JP2017088623A - 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法 - Google Patents

第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法 Download PDF

Info

Publication number
JP2017088623A
JP2017088623A JP2017028814A JP2017028814A JP2017088623A JP 2017088623 A JP2017088623 A JP 2017088623A JP 2017028814 A JP2017028814 A JP 2017028814A JP 2017028814 A JP2017028814 A JP 2017028814A JP 2017088623 A JP2017088623 A JP 2017088623A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
factor viii
item
subject
polypeptide
chimeric polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2017028814A
Other languages
English (en)
Inventor
エー． ドゥモント ジェニファー
A Dumont Jennifer
エー． ドゥモント ジェニファー
ロー スーザン
Low Susan
ロー スーザン
ジェイ． ビトンティ アラン
Alan J Bitonti
ジェイ． ビトンティ アラン
ピアース グレン
Pierce Glenn
ピアース グレン
ルック アルビン
Luk Alvin
ルック アルビン
ジャン ヘイヤン
Jiang Haiyan
ジャン ヘイヤン
マッキンニー バイロン
mckinney Byron
マッキンニー バイロン
オットマー マット
Ottmer Matt
オットマー マット
ソマー ジャーグ
Sommer Jurg
ソマー ジャーグ
ニューゲント カレン
nugent Karen
ニューゲント カレン
リアン リー
Lian Li
リアン リー
ピーターズ ロバート
Peters Robert
ピーターズ ロバート
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioverativ Therapeutics Inc
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc
Publication of JP2017088623A publication Critical patent/JP2017088623A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

【課題】第ＶＩＩＩ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法を提供すること。
【解決手段】本発明は、第ＶＩＩＩ因子（プロセシングされたＦＶＩＩＩ、一本鎖ＦＶＩＩＩ、またはそれらの組み合わせ）を投与する方法、第ＶＩＩＩ因子を含むキメラおよびハイブリッドポリペプチドを投与する方法、第ＶＩＩＩ因子を含むキメラおよびハイブリッドポリペプチド、そのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む細胞、ならびにそのような細胞を用いてそのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドを産生する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

電子的に提出された配列表への言及
本出願とともに提出されるＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出される配列表（名前：ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ、サイズ：＿＿＿＿バイト、および作成日：＿＿＿＿）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、一般に、止血障害の治療薬の分野に関する。
血友病Ａは、ＦＶＩＩＩ活性の欠損をもたらす第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子における突然変異および／または欠失に起因するＸ連鎖性出血性障害である（非特許文献１（Ｐｅｙｖａｎｄｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２：８２−８９（２００６））。この疾患は、突発性出血および外傷後の過剰な出血により特徴付けられる。やがて、筋肉および関節への反復的な出血（幼少期に始まることが多い）が、血友病性関節症および不可逆的な関節損傷をもたらす。この損傷は進行性であり、関節の非常に限定された可動性、筋萎縮症、および慢性痛に至る可能性がある（非特許文献２（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍｅｒｃｈａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：８７−９６（２００３））、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
Ａ２ドメインは、第ＶＩＩＩ因子分子の凝血促進活性に必要である。研究では、ブタ第ＶＩＩＩ因子がヒト第ＶＩＩＩ因子よりも６倍高い凝血促進活性を有することが示されており（非特許文献３（Ｌｏｌｌａｒ，Ｐ．，ａｎｄ Ｅ．Ｔ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２４８１−１２４８６（１９９１）））、ヒト第ＶＩＩＩ因子とブタ第ＶＩＩＩ因子との間の凝固活性の差は、ヒトおよびブタのＡ２ドメインにおける１つ以上の残基間のアミノ酸配列の差に基づくようである（非特許文献４（Ｌｏｌｌａｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２３６５２−２３６５７（１９９２）））。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
血友病Ａの治療は、ＦＶＩＩＩ活性を正常レベルの１〜５％まで回復させて、突発性出血を予防することを目的とする補充療法による（非特許文献５（Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３−１７７９（２００１））、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。出血エピソードをオンデマンドで治療する、または予防的に治療することによって出血エピソードが起こることを予防するために利用可能な血漿由来および組換えＦＶＩＩＩ製品がある。しかしながら、これらの製品の例えば、８〜１２時間の短い半減期に基づいて、治療レジメンは頻繁な静脈内注射の投与を必要とする。そのような頻繁な投与は、痛みを伴い、かつ不都合である。
死亡率の低下、関節損傷の予防、生活の質の改善は、血漿由来および組換え第ＶＩＩＩ因子の開発による重要な成果である。出血からの長期保護は、血友病Ａ患者の治療における別の重要な進歩を示すであろう。しかしながら、これまで長期の止血保護を可能にする製品は開発されていない。したがって、現在の治療法よりも容認でき、長く続き、かつ有効である、第ＶＩＩＩ因子欠損症に起因する血友病を治療する改善された方法が必要である。
Ｐｅｙｖａｎｄｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２：８２−８９（２００６） Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍｅｒｃｈａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：８７−９６（２００３） Ｌｏｌｌａｒ，Ｐ．，ａｎｄ Ｅ．Ｔ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２４８１−１２４８６（１９９１） Ｌｏｌｌａｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２３６５２−２３６５７（１９９２） Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３−１７７９（２００１）
本発明は、第ＶＩＩＩ因子を投与する方法、第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドおよびそのようなキメラポリペプチドのハイブリッドを投与する方法、第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドおよびそのようなキメラポリペプチドのハイブリッド、そのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む細胞、ならびにそのような細胞を用いてそのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドを産生する方法を提供する。
本発明は、第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とする対象に投与する方法であって、この対象に、治療用量のキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、例えば、キメラ第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃポリペプチドを、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５倍長い投与間隔で投与することを含む、方法を提供する。
投与間隔は、等価用量のＦｃ部分等の非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５〜６倍長いか、１．５〜５倍長いか、１．５〜４倍長いか、１．５〜３倍長いか、または１．５〜２倍長くあり得る。投与間隔は、等価用量のＦｃ部分等の非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、または６倍長くあり得る。投与間隔は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはそれ以上長くあり得る。
投与間隔は、少なくとも約１．５〜５、１．５、２、３、４、もしくは５日、またはそれ以上であり得る。
本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とする対象に投与する方法であって、この対象に、治療用量のキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、例えば、キメラ第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃポリペプチドを投与して、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチド）により得られる血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）よりも少なくとも約１．２５倍大きなＡＵＣを得ることを含む、方法も提供する。
本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とする対象に投与する方法であって、この対象に、第ＶＩＩＩ因子およびＦｃを含む治療用量のポリペプチドを、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはそれ以上の投与間隔で投与することを含む、方法も提供する。
本発明の方法は、予防的処置またはオンデマンド治療を必要とする対象に対して実施することができる。
オンデマンド治療には、出血エピソード、関節血症、筋肉出血、口の出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷（ｔｒａｕｍａ ｃａｐｉｔｉｓ）、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、または腸腰筋鞘（ｉｌｌｉｏｐｓｏａｓ ｓｈｅａｔｈ）内の出血に対する治療が含まれる。対象は、外科的予防、手術中管理、または外科手術のための処置を必要とし得る。そのような外科手術には、例えば、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術が含まれる。
オンデマンド治療については、当該キメラポリペプチドの投与間隔は、２４〜３６、２４〜４８、２４〜７２、２４〜９６、２４〜１２０、２４〜１４４、２４〜１６８、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間ごと、またはそれ以上で約１回である。
本発明の方法で使用され得る治療用量は、約１０〜約１００ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ＩＵ／ｋｇである。
本発明の方法で使用され得る治療用量は、約１０〜約１５０ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、約１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、約１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ＩＵ／ｋｇである。
本発明の方法における対象は、ヒト対象である。投与間隔およびＡＵＣの決定は、単一の対象で、または対象の集団で実施することができる。
第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、ヒト第ＶＩＩＩ因子である。第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、Ｂドメインの完全または部分欠失を有し得る。
第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸４〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一であり得る。第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一であり得る。
第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一であり得る。第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同一であり得る。
Ｆｃ部分（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と少なくとも９０％または９５％同一であり得る。Ｆｃ部分（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と同一であり得る。
キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含み得る。キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と同一である配列を含み得る。
キメラポリペプチドは、当該キメラポリペプチドと結合した第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態であってよく、当該第２のポリペプチドは、Ｆｃを含むか、またはＦｃから本質的になる。
第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含み得るか、またはこの配列から本質的になり得る。第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と同一である配列を含み得るか、またはこの配列から本質的になり得る。
キメラポリペプチドまたはハイブリッドは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与され得る。
本発明はまた、上記のキメラおよびハイブリッドポリペプチドそれ自体、それらをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含む培養されたヒト胚細胞、そのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドを産生する方法、およびそのような方法によって産生されたポリペプチドも提供する。
本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子部分および第２の部分を含む第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドも提供し、この第ＶＩＩＩ因子部分は、重鎖を含む第１の鎖および軽鎖を含む第２の鎖の２つの鎖を含むプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であり、当該第１の鎖および当該第２の鎖は、金属結合により会合される。例えば、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である。
加えて、本発明は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドを含み、第ＶＩＩＩ因子部分は、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。一態様において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、無傷の細胞内プロセシング部位を含有することができる。一実施形態において、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、または約２５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。別の実施形態において、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。別の態様において、一本鎖ＦＶＩＩＩは、細胞内プロセシング部位を含有しない。例えば、一本鎖ＦＶＩＩＩは、完全長第ＶＩＩＩ因子において、アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異、またはアルギニン１６４５およびアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異を含む。アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸は、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸とは異なるアミノ酸である。ある特定の実施形態において、置換または突然変異は、アルギニン以外のアミノ酸、例えば、アラニンである。
幾つかの実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子活性が発色アッセイによってインビトロで測定される場合、２つのＦｃ部分と、この２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵するレベルで第ＶＩＩＩ因子活性を有する。他の実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、この２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵するインビボでの第ＶＩＩＩ因子活性を有する。さらに他の実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、この２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵する第Ｘａ因子の発生率を有する。ある特定の実施形態において、キメラポリペプチド中の一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルで、活性化プロテインＣによって不活性化される。なお他の実施形態において、キメラポリペプチド中の一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵する第ＩＸａ因子の相互作用率を有する。さらなる実施形態において、キメラポリペプチド中の一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルでフォンウィルブランド因子に結合する。
本発明は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドを含む組成物であって、当該ポリペプチドの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子部分、および第２の部分を含み、当該一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、組成物をさらに含む。一実施形態において、第２の部分は、Ｆｃであり得る。別の実施形態において、ポリペプチドは、第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、当該第２のポリペプチドは、Ｆｃから本質的になる。他の実施形態において、ポリペプチドは、当該第ＶＩＩＩ因子からなるポリペプチドに対して少なくとも１．５〜６倍長い、１．５〜５倍長い、１．５〜４倍長い、１．５〜３倍長い、または１．５〜２倍長い半減期を有する。
治療上有効量の組成物を投与することを含む、出血性状態を治療する方法も提供される。この治療は、予防的処置またはオンデマンド治療または手術中であり得る。出血凝固障害は、血友病であり得る。一実施形態において、治療される対象は、小児対象である。
本発明はまた、対象における出血エピソードを予防、減少、または治療する方法も対象とし、この対象に、有効量の長時間作用型第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を投与することを含み、対象は、血漿中に高レベルのフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を発現する。一実施形態において、対象は、血漿中に高レベルのＶＷＦを発現することが特定される。本発明はまた、対象における出血エピソードを予防、減少、または治療する方法も対象とし、この方法には、（ａ）高レベルのＶＷＦを有する対象を、当該対象の血漿中のＶＷＦレベルを測定することによって特定することであって、少なくとも約１００ＩＵ／ｄＬのＶＷＦレベルが、高レベルのＶＷＦを有するものとして対象を特定する、対象を特定することと、（ｂ）当該対象に、有効量の長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質を投与することと、を含む。
一実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、小児対象である。別の実施形態において、対象は、血友病Ａを有する。
一実施形態において、高レベルのＶＷＦは、少なくとも約１００ＩＵ／ｄＬである。別の実施形態において、高レベルのＶＷＦは、約１００ＩＵ／ｄＬ〜約２００ＩＵ／ｄＬである。別の実施形態において、高レベルのＶＷＦは、約１１０ＩＵ／ｄＬ、約１２０ＩＵ／ｄＬ、約１３０ＩＵ／ｄＬ、約１４０ＩＵ／ｄＬ、約１５０ＩＵ／ｄＬ、約１６０ＩＵ／ｄＬ、約１７０ＩＵ／ｄＬ、約１８０ＩＵ／ｄＬ、約１９０ＩＵ／ｄＬ、または約２００ＩＵ／ｄＬである。
一実施形態において、対象は、血清型Ａ、Ｂ、またはＡＢを有する。
一実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、当該対象において、約２０〜約４０時間の半減期を有する。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、約２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、または４０時間の半減期を有する。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、約２０〜約２７時間の半減期を有する。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、平均レベルのＶＷＦを有する個人に投与される場合、当該当該長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期を有する。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、平均レベルのＶＷＦを有する個人に投与される場合、当該当該長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期よりも少なくとも約約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い半減期を有する。
一実施形態において、投与される長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質の有効量は、少なくとも約２０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約２５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約３０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約３５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約４０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約４５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約５０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約５５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約６０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約６５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約７０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約７５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約８０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約８５ＩＵ／ｋｇ、または少なくとも約９０ＩＵ／ｋｇである。別の実施形態において、有効量は、少なくとも約６５ＩＵ／ｋｇ〜少なくとも約９０ＩＵ／ｋｇである。別の実施形態において、有効量は、８０ＩＵ／ｋｇである。
一実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、７２時間ごとまたはそれ以上で投与される。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、１週間またはそれ以上で約１回投与される。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、１０日ごとに約１回、２週間ごとに約１回、１５日ごとに約１回、２０日ごとに約１回、３週間ごとに約１回、２５日ごとに約１回、４週間ごとに約１回、または１ヶ月ごとに約１回投与される。
一実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩは、８０ＩＵ／ｋｇの投与量で７２時間ごとに１回投与される。さらなる実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩは、小児対象に、８０ＩＵ／ｋｇの投与量で７２時間ごとに１回投与される。
一実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質の投与は、出血エピソードの５〜２０％超、５〜１５％超、５〜１０％超、１０〜２０％超、または１０〜１５％超を解消する。一実施形態において、対象において、血漿第ＶＩＩＩ因子：Ｃのトラフレベルは、１〜３または３〜５ＩＵ／ｄＬを超えて維持される。一実施形態において、投与は、対象において、出血エピソードを予防する。別の実施形態において、出血エピソードは、突発的である。別の実施形態において、投与は、出血エピソードの８０〜１００％超、８０〜９０％超、８５〜９０％超、９０〜１００％超、９０〜９５％超、または９５〜１００％超を解消する。
一実施形態において、投与は、外科手術を必要とする対象の集団において、恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｓ）を維持する。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、外科手術前、その間、またはその後に投与される。別の実施形態において、外科手術は、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術である。別の実施形態において、外科手術は、緊急手術である。
一実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩからなるポリペプチドよりも長い半減期を有する。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、ペグ化、ＨＥＳ化、またはポリシアル化されている。
一実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ部分および第２の部分を含むキメラタンパク質である。別の実施形態において、第２の部分は、Ｆｃ領域、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリン、ＣＴＰ（４つのＯ−グリカンを有するｈＣＧの２８アミノ酸Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合ポリペプチド、アルブミン結合小分子、またはそれらの２つ以上の組み合わせである。別の実施形態において、第２の部分は、ＦＶＩＩＩ部分のアミノ末端またはカルボキシ末端と融合している。別の実施形態において、第２の部分は、ＦＶＩＩＩ部分の２つのアミノ酸間に挿入されている。別の実施形態において、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体二量体ハイブリッドである。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、一本鎖である。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、重鎖および軽鎖を含む。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、完全長第ＶＩＩＩ因子、成熟第ＶＩＩＩ因子、またはＢドメインの完全もしくは部分欠失を有する第ＶＩＩＩ因子を含む。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２のアミノ酸１〜１４３８または配列番号６のアミノ酸１〜２３３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２のアミノ酸１〜１４３８または配列番号６のアミノ酸１〜２３３２を含む。別の実施形態において、キメラポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１４３９〜１６６５または配列番号６のアミノ酸２３３３〜２５５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃ部分を含む。別の実施形態において、第２の部分は、配列番号２のアミノ酸１４３９〜１６６５または配列番号６のアミノ酸２３３３〜２５５９を含む。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩのポリペプチドは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される。
本発明はまた、出血性障害であると診断されている対象を治療する方法であって、正常な対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期は、この対象が長い投与間隔の候補者であることを示す、当該対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期を測定することと、有効量のＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドを少なくとも３日間の投与間隔で投与することと、を含む、方法も提供する。
本発明はまた、出血性障害であると診断されている対象を治療する方法であって、対象に、有効量のＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドを少なくとも３日間の投与間隔で投与することであって、当該対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期が、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い、投与することを含む、方法も提供する。
一実施形態において、当該対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの血漿半減期は、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの血漿半減期よりも少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの血漿半減期は、２０〜４０時間である。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、約２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、または４０時間の半減期を有する。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、約２０〜約２７時間の半減期を有する。
本発明はまた、出血性障害であると診断されている対象を治療する方法であって、本方法は、当該対象に投与された短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期を測定して、平均レベルのＶＷＦを有する対象における当該短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期が、この対象が長い投与間隔の候補者であることを示すことと、有効量の長期間作用型ＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドを少なくとも３日間の投与間隔で投与することと、を含む、方法も提供する。一実施形態において、当該対象における短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期は、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合の短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い。
一実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、小児対象である。別の実施形態において、対象は、血友病Ａを有する。別の実施形態において、対象は、血清型Ａ、Ｂ、またはＡＢを有する。
一実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩ−Ｆｃは、少なくとも約２０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約２５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約３０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約３５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約４０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約４５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約５０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約５５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約６０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約６５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約７０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約７５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約８０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約８５ＩＵ／ｋｇ、または少なくとも約９０ＩＵ／ｋｇの有効量で投与される。別の実施形態において、有効量は、少なくとも約６５ＩＵ／ｋｇ〜少なくとも約９０ＩＵ／ｋｇである。
一実施形態において、有効量のＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、１週間ごとに約１回、１０日ごとに約１回、２週間ごとに約１回、１５日ごとに約１回、２０日ごとに約１回、３週間ごとに約１回、２５日ごとに約１回、４週間ごとに約１回、または１ヶ月ごとに約１回投与される。
一実施形態において、投与は、出血エピソードの５〜２０％超、５〜１５％超、５〜１０％超、１０〜２０％超、または１０〜１５％超を解消する。一実施形態において、対象において、血漿第ＶＩＩＩ因子：Ｃのトラフレベルは、１〜３または３〜５ＩＵ／ｄＬを超えて維持される。
一実施形態において、投与は、対象において、出血エピソードを予防する。一実施形態において、出血エピソードは、突発的である。一実施形態において、投与は、出血エピソードの８０〜１００％超、８０〜９０％超、８５〜９０％超、９０〜１００％超、９０〜９５％超、または９５〜１００％超を解消する。一実施形態において、投与は、外科手術を必要とする対象の集団において、恒常性を維持する。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、外科手術前、その間、またはその後に投与される。一実施形態において、外科手術は、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術である。一実施形態において、外科手術は、緊急手術である。
一実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、ＦＶＩＩＩからなるポリペプチドよりも長い半減期を有する。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、ペグ化、ＨＥＳ化、またはポリシアル化されている。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体二量体ハイブリッドである。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、一本鎖である。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、重鎖および軽鎖を含む。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、完全長第ＶＩＩＩ因子、成熟第ＶＩＩＩ因子、またはＢドメインの完全もしくは部分欠失を有する第ＶＩＩＩ因子を含む。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２のアミノ酸１〜１４３８または配列番号６のアミノ酸１〜２３３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２のアミノ酸１〜１４３８または配列番号６のアミノ酸１〜２３３２を含む。一実施形態において、キメラポリペプチドの第２の部分は、配列番号２のアミノ酸１４３９〜１６６５または配列番号６のアミノ酸２３３３〜２５５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃ部分を含む。一実施形態において、第２の部分は、配列番号２のアミノ酸１４３９〜１６６５または配列番号６のアミノ酸２３３３〜２５５９を含む。
一実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される。
本発明はまた、出血性障害であると診断されている対象が、長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドを用いた長い投与間隔の候補者であるかどうかを決定するための方法であって、血漿ＶＷＦの発現レベルを測定して、少なくとも１００ＩＵ／ｄＬのＶＷＦ発現レベルが、この対象が長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドを用いた長い投与間隔の候補者であることを示すことを含む、方法も提供する。一実施形態において、ＶＷＦ発現レベルは、少なくとも約１１０ＩＵ／ｄＬ、約１２０ＩＵ／ｄＬ、約１３０ＩＵ／ｄＬ、約１４０ＩＵ／ｄＬ、約１５０ＩＵ／ｄＬ、約１６０ＩＵ／ｄＬ、約１７０ＩＵ／ｄＬ、約１８０ＩＵ／ｄＬ、約１９０ＩＵ／ｄＬ、または約２００ＩＵ／ｄＬである。
本発明はまた、出血性障害であると診断されている対象が、長期間作用型ＦＶＩＩＩのポリペプチドの長い投与間隔の候補者であるかどうかを決定するための方法であって、当該対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期を測定して、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期が、この対象が長い投与間隔の候補者であることを示すことを含む、方法も提供する。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期は、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い。
本発明はまた、出血性障害であると診断されている対象が、長期間作用型ＦＶＩＩＩのポリペプチドの長い投与間隔の候補者であるかどうかを決定するための方法であって、当該対象における短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期を測定して、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合の短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期が、この対象が長い投与間隔の候補者であることを示すことを含む、方法も提供する。一実施形態において、半減期は、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とするヒト対象に投与する方法であって、前記対象に、第ＶＩＩＩ因子部分および第２の部分を含む治療用量のキメラポリペプチドを、前記第ＶＩＩＩ因子部分からなる等価用量のポリペプチドに必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５倍長い投与間隔で投与することを含み、前記第ＶＩＩＩ因子部分は、重鎖を含む第１の鎖および軽鎖を含む第２の鎖の２つの鎖を有するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含み、前記第１の鎖および前記第２の鎖は、金属結合により会合される、方法。
（項目２）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１００％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第ＶＩＩＩ因子部分は、一本鎖である、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む、項目１または２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、無傷の細胞内プロセシング部位を含有する、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記細胞内プロセシング部位は、完全長第ＶＩＩＩ因子の残基１６４８のアルギニン（配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１のアルギニン残基１６６７）に対応する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、または約２５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である、項目３〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約２５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約７５％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約２０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約８０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約８５％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９５％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目７に記載の方法。
（項目１３）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９９％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目７に記載の方法。
（項目１４）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である、項目３〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約３０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約７０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約４０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約６０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約５０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約５０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約６０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約４０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約７０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約３０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約８０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約２０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約８５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１５％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約５％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目２４）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９９％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目２５）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１００％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である、項目１４に記載の方法。
（項目２６）
一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む前記キメラポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子活性が発色アッセイによってインビトロで測定される場合、２つのＦｃ部分と、前記２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵するレベルで、前記第ＶＩＩＩ因子活性を有する、項目４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む前記キメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、前記２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵するインビボでの第ＶＩＩＩ因子活性を有する、項目４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む前記キメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、前記２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵する第Ｘａ因子の発生率を有する、項目４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記キメラポリペプチド中の前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルで、活性化プロテインＣによって不活性化される、項目４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記キメラポリペプチド中の前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵する第ＩＸａ因子の相互作用率を有する、項目４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記キメラポリペプチド中の前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルでフォンウィルブランド因子に結合する、項目４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記キメラポリペプチドは、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵するリン脂質ベシクルと相互作用する能力と、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第Ｘ因子を活性化するＸアーゼ複合体を形成する能力と、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する５分以内にαトロンビンによって活性化される能力と
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第ＩＸａ因子と相互作用する能力と、からなる群から選択される１つ以上の特性を有する、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記キメラポリペプチドは、
Ｋｍが第Ｘ因子の濃度の一関数として測定される、前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドのＫｍの約１、約１．５、または約２の標準偏差以内のＫｍで第Ｘ因子を活性化するＸアーゼ複合体を形成することと、
Ｖｍａｘが第Ｘ因子の濃度の一関数として測定される、前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドのＶｍａｘの約１、約１．５、または約２の標準偏差以内のＶｍａｘで第Ｘ因子を活性化するＸアーゼ複合体を形成することと、
Ｋｄが第ＩＸａ因子の濃度の一関数として測定される、前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドのＫｄの約１、約１．５、または約２の標準偏差以内のＫｄで第Ｘ因子を活性化するＸアーゼ複合体を形成することと、
Ｖｍａｘが第ＩＸａ因子の濃度の一関数として測定される、前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドのＶｍａｘの約１、約１．５、または約２の標準偏差以内のＶｍａｘで第Ｘ因子を活性化するＸアーゼ複合体を形成することと、からなる群から選択される１つ以上の特性を有する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記用量は、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．３８ＩＵ／ｄＬより大きい平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）を有する、項目１〜３３のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
前記用量は、１ＩＵ／ｋｇ当たり少なくとも約１．５、少なくとも約１．８５、または少なくとも約２．４６ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）を有する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記キメラポリペプチドは、前記患者集団または前記対象において、以下からなる群から選択される、１つ以上の薬物動態パラメーターを示す、項目１〜３５のいずれかに記載の方法：
２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与された前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳが、一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、前記完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる２５ＩＵ／ｋｇのポリペプチドが投与された対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳに匹敵すること、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約６０．５ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約５３．１〜６９ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１１９ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１０３〜１３６ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約７６．５ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約６４．９〜９０．１ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１８２ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１４６〜２２７ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約２．３３±１．０８ｍＬ／時間／ｋｇ以下の前記患者集団における平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
約１．８〜２．６９ｍＬ／時間／ｋｇの前記患者集団における平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドのクリアランスの約６５％である、前記患者集団における平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
約１．２２〜５．１９ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象における平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）が、一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、前記完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるクリアランスよりも０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６０、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、または０．７０倍低いこと、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１．６８ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１．３１〜２．１５ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約２．３２ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１．６４〜３．２９ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１．４９ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１．１６〜１．９２ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１．５２ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１．０５〜２．２０ｍＬ／時間／ｋｇの前記対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
少なくとも約２６．３±８．３３時間の前記患者集団における平均平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
約２５．９〜２６．５時間の前記患者集団における平均ＭＲＴ（活性）、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの平均ＭＲＴよりも約１．５倍長い前記患者集団における平均ＭＲＴ（活性）、
約１４〜４１．３時間の前記対象における平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
前記対象におけるＭＲＴが、一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、前記完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるＭＲＴよりも少なくとも１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、または１．９０倍高いこと、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される場合、約２７時間の前記対象におけるＭＲＴ（活性）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約２０．６〜３５．３時間の前記対象におけるＭＲＴ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される、約２３．９〜２８．５時間の前記対象におけるＭＲＴ（活性）、
二段階（発色）アッセイ二段階（発色）アッセイによって測定される、約１９．８〜２８．９時間の前記対象におけるＭＲＴ（活性）、
二段階（発色）アッセイ二段階（発色）アッセイによって測定される、約２０．５〜３９．６時間の前記対象におけるＭＲＴ（活性）、
約１８．３±５．７９時間の前記患者集団における平均ｔ１／２ベータ（活性）、
約１８〜１８．４時間である前記患者集団における平均ｔ１／２ベータ（活性）、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの平均ｔ１／２ベータよりも約１．５倍長い前記患者集団における平均ｔ１／２ベータ（活性）、
約１１〜２６．４時間の前記対象における平均ｔ１／２ベータ（活性）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、前記完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるｔ１／２ベータ（活性）よりも少なくとも１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、または１．８７倍高い前記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１８．８時間の前記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１４．３〜２４．５時間の前記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される、約１６．７時間の前記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される、約１３．８〜２０．１時間の前記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される、約１９．８時間の前記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される、約１４．３〜２７．５時間の前記対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．０１±０．４４ＩＵ／ｄＬの前記患者集団における平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約１．８５〜２．４６ＩＵ／ｄＬの前記患者集団における平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの平均増分回収率の約９０％である前記患者集団における平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約１．３８〜２．８８ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、前記完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなるポリペプチドが投与された対象における増分回収率に匹敵する前記対象における増分回収率、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．４４ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．１２〜２．８１ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１．８３ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１．５９〜２．１０ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約３．０９ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．８０ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．６１〜３．６６ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率、および
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．２４〜３．５０ＩＵ／ｄＬの前記対象における増分回収率、
約５５．１±１２．３ｍＬ／ｋｇの前記患者集団における平均Ｖｓｓ（活性）、
約４５．３〜５６．１ｍＬ／ｋｇの前記患者集団における平均Ｖｓｓ（活性）、
約３７．７〜７９．４ｍＬ／ｋｇの前記対象における平均Ｖｓｓ（活性）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、前記完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるＶｓｓ（活性）に匹敵する前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約４５．５ｍＬ／ｋｇの前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約３９．３〜５２．５ｍＬ／ｋｇの前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約６２．８ｍＬ／ｋｇの前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約５５．２〜７１．５ｍＬ／ｋｇの前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約３５．９ｍＬ／ｋｇの前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約３０．４〜４２．３ｍＬ／ｋｇの前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約４３．４ｍＬ／ｋｇの前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約３８．２〜４９．２ｍＬ／ｋｇの前記対象におけるＶｓｓ（活性）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約４９．９±１８．２ＩＵ＊ｈ／ｄＬの前記患者集団における平均ＡＵＣ／用量（活性）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約４４．８〜５７．６ＩＵ＊ｈ／ｄＬの前記患者集団における平均ＡＵＣ／用量（活性）、および
１ＩＵ／ｋｇ当たり約１９．２〜８１．７ＩＵ＊ｈ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣ／用量、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、前記完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された前記対象におけるＡＵＣＩＮＦよりも少なくとも１．４５ １．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９０倍高い前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１４４０±３１６時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１１６０〜１８８０時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１４８０時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２９１０±１３２０時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１９８０〜３９７０時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２８００時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１６６０時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１３００〜２１２０時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約４２８０時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇの前記キメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２９６０〜６１９０時間＊ＩＵ／ｄＬの前記対象におけるＡＵＣＩＮＦ。
（項目３７）
前記治療用量は、約１０〜約１５０、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ＩＵ／ｋｇである、項目１〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記投与間隔は、１．５〜５、１．５、２、３、４、もしくは５日、またはそれ以上である、項目１〜３７のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子部分、および第２の部分を含み、前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、組成物。
（項目４０）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一である、項目３９に記載の組成物。
（項目４１）
第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子部分、および第２の部分を含み、前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、組成物。
（項目４２）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同一である、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記第２の部分は、Ｆｃ領域、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリンもしくはＣＴＰ（４つのＯ−グリカンを有するｈＣＧの２８アミノ酸Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合ポリペプチド、アルブミン結合小分子、またはそれらのいずれかの組み合わせである、項目３９〜４２のいずれかに記載の組成物。
（項目４４）
前記第２の部分は、Ｆｃ領域である、項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記Ｆｃは、表２に示される前記Ｆｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目４４に記載の組成物。
（項目４６）
前記Ｆｃは、表２に示される前記Ｆｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と同一である、項目４５に記載の組成物。
（項目４７）
前記ポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む、項目３９に記載の組成物。
（項目４８）
前記ポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される前記第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される前記第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む、項目３９に記載の組成物。
（項目４９）
前記ポリペプチドは、第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、前記第２のポリペプチドは、Ｆｃから本質的になる、項目３９〜４８のいずれかに記載の組成物。（項目５０）
前記第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列から本質的になる、項目４９に記載の組成物。
（項目５１）
前記第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示される前記アミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示される前記アミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列から本質的になる、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記ポリペプチドは、前記第ＶＩＩＩ因子からなるポリペプチドに対して少なくとも１．５〜６倍長い、１．５〜５倍長い、１．５〜４倍長い、１．５〜３倍長い、または１．５〜２倍長い半減期を有する、項目３９〜５１のいずれかに記載の組成物。
（項目５３）
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵するリン脂質ベシクルと相互作用する能力と、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第Ｘ因子を活性化するＸアーゼ複合体を形成する能力と、
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する５分以内にαトロンビンによって活性化される能力と
前記第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドの能力に匹敵する第ＩＸａ因子と相互作用する能力と、からなる群から選択される、１、約１．５、または約２つ以上の特性を有する、項目３９〜５２のいずれかに記載の組成物。
（項目５４）
前記ポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜５３のいずれかに記載の組成物。
（項目５５）
一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む前記キメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵する第ＶＩＩＩ因子活性を有し、前記プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子は、前記第ＶＩＩＩ因子が発色アッセイによってインビトロで測定される場合、前記２つのＦｃ部分のうちの１つのＦｃと融合している、項目３９〜５４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５６）
一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む前記キメラポリペプチドは、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵する第Ｘａ因子の発生率を有する、項目３９〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５７）
一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む前記キメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、前記２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵する第Ｘａ因子の発生率を有する、項目３９〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５８）
前記キメラポリペプチド中の前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵する第Ｘａ因子の相互作用率を有する、項目３９〜５７のいずれか１項
に記載の組成物。
（項目５９）
前記キメラポリペプチド中の前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルで、活性化プロテインＣによって不活性化される、項目３９〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６０）
前記キメラポリペプチド中の前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルで、フォンウィルブランド因子に結合する、項目３９〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６１）
一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む前記キメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、前記２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とからなるキメラポリペプチドに匹敵するインビボでの第ＶＩＩＩ因子活性を有する、項目３９〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６２）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約３０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約７０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６３）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約４０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約６０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６４）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約５０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約５０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６５）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約６０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約４０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６６）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約７０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約３０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６７）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約８０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約２０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６８）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１０％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６９）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約５％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７０）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約９９％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約５％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７１）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分の約１００％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である、項目３９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７２）
賦形剤をさらに含む薬学的組成物である、項目３９〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７３）
治療上有効量の項目３９〜７２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、出血性状態を治療する方法。
（項目７４）
前記治療は、予防的処置である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記治療は、オンデマンド治療である、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
前記出血性状態は、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口の出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷（ｔｒａｕｍａ ｃａｐｉｔｉｓ）、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、および腸腰筋鞘（ｉｌｌｉｏｐｓｏａｓ ｓｈｅａｔｈ）内の出血からなる群から選択される、項目７３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７７）
前記出血凝固障害は、血友病である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記出血凝固障害は、血友病Ａである、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記投与は、１％を超えるレベルで、前記患者集団の少なくとも９０％において、第ＶＩＩＩ因子のトラフレベルを維持する、項目１〜３８および７３〜７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目８０）
前記投与は、３％を超えるレベルで、前記集団の少なくとも６０％において、第ＶＩＩＩ因子のトラフレベルを維持する、項目１〜３８および７３〜７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
１％を超えるレベルで少なくとも１日、２日、または３日間、患者集団において、第ＶＩＩＩ因子を維持する方法であって、前記集団に、治療上有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃを投与することを含み、前記治療上有効量は、少なくとも２５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃであり、前記集団の少なくとも９０％が、少なくとも１％以上の前記第ＶＩＩＩ因子のトラフレベルを維持する、方法。
（項目８２）
３％を超えるレベルで少なくとも１日、２日、または３日間、患者集団において、第ＶＩＩＩ因子を維持する方法であって、前記集団に、治療上有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃを投与することを含み、前記治療上有効量は、少なくとも６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃであり、前記集団の少なくとも９０％が、少なくとも３％以上の前記第ＶＩＩＩ因子のトラフレベルを維持する、方法。
（項目８３）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目４〜３８および７３〜８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目８４）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目４〜３８および７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、完全長第ＶＩＩＩ因子中のアルギニン１６４５およびアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目４〜３８および７３〜８４のいずれか１項に記載の方法。
（項目８６）
アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸は、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸とは異なるアミノ酸である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記置換または突然変異は、アルギニン以外のアミノ酸である、項目８３〜８６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８８）
前記一本鎖ＦＶＩＩＩは、無傷の細胞内プロセシング部位を含む、項目３９〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目８９）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子中のアルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目３９〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目９０）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子中のアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目３９〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目９１）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子中のアルギニン１６４５およびアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目３９〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目９２）
アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸は、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸とは異なるアミノ酸である、項目９１に記載の組成物。
（項目９３）
前記置換または突然変異は、アルギニン以外のアミノ酸である、項目８９〜９２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目９４）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、無傷の細胞内プロセシング部位を含む、項目７３〜８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子中のアルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目７３〜８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子中のアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目７３〜８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子中のアルギニン１６４５およびアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換または突然変異を含む、項目７３〜８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目９８）
アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸は、完全長第ＶＩＩＩ因子中のアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸とは異なるアミノ酸である、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記置換または突然変異は、アルギニン以外のアミノ酸である、項目９５〜９８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１００）
アルギニン以外のアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、オルニチン、ピロリシン、またはタウリンからなる群から選択される、項目８７または９９に記載の方法。
（項目１０１）
アルギニン以外のアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、オルニチン、ピロリシン、またはタウリンからなる群から選択される、項目９３に記載の組成物。
（項目１０２）
前記対象は、小児対象である、項目１〜３８、７３〜８７、または９４〜１００のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０３）
対象に、出血エピソードを予防、減少、または治療する方法であって、前記対象に、有効量の長時間作用型第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を投与することを含み、前記対象は、血漿中に高レベルのフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を発現する、方法。（項目１０４）
前記対象は、血漿中に高レベルのＶＷＦを発現するとして特定されている、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
対象において、出血エピソードを予防、減少、または治療する方法であって、
（ａ）高レベルのＶＷＦを有する対象を、前記対象の血漿中のＶＷＦレベルを測定することによって特定することであって、少なくとも約１００ＩＵ／ｄＬのＶＷＦレベルが、高レベルのＶＷＦを有するものとして前記対象を特定する、対象を特定することと、
（ｂ）前記対象に、有効量の長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質を投与することと、を含む、方法。
（項目１０６）
前記対象は、ヒトである、項目１０３〜１０５のいずれかに記載の方法。
（項目１０７）
前記対象は、小児対象である、項目１０３〜１０６のいずれかに記載の方法。
（項目１０８）
前記対象は、血友病Ａを有する、項目１０３〜１０７のいずれかに記載の方法。
（項目１０９）
前記高レベルのＶＷＦは、少なくとも約１００ＩＵ／ｄＬである、項目１０３〜１０８のいずれかに記載の方法。
（項目１１０）
前記高レベルのＶＷＦは、約１００ＩＵ／ｄＬ〜約２００ＩＵ／ｄＬである、項目１０３〜１０９のいずれかに記載の方法。
（項目１１１）
前記高レベルのＶＷＦは、約１１０ＩＵ／ｄＬ、約１２０ＩＵ／ｄＬ、約１３０ＩＵ／ｄＬ、約１４０ＩＵ／ｄＬ、約１５０ＩＵ／ｄＬ、約１６０ＩＵ／ｄＬ、約１７０ＩＵ／ｄＬ、約１８０ＩＵ／ｄＬ、約１９０ＩＵ／ｄＬ、または約２００ＩＵ／ｄＬである、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記対象は、血清型Ａ、Ｂ、またはＡＢを有する、項目１０３〜１１１のいずれかに記載の方法。
（項目１１３）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、前記対象において、２０時間〜約４０時間の半減期を有する、項目１０３〜１１２のいずれかに記載の方法。
（項目１１４）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、約２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、または４０時間の半減期を有する、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、約２０〜約２７時間の半減期を有する、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、平均レベルのＶＷＦを有する個人に投与される場合の前記前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期よりも少なくとも約１．２倍高い半減期を有する、項目１０３〜１１５のいずれかに記載の方法。
（項目１１７）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、平均レベルのＶＷＦを有する個人に投与される場合の前記前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期よりも少なくとも約約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍高い半減期を有する、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記有効量は、少なくとも約２０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約２５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約３０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約３５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約４０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約４５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約５０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約５５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約６０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約６５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約７０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約７５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約８０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約８５ＩＵ／ｋｇ、または少なくとも約９０ＩＵ／ｋｇである、項目１０３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１９）
前記有効量は、少なくとも約６５ＩＵ／ｋｇ〜少なくとも約９０ＩＵ／ｋｇである、項目１０３〜１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２０）
前記有効量は、８０ＩＵ／ｋｇである、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、７２時間ごとまたはそれ以上で投与される、項目１０３〜１２０のいずれかに記載の方法。
（項目１２２）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、１週間またはそれ以上で約１回投与される、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
前記有効量の前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、１０日ごとに約１回、２週間ごとに約１回、１５日ごとに約１回、２０日ごとに約１回、３週間ごとに約１回、２５日ごとに約１回、４週間ごとに約１回、または１ヶ月ごとに約１回投与される、項目１２１に記載の方法。
（項目１２４）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩは、８０ＩＵ／ｋｇの投与量で７２時間ごとに１回投与される、項目１２１に記載の方法。
（項目１２５）
前記対象は、小児対象である、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記投与は、出血エピソードの５〜２０％超、５〜１５％超、５〜１０％超、１０〜２０％超、または１０〜１５％超を解消する、項目１０３〜１２５のいずれかに記載の方法。
（項目１２７）
前記対象において、血漿第ＶＩＩＩ因子：Ｃのトラフレベルは、１〜３または３〜５ＩＵ／ｄＬを超えて維持される、項目１０３〜１２６のいずれかに記載の方法。
（項目１２８）
前記投与は、前記対象において、出血エピソードを予防する、項目１０３〜１２７のいずれかに記載の方法。
（項目１２９）
前記出血エピソードは、突発的である、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記投与は、出血エピソードの８０〜１００％超、８０〜９０％超、８５〜９０％超、９０〜１００％超、９０〜９５％超、または９５〜１００％超を解消する、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記投与は、外科手術を必要とする対象の集団において、恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｓ）を維持する、項目１０３〜１３０のいずれかに記載の方法。
（項目１３２）
前記長時間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、前記外科手術前、その間、またはその後に投与される、項目１０３〜１３１のいずれかに記載の方法。
（項目１３３）
前記外科手術は、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術である、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記外科手術は、緊急手術である、項目１３１〜１３３のいずれかに記載の方法。
（項目１３５）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩからなるポリペプチドよりも長い半減期を有する、項目１０３〜１３４のいずれかに記載の方法。
（項目１３６）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、ペグ化、ＨＥＳ化、またはポリシアル化されている、項目１０３〜１３５のいずれかに記載の方法。
（項目１３７）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ部分および第２の部分を含むキメラタンパク質である、項目１０３〜１３６のいずれかに記載の方法。
（項目１３８）
前記第２の部分は、Ｆｃ領域、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリンもしくはＣＴＰ（４つのＯ−グリカンを有するｈＣＧの２８アミノ酸Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合ポリペプチド、アルブミン結合小分子、またはそれらのいずれかの組み合わせである、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記第２の部分は、前記ＦＶＩＩＩ部分のアミノ末端またはカルボキシ末端と融合する、項目１３７または１３８に記載の方法。
（項目１４０）
前記第２の部分は、前記ＦＶＩＩＩ部分の２つのアミノ酸間に挿入される、項目１３７または１３８に記載の方法。
（項目１４１）
前記キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体二量体ハイブリッドである、項目１３７〜１４０のいずれかに記載の方法。
（項目１４２）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、一本鎖である、項目１４１に記載の方法。
（項目１４３）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、重鎖および軽鎖を含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、完全長第ＶＩＩＩ因子、成熟第ＶＩＩＩ因子、またはＢドメインの完全もしくは部分欠失を有する第ＶＩＩＩ因子を含む、項目１３７〜１４３のいずれかに記載の方法。
（項目１４５）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２のアミノ酸１〜１４３８または配列番号６のアミノ酸１〜２３３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１４１に記載の方法。
（項目１４６）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２のアミノ酸１〜１４３８または配列番号６のアミノ酸１〜２３３２を含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記キメラポリペプチドの前記第２の部分は、配列番号２のアミノ酸１４３９〜１６６５または配列番号６のアミノ酸２３３３〜２５５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃ部分を含む、項目１３７〜１４６のいずれかに記載の方法。
（項目１４８）
前記第２の部分は、配列番号２のアミノ酸１４３９〜１６６５または配列番号６のアミノ酸２３３３〜２５５９を含む、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩのポリペプチドは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される、項目１０３〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５０）
出血性障害であると診断されている対象を治療する方法であって、前記対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期を測定し、正常な対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期が、前記対象が長い投与間隔の候補者であることを示すことと、有効量のＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドを少なくとも３日間の投与間隔で投与することと、を含む、方法。
（項目１５１）
出血性障害であると診断されている対象を治療する方法であって、対象に、有効量のＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドを少なくとも３日間の投与間隔で投与することであって、前記対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期が、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い、投与することを含む、方法。
（項目１５２）
前記対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの血漿半減期は、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの血漿半減期よりも少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い、項目１５０または１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの血漿半減期は、２０〜４０時間である、項目１５０〜１５２のいずれかに記載の方法。
（項目１５４）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、約２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、または４０時間の半減期を有する、項目１５３に記載の方法。
（項目１５５）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩタンパク質は、約２０〜約２７時間の半減期を有する、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
出血性障害であると診断されている対象を治療する方法であって、前記対象に投与される短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期を測定し、平均レベルのＶＷＦを有する対象における前記短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期が、前記対象が長い投与間隔の候補者であることを示すことと、有効量の長期間作用型ＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドを少なくとも３日間の投与間隔で投与することと、を含む、方法。
（項目１５７）
前記対象における前記短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期は、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合の短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い、項目１５６に記載の方法。
（項目１５８）
前記対象は、ヒトである、項目１５０〜１５７のいずれかに記載の方法。
（項目１５９）
前記対象は、小児対象である、項目１５０〜１５８のいずれかに記載の方法。
（項目１６０）
前記対象は、血友病Ａを有する、項目１５０〜１５９のいずれかに記載の方法。
（項目１６１）
前記対象は、血清型Ａ、Ｂ、またはＡＢを有する、項目１５０〜１６０のいずれかに記載の方法。
（項目１６２）
前記長期間作用型ＦＶＩＩＩ−Ｆｃは、少なくとも約２０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約２５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約３０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約３５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約４０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約４５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約５０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約５５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約６０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約６５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約７０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約７５ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約８０ＩＵ／ｋｇ、少なくとも約８５ＩＵ／ｋｇ、または少なくとも約９０ＩＵ／ｋｇの有効量で投与される、項目１５０〜１６１のいずれかに記載の方法。
（項目１６３）
前記有効量は、少なくとも約６５ＩＵ／ｋｇ〜少なくとも約９０ＩＵ／ｋｇである、項目１５０〜１６１のいずれかに記載の方法。
（項目１６４）
前記有効量の前記ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、１週間ごとに約１回、１０日ごとに約１回、２週間ごとに約１回、１５日ごとに約１回、２０日ごとに約１回、３週間ごとに約１回、２５日ごとに約１回、４週間ごとに約１回、または１ヶ月ごとに約１回投与される、項目１５０〜１６３のいずれかに記載の方法。
（項目１６５）
前記投与は、出血エピソードの５〜２０％超、５〜１５％超、５〜１０％超、１０〜２０％超、または１０〜１５％超を解消する、項目１５０〜１６４のいずれかに記載の方法。
（項目１６６）
前記対象において、血漿第ＶＩＩＩ因子：Ｃのトラフレベルは、１〜３または３〜５ＩＵ／ｄＬを超えて維持される、項目１５０〜１６５のいずれかに記載の方法。
（項目１６７）
前記投与は、前記対象における出血エピソードを予防する、項目１５０〜１６６のいずれかに記載の方法。
（項目１６８）
前記出血エピソードは、突発的である、項目１６７に記載の方法。
（項目１６９）
前記投与は、出血エピソードの８０〜１００％超、８０〜９０％超、８５〜９０％超、９０〜１００％超、９０〜９５％超、または９５〜１００％超を解消する、項目１６７に記載の方法。
（項目１７０）
前記投与は、外科手術を必要とする対象の集団において、恒常性を維持する、項目１５０〜１６９のいずれかに記載の方法。
（項目１７１）
前記ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、前記外科手術前、その間、またはその後に投与される、求項１５０〜１７０のいずれかに記載の方法。
（項目１７２）
前記外科手術は、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術である、項目１７０または１７１に記載の方法。
（項目１７３）
前記外科手術は、緊急手術である、項目１７０〜１７２のいずれかに記載の方法。
（項目１７４）
前記ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、ＦＶＩＩＩからなるポリペプチドよりも長い半減期を有する、項目１５０〜１７３のいずれかに記載の方法。
（項目１７５）
前記ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、ペグ化、ＨＥＳ化、またはポリシアル化されている、項目１５０〜１７４のいずれかに記載の方法。
（項目１７６）
前記ＦＶＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体二量体ハイブリッドである、項目１７４または１７５に記載の方法。
（項目１７７）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、一本鎖である、項目１７２〜１７６のいずれかに記載の方法。（項目１７８）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、重鎖および軽鎖を含む、項目１７７に記載の方法。
（項目１７９）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、完全長第ＶＩＩＩ因子、成熟第ＶＩＩＩ因子、またはＢドメインの完全もしくは部分欠失を有する第ＶＩＩＩ因子を含む、項目１７４〜１７８のいずれかに記載の方法。
（項目１８０）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２のアミノ酸１〜１４３８または配列番号６のアミノ酸１〜２３３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１７９に記載の方法。
（項目１８１）
前記ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２のアミノ酸１〜１４３８または配列番号６のアミノ酸１〜２３３２を含む、項目１８０に記載の方法。
（項目１８２）
前記キメラポリペプチドの前記第２の部分は、配列番号２のアミノ酸１４３９〜１６６５または配列番号６のアミノ酸２３３３〜２５５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃ部分を含む、項目１７４〜１８１のいずれかに記載の方法。
（項目１８３）
前記第２の部分は、配列番号２のアミノ酸１４３９〜１６６５または配列番号６のアミノ酸２３３３〜２５５９を含む、項目１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記ＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される、項目１５０〜１８３のいずれかに記載の方法。
（項目１８５）
出血性障害であると診断されている対象が、長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドを用いた長い投与間隔の候補者であるかどうかを決定するための方法であって、血漿ＶＷＦの発現レベルを測定し、少なくとも１００ＩＵ／ｄＬのＶＷＦ発現レベルが、前記対象が長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドを用いた長い投与間隔の候補者であることを示すことを含む、方法。
（項目１８６）
前記ＶＷＦ発現レベルは、少なくとも約１１０ＩＵ／ｄＬ、約１２０ＩＵ／ｄＬ、約１３０ＩＵ／ｄＬ、約１４０ＩＵ／ｄＬ、約１５０ＩＵ／ｄＬ、約１６０ＩＵ／ｄＬ、約１７０ＩＵ／ｄＬ、約１８０ＩＵ／ｄＬ、約１９０ＩＵ／ｄＬ、または約２００ＩＵ／ｄＬである、項目１８５に記載の方法。
（項目１８７）
出血性障害であると診断されている対象が、長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドの長い投与間隔の候補者であるかどうかを決定するための方法であって、前記対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期を測定し、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期が、前記対象が長い投与間隔の候補者であることを示す、方法。
（項目１８８）
ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期は、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い、項目１８７に記載の方法。
（項目１８９）
出血性障害であると診断されている対象が、長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドの長い投与間隔の候補者であるかどうかを決定するための方法であって、前記対象における短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期を測定し、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合の短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期よりも少なくとも約１．２倍長い半減期が、前記対象が長い投与間隔の候補者であることを示す、方法。
（項目１９０）
前記半減期は、平均レベルのＶＷＦを有する対象に投与される場合のＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期よりも少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍長い、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
前記キメラポリペプチドは、Ｆｃ部分を含む、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜１９０のいずれかに記載の方法。
（項目１９２）
前記投与間隔は、前記第ＶＩＩＩ因子部分からなる等価用量のポリペプチドに必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５〜６倍長い、１．５〜５倍長い、１．５〜４倍長い、１．５〜３倍長い、または１．５〜２倍長い、項目１９１に記載の方法。
（項目１９３）
前記投与間隔は、前記第ＶＩＩＩ因子部分からなる等価用量のポリペプチドに必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、または６倍長い、項目１９２に記載の方法。
（項目１９４）
前記キメラポリペプチドの前記投与間隔は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはそれ以上である、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜１９３のいずれかに記載の方法。
（項目１９５）
前記対象は、予防的処置を必要とする、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜１９４のいずれかに記載の方法。
（項目１９６）
前記対象は、オンデマンドを必要とする、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜１９３のいずれかに記載の方法。
（項目１９７）
前記対象は、出血エピソードの治療を必要とする、項目１９６に記載の方法。
（項目１９８）
前記対象は、関節血症、筋肉出血、口の出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、または腸腰筋鞘内の出血の治療を必要とする、項目１９７に記載の方法。
（項目１９９）
前記対象は、外科的予防、手術中管理、または外科手術のための処置を必要とする、項目１９６に記載の方法。
（項目２００）
前記外科手術は、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術である、項目１９９に記載の方法。
（項目２０１）
前記キメラポリペプチドの前記投与間隔は、２４〜３６、２４〜４８、２４〜７２、２４〜９６、２４〜１２０、２４〜１４４、２４〜１６８、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間ごと、またはそれ以上で約１回である、項目１９６〜２００のいずれかに記載の方法。
（項目２０２）
前記治療用量は、１０〜１００ＩＵ／ｋｇである、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜２０１のいずれかに記載の方法。
（項目２０３）
前記治療用量は、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ＩＵ／ｋｇである、項目２０１に記載の方法。
（項目２０４）
前記治療用量は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ＩＵ／ｋｇである、項目２０２に記載の方法。
（項目２０５）
前記第ＶＩＩＩ因子は、ヒト第ＶＩＩＩ因子である、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、または１０２〜２０４のいずれかに記載の方法。
（項目２０６）
前記第ＶＩＩＩ因子は、前記Ｂドメインの完全または部分欠失を有する、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜２０５のいずれかに記載の方法。
（項目２０７）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７、配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２０５に記載の方法。
（項目２０８）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一である、項目２０７に記載の方法。
（項目２０９）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２０５に記載の方法。
（項目２１０）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同一である、項目２０９に記載の方法。
（項目２１１）
前記キメラポリペプチドの前記第２の部分は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２０５または２０６に記載の方法。
（項目２１２）
前記キメラポリペプチドの前記第２の部分は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と同一である、項目２１１に記載の方法。
（項目２１３）
前記キメラポリペプチドは、前記キメラポリペプチドと結合した第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、前記第２のポリペプチドは、Ｆｃから本質的になる、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜２１２のいずれかに記載の方法。
（項目２１４）
前記キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む、項目２１３に記載の方法。
（項目２１５）
前記キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と同一である配列を含む、項目２１４に記載の方法。
（項目２１６）
前記第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む、表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列から本質的になる、項目２１３〜２１５のいずれかに記載の方法。
（項目２１７）
前記第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と同一であるか、またはシグナル配列を含む、表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と同一である配列から本質的になる、項目２１６に記載の方法。
（項目２１８）
前記キメラポリペプチドは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜２１７のいずれかに記載の方法。
（項目２１９）
第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とするヒト対象に投与する方法であって、前記対象に、第ＶＩＩＩ因子部分および第２の部分を含む治療用量のキメラポリペプチドを投与して、前記第ＶＩＩＩ因子部分からなる等価用量のポリペプチドによって得られる血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）よりも少なくとも約１．２５倍大きいＡＵＣを得ることを含む、方法。
（項目２２０）
前記キメラポリペプチドは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはそれ以上の投与間隔で投与される、項目２１９に記載の方法。
（項目２２１）
前記対象は、予防的処置を必要とする、項目２１９または２２０に記載の方法。
（項目２２２）
前記対象は、オンデマンド治療を必要とする、項目２１９または２２０に記載の方法。（項目２２３）
前記対象は、出血エピソードの治療を必要とする、項目２１９〜２２２のいずれかに記載の方法。
（項目２２４）
前記対象は、関節血症、筋肉出血、口の出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、または腸腰筋鞘内の出血の治療を必要とする、項目２１９〜２２２のいずれかに記載の方法。
（項目２２５）
前記対象は、外科的予防、手術中管理、または外科手術のための処置を必要とする、項目２２２に記載の方法。
（項目２２６）
前記外科手術は、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術である、項目２２５に記載の方法。
（項目２２７）
前記キメラポリペプチドの前記投与間隔は、２４〜３６、２４〜４８、２４〜７２、２４〜９６、２４〜１２０、２４〜１４４、２４〜１６８、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間ごと、またはそれ以上で約１回である、項目２１９〜２２６のいずれかに記載の方法。
（項目２２８）
前記治療用量は、１０〜１００ＩＵ／ｋｇである、項目２１９〜２２７のいずれかに記載の方法。
（項目２２９）
前記治療用量は、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ＩＵ／ｋｇである、項目２２８に記載の方法。
（項目２３０）
前記治療用量は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ＩＵ／ｋｇである、項目２２９に記載の方法。
（項目２３１）
前記第ＶＩＩＩ因子は、ヒト第ＶＩＩＩ因子である、項目２１９〜２３０のいずれかに記載の方法。
（項目２３２）
前記第ＶＩＩＩ因子は、前記Ｂドメインの完全または部分欠失を有する、項目２１９〜２３１のいずれかに記載の方法。
（項目２３３）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７、配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２３１に記載の方法。
（項目２３４）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一である、項目２３３に記載の方法。
（項目２３５）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２３１に記載の方法。
（項目２３６）
前記キメラポリペプチドの前記第ＶＩＩＩ因子部分は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同一である、項目２３５に記載の方法。
（項目２３７）
前記キメラポリペプチドの前記第２の部分は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２３１または２３２に記載の方法。
（項目２３８）
前記キメラポリペプチドの前記第２の部分は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と同一である、項目２３７に記載の方法。
（項目２３９）
前記キメラポリペプチドは、前記キメラポリペプチドと結合した第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、前記第２のポリペプチドは、Ｆｃから本質的になる、項目２１９〜２３８のいずれかに記載の方法。
（項目２４０）
前記キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む、項目２３９に記載の方法。
（項目２４１）
前記キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む、項目２４０に記載の方法。
（項目２４２）
前記第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列から本質的になる、項目２３９〜２４１のいずれかに記載の方法。
（項目２４３）
前記第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と同一である配列から本質的になる、項目２４２に記載の方法。
（項目２４４）
前記キメラポリペプチドは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される、項目２１９〜２４３のいずれかに記載の方法。
（項目２４５）
第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
前記対象に、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはそれ以上の投与間隔で、第ＶＩＩＩ因子およびＦｃを含む治療用量のポリペプチドを投与することを含む、方法。
（項目２４６）
前記対象は、予防的処置を必要とする、項目２４５に記載の方法。
（項目２４７）
前記治療用量は、１０〜１００ＩＵ／ｋｇである、項目２４５または２４６に記載の方法。
（項目２４８）
前記治療用量は、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ＩＵ／ｋｇである、項目２４７に記載の方法。
（項目２４９）
前記治療用量は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ＩＵ／ｋｇである、項目２４８に記載の方法。
（項目２５０）
前記第ＶＩＩＩ因子は、ヒト第ＶＩＩＩ因子である、項目２４５〜２４９のいずれかに記載の方法。
（項目２５１）
前記第ＶＩＩＩ因子は、前記Ｂドメインの完全または部分欠失を有する、項目２４５〜２５０のいずれかに記載の方法。
（項目２５２）
前記第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２５０に記載の方法。
（項目２５３）
前記第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７または配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一である、項目２５２に記載の方法。
（項目２５４）
前記第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２５０に記載の方法。
（項目２５５）
前記第ＶＩＩＩ因子は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同一である、項目２５０に記載の方法。
（項目２５６）
前記第２の部分は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目２５０または２５１に記載の方法。
（項目２５７）
前記第２の部分は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と同一である、項目２５６に記載の方法。
（項目２５８）
前記キメラポリペプチドは、前記キメラポリペプチドと結合した第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態である第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃキメラポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドは、Ｆｃから本質的になる、項目２４５〜２５７のいずれかに記載の方法。
（項目２５９）
前記キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む、項目２５８に記載の方法。
（項目２６０）
前記キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む、項目２５９に記載の方法。
（項目２６１）
前記第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列から本質的になる、項目２５８〜２６０のいずれかに記載の方法。
（項目２６２）
前記第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列から本質的になる、項目２６１に記載の方法。（項目２６３）
前記ポリペプチドは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与される、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、および１０２〜２６２のいずれかに記載の方法。
（項目２６４）
前記キメラポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子活性を有する、項目１〜３８、７３〜８７、９４〜１００、または１０２〜２６３のいずれか１項に記載の方法。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ単量体を示す概略図。 Ａ〜Ｂ．ｒＦＶＩＩＩＦｃ（プロセシングされたまたは一本鎖）の非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｃ．ＬＣ／ＵＶおよびＬＣ／ＭＳによって分析されたｒＦＶＩＩＩＦｃの構造。Ｄ．トロンビン切断後のｒＦＶＩＩＩＦｃの全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラム（ＬＣ／ＭＳマップ）。主要な消化産物が示される。Ｅ．ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤＦＶＩＩＩのＡ２ドメインのデコンボリューション質量スペクトル。トロンビンで切断されたＡ２ドメイン（Ｓ３７３〜Ｒ７４０）ならびに２つの切断産物、Ｓ３７３〜Ｙ７２９およびＳ３７３〜Ｅ７２０に対応する、主要な産物およびそれらの同族質量が示される。 ｒＦＶＩＩＩ−Ｆｃの生化学的特性：Ａ．リン脂質ベシクル濃度の一関数としての第Ｘ因子の活性化。Ｂ．第ＦＸ因子濃度の一関数としての第Ｘ因子の活性化。Ｃ．第ＩＸａ因子濃度の一関数としての第Ｘ因子の活性化。 活性化プロテインＣによる切断後の第Ｘ因子の活性化。 時間に対する、用量レベルによって分類され、化合物（一段階アッセイ、２５ＩＵ／ｋｇ（Ａ）または６５ＩＵ／ｋｇ（Ｂ）；および発色アッセイ、２５ＩＵ／ｋｇ（Ｃ）または６５ＩＵ／ｋｇ（Ｄ））によってグループ分けされた、対時間の観察された群平均ＦＶＩＩＩ活性（±標準誤差）プロファイル。 時間に対する、用量レベルおよび化合物（一段階アッセイ（Ａ）または発色アッセイ（Ｂ））によってグループ分けされた、観察された対時間の群平均ＦＶＩＩＩ活性（±標準誤差）プロファイル。 血友病Ａマウス尾静脈切断モデルにおける一本鎖ＦＶＩＩＩ：Ｆｃのインビボ有効性。（Ａ）一本鎖ｒＦＶＩＩＩ：Ｆｃの用量を四角で示し、プロセシングされたｒＦＶＩＩＩ：Ｆｃの用量を丸で示す。（Ｂ）４．６μｇ／ｋｇ、１．３８μｇ／ｋｇ、および０．４６μｇ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃの尾静脈切断後の生存率（％）。（Ｃ）４．６μｇ／ｋｇ（黒丸または逆三角形）、１．３８μｇ／ｋｇ（三角またはひし形）、および０．４６μｇ／ｋｇ（四角および灰色の丸）のｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのそれぞれの尾静脈切断後の出血しなかったもののパーセント。 研究設計。図８は、２５ＩＵ／ｋｇ（低用量コホートＡ）または６５ＩＵ／ｋｇ（高用量コホートＢ）のいずれかの単回静脈内投与後のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較したｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性およびＰＫを評価するために、用量漸増の逐次的な設計であった、第１／２ａ相試験の研究設計を示す。 一段階（ａＰＴＴ）および発色アッセイによるｒＦＶＩＩＩ活性の相関関係。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（◆）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ（□）の注射後のＦＶＩＩＩ活性（ＩＵ／ｍＬ）を測定する一段階凝固（ａＰＴＴ）と発色アッセイの結果間の相関関係。 低用量および高用量のコホートに対する群平均血漿ＦＶＩＩＩ活性の薬物動態プロファイル。ｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の単回静脈注射後の、血漿ＦＶＩＩＩ活性（一段階ａＰＴＴアッセイ）の対時間曲線を、（Ａ）２５ＩＵ／ｋｇ（低用量のコホート、ｎ＝６）、および（Ｂ）６５ＩＵ／ｋｇ（高用量のコホート、ｎ＝１０［ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）］、ｎ＝９［ｒＦＶＩＩＩＦｃ］）について示す。表された結果は、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。 ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後のＦＶＩＩＩ活性のＣｌおよびｔ１／２に対するＶＷＦ抗原レベルの効果。ＶＷＦ抗原レベルと、（Ａ）ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ｒ２＝０．５４１５およびｐ＝０．００１２）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ（Ｒ２＝０．５４９２およびｐ＝０．００１６）の体重調節されたＣｌと、（Ｂ）ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ｒ２＝０．７９２３およびｐ＜０．０００１）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ（Ｒ２＝０．６４０３およびｐ＝０．０００３）のｔ１／２との間の相関関係。それぞれの点は、個々の対象を表す。 ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後の個々の対象に対するエクスビボ全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）の結果。血液が、指定された時点で、（Ａ）２５ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ、ならびに（Ｂ）６５ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの用量での処置前および処置後の対象からサンプリングされた。凝固時間は、ＲＯＴＥＭ（登録商標）機器において、Ｃａ＋＋を用いて開始されたＮＡＴＥＭによって決定された。示される結果は、それぞれの個々のサンプルに対する三重チャンネル読み取りからの平均±標準誤差（ＳＥＭ）である。 トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）における活性の比較。（Ａ）ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ｒＦＶＩＩＩＦｃと比較して、内因性トロンビン生成能（ＥＴＰ）の低下を示し、（Ｂ）は、ピークトロンビンの低下を示した。 インビトロＲＯＴＥＭデータ。ナイーブ血友病Ａマウスから得られたプールされた全血に添加した異なる濃度のＸＹＮＴＨＡ、ＡＤＶＡＴＥ＜、およびｒＦＶＩＩＩＦｃに対するＲＯＴＥＭ（ＮＡＴＥＭ）の結果（平均±標準偏差）。（Ａ）平均凝固時間（ＣＴ）（図１４Ａ）、（Ｂ）血餅形成時間（ＣＦＴ）、および（Ｃ）アルファ角。 エクスビボＲＯＴＥＭデータ。５０ＩＵ／ｋｇのＸＹＮＴＨＡ、ＡＤＶＡＴＥ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃの単回静脈内投与から５分、２４、４８、７２、および９６時間後の血友病ＡマウスからのＲＯＴＥＭ（ＮＡＴＥＭ）の結果（平均±標準偏差）。（Ａ）平均凝固時間（ＣＴ）、（Ｂ）血餅形成時間（ＣＦＴ）、および（Ｃ）アルファ角。 ｒＦＶＩＩＩＦｃおよび一本鎖（ＳＣ）ｒＦＶＩＩＩＦｃとｖＷＦとの相互作用の実時間評価ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｖＷＦからのＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのトロンビンに媒介される放出の実時間評価。（Ａ）ｖＷＦに対するｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ親和性の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。結合曲線および１：１のフィット相互作用モデルを示す。ｘ軸は、秒単位の時間を示し、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）の反応を示す。 ｒＦＶＩＩＩＦｃおよび一本鎖（ＳＣ）ｒＦＶＩＩＩＦｃとｖＷＦとの相互作用の実時間評価ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｖＷＦからのＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのトロンビンに媒介される放出の実時間評価。（Ｂ）２５℃（上）および３７℃（下）で、活性化したｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびＢドメイン欠失の、Ｆｃ部分を欠くｒＦＶＩＩＩ（ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）のトロンビンに媒介される放出の基準除算センサーグラム（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）。ｘ軸は、秒単位の時間を示し、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）の反応を示す。個々の線は、異なるα−トロンビン濃度での反応を示す。最上の線は、０Ｕ／ｍＬのα−トロンビンでの反応であり、それに続くそれぞれの線は、０．００５、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１６、０．３１、０．６３、１．３、２．５、５、１０、および２０Ｕ／ｍＬの順でα−トロンビン濃度に対して表示される。 ｒＦＶＩＩＩＦｃおよび一本鎖（ＳＣ）ｒＦＶＩＩＩＦｃとｖＷＦとの相互作用の実時間評価ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｖＷＦからのＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのトロンビンに媒介される放出の実時間評価。（Ｃ）２５℃（上）および３７℃（下）で、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩに対するトロンビンに媒介される放出相の二重の基準除算センサーグラム。ｘ軸は、秒単位の時間を示し、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）の反応を示す。個々の線は、異なるα−トロンビン濃度での反応を示す。最上の線は、０Ｕ／ｍＬのα−トロンビンでの反応であり、それに続くそれぞれの線は、０．００５、０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１６、０．３１、０．６３、１．３、２．５、５．０、１０、および２０Ｕ／ｍＬの順でα−トロンビン濃度に対して表示される。 ｒＦＶＩＩＩＦｃおよび一本鎖（ＳＣ）ｒＦＶＩＩＩＦｃとｖＷＦとの相互作用の実時間評価ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｖＷＦからのＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのトロンビンに媒介される放出の実時間評価。（Ｄ）２５℃（上）および３７℃（下）での、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩに対する時間の関数としてのトロンビンに媒介される放出率。ｘ軸は、秒単位の時間を示し、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）の反応を示す。個々の線は、異なるα−トロンビン濃度での反応を示す。最上の線は、２０Ｕ／ｍＬのα−トロンビンでの反応であり、それに続くそれぞれの線は、１０、５、２．５、１．３、０．６３、０．３１、０．１６、０．０８、０．０４、０．０２、０．０１、および０．００５Ｕ／ｍＬの順でα−トロンビン濃度に対して表示される。 ｒＦＶＩＩＩＦｃおよび一本鎖（ＳＣ）ｒＦＶＩＩＩＦｃとｖＷＦとの相互作用の実時間評価ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｖＷＦからのＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのトロンビンに媒介される放出の実時間評価。（Ｅ）２５℃（上）および３７℃（下）での、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩに対するトロンビン濃度の関数としてのトロンビンに媒介されるピークの放出率。ＥＣ５０は、半最大有効濃度である。ｘ軸は、Ｕ／ｍＬでのα−トロンビン濃度であり、ｙ軸は、ＲＵ／秒での最大放出率である。
本発明は、現在知られている第ＶＩＩＩ因子産物を用いて可能であるものよりもより長い投与間隔および／またはより大きなＡＵＣを用いて、第ＶＩＩＩ因子（プロセシングされた、一本鎖、またはそれらの組み合わせ）を用いて血友病Ａを治療する方法を提供する。本発明はまた、改善された第ＶＩＩＩ因子キメラポリペプチドおよび産生方法も提供する。
血友病Ａの治療は、ＦＶＩＩＩ活性を正常レベルの１〜５％まで回復させて、突発性出血を予防することを目的とする補充療法による（Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３−９（２００１）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。出血エピソードをオンデマンドで治療するため、または予防的に治療することにより起こる出血エピソードを予防するために利用可能な血漿由来および組換えＦＶＩＩＩ製品がある。これらの製品の短半減期（８〜１２時間）（Ｗｈｉｔｅ Ｇ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：６６０−７（１９９７）、Ｍｏｒｆｉｎｉ，Ｍ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ９（ｓｕｐｐｌ １）：９４−９９；考察１００（２００３））に基づいて、治療レジメンでは、一般に、予防のために週に２〜３回、オンデマンド治療のために１日に１〜３回、頻繁な静脈内投与が必要とされる（Ｍａｎｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５７：５３５−５４４（２００７））、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのような頻繁な投与は、苦痛を伴い、かつ不都合である。
本発明は、第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とするヒト対象（例えば、ヒト患者）に投与する方法であって、この対象に、治療用量のキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、例えば、キメラ第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃポリペプチド、またはそのようなポリペプチドのハイブリッドを投与して、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５倍長い投与間隔で投与することを含む、方法を提供する。本発明はまた、キメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを投与することを含む、第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とするヒト対象に投与する投与間隔を増大する方法も対象とする。
投与間隔は、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５〜６倍長いか、１．５〜５倍長いか、１．５〜４倍長いか、１．５〜３倍長いか、または１．５〜２倍長くあり得る。投与間隔は、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、または６倍長くあり得る。投与間隔は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはそれ以上であってよい。
投与間隔は、少なくとも約１．５〜５、１．５、２、３、４、もしくは５日、またはそれ以上であり得る。
本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とするヒト対象に投与する方法であって、この対象に、治療用量のキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、例えば、キメラ第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃポリペプチド、またはそのようなポリペプチドのハイブリッドを投与して、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチド）によって得られる血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）よりも少なくとも約１．２５倍大きなＡＵＣを得ることを含む、方法も提供する。したがって、本発明は、キメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを投与することを含む、それを必要とするヒト患者における第ＶＩＩＩ因子活性のＡＵＣを増大させるまたは広げる方法を含む。
本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子を、それを必要とする対象に投与する方法であって、この対象に、第ＶＩＩＩ因子およびＦｃを含む治療用量のポリペプチドを、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごとまたはそれ以上の投与間隔で投与することを含む、方法も提供する。
本発明の方法は、予防的処置またはオンデマンド治療を必要とする対象に対して実施することができる。
本明細書で使用される「投与」とは、薬剤的に許容される本発明の第ＩＸ因子ポリペプチドを、薬剤的に許容される経路で対象に与えることを意味する。投与の経路は、静脈内、例えば、静脈内注射および静脈内注入であり得る。さらなる投与経路には、例えば、皮下、筋肉内、経口、経鼻、および肺投与が含まれる。キメラポリペプチドおよびハイブリッドタンパク質は、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与されてもよい。
本明細書で使用される「血漿濃度対時間曲線下面積」は、薬理学における専門用語と同じであり、投与後の第ＶＩＩＩ因子の吸収の速度および程度に基づく。ＡＵＣは、特定の時間、例えば、１２、１８、２４、３６、４８、もしくは７２時間にわたって、または曲線の勾配に基づいた外挿を用いて無限大で決定される。本明細書中に特に明記されない限り、ＡＵＣは無限大で決定される。ＡＵＣの決定は、単一の対象において、または平均を計算する対象の集団において実施することができる。
本明細書で使用される第ＶＩＩＩ因子の「Ｂドメイン」は、内部アミノ酸配列同一性およびトロンビンによるタンパク質分解的切断部位、例えば、完全長ヒト第ＶＩＩＩ因子の残基Ｓｅｒ７４１−Ａｒｇ１６４８によって定義される当技術分野で公知のＢドメインと同じである。他のヒト第ＶＩＩＩ因子ドメインは、アミノ酸残基：Ａ１、残基Ａｌａ１−Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３−Ａｒｇ７４０；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０−Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３−Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２によって定義される。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０−Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列である、残基Ｇｌｕ１６４９−Ａｒｇ１６８９は、通常、第ＶＩＩＩ因子軽鎖活性化ペプチドと称される。ブタ、マウス、およびイヌ第ＶＩＩＩ因子について、Ｂドメインを含むドメインのすべてについての境界の位置も当技術分野で公知である。一実施形態において、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは、欠失している（「Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子」または「ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤ ＦＶＩＩＩの一例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）であり、これは、表２Ａ（ｉ）の配列の第ＶＩＩＩ因子部分（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７または２０〜１４５７）と同じ配列を有する。別の実施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、配列番号２のアルギニン残基７７３に対応するＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の残基７５４の、または配列番号６のアルギニン残基１６６７に対応する完全長第ＶＩＩＩ因子の残基１６４８のアルギニンに対応する、無傷の細胞内プロセシング部位を含有する。別様に示されない限り、いかなる配列番号にも称されない本明細書で使用される配列残基番号は、そのシグナルペプチド配列（１９アミノ酸）を含まない第ＶＩＩＩ因子配列に対応する。例えば、完全長第ＶＩＩＩ因子のＳ７４３／Ｑ１６３８は、１９アミノ酸シグナルペプチド配列のため、配列番号６のＳ７６２／Ｑ１６５７に対応する。他の実施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、完全長第ＶＩＩＩ因子において、アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異、またはアルギニン１６４５およびアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異を含む。幾つかの実施形態において、アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸は、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸とは異なるアミノ酸である。ある特定の実施形態において、この置換または突然変異は、アルギニン以外のアミノ酸、例えば、アラニンである。
「Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子」は、米国特許第６，３１６，２２６号、第６，３４６，５１３号、第７，０４１，６３５号、第５，７８９，２０３号、第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、第６，２２８，６２０号、第５，９７２，８８５号、第６，０４８，７２０号、第５，５４３，５０２号、第５，６１０，２７８号、第５，１７１，８４４号、第５，１１２，９５０号、第４，８６８，１１２号、第６，４５８，５６３号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示される完全または部分欠失を有し得る。幾つかの実施形態において、本発明のＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子配列は、米国特許第６，３１６，２２６号の第４段第４行から第５段第２８行および実施例１〜５（またはＵＳ第６，３４６，５１３号においても）で開示される欠失のうちのいずれか１つを含む。幾つかの実施形態において、本発明のＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，７８９，２０３号の第２段第２６〜５１行および実施例５〜８（またはＵＳ第６，０６０，４４７号、ＵＳ第５，５９５，８８６号、およびＵＳ第６，２２８，６２０号においても）で開示される欠失を有する。幾つかの実施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２，８８５号の第１段第２５行から第２段第４０行；米国特許第６，０４８，７２０号の第６段第１〜２２行および実施例１；米国特許第５，５４３，５０２号の第２段第１７〜４６行；米国特許第５，１７１，８４４号の第４段第２２行から第５段第３６行；米国特許第５，１１２，９５０号の第２段第５５〜６８行、図２、および実施例１；米国特許第４，８６８，１１２号の第１９段第２１行および表２；米国特許第７，０４１，６３５号の第２段第１行から第３段第１９行、第３段第４０行から第４段６７行、第７段第４３行から第８段第２６行、第１１段第５行から第１３段第３９行；または米国特許第６，４５８，５６３号の第４段第２５〜５３行に記載される欠失を有する。幾つかの実施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、Ｂドメインの大部分が欠失しているが、国際公開ＷＯ第９１／０９１２２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように、一次翻訳産物の２つのポリペプチド鎖（すなわち、細胞内プロセシング部位）へのインビボタンパク質分解処理に必須であるＢドメインのアミノ末端配列を依然として含む。幾つかの実施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、アミノ酸７４７〜１６３８の欠失、すなわち、実質的には、Ｂドメインの完全欠失で構成される。Ｈｏｅｂｅｎ Ｒ．Ｃ．，ｅｔ
ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８−７３２３（１９９０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子はまた、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２の欠失も含み得る。Ｍｅｕｌｉｅｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２（４）：３０１−６（１９８８）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の一部であるさらなるＢドメイン欠失には、例えば、アミノ酸９８２〜１５６２または７６０〜１６３９の欠失（Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：５９３９−５９４２（１９８６））、７９７〜１５６２の欠失（Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：８３４３−８３４７（１９８６））、７４１〜１６４６の欠失（Ｋａｕｆｍａｎ（ＰＣＴ公開出願ＷＯ第８７／０４１８７号））、７４７〜１５６０の欠失（Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ６：５５３−５６４（１９８７））、７４１〜１６４８の欠失（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ出願第８８／００８３１号））、８１６〜１５９８または７４１〜１６８９の欠失（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ８２：１６−２５、欧州特許第ＥＰ２９５５９７号））（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれる。前述の欠失のそれぞれは、任意の第ＶＩＩＩ因子配列でなされ得る。
一実施形態において、キメラポリペプチド中のＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子部分は、金属結合によって接続された（または結合された）２つの鎖にプロセスされ、第１の鎖は重鎖（Ａ１−Ａ２−部分的にＢ）を含み、第２の鎖は軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）を含む。別の実施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子部分は、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の残基７５４（配列番号２の残基７７３）の、または完全長第ＶＩＩＩ因子の残基１６４８（配列番号６の残基１６５７）のアルギニンに対応する細胞内プロセシング部位を含むことができる。
重鎖と軽鎖との間の金属結合は、当技術分野で公知の任意の金属であり得る。例えば、本発明に有用な金属は、二価金属イオンであり得る。重鎖および軽鎖を結合させるために使用することができる金属としては、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣｕ２＋が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆａｔｏｕｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１５５（１）：１２１−１３１（１９９７）、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ．２７９（１３）：１２６７７−１２６８４（２００４）。
本明細書で使用される「キメラポリペプチド」は、その中に異なる起源由来のポリペプチド少なくとも２つのポリペプチド（またはサブ配列もしくはペプチド）を含むポリペプチドを意味する。キメラポリペプチドは、例えば、異なる遺伝子、異なるｃＤＮＡ、または異なる動物もしくは他の種等の異なる起源由来の２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のポリペプチドを含み得る。キメラポリペプチドは、例えば、異なるサブ配列を連結する１つ以上のリンカーを含み得る。したがって、サブ配列は、単一のキメラポリペプチド内で直接連結され得るか、またはリンカーを介して、間接的に連結され得るか、あるいはそれらの両方であり得る。キメラポリペプチドは、例えば、シグナル配列等のさらなるペプチド、ならびにタンパク質の精製または検出を支援する６ＨｉｓおよびＦＬＡＧ等の配列等を含み得る。加えて、キメラポリペプチドは、Ｎおよび／またはＣ末端へのアミノ酸またはペプチド付加を有し得る。
幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子部分および非第ＶＩＩＩ因子部分を含む。例となる非第ＶＩＩＩ因子部分には、例えば、Ｆｃ、ＸＴＥＮ、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリン、ＣＴＰ（４つのＯ−グリカンを有するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の２８アミノ酸Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合ポリペプチド、およびアルブミン結合小分子が含まれる。本発明の例となるキメラポリペプチドには、例えば、キメラ第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃポリペプチド、キメラ第ＶＩＩＩ因子−ＸＴＥＮポリペプチド、キメラ第ＶＩＩＩ因子−アルブミンポリペプチド、キメラ第ＶＩＩＩ因子−ＰＡＳポリペプチド、キメラ第ＶＩＩＩ因子−トランスフェリンポリペプチド、キメラ第ＶＩＩＩ因子−ＣＴＰポリペプチド、キメラ第ＶＩＩＩ因子−ＰＥＧポリペプチド、キメラ第ＶＩＩＩ因子−ＨＥＳポリペプチド、キメラ第ＶＩＩＩ因子−アルブミン結合ポリペプチドポリペプチド、およびキメラ第ＶＩＩＩ因子−アルブミン結合小分子ポリペプチドが含まれる。
例となるキメラ第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃポリペプチドには、例えば、それらのシグナル配列を含むまたは含まない、配列番号２または６（表２）、および配列番号４（表２）のキメラＦｃポリペプチドが含まれる。
キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含み得、この配列は第ＶＩＩＩ因子活性を有する。第ＶＩＩＩ因子活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＰＴ）アッセイ、発色アッセイ、または他の既知の方法によって測定することができる。キメラポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１６８４）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉ）に示される第ＶＩＩＩ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１６８４）と同一である配列を含み得る。
前述のように、例となるキメラポリペプチドには、１つ以上のＸＴＥＮポリペプチドと融合する第ＶＩＩＩ因子が含まれる。Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７：１１８６−９０（２００９）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＸＴＥＮポリペプチドを、ＦＶＩＩＩのＮ末端またはＦＶＩＩＩのＣ末端のいずれかと融合し得る。プロテアーゼ部位が、ＸＴＥＮ部分と第ＶＩＩＩ因子部分との間に含められて、そのようなプロセシングを可能にさせ得る。ＸＴＥＮポリペプチドには、例えば、ＷＯ第２００９／０２３２７０号、ＷＯ第２０１０／０９１１２２号、ＷＯ第２００７／１０３５１５号、ＵＳ第２０１０／０１８９６８２号、およびＵＳ第２００９／００９２５８２号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるものが含まれる。
前述のように、例となるキメラポリペプチドはまた、１つ以上のアルブミンポリペプチド、アルブミン結合ポリペプチド、またはアルブミン結合小分子と融合する第ＶＩＩＩ因子も含む。一実施形態において、アルブミンは、ヒトアルブミンである。アルブミンまたはアルブミン結合タンパク質を、ＦＶＩＩＩのＮ末端またはＦＶＩＩＩのＣ末端のいずれかと融合し得るか、またはＦＶＩＩＩ中の２つのアミノ酸間に挿入し得る。本発明に使用され得るアルブミン、例えばその断片の例は、例えば、米国特許第７，５９２，０１０号、米国特許第６，６８６，１７９号、およびＳｃｈｕｌｔｅ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．１２４ Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ６−Ｓ８（２００９）（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で公知である。
アルブミン結合ポリペプチドは、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミンと結合することができるアルブミン結合抗体断片を含むことができるが、これらに限定されない。Ｋｒａｕｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７８：１９０−１９４（１９９６）およびＬｉｎｈｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１：２０６−２１３（２００２）によって開示される、連鎖球菌プロテインＧ由来のドメイン３が、細菌アルブミン結合ドメインの一例である。アルブミン結合ペプチドの例には、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号７）を有する一連のペプチドが含まれる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）を参照のこと。アルブミン結合抗体断片の例は、Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９−３２６（２００７）、Ｒｏｏｖｅｒｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３−３１７（２００７）、およびＨｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｃｉ．，２１：２８３−２８８（２００８）（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
ある種の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩポリペプチドは、非ポリペプチド小分子、変異体、またはアルブミンと結合することができるその誘導体に対して少なくとも１つの付着部位を含む。そのようなアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０：２２８６−２２９２（２００９）によって開示される、２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェイル）ブタンアミド）ヘキサン酸塩（「Ａｌｂｕ」タグ）である。
上述のように、例となるキメラポリペプチドはまた、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）の少なくとも１つのβサブユニットと融合される第ＶＩＩＩ因子が含まれる。ＣＴＰを、ＦＶＩＩＩのＮ末端またはＦＶＩＩＩのＣ末端のいずれかの第ＶＩＩＩ因子と融合し得るか、またはＦＶＩＩＩ中の２つのアミノ酸間に挿入し得る。組換えタンパク質と融合される、またはそれに挿入される１つ以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のインビボ半減期を増大させることが知られている。例えば、米国特許第５，７１２，１２２号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例となるＣＴＰペプチドは、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号８）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号９）を含む。例えば、米国特許出願公開ＵＳ第２００９／００８７４１１ Ａ１号を参照されたく、参照により組み込まれる。
上述のように、例となるキメラポリペプチドはまた、少なくとも１つのＰＡＳ配列、またはその断片、変異体、もしくは誘導体と融合される第ＶＩＩＩ因子も含む。ＰＡＳ配列を、ＦＶＩＩＩのＮ末端またはＦＶＩＩＩのＣ末端のいずれかと融合し得るか、またはＦＶＩＩＩ中の２つのアミノ酸間に挿入し得る。本明細書で使用されるＰＡＳペプチドまたはＰＡＳ配列は、主に、アラニンおよびセリン残基を含むか、または主にアラニン、セリン、およびプロリン残基を含む、生理学的条件下でランダムコイル構造を形成するアミノ酸配列を意味する。したがって、ＰＡＳ配列は、アラニン、セリン、およびプロリンを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる、構成要素、アミノ酸ポリマー、または配列カセットであり、これらはキメラタンパク質において異種部分の一部として使用することができる。アミノ酸ポリマーはまた、アラニン、セリン、およびプロリン以外の残基がＰＡＳ配列中の副次成分として添加される場合のランダムコイル構造を形成することもできる。「副次成分」とは、アラニン、セリン、およびプロリン以外のアミノ酸を、ある程度まで、例えば、最大約１２％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００アミノ酸のうちの約１２、最大約１０％、最大約９％、最大約８％、約６％、約５％、約４％、約３％、すなわち、約２％、または約１％のアミノ酸をＰＡＳ配列中に添加することができるものを意味する。アラニン、セリン、およびプロリンとは異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択され得る。生理学的条件下で、ＰＡＳペプチドは、ランダムコイル構造を形成し、それによって、本発明の組換えタンパク質への増加したインビボおよび／またはインビトロ安定性を媒介することができ、これは凝固促進活性を有する。
ＰＡＳペプチドの非限定例には、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号１０）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号１１）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１２）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１３）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号１４）ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号１５）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号１６）、もしくはその任意の変異体、誘導体、断片、またはそれらの組み合わせが含まれる。ＰＡＳ配列のさらなる例は、米国特許公開第２０１０／０２９２１３０ Ａ１号およびＰＣＴ出願公開ＷＯ第２００８／１５５１３４ Ａ１号、欧州出願特許第２１７３８９０号より公知である。
上述のように、例となるキメラポリペプチドはまた、少なくとも１つのトランスフェリンペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体と融合される第ＶＩＩＩ因子も含む。少なくとも１つのトランスフェリンペプチドを、ＦＶＩＩＩのＮ末端またはＦＶＩＩＩのＣ末端のいずれかと融合し得るか、またはＦＶＩＩＩ中の２つのアミノ酸間に挿入し得る。任意のトランスフェリンを、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質と融合し得るか、またはその中に挿入させ得る。例としては、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、遺伝子重複に由来するように思われる、Ｎ（約３３０アミノ酸）およびＣ（約３４０アミノ酸）の２つの主要なドメインを有する（グリコシル化からなるものではない）約７５ＫＤａの６７９アミノ酸タンパク質である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７、およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
トランスフェリンは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）で媒介されたエンドサイトーシスを通じて鉄を輸送する。鉄がエンドソーム区画に放出され、Ｔｆ−ＴｆＲ複合体が細胞表面に再利用された後、Ｔｆは、鉄輸送の次のサイクルのために細胞外空間に戻って放出される。Ｔｆは、１４〜１７日を超える長い半減期を有する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２３：２０６−２０９（２００２））。トランスフェリン融合タンパク質は、半減期の延長、癌療法のための標的送達、プロインスリンの経口送達および持続的活性化について研究されている（Ｂｒａｎｄｓｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２９：２３０−２３８（２０１１）、Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：７２９２−７２９６（２００５）、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３３４：６８２−６９２（２０１０）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５５：３８６−３９２（２０１１））。
上述のように、例となるキメラポリペプチドはまた、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と融合する第ＶＩＩＩ因子も含む。
ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩと少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子との間に形成された複合体を指し得る。ＰＥＧは、多種多様の分子量および平均分子量の範囲で市販されている。ＰＥＧの平均分子量の範囲の典型的な例としては、約２００、約３００、約４００、約６００、約１０００、約１３００〜１６００、約１４５０、約２０００、約３０００、約３０００〜３７５０、約３３５０、約３０００〜７０００、約３５００〜４５００、約５０００〜７０００、約７０００〜９０００、約８０００、約１００００、約８５００〜１１５００、約１６０００〜２４０００、約３５０００、約４００００、約６００００、および約８００００ダルトンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの平均分子量は、単に例としてのみ提供されるものであり、決して限定することを意味するものではない。
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質を、ＰＥＧ化して、モノまたはポリ（例えば、２〜４個の）ＰＥＧ部分を含めることができる。ＰＥＧ化は、当技術分野で公知の任意のＰＥＧ化反応によって実施され得る。ＰＥＧ化タンパク質生成物を調製するための方法は、一般に、（ｉ）ポリペプチドを、本発明のペプチドが、１つ以上のＰＥＧ基と結合する条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させることと、（ｉｉ）反応生成物（複数を含む）を得ることと、を含む。一般に、反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて個別に決定される。
例えば、Ｍａｌｉｋ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−３５（１９９２）、Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ
３（２）：４−１０（１９９２）、欧州特許公開第０４０１３８４号、第０１５４３１６号、および第０４０１３８４号；ならびに国際特許出願公開ＷＯ第９２／１６２２１号およびＷＯ第９５／３４３２６号等の当業者には利用可能な多くのＰＥＧ付着方法がある。非限定例として、ＦＶＩＩＩ変異体は、ＦＶＩＩＩ中の１つ以上の挿入位置でシステイン置換基を含有することができ、システインは、さらに、ＰＥＧポリマーに複合体化され得る。Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０−２７９（２０１０）および米国特許第７，６３２，９２１号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
上述のように、例となるキメラポリペプチドはまた、少なくとも１つのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）ポリマーと融合する第ＶＩＩＩ因子も含む。ＨＥＳは、天然アミロペクチンの誘導体であり、体内ではアルファ−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、有利な生物学的特性を示し、血液用補液剤（ｂｌｏｏｄ ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）として、診療所における血液希釈療法に使用されている。例えば、Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ ８：２７１−２７８（１９８７）、およびＷｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４１：４９４−４９８（１９９１）を参照のこと。
ＨＥＳは、主として分子量分布および置換度によって特徴付けられる。ＨＥＳは、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ、３〜１００ｋＤ、または４〜７０ｋＤの平均分子量（重量平均）を有する。ヒドロキシルエチルデンプンは、さらに、０．１〜３、０．１〜２、０．１〜０．９、または０．１〜０．８のモル置換度と、ヒドロキシルエチル基に関して２〜２０の範囲でＣ２：Ｃ６置換比と、を示すことができる。約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳは、ＦｒｅｓｅｎｉｕｓのＶｏｌｕｖｅｎ（登録商標）である。Ｖｏｌｕｖｅｎ（登録商標）は、例えば、血液量減少の治療および予防の治療的適応に補液として使用される人工コロイドである。例えば、上述と同じＰＥＧ付着方法等の当業者には利用可能な多くのＨＥＳ付着方法がある。
幾つかの実施形態において、第ＶＩＩＩ因子部分を含むキメラポリペプチドは、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない同じ第ＶＩＩＩ因子部分からなるポリペプチドを超える増加した半減期（ｔ１／２）を有する。増加したｔ１／２を有するキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、本明細書中で長時間作用型第ＶＩＩＩ因子と称され得る。長時間作用型キメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、例えば、Ｆｃと融合する第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＦＶＩＩＩＦｃの単量体二量体ハイブリッド等のハイブリッドの形態でキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含む；実施例１、図１、および表２Ａ；ならびに米国特許第７，４０４，９５６号および第７，３４８，００４号を参照のこと）、ＸＴＥＮと融合する第ＶＩＩＩ因子、およびアルブミンと融合する第ＶＩＩＩ因子が含まれる。
本明細書で使用される「培養する（Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、「培養すること（ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ）」、および「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」は、細胞増殖または細胞分割を可能にするインビトロ条件下で、細胞をインキュベートするか、または生存状態で細胞を維持することを意味する。本明細書で使用される「培養細胞」は、インビトロで増殖する細胞を意味する。
本明細書で使用される「第ＶＩＩＩ因子」は、特に明記されない限り、凝血におけるその通常の役割における、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを意味する。したがって、第ＶＩＩＩ因子という用語は、機能的な変異体ポリペプチドを含む。第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、およびネズミ第ＶＩＩＩ因子タンパク質であり得る。背景技術の項で記載されるように、完全長ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列が知られており、多くの機能的断片、突然変異体、および修飾バージョンも同様である。ヒト第ＶＩＩＩ因子配列の例は、配列番号２または６（表２）においてサブ配列として示される。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、例えば、完全長第ＶＩＩＩ因子、Ｎ末端でＭｅｔがない完全長第ＶＩＩＩ因子、成熟第ＶＩＩＩ因子（シグナル配列がない）、Ｎ末端でさらなるＭｅｔを有する成熟第ＶＩＩＩ因子、および／またはＢドメインが完全もしくは部分的に欠失した第ＶＩＩＩ因子が含まれる。第ＶＩＩＩ因子変異体には、部分欠失または完全欠失に関わらず、Ｂドメイン欠失が含まれる。
前述および後述のように、非常に多くの機能的第ＶＩＩＩ因子変異体が知られている。加えて、第ＶＩＩＩ因子における数百の非機能的突然変異が血友病患者で同定され、これらの突然変異の第ＶＩＩＩ因子機能に対する影響は、置換の性質よりも、第ＶＩＩＩ因子の３次元構造内のどこにそれらがあるかによるものであることが見出されている（Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９：２７４−８（２００２））、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、ヒトおよび他の種由来の第ＶＩＩＩ因子の比較により、機能に必要とされる可能性がある保存された残基が特定されている（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７−２２（１９９８）、米国特許ＵＳ第６，２５１，６３２号）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子が哺乳動物細胞で単離され、発現され（Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３４２−３４７（１９８４）、Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３２６−３３０（１９８４）、Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３０−３３７（１９８４）、Ｖｅｈａｒ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３７−３４２（１９８４）、国際公開ＷＯ第８７／０４１８７号、ＷＯ第８８／０８０３５号、ＷＯ第８８／０３５５８号、米国特許第４，７５７，００６号）（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、そしてアミノ酸配列がｃＤＮＡから推定された。Ｃａｐｏｎらの米国特許第４，９６５，１９９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、哺乳動物宿主細胞における第ＶＩＩＩ因子の産生およびヒト第ＶＩＩＩ因子の精製のための組換えＤＮＡ法を開示している。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞およびＢＨＫＣ（ベビーハムスター腎臓細胞）におけるヒト第ＶＩＩＩ因子発現が報告されている。Ｂドメインの一部またはすべてを欠失するためにヒト第ＶＩＩＩ因子を修飾し（米国特許第４，９９４，３７１号および第４，８６８，１１２号、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインのヒト第Ｖ因子Ｂドメインでの置換が実施されている（米国特許第５，００４，８０３号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするｃＤＮＡ配列および予想されるアミノ酸配列はそれぞれ、米国特許出願公開第２００５／０１００９９０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の配列番号１および２で示される。
米国特許第５，８５９，２０４号、Ｌｏｌｌａｒ，Ｊ．Ｓ．（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、抗原性が減少し、かつ免疫反応性が減少した第ＶＩＩＩ因子の機能的突然変異を報告している。米国特許第６，３７６，４６３号、Ｌｏｌｌａｒ，Ｊ．Ｓ．（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた、免疫反応性が減少した第ＶＩＩＩ因子の突然変異を報告している。Ｓａｅｎｋｏらの米国特許出願公開第２００５／０１００９９０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインにおける機能的突然変異を報告している。
Ｂドメイン欠失を含む多くの機能的第ＶＩＩＩ分子が、以下の特許で開示されている：米国特許第６，３１６，２２６号および第６，３４６，５１３号、どちらもＢａｘｔｅｒに譲渡；米国特許第７，０４１，６３５号、Ｉｎ２Ｇｅｎに譲渡；米国特許第５，７８９，２０３号、米国特許第６，０６０，４４７号、米国特許第５，５９５，８８６号、および米国特許第６，２２８，６２０号、Ｃｈｉｒｏｎに譲渡；米国特許第５，９７２，８８５号および米国特許第６，０４８，７２０号、Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍに譲渡、米国特許第５，５４３，５０２号および米国特許第５，６１０，２７８号、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋに譲渡；米国特許第５，１７１，８４４号、Ｉｍｍｕｎｏ Ａｇに譲渡；米国特許第５，１１２，９５０号、Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｓ．Ａ．に譲渡；米国特許第４，８６８，１１２号、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに譲渡、（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ブタ第ＶＩＩＩ因子配列が公開され（Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５９３９−５９４２（１９８６））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ブタ膵臓ｃＤＮＡライブラリーからの第ＶＩＩＩ因子配列のＰＣＲ増幅から得られる完全ブタｃＤＮＡ配列が報告されている（Ｈｅａｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８８：４２０９−４２１４（１９９６）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。全ドメイン、全サブユニット、および特異的アミノ酸配列の置換を有するハイブリッドヒト／ブタ第ＶＩＩＩ因子が、ＬｏｌｌａｒおよびＲｕｎｇｅによる米国特許第５，３６４，７７１号、ならびに国際公開第９３／２００９３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示された。より最近では、ブタ第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列ならびにブタＡ１および／またはＡ２ドメインが対応するヒトドメインで置換されたキメラ第ＶＩＩＩ因子が国際公開第９４／１１５０３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で報告された。米国特許第５，８５９，２０４号、Ｌｏｌｌａｒ，Ｊ．Ｓ．も、ブタｃＤＮＡおよび推定されたアミノ酸配列を開示する。Ｅｍｏｒｙに譲渡された米国特許第６，４５８，５６３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、Ｂドメイン欠失ブタ第ＶＩＩＩ因子を開示する。
第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７および配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一であり得、当該第ＶＩＩＩ因子部分は、第ＶＩＩＩ因子活性を有する。第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、シグナル配列を含まない表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸２０〜１４５７および配列番号６のアミノ酸２０〜２３５１）と同一であり得る。
第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７および配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と少なくとも９０％または９５％同一であり得、当該第ＶＩＩＩ因子部分は、第ＶＩＩＩ因子活性を有する。第ＶＩＩＩ因子（またはキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分）は、シグナル配列を含む表２に示される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜１４５７および配列番号６のアミノ酸１〜２３５１）と同一であり得る。
本明細書で使用される「等価用量」は、国際単位で表されるのと同じ用量の第ＶＩＩＩ因子活性を意味し、これは問題のポリペプチドの分子量に無関係である。１国際単位（ＩＵ）の第ＶＩＩＩ因子活性は、１ミリリットルの正常ヒト血漿中の第ＶＩＩＩ因子の量にほぼ相当する。ヨーロッパ薬局方発色基質アッセイおよび一段階凝固アッセイを含む幾つかのアッセイが、第ＶＩＩＩ因子活性を測定するために利用可能である。
本明細書で使用される「Ｆｃ」は、特に明記されない限り、機能的な新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合パートナーを意味する。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ受容体によって特異的に結合され得、その結果、ＦｃＲｎ受容体によって該ＦｃＲｎ結合パートナーが能動輸送される、任意の分子である。したがって、Ｆｃという用語には、機能的であるＩｇＧ Ｆｃの任意の変異体が含まれる。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて、記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９（１９９４）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＦｃＲｎとＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの接合部付近である。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接点はすべて、単一Ｉｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーには、例えば、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全結合領域を含むＩｇＧの他の断片が含まれる。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６が含まれる。免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片、または領域のアミノ酸番号付けに対して行う言及はすべて、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ；ＭＤに基づき、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。（ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含む幾つかの哺乳類種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列が知られている（Ｓｔｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７（１９９４）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域を含むまたは含まない免疫グロブリンのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでもよい。例となるＦｃ変異体は、国際公開第２００４／１０１７４０号および第２００６／０７４１９９号に提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、１つ以上の突然変異体、および突然変異体の組み合わせを含有してもよい。
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：１７５０（２００９）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびその組み合わせ、ならびにＶａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２８３（２００５）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、およびその組み合わせ等の増加した半減期を付与する突然変異体、１〜２頁の段落［００１２］、および米国特許第２００９／０２６４６２７ Ａ１号の実施例９および１０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される変異体、ならびに米国特許第２００９０１６３６９９ Ａ１号の２頁の段落［００１４］〜［００２１］（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される突然変異体を含んでもよい。
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）はまた、例えば、以下の突然変異体を含んでもよい。部位特異的変異形成等のよく認識される手法に従って、ＩｇＧのＦｃ領域を修飾して、ＦｃＲｎによって結合されるであろう修飾ＩｇＧまたはＦｃ断片またはその部分を得ることも可能である。そのような修飾には、ＦｃＲｎ接触部位から遠く離れた修飾、ならびにＦｃＲｎへの結合を保持するかまたはさらには増強する接触部位内の修飾が含まれる。例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ中の以下の１つのアミノ酸残基（Ｆｃｙ１）が、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性を著しく失うことなく置換され得る：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、およびＫ４４７Ａ。ここで、例えば、Ｐ２３８Ａは、位置番号２３８で野生型プロリンがアラニンによって置換されたことを示す。アラニンに加えて、他のアミノ酸が、上記に明記される位置で野生型アミノ酸を置換することも可能である。突然変異体を単独でＦｃに導入して、天然Ｆｃと異なる、１００を超えるＦｃＲｎ結合パートナーを生じることも可能である。さらに、これらの個々の突然変異体のうちの２つ、３つ、またはそれ以上からなる組み合わせを、一緒に導入して、さらに数百のＦｃＲｎ結合パートナーを生じることも可能である。ある種のこれらの変異は、ＦｃＲｎ結合パートナーに新たな機能性を与えることも可能である。例えば、１つの実施形態は、Ｎ２９７Ａを取り込み、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を取り除く。この突然変異の効果は、免疫原性を減少させ、それによってＦｃＲｎ結合パートナーの循環半減期を増強すること、ならびにＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＡ、ＦｃｙＲＩＩＢ、およびＦｃｙＲＩＩＩＡと結合することができなくなるようにすることである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：８４７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；Ｆｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１６３２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、少なくとも３つのヒトＦｃガンマ受容体が、下部ヒンジ領域、一般にアミノ酸２３４〜２３７内のＩｇＧ上の結合部位を認識するようである。したがって、新しい機能および可能性が減少した免疫原性の別の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１「ＥＬＬＧ」のアミノ酸２３３〜２３６をＩｇＧ２「ＰＶＡ」からの対応する配列（１つのアミノ酸欠失を有する）と置換することによって、この領域の突然変異から生じることも可能である。様々なエフェクター機能を媒介するＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、およびＦｃｙＲＩＩＩは、そのような突然変異が導入されるとき、ＩｇＧ１と結合しないことが示されている（Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７（１９９５）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；およびＡｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３（１９９９）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。上記の突然変異から生じる新たな機能性のさらなる例として、場合によっては、ＦｃＲｎに対する親和性を、野生型のものより増加させることも可能である。この増加した親和性は、「オン」速度の増加、「オフ」速度の減少、または「オン」速度の増加および「オフ」速度の減少の両方を反映する可能性がある。ＦｃＲｎに対する増加した親和性を付与すると考えられる突然変異としては、例えば、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが含まれる（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１（２００１）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４または配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と少なくとも９０％または９５％同一であり得る。Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、表２に示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１４５８〜１６８４および配列番号６のアミノ酸２３５２〜２５７８）と同一であり得る。
本明細書で使用される「ハイブリッド」ポリペプチドおよびタンパク質は、キメラポリペプチドの第２ポリペプチドとの組み合わせを意味する。ハイブリッド中のキメラポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、タンパク質間相互作用、例えば、電荷間相互作用または疎水性相互作用により互いに結合し得る。ハイブリッド中のキメラポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ジスルフィド結合または他の共有結合（複数を含む）により互いに結合し得る。ハイブリッドは、国際公開第２００４／１０１７４０号および国際公開第２００６／０７４１９９号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。米国特許第７，４０４，９５６号および第７，３４８，００４号も参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。第２ポリペプチドは、同一のキメラポリペプチドの第２のコピーであっても、同一でないキメラポリペプチドであってもよい。例えば、図１、実施例１、および表２を参照のこと。一実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃを含むポリペプチドである。別の実施形態において、キメラポリペプチドは、キメラ第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、Ｆｃから本質的になる、例えば、介在するリンカー配列のない、ヒトＩｇＧ１の二量体Ｆｃドメインと融合する組換えＢドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ）の１つの分子からなるｒＦＶＩＩＩＦｃ組換え融合タンパク質である実施例１のハイブリッドポリペプチドである。このハイブリッドポリペプチドは、本明細書中では、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体Ｆｃ融合タンパク質、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体ハイブリッド、単量体ＦＶＩＩＩＩＦｃハイブリッド、およびＦＶＩＩＩＦｃ単量体−二量体と称される。実施例１、図１、および表２Ａを参照のこと。実施例は、このハイブリッドポリペプチドについての前臨床および臨床データを提供する。
ハイブリッド中の第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含み得るか、またはこの配列から本質的になり得る。第２のポリペプチドは、シグナル配列を含まない表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と同一であるか、またはシグナル配列を含む表２Ａ（ｉｉ）に示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２４７）と同一である配列を含み得るか、またはこの配列から本質的になり得る。
図１は、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃキメラポリペプチドの構造、およびＦｃポリペプチドである第２のポリペプチドとの関連を示す略図である。このハイブリッドを得るために、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりヒト肝臓ポリＡ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＦＶＩＩＩ特異的ポリマーを用いて、ヒト組換えＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩのコード配列を得た。ＦＶＩＩＩ配列は、ＦＶＩＩＩの天然のシグナル配列を含む。Ｂドメイン欠失は、セリン７４３（Ｓ７４３；２２８７ｂｐ）からグルタミン１６３８（Ｑ１６３８；４９６９ｂｐ）までの、合計２６８２ｂｐの欠失であった。次いで、ＲＴ−ＰＣＲによりヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＦｃ特異的ポリマーを用いて、ヒト組換えＦｃのコード配列を得た。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列が介在するリンカーなしで、Ｆｃ配列のＮ末端に直接融合するように、プライマーを設計した。ＦＶＩＩＩＦｃ ＤＮＡ配列を、哺乳動物二重発現ベクターｐＢＵＤＣＥ４．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にＣＭＶプロモーターの制御下でクローンした。マウスＩｇｋシグナル配列を含む第２の同じＦｃ配列を、ＲＴ−ＰＣＲにより得、発現ベクターｐＢＵＤＣＥ４．１中で第２のプロモーターであるＥＦ１αの下流にクローンした。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｈ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での選択により安定なクローン細胞株を生成させた。１つのクローン細胞株である３Ｃ４−２２を用いて、インビボでの特徴付けのためにＦＶＩＩＩＦｃを生成させた。組換えＦＶＩＩＩＦｃをＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で産生し、精製した（ＭｃＣｕｅ ｅｔ ａｌ．２００９）。上述のトランスフェクション戦略は、３つの生成物、すなわち、単量体ｒＦＶＩＩＩＦｃハイブリッド、二量体ｒＦＶＩＩＩＦｃハイブリッド、および二量体Ｆｃを産出することが予測された。しかしながら、これらの細胞から馴化培地では二量体ｒＦＶＩＩＩＦｃは本質的に検出されなかった。むしろ、馴化培地は、Ｆｃおよび単量体ｒＦＶＩＩＩＦｃを含んだ。二量体ｒＦＶＩＩＩＦｃのサイズは大きすぎて、細胞からの十分な分泌を阻止した可能性がある。この結果は、モノマーの精製を３つのタンパク質すべてが存在する場合よりも複雑にしないので、この結果は有益であった。これらの試験で使用した物質は、約９０００ＩＵ／ｍｇの比活性を有していた。
一実施形態において、本発明のポリペプチドが、高レベルのフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を発現する患者に投与される。本明細書で使用される「対象」または「患者」は、ヒト個人を意味する。対象は、現在、出血性障害に苦しんでいる、またはそのような治療を必要とすることが予想される患者であり得る。「対象」は、成人または小児対象を含むことができる。小児対象は、１２歳未満の小児患者であり得る。本明細書で使用される「小児科」という用語は、乳児および子供のケアおよび彼らの疾患の治療に対処する科である。一実施形態において、対象は、重篤な血友病Ａであると診断されている小児患者である。特定の実施形態において、小児対象は、本発明の長時間作用型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドによって治療される。
ＶＷＦは、様々な形態の分子量が、それぞれの単量体サブユニットについての約２３０ｋＤａからより大きな分子量の多量体形態における２０００万Ｄａ超までの間で変動し、かくして公知の最大の可溶性タンパク質を形成する、多量体構造を有する血漿タンパク質である。その血漿濃度は、およそ５〜１０μｇ／ｍＬ前後（Ｓｉｅｄｌｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ ８８：２９３９−２９５０（１９９６））であり、より小さいサイズの血漿形態は、約５００ｋＤａのサイズを持つ二量体に対応する。
ＶＷＦは、損傷を受けた血管表面に対する血小板の付着、ひいてはフィブリン凝集物の形成機序がその上で展開する血小板血栓の形成が関与しており、一次止血において重要な役割を果たす。より高い分子量の多量体がさらに効率良く内皮下層に対する血小板付着機序を支援することが示唆され、ＶＷＦ濃縮物の臨床的効能は、より高い分子量のこれらの多量体の濃度に関係付けられている（Ｍｅｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ４：２５−３２（１９９８）。
したがって、高レベルのＶＷＦを発現する対象は、より低いまたは正常レベルのＶＷＦを発現する対象と比較してあまり頻繁でないＦＶＩＩＩの投与を必要とするであろう。血漿中のＶＷＦの平均範囲は、約５０ＩＵ／ｄＬ〜約２００ＩＵ／ｄＬである。一実施形態において、血漿中のＶＷＦの平均レベルは、約５０ＩＵ／ｄＬである。別の実施形態において、少なくとも約１００ＩＵ／ｄＬの血漿中のＶＷＦレベルは、高ＶＷＦレベルであると見なされる。別の実施形態において、血漿中の高レベルのＶＷＦは、約１００ＩＵ／ｄＬ〜約２００ＩＵ／ｄＬである。別の実施形態において、血漿中の高レベルのＶＷＦは、少なくとも約１１０ＩＵ／ｄＬ、約１２０ＩＵ／ｄＬ、約１３０ＩＵ／ｄＬ、約１４０ＩＵ／ｄＬ、約１５０ＩＵ／ｄＬ、約１６０ＩＵ／ｄＬ、約１７０ＩＵ／ｄＬ、約１８０ＩＵ／ｄＬ、約１９０ＩＵ／ｄＬ、または約２００ＩＵ／ｄＬである。
したがって、一実施形態において、少なくとも約１００ＩＵ／ｄＬの血漿ＶＷＦを発現する対象に、長い間隔の投与レジメンで本発明の長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドが投与される。一実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドは、少なくとも約３日の投与間隔で投与される。別の実施形態において、長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドは、１週間ごとに少なくとも約１回、２週間ごとに約１回、１５日ごとに約１回、２０日ごとに約１回、３週間ごとに約１回、２５日ごとに約１回、４週間ごとに約１回、または１ヶ月ごとに約１回の投与間隔で投与される。
一実施形態において、対象は、高レベルのＶＷＦを有するものとして以前に特定された。ある特定の実施形態において、Ｏ以外の血清型（すなわち、Ａ、Ｂ、またはＡＢ）を有する対象は、長時間作用型ＦＶＩＩＩがこれらの対象においてより長い半減期を有するため、長時間作用型ＦＶＩＩＩの頻繁な投与をあまり必要としない。これらの対象において、増加した半減期は、それらの上昇したＶＷＦレベルによるものである。
さらに、薬物吸収、分布、代謝、および排せつの時間経過の試験として画定される薬物動態データは、本発明の長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドを用いて、より長いまたは短い投与間隔にふさわしい対象の識別子として使用することができる。臨床薬物動態は、個々の患者における薬物の安全性および有効性の治療管理への薬物動態の原則の適用である。臨床薬物動態の主要目的は、患者の薬物療法の有効性を増強することと、その毒性を減少させることと、を含む。薬物濃度とそれらの薬理反応との間の強い相関関係の発生は、臨床医が実際の患者の状況に薬物動態の原則を適用することを可能にする。
したがって、一実施形態において、本発明のＦＶＩＩＩ−Ｆｃポリペプチドの半減期が、高レベルのＶＷＦを発現する患者を特定するために使用される。ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期の範囲は、約１０〜約４０時間であり、存在するＶＷＦのレベルにおいて少なくとも一部分において異なる。しかしながら、平均して、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期は、約１８時間である。一般に、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃは、平均レベルのＶＷＦを有する個人に投与される場合、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期と比較して、高レベルのＶＷＦを有する患者において少なくとも約１．２倍の増加した半減期を示す。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃは、平均レベルのＶＷＦを有する個人に投与される場合、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期と比較して、少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍の増加した半減期を示す。一実施形態において、高レベルのＶＷＦを発現する対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期は、少なくとも約２０時間〜約４０時間である。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期は、少なくとも約２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、または４０時間である。一実施形態において、高レベルのＶＷＦを発現する対象におけるＦＶＩＩＩ−Ｆｃの半減期は、約２０〜約２７時間である。したがって、一実施形態において、平均値と比較したＦＶＩＩＩ−Ｆｃの増加した半減期は、本発明の長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドを用いたより長い投与間隔にふさわしい対象を示す。
別の実施形態において、短時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドの半減期が、高レベルのＶＷＦを発現する患者を特定するために使用される。本明細書で使用される「短時間作用型ＦＶＩＩＩ」という用語は、半減期延長要素を添加しないＦＶＩＩＩポリペプチドを指す。一実施形態において、短時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドは、完全長またはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩからなる。短時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドの例は、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）である。
短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期はまた、ＶＷＦレベルに応じて少なくとも一部分において異なるため、短時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドはまた、本発明の長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドのより長い投与間隔にふさわしい患者を特定するために使用することもできる。一実施形態において、短時間作用型ＦＶＩＩＩは、平均レベルのＶＷＦを有する個人に投与される場合の短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期と比較して、高レベルのＶＷＦを発現する個人において少なくとも約１．２倍の増加した半減期を示す。別の実施形態において、短時間作用型ＦＶＩＩＩは、平均レベルのＶＷＦを有する個人に投与される場合の短時間作用型ＦＶＩＩＩの半減期と比較して、高レベルのＶＷＦを発現する個人において少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５倍の増加した半減期を示す。したがって、個人が短時間作用型ＦＶＩＩＩを投与される場合、少なくとも約１．２倍の半減期を示す個人は、本発明の長時間作用型ＦＶＩＩＩポリペプチドを用いたより長い投与間隔にふさわしい。
本明細書で使用される「投与間隔」は、対象に投与される複数回投与間で経過する投与時間を意味する。投与間隔の比較は、単一の対象において、または対象集団において実行することができ、次いで、その集団において得られた平均を計算することができる。
キメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、例えば、本発明のキメラ第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃポリペプチド（第ＶＩＩＩ因子またはハイブリッドを含むポリペプチド）を投与する場合の投与間隔は、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５倍長くあり得る。投与間隔は、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５〜６倍長いか、１．５〜５倍長いか、１．５〜４倍長いか、１．５〜３倍長いか、または１．５〜２倍長くあり得る。投与間隔は、非第ＶＩＩＩ因子部分を含まない、例えば、Ｆｃ部分を含まない等価用量の当該第ＶＩＩＩ因子（当該第ＶＩＩＩ因子からなるポリペプチド）に必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５．５．５、または６倍長くあり得る。投与間隔は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日ごと、またはそれ以上であり得る。投与間隔は、少なくとも約１．５〜５、１．５、２、３、４、もしくは５日、またはそれ以上であり得る。オンデマンド治療については、当該キメラポリペプチドまたはハイブリッドの投与間隔は、２４〜３６、２４〜４８、２４〜７２、２４〜９６、２４〜１２０、２４〜１４４、２４〜１６８、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間ごとまたはそれ以上で約１回である。
一実施形態において、有効量は、２５〜８０ＩＵ／ｋｇ（２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、もしくは８０ＩＵ／ｋｇ）であり、投与間隔は、３〜５、３〜６、３〜７、３、４、５、６、７、もしくは８日ごとまたはそれ以上で１回、または１週間ごとに３回、または１週間ごとに３回以下である。一実施形態において、有効量は、８０ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、３日ごとに１回である。さらなる実施形態において、３日ごとの投与間隔で与えられる８０ＩＵ／ｋｇの有効量を、小児対象に投与する。別の実施形態において、有効量は、６５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔は、１週間に１回、または６〜７日ごとに１回である。この用量は、必要である限り、繰り返しされ得る（例えば、少なくとも１０、２０、２８、３０、４０、５０、５２、または５７週間、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年間）。
ある特定の実施形態において、オンデマンド治療のための有効量は、２０〜５０ＩＵ／Ｋｇ（２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ＩＵ／ｋｇ）である。オンデマンド治療は、１回の投与または繰り返し投与であり得る。繰り返し投与については、投与間隔は、１２〜２４時間ごと、２４〜３６時間ごと、２４〜４８時間ごと、３６〜４８時間ごと、または４８〜７２時間ごとであり得る。
「長時間作用型第ＶＩＩＩ因子」は、参照第ＶＩＩＩ因子を上回る増加した半減期（本明細書中で、ｔ１／２、ｔ１／２ベータ、排出半減期、およびＨＬと称される）を有する第ＶＩＩＩ因子である。長時間作用型第ＶＩＩＩ因子の増加した半減期は、１つ以上の非第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、例えば、Ｆｃ、ＸＴＥＮ、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリン、ＣＴＰ（４つのＯ−グリカンを有するｈＣＧの２８アミノ酸Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合ポリペプチド、アルブミン結合小分子等、またはそれらの２つ以上の組み合わせに対する融合によるものであり得る。増加した半減期は、例えば、ペグ化等の１つ以上の修飾によるものであり得る。例となる長時間作用型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、例えば、Ｆｃを含むキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ＸＴＥＮを含むキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、およびアルブミンを含むキメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが含まれる。さらなる例となる長時間作用型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、例えば、ペグ化第ＶＩＩＩ因子が含まれる。
長時間作用型キメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの場合、「参照」ポリペプチドは、例えば、Ｆｃ部分、ＸＴＥＮ部分、またはアルブミン部分を含まない同じ第ＶＩＩＩ因子部分等のキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分から本質的になるポリペプチドである。同様に、修飾第ＶＩＩＩ因子の場合、参照ポリペプチドは、修飾されていない同じ第ＶＩＩＩ因子、例えば、ペグ化されていない第ＶＩＩＩ因子である。
幾つかの実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、対象に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
約１４〜４１．３時間の当該対象における平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
約１．２２〜５．１９ｍＬ／時間／ｋｇ以下の当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約１１〜２６．４時間の当該対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約１．３８〜２．８８ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
約３７．７〜７９．４ｍＬ／ｋｇの当該対象におけるＶｓｓ（活性）、および
１ＩＵ／ｋｇ当たり約１９．２〜８１．７ＩＵ＊ｈ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣ／用量。
幾つかの実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、患者集団に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
１ＩＵ／ｋｇ当たり１．３８ＩＵ／ｄＬを超える平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり少なくとも約１．５、少なくとも約１．８５、もしくは少なくとも約２．４６ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
約２．３３±１．０８ｍＬ／時間／ｋｇ以下の当該患者集団における平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
約１．８〜２．６９ｍＬ／時間／ｋｇの当該患者集団における平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
修飾がなく当該第ＶＩＩＩ因子を含むポリペプチドのクリアランスの約６５％である当該患者集団における平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
少なくとも約２６．３±８．３３時間の当該患者集団における平均平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
約２５．９〜２６．５時間の当該患者集団における平均ＭＲＴ（活性）、修飾がなく当該第ＶＩＩＩ因子を含むポリペプチドの平均ＭＲＴよりも約１．５倍長い当該患者集団における平均ＭＲＴ（活性）、
約１８．３±５．７９時間の当該患者集団における平均ｔ１／２ベータ（活性）、
約１８〜１８．４時間である当該患者集団における平均ｔ１／２ベータ（活性）、
修飾がなく当該第ＶＩＩＩ因子を含むポリペプチドの平均ｔ１／２ベータよりも約１．５倍長い当該患者集団における平均ｔ１／２ベータ（活性）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．０１±０．４４ＩＵ／ｄＬの当該患者集団における平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約１．８５〜２．４６ＩＵ／ｄＬの当該患者集団における平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
修飾がなく当該第ＶＩＩＩ因子を含むポリペプチドの平均増分回収率の約９０％である当該患者集団における平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
約５５．１±１２．３ｍＬ／ｋｇの当該患者集団における平均Ｖｓｓ（活性）、
約４５．３〜５６．１ｍＬ／ｋｇの当該患者集団における平均Ｖｓｓ（活性）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約４９．９±１８．２ＩＵ＊ｈ／ｄＬの当該患者集団における平均ＡＵＣ／用量（活性）、
１ＩＵ／ｋｇ当たり約４４．８〜５７．６ＩＵ＊ｈ／ｄＬの当該患者集団における平均ＡＵＣ／用量（活性）。
他の実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、患者集団に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
キメラポリペプチドが投与された当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳが、一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳに匹敵する、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約６０．５ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±１ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±２ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±３ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±４ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±５ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±６ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±７ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±８ＩＵ／ｄＬ、約６０．５±９ＩＵ／ｄＬ、もしくは約６０．５±１０ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約５３．１〜６９ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１１９ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１ＩＵ／ｄＬ、約１１９±２ＩＵ／ｄＬ、約１１９±３ＩＵ／ｄＬ、約１１９±４ＩＵ／ｄＬ、約１１９±５ＩＵ／ｄＬ、約１１９±６ＩＵ／ｄＬ、約１１９±７ＩＵ／ｄＬ、約１１９±８ＩＵ／ｄＬ、約１１９±９ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１０ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１１ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１２ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１３ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１４ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１５ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１６ＩＵ／ｄＬ、約１１９±１７ＩＵ／ｄＬ、もしくは約１１９±１８ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１０３〜１３６ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約７６．５ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±２ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±３ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±４ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±５ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±６ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±７ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±８ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±９ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１０ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１１ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１２ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１３ＩＵ／ｄＬ、約７６．５±１４ＩＵ／ｄＬ、もしくは約７６．５±１５ＩＵ／Ｄｌの当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約６４．９〜９０．１ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１８２ＩＵ／ｄＬ、約１８２±２ＩＵ／ｄＬ、約１８２±４ＩＵ／ｄＬ、約１８２±６ＩＵ／ｄＬ、約１８２±８ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１０ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１２ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１４ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１６ＩＵ／ｄＬ、約１８２±１８ＩＵ／ｄＬ、もしくは約１８２±２０ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ、または
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１４６〜２２７ＩＵ／ｄＬ、約１４６±５ＩＵ／ｄＬ、約１４６±１０ＩＵ／ｄＬ、約２２７±５ＩＵ／ｄＬ、もしくは約１４６±１０ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＣｍａｘ＿ＯＢＳ。
ある特定の実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、患者集団に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるｔ１／２ベータ（活性）よりも少なくとも１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、または１．９０倍高い当該対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される場合、約１８．８時間、１８．８±１時間、１８．８±１時間、１８．８±２時間、１８．８±３時間、１８．８±４時間、１８．８±５時間、１８．８±６時間、１８．８±７時間、１８．８±８時間、１８．８±９時間、１８．８±１０時間、もしくは１８．８±１１時間の当該対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される場合、約１４．３〜２４．５時間の当該対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される場合、約１６．７時間、１６．７±１時間、１６．７±２時間、１６．７±３時間、１６．７±４時間、１６．７±５時間、１６．７±６時間、１６．７±７時間、１６．７±８時間、１６．７±９時間、１６．７±１０時間、もしくは１６．７±１１時間の当該対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される場合、約１３．８〜２０．１時間の当該対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される場合、約１９．８時間、１９．８±１時間、１９．８±２時間、１９．８±３時間、１９．８±４時間、１９．８±５時間、１９．８±６時間、１９．８±７時間、１９．８±８時間、１９．８±９時間、１９．８±１０時間、もしくは１９．８±１１時間の当該対象におけるｔ１／２ベータ（活性）、または
二段階（発色）アッセイによって測定される場合、約１４．３〜２７．５時間の当該対象におけるｔ１／２ベータ（活性）。
ある特定の実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、患者集団に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）が、一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるクリアランスよりも０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６０、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、または０．７０倍低い、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１．６８ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．１ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．２ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．３ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．４ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．５ｍＬ／時間／ｋｇ、１．６８±０．６ｍＬ／時間／ｋｇ、もしくは１．６８±０．７ｍＬ／時間／ｋｇの当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１．３１〜２．１５ｍＬ／時間／ｋｇの当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約２．３２ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．１ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．２ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．３ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．４ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．５ｍＬ／時間／ｋｇ、２．３２±０．６ｍＬ／時間／ｋｇ、もしくは２．３２±０．７ｍＬ／時間／ｋｇの当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約１．６４〜３．２９ｍＬ／時間／ｋｇの当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１．４９ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．１ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．２ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．３ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．４ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．５ｍＬ／時間／ｋｇ、１．４９±０．６ｍＬ／時間／ｋｇ、もしくは１．４９±０．７ｍＬ／時間／ｋｇの当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１．１６〜１．９２ｍＬ／時間／ｋｇの当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１．５２ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．１ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．２ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．３ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．４ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．５ｍＬ／時間／ｋｇ、１．５２±０．６ｍＬ／時間／ｋｇ、もしくは１．５２±０．７ｍＬ／時間／ｋｇの当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）、または
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約１．０５〜２．２０ｍＬ／時間／ｋｇの当該対象におけるクリアランス（ＣＬ）（活性）。
幾つかの実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、患者集団に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
当該対象におけるＭＲＴが、一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるＭＲＴよりも少なくとも１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９０、１．９１、１．９２、または１．９３倍高い、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約２７時間、２７±１時間、２７±２時間、２７±３時間、２７±４時間、２７±５時間、２７±６時間、２７±７時間、２７±８時間、２７±９時間、もしくは２７±１０時間の当該対象におけるＭＲＴ（活性）、
一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約２０．６〜３５．３時間の当該対象におけるＭＲＴ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される、約２３．９〜２８．５時間の当該対象におけるＭＲＴ（活性）、
二段階（発色）アッセイによって測定される、約１９．８〜２８．９時間の当該対象におけるＭＲＴ（活性）、または
二段階（発色）アッセイによって測定される、約２０．５〜３９．６時間の当該対象におけるＭＲＴ（活性）。
他の実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、患者集団に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象における増分回収率に匹敵する当該対象における増分回収率、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．４４ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．１ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．２ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．３ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．４ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．５ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．６ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．７ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．８ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±０．９ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±１．０ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±１．１ＩＵ／ｄＬ、もしくは１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４４±１．２ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．１２〜２．８１ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１．８３ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．１ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．２ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．３ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．４ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．５ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．６ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．７ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．８ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±０．９ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±１．０ＩＵ／ｄＬ、もしくは１ＩＵ／ｋｇ当たり１．８３±１．１ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１．５９〜２．１０ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約３．０９ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．１ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．２ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．３ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．４ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．５ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．６ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．７ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．８ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．９ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±１．０ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±１．１ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±１．２ＩＵ／ｄＬ、もしくは１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±１．３ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．８０ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．１ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．２ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．３ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．４ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．５ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．６ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．７ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．８ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±０．９ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±１．０ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±１．１ＩＵ／ｄＬ、もしくは１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８０±１．２ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．６１〜３．６６ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率、および
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２．２４〜３．５０ＩＵ／ｄＬの当該対象における増分回収率。
さらに他の実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、患者集団に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるＶｓｓ（活性）に匹敵する当該対象におけるＶｓｓ（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約４５．５ｍＬ／ｋｇ、４５．５±１ｍＬ／ｋｇ、４５．５±２ｍＬ／ｋｇ、４５．５±３ｍＬ／ｋｇ、４５．５±４ｍＬ／ｋｇ、４５．５±５ｍＬ／ｋｇ、４５．５±６ｍＬ／ｋｇ、４５．５±７ｍＬ／ｋｇ、４５．５±８ｍＬ／ｋｇ、４５．５±９ｍＬ／ｋｇ、４５．５±１０ｍＬ／ｋｇ、もしくは４５．５±１１ｍＬ／ｋｇの当該対象におけるＶｓｓ（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約３９．３〜５２．５ｍＬ／ｋｇの当該対象におけるＶｓｓ（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約６２．８ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１ｍＬ／ｋｇ、６２．８±２ｍＬ／ｋｇ、６２．８±３ｍＬ／ｋｇ、６２．８±４ｍＬ／ｋｇ、６２．８±５ｍＬ／ｋｇ、６２．８±６ｍＬ／ｋｇ、６２．８±７ｍＬ／ｋｇ、６２．８±８ｍＬ／ｋｇ、６２．８±９ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１０ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１１ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１２ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１３ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１４ｍＬ／ｋｇ、６２．８±１５ｍＬ／ｋｇ、もしくは６２．８±１６ｍＬ／ｋｇの当該対象におけるＶｓｓ（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、約５５．２〜７１．５ｍＬ／ｋｇの当該対象におけるＶｓｓ（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約３５．９ｍＬ／ｋｇ、３５．９±１ｍＬ／ｋｇ、３５．９±２ｍＬ／ｋｇ、３５．９±３ｍＬ／ｋｇ、３５．９±４ｍＬ／ｋｇ、３５．９±５ｍＬ／ｋｇ、３５．９±６ｍＬ／ｋｇ、３５．９±７ｍＬ／ｋｇ、３５．９±８ｍＬ／ｋｇ、３５．９±９ｍＬ／ｋｇ、３５．９±１０ｍＬ／ｋｇ、３５．９±１１ｍＬ／ｋｇ、３５．９±１２ｍＬ／ｋｇ、もしくは３５．９±１３ｍＬ／ｋｇの当該対象におけるＶｓｓ（活性）、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約３０．４〜４２．３ｍＬ／ｋｇの当該対象におけるＶｓｓ（活性）、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約４３．４ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１ｍＬ／ｋｇ、４３．４±２ｍＬ／ｋｇ、４３．４±３ｍＬ／ｋｇ、４３．４±４ｍＬ／ｋｇ、４３．４±５ｍＬ／ｋｇ、４３．４±６ｍＬ／ｋｇ、４３．４±７ｍＬ／ｋｇ、４３．４±８ｍＬ／ｋｇ、４３．４±９ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１０ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１１ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１２ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１３ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１４ｍＬ／ｋｇ、４３．４±１５ｍＬ／ｋｇ、もしくは４３．４±１６ｍＬ／ｋｇ当該対象におけるＶｓｓ（活性）、または
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、約３８．２〜４９．２ｍＬ／ｋｇの当該対象におけるＶｓｓ（活性）。
さらに他の実施形態において、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子は、患者集団に投与される場合に以下の特性のうちの１つ以上を有する：
一段階（ａＰＴＴ）アッセイまたは二段階（発色）アッセイによって測定される場合、完全長成熟第ＶＩＩＩ因子からなる同じ量のポリペプチドが投与された対象におけるＡＵＣＩＮＦよりも少なくとも１．４５ １．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９０倍高い当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１４４０±３１６時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１１６０〜１８８０時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１４８０時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±１００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±２００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±３００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±４００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±５００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±６００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±７００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±８００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±９００時間＊ＩＵ／ｄＬ、もしくは１ＩＵ／ｋｇ当たり１４８０±１０００時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２９１０±１３２０時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１９８０〜３９７０時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２８００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±１００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±２００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±３００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±４００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±５００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±６００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±７００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±８００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±９００時間＊ＩＵ／ｄＬ、もしくは１ＩＵ／ｋｇ当たり２８００±１０００時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１６６０時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±１００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±２００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±３００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±４００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±５００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±６００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±７００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±８００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±９００時間＊ＩＵ／ｄＬ、もしくは１ＩＵ／ｋｇ当たり１６６０±１０００時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約２５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約１３００〜２１２０時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約４２８０時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±１００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±２００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±３００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±４００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±５００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±６００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±７００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±８００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±９００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±１０００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±１１００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±１２００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±１３００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±１４００時間＊ＩＵ／ｄＬ、１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±１５００時間＊ＩＵ／ｄＬ、もしくは１ＩＵ／ｋｇ当たり４２８０±１６００時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ、または
約６５ＩＵ／ｋｇのキメラポリペプチドが投与される場合、二段階（発色）アッセイによって測定される、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２９６０〜６１９０時間＊ＩＵ／ｄＬの当該対象におけるＡＵＣＩＮＦ。
本明細書で使用される「オンデマンド治療」は、短期間で行われることを目的とし、出血エピソード等の現状に反応して、または計画された手術等の認識された必要性に対する治療を意味する。オンデマンド治療を必要とし得る状態には、例えば、出血エピソード、関節血症、筋肉出血、口の出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、または腸腰筋鞘内の出血が含まれる。対象は、外科的予防、手術中管理、または外科手術のための処置を必要とし得る。そのような外科手術には、例えば、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、人工膝関節全置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術が含まれる。
一実施形態において、オンデマンド治療は、単回投与で出血（例えば、突発性出血）の８０％超（８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、もしくは１００％）または８０〜１００％、８０〜９０％、８５〜９０％、９０〜１００％、９０〜９５％、もしくは９５〜１００％を解消する。別の実施形態において、出血エピソードの８０％超（８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、もしくは１００％）または８０〜１００％、８０〜９０％、８５〜９０％、９０〜１００％、９０〜９５％、もしくは９５〜１００％が、オンデマンド治療後に医師により優または良と評価される。他の実施形態において、出血エピソードの５％超（６％超、７％超、８％超、９％超、１０％超、１１％超、１２％超、１３％超、１４％超、１５％超、１６％超、１７％超、１８％超、１９％超、２０％超）または５〜２０％、５〜１５％、５〜１０％、１０〜２０％、もしくは１０〜１５％が、オンデマンド治療後に医師により可と評価される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、互換的に使用され、共有結合したアミノ酸残基からなる高分子化合物を指す。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互換的に使用され、共有結合したヌクレオチド残基からなる高分子化合物を指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、もしくは二重鎖、ベクター、プラスミド、ファージ、またはウイルスであり得る。ポリヌクレオチドは、表２のポリペプチドをコードする表１にあるものを含む（表１を参照のこと）。ポリヌクレオチドはまた、例えば、表１のポリヌクレオチドの断片、例えば、第ＶＩＩＩ因子、Ｆｃ、シグナル配列、６Ｈｉｓ、および表２のポリペプチドの他の断片等の表２のポリペプチドの断片をコードするものも含む。
本明細書で使用される「予防的処置」は、対象に長期間にわたって複数回投与で第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを投与して、対象の血漿中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルを増加させることを意味する。増加したレベルは、突発性出血の発生率を低下させるか、または例えば、不測の損傷の場合に出血を予防するために十分であり得る。予防的処置中に、対象中の血漿タンパク質レベルは、当該対象のベースラインレベルよりも低くならないか、または重篤な血友病を特徴付ける第ＶＩＩＩ因子のレベル（＜１ＩＵ／ｄＬ［１％］）よりも低くならない。
一実施形態において、予防レジメンは、例えば、それぞれの患者についてのＰＫデータを決定することにより、そして１〜３％のＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルを維持する投与間隔で本発明の第ＶＩＩＩ因子を投与することにより、個々の患者に対して「合わされる」。調節は、２ヶ月の期間にわたって２以上の突発性出血エピソードと定義される許容できない出血エピソードを対象が経験する場合に、なされ得る。この場合、調節は、３〜５％のトラフレベルを目標とする。別の実施形態において、予防的処置は、出血の予防および制御、出血の持続的制御、出血からの持続的保護、および／または持続的利益が得られる。予防、例えば、持続的保護は、最終測定時点までの増加したＡＵＣ（ＡＵＣ−ＬＡＳＴ）および減少したクリアランスにより示すことができ、その結果、短時間作用型ＦＶＩＩＩと比較して増加した終末ｔ１／２となる。予防は、短時間作用型ＦＶＩＩＩに対して、より良好なＣｍａｘ、より良好なＴｍａｘ、および／またはより良好な平均滞留時間によって示され得る。幾つかの実施形態において、予防は、注射（例えば、最後の注射）後、約２４、３６、４８、７２、または９６時間以内（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９６時間）に、突発性出血エピソードが起こらない。ある特定の実施形態において、予防の結果、１週間に１回の投与で（例えば、６５ＩＵ／ｋｇで）、３０％超（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９６、８７、８８、８９、もしくは９０％、例えば、５０％超）の年間出血エピソードの平均的減少となる。本明細書で使用される「治療用量」は、本明細書に記載される、治療の目的を達成する用量を意味する。第ＶＩＩＩ因子の必要な投与量の計算は、平均で、体重１ｋｇ当たり１ＩＵの第ＶＩＩＩ因子が、血漿第ＶＩＩＩ因子活性を約２ＩＵ／ｄＬ上昇させるという経験的知見に基づく。必要な投与量は、次式により決定される：
必要とされる単位量＝体重（ｋｇ）×所望の第ＶＩＩＩ因子上昇（ＩＵ／ｄＬまたは正常値の％）×０．５（１ＩＵ／ｄＬ当たりＩＵ／ｋｇ）
本発明の方法で使用され得る治療用量は、約１０〜約１００ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ＩＵ／ｋｇである。
本発明の方法で使用され得るさらなる治療用量は、約１０〜約１５０ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、約１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、約１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ＩＵ／ｋｇである。
本明細書で使用される「変異体」とは、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その基本的な特性、例えば第ＶＩＩＩ因子の凝固活性またはＦｃ（ＦｃＲｎ結合）活性を保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一般的に、変異体は、全体的に非常に類似し、多くの領域で元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。変異体は、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片、元のポリペプチドの欠失、挿入、および修飾された変形を含む。
変異体ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１、３、または５中のヌクレオチドコード配列（第ＶＩＩＩ因子部分、Ｆｃ部分、個別にもしくは一緒に）またはそれに相補的な鎖、本明細書で参照される刊行物および特許に開示されているもの等の公知の突然変異体および組換え型第ＶＩＩＩ因子またはＦｃのヌクレオチドコード配列またはそれに相補的な鎖、配列番号２、４、または６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（第ＶＩＩＩ因子部分、Ｆｃ部分、個別にもしくは一緒に）、ならびに／またはこれらの核酸分子のいずれかのポリヌクレオチド断片（例えば、本明細書に記載されるこれらの断片）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含み得るか、またはこのヌクレオチド配列からなり得る。また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件または低ストリンジェントな条件下で、これらの核酸分子にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、それらが機能的である限り、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、変異体として含まれる。
変異体ポリペプチドは、例えば、配列番号２、４、または６に示されるポリペプチド配列（第ＶＩＩＩ因子部分、Ｆｃ部分、個別にもしくは一緒に）、ならびに／またはこれらのポリペプチドのいずれかのポリペプチド断片（例えば、本明細書に記載されるこれらの断片）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、またはこのアミノ酸配列からなり得る。
参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有する核酸とは、この核酸のヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチドにつき最高で５つの点突然変異を含み得ることを除けば、参照配列と同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸を得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失しているか、別のヌクレオチドで置換されてもよいか、または参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの複数のヌクレオチドが参照配列中に挿入されてもよい。クエリー配列は、例えば、配列番号１または３に示される配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書に記載される、特定される任意の断片であってもよい。
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチドと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを用いて通常通り決定することができる。グローバル配列アラインメントと称される、クエリー配列（参照または元の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列アラインメントにおいて、クエリーおよび対象配列はともに、ＤＮＡ配列である。ＵをＴに変換することによって、ＲＮＡ配列を比較することができる。当該グローバル配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで表される。別の実施形態において、同一性パーセントを計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用されるパラメーターは、マトリックス＝単一、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方である。
対象配列が、内部欠失のためではなく、５’または３’欠失のためにクエリー配列よりも短い場合、結果に対して手作業で補正を行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを計算する場合に、対象配列の５’および３’短縮化を考慮しないためである。５’または３’末端で短縮された対象配列については、クエリー配列と比較して、一致／アラインされない、対象配列の５’および３’であるクエリー配列の塩基数をクエリー配列の総塩基のパーセントとして計算することによって、同一性パーセントが補正される。ヌクレオチドが、一致／アラインされるかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから減算され、最終の同一性パーセントスコアをもたらす。この補正されたスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。クエリー配列と一致／アラインされない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって示される、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントスコアの手作業による調節の目的のために計算される。
例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために、１００塩基のクエリー配列とアラインされる。欠失は、対象配列の５’末端で起こり、したがって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端の最初の１０塩基の一致／アラインメントを示さない。１０個の不対塩基が、配列の１０％（一致しない５’末端および３’末端の塩基の数／クエリー配列中の塩基の総数）であるため、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから減算される。残りの９０塩基が、完全に一致した場合、最終の同一性パーセントは、９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリー配列と比較される。今度は、欠失が内部欠失であるため、クエリーと一致／アラインしない塩基は、対象配列の５’または３’にはない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは、手作業で補正されない。再度、クエリー配列と一致／アラインしない、対象配列の塩基の５’および３’の塩基のみが、手作業で補正される。他の手作業の補正は、本発明の目的のためには行われない。
本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸につき最高で５個のアミノ酸改変を含み得ることを除けば、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、クエリー配列と同一であることを意図している。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中のアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消失）、または別のアミノ酸で置換されてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、あるいは参照配列中の残基間に個々に、または参照配列内の１つ以上の連続基のどちらかに散在する、これらの末端位置の間のどこでも起こり得る。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２（第ＶＩＩＩ因子部分、Ｆｃ部分、個々にもしくは一緒に）もしくは４のアミノ酸配列、または公知の第ＶＩＩＩ因子もしくはＦｃポリペプチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを用いて従来通り決定することができる。一実施形態において、グローバル配列アラインメントと称される、クエリー配列（参照または元の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列アラインメントでは、クエリーおよび対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるか、両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。当該グローバル配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで表される。別の実施形態において、ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用されるパラメーターは、マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方である。
対象配列が、内部欠失のためではなく、Ｎ末端またはＣ末端欠失のため、クエリー配列よりも短い場合、結果に対して手作業で補正を行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバル同一性パーセントを計算する場合に、対象配列のＮ末端およびＣ末端短縮化を考慮しないためである。Ｎ末端およびＣ末端で短縮された対象配列については、クエリー配列と比較して、対応する対象残基と一致／アラインされない、対象配列のＮ末端およびＣ末端であるクエリー配列の残基数をクエリー配列の総塩基のパーセントとして計算することによって、同一性パーセントが補正される。残基が、一致／アラインされるかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから減算され、最終の同一性パーセントスコアをもたらす。この最終の同一性パーセントスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。クエリー配列と一致／アラインされない、対象配列のＮ末端およびＣ末端の残基のみが、同一性パーセントスコアを手作業で調節する目的のためのものと見なされる。すなわち、クエリー残基のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端の残基の外側に位置合わせされる。
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために、１００残基のクエリー配列とアラインされる。欠失は、対象配列のＮ末端で起こり、したがって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／アラインメントを示さない。１０個の不対残基が、配列の１０％（一致しないＮ末端およびＣ末端の残基の数／クエリー配列中の残基の総数）であるため、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから減算される。残りの９０残基が、完全に一致した場合、最終同一性パーセントは、９０％である。別の例では、９０残基の対象配列が、１００残基のクエリー配列と比較される。今度は、欠失が内部欠失であるため、クエリーと一致／アラインしない対象配列のＮ末端およびＣ末端の残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは、手作業で補正されない。再度、ＦＡＳＴＤＢアラインメントに示される、クエリー配列と一致／アラインしない、対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが、手作業で補正される。他の手作業の補正は、本発明の目的のためには行われない。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、または両方で改変を含んでもよい。一実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、コード化されたポリペプチドの特性もしくは活性を改変しない改変を含む。別の実施形態において、ヌクレオチド変異体は、遺伝コードの縮重によるサイレント置換によって産生される。他の実施形態において、５〜１０、１〜５、または１〜２個のアミノ酸が、任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されている変異体。例えば、特定の宿主に対してコドン発現を最適化すること（例えば、大腸菌等の細菌宿主等の他のものにヒトｍＲＮＡ中のコドンを変化させること）等の様々な理由で、ポリヌクレオチド変異体を産生することができる。
天然に存在する変異体は、「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の幾つかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立変異体は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルのいずれかで異なってよく、および本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技法または直接合成によって産生してもよい。
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技法の公知の方法を用いて、ポリペプチドの特徴を改善または改変するために変異体が作製され得る。例えば、生物学的機能の実質的な損失を伴わずに、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から、１つ以上のアミノ酸を欠失させることができる。Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、３、８、または２７のアミノ酸末端アミノ酸残基を欠失後でさえ、ヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０アミノ酸残基の欠失後に、最高１０倍まで高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
さらに、十分な証拠により、変異体は多くの場合、天然に存在するタンパク質のものと類似した生物学的活性を保持することが示される。例えば、Ｇａｙｌｅおよび共同研究者（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの大規模な突然変異分析を行った。彼らは、ランダムな突然変異誘発を使用して、分子の全長にわたって、１変異体当たり平均して２．５個のアミノ酸の変化がある、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ突然変異体を作製した。あらゆる可能なアミノ酸位置で複数の突然変異を調査した。研究者らは、「結合または生物活性」のいずれかにほとんど影響することなく、分子の「大」部分が改変できることを見出した。（要約を参照のこと）。実際、調査した３，５００を超えるヌクレオチド配列のうち、わずか２３の独自のアミノ酸配列だけが、野生型とは活性が有意に異なるタンパク質を産生した。
前述のように、ポリペプチド変異体には、例えば、修飾ポリペプチドが含まれる。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０−７９（２０１０）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡが仲介するタンパク質へのアミノ酸の付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン化が挙げられる。幾つかの実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は、任意の都合のよい位置で、修飾される、例えば、ペグ化される。幾つかの実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子の表面に露出したアミノ酸で、例えば、操作されたシステインであり得る表面に露出したシステインでペグ化される。上記参照。幾つかの実施形態において、修飾された第ＶＩＩＩ因子、例えば、ペグ化第ＶＩＩＩ因子は、長時間作用型第ＶＩＩＩ因子である。
本明細書で使用される「定常状態での分布体積（Ｖｓｓ）」は、薬物が分配される見かけの空間（体積）という、薬理学で用いられるこの用語と同じ意味を有する。Ｖｓｓ＝定常状態の血漿濃度で割った体内の薬剤の量。
本明細書で範囲について使用される場合、「約」は、その範囲の両端を修飾する。したがって、「約１０〜２０」は、「約１０〜約２０」を意味する。
本明細書で使用されるキメラポリペプチドは、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子もしくは一本鎖第ＶＩＩＩ因子またはその組み合わせを含み得る。本明細書で使用される「プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子」は、（完全長第ＶＩＩＩ因子に対しては）アルギニン１６４８または（Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子に対しては）アルギニン７５４で、すなわち、細胞内プロセシング部位で切断される第ＶＩＩＩ因子を意味する。細胞内プロセシング部位での切断により、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子は、第１の鎖が重鎖であり、第２の鎖が軽鎖である２つのポリペプチド鎖を含む。例えば、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、Ｆｃと融合する重鎖および軽鎖）は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、それぞれ約９０ｋＤａおよび１３０ｋＤａ、ならびに還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、それぞれ９０ｋＤａおよび１０５ｋＤａで泳動する。したがって、一実施形態において、キメラポリペプチド中の第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である。別の実施形態において、キメラポリペプチド中の第ＶＩＩＩ因子部分の約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である。特定の実施形態において、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドから精製（または単離）され、キメラポリペプチド中の第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である。
本明細書で使用される「一本鎖第ＶＩＩＩ因子」、「ＳＣ第ＶＩＩＩ因子」、または「ＳＣＦＶＩＩＩ」は、アルギニン部位（完全長第ＶＩＩＩ因子に対しては残基１６４８（すなわち、配列番号６の残基１６６７）、またはＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子に対しては残基７５４（すなわち、配列番号２の残基７７３）で切断されていない第ＶＩＩＩ因子を意味する。したがって、本明細書で使用されるキメラポリペプチド中の一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、一本鎖を含む。一実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、無傷の細胞内プロセシング部位を含有する。別の実施形態において、本発明の一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、完全長第ＶＩＩＩ因子において、アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異、またはアルギニン１６４５およびアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置での置換もしくは突然変異を含む。他の実施形態において、アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸は、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸とは異なるアミノ酸である。ある特定の実施形態において、置換または突然変異は、アルギニン以外のアミノ酸、例えば、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、オルニチン、ピロリシン、またはタウリンである。一本鎖第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ融合タンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約２２０ｋＤａおよび還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約１９５ｋＤａで泳動する。
一実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドから精製（または単離）され、本明細書で使用されるキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。別の実施形態において、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。他の実施形態において、本明細書で使用されるキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約１％〜約１０％、約５％〜約１５％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２５％、約２０％〜約３０％、約２５％〜約３５％、約３０％〜約４０％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。特定の実施形態において、本明細書で使用されるキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％ 約２５％、約３０％、約３５％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。他の実施形態において、本明細書で使用されるキメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドの一本鎖第ＶＩＩＩ因子とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子との比率は、（ａ）約２５％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約７５％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｂ）約２０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約８０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｃ）約１５％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約８５％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｄ）約１０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約９０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｅ）約５％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約９５％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｆ）約１％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約９９％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｇ）約１００％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｈ）約３０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約７０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｉ）約３５％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約６５％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、または（ｊ）約４０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約６０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子である。他の実施形態において、キメラポリペプチドの一本鎖第ＶＩＩＩ因子とプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子との比率は、（ａ）約３０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約７０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｂ）約４０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約６０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｃ）約５０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約５０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｄ）約６０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約４０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｅ）約７０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約３０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｆ）約８０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約２０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｇ）約９０％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約１０％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｈ）約９５％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約５％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、（ｉ）約９９％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子および約１％のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子、または（ｊ）約１００％の一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。
本明細書で使用されるキメラポリペプチド中の第ＶＩＩＩ因子部分は、第ＶＩＩＩ因子活性を有する。第ＶＩＩＩ因子活性は、当技術分野であらゆる公知の方法によって測定することができる。例えば、これらの方法のうちの１つが、発色アッセイであり得る。発色アッセイの機構は、血液凝固カスケードの原理に基づき、そこでは活性化第ＶＩＩＩ因子は、活性化第ＩＸ因子、リン脂質、およびカルシウムイオンの存在下で、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を加速させる。第Ｘａ因子活性は、第Ｘａ因子に特異的なｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解によって評価される。４０５ｎＭで測定されるｐ−ニトロアニリドの放出の初期速度は、第Ｘａ因子活性に正比例し、ひいては、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子活性に正比例する。この発色アッセイは、国際血栓止血学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｓｉｓ）（ＩＳＴＨ）の科学的標準化委員会（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＳＳＣ）の第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の小委員会によって推奨される。１９９４年以降、発色アッセイはまた、ＦＶＩＩＩ濃縮物の力価の割り当てのためのヨーロッパ薬局方の参照方法でもある。したがって、一実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子活性が発色アッセイによってインビトロで測定される場合、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチド（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチド）に匹敵する第ＶＩＩＩ因子活性を有する。
別の実施形態において、本発明の一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチド（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチド）に匹敵する第Ｘａ因子の発生率を有する。
第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化するために、活性化第ＩＸ因子（第ＩＸａ因子）は、Ｃａ２＋、膜リン脂質、および第ＶＩＩＩ因子の補因子の存在下で、第Ｘ因子の１つのアルギニン−イソロイシン結合を加水分解して、第Ｘａ因子を形成する。したがって、第ＶＩＩＩ因子と第ＩＸ因子との相互作用は、凝固経路において決定的に重要である。ある特定の実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチド（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチド）に匹敵する割合で第ＩＸａ因子と相互作用することができる。
加えて、第ＶＩＩＩ因子は、循環において不活性であるが、フォンウィルブランド因子と結合する。第ＶＩＩＩ因子は、ｖＷＦと結合しない場合、急速に分解され、トロンビンの作用によってｖＷＦから放出される。幾つかの実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチド（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチド）に匹敵するレベルでフォンウィルブランド因子と結合する。
第ＶＩＩＩ因子は、カルシウムおよびリン脂質の存在下で、活性化プロテインＣによって不活性化され得る。活性化プロテインＣは、Ａ１ドメイン内のアルギニン３３６後の第ＶＩＩＩ因子の重鎖を切断し、これが第Ｘ因子基質の相互作用部位を撹乱し、Ａ２ドメイン内のアルギニン５６２後を切断し、これがＡ２ドメインの解離を促進し、第ＩＸａ因子を有する相互作用部位を撹乱する。この切断はまた、Ａ２ドメイン（４３ｋＤａ）を分割し、Ａ２−Ｎ（１８ｋＤａ）およびＡ２−Ｃ（２５ｋＤａ）ドメインを生成する。したがって、活性化プロテインＣは、重鎖中の複数の切断部位を触媒することができる。一実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチド（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチド）に匹敵するレベルで活性化プロテインＣによって不活性化される。
他の実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチド（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチド）に匹敵するインビボの第ＶＩＩＩ因子活性を有する。特定の実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、血友病Ａマウス尾静脈切断モデルにおいて、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチド（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチド）に匹敵するレベルで血友病Ａマウスを保護することができる。
本明細書で使用される「匹敵する」という用語は、キメラポリペプチドを用いることから得られる比較される割合またはレベルが、基準の割合またはレベルと等しい、実質的に等しい、または同様であることを意味する。本明細書で使用される「同様」という用語は、比較される割合またはレベルが、基準の割合またはレベル（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチドによるＦＸａの発生率）との１０％を超えないまたは１５％を超えない差異を有することを意味する。「実質的に等しい」という用語は、比較される割合またはレベルが、基準の割合またはレベルとの０．０１％、０．５％、または１％以下の差異を有することを意味する。
本発明はさらに、第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドを含む組成物を含み、そこでキメラポリペプチドの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子部分および第２の部分を含む。別の実施形態において、組成物中のキメラポリペプチドの約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。他の実施形態において、第２の部分は、Ｆｃ、ＸＴＥＮ、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリンもしくはＣＴＰ（４つのＯ−グリカンを有するｈＣＧの２８アミノ酸Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合ポリペプチド、アルブミン結合小分子、またはそれらの２つ以上の組み合わせである。さらに他の実施形態において、本発明の組成物は、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドおよび一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドの組み合わせを含み、（ａ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約３０％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約７０％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、（ｂ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約４０％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約６０％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、（ｃ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約５０％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約５０％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、（ｄ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約６０％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約４０％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、（ｅ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約７０％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約３０％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、（ｆ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約８０％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約２０％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、（ｇ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約９０％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約１０％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、（ｈ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約９５％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約５％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、（ｉ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約９９％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子であり、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約１％がプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子であるか、または（ｊ）キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子部分の約１００％が一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、第ＶＩＩＩ因子活性が発色アッセイによってインビトロで測定される場合、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含む組成物（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチドを含む組成物）に匹敵する第ＶＩＩＩ因子活性を有する。
他の実施形態において、本発明の組成物は、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含む組成物（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチドを含む組成物）に匹敵する第Ｘａ因子の発生率を有する。さらに他の実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む組成物は、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含む組成物（例えば、２つのＦｃ部分と、１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチドを含む組成物）に匹敵する割合で第ＩＸａ因子と相互作用することができる。さらなる実施形態において、本発明の組成物のキメラポリペプチド中の一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、組成物（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチドを含む組成物）のキメラポリペプチド中のプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルで、活性化プロテインＣによって不活性化される。特定の実施形態において、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む組成物は、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含む組成物（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチドを含む組成物）に匹敵するインビボの第ＶＩＩＩ因子活性を有する。幾つかの実施形態において、本発明の一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含む組成物は、血友病Ａマウス尾静脈切断モデルにおいて、プロセシングされた第ＶＩＩＩ因子を含む組成物（例えば、２つのＦｃ部分と、２つのＦｃ部分のうちの１つと融合するプロセシングされた第ＶＩＩＩ因子とから本質的になるか、またはそれらからなるキメラポリペプチドを含む組成物）に匹敵するレベルで血友病Ａマウスを保護することができる。
本発明はさらに、本発明の組成物を用いてヒト対象における出血性状態を治療するための方法を提供する。例となる方法は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドを含む治療上有効量の薬学的組成物／製剤を、それを必要とする対象に投与することを含み、キメラポリペプチドの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％が、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子部分および第２の部分を含む。
出血性状態は、血液凝固障害によって引き起こされ得る。血液凝固障害はまた、凝血障害と称され得る。一例において、本開示の薬学的組成物で治療することができる血液凝固障害は、血友病またはフォンウィルブランド病（ｖＷＤ）である。別例において、本開示の薬学的組成物で治療することができる血液凝固障害は、血友病Ａである。
幾つかの実施形態において、出血性状態と関連する出血の種類は、関節血症、筋肉出血、口の出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、または腸腰筋鞘内の出血から選択される。
他の実施形態において、出血性状態を患っている対象は、例えば、外科的予防または手術中管理を含む、外科手術のための処置を必要とする。一例において、外科手術は、小手術および大手術から選択される。例となる外科的手技には、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術（例えば、人工膝関節全置換術、人工股関節置換手術等）、心臓手術、および帝王切開術が含まれる。
別例において、対象は、ＦＩＸを用いて同時に治療される。本発明の化合物は、ＦＩＸａを活性化することができるため、対象へのＦＩＸａの投与前に、ＦＩＸａポリペプチドを予め活性化させるために使用され得る。
本発明の方法は、予防的処置またはオンデマンド治療を必要とする対象に対して実施することができる。
一本鎖第ＶＩＩＩ因子の少なくとも３０％を含む薬学的組成物は、例えば、局所（例えば、経皮もしくは眼球）、経口、口腔、経鼻、膣内、直腸、または非経口投与を含む、あらゆる適切な投与様式のために製剤化され得る。
本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、鞘内、眼球内、眼周囲、眼窩内、滑液嚢内、および腹腔内注射、ならびに任意の同様な注射または注入法を含む。組成物はまた、例えば、懸濁液、乳液、徐放性製剤、クリーム剤、ゲル、または粉末であり得る。組成物は、トリグリセリド等の従来の結合剤および担体とともに坐剤として製剤化することができる。
一例において、薬学的製剤は、液体製剤、例えば、緩衝等張水溶液である。別例において、薬学的組成物は、生理的または生理的に近いｐＨを有する。他の例において、水性製剤は、生理的または生理的に近いオスモル濃度および塩分を有する。それは、塩化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムを含有し得る。幾つかの例において、本発明の組成物は、凍結乾燥される。
これまで詳細に本発明を説明してきたが、本発明の理解は、以下の実施例を参照することにより、さらに明確になり、これらは、例示のみの目的で本明細書に含まれ、本発明の限定を限定するものではない。本明細書で言及するすべての特許および刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。
（実施例１）
ｒＦＶＩＩＩＦｃのクローニング、発現、および精製
すべての分子生物学的手順は、標準的な技術に従って行われた。天然シグナル配列を含むヒトＦＶＩＩＩのコード配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１３２）は、ヒト肝臓ポリＡ ＲＮＡから、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって得られた。ＦＶＩＩＩのサイズが大きいため、コード配列は、別々のＲＴ−ＰＣＲ反応から幾つかのセクションで得られ、一連のＰＣＲ反応、制限消化、セリン７４３（Ｓ７４３）のグルタミン１６３８（Ｑ１６３８）への融合を有するＢドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩコード領域を含有する中間クローニングベクターへのライゲーション、完全長ＦＶＩＩＩのＢドメインから２６８２ｂｐを消去することによって組み立てられた。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１４７３５）は、白血球ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって得られ、最終発現カセットは、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列が介在するリンカーなしでＦｃ配列（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ＩｇＧ１配列のＤ２２１で開始、ＥＵ番号付け）のＮ末端に直接融合するような方法で作製された。Ｆｃ鎖のみの発現のためには、マウスＩｇκ（カッパ）軽鎖シグナル配列を、合成オリゴヌクレオチドを用いて作製し、ＰＣＲを用いてＦｃコード配列に付加し、このタンパク質生成物の分泌を可能にした。ＦＶＩＩＩＦｃおよびＦｃ鎖コード配列を、二重発現ベクター、ｐＢｕｄＣＥ４．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。
リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０１３プラスミドでトランスフェクトし、安定した細胞株がゼオシンで選択された。無血清懸濁培養液中で、細胞は増殖され、ＦＶＩＩＩに特異的な親和性精製ステップ（ＭｃＣｕｅ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，１２１６（４５）：７８２４−３０（２００９））、続いて、アニオン交換カラムおよび疎水性相互作用カラムの組み合わせを含む、４つのカラム精製プロセスを用いて、浄化された収穫培地からｒＦＶＩＩＩＦｃタンパク質が精製された。
（実施例２）
生化学的特性決定
プロセシングされた組換えＦＶＩＩＩ−Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）が、２つのポリペプチド鎖として合成され、１６６４アミノ酸の全鎖長については、一方の鎖がＩｇＧ１（２２６アミノ酸、Ｄ２２１からＧ４５６まで延長する、ＥＵ番号付け）のＦｃドメイン（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）と融合するＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（Ｓ７４３−Ｑ１６３８融合、１４３８アミノ酸）からなり、もう一方の鎖が同じＦｃ領域のみ（２２６アミノ酸）からなる。ＦＶＩＩＩＦｃ／Ｆｃ二重発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞は、３つの生成物（ＦＶＩＩＩＦｃ二量体、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体、およびＦｃ二量体）を分泌することが予期されたが、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体およびＦｃ二量体のみが馴化培地中で検出された。非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、精製されたＦＶＩＩＩＦｃが分析された（図２ＡおよびＢ）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、予測された分子量のＦＶＩＩＩＦｃ重鎖（ＨＣ）および軽鎖二量体Ｆｃ融合（ＬＣＦｃ２）と一致する、約９０ｋＤａおよび１３０ｋＤａで泳動するバンドが認められた（図２Ａ、レーン３）。また、一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ（ＳＣ ＦＶＩＩＩＦｃ；ＨＣ＋ＬＣＦｃ２）について予測された分子量と一致する約２２０ｋＤａで第３のバンドが検出され、７５４（完全長配列に対しては１６４８）位でアルギニン残基は、分泌中切断されない。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析については、一本鎖Ｆｃ、ＨＣ、ＬＣＦｃ、およびＳＣ ＦＶＩＩＩＦｃの予測された分子量と一致する、約２５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１０５ｋＤａ、および１９５ｋＤａで泳動する主要なバンドが認められた（図２Ｂ、レーン３）。前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン（ＰＣＳＫ）型プロテアーゼの成員であるヒトＰＣ５との共トランスフェクションにより、ｒＦＶＩＩＩＦｃ生成物の完全プロセシングを生じた（図２Ａ、Ｂ、レーン２）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のｒＦＶＩＩＩＦｃの幾つかのバッチの密度分析は、予期されるバンドの９８％を超える純度を示した。また、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、存在する凝集度を評価し、すべてのバッチは、０．５％以下の凝集レベルを有することが認められた。
ｒＦＶＩＩＩＦｃ構造が、トロンビン切断、還元、ならびにＬＣ／ＵＶおよびＬＣ／ＭＳによる分析によってさらに分析された。トロンビンによって（３７２、７４０、および７９５（完全長ＦＶＩＩＩ配列に対しては、１６８９に対応する７９５）位の３つのアルギニン残基での切断によって）生成される４つの第ＶＩＩＩ因子断片は、Ｆｃ（ピーク１）、軽鎖Ｆｃ（ピーク２）、重鎖からＡ１ドメイン（ピーク３）、および重鎖からＡ２ドメイン（ピーク４）のタンパク質のセグメントに対応する、ＵＶ吸光度によって検出することができる（図２Ｃ）。１４アミノ酸Ｂドメインリンカーおよび約６ｋＤａのａ３関連ペプチドは、サイズが小さいため、ＵＶ吸光度によって検出されない。
ＨＰＬＣ／ＭＳによるｒＦＶＩＩＩＦｃのトロンビン消化の分析により、４つの主要ドメイン、ならびに約６ｋＤａのａ３関連ペプチドの詳細な情報を得、同じ方法を用いて、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、ＣＨＯ由来組換えＢＤＤ−ＦＶＩＩＩタンパク質（ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）と比較された。ＦＶＩＩＩサンプルは、Ｔｗｅｅｎの除去のために、Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ＯＵＴＤＴＧ−１００Ｘカラム（ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＯ）を通過させ、トロンビンを用いて完全に消化させ、還元させ、水中アセトニトリル＋０．１％ ギ酸の勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＵＶ（ＰＯＲＯＳ Ｒ１／１０、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ６２１０ＴＯＦ質量分析計に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ１２００）のいずれかによって分析された。ペプチド配列はまた、ＬｙｓＣペプチドマッピングを用いて確認され、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ−ＸＬ−ＥＴＤ）によって分析された。
予想されるように、ｒＦＶＩＩＩＦｃの全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラム（図２Ｄ）は、ＵＶクロマトグラム（図２Ｃ）と同様であると見られる。期待された６つの生成物のうちの５つは、ＬＣ／ＭＳによって検出することができ、これには、プロセシングされたおよび一本鎖イソ型から生成されたａ３酸性領域の２つの型、ならびに消化のために使用されたトロンビンを含む。また、さらなる切断型のａ３酸性領域が観察され、以下にさらに十分に記載する。ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、同様のＴＩＣクロマトグラムを得たが、遊離Ｆｃ鎖がなく、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＬＣ−Ｆｃと比較してＬＣに対する異なる質量を有し、Ｆｃ領域の欠失と一致する（データ示さず）。
タンパク質の大部にわたるグリコシル化の異種性のため、Ａ１、ＬＣ−Ｆｃ、およびＦｃ領域に対するデコンボリューション質量スペクトルは複雑であり、そのため、すべての分子イオンの同一性は、構築されていない。しかしながら、Ｆｃ領域から３つの主要ピークに対して観察された質量は、ＩｇＧ分子上に見出されたＧ０、Ｇ１、およびＧ２イソ型と一致することが見出され、これは、０、１、または２つのガラクトース残基で終了する二分岐オリゴ糖に対応する。ａ３関連ペプチドおよびＡ２ドメインのデコンボリューション質量スペクトルは、これらの領域内の翻訳後修飾における異種性がないため、最も信頼のおけるデータを提供し、期待される質量を明確に特定することができる。
Ｒ１６８９の切断後、ＬＣから放出された６ｋＤａのＮ末端ペプチドは、プロセシングされたイソ型由来である場合、ａ３酸性領域（アミノ酸Ｅ１６４９〜Ｒ１６８９）を含み、一本鎖イソ型由来である場合、１４アミノ酸切断Ｂドメインは、ａ３酸性領域と融合することが予測される。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩは共に、ａ３領域の型を含有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく予想されるレベルと比例することが見出された。加えて、両タンパク質は、他のＦＶＩＩＩ製品に関して報告されているように、アミノ酸Ｄ１６５８〜Ｒ１６８９に対応するａ３領域の切断型を含有したが、これは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ中よりもｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ中により豊富に存在することが見出された。
Ａ２ドメインは、３つの可能性のあるチロシン硫酸化部位を含有するが、複雑な異種性をもたらし得るグリコシル化部位は含有せず、したがって、この領域の正確な質量を計算することができる。Ｓ３７３〜Ｒ７４０配列の質量と相関するｒＦＶＩＩＩＦｃのデコンボリューション質量スペクトルにおける第１の予想されるピークに加えて（図２Ｅ）、Ｅ７２０およびＹ７２９で切断されたＡ２ドメインと相関して、ＦＶＩＩＩ ＨＣの既知の切断に対応する２つのさらなるが特定された。これらの報告された切断型はまた、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ Ａ２のデコンボリューションスペクトルにおいて直接観察された（図２Ｅ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ Ａ２は共に、Ｙ７２９で切断された型の同様の相対量を含有したが、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ Ａ２ドメインは、ｒＦＶＩＩＩＦｃにおける同じ型と比較して、Ｅ７２０で切断された著しく高いレベルの型を含有した（図２Ｅ）。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの一次配列は、リシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）の消化によるペプチドマッピング、続いて、紫外線および質量分光法による検出によって確認された。ｒＦＶＩＩＩＦｃから産生された９９の理論的なペプチドのうち、全配列の９８％に対応する、８１が検出された。ｒＦＶＩＩＩＦｃの翻訳後修飾もまた、この方法によって特徴付けられた。ＦＶＩＩＩは、３４６、７１８、７１９、７２３、１６６４、および１６８０位に対応する６つの潜在的なチロシン硫酸化部位を含有する。これらの６つの部位に対応する完全に硫酸化されたペプチドが見出され、質量スペクトルにおける全イオンクロマトグラムの積分によって評価されると、１６８０位に対応する微量の非硫酸化ペプチドがあり、他の位置に対応する検出可能な非硫酸化ペプチドはなかった。ＢＤＤ ＦＶＩＩＩはまた、６つの潜在的なＮグリコシル化部位を含有し、このうちの４つは、組換えＦＶＩＩＩ製品においてグリコシル化されることが報告されている。これと一致して、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、グリコシル化される同じ４つの部位を有することが見出され、Ｎ２３９およびＮ２１１８は、高マンノース構造体を含有することが見出される一方で、Ｎ４１およびＮ１８１０は、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩに見出されるものと同様に、より複雑な糖質を含有することが見出された。Ｆｃ領域のＮ結合型グリコシル化は、ＬＣ／ＭＳによって、トロンビンマップで見出されるＧ０、Ｇ１、およびＧ２のイソ型と一致することが見出された。ＦＶＩＩＩは、部分的に占有されたＳｅｒ７４１および７４３でＯ−グリコシル化部位を有することが報告され、このことは、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関する場合にも見出された。
共トランスフェクトしたプロセシング酵素を用いないで産生されたｒＦＶＩＩＩＦｃポリペプチドは、１５〜２５％の一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ（ＳＣ ＦＶＩＩＩＦｃ）を示し、Ｒ７５４とＥ７５５との間の単一ペプチド結合（完全長ＦＶＩＩＩに対してはＲ１６４８／Ｅ１６４９）で、プロセシングされたｒＦＶＩＩＩＦｃとは異なる。このイソ型は、精製され、上述の生化学アッセイのすべてにおいて特徴付けられ、以下に示されるように、ｒＦＶＩＩＩＦｃに匹敵することが見出された。精製された一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃの活性は、発色アッセイ、ならびに以下に記載される様々な機能アッセイによってｒＦＶＩＩＩＦｃと同様であることが見出された。
発色および一段階ａＰＴＴアッセイによるＦＶＩＩＩ活性の測定
ＦＶＩＩＩ活性が、ＦＶＩＩＩ発色アッセイによって測定された。ｒＦＶＩＩＩＦｃの４つの別々のバッチからの平均比活性度は、発色アッセイによって、９７６２±４４９ＩＵ／ｍｇであることが見出され、これは、２１４８±９９ＩＵ／ｎｍｏｌに相当する。ｒＦＶＩＩＩＦｃの１４のバッチからの平均比活性度は、ａＰＴＴアッセイによって、８４６０±６９９ＩＵ／ｍｇであり、発色アッセイによって、９３４８±１３５３ＩＵ／ｍｇであることが見出され、これはそれぞれ、１８６１±１５４および２０５７±２９８ＩＵ／ｎｍｏｌに相当する。一本鎖ＦＶＩＩＩ：ＦｃのＦＶＩＩＩ活性もまた、発色アッセイによって測定され、完全にプロセシングされたｒＦＶＩＩＩ：ＦｃまたはｒＦＶＩＩＩ：Ｆｃ ＤＳ（約２５％の一本鎖ｒＦＶＩＩＩ：Ｆｃを含有する）と比較された。表３Ａが示すように、一本鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃは、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）の存在下および不在下の両方で、発色アッセイによって完全にプロセシングされたＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳの第ＶＩＩＩ因子活性と比較して、ＦＶＩＩＩ活性においていかなる有意な差異も示さなかった。表３Ｂは、一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイによって測定されるように、ＳＣｒＦＶＩＩＩＦｃの完全活性がＶＷＦの不在下で観察されたことを示す。
一段階凝固アッセイ（ＡＰＴＴ）において、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃは、血漿が正常なＶＷＦレベルを有する場合、６０％の活性の減少を示し、これは、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃの活性化における可能性のある役割を示唆している。この観察は、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃの凝固活性が先天性ＦＶＩＩＩ欠損血漿におけるものと同じレベルまで減少した場合に、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ欠乏血漿（表３）までヒトＶＷＦを添加することによってさらに確認された。
Ｘアーゼ複合体の活性
ＦＶＩＩＩ活性はまた、カルシウムの存在下で、リン脂質表面上での活性化ＦＩＸおよびトロンビン活性化ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃタンパク質をインキュベートし、発色または蛍光発生基質の切断によって測定される、ＦＸのＦＸａへの転換をモニタリングすることによって、Ｘアーゼ複合体において測定され、これにより、ＦＸａの発生率が決定された。次いで、このアッセイは、それぞれの個々の成分との相互作用を検査するために、その他を一定に維持しながら、アッセイの１つの成分を変化させることによって改変された。
ＦＸａの発生率は、合成リン脂質ベシクル（２５％ ホスファチジルセリン／７５％ ホスファチジルコリン）を用いて、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳ、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ、および一本鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する異なるリン脂質濃度の一関数として決定された（図３Ａ）。双方のタンパク質は共に、約１５６μＭのリン脂質でピーク活性を有する同様の活性プロファイルを有することが認められた。
次いで、ＦＸａの発生率が、異なるＦＸ濃度の一関数として決定され、ＫｍおよびＶｍａｘが計算された（図３Ｂ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳ、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ、および一本鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する活性プロファイルは、同様のＫｍおよびＶｍａｘを有し、同様であることが見出された（表４）。最後に、ＦＸａの発生率が、異なるＦＩＸ濃度の一関数として決定された（図３Ｃ）。この活性プロファイルは、同様のＫｄおよびＶｍａｘを有し、同様であると思われた（表４）。同様の結果が、リン脂質源として血小板を用いて得られた（未発表データ、２００９年６月）。



ＡＰＣによる不活性化
活性化すると、ＦＶＩＩＩは、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による切断、およびＡ２ドメインの解離によって不活性化される。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩをいずれも、トロンビンによって活性化し、次いで、ＦＸａ発生アッセイにおいて決定される異なる時間および活性に対してＡＰＣでインキュベートした（図４）。トロンビン活性化の不在下では、ＦＸａの発生がほとんど検出されず、トロンビン消化に伴って有意に増加した。９０分間のＡＰＣによる処理は、非活性化サンプルと同様である、ＦＸａの発生率の有意な減少をもたらし、これらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ ＤＳ、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ、および一本鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃに対して同様であった。
ｖＷＦに対する親和性
フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）とのＦＶＩＩＩの相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づいて、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって測定し、ｖＷＦに対するｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩの結合動態反応速度を決定した（表６）。Ｋａ（オン速度）およびＫｄ（オフ速度）の動態反応速度パラメーターならびに親和性ＫＤ（Ｋｄ／Ｋａ）は、同一の条件下で、それぞれのＦＶＩＩＩの相互作用に対して決定された。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩは共に、それぞれ、１．６４±０．３７および０．８４６±０．１８１ｎＭの、ｖＷＦに対して低いｎＭの結合親和性（ＫＤ）を有することが見出された。それらのタンパク質は、親和性において２倍の差をもたらすオン速度の２倍の差を有する、同様のオフ速度を有した。
表６に示されるように、ｖＷＦとのｒＦＶＩＩＩ：Ｆｃ ＤＳまたは一本鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃの親和性は、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩのみの親和性よりもほぼ２倍多い、低ｎＭ範囲であることが見出された。生理学的濃度では、これは、遊離ＦＶＩＩＩと比較して、ｖＷＦで複合されたｒＦＶＩＩＩＦｃ（プロセシングされたまたは一本鎖）のパーセンテージのわずかな減少をもたらすだろうが、インビボ研究は、このわずかに低い親和性にかかわらず、ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期が完全長またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを上回って有意に延長することを示し、そのため、これはこの分子の半減期を損なうとは思われない。遊離ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＦｃＲｎ経路を介してより有効に再利用され、そのため、これは、半減期のより長い延長に寄与し得る可能性がある。
ｖＷＦに対する親和性およびトロンビンで媒介されるｖＷＦからの放出
組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）が、ＨＥＫ２９３細胞において発現された。ＨＥＫ２９３細胞における生合成中、ｒＦＶＩＩＩＦｃの大部分は、制限タンパク分解によってプロセシングされて、Ｆｃ部分が付着するＦＶＩＩＩの重鎖（ＨＣ）およびＦＶＩＩＩの軽鎖（ＬＣ）を生成する。血漿中およびＦＶＩＩＩの薬物製剤の保存中のＨＣおよびＬＣの自発的解離は、ＦＶＩＩＩ活性の損失の一因となると考えられる。プロセシングされない、生合成されたｒＦＶＩＩＩＦｃの残りの部分は、プロセシングされたｒＦＶＩＩＩＦｃと比較して、増大した製造可能性および安定性を提供し得る一本鎖イソ型のｒＦＶＩＩＩＦｃ（ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を形成する。
この実施例は、ｒＦＶＩＩＩＦｃとｖＷＦとの相互作用に関して、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃとフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）との相互作用と比較するアッセイを説明する。ｖＷＦとの相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づいて、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって測定し、ｖＷＦに対するｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩの動態結合反応速度を決定した（表１１および図１６Ａ）。ＦＶＩＩＩを含まないヒト血漿由来ｖＷＦは、質量輸送制限を防ぐのに十分低いレベルで、バイオセンサー表面上にアミン結合によって固定化された。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃを、０．１３〜５．０ｎＭの濃度で単一サイクルの反応速度モードで順次注入した。センサーグラムデータを、１：１の相互作用モデルに当てはめた。
Ｋａ（オン速度）およびＫｄ（オフ速度）の動態反応速度パラメーターならびに親和性ＫＤ（Ｋｄ／Ｋａ）が、同一の条件下で、それぞれのＦＶＩＩＩの相互作用に対して決定された。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩは共に、それぞれ、０．３４±０．１および０．３１±０．１ｎＭのｖＷＦに対して低いｎＭの結合親和性（ＫＤ）を有することが見出された。両方のイソ型はまた、同様のオン速度およびオフ速度を有した。
次に、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびＢドメイン欠失のＦｃ部分を欠いているＦＶＩＩＩ（ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）のトロンビンに媒介される放出を、２５℃および３７℃の両方で測定した。ヒトｖＷＦを、バイオセンサー表面上の３つのフロー細胞における同様のレベルでアミン結合によって固定化した。残りのフロー細胞は、参照目的のための空としての役割を果たした。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃタンパク質を、ｖＷＦによって捕捉し、ゆっくりと解離させ、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃの濃度を調整して、解離相の終点までに等モル量の捕捉レベルを得た。ヒトα−トロンビン溶液を、２倍段階希釈により調製し、０．００５〜２０Ｕ／ｍＬの範囲の濃度で適用し、ｖＷＦからＦＶＩＩＩａ種のタンパク質分解放出をもたらした。ｖＷＦからの活性化したｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩのトロンビンに媒介される放出を、ＳＰＲベースの光バイオセンサーを用いてリアルタイムにおいてモニタリングした（図１６Ｂ）。空の参照値の減算後（図１６Ｃ）、α−トロンビン濃度の一関数としての放出率が決定された（図１６Ｄ）。２５℃でｒＦＶＩＩＩＦｃに対する３．９±０．３Ｕ／ｍＬと比較して、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃに対するトロンビンの半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、１２±１Ｕ／ｍＬであり、３７℃でｒＦＶＩＩＩＦｃに対する４．８±０．２Ｕ／ｍＬと比較してＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃに対して１５±１Ｕ／ｍＬであった（図１６Ｅ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、２５℃で３．９±０．３Ｕ／ｍＬおよび３．３±０．３Ｕ／ｍＬの値をそれぞれ有し、３７℃で４．８±０．２Ｕ／ｍＬおよび４．０±０．２Ｕ／ｍＬの値をそれぞれ有し、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩと比較して同様のトロンビンのＥＣ５０値を有した。ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ｒＦＶＩＩＩＦｃよりも約３倍高いトロンビンのＥＣ５０値を有した。ｖＷＦからのトロンビンに媒介される放出の減退は、ｖＷＦが存在するａＰＴＴアッセイにおいて観察されたＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する比活性度の説特異的減少の根底であり得る（表３Ｂ）。
（実施例３）
第Ｉ／ＩＩａ相の非盲検、交差、用量増加、多施設、およびヒト初回試験が、重症（＜１ＩＵ／ｄＬ［１％］内因性第ＶＩＩＩ因子［ＦＶＩＩＩ］として定義される）血友病Ａを有する対象におけるｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与の安全性、耐容性、および薬物動態を評価するために設計された。合計約１２人の治療歴のある患者を登録し、２５または６５ＩＵ／ｋｇでｒＦＶＩＩＩＦｃを投与した。スクリーニング（参照比較物質であるＡＤＶＡＴＥ（登録商標）［ｒＦＶＩＩＩ］の初回投与前２８日以内に予定）ならびに初回注射前に無ＦＶＩＩＩ処置で最低４日間（９６時間）経過した後、約６人の対象が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の単回の２５ＩＵ／ｋｇの用量投与を受けて、その後、３日間（７２時間）薬物動態（ＰＫ）プロファイル、次いで、交差試験を受けて、７日間（１６８時間）ＰＫプロファイリングのためのｒＦＶＩＩＩＦｃの２５ＩＵ／ｋｇの単回、非盲検用量投与を受けた。最初の３人の対象は、順次用量投与した。２５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを用量投与した最初の３人の対象に関しては、それぞれの対象は、ｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後１４日目（３３６時間）に阻害剤評価を受けた。次の対象（最初の３人の対象のみに関して）の用量投与は、阻害剤試験が完了した時点で行った。３番目の対象が１４日間の阻害剤評価を完了した後、残りの３人の対象は２５ＩＵ／ｋｇで、および６人の対象は６５ＩＵ／ｋｇで、それぞれの用量群内で少なくとも１日は離して逐次的に、登録を開始した。
最後の対象がｒＦＶＩＩＩＦｃの２５ＩＵ／ｋｇの用量投与を受けた１週間後に、約６人の異なる対象が、６５ＩＵ／ｋｇのコホートのために採用された。６５ＩＵ／ｋｇのコホート中のそれぞれの対象は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の単回の６５ＩＵ／ｋｇの用量投与を受けて、その後、４日間（９６時間）ＰＫプロファイリング、次いで、交差試験を受けて、１０日間（２４０時間）プロファイリングのためのｒＦＶＩＩＩＦｃの６５ＩＵ／ｋｇの単回、非盲検用量投与を受けた。任意のコホートにおいてｒＦＶＩＩＩＦｃの初回注射前に出血エピソードが生じた場合には、対象の予備試験ＦＶＩＩＩ製品を処置のために用いて、ＰＫプロファイルのためのｒＦＶＩＩＩＦｃの最初の注射を受ける前に、少なくとも４日間の間隔を経過していなければならなかった。
すべての対象は、安全のために、ｒＦＶＩＩＩＦｃの２５ＩＵ／ｋｇまたは６５ＩＵ／ｋｇの投与後、１４日（３３６時間）および２８日の安全性評価期間の間、追跡調査された。すべての対象は、指定された時点で、ＦＶＩＩＩ活性の分析のための血液サンプルと共に、用量投与前および後に、薬物動態サンプリングを行った。
第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験のための薬物動態データは、ＦＶＩＩＩＦｃに対して以下の結果を示した。ＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（完全長ｒＦＶＩＩＩ）と比較して、全身曝露（ＡＵＣＩＮＦ）の約５０％増加、クリアランス（Ｃｌ）の約５０％減少、ならびに排出半減期およびＭＲＴの約５０〜７０％増加を有した。加えて、ＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、Ｃ１６８、ＴＢＬＰ１、ＴＢＬＰ３、およびＴＢＬＰ５値の増加を示した。

ＡＵＣＩＮＦ
ゼロから無限までの濃度−時間曲線下面積

ベータＨＬ
排出層半減期；ｔ１／２βとも称される

Ｃ１６８
用量投与後約１６８時間でのベースラインを上回る推定ＦＶＩＩＩＦｃ活性

Ｃｌ
クリアランス

ＭＲＴ
平均滞留時間

ＴＢＬＰ１
ＦＶＩＩＩＦｃ活性がベースラインを上回る約１ＩＵ／ｄＬに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間

ＴＢＬＰ３
ＦＶＩＩＩＦｃ活性がベースラインを上回る約３ＩＵ／ｄＬに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間

ＴＢＬＰ５
ＦＶＩＩＩＦｃ活性がベースラインを上回る約５ＩＵ／ｄＬに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間
（実施例４）
組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）融合タンパク質が、ＦＶＩＩＩの半減期を延長するためのアプローチとして作製された。ｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態（ＰＫ）を、血友病ＡマウスにおいてｒＦＶＩＩＩと比較した。終末半減期は、ｒＦＶＩＩＩと比較してｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては２倍長いことが分かった。半減期の延長に関する根本的機序がＦｃＲｎによるｒＦＶＩＩＩＦｃの保護のためであることを確証するために、ＦｃＲｎノックアウトおよびヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいて、ＰＫを評価した。単回静脈内用量（１２５ＩＵ／ｋｇ）を投与して、発色活性アッセイを用いて血漿濃度を測定した。Ｃｍａｘは、両マウス株において、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標））間で同様であった。しかしながら、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関する半減期は、ＦｃＲｎノックアウトマウスにおいてはｒＦＶＩＩＩのものに匹敵したが、一方、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関する半減期は、ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいてはｒＦＶＩＩＩより約２倍長く延長された。これらの結果は、ＦｃＲｎが、ｒＦＶＩＩＩと比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期延長を媒介するか、またはそれに関与することを確証する。回転血栓弾性測定法（ＲＯＴＥＭ（登録商標））により測定される全血の止血は、血友病マウスの出血モデルにおける、ならびに臨床的適用において、凝固因子の効力と相関することが示されているため、ＲＯＴＥＭ（登録商標）を用いて血友病ＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃのエクスビボ効力を評価しようとした。血友病Ａマウスに、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（ＦＶＩＩＩ）、またはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（ＦＶＩＩＩ）の単回静脈内用量投与を施した。用量投与の５分後、血餅形成は、凝固時間（ＣＴ）、血餅形成時間（ＣＦＴ）、およびα角に関して同様であった。しかしながら、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、用量投与後７２および９６時間にＣＴの有意の改善を示し、そして、ＣＦＴおよびα角も、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫ延長と一致して、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（ＦＶＩＩＩ）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（ＦＶＩＩＩ）の両方と比較して９６時間で改善された。したがって、ＦＶＩＩＩのＦｃ融合物の構築は、増加した半減期、および出血からの長期の保護を提供する潜在能力を有する作用の明示された機序を有する分子を産生する。
（実施例５）
この実施例は、２５および６５ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩＩ製品で処置された１６人の患者からのＦＶＩＩＩ活性に関する最終分析結果を示す。実施例３を参照のこと。
この実施例において、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ヒトＩｇＧ１の二量体Ｆｃドメインと融合する組換えＢドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ）の単一分子からなる組換え融合タンパク質であって、介在するリンカー配列を有さない。このタンパク質構築は、本明細書中では、ｒＦＶＩＩＩＦｃへテロ二量体ハイブリッドタンパク質、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体Ｆｃ融合タンパク質、ＦＶＩＩＩＦｃ単量体ハイブリッド、単量体ＦＶＩＩＩＩＦｃハイブリッド、およびＦＶＩＩＩＦｃ単量体−二量体とも称される。実施例１、図１、および表２Ａを参照のこと。
ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いる前臨床試験は、市販のｒＦＶＩＩＩ製品と比較して、ｒＦＶＩＩＩ活性の半減期の約２倍の延長を示している。この試験の論理的根拠は、凍結液体製剤中のｒＦＶＩＩＩＦｃの単回用量投与の安全性および耐容性を評価し、重症血友病Ａ対象におけるＰＫに関するデータを提供することであった。この試験のために、１６人の評価可能対象が、ＰＫ評価のために利用可能であった。２５（ｎ＝６）および６５ＩＵ／ｋｇ／体重（ｎ＝１０）の公称用量でのｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の両方の２つの用量の単回投与を、約１０分間にわたって静脈内に注入した。血漿ＰＫ評価のための血液サンプルを、注入前、ならびに用量投与後１０日までに入手した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの両方に関するＦＶＩＩＩ活性のＰＫを、モデル依存的方法を用いて、この試験で特徴付けした。
目的
この試験の主目的は、重症血友病Ａを有する１２歳以上の治療歴のある患者（ＰＴＰ）における２つの用量のｒＦＶＩＩＩＦｃ（２５および６５ＩＵ／ｋｇ）の単回投与の安全性および耐容性を評価することであった。
副次目的は、一段階凝固および発色アッセイにおいて、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、２５または６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与後、長時間にわたるＦＶＩＩＩの薬力学（ＰＤ）活性により決定される薬物動態（ＰＫ）パラメーターを決定することであった。
研究設計（実施例３を参照のこと）
スクリーニング来院時（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の用量投与前２８日以内）；注射前（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の注射）０日目ならびに注射後１０および３０分ならびに１、３、６、および９時間目に；ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の注射後２４時間での１日目に；ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の注射後４８時間での２日目に；ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の注射後７２時間での３日目に；高用量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の注射後９６時間での４日目に（コホートＢのみ）、ＦＶＩＩＩ活性ＰＫ評価のために、血液サンプルを採取した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの投与の直前、ｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後１０および３０分ならびに１、３、６、および９時間目のｒＦＶＩＩＩＦｃ注射の当日に；ｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後２４時間での１日目に；ｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後４８、７２、９６、および１２０時間での２〜５日目に；ｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後１６８時間での７日目に；高用量のｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後１９２、２１６、および２４０時間での８、９、および１０日目に（コホートＢのみ）、ＦＶＩＩＩ活性ＰＫ評価のために、血液サンプルを採取した。ｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後６７２時間での最終試験来院時（ｒＦＶＩＩＩＦｃの注射後２８日目）にも、ＦＶＩＩＩ活性を測定した。

薬物動態モデリングおよび算定

略語
ＴＢＬＰ１＝ＦＶＩＩＩ活性がベースラインを上回る約１ＩＵ／ｄＬに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間。

ＴＢＬＰ３＝ＦＶＩＩＩ活性がベースラインを上回る約３ＩＵ／ｄＬに減少した場合の用量投与後のモデル予測時間。

ＫＶ＿Ｍ＝Ｃｍａｘ＿Ｍ／実用量（ＩＵ／ｋｇ）

ＫＶ＿ＯＢ＝Ｃｍａｘ＿ＯＢ／実用量（ＩＵ／ｋｇ）

ＩＶＲ＿Ｍ＝１００×Ｃｍａｘ＿Ｍ×血漿容積（ｄＬ）／総容量（ＩＵ）；血漿容積（ｍＬ）＝（２３．７×体長（ｃｍ））＋（９．０×体重（ｋｇ））−１７０９。

ＩＶＲ＿ＯＢ＝１００×Ｃｍａｘ＿ＯＢ×血漿容積（ｄＬ）／総容量（ＩＵ）；血漿容積（ｍＬ）＝（２３．７×体長（ｃｍ））＋（９．０×体重（ｋｇ））−１７０９。
結果単回用量投与薬物動態（一段階アッセイ）
観察されたＦＶＩＩＩ活性は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの短時間ＩＶ注入後に急に増加し、平均（±標準偏差）モデル予測Ｃｍａｘ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては５６．６±４．７４および１２１±２８．２ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては５５．６±８．１８および１０８±１６．９ＩＵ／ｄＬであった。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃで処置した患者はすべて、ＦＶＩＩＩ活性の用量依存的な増加を有した。ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦの両方において観察された増加は、評価された用量範囲を上回る用量に比例するよりわずかに低かった。
注入終了後、観察ＦＶＩＩＩ活性の減少は、ベースラインレベルに到達するまで、単一指数関数型崩壊特性を示した。ＦＶＩＩＩ活性の減少速度は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関するものよりｒＦＶＩＩＩＦｃに関する方が低く、平均（±標準偏差）モデル予測排出半減期値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１１．９±２．９８および１０．４±３．０３時間、ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１８．０±３．８８および１８．４±６．９９時間であった。排出半減期値は、両ＦＶＩＩＩ製品に関して評価された用量範囲全体で用量非依存性であると思われた。
総全身ＦＶＩＩＩ曝露（ＡＵＣＩＮＦにより評価）は、それぞれ、２５および６５ＩＵ／ｋｇの用量レベルで、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりｒＦＶＩＩＩＦｃ投与後に約４８％および６１％大きかった。平均（±標準偏差）モデル予測ＡＵＣＩＮＦ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては９７４±２５９および１８１０±６０６時間＊ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１４４０±３１６および２９１０±１３２０時間＊ＩＵ／ｄＬであった。
排出半減期と同様に、ＭＲＴは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較してｒＦＶＩＩＩＦｃに関して延長された。平均（±標準偏差）モデル予測ＭＲＴ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１７．１±４．２９および１４．９±４．３８時間であり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては２５．９±５．６０および２６．５±１０．１時間であった。ＭＲＴ値は、両ＦＶＩＩＩ製品に関して評価された用量範囲全体で用量非依存性であると思われた。
加えて、ＣＬおよびＶに関する第１のＰＫパラメーター値を決定した。ｒＦＶＩＩＩＦｃに関するＣＬ値は、等価用量でのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関して観察された値の約６６％のみを占めるだけであった。平均（±標準偏差）モデル予測ＣＬ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては２．７０±０．７２９および４．０８±１．６９ｍＬ／時間／ｋｇであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１．８０±０．４０９および２．６９±１．２５ｍＬ／時間／ｋｇであった。Ｖ値は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）とｒＦＶＩＩＩＦｃとの間で同等であり、平均（±標準偏差）モデル予測Ｖ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては４３．９±４．２７および５６．１±１３．４ｍＬ／ｋｇ、ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては４５．３±７．２３および６１．６±１０．６ｍＬ／ｋｇであった。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの漸増用量に伴って平均ＣＬおよびＶ値のわずかな増加が認められたが、限られた用量レベルと相まって６５ＩＵ／ｋｇ用量での標準偏差の増加は、これらのパラメーターの用量依存性の評価を混乱させた。例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置群に関するＣＶ％幾何学平均ＣＬ値は、２３．０％（２５ＩＵ／ｋｇ）から４８．６％（６５ＩＵ／ｋｇ）に増加した。
第１のＰＫパラメーターに加えて、第２のＰＫパラメーター（例えば、Ｋ値、ＩＶＲ等）を決定して、効果のＦＶＩＩＩ持続期間を評価した。ＰＫ差の証拠も、ｒＦＶＩＩＩＦｃで観察されたが、これは、等価用量で、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、ＴＢＬＰ１およびＴＢＬＰ３値の増加を示した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃに関するＩＶＲおよびＫ値は、同等であると思われた。ＴＢＬＰ１およびＴＢＬＰ３値のわずかな増加が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの漸増用量に伴って観察された。対照的に、平均ＩＶＲおよびＫ値のわずかな減少が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの漸増用量に伴って認められた。前述のように、これらのパラメーターの用量依存性の評価は、限られた用量レベルにより混乱させられる。
平均（±標準偏差）観察ＴＢＬＰ１は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり２．８８±０．７３３および２．９３±０．８４８ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり４．２８±０．８７３および５．１６±２．０２ＩＵ／ｄＬであった。平均（±標準偏差）観察ＴＢＬＰ３は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり２．０６±０．５２７および２．２６±０．６６６ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０９±０．６２３および３．９３±１．５９ＩＵ／ｄＬであった。
観察Ｃｍａｘ値を用いて算定される平均ＩＶＲおよびＫ値（モデル内のベースラインおよび残留薬物を差し引く）は、一般的に、モデル予測Ｃｍａｘ値を用いて決定される値より大きく、これは、１分画モデルを用いて観察されるピーク活性よりわずかに低い推定値と一致した。平均（±標準偏差）観察Ｋ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり２．５７±０．１９８および２．１３±０．５９８ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり２．４６±０．３３０および１．８５±０．３３２ＩＵ／ｄＬであった。平均（±標準偏差）観察ＩＶＲ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては９４．１±１５．６および８５．８±１６．５％であり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては８９．５±１１．９および７４．８±６．７２％であった。
単回用量投与薬物動態（発色アッセイ）
観察ＦＶＩＩＩ活性は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの短時間ＩＶ注入後に急に増加し、平均（±標準偏差）モデル予測Ｃｍａｘ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては７０．２±９．６０および１５７±３８．６ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては７０．３±１０．０および１５８±３４．７ＩＵ／ｄＬであった。
ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃで処置した患者はすべて、ＦＶＩＩＩ活性の用量依存的な増加を有した。ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦの両方において観察された増加は、評価された用量範囲を上回る用量に比例するよりわずかに低かった。
注入終了後、観察ＦＶＩＩＩ活性の減少は、ベースラインレベルに到達するまで、単一指数関数型崩壊特性を示した。ＦＶＩＩＩ活性の減少速度は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関するものよりｒＦＶＩＩＩＦｃに関する方が低く、平均（±標準偏差）モデル予測排出半減期値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１０．７±１．９８および１０．３±３．２７時間、ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１６．２±２．９２および１９．０±７．９４時間であった。排出半減期値は、両ＦＶＩＩＩ製品に関して評価された用量範囲全体で用量非依存性であると思われた。
総全身ＦＶＩＩＩ曝露（ＡＵＣＩＮＦにより評価）は、それぞれ、２５および６５ＩＵ／ｋｇの用量レベルで、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりｒＦＶＩＩＩＦｃ投与後に約５３％および８４％大きかった。平均（±標準偏差）モデル予測ＡＵＣＩＮＦ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１０８０±２３６および２３２０±７８４時間＊ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１６５０±４０８および４２８０±１８６０時間＊ＩＵ／ｄＬであった。
排出半減期と同様に、ＭＲＴは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較してｒＦＶＩＩＩＦｃに関して延長された。平均（±標準偏差）モデル予測ＭＲＴ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１５．３±２．８６および１４．８±４．７２時間であり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては２３．４±４．２２および２７．３±１１．４時間であった。ＭＲＴ値は、両ＦＶＩＩＩ製品に関して評価された用量範囲全体で用量非依存性であると思われた。
加えて、ＣＬおよびＶに関する第１のＰＫパラメーター値を決定した。ｒＦＶＩＩＩＦｃに関するＣＬ値は、等価用量でのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関して観察された値の約５８〜６６％のみを占めるだけであった。平均（±標準偏差）モデル予測ＣＬ値は、２５および６５ＩＵ／ＫＧ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては２．３９±０．５２７および３．２１±１．４０ｍＬ／時間／ｋｇであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１．５７±０．３４９および１．８６±０．９７０ｍＬ／時間／ｋｇであった。Ｖ値は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）とｒＦＶＩＩＩＦｃとの間で同等であり、平均（±標準偏差）モデル予測Ｖ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては３５．８±５．５２および４３．６±１１．２ｍＬ／ｋｇ、ならびにｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては３５．９±６．６５および４２．７±８．９１であった。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの漸増用量に伴って平均ＣＬおよびＶ値の増加が認められたが、限られた用量レベルと相まって６５ＩＵ／ｋｇでの標準偏差の増加は、これらのパラメーターの用量依存性の評価を混乱させた。
第１のＰＫパラメーターに加えて、第２のＰＫパラメーター（例えば、Ｋ値、ＩＶＲ等）を決定して、効果のＦＶＩＩＩ持続期間を評価した。ＰＫ差の証拠も、ｒＦＶＩＩＩＦｃで観察されたが、これは、等価用量で、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、ＴＢＬＰ１およびＴＢＬＰ３値の増加を示す。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃに関するＩＶＲおよびＫ値は、同等であると思われた。
ＴＢＬＰ１およびＴＢＬＰ３値のわずかな増加が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの漸増用量に伴って観察された。対照的に、平均ＩＶＲおよびＫ値のわずかな減少が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの漸増用量に伴って認められた。前述のように、これらのパラメーターの用量依存性の評価は、限られた用量レベルにより混乱させられる。
平均（±標準偏差）観察ＴＢＬＰ１は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり２．７０±０．５１１および３．０９±０．９７８ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり４．０６±０．７９８および５．６６±２．３８ＩＵ／ｄＬであった。平均（±標準偏差）観察ＴＢＬＰ３は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり１．９８±０．３７７および２．３９±０．７１８ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０４±０．５９８および４．４４±１．８４ＩＵ／ｄＬであった。
観察Ｃｍａｘ値を用いて算定される平均ＩＶＲおよびＫ値（モデル内のベースラインおよび残留薬物を差し引く）は、一般的に、モデル予測Ｃｍａｘ値を用いて決定される値より大きく、これは、１分画モデルを用いて観察されるピーク活性よりわずかに低い推定値と一致した。平均（±標準偏差）観察Ｋ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり３．０８±０．４２９および２．８５±０．７２１ＩＵ／ｄＬであり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１ＩＵ／ｋｇ当たり３．１２±０．４５１および２．９２±０．９８５ＩＵ／ｄＬであった。平均（±標準偏差）観察ＩＶＲ値は、２５および６５ＩＵ／ｋｇ用量群に関してそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては１１２±１４．５および１１６±２６．９％であり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては１１３±１６．３および１１７±３３．６％であった。
結論
ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃで処置した患者はすべて、評価された用量範囲全体でＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦの同等の用量依存的な増加を有した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ活性のピーク血漿レベルは、注入終了後１時間以内に一般的に観察され、用量投与後数日間、依然として検出可能であった。注入終了後、ベースライン補正ＦＶＩＩＩ活性の減少は、両製品に関してベースラインレベルに到達するまで、単一指数関数型崩壊特性を示した。排出半減期およびＭＲＴに関するパラメーター値は、両ＦＶＩＩＩ製品に関して評価された用量範囲全体で用量依存性であると思われた。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの漸増用量に伴って平均ＣＬおよびＶ値のわずかな増加が認められたが、限られた用量レベルと相まって６５ＩＵ／ｋｇでの対象間変動の増加は、これらのパラメーターの用量依存性の評価を混乱させた。
ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）活性ＰＫの比較は、同等の用量でのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関して全身性曝露の約４８〜６１％（一段階アッセイ）または５３〜８４％（発色アッセイ）の増加、クリアランスの約３０〜４０％低減、排出半減期およびＭＲＴの両方の約５０〜８０％増加を明示した。ＰＫ差の証拠も、ｒＦＶＩＩＩＦｃで観察されたが、これは、等価用量で、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、ＴＢＬＰ１およびＴＢＬＰ３値の増加を実証した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃに関するＩＶＲおよびＫ値は、同等であると思われた。
発色アッセイの結果から得られるＰＫパラメーターは、発色アッセイが、より高い曝露パラメーター（例えば、Ｃｍａｘ、ＡＵＣＩＮＦ等）推定値を生じたことを除いては、一般的に、一段階アッセイからのものと一致した。
ＰＫで観察された改善に伴って、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、出血からの長期の保護を提供し得、血友病Ａを有する個体に対する注射頻度を低くし得る。
（実施例６）
ｒＦＶＩＩＩ：Ｆｃのヒトで最初の試験からの暫定ＰＫ分析（実施例３）に基づいて、Ａ−ＬＯＮＧ試験を計画した。Ａ−ＬＯＮＧは、重症血友病Ａ（＜１ＩＵ／ｄＬ［＜１％］内因性ＦＶＩＩＩと定義される）を有する治療歴のある対象における出血の防止および処置における組換え第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ融合（ＦＶＩＩＩ：Ｆｃ）の安全性、薬物動態、および効力の非盲検多施設評価である。
約１０６人の対象を、３つのレジメンのうちの１つに登録する：目的に合わせた予防レジメン（アーム１）、週投与レジメン（アーム２）、およびオンデマンドレジメン（アーム３）。
アーム１：目的に合わせた予防レジメン アーム１は、全群およびＰＫ亜群を含む。約６６人の対象が登録される。最初のレジメンは、初日に２５ＩＵ／ｋｇ、続いて、その週の４日目に５０ＩＵ／ｋｇの週２回である。ｒＦＶＩＩＩＦｃに関するＰＫ結果が得られるまで、対象は、この週予防レジメンでｒＦＶＩＩＩＦｃを投与する。これらの結果に基づいて、それぞれの個人に関して目的に合わせた予防レジメンが確立されるが、この場合、用量および間隔は、１〜３％ＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルを保持するように決定される。次いで、それぞれの対象は、その個々の目的に合わせた予防レジメンを試験中ずっと投与される。
対象は、試験中ずっとモニタリングされ、継続中の用量および間隔調整がなされる。
調節は、２ヶ月の期間にわたって２以上の突発性出血エピソードと定義される許容できない出血エピソードを対象が経験する場合にのみ見なされるであろう。この場合、調節は、３〜５％のトラフレベルを目標とする。
アーム２：週投与レジメン
約２０人の対象が登録され／無作為化されて、以下のような簡易なｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイリングを受ける：少なくとも９６時間の洗い流し；ｒＦＶＩＩＩＦｃの６５ＩＵ／ｋｇの単回用量投与；０日目にｒＦＶＩＩＩＦｃで開始して、注射前、ならびに注射開始から１０（±２）分、３時間（±１５分）、７２（±２）時間［３日目］、および９６（±２）時間［４日目］を含む、簡易なサンプリング。簡易なＰＫプロファイリング後、次に、対象に、７日ごとに一定用量６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを少なくとも２８週間、最長５２週間投与する。
アーム３：オンデマンドレジメン
少なくとも５人の対象における最低１０人の大手術を、本試験で評価する。大手術は、全身麻酔および／または呼吸補助を伴う任意の外科的手法（選択的または緊急）と定義され、この場合、主要な体腔を貫通し、露出するか、または身体的もしくは生理学的機能の実質的減損が生じる（例えば、開腹術、開胸術、開頭術、関節置換術、および四肢切断術）。
外科手術中の予防のために、対象は、１２〜２４時間ごとに、２０〜５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃで処置される。外科手術前に、医師は、対象のｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを検討し、予定手術の種類ならびに対象の臨床状態に一般的に必要とされる第ＶＩＩＩ因子置換の用量投与レジメンを評価する。任意のリハビリ時間を含む外科的処置期間におけるｒＦＶＩＩＩＦｃの適切な用量投与のための推奨は、これらの因子を考慮に入れる。
この試験の主目的は、（ａ）予防、オンデマンド、および外科的処置レジメンとして施されるｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および耐容性を評価すること、ならびに（ｂ）予防、オンデマンド、および外科的処置レジメンとして施されるｒＦＶＩＩＩＦｃの有効性を評価することである。この試験の副次目的は、（ａ）ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを特徴付けし、ＦＶＩＩＩＦｃのＰＫを、現行の市販製品であるＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較すること、（ｂ）ＦＶＩＩＩＦｃによる個体応答を評価すること、ならびに（ｃ）ＦＶＩＩＩＦｃ消費を評価することである。

主目的
・予防、週、オンデマンド、および外科的処置レジメンとして施されるｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および耐容性を評価すること
・目的に合わせた予防、オンデマンド、および外科的処置レジメンとして施されるｒＦＶＩＩＩＦｃの有効性を評価すること
副次目的
・ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを特徴付けし、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫを、現行の市販製品であるＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較すること
・ｒＦＶＩＩＩＦｃによる個体応答を評価すること
・予防レジメンにおける出血を適切に防止し、外科的設定における恒常性を保持し、またはオンデマンド、週ごとの処置、もしくは予防設定における出血エピソードを処置するために必要とされる用量およびスケジュールの範囲を特徴付けること
・ｒＦＶＩＩＩＦｃ消費を評価すること（例えば、１人の対象当たりの総年間ｒＦＶＩＩＩＦｃ消費量）
（実施例７）
臨床的ＲＯＴＥＭ（登録商標）評価
実施例７における試験では、一段階活性化部分トランボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイによる血漿ＦＶＩＩＩ活性の測定に加えて、全血回転血栓弾性測定（ＲＯＴＥＭ（登録商標））も調べられて、２人の対象、具体的には、低用量コホート１人および高用量コホート１人におけるｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）によるグローバルな止血の改善を評価した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置前に対象の血液中に加えた場合、血餅形成において同等に活性であると思われる。凝固時間（ＣＴ）は、正常の約１％〜１００％の範囲でｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の用量に関して線状であり、用量応答は、同一対象においてｒＦＶＩＩＩＦｃとＡＤＶＡＴＥ（登録商標）との間で同等であった。
ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびその後のｒＦＶＩＩＩＦｃの用量投与後、種々の時点でクエン酸処理全血をサンプリングし、カルシウム再添加後の血餅形成をＲＯＴＥＭ（登録商標）によりモニタリングした。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの用量投与前の残留物ＦＶＩＩＩレベルによる可変ベースラインＣＴにもかかわらず、両製品は、注射後３０分に、ＣＴを同等のレベルに有効に補正した。加えて、ＣＴの改善は、２５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃの注射時および注射後３時間目に、この低用量で用量投与された対象において、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して良好に持続された。しかしながら、ｒＦＶＩＩＩＦｃ対ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の示差的改善は、６５ＩＵ／ｋｇ用量ではあまり容易に感知できなかった。
（実施例８）
血友病Ａマウスを尾クリップ試験のために使用した。まず、マウスに麻酔をかけ、次いで、４．６μｇ／ｋｇ、１．３８μｇ／ｋｇ、または０．４６μｇ／ｋｇのプロセシングされたｒＦＶＩＩＩＦｃ（約７５％〜８５％のプロセシングされたｒＦＶＩＩＩＦｃを含有する薬剤物質）および精製された一本鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃのいずれかを注射した。注射後、尾を先端から切り取り、直ちに管に入れて、血液を採取した。生存における保護のパーセンテージを、表７および図７に示されるように、プロセシングされたｒＦＶＩＩＩＦｃ（薬剤物質）および一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃに関して測定した。
表７および図７に示されるように、一本鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃによる生存における保護は、プロセシングされたｒＦＶＩＩＩＦｃ（ＤＳ）と同等である。
インビトロＲＯＴＥＭによる凝固活性
ｒＦＶＩＩＩＦｃの凝固力価が、一連の濃度にわたって、全血回転血栓弾性測定（ＲＯＴＥＭ）でさらに調べられ、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ（Ｘｙｎｔｈａ）および組換え完全長ＦＶＩＩＩ（ｒｆｌＦＶＩＩＩ；Ａｄｖａｔｅ）の両方と比較された。インビトロＲＯＴＥＭのために、ｒＦＶＩＩＩタンパク質を、５〜６匹の雄血友病Ａマウスの大静脈から採取されたクエン酸処理したプール血液に、正常血漿ＦＶＩＩＩレベルの０、０．１、１、１０、および１００％の最終濃度まで三重に添加した。ＣａＣｌ２（ＮＡＴＥＭ）の添加により凝固を開始し、凝固時間（ＣＴ）、血餅形成時間（ＣＦＴ）、α角、および最大凝固硬度（ＭＣＦ）が、ＲＯＴＥＭシステム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において記録された。正常ＦＶＩＩＩレベルの０．１〜１００％の段階的に増大する用量で血友病Ａマウスの血液中に添加される３つのタンパク質に関する凝固時間（ＣＴ）、血餅形成時間（ＣＦＴ）、およびα角を図１４に示す。正常の０．１〜１００％の広範囲で、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩ、およびｒｆｌＦＶＩＩＩの中で、ＣＴおよびＣＦＴは、同等である。α角は、１０％で、ｒＦＶＩＩＩＦｃとｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩとの間で唯一有意差がある（ｐ＜０．０５）。
エクスビボＲＯＴＥＭによる凝固活性
ＲＯＴＥＭにより測定して、ｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態を、血友病Ａマウスへの単回静脈注射後、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩおよびｒｆｌＦＶＩＩＩと比較した。エクスビボＲＯＴＥＭのために、雄血友病Ａマウスに、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、およびＸＹＮＴＨＡ（登録商標）を単回用量で静脈注射し、それぞれの時点（用量投与後５分、２４、４８、７２、および９６時間目）で５匹のマウスを殺処分した。大静脈から採取された個々のクエン酸処理した全血が、ＲＯＴＥＭシステム上のＮＡＴＥＭにより直ちに分析され、上述のようにパラメーターが測定された。ＣＴ、ＣＦＴ、およびα角は、用量投与後５分〜９６時間で採取されたサンプルに関して決定され、図１５に示した。５分で、同様のＣＴ、ＣＦＴ、およびα角を生じるすべては同等に有効である（図１５Ａ〜Ｃ）。しかしながら、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ｒＢＤＤ ＦＶＩＩＩおよびｒｆｌＦＶＩＩＩと比較して、７２および９６時間で、有意に改善された（ｐ＜０．０５）ＣＴを示し、ＣＦＴおよびα角は９６時間で示した（図１５Ａ〜Ｃ）。
（実施例９）
組換え因子ＶＩＩＩＦｃ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃドメインと遺伝的に融合するＢドメイン欠失（ＢＤＤ）ｒＦＶＩＩＩからなる。ＨＥＫ２９３細胞から分泌される前に、ｒＦＶＩＩＩＦｃの大部分は、ＦＶＩＩＩ重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ＋Ｆｃ）にプロセシングされる。循環中、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）と複合化され、天然ＦＶＩＩＩと区別できない様式で活性化される時に放出される。ＨＣおよびＬＣの自発的分離は、血漿中およびＦＶＩＩＩの薬物製剤の保存中のＦＶＩＩＩ活性の損失の一因となると考えられる。ここで、天然ＦＶＩＩＩと比較して、優れた製造可能性および増大した安定性を提供し得る、一本鎖がプロセシングされないイソ型のｒＦＶＩＩＩＦｃ（ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を説明する。
ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃを、プロセシングされないイソ型の画分を含有するｒＦＶＩＩＩＦｃから精製した。ｒＦＶＩＩＩＦｃと比較して、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃは、一段階（ａＰＴＴ）アッセイによって等価の発色活性を示したが、活性が約６０％減少したことを示した（表３Ａ〜Ｂ）。トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を、（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（登録商標）による）自動較正トロンボグラムを用いて行なった。トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）では、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃはまた、ｒＦＶＩＩＩＦｃと比較して、減少したトロンビンの有効性（図１３Ａ）およびピークのトロンビン（図１３Ｂ）を示した。しかしながら、表３Ｂで示されるように、ａＰＴＴによるＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃの完全活性が、ｖＷＦの不在下で観察され、ａ３放出および完全にプロセシングされたＦＶＩＩＩからの解離と比較して、ｖＷＦからの放出が、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃ中のＡｒｇ１６８０切断後のＨＣへのａ３酸性領域の共有結合により遅延され得ることを示唆した。ｖＷＦからの遅延した解離は、ａＰＴＴアッセイおよびＴＧＡにおいて観察された減少した活性を説明し得、一方、完全活性は、二段階発色アッセイにおいて観察された。ｖＷＦの存在下で、活性化の減少率は、ＦＶＩＩＩの活性剤として限られたトロンビンを有する修飾された発色基質アッセイにおいて確認された。
ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのインビボ機能を、血友病Ａマウス尾部静脈切断（ＴＶＴ）モデルにおいて評価した。血友病Ａ雄マウスを、ＴＶＴの４８時間前に、ｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物製剤またＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのいずれかの指示された用量で処置した。尾の再出血および生存を、ＴＶＴ後１２時間まで時間ごとにモニタリングし、最終的な観察を、ＴＶＴ後２４時間目に行なった。ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩＦｃは、このモデルにおける等価のインビボ有効性を示し、ＴＶＴが注入後４８時間目に行われた場合、それぞれ、１．１７μｇ／ｋｇおよび１．２３μｇ／ｋｇのＥＤ５０を有した（図７（Ａ））。血友病ＡマウスにおけるＴＶＴ後の２４時間目に同等の生存曲線（ｐ≧０．６５）（図７（Ｂ））および再出血率（図７（Ｃ））が、それぞれの試験した用量レベルで、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩＦｃに関して観察され、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃが、より低い見掛けのａＰＴＴ活性にもかかわらず、ｒＦＶＩＩＩＦｃと同様に有効であったことを示した。したがって、ｖＷＦの存在下でＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃのインビトロ活性化の遅延は、インビボ有効性において有意な影響がないように思われる。それ故に、ＳＣ ｒＦＶＩＩＩＦｃは、臨床的適用を有する可能性がある新規かつ有効なイソ型のｒＦＶＩＩＩＦｃを表す。さらなる試験が、このＦｃ融合タンパク質において、増大した製品の安定性を示すために必要とされるであろう。
（実施例１０）
現行の因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）製品は、約８〜１２時間の半減期（ｔ１／２）を示し、血友病Ａ患者の予防および処置のために頻繁な静脈注射を必要とする。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、循環ｒＦＶＩＩＩ半減期を延長するために、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに共有結合されるＦＶＩＩＩの単一分子からなる組換え融合タンパク質である。重症血友病Ａを有する治療歴のある男性対象におけるこのヒト初回試験は、ｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および薬物動態を調査した。１６人の対象が、単回用量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を２５または６５ＩＵ／ｋｇで投与され、続いて、等用量のｒＦＶＩＩＩＦｃが投与された。ほとんどの有害事象は、研究薬物とは関連しなかった。研究対象のいずれも、抗ＦＶＩＩＩＦｃ抗体または阻害剤を発生しなかった。用量レベルにわたって、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、１．５４〜１．７１倍長い排除ｔ１／２および平均滞留時間、１．４９〜１．５６倍低いクリアランス、および１．４８〜１．５６倍高い総全身曝露を示した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃは、同等の用量依存性のピーク血漿濃度および回復を有した。ベースラインを上回る１％のＦＶＩＩＩ活性までの時間は、用量レベルにわたって、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりも約１．５３〜１．６８倍長かった。それ故に、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、血友病Ａを有する患者における長期の止血保護および用量投与のより少ない頻度を達成するような、実行可能な治療的なアプローチを提供し得る。
血友病Ａは、関節および軟組織への頻繁な突発性および外傷性出血を生じる遺伝性出血性障害である。Ｍａｎｎｕｃｃｉ ＰＭ，Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ ＥＧＤ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４４：１７７３−１７７９（２００１）。不十分に処置される場合、この出血は、慢性関節症、身体障害、および増加した死亡の危険性を引き起こす。Ｓｏｕｃｉｅ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．９６（２）：４３７−４４２（２０００）。
血漿由来ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩ）および組換えヒトＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）製品が、出血エピソードの処置（オンデマンド療法）および予防（予防的療法）のために使用される。ｒＦＶＩＩＩが、血液媒介病原菌の感染、続いて、ＨＩＶおよび肝炎ウイルスを含む血漿製品の広範囲に及ぶ汚染の危険性を軽減するため、およびＦＶＩＩＩ製品の適切な供給を保証するために開発された。しかしながら、現行のＦＶＩＩＩ製品を用いた止血保護は、約８〜１２時間の短半減期（ｔ１／２）のため、時間的に制限されており、ほとんどの突発性出血エピソードに対して保護として確立されているレベルの１％を上回るＦＶＩＩＩレベルを維持するために、ほとんどの患者に対して週に３回または１日おきに予防注射を必要とする。Ｍａｎｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５７（６）：５３５−４４（２００７）。
多くの研究は、高用量でさえ、オンデマンド療法は、関節症を防止するのに有効ではないことを示している。Ａｌｅｄｏｒｔ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２３６：３９１−３９９（１９９４）、Ｐｅｔｒｉｎｉ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１３：２８０−２８７（１９９１）。第一関節出血後に一次予防を開始した小児が、オンデマンドで治療された小児よりも出血が著しく減り、関節損傷が少なかったことを立証した、予防的療法の有益性は、多くの臨床研究４、６〜１５およびＭａｎｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記において実証されている。
オンデマンド治療と比較して、予防的療法はまた、身体障害、入院率、および失われた学習または労働時間を減らし６、１６、患者およびその家族の生活の質を向上する１７。しかしながら、予防的療法は、小児において、中心静脈アクセス装置の使用を必要とし、感染症、敗血症、および血栓症の危険性を伴う場合がある。加えて、これらの有益性にもかかわらず、予防法の承諾およびコンプライアンスは、１つには不便さおよび侵襲性のため、年齢が上がるに伴って減少する１８、１９。それ故に、長期の血漿ｔ１／２を有するｒＦＶＩＩＩ製品は、有効である可能性があり得る。Ｌｉｌｌｉｃｒａｐ Ｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １７：３９３−３９７（２０１０）。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと共有結合しているＢドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩの単一分子からなる組換え融合タンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質の可能性のある利点には、より良好な耐容性および長期の止血保護が含まれ、Ｆｃドメインは、既知の固有の毒性のない天然分子を表す２１、２２。ＩｇＧ１ Ｆｃドメインへの付着は、内皮細胞を含む多くの細胞型において発現される新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を可能にする。ＦｃＲｎ発現は、一生を通じて安定しており、リソソーム分解からのＩｇＧ１およびＦｃ融合タンパク質の保護に関与し、それ故に、タンパク質のｔ１／２を延長する２１，２３。循環内の多くのタンパク質は、非特異的飲作用を通して血管内皮細胞に内在化し、エンドソームおよびリソソーム分解経路に取り込まれる。
Ｆｃタンパク質は、エンドソーム内に常在するＦｃＲｎと相互作用する。ＦｃＲｎを含むエンドソームは、Ｆｃ融合タンパク質を原形質膜に直接戻し、ｐＨ依存性の様式で循環にそれらを放出し２４、それにより、リソソーム分解を回避する。この再生利用アプローチは、治療用生物製剤のｔ１／２を延長するのに首尾よく使用されており、多くのＦｃ融合ベースの薬物は、臨床用途のために承認されており（例えば、エタネルセプト、ロミプロスチム）、その他は開発中である２５、２６。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの前臨床データは、ＦＶＩＩＩが、ＦｃＲｎにより媒介された天然の防御経路による分解から免れ、そのために、ｔ１／２を延長することができることを示す。血友病Ａマウスおよびイヌでは、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関する末端血漿ｔ１／２は、ｒＦＶＩＩＩが有するよりも約２倍長い２７、２８。これらのデータに基づいて、血友病Ａを有する対象における長期にわたるｒＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質の安全性およびＰＫを調査するために、ヒト初回臨床試験を行った。
研究設計：重症血友病Ａを有する治療歴のある患者における、この非盲検、用量増加、多施設、第１／２ａ相研究は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較したｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性およびその薬物動態（ＰＫ）（抗血友病因子［組換え型］、血漿／アルブミンを含まない方法、オクトコグアルファ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を調査した。この研究は、臨床試験実施に関する基準におけるＵＳ ＣＦＲおよびＩＣＨガイドラインに従って行われた。いかなる試験を行う前にも、加入する治験審査委員会の承認およびすべての対象からの書面によるインフォームドコンセントを得た。研究設計は、逐次的であり、単回用量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）は、２５または６５ＩＵ／ｋｇで投与され、続いて、等用量のｒＦＶＩＩＩＦｃが投与された（図８）。両薬物は、約１０分間にわたって静脈注射された。２つの用量レベルは、一般的な治療用量範囲を網羅することが期待された。対象は、注射後１４および２８日目に抗ＦＶＩＩＩ抗体および阻害剤に対する試験を行うことを含み、安全性分析のためにｒＦＶＩＩＩＦｃを受容した後２８日間追跡された。血漿ＦＶＩＩＩ活性を、注射前、ｒＦＶＩＩＩＦｃ注射後、１０および３０分、１、３、６、９、２４、４８、７２、９６、１２０、および１６８時間（７日）目に、対象において測定し、６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを投与された対象に対しては、１９２、２１６、および２４０時間（１０日）にさらなるサンプルを採取した。血漿ＦＶＩＩＩ活性を、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）処置後、２５ＩＵ／ｋｇ群については、７２時間、および６５ＩＵ／ｋｇ群については、９６時間までの同じ時点で測定した。
対象：男性対象は、重症血友病Ａ（１％未満のＦＶＩＩＩ活性レベルと定義される）を有する少なくとも１２歳であり、ＦＶＩＩＩ濃縮物（ｐｄＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩ）に対して少なくとも１００の文書化された事前曝露日を有した。マウスまたはハムスタータンパク質への公知の過感受性を有する、スクリーニング時に阻害剤もしくは検出可能な阻害剤力価の使用歴がある対象、または止血もしくは全身性免疫抑制剤に影響を及ぼし得るいずれかの薬剤を服用した対象、またはスクリーニングの３０日以内に（肝炎もしくはＨＩＶ以外の）活性細菌もしくはウイルス感染を経験した対象は、除外された。対象の遺伝子型が、知られている場合、研究参加時に記録された。
処置製品：ヒトｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＦｃトランス遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞に安定にトランスフェクトし、細胞株を、安全性を確保するために、安定性、滅菌性、およびウイルス感染に関して広範に試験を行った。精製薬物製品は、細胞からの合成および分泌中、第２のＦｃ単量体を用いてジスルフィド結合を形成するＦｃ単量体のＮ末端にそのカルボキシ末端を通して共有結合された単量体Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩからなる。ｒＦＶＩＩＩＦｃを、クロマトグラフィーおよびナノ濾過により精製し、市販のｒＦＶＩＩＩ調製物に対して、一段階および発色凝固アッセイにおいて完全に活性であった。それは、２ｍＬの溶液当たり１０００ＩＵを含む冷凍液として供給され、Ｌ−ヒスチジン（ｐＨ７）、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、スクロース、マンニトール、およびポリソルベート２０を用いて製剤化された。注射のために、この製品は、食塩溶液（０．９％ ＮａＣｌ）で希釈された。
結果の測定項目：この研究の第１の目的は、安全性であり、身体検査、治療中に発生した有害事象（ＡＥ）の報告、抗体の発生、および経時的な実験室モニタリングを通して評価された。第２の目的には、ＰＫ分析から得られたパラメーターが含まれた。実験的評価には、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、国際標準比率、Ｄ二量体レベル、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）抗原、標準的な血液学および血液化学検査、ならびに尿検査が含まれた。
ＦＶＩＩＩ活性を、ヒト血漿に関する世界保健機関（ＷＨＯ）の第５国際標準品（ＩＳ）に対して追跡可能な正常な参照血漿（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ（商標））に対して較正を行った市販の試薬（Ｄａｄｅ Ａｃｔｉｎ ＦＳＬ）を用いて、Ｓｉｅｍｅｎｓ ＢＣＳ−ＸＰ分析器上で一段階凝固（ａＰＴＴ）アッセイによって測定した。ａＰＴＴアッセイに加えて、ＦＶＩＩＩ活性を、ヨーロッパ薬局方の推奨に適合する市販のキット（Ａｎｉａｒａ ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃ）を用いて、発色基質アッセイ２９によって測定した。発色アッセイを、正常なヒト参照血漿（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＯＲＫＥ４５）に対して較正し、これもまた、ＷＨＯの第５ＩＳヒト血漿標準品に対して割り当てられた力価を有した。
一段階および発色アッセイに関する定量下限（ＬＬＯＱ）はそれぞれ、０．５ＩＵ／ｄＬおよび０．４ＩＵ／ｄＬであった。ＦＶＩＩＩ阻害剤を、＊Ｎｉｊｍｅｇｅｎで修正されたＢｅｔｈｅｓｄａアッセイによって測定し、０．６ＢＵ／ｍＬ未満は、陰性であると見なされた。抗ｒＦＶＩＩＩＦｃ抗体を、ビオチンおよびスルホタグ付きｒＦＶＩＩＩＦｃを使用する、特定の架橋電気化学発光免疫学的アッセイを用いて評価した。アッセイ感度は、代理対照として抗ヒトＦＶＩＩＩのモノクローナル抗体を用いて、８９ｎｇ／ｍＬであることが決定された。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃを用いた注射後のグローバルな止血の改善を評価するために、様々な時点で、それぞれの用量レベルから１人ずつ２人の対象において、予備的な全血回転血栓弾性測定法（ＲＯＴＥＭ（登録商標））を行った。
薬物動態分析：内因性ＦＶＩＩＩレベルおよびその後の残留遅延を自動的に推定する、ユーザー定義された１分画分布モデルが、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの単回投与後の個々の対象の血漿ＦＶＩＩＩ活性対時間データの分析のために、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎにおいて使用された。実際のサンプリング時間、用量、および注射期間が、最大活性（Ｃｍａｘ）、ｔ１／２、クリアランス（ＣＬ）、定常状態分布容積（Ｖｓｓ）、濃度曲線下面積（時間ゼロから無限まで外挿された［ＡＵＣＩＮＦ］）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および増分回収率を含む、パラメーターの計算のために使用された。
２５ＩＵ／ｋｇまたは６５ＩＵ／ｋｇの投与レジメン後のＦＶＩＩＩ活性−時間プロファイルを確立するための、ｒＦＶＩＩＩＦｃ活性−対−時間プロファイルのモンテカルロシミュレーション、モンテカルロシミュレーションを、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの集団ＰＫモデルを用いておこなった。試験した集団におけるモデルパラメーター（ＣＬ、分配容積）の平均推定値、個人間分散、および残差変動が、この第１／２ａ相研究において、１６人の対象からのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの一段階（ａＰＴＴ）凝固アッセイ活性データに基づいて推定された。５００人の対象が、それぞれの投与レジメンに関してそれぞれの対象に対して１５のサンプリングポイントでシミュレートされた。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの異なる投与レジメン後の、異なる時間で、１％および３％以上のＦＶＩＩＩ活性を有する集団のパーセンテージが推定された。
統計的分析−ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に対して選択されたＰＫパラメーターが、変動モデルの分析を用いて比較された。ＰＫパラメーターは、これらの分析に対して対数変換され、対数尺度における推定された平均、平均差、および信頼区間を変換して、元の尺度における、幾何平均推定値、幾何平均比（ＧＭＲ）、および信頼区間のそれぞれを得た。ＧＭＲは、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫパラメーター値対ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）のＰＫパラメーター値の対象間の幾何平均比である。
結果
対象分布−１９人の対象が、この研究において登録され、１６人が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの両方に関してＰＫ評価を受けた。１人の対象は、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を用いた用量投与後、休薬期間を完了する前に前回の製品を自己投与し、そのため、ＰＫ分析から除外されたが、安全性分析には含まれた。３人の対象は、いずれかの研究薬物を受容するまえに研究を中止された：１人は、自発的に中止した、２人目は、ノンコンプライアンスのため、主治医が中止した、もう１人は、研究登録の完了によりスポンサーの要求で中止した。投与された対象のうち、６人の対象は、２５ＩＵ／ｋｇを受容し、１０人の対象は、６５ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの両方を受容した。平均年齢は、４０．３歳（２３〜６１歳）であった。遺伝子型特定は、７人の対象に関して収集された、イントロン２２の逆位が、６人の対象において報告され、フレームシフト異常が１人の対象において報告された。遺伝子型は、９人の対象に関して不明であった。１３人の対象は、Ｃ型肝炎抗体を有し、そのうちの４人はまた、ＨＩＶに対して陽性であった。
安全性−４４の治療中に発生した有害事象が、治療中およびフォローアップ期間、１１人（６９％）の対象によって報告された。これには、ＡｄｖａｔｅまたはｒＦＶＩＩＩＦｃを投与した日から投与後２８日の観察期間までが含まれた。事象の大部分は、軽度であると見なされ、試験の中止をもたらすものはなかった。６５ＩＵ／ｋｇの用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを受容する間に、１人の対象において、１つの事象である味覚障害が一時的に生じ、これは、ｒＦＶＩＩＩＦｃと関連すると見なされた。
１人の対象は、６５ＩＵ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩＦｃを受容した後、不安発作を経験し、２１の有害事象が生じ、これらのうちの１９は、軽度として段階付けられ、このうちの２つ（頭痛および羞明）は、中等度と判断された。主治医によりどちらもｒＦＶＩＩＩＦｃと関連するとは見なされなかった。
重篤な出血エピソードは報告されなかった。注射へのアレルギー反応の証拠は検出されなかった。試験したすべての血漿サンプルは、ＦＶＩＩＩ阻害剤および抗ｒＦＶＩＩＩＦｃ抗体に対して陰性であった。注射部位の反応の兆候は、観察されなかった。異常な実験室での値の臨床的に有意な変化は報告されなかった。
薬物動態：血漿中のｒＦＶＩＩＩＦｃに対するａＰＴＴと発色活性との間の相関関係−ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃ活性は、市販の試薬および正常なヒト血漿標準に対する較正を用いて同じアッセイにおいて決定された。ＬＬＯＱを上回る活性を有したサンプルにおいて、一段階凝固アッセイおよび発色アッセイによって得られた結果の間に強い相関関係があった。０．９４および０．９５の相関係数（ピアソンＲ２）がそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の用量投与後の１５１のサンプルおよびｒＦＶＩＩＩＦｃの用量投与後の１８５のサンプルに対する２つのアッセイ間で観察された。ａＰＴＴの結果と比較して、発色ＦＶＩＩＩ活性は、平均して、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）に関しては、２１％高く、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関しては３２％高かったが、統計的に有意でなかった（図９）。この観察は、両薬物に対する発色評価による曝露パラメーターのわずかに高い推定をもたらした。発色アッセイにより明らかに高いＦＶＩＩＩ回収率は、臨床アッセイにおいて試験された組換えＦＶＩＩＩ製品では一般的であり、大部分のその他の販売されているＦＶＩＩＩ製品と一致している３０〜３２。
ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する改善された薬物動態−第１のＰＫ推定値は、一段階（ａＰＴＴ）凝固アッセイ活性データから得られた。２５または６５ＩＵ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を受容した後、等用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを受容した対象において、血漿ＦＶＩＩＩ活性は、急激に上昇し、用量投与後１時間以内にＣｍａｘに達した。その後の観察ＦＶＩＩＩ活性の減少は、ベースラインＦＶＩＩＩ活性に到達するまで単一指数型崩壊特性を示した（図１０）。Ｃｍａｘは、用量に対して比例的に増加したが、等用量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）とｒＦＶＩＩＩＦｃとの間で同等であった（表８）。総曝露（ＡＵＣＩＮＦ）はまた、用量に対して比例的に増加した。しかしながら、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＡＵＣＩＮＦは、２５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＝０．００２）および６５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）でそれぞれ、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）のものよりも１．４８および１．５６倍長かった（表８）。
ｔ１／２、ＭＲＴ、ＣＬ、およびＶｓｓは、用量から独立しているように思われた（表８）。２５ＩＵ／ｋｇおよび６５ＩＵ／ｋｇの両用量群に対するｒＦＶＩＩＩＦｃの幾何平均ｔ１／２は、１８．８時間であった。これは、それぞれ、等価用量で、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）のもの（１２．２時間および１１．０時間）を上回る、１．５４および１．７０倍の改善（ｐ＜０．００１）を表す（表８）。同じ対象内の改善が、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（２５ＩＵ／ｋｇに対して１７．５時間および６５ＩＵ／ｋｇに対して１５．８時間）と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＭＲＴ（両用量群に対して２７．０時間）において観察された（ｐ＜０．００１）。ｔ１／２およびＭＲＴにおける改善と一致して、それぞれ、２５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＝０．００２）および６５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）の用量で、対応する対象内のクリアランスが１．４９および１．５６倍減少した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）とｒＦＶＩＩＩＦｃとの間でＶｓｓおよび増分回収率における有意差はなかった。したがって、それぞれの対象内で、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して改善されたＰＫプロファイルを示した。また、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）においてより短い半減期を有する患者は、ｒＦＶＩＩＩＦｃにおいてより短い半減期を有し、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）においてより長い半減期を有する患者は、ｒＦＶＩＩＩＦｃにおいてより長い半減期を有することも観察された。
ｒＦＶＩＩＩＦｃの改善されたＰＫプロファイルは、それぞれ、２５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）および６５ＩＵ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）で、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を用いるよりも１．５３および１．６８倍長い、用量投与後の１％ＦＶＩＩＩ活性への時間の増加をもたらし（データは示さず）、これはｒＦＶＩＩＩＦｃに対して治療の持続時間が長い可能性があることを示唆している。
ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃの有利なＰＫプロファイルもまた、発色アッセイにおいて測定されたＦＶＩＩＩ活性によっても実証され、ａＰＴＴアッセイから得られたデータと同等であった（表９）。しかしながら、曝露の推定、すなわち、ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦは、発色アッセイに基づき、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）およびｒＦＶＩＩＩＦｃの両方に対する一段階（ａＰＴＴ）凝固アッセイよりもわずかに高かった。
フォンウィルブランド因子とｒＦＶＩＩＩＦｃの動態との間の相関関係−循環中の大部分のＦＶＩＩＩがＶＷＦと複合しているため３３、およびゲノム規模関連研究は遺伝的決定基のＦＶＩＩＩレベルが主にＶＷＦレベルに依存していることを特定しているため３４、ＶＷＦとｒＦＶＩＩＩＦｃとの間の関連性を調べた。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の両方に関して、ＶＷＦレベルとＣＬおよびｔ１／２との間に強い相関関係が観察された。図１０で示されるように、ＶＷＦレベルが増加すると、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（ｐ＝０．００１２）のＣＬが減少した（ｐ＝０．００１６）。
ＶＷＦレベルとｔ１／２との間に逆の関係が観察された。ＶＷＦレベルが増加すると、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（ｐ＝０．０００３）およびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（ｐ＜０．０００１）のｔ１／２が増加した。この相関関係は、ｒＦＶＩＩＩＦｃのＦｃ部分がクリアランスからのＦＶＩＩＩの保護においてＶＷＦの役割を変えないことを示唆している。
全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）におけるｒＦＶＩＩＩＦｃの長期のＰＫの効果−研究薬物の投与前に、それぞれの用量群中の１人の対象から血液に、等用量のｒＦＶＩＩＩＦｃまたはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を添加し、全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）によって分析した。凝固時間（ＣＴ）は、正常の約１％〜１００％の範囲で用量に関して線状であり、用量応答は、同じ対象においてｒＦＶＩＩＩＦｃとＡＤＶＡＴＥ（登録商標）との間で同等であり（データは示さず）、これは、血餅形成において、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の同等の力価を示した。
ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはｒＦＶＩＩＩＦｃの投与前の残留物ＦＶＩＩＩレベルによる可変ベースラインＣＴにもかかわらず、両製品は、用量投与後３０分に、ＣＴを同等のレベルまで有効に補正した（図１２）。ＣＴの改善は、２５ＩＵ／ｋｇの用量投与から３時間後（図１２Ａ）、および６５ＩＵ／ｋｇの用量投与から２４時間後（図１２Ｂ）、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）よりもｒＦＶＩＩＩＦｃによってより良好に持続した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、両用量で対象によって良好な耐容性を示した。血液学、血液化学、または尿検査のパラメーターにおいて観察された臨床的に有意な変化はなかった。有害事象の大部分は、軽度であり、ｒＦＶＩＩＩＦｃに関連せず、続発症なく消散した。研究中、重篤な有害事象または死亡は生じず、いずれの用量で、対象は、ｒＦＶＩＩＩＦｃに対する中和または結合抗体を発生しなかった。
ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、有意に改善されたＦＶＩＩＩ活性のＰＫプロファイルを示し、一段階（ａＰＴＴ）凝固アッセイによって測定して、用量レベルにわたってｔ１／２およびＭＲＴは、１．５４〜１．７１倍長く、二段階発色アッセイによっては１．５９〜１．８４倍長かった。ｒＦＶＩＩＩＦｃの長期活性は、可能な長期効力を予測し、血友病Ａを有する患者の予防的処置における投与レジメンのより少ない頻度を可能にする。
この研究から得られたＰＫパラメーターを採用して、モンテカルロシミュレーションは、等用量のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）を受容する患者と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃを受容する患者のより高いパーセンテージが、１％または３％を上回るＦＶＩＩＩレベルを持続するであろうと予測する（表１０）。例えば、２５ＩＵ／ｋｇの用量で、７１．２％のｒＦＶＩＩＩＦｃ患者に対して１２．２％のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）患者は、４日目に１％を上回るＦＶＩＩＩのトラフレベルを有することが予測され、６５ＩＵ／ｋｇの用量で、６６．４％のｒＦＶＩＩＩＦｃ患者に対して１１．０％のＡＤＶＡＴＥ（登録商標）患者は、４日目に３％を上回るＦＶＩＩＩレベルを有することが予測される。より多くの患者における臨床試験が、この第１／２ａ相研究およびモンテカルロシミュレーションからの結果を確証するために計画されている。
様々なタンパク質治療薬に関する循環ｔ１／２の延長におけるＦｃ融合技術の成功にもかかわらず、ｒＦＶＩＩＩは、大きすぎて、二量体Ｆｃ融合物をうまく産生することができないと見なされていた。それ故に、単量体Ｆｃ融合タンパク質を作製し、これにより、単一のエフェクター分子が、二量体Ｆｃに共有結合し、細胞内ＦｃＲｎと結合し、その後、再利用することができる２１、２２。インビトロ凝固アッセイは、市販の試薬および一般的に使用されるＦＶＩＩＩ参照標準品を用いて、凝固アッセイまたは発色アッセイのいずれによっても、Ｂドメイン欠失または天然ＦＶＩＩＩと比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃに対して比活性の損失がないことを示す（ＪＡＤ，ＴＬ，ＳＣＬ，ｅｔ ａｌ．，２０１１年８月に手書き原稿で提出）。加えて、これらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦｃが、一段階アッセイまたは発色法のいずれかによって、臨床的設定において確実に検定され得ることを示す。
要約すれば、この第１／２ａ相臨床試験は、重症血友病Ａを有する患者におけるｒＦＶＩＩＩＦｃの安全性および長期のｔ１／２を示すための第１の試験である。極めて重要な第３相研究は、血友病Ａを有する個人に対して、有効な予防の投与レジメンを確立するために、ｒＦＶＩＩＩＦｃを用いて継続中である。
（実施例１１）
生合成中、残基Ｒ１６４８で不完全なタンパク質分解によって生じる、新規の一本鎖（ＳＣ）イソ型の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、天然ＦＶＩＩＩと比較して、優れた製造可能性および安定性を提供し得る。免疫グロブリンＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）およびその精製ＳＣの等価物（ＳＣ−ｒＦＶＩＩＩＦｃ）と融合する単一組換えＢドメイン欠失因子ＶＩＩＩ分子は、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）が欠失している血漿を用いた一段階凝固アッセイにおいて同様の比活性度を示したが、ＳＣ−ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＶＷＦの存在下で、より低い比活性度を示した。この研究は、ＶＷＦ結合ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣ−ｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ ＡＦ（登録商標））が、ＶＷＦからのトロンビンで媒介された放出とは異なるかどうかを決定するために企てられた。
等モル量のｒＦＶＩＩＩＦｃ、ＳＣ−ｒＦＶＩＩＩＦｃ、およびｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩが、ヒトＶＷＦがアミン結合により固定化された光バイオセンサーチップ上に捕捉された。一連の濃度でヒトα−トロンビンを、チップ表面上に注入し、固定化したＶＷＦからのＦＶＩＩＩ放出率を実時間でモニターした。α−トロンビンの半最大有効濃度（ＥＣ５０）を、それぞれのＦＶＩＩＩ種に対して決定した。
ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩに対するα−トロンビンＥＣ５０値は、同等であった（それぞれ３．７±０．２Ｕ／ｍＬおよび３．２±０．３Ｕ／ｍＬ）が一方、ＳＣ−ｒＦＶＩＩＩＦｃに対するＥＣ５０値は、３倍以上高かった（１１．７±０．９Ｕ／ｍＬ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのいずれよりもＳＣ−ｒＦＶＩＩＩＦｃがＶＷＦからよりゆっくりと放出されるというこの所見は、ＶＷＦがアッセイ血漿サンプル中に存在した場合にのみ、ＳＣ−ＦＶＩＩＩＦｃがより低い見掛けの活性を有した、一段階凝固アッセイ（ａＰＴＴ）において、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＳＣ−ｒＦＶＩＩＩＦｃの活性に関して以前に観察された所見と一致する。しかしながら、すべてのサンプルは、マウス出血モデルにおける等価の活性を有し、ＶＷＦからのＦＶＩＩＩの放出におけるトロンビンへのＦＶＩＩＩ調製物の反応性は、インビボの有効性とは相関しないことを示した。


参考文献
４．Ａｌｅｄｏｒｔ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．：２３６：３９１−３９９（１９９４）。
５．Ｐｅｔｒｉｎｉ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１３：２８０−２８７（１９９１）。
６．Ａｚｎａｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ６（３）：１７０−１７６（２０００）。
７．Ｆｅｌｄｍａｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．４：１２２８−１２３６（２００６）。
８．Ｋｒｅｕｚ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ４：４１３−４１７（１９９８）。
９．Ｌｉｅｓｎｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｂ Ｊ Ｈａｅｍ．９２：９７３−９７８（１９９６）。
１０．Ｌｊｕｎｇ Ｒ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．４（４）：４０９−４１２（１９９８）。
１１．Ｌｏｅｆｑｕｉｓｔ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２４１：３９５−４００（１９９７）。
１２．Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂ．Ｊ Ｉｎｔ Ｍｅｄ ２３２：２５−３２（１９９２）。
１３．Ｒｉｓｅｂｒｏｕｇｈ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．１４：７４３−７５２（２００８）。
１４．Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ９（Ｓｕｐｐｌ．１）：２７−３１（２００３）。
１５．Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８９（６）：６４５−６５０（２００４）。
１６．Ｍｏｌｈｏ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ６（１）：２３−３２（２０００）。
１７．Ｃｏｐｐｏｌａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ．６（２）：４−１１（２００８）。
１８．Ｇｅｒａｇｈｔｙ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２：７５−８１（２００６）。
１９．Ｈａｃｋｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ７（４）：３９２−３９６（２００１）。
２０．Ｌｉｌｌｉｃｒａｐ Ｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １７：３９３−３９７（２０１０）。
２１．Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０（３）：１５１−６０（２００６）。
２２．Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｌｏｎｇ ｌａｓｔｉｎｇ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ，” ｉｎ：Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ
Ｒ．，ｅｄ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；ｉｎ ｐｒｅｓｓ。
２３．Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（９）：７１５−２５（Ｅｐｕｂ ２００７ Ａｕｇ １７）。
２４．Ｌｅｎｃｅｒ Ｗ．Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｒ．Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５（１）：５−９（２００５）。
２５．Ｈｕａｎｇ Ｃ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（６）：６９２−９．（Ｅｐｕｂ ２００９ Ｎｏｖ ４）。
２６．Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．１２（２）：２８４−２９５（２００９）。
２７．Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１１６（２１） Ａｂｓｔｒａｃｔ ５４５（２００９）。
２８．Ｌｉｕ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．９（Ｓ２）：５６１（２０１１）。
２９．Ｒｏｓｅｎ Ｓ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ Ｓｕｐｐｌ．３３（Ｓｕｐｐｌ ４０）：１３９−４５（１９８４）。
３０．Ｌｅｅ Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．８２（６）：１６４４−７（Ｄｅｃ．１９９９）。
３１．Ｍｉｋａｅｌｓｓｏｎ Ｍ．ａｎｄ Ｏｓｗａｌｄｓｓｏｎ Ｕ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２８（３）：２５７−６４（Ｊｕｎｅ ２００２）。
３２．Ｓｔｒｏｏｂａｎｔｓ Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．９（Ｓｕｐｐｌ ２）（２０１１）。
３３．Ｌｅｎｔｉｎｇ Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．５：１３５３−６０（２００７）。
３４．Ｓｍｉｔｈ Ｎ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２１：１３８２−１３９２（２０１０）。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
JP2017028814A 2011-07-08 2017-02-20 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法 Pending JP2017088623A (ja)

Applications Claiming Priority (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161506015P 2011-07-08 2011-07-08
US61/506,015 2011-07-08
US201161522647P 2011-08-11 2011-08-11
US61/522,647 2011-08-11
US201161541561P 2011-09-30 2011-09-30
US61/541,561 2011-09-30
US201161569158P 2011-12-09 2011-12-09
US61/569,158 2011-12-09
US201261586443P 2012-01-13 2012-01-13
US61/586,443 2012-01-13
US201261622789P 2012-04-11 2012-04-11
US61/622,789 2012-04-11
US201261657641P 2012-06-08 2012-06-08
US61/657,641 2012-06-08

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014519074A Division JP2014522838A (ja) 2011-07-08 2012-07-06 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018223631A Division JP7273487B2 (ja) 2011-07-08 2018-11-29 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2017088623A true JP2017088623A (ja) 2017-05-25

Family

ID=47506823

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014519074A Withdrawn JP2014522838A (ja) 2011-07-08 2012-07-06 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP2017028814A Pending JP2017088623A (ja) 2011-07-08 2017-02-20 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP2018223631A Active JP7273487B2 (ja) 2011-07-08 2018-11-29 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP2021170188A Withdrawn JP2022003096A (ja) 2011-07-08 2021-10-18 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP2023124309A Pending JP2023134851A (ja) 2011-07-08 2023-07-31 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014519074A Withdrawn JP2014522838A (ja) 2011-07-08 2012-07-06 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018223631A Active JP7273487B2 (ja) 2011-07-08 2018-11-29 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP2021170188A Withdrawn JP2022003096A (ja) 2011-07-08 2021-10-18 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP2023124309A Pending JP2023134851A (ja) 2011-07-08 2023-07-31 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法

Country Status (27)

Country Link
US (3) US10010622B2 (ja)
EP (3) EP3513804B1 (ja)
JP (5) JP2014522838A (ja)
KR (2) KR101829603B1 (ja)
CN (2) CN107261122A (ja)
AR (1) AR087091A1 (ja)
AU (3) AU2012282875B2 (ja)
BR (1) BR112014000466A2 (ja)
CA (1) CA2841066C (ja)
CL (1) CL2014000024A1 (ja)
CO (1) CO6940381A2 (ja)
CY (1) CY1122900T1 (ja)
DK (2) DK3513804T3 (ja)
EA (1) EA029045B1 (ja)
ES (2) ES2913994T3 (ja)
HR (2) HRP20220639T1 (ja)
HU (1) HUE043763T2 (ja)
IL (2) IL230333B (ja)
LT (2) LT3513804T (ja)
MX (1) MX350581B (ja)
MY (1) MY180714A (ja)
PL (2) PL3513804T3 (ja)
PT (2) PT2729161T (ja)
RS (2) RS63241B1 (ja)
SI (2) SI3513804T1 (ja)
TW (3) TWI764092B (ja)
WO (1) WO2013009627A2 (ja)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE497783T1 (de) * 2003-05-06 2011-02-15 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor vii-fc chimäre proteine zur behandlung von hämostatischen krankheiten
WO2008074032A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
PL2459224T3 (pl) 2009-07-27 2017-08-31 Baxalta GmbH Koniugaty białka związanego z krzepnięciem krwi
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
NZ597600A (en) 2009-07-27 2014-05-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
DK2459224T3 (en) 2009-07-27 2016-07-25 Baxalta GmbH Blodstørkningsproteinkonjugater
AU2010325787B2 (en) 2009-12-06 2016-05-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-Fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
HUE049352T2 (hu) 2010-12-22 2020-09-28 Baxalta GmbH Anyagok és módszerek egy vízoldható zsírsavszármazéknak egy fehérjéhez való konjugálására
EP3513804B1 (en) * 2011-07-08 2022-03-23 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
SI2802668T1 (sl) * 2012-01-12 2019-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Zmanjšanje imunogeničnosti proti faktorju VIII pri posameznikih, ki se zdravijo zaradi faktorja VIII
EP3521321B1 (en) 2012-04-11 2020-11-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of detecting glycosaminoglycans
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc CHIMERIC COAGULATION FACTORS
AU2013270682A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
US10023628B2 (en) 2012-07-06 2018-07-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor VIII polypeptides and uses thereof
WO2014070953A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FVIII Polypeptide
ES2959747T3 (es) * 2013-02-15 2024-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Gen del factor VIII optimizado
ES2926798T3 (es) 2013-03-15 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
US9234757B2 (en) 2013-11-29 2016-01-12 Fedex Corporate Services, Inc. Determining node location using a variable power characteristic of a node in a wireless node network
US10453023B2 (en) 2014-05-28 2019-10-22 Fedex Corporate Services, Inc. Methods and node apparatus for adaptive node communication within a wireless node network
US11238397B2 (en) 2015-02-09 2022-02-01 Fedex Corporate Services, Inc. Methods, apparatus, and systems for generating a corrective pickup notification for a shipped item using a mobile master node
US10305744B2 (en) * 2015-07-08 2019-05-28 Fedex Corporate Services, Inc. System, apparatus, and methods of event monitoring for an event candidate related to an ID node within a wireless node network
PE20231949A1 (es) 2015-10-30 2023-12-05 Spark Therapeutics Inc VARIANTES DEL FACTOR VIII REDUCIDO CON CpG, COMPOSICIONES Y METODOS Y USOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA
HRP20221089T1 (hr) 2016-02-01 2022-11-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizirani geni faktora viii
EP3433809A4 (en) 2016-03-23 2019-10-02 Fedex Corporate Services, Inc. SYSTEMS, APPARATUS AND METHODS FOR AUTOMATIC ADJUSTMENT OF BROADCAST ADJUSTMENT OF A NODE IN A WIRELESS NODE NETWORK
WO2018032638A1 (zh) 2016-08-19 2018-02-22 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
CN110520149A (zh) * 2016-12-02 2019-11-29 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 诱导对凝血因子的免疫耐受性的方法
JP7370974B2 (ja) 2017-11-07 2023-10-30 ラニ セラピューティクス， エルエルシー 嚥下可能薬物送達デバイスを使用する腸管組織への送達のための凝固因子調製物
WO2019175380A2 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
EP3765064A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
US12098179B2 (en) 2018-03-16 2024-09-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
KR20210005872A (ko) * 2018-03-28 2021-01-15 오리오니스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 이작용성 단백질 및 이의 작제물
JP2021523878A (ja) 2018-05-18 2021-09-09 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 血友病ａを処置する方法
CA3137539A1 (en) * 2019-05-03 2020-10-20 Rani Therapeutics, Llc Clotting factor preparations for delivery into tissue of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
CA3144630A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods and compositions for treating hemophilia and low bone mineral density with factor viiifc protein
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011069164A2 (en) * 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
CA1341174C (en) 1985-04-12 2001-01-30 John J. Toole Jr. Procoagulant proteins derived from factor viii: c
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
DE3785102T2 (de) 1986-01-03 1993-07-22 Genetics Inst Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ-proteinen.
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
CA1331157C (en) 1987-04-06 1994-08-02 Randal J. Kaufman Method for producing factor viii:c-type proteins
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US4994371A (en) 1987-08-28 1991-02-19 Davie Earl W DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences
US5004803A (en) 1988-11-14 1991-04-02 Genetics Institute, Inc. Production of procoagulant proteins
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
ATE148171T1 (de) 1989-02-21 1997-02-15 Univ Washington Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
SG47099A1 (en) 1991-03-15 1998-03-20 Amgen Boulder Inc Pegylation of polypeptides
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US5859204A (en) 1992-04-07 1999-01-12 Emory University Modified factor VIII
US5364771A (en) 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US5563045A (en) * 1992-11-13 1996-10-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric procoagulant proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
WO2001058957A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
EP1572889B1 (en) * 2001-10-05 2008-12-17 Expression Therapeutics, LLC Nucleic acid and amino acid sequences encoding high-level expressor factor viii polypeptides and methods of use
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ATE497783T1 (de) 2003-05-06 2011-02-15 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor vii-fc chimäre proteine zur behandlung von hämostatischen krankheiten
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
PT2371856T (pt) 2004-11-12 2022-08-12 Bayer Healthcare Llc Modificação de fviii direcionada a sítio
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
SG123635A1 (en) 2004-12-28 2006-07-26 Nanoscience Innovation Pte Ltd Nanostructured zinc oxide and a method of producing the same
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
EP1996937A4 (en) 2006-03-06 2009-04-08 Amunix Inc GENETIC PACKS AND USES THEREOF
CA2673459C (en) * 2006-12-22 2016-09-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
DK2369005T3 (da) 2007-06-21 2013-06-24 Univ Muenchen Tech Biologisk aktive proteiner med forøget stabilitet in vivo og/eller in vitro
AU2008287340A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
US8239182B2 (en) 2007-12-04 2012-08-07 Spansion Llc Data transmission system-on-chip memory model based validation
CN102348715B (zh) 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
NZ605400A (en) * 2010-07-09 2015-05-29 Biogen Idec Hemophilia Inc Chimeric clotting factors
EP3508573A1 (en) * 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EP3513804B1 (en) * 2011-07-08 2022-03-23 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011069164A2 (en) * 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM J., 1995, VOL.312, P.49-55, JPN6016015560, ISSN: 0003977258 *
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1994, VOL.269, NO.25, P.17329-17337, JPN6016015562, ISSN: 0003977259 *
日本輸血学会雑誌, vol. 36, no. 3, JPN6017017017, 1990, pages 406 - 410, ISSN: 0003977260 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140066157A (ko) 2014-05-30
EP2729161B1 (en) 2018-12-19
AU2018202936B2 (en) 2020-07-02
TW201822788A (zh) 2018-07-01
EP3513804A1 (en) 2019-07-24
PL2729161T3 (pl) 2019-08-30
DK3513804T3 (da) 2022-06-20
ES2913994T3 (es) 2022-06-07
RS63241B1 (sr) 2022-06-30
PL3513804T3 (pl) 2022-07-11
HUE043763T2 (hu) 2019-09-30
IL271870A (en) 2020-02-27
AU2018202936A1 (en) 2018-05-17
AU2016204986A1 (en) 2016-08-04
CN107261122A (zh) 2017-10-20
AR087091A1 (es) 2014-02-12
MX2014000202A (es) 2014-10-06
SI2729161T1 (sl) 2019-05-31
NZ619438A (en) 2016-06-24
EA029045B1 (ru) 2018-02-28
MY180714A (en) 2020-12-07
HRP20220639T1 (hr) 2022-07-08
AU2016204986B2 (en) 2018-05-10
TW202042838A (zh) 2020-12-01
TWI626947B (zh) 2018-06-21
TWI764092B (zh) 2022-05-11
HRP20190535T1 (hr) 2019-05-17
CA2841066A1 (en) 2013-01-17
LT3513804T (lt) 2022-05-25
LT2729161T (lt) 2019-04-10
KR101829603B1 (ko) 2018-02-19
EP2729161A4 (en) 2015-06-24
ES2722209T3 (es) 2019-08-08
DK2729161T3 (en) 2019-04-08
US10881742B2 (en) 2021-01-05
KR20180020305A (ko) 2018-02-27
AU2012282875A1 (en) 2013-05-02
CO6940381A2 (es) 2014-05-09
PT2729161T (pt) 2019-04-01
EA201490039A1 (ru) 2014-06-30
CY1122900T1 (el) 2021-05-05
US20140294821A1 (en) 2014-10-02
EP3513804B1 (en) 2022-03-23
WO2013009627A3 (en) 2013-03-07
US20210220476A1 (en) 2021-07-22
WO2013009627A2 (en) 2013-01-17
EP4169525A1 (en) 2023-04-26
US20180360982A1 (en) 2018-12-20
US10010622B2 (en) 2018-07-03
CA2841066C (en) 2023-09-26
EP2729161A2 (en) 2014-05-14
JP2022003096A (ja) 2022-01-11
PT3513804T (pt) 2022-06-02
TW201315480A (zh) 2013-04-16
JP2014522838A (ja) 2014-09-08
TWI687226B (zh) 2020-03-11
SI3513804T1 (sl) 2022-07-29
JP2019048877A (ja) 2019-03-28
KR102110736B1 (ko) 2020-05-14
CN103796670A (zh) 2014-05-14
IL271870B (en) 2022-04-01
MX350581B (es) 2017-09-11
JP2023134851A (ja) 2023-09-27
AU2012282875B2 (en) 2016-04-21
RS58578B1 (sr) 2019-05-31
CL2014000024A1 (es) 2014-11-21
JP7273487B2 (ja) 2023-05-15
BR112014000466A2 (pt) 2017-02-21
IL230333B (en) 2020-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7273487B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
JP6641340B2 (ja) 第ＶＩＩＩ−Ｆｃ因子キメラおよびハイブリッドポリペプチドならびにその使用法
EP2968477B1 (en) Factor viii polypeptide formulations
EP3552619A1 (en) Factor ix polypeptides and methods of use thereof
EP3446700A1 (en) Methods of using fviii polypeptide
JP2023101713A (ja) 血友病ａを処置する方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170220

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170928

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171228

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180531

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180830

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20181018

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20190214