롬빈 생성 검정(TGA)에서, SC rFVIIIFc는 또한 rFVIIIFc와 비교하여 감소된 트롬빈 전위(도 13a) 및 피크 트롬빈(도 13b)을 나타냈다. 그러나, 표 3B에 기재된 것처럼, aPTT에 의한 SC rFVIIIFc의 완전 활성이 vWF의 부재 하에 관찰되어, 완전 처리된 FVIII로부터의 a3 방출 및 해리와 반대로, vWF로부터의 방출이 SC rFVIIIFc에서 Arg 1680 절단 후 HC에 대한 a3 산성 영역의 공유 결합으로 인해 지연될 수 있다는 것을 제시한다. vWF로부터의 해리 지연은 aPTT 검정 및 TGA에서 관찰된 활성 감소를 설명할 것이지만, 2단계 발색 검정에서 완전 활성이 관찰되었다. FVIII 활성화제로서 제한적인 트롬빈에 의한 변형 발색 기질 검정에서 vWF의 존재 하의 활성화 속도 감소가 확인되었다.
HemA 마우스 꼬리 정맥 절제(TVT) 모델에서 SC rFVIIIFc의 생체내 기능을 평가하였다. TVT 48시간 전에 rFVIIIFc 약물 생성물 또는 SC rFVIIIFc의 표시된 용량으로 HemA 수컷 마우스를 치료하였다. TVT 24시간 후 최종 관찰을 수행하면서, 꼬리 재출혈 및 생존율을 TVT 후 12시간까지 시간마다 모니터링하였다. SC rFVIIIFc 및 rFVIIIFc는, 점적 48시간 후 TVT를 수행할 때 각각 1.17㎍/㎏ 및 1.23㎍/㎏의 ED50으로, 이 모델에서 동등한 생체내 효율을 나타냈다(도 7a). HemA 마우스에서 필적하는 TVT 24시간 후 생존 곡선(p = 0.65)(도 7b) 및 재출혈 속도(도 7c)가 각각의 시험된 용량 수준에서 SC rFVIIIFc 및 rFVIIIFc에서 관찰되어, 이의 더 낮은 명확한 aPTT 활성에도 불구하고 SC rFVIIIFc가 rFVIIIFc와 동등하게 효과적이라는 것을 나타낸다. vWF의 존재 하의 SC rFVIIIFc의 지연된 실험실내 활성화는 따라서 이의 생체내 효율에 유의적인 영향을 갖는 것으로 보였다. 따라서, SC rFVIIIFc는 잠재적 임상 분야를 갖는 rFVIIIFc의 새롭고 효과적인 아이소폼을 나타낸다. 이 Fc 융합 단백질의 맥락에서 증대된 생성물 안정성을 나타내기 위해 추가의 연구가 필요하다.
실시예 10
현재의 VIII 인자(FVIII) 생성물은 대략 8시간 내지 12시간의 반감기(t1/2)를 나타내고, A형 혈우병 환자의 예방 및 치료를 위해 빈번한 정맥 주사를 요한다. rFVIIIFc는 순환 rFVIII 반감기를 연장시키는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 공유 결합된 FVIII의 단일 분자로 이루어진 재조합 융합 단백질이다. 중증 A형 혈우병을 앓는 이전에 치료된 남성 피험체에서 이 인간 우선 연구는 rFVIIIFc의 안전성 및 약물동태학을 조사하였다. 16명의 피험체는 25 또는 65IU/㎏에서 애드베이트(등록 상표)의 단일 용량, 이어서 동일 용량의 rFVIIIFc를 받았다. 대부분의 부작용은 연구 약물과 연관되지 않았다. 어떤 연구 피험체도 항-FVIIIFc 항체 또는 억제제를 발생시키지 않았다. 용량 수준에 걸쳐, 애드베이트(등록 상표)와 비교하여, rFVIIIFc는 1.54 내지 1.71배 더 긴 제거 t1/2 및 평균체류시간, 1.49 내지 1.56배 더 낮은 청소율 및 1.48 내지 1.56배 더 높은 전체 전신 노출을 나타냈다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc는 필적하는 용량 의존 피크 혈장 농도 및 회수율을 가졌다. 기준치 1% 초과의 FVIII 활성에 대한 시간은 용량 수준에 걸쳐 애드베이트(등록 상표)보다 대략 1.53 내지 1.68배 더 길었다. 따라서, rFVIIIFc는 A형 혈우병을 앓는 환자에서 연장된 지혈 보호 및 덜 빈번한 투약을 성취하기 위해 실행 가능한 치료학적 접근법을 제공할 수 있다.
A형 혈우병은 관절 및 연조직으로의 빈번한 자발적 및 외상성 출혈을 발생시키는 유전적 출혈 장애이다[Mannucci PM, Tuddenham EGD, N Engl J Med, 344:1773-1779 (2001)]. 부적절하게 치료할 때, 이 출혈은 만성 관절증, 장애를 발생시키고, 사망 위험을 증가시킨다[Soucie JM et al., Blood. 96(2):437-442 (2000)].
출혈 삽화의 치료(온디맨드식 치료) 및 예방(예방 치료)에 혈장 유래 FVIII(pdFVIII) 및 재조합 인간 FVIII(rFVIII) 생성물을 이용하였다. HIV 및 간염 바이러스에 의한 혈장 생성물의 광범위한 오염 후 혈액 매개 전염병 전달 위험을 감소시키고 FVIII 생성물의 적절한 공급을 보장하기 위해 rFVIII를 개발하였다. 그러나, 현재의 FVIII 생성물에 의한 지혈 보호는 대략 8시간 내지 12시간의 짧은 반감기(t1/2)로 인해 일시적으로 제한되어, 대부분의 자발적인 출혈 삽화에 대한 보호로서 확립된 수준인 1% 초과의 FVIII 수준을 유지시키기 위해 대부분의 환자의 경우 주마다 또는 격일마다 3회 예방학적 주사를 요한다[Manco-Johnson et al., New Engl J Med. 357(6):535-44 (2007)].
많은 연구는, 고용량에서도, 온디맨드식 치료는 관절증을 예방하는 데 있어서 효과적이지 않은 것으로 나타났다[Aledort L. et al., J Intern Med. 236:391-399 (1994); Petrini P. et al., Am J Pediatr Hematol Oncol.13:280-287 (1991)]. 예방학적 치료의 이점은 다양한 임상 연구4, 6-15에서 입증되었고, 만코-존슨(Manco-Johnson) 등(상기 참조)은 이의 제1 관절 출혈 후 1차 예방을 시작한 어린이가 온디맨드식으로 치료된 어린이보다 유의적으로 출혈이 적고 관절 손상이 덜하다는 것을 확립하였다.
온디맨드식 치료와 비교하여, 예방학적 치료는 또한 장애, 입원율 및 학교 또는 직장에서의 휴가를 감소시키고;6,16 환자 및 이의 가족의 삶의 질을 개선하였다.17 그러나, 예방학적 치료는 대개 어린이에서 중심 정맥 접근 장치의 사용 및 이의 수반되는 감염, 패혈증 및 혈전증 위험을 요한다. 또한, 이점에도 불구하고, 예방에 의한 수용도 및 순응도는 부분적으로 불편함 및 침습성으로 인해 나이에 따라 감소하였다.18,19 따라서, 연장된 혈장 t1/2를 갖는 rFVIII 생성물은 잠재적으로 유리할 것이다[Lillicrap D., Current Opinion in Hematology 17:393-397 (2010)].
rFVIIIFc는 인간 IgG1 Fc 도메인에 공유 결합된 B 도메인 결핍 rFVIII의 단일 분자로 이루어진 재조합 융합 단백질이다. Fc-융합 단백질의 잠재적 이점은 더 우수한 관용성 및 연장된 지혈 보호를 포함하고, Fc 도메인은 공지된 고유 독성을 갖는 중성 분자를 나타낸다.21,22 IgG1 Fc 도메인에 대한 부착은 내피 세포를 포함하는 많은 세포 유형에서 발현된 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 허용한다. FcRn 발현은 살아 있는 동안 안정하고, 리소좀 분해로부터 IgG1 및 Fc-융합 단백질의 보호를 담당하여, 단백질의 t1/2를 연장시킨다.21,23 순환 내의 다양한 단백질은 비특이적 음세포작용을 통해 맥관구조를 라이닝하는 세포로 내재화되고, 엔도솜 및 리소좀 분해 경로에 수송된다.
Fc 단백질은 엔도솜 내에 있는 FcRn과 상호작용한다. FcRn을 포함하는 엔도솜은 Fc 융합 단백질을 혈장막으로 다시 지시하고, 이들을 pH 의존 방식으로 순환으로 방출시켜,24 리소좀 분해를 피한다. 이러한 사이클링 접근법은 치료학적 생물물질의 t1/2를 연장시키기 위해 성공적으로 사용되고; 다수의 Fc 융합 기반 약물(예를 들면, 에타네르셉트, 로미플로스팀)이 임상 사용에 승인받았고, 다른 것은 개발 중에 있다.25,26
rFVIIIFc에 대한 전임상 데이터는 FVIII가 FcRn에 의해 중재되는 천연 보호 경로에 의해 분해로부터 구제되어, 따라서 t1/2를 연장시킬 수 있다. A형 혈우병 마우스 및 개에서, rFVIIIFc에 대한 최종 혈장 t1/2는 rFVIII보다 대략 2배 길다.27,28 이 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 A형 혈우병을 앓는 피험체에서 지속성 rFVIIIFc 융합 단백질의 안전성 및 PK를 조사하기 위해 인간 우선 임상 연구를 수행하였다.
연구 설계: 이전에 치료된 중증 A형 혈우병을 앓는 환자에서 이 오픈 라벨 용량 증가 다기관 1/2a상 연구는 애드베이트(등록 상표)(항혈우병 인자[재조합], 혈장/알부민 비함유 방법, 옥토코그 알파(octocog alfa), 박스터 헬스케어(Baxter Healthcare))와 비교하여 rFVIIIFc의 안전성 및 이의 약물동태학(PK)을 조사하였다. 임상 관리 기준에서 US CFR 및 ICH 가이드라인에 따라 이 연구를 수행하였다. 임의의 시험 전에, 참여한 임상연구심의협의회(Institutional Review Boards)로부터 승인을 얻고 모든 피험체로부터 동의서를 얻었다. 연구 설계는 순차적이었다; 애드베이트(등록 상표)의 단일 용량을 25 또는 65IU/㎏에서 투여하고, 이어서 동일 용량의 rFVIIIFc을 투여하였다(도 8). 약물 둘 다를 대략 10분에 걸쳐 정맥내로 주사하였다. 2 용량 수준은 통상적인 치료학적 용량 범위를 함께 묶는 것으로 예상되었다. 피험체는 주사 14일 및 28일 후 항-FVIII 항체 및 억제제에 대한 시험을 비롯하여 안전성 분석을 위해 rFVIIIFc를 받은 후 28일 따랐다. 혈장 FVIII 활성을 주사전, rFVIIIFc 주사 10분 및 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 9시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간 및 168시간(7일) 후, 65IU/㎏의 rFVIIIFc가 투약된 피험체의 경우 192시간, 216시간 및 240시간(10일)에서의 추가의 샘플과 함께, 피험체에서 측정하였다. 25IU/㎏ 그룹의 경우 72시간 및 65IU/㎏ 그룹의 경우 96시간을 통해 애드베이트(등록 상표) 치료 후 동일한 시점에서 혈장 FVIII 활성을 측정하였다.
피험체: 남성 피험체는 중증 A형 혈우병(1% 미만의 FVIII 활성 수준으로 정의됨)을 않는 12세 이상이고, 이전에 FVIII 농축물(pdFVIII 또는 rFVIII)에 대한 적어도 100건의 노출 사례를 가졌다. 마우스 또는 햄스터 단백질에 공지된 과민증, 스크리닝에서 억제제 또는 검출 가능한 억제제 역가의 이력을 갖는 피험체 또는 지혈 또는 전신 면역억제 약물에 영향을 미치는 임의의 약제를 섭취한 피험체 또는 스크리닝 30일 내 (간염 또는 HIV 이외의) 활성 박테리아 또는 바이러스 감염을 경험한 피험체는 배제되었다. 피험체의 유전자형을 알고 있을 때 연구 진입 시 기록하였다.
치료 생성물: 인간 rFVIIIFc 및 Fc 형질전환유전자를 HEK293 세포로 안정하게 형질감염시키고, 안전성을 보장하기 위해 안정성, 무균성 및 바이러스 오염에 대해 세포주를 광범위하게 시험하였다. 정제된 약물 생성물은 Fc 단량체의 이의 카복시 말단을 거쳐 N 말단으로 공유 결합된 단량체 B 도메인 결핍 FVIII로 이루어져, 합성 및 세포로부터의 분비 동안 제2 Fc 단량체와 이황화 결합을 형성하였다. rFVIIIFc는 크로마토그래피 및 나노여과에 의해 정제되었고, 상업적으로 구입 가능한 rFVIII 제제에 비해 1단계 및 발색 응고 검정에서 완전 활성이었다. 이것은 용액 2㎖당 1000IU를 포함하는 동결 액체로서 제공되고, L-히스티딘(pH 7), 염화나트륨, 염화칼슘, 수크로스, 만니톨 및 폴리소르베이트 20과 제제화되었다. 주사의 경우, 생성물을 식염수 용액(0.9% NaCl)으로 희석하였다.
결과 측정: 연구의 1차 목적은 신체 검사를 통해 평가된 안전성이고, 이는 시간에 걸쳐 치료 응급 부작용(AE), 항체 발생 및 실험실 모니터링을 알려준다. 2차 목적은 PK 분석으로부터 유도된 매개변수를 포함하였다. 실험실 평가는 프로트롬빈 시간, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 국제 정상화 비율, D-이합체 수준, 폰 빌레브란트 인자(vWF) 항원, 표준 혈액학 및 혈액 화학 시험 및 요검사를 포함하였다.
인간 혈장에 대한 국제 보건 기구(World Health Organization: WHO) 5판 국제 표준(IS)에 유래하는 정상 기준 혈장(프리시즌 바이올로직스(Precision Biologics) CRYOcheck(상표명)에 대해 보정하여, 상업용 시약(Dade Actin FSL)을 사용하여 지멘스(Siemens) BCS-XP 분석기에서 1단계 응고(aPTT) 검정에 의해 FVIII 활성을 측정하였다. aPTT 검정 이외에, 유럽 약전 추천에 부합하는 상업적으로 구입 가능한 키트(Aniara BIOPHEN FVIII:C)를 사용하여 발색 기질 검정29에 의해 FVIII 활성을 측정하였다. 정상 인간 기준 혈장(인스트루먼테이션 레보라토리즈(Instrumentation Laboratories) ORKE45)에 대해 발색 검정을 보정하고, 이는 또한 WHO 5판 IS 인간 혈장 표준에 대해 부여된 효능을 갖는다.
1단계 및 발색 검정에 대한 정량 하한(lower limit of quantification: LLOQ)은 각각 0.5IU/dL 및 0.4IU/dL였다. -*네이메헌(Nijmegen) 변형 베데스다 검정에 의해 FVIII 억제제를 측정하고, 0.6 BU/㎖ 미만이 네가티브로 생각되었다. 바이오틴 및 설포 태그 rFVIIIFc를 사용하는 특이적 브릿징 전기화학발광 면역검정을 이용하여 항-rFVIIIFc 항체를 평가하였다. 대리 대조군으로서 항인간 FVIII 모노클론 항체를 사용하여 검정 감도가 89ng/㎖인 것으로 결정되었다. 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc에 의한 주사 후 전체 지혈의 개선을 평가하기 위해 다양한 시점에서 2명의 피험체(각각의 용량 수준으로부터 1명)에서 탐색적 전혈 회전 혈전탄성측정(로템(등록 상표))을 수행하였다.
약물동태학적 분석: 애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 단일 투여 후 시간에 대한 각각의 피험체 혈장 FVIII 활성 데이터의 분석을 위해 윈논린(WinNonLin)에서 내생 FVIII 수준 및 후속 잔류 감소를 자동으로 추산하는 사용자 정의 1구획 배치 모델을 이용하였다. 최대 활성(Cmax), t1/2, 청소율(CL), 정상 상태에서의 분포 용적(Vss), 곡선하 면적(무한으로 외삽된 0시간[AUCINF]), 평균체류시간(MRT) 및 증분 회수율을 포함하는 매개변수의 계산을 위해 실제 샘플링 시간, 용량 및 주사 기간을 이용하였다.
시간에 대한 rFVIIIFc 활성의 몬테 카를로 시뮬레이션(Monte Carlo Simulation) 프로필 - 25IU/㎏ 또는 65IU/㎏의 투약 섭생 후 시간에 대한 FVIII 활성 프로필을 구축하기 위해, 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 집단 PK 모델을 이용하여 몬테 카를로 시뮬레이션을 수행하였다. 시험된 집단에서 모델 매개변수(CL, 분포 용적)의 평균 예상치, 개체간 분산 및 잔류 생존율은 이 1/2a상 연구에서 16명의 피험체로부터 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc의 1단계(aPTT) 응고 검정 활성 데이터에 기초한 예상치이다. 각각의 투약 섭생에 대해 각각의 피험체에 대해 15의 샘플링 지점으로 500명의 피험체를 시뮬레이션하였다. 애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 상이한 투약 섭생 후 상이한 시간에 1% 및 3% 이상의 FVIII 활성을 갖는 집단의 백분율이 예측되었다.
통계 분석 - 분산 모델의 분석을 이용하여 rFVIIIFc 및 애드베이트(등록 상표)에 대한 선택된 PK 매개변수를 비교하였다. PK 매개변수는 이 분석 및 예상 평균에 대해 로그 변환되고, 로그 스케일의 평균 차이 및 신뢰 구간은 원래 스케일에서 각각 기하 평균, 기하 평균 비율(geometric mean ratio: GMR) 및 신뢰 구간에 대한 예측치를 얻기 위해 변환되었다. GMR은 애드베이트(등록 상표) PK 매개변수 값에 대한 rFVIIIFc PK 매개변수 값의 피험체간 비율의 기하 평균이다.
결과
피험체 성향 - 연구에 19명의 피험체가 등록하였고; 16명은 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc 둘 다에 대해 PK 평가를 받았다. 1명의 피험체는 애드베이트(등록 상표)의 투약 후 세척 기간을 마치기 전에 이전 생성물을 자가 투여받았고, 따라서 PK 분석으로부터 배제되었지만, 안전성 분석에 포함되었다. 3명의 피험체는 연구 약물 중 어느 하나를 받기 전에 연구로부터 중단되었다: 1명은 자발적으로 기권하고; 다음 1명은 조사자가 비순응도로 인해 기권시켰고; 1명은 연구 등록 완료로 인해 지원자의 요청으로 기권하였다. 투약된 피험체 중, 6명의 피험체는 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc 둘 다를 25IU/㎏ 받았고, 10명의 피험체는 65IU/㎏ 받았다. 평균 연령은 40.3세(23 내지 61세)이었다. 7명의 피험체에 대해 유전자형 확인을 수집하였다; 인트론 22의 전위가 6명의 피험체에서 보고되었고; 프레임 쉬프트 결함(frame-shift defect)이 1명의 피험체에서 보고되었다. 9명의 피험체에 대해 유전자형이 알려지지 않았다. 13명의 피험체가 C형 간염 항체를 가졌고, 이들 4명은 또한 HIV에 양성이었다.
안전성 - 치료 및 추적관찰 기간 동안 11명(69%)의 피험체에 의해 44건의 치료 응급 AE가 보고되었다. 이는 투약 28일 후 관찰 기간을 통해 애드베이트 또는 rFVIIIFc에 의한 투약일을 포함하였다. 대부분의 부작용은 경증으로 생각되고, 누구도 연구로부터 배제되지 않았다. 65IU/㎏ 용량의 rFVIIIFc를 투여받은 1명의 피험체에서 미각장애의 1건의 사례가 일시적으로 발생하였고, rFVIIIFc와 관련되는 것으로 생각되었다.
1명의 피험체는 65IU/㎏의 rFVIIIFc를 투여받은 후 불안 공격을 경험하였고, 이러한 투여는 21건의 AE를 발생시켰으며, 이들 중 19건은 경증으로 분류되고, 이들 중 2건(두통 및 공선혐기증)은 중등증으로 평가되었다. 조사자에 의해 어떤 것도 rFVIIIFc와 관련되는 것으로 생각되지 않았다.
중증 출혈 삽화가 보고되지 않았다. 주사에 대한 알레르기 반응의 근거가 검출되지 않았다. 모든 혈장 샘플은 FVIII 억제제 및 항-rFVIIIFc 항체에 음성인 것으로 시험되었다. 주사 자리 반응의 징후가 관찰되지 않았다. 비정상 실험실 값에서 임상적으로 의미있는 변화가 보고되지 않았다.
약물동태학: 혈장에서 rFVIIIFc에 대한 aPTT와 발색 활성 사이의 상관관계 - 상업적으로 구입 가능한 시약을 사용한 동일한 검정 및 정상 인간 혈장 표준품에 대한 보정에서 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc 활성을 결정하였다. LLOQ 초과의 활성을 갖는 샘플에서 1단계 응고 검정 및 발색 검정에 의해 얻은 결과 사이에 강한 상관관계가 있었다. 각각 애드베이트(등록 상표) 투약 후 151개의 샘플 및 rFVIIIFc 투약 후 185개의 샘플에 대해 2의 검정 결과 사이에 0.94 및 0.95의 상관관계 계수(피어슨 R2)가 관찰되었다. aPTT 결과와 비교하여, 발색 FVIII 활성은, 평균적으로, 애드베이트(등록 상표)에 대해 21% 높고 rFVIIIFc에 대해 32% 높았지만, 통계적으로 유의적이지 않았다(도 9). 이러한 관찰은 약물 둘 다에 대한 발색 평가에 의해 노출 매개변수의 약간 높은 예측치를 발생시켰다. 발색 검정에 의한 명확히 더 높은 FVIII 회수율은 임상 검정에서 시험된 재조합 FVIII 생성물에 통상적이고, 대부분의 다른 시판중인 FVIII 제품과 일치한다.30-32
rFVIIIFc-The 1차 PK 예측치에 대한 개선된 약물동태학은 1단계(aPTT) 응고 검정 활성 데이터로부터 유도되었다. 25 또는 65IU/㎏의 애드베이트(등록 상표), 이어서 동일 용량의 rFVIIIFc를 투여받은 피험체에서, 혈장 FVIII 활성은 급격히 상승하여 투약 후 제1 시간 내에 Cmax에 도달하였다. 관찰된 FVIII 활성의 후속 감소는 기준치 FVIII 활성이 도달할 때까지 단일지수 감소 특성을 나타냈다(도 10). Cmax는 용량에 비례하여 증가하였지만, 동일 용량의 애드베이트(등록 상표)와 rFVIIIFc(표 8)에 필적하였다. 전체 노출(AUCINF)은 또한 용량에 비례하여 증가하였다. 그러나, rFVIIIFc의 AUCINF는 각각 25IU/㎏(p=0.002) 및 65IU/㎏(p<0.001)에서 애드베이트(등록 상표)보다 1.48배 및 1.56배 높았다(표 8).
t1/2, MRT, CL 및 Vss는 용량에 독립적인 것으로 보였다(표 8). rFVIIIFc의 기하 평균 t1/2는 25IU/㎏ 및 65IU/㎏ 용량 그룹 둘 다에 대해 18.8시간이었다. 이는 각각 등가 용량(p<0.001)에서 애드베이트(등록 상표)(12.2시간 및 11.0시간)에 비해 1.54배 및 1.70배 개선을 나타낸다(표 8). 애드베이트(등록 상표)(25IU/㎏에 대해 17.5시간 및 65IU/㎏에 대해 15.8시간)(p<0.001)와 비교하여 rFVIIIFc(용량 그룹 둘 다에 대해 27.0시간)의 MRT에서 동일한 피험체간 개선이 관찰되었다. 각각 25IU/㎏(p=0.002) 및 65IU/㎏(p<0.001)의 용량에서 상응하는 피험체간 CL의 1.49 및 1.56배 감소는 t1/2 및 MRT의 개선과 일치하였다. 애드베이트(등록 상표)와 rFVIIIFc 사이의 Vss 및 증분 회수율에서 유의차가 없었다. 따라서, 각각의 피험체 내에, rFVIIIFc는 애드베이트(등록 상표)와 비교하여 개선된 PK 프로필을 나타냈다. 애드베이트(등록 상표)에서 더 짧은 반감기를 갖는 환자가 rFVIIIFc에서 더 짧은 반감기를 갖고, 애드베이트(등록 상표)에 더 긴 반감기를 갖는 환자가 rFVIIIFc에 더 긴 반감기를 갖는 것으로 또한 관찰되었다.
rFVIIIFc의 개선된 PK 프로필은 25IU/㎏(p<0.001) 및 65IU/㎏(p<0.001)에서 애드베이트(등록 상표)보다 각각 1.53배 및 1.68배 긴 1%의 FVIII 활성으로 투약후 시간을 증가시키고(데이터 표시 생략), 이는 rFVIIIFc에 대한 잠재적으로 더 긴 치료학적 기간을 제시한다.
애드베이트(등록 상표)에 비해 rFVIIIFc의 양호한 PK 프로필이 발색 검정에서 측정된 FVIII 활성에 의해 또한 나타났고(표 9), 이는 aPTT 검정으로부터 유도된 데이터에 필적하였다. 그러나, 애드베이트(등록 상표) 및 rFVIIIFc 둘 다에 대해 1단계(aPTT) 응고 검정보다 발색 검정에 기반하여, 노출 예측치, 즉 Cmax 및 AUCINF는 약간 높았다.
폰 빌레브란트 인자와 rFVIIIFc의 성향 사이의 상관관계 - 순환 시 대부분의 FVIII가 VWF와 복합체 형태이고33 전장 게놈 연관 연구가 FVIII 수준의 유전 결정자가 VWF 수준에 주로 의존한다는 것을 확인시켜 주므로,34 본 발명자들은 VWF와 rFVIIIFc 사이의 연관을 검사하였다. rFVIIIFc 및 애드베이트(등록 상표) 둘 다에 대해 VWF 수준 및 CL 및 t1/2 사이의 강한 상관관계가 관찰되었다. 도 10에 도시된 바대로, 증가된 VWF 수준으로서, rFVIIIFc(p=0.0016) 및 애드베이트(등록 상표)(p=0.0012)의 CL이 감소하였다.
VWF 수준과 t1/2 사이의 역관계가 관찰되었다. 증가된 VWF 수준으로서, rFVIIIFc(p=0.0003) 및 애드베이트(등록 상표)(p<0.0001)의 t1/2가 증가하였다. 이 상관관계는 rFVIIIFc의 Fc 모이어티가 청소율로부터 FVIII를 보호하는 데 있어서 VWF의 역할을 변경하지 않는다는 것을 제시한다.
전혈 로템(등록 상표)에 대한 rFVIIIFc의 연장된 PK의 효과 - 연구 약물의 투여 전에, 각각의 용량 그룹에서 1명의 피험체로부터의 혈액은 동일 용량의 rFVIIIFc 또는 애드베이트(등록 상표)가 스파이킹되고, 전혈 로템(등록 상표)에 의해 분석되었다. 응고 시간(CT)은 정상의 대략 1% 내지 100% 범위에서 용량과 관련하여 직선이고, 용량 반응은 동일한 피험체에서 rFVIIIFc와 애드베이트(등록 상표) 사이에 필적하고(데이터 표시 생략), 이는 혈전 형성에서 rFVIIIFc 및 애드베이트(등록 상표)의 필적하는 효능을 나타낸다.
애드베이트(등록 상표) 또는 rFVIIIFc의 투여 전에 잔류 FVIII 수준으로 인한 가변 기준치 CT에도 불구하고, 생성물 둘 다 투약 30분 후 CT를 필적하는 수준으로 효과적으로 보정하였다(도 12). 25IU/㎏ 투약 3시간 후(도 12a) 및 65IU/㎏ 투약 24시간 후(도 12b) 애드베이트(등록 상표)보다 rFVIIIFc에 의해 CT 개선이 우수하게 유지되었다.
rFVIIIFc는 용량 둘 다에서 피험체에 의해 훌륭히 내약성이었다. 혈액학, 혈액 화학 또는 요검사 매개변수에서 임상적으로 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 대부분의 AE는 경증이고, rFVIIIFc와 무관하며, 후유증 없이 해소되었다. 연구 동안 중증 AE 또는 사망이 발생하지 않았고, 피험체는 어떤 용량에서도 rFVIIIFc에 대한 중화 또는 결합 항체를 발생시키지 않았다.
rFVIIIFc는 애드베이트(등록 상표)에 비해 유의적으로 개선된 FVIII 활성 PK 프로필을 나타났고, 용량 수준에 걸쳐 t1/2 및 MRT는 1단계(aPTT) 응고 검정에 의해 측정될 때 1.54 내지 1.71배 더 길고, 2단계 발색 검정에 의해 측정될 때 1.59 내지 1.84배 더 길었다. rFVIIIFc의 연장된 활성은 가능한 연장된 효율을 예측하여, A형 혈우병을 앓는 환자의 예방학적 치료에서 덜 빈버한 투약 섭생을 허용한다.
이 연구로부터 유도된 PK 매개변수를 채택하여, 몬테 카를로 시뮬레이션은 rFVIIIFc를 투여받는 더 높은 백분율의 환자가 동일 용량의 애드베이트(등록 상표)를 투여받은 환자와 비교하여 1% 또는 3% 초과의 FVIII 수준을 유지할 것이라고 예측하였다(표 10). 예를 들면, 25IU/㎏의 용량에서, 12.2%의 애드베이트(등록 상표) 환자 대 71.2%의 rFVIIIFc 환자는 4일에 1% 초과의 FVIII 최저혈중농도를 갖는 것으로 예측되었고; 65IU/㎏의 용량에서, 11.0%의 애드베이트(등록 상표) 환자 대 66.4%의 rFVIIIFc 환자는 4일에 3% 초과의 FVIII 수준을 갖는 것으로 예측되었다. 다수의 환자에서의 임상 실험은 이 1/2a상 연구 및 몬테 카를로 시뮬레이션 예측으로부터 얻은 결과를 확인시켜 주도록 계획되었다.
다양한 단백질 치료제에 대한 순환 t1/2를 연장하는 데 있어서 Fc 융합 기술의 성공에도 불구하고, 이합체 Fc 융합을 성공적으로 생성하기에는 rFVIII가 너무 큰 것으로 생각되었다. 본 발명자들은 따라서 단량체 Fc 융합 단백질을 생성하고, 이에 의해 단일 이팩터 분자가 이합체 Fc에 공유 결합되어, 세포내 FcRn에 대한 결합 및 후속 사이클링이 가능하게 하였다.21,22 실험실내 응고 검정은 상업적으로 구입 가능한 시약 및 흔히 사용되는 FVIII 기준 표준품을 사용하여 응고 또는 발색 검정에 의해, B 도메인 결핍 또는 네이티브 FVIII와 비교하여, rFVIIIFc에 대해 비활성 손실을 나타내지 않았다[JAD, TL, SCL 등, 2011년 8월 제출된 사본]. 또한, 이 결과는 1단계 검정 또는 발색 방법에 의해 rFVIIIFc가 임상 세팅에서 신뢰할 만하게 평가될 수 있다는 것을 나타낸다.
요약하면, 이 1/2a상 임상 실험은 중증 A형 혈우병을 앓는 환자에서 rFVIIIFc의 안전성 및 연장된 t1/2를 입증하는 제1 실험이다. 중심 3상 연구가 A형 혈우병을 앓는 개체에 대해 효과적인 예방 투약 섭생을 확립하기 위해 rFVIIIFc로 진행 중에 있다.
실시예 11
생합성 동안 R1648 잔기에서 불완전 단백질분해로부터 생긴 VIII 인자(FVIII)의 새로운 단쇄(SC) 아이소폼은 네이티브 FVIII에 비해 더 우수한 생성능 및 안정성을 제공할 수 있다. 면역글로불린 Fc 도메인(rFVIIIFc)에 융합된 단일 재조합 B 도메인 결핍 VIII 인자 분자 및 이의 정제된 SC 대응물(SC-rFVIIIFc)은 폰 빌레브란트 인자(VWF)가 결핍된 혈장을 이용하여 1단계 응고 검정에서 유사한 비활성을 나타냈지만, SC-rFVIIIFc는 VWF의 존재 하에 더 낮은 비활성을 나타냈다. VWF로부터의 트롬빈 매개 단백질분해 방출과 관련하여 VWF 결합 rFVIIIFc, SC-rFVIIIFc 및 rBDD-FVIII(진타(등록 상표), 레팍토 AF(등록 상표))가 상이하다는 것을 결정하기 위해 이 연구를 수행하였다.
인간 VWF가 아민 커플링에 의해 부동화된 광학 바이오센서 칩에서 등몰량의 rFVIIIFc, SC-rFVIIIFc 및 rBDD-FVIII를 포획하였다. 농도 범위에서의 인간 α-트롬빈을 칩 표면 위로 인퓨즈하고, 부동화된 VWF로부터의 FVIII 방출 속도를 실시간으로 모니터링하였다. 각각의 FVIII 종에 대해 α-트롬빈의 최대 반 유효 농도(EC50)를 결정하였다.
rFVIIIFc 및 rBDD-FVIII에 대한 α-트롬빈 EC50 값은 필적하는 반면(각각 3.7±0.2U/㎖ 및 3.2±0.3U/㎖), SC-rFVIIIFc에 대한 EC50 값은 3배 높았다(11.7±0.9U/㎖). SC-rFVIIIFc가 rFVIIIFc 또는 rBDD-FVIII보다 VWF로부터 더 천천히 방출된다는 이러한 발견은 1단계 응고 검정(aPTT)(여기서, SC-FVIIIFc는 VWF가 검정 혈장 샘플에 존재할 때만 더 낮은 명확한 활성을 가짐)에서 rFVIIIFc 및 SC-rFVIIIFc의 활성과 관련하여 이전에 관찰된 발견과 일치한다. 그러나, 모든 샘플은 마우스 출혈 모델에서 등등한 활성을 보유하고, 이는 VWF로부터 FVIII의 방출에서 트롬빈에 대한 FVIII 제제의 반응성이 생체내 효율과 연관되지 않는다는 것을 나타낸다.
[표 1] 폴리뉴클레오타이드 서열
A. B 도메인 결핍 FVIIIFc
(ⅰ) B 도메인 결핍 FVIIIFc 사슬 DNA 서열(밑줄친 FVIII 신호 펩타이드, 볼드체의 Fc 영역)(서열 번호 2를 코딩하는 서열 번호 1)
(ⅱ) Fc DNA 서열(밑줄친 마우스 Igκ 신호 펩타이드)(서열 번호 4를 코딩하는 서열 번호 3)
B. 전장 FVIIIFc
(ⅰ) 전장 FVIIIFc DNA 서열(밑줄친 FVIII 신호 펩타이드, 볼드체의 Fc 영역)(서열 번호 6을 코딩하는 서열 번호 5)
(ⅱ) Fc(A(ⅱ)(서열 번호 3)와 동일한 서열)]
[표 2] 폴리펩타이드 서열
A. B 도메인 결핍 FVIII-Fc 단량체 하이브리드(BDD FVIIIFc 단량체 이합체): BDD FVIIIFc 및 Fc 사슬을 동시발현하여 생성됨.
구성체 = HC-LC-Fc 융합. Fc 발현 카세트를 BDDFVIII-Fc와 동시형질감염시켜 BDD FVIIIFc 단량체를 생성시켰다. BDD FVIIIFc 사슬의 경우, Fc 서열이 볼드체로 기재되어 있고; HC 서열은 이중 밑줄로 기재되어 있고; 남은 B 도메인 서열은 이탤릭체로 기재되어 있다. 신호 펩타이드는 밑줄쳐 있다.
(ⅰ) B 도메인 결핍 FVIII-Fc 사슬(밑줄친 19개의 아미노산 신호 서열)(서열 번호 2)
(ⅱ) Fc 사슬(밑줄친 마우스 Igκ 사슬로부터 20개의 아미노산 비상동성 신호 펩타이드)(서열 번호 4)
B. 전장 FVIIIFc 단량체 하이브리드(전장 FVIIIFc 단량체 이합체): FVIIIFc 및 Fc 사슬을 동시발현하여 생성됨.
구성체 = HC-B-LC-Fc 융합. Fc 발현 카세트를 전장 FVIII-Fc와 동시형질감염시켜 전장 FVIIIFc 단량체를 생성시켰다. FVIIIFc 사슬의 경우, Fc 서열이 볼드체로 기재되어 있고; HC 서열은 이중 밑줄로 기재되어 있고; B 도메인 서열은 이탤릭체로 기재되어 있다. 신호 펩타이드는 밑줄쳐 있다.
(ⅰ) 전장 FVIIIFc 사슬(밑줄친 FVIII 신호 펩타이드(서열 번호 6)
(ⅱ) Fc 사슬(밑줄친 마우스 Igκ 사슬로부터 20개의 아미노산 비상동성 신호 펩타이드)(서열 번호 4)
인용문헌
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<160> 16
<170> PatentIn version 2.0
<210> 1
<211> 5052
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-Domain Deleted FVIIIFc Chain
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> FVIII signal
<220>
<221> misc_feature
<222> (4372)..(5052)
<223> Fc region
<400> 1
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340
cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400
gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460
cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520
catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580
caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640
ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700
agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760
cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820
ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940
ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000
tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060
gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120
tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180
caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240
attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300
tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360
tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420
gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480
cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540
tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600
ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660
ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720
cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780
aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840
tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact 4380
cacacatgcc caccgtgccc agctccagaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc 4440
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 4500
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 4560
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 4620
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 4680
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 4740
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 4800
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 4860
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc 4920
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 4980
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 5040
tctccgggta aa 5052
<210> 2
<211> 1684
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B domain deleted FVIII-Fc chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Signal
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(753)
<223> Heavy chain (HC)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (760)..(773)
<223> B domain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1457)..(1684)
<223> Fc region
<400> 2
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1445 1450 1455
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1460 1465 1470
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1475 1480 1485
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1490 1495 1500
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1505 1510 1515
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1520 1525 1530
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1535 1540 1545
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1550 1555 1560
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1565 1570 1575
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1580 1585 1590
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1595 1600 1605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1610 1615 1620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1625 1630 1635
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1640 1645 1650
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1655 1660 1665
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1670 1675 1680
Lys
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(60)
<223> Mouse Ig kappa signal
<400> 3
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggagg accgtcagtc 120
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 180
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 240
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 300
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 360
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 420
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgcgatga gctgaccaag 480
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 540
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 600
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 660
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 720
ctctccctgt ctccgggtaa a 741
<210> 4
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> heterologous signal from Mouse Ig kappa chain
<400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
35 40 45
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
50 55 60
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
65 70 75 80
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
85 90 95
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
100 105 110
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
115 120 125
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
145 150 155 160
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
165 170 175
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
210 215 220
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
<210> 5
<211> 7734
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full length FVIIIFc
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(57)
<223> FVIII signal
<220>
<221> misc_feature
<222> (7054)..(7734)
<223> Fc region
<400> 5
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340
ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400
atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460
gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520
cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580
catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640
aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700
tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760
agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820
tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880
aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940
aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3000
gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060
aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120
attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180
gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240
aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300
gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360
ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420
caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480
aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540
ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600
ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660
gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720
aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780
ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840
aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900
aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960
agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020
ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080
aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140
aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200
caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260
atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320
agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat 4380
aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440
ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500
aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560
cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg 4620
gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct 4680
ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta 4740
ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800
tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860
aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920
atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980
gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040
attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160
gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220
gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280
tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580
gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640
acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700
atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760
ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820
aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880
tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940
gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000
gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060
attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120
cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180
caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240
tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540
cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600
agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660
acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720
caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780
ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 6840
atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900
gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960
ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tacgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 7080
ccagctccag aactcctggg cggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 7140
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 7200
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 7260
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 7320
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 7380
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aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 7560
aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 7620
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 7680
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 7734
<210> 6
<211> 2578
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full length FVIIIFc chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> FVIII signal
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(759)
<223> HC
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (760)..(1667)
<223> B domain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2352)..(2578)
<223> Fc region
<400> 6
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro
755 760 765
Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp
770 775 780
Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys
785 790 795 800
Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser
805 810 815
Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr
820 825 830
Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn
835 840 845
Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly
850 855 860
Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu
865 870 875 880
Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys
885 890 895
Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn
900 905 910
Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met
915 920 925
Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys
930 935 940
Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu
945 950 955 960
Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu
965 970 975
Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe
980 985 990
Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala
995 1000 1005
Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser
1010 1015 1020
Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser
1025 1030 1035
Leu Leu Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu
1040 1045 1050
Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg
1055 1060 1065
Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met
1070 1075 1080
Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln
1085 1090 1095
Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met
1100 1105 1110
Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile
1115 1120 1125
Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro
1130 1135 1140
Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu
1145 1150 1155
Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys
1160 1165 1170
Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro
1175 1180 1185
Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu
1190 1195 1200
Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu
1205 1210 1215
Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile
1220 1225 1230
His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu
1235 1240 1245
Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr
1250 1255 1260
Ala Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn
1265 1270 1275
Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu
1280 1285 1290
Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu
1295 1300 1305
Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln
1310 1315 1320
Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg
1325 1330 1335
Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp
1340 1345 1350
Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro
1355 1360 1365
Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala
1370 1375 1380
Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser
1385 1390 1395
Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser
1400 1405 1410
Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe
1415 1420 1425
Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys
1430 1435 1440
Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys
1445 1450 1455
Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly
1460 1465 1470
Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser
1475 1480 1485
Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp
1490 1495 1500
Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His
1505 1510 1515
Ile Tyr Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser
1520 1525 1530
Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr
1535 1540 1545
Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val
1550 1555 1560
Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser
1565 1570 1575
Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln
1580 1585 1590
Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys
1595 1600 1605
Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys
1610 1615 1620
Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys
1625 1630 1635
Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg
1640 1645 1650
Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu
1655 1660 1665
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1670 1675 1680
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1685 1690 1695
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1700 1705 1710
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1715 1720 1725
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1730 1735 1740
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1745 1750 1755
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1760 1765 1770
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1775 1780 1785
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1790 1795 1800
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1805 1810 1815
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1820 1825 1830
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1835 1840 1845
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1850 1855 1860
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1865 1870 1875
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1880 1885 1890
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1895 1900 1905
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1910 1915 1920
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1925 1930 1935
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1940 1945 1950
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1955 1960 1965
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1970 1975 1980
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1985 1990 1995
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
2000 2005 2010
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
2015 2020 2025
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
2030 2035 2040
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
2045 2050 2055
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
2060 2065 2070
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
2075 2080 2085
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
2090 2095 2100
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
2105 2110 2115
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
2120 2125 2130
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
2135 2140 2145
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
2150 2155 2160
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
2165 2170 2175
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
2180 2185 2190
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
2195 2200 2205
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
2210 2215 2220
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
2225 2230 2235
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
2240 2245 2250
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
2255 2260 2265
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
2270 2275 2280
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
2285 2290 2295
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
2300 2305 2310
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
2315 2320 2325
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
2330 2335 2340
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
2345 2350 2355
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
2360 2365 2370
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
2375 2380 2385
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
2390 2395 2400
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
2405 2410 2415
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
2420 2425 2430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
2435 2440 2445
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
2450 2455 2460
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
2465 2470 2475
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
2480 2485 2490
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
2495 2500 2505
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
2510 2515 2520
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
2525 2530 2535
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
2540 2545 2550
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
2555 2560 2565
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2570 2575
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> albumin-binding peptide
<400> 7
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP peptide
<400> 8
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20 25 30
<210> 9
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP Petptide
<400> 9
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAS peptide
<400> 10
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala
20
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAS peptide
<400> 11
Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser
20
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAS peptide
<400> 12
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ser
20
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAS peptide
<400> 13
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAS peptide
<400> 14
Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ala
20
<210> 15
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAS peptide
<400> 15
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala
20
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAS peptide
<400> 16
Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala
20
Claims (264)
- (i) 인자 VIII (FVIII) 부분 및 제 2 부분을 포함하고 있는 키메라 폴리펩타이드; 및 (ii) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물로서,
키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 25% 내지 40% 가 단쇄 FVIII 이며, 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 60% 내지 75% 가 처리된 FVIII 이고,
상기 단쇄 FVIII 는 단일 폴리펩타이드 사슬 상에 FVIII 중쇄 및 FVIII 경쇄를 포함하고, 상기 처리된 FVIII 는 2 개의 폴리펩타이드 사슬 상에 FVIII 중쇄 및 FVIII 경쇄를 포함하고,
상기 제 2 부분은 키메라 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 비-FVIII 부분을 포함하는 약제학적 조성물. - 제 1 항에 있어서,
키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 30% 내지 40% 가 단쇄 FVIII 인 약제학적 조성물. - 제 1 항에 있어서,
(a) 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 25% 가 단쇄 FVIII 이고, 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 75% 가 처리된 FVIII 이거나;
(b) 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 30% 가 단쇄 FVIII 이고, 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 70% 가 처리된 FVIII 이거나;
(c) 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 35% 가 단쇄 FVIII 이고, 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 65% 가 처리된 FVIII 이거나;또는
(d) 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 40% 가 단쇄 FVIII 이고, 키메라 폴리펩타이드의 FVIII 부분의 60% 가 처리된 FVIII 인 약제학적 조성물. - 제 1 항에 있어서, 단쇄 FVIII 를 포함하는 키메라 폴리펩타이드가 처리된 FVIII 를 포함하는 폴리펩타이드에 필적할 FVIII 활성을 갖는 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 지속성 FVIII 폴리펩타이드인 약제학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 FVIII 부분으로 이루어진 폴리펩타이드보다 더 긴 반감기를 갖는 약제학적 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 제 2 부분이 Fc 영역, 알부민, PAS 서열, 트랜스페린, 4 O-글라이칸을 갖는 hCG의 28개의 아미노산 C 말단 펩타이드(CTP), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 알부민 결합 폴리펩타이드, 알부민 결합 소분자 또는 2 이 상의 이들의 조합을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 FVIIIFc 단량체 이합체 하이브리드인 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, FVIII 부분이 B-도메인 결실 FVIII 또는 전장, 성숙 FVIII 를 포함하거나, 또는 전장 성숙 FVIII 에서 1645 번에 해당하는 잔기, 전장 성숙 FVIII 에서 1648 번에 해당하는 잔기, 또는 양쪽 모두의 잔기가 야생형 FVIII 에 비해 단쇄 FVIII 중 치환되어 있거나 또는 돌연변이화되어 있는 약제학적 조성물.
- 제 9 항에 있어서, FVIII 부분이 부분 B-도메인 결실 FVIII 을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 신호 서열 없이 서열 번호 2 와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 신호 서열 없이 서열 번호 2 로 이루어진 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 키메라 폴리펩타이드가 신호 서열 없이 서열 번호 6 과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 상기 키메라 폴리펩타이드가 신호 서열 없이 서열 번호 6 으로 이루어진 약제학적 조성물.
- 제 9 항에 있어서, FVIII 부분이 완전 B-도메인 결실 FVIII 을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 인간에 대해 피하, 피내, 맥관내, 정맥내, 근육내, 척추, 두개내, 척추강내, 안내, 안주위, 안와하강, 활액내 또는 복강내 주사를 위해 적합한 약제학적 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 피험체에서의 출혈 삽화의 예방, 감소 또는 치료를 위한, 피험체에서의 출혈 삽화를 예방학적으로 치료하기 위한, 피험체에서의 출혈 삽화의 온디맨드식 치료를 위한, 또는 수술이 필요한 피험체에서의 항상성 유지를 위한 약제학적 조성물.
- 제 17 항에 있어서, 출혈 삽화가 관절혈증, 근육 출혈, 경구 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구내 출혈, 외상, 두근 외상 (두부 외상), 위장 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강내 출혈, 복막후강내 출혈 또는 장요근초내 출혈을 포함하는 질환 또는 상태와 관련있는 것인 약제학적 조성물.
- 제 17 항에 있어서, 수술이 소수술, 대수술, 발치, 편도선 수술, 서혜부 절제술, 활막절제술, 슬관절 전치환술, 개두술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술, 응급 수술 또는 관절 대체 수술인 약제학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 건조된 약제학적 조성물.
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