TW201315480A - 因子ｖｉｉｉ嵌合及雜交多肽，及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供投與因子VIII(經加工之FVIII、單鏈FVIII或其組合)之方法；投與包含因子VIII之嵌合及雜交多肽之方法；包含因子VIII之嵌合及雜交多肽；編碼該等嵌合及雜交多肽之多核苷酸；包含該等多核苷酸之細胞；及使用該等細胞製備該等嵌合及雜交多肽之方法。
Description
與本發明一起提交之ASCII文本檔案(名稱：sequencelisting_ascii.txt；大小：____位元組；及創建日期：____)中以電子方式提交之序列表的內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明大體關於用於止血病症之治療劑的領域。
血友病A為由因子VIII(FVIII)基因中之突變及/或缺失(從而導致FVIII活性缺乏)引起的X性聯出血病症(Peyvandi,F.等人Haemophilia 12：82-89(2006)。該疾病之特徵在於自發性流血及創傷後過量出血。隨時間推移，肌肉及關節中之重複出血(其通常始於兒童早期)引起血友病性關節病及不可逆關節損傷。此損傷為進行性的且可導致關節活動性嚴重受限、肌肉萎縮及慢性疼痛(Rodriguez-Merchan,E.C.,Semin.Thromb.Hemost.29：87-96(2003)，其以全文引用之方式併入本文中)。
A2域為因子VIII分子之促凝血活性所必需。研究顯示，豬因子VIII具有人類因子VIII六倍高的促凝血活性(Lollar,P.及E.T.Parker,J.Biol.Chem.266：12481-12486(1991))，且人類與豬因子VIII之間凝血活性的差
異似乎基於在胺基酸序列中人類與豬A2域中一或多個殘基之間的差異(Lollar,P.等人，J.Biol.Chem.267：23652-23657(1992))，以全文引用之方式併入本文中。
治療血友病A係藉由目標在於使FVIII活性恢復至正常程度之1至5%以預防自發性出血的替代療法(Mannucci,P.M.等人，N.Engl.J.Med.344：1773-1779(2001)，其以全文引用之方式併入本文中)。存在可用於按需治療出血事件或藉由預防性治療來防止出血事件發生的血漿來源及重組FVIII產品。然而，基於此等產品之短半衰期(例如8-12小時)，治療方案需要頻繁投與靜脈內注射。該頻繁投與痛苦且不便。
降低死亡率、預防關節損傷及提高生活品質因血漿來源及重組FVIII之開發已獲得重要進展。出血保護延長將代表血友病A患者治療之另一關鍵進步。然而，迄今為止，尚未開發出允許長期止血保護之產品。因此，仍對比現有療法更耐受、持續時間更長且更有效之治療因子VIII缺乏所致之血友病的改良方法存在需要。
本發明提供投與因子VIII之方法；投與包含因子VIII之嵌合多肽及該等嵌合多肽之雜交物的方法；包含因子VIII之嵌合多肽及該等嵌合多肽之雜交物；編碼該等嵌合及雜交多肽之多核苷酸；包含該等多核苷酸之細胞；及使用該等細胞製造該等嵌合及雜交多肽之方法。
本發明提供向有需要之受試者投與因子VIII之方法，其包括向該受試者投與治療劑量之嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽，給藥間隔為相等劑量之無非因子VIII部分之該因子VIII(由該因子VIII部分組成之多肽)(例如無Fc部分)所需要的給藥間隔之至少約一倍半長。
給藥間隔可為相等劑量之無非因子VIII部分(例如Fc部分)之該因子VIII(由該因子VIII部分組成之多肽)所需要的給藥間隔之至少約一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長。給藥間隔可為相等劑量之無非因子VIII部分(例如Fc部分)之該因子VIII(由該因子VIII部分組成之多肽)所需要的給藥間隔之至少約一倍半、兩倍、兩倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍長。給藥間隔可為約每五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天或更長時間一次。
給藥間隔可為至少約一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更長時間。
本發明亦提供向有需要之受試者投與因子VIII之方法，其包括向該受試者投與治療劑量之嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽，以獲得由相等劑量之無非因子VIII部分之該因子VIII(由該因子VIII部分組成之多肽)(例如無Fc部分)所獲得的血漿濃度對時間曲線下面積(AUC)之至少約一又四分之一倍大的AUC。
本發明亦提供向有需要之受試者投與因子VIII之方法，其包括向該受試者投與治療劑量之包含因子VIII及Fc的多肽，給藥間隔為約每三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天或更長時間一次。
本發明之方法可對需要預防性治療或按需治療之受試者實施。
按需治療包括治療出血事件、關節血腫、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內流血、口腔流血、創傷、頭部創傷(trauma capitis)(頭部創傷(head trauma))、胃腸出血、顱內流血、腹內流血、胸內流血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血或髂腰肌鞘出血。受試者可能需要手術預防、手術前後管理或手術預備治療(treatment for surgery)。該等手術包括例如小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。
對於按需治療，該嵌合多肽之給藥間隔為約每24-36、24-48、24-72、24-96、24-120、24-144、24-168、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
可用於本發明方法中之治療劑量為約10至約100 IU/kg，更特定言之為約10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100 IU/kg，且更特定言之為約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 IU/kg。
可用於本發明方法中之治療劑量為約10至約150 IU/kg，更特定言之為約100-110、110-120、120-130、130-140、140-150 IU/kg，且更特定言之為約110、115、120、125、130、135、140、145或150 IU/kg。
本發明方法中之受試者為人類受試者。給藥間隔及AUC之確定可在單一受試者或在受試者群體中進行。
因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)為人類因子VIII。因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)之B域可完全或部分缺失。
因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)可與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸4至2351)至少90%或95%一致。因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)可與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)相同。
因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)可與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)至少
90%或95%一致。因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)可與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)相同。
Fc部分(或嵌合多肽之Fc部分)可與表2中所示之Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)至少90%或95%一致。Fc部分(或嵌合多肽之Fc部分)可與表2中所示之Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)相同。
嵌合多肽可包含與表2A(i)中所示無信號序列之因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)至少90%或95%一致或與表2A(i)中所示有信號序列之因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列。嵌合多肽可包含與表2A(i)中所示無信號序列之因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)相同或與表2A(i)中所示有信號序列之因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)相同的序列。
嵌合多肽可呈包含與該嵌合多肽締合之第二多肽的雜交物形式，其中該第二多肽包含Fc或基本上由Fc組成。
第二多肽可包含以下或基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)至少90%或95%一致或與表2A(ii)中所示
有信號序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。第二多肽可包含以下或基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)相同或與表2A(ii)中所示有信號序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)相同的序列。
嵌合多肽或雜交物可作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物的一部分投與。
本發明亦提供上述嵌合及雜交多肽本身、編碼其之多核苷酸、包含該等多核苷酸之培養人類胚胎細胞及產生該等嵌合及雜交多肽之方法，及由該等方法產生之多肽。
本發明亦提供包含因子VIII部分及第二部分之具有因子VIII活性之嵌合多肽，其中該因子VIII部分為包含兩條鏈之經加工之因子VIII，第一鏈包含重鏈且第二鏈包含輕鏈，其中該第一鏈及該第二鏈由金屬鍵締合。舉例而言，嵌合多肽之因子VIII部分之至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%為經加工之因子VIII。
此外，本發明包括具有因子VIII活性之嵌合多肽，其中該因子VIII多肽為單鏈因子VIII。在一個態樣中，單鏈因子VIII可含有完整細胞內加工位點。在一實施例中，嵌合多肽之因子VIII部分之至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%或約25%為單鏈因子VIII。在另一實施例中，嵌合多肽之因子VIII部分之至少約30%、約
40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或約99%為單鏈因子VIII。在另一態樣中，單鏈FVIII不含細胞內加工位點。舉例而言，SCFVIII包含對應於精胺酸1645之胺基酸位置處之取代或突變、對應於精胺酸1648之胺基酸位置處之取代或突變，或對應於全長因子VIII中精胺酸1645與精胺酸1648之胺基酸位置處之取代或突變。在對應於精胺酸1645之胺基酸位置處取代之胺基酸為與在對應於精胺酸1648之胺基酸位置處取代之胺基酸不同的胺基酸。在某些實施例中，取代或突變為除精胺酸以外之胺基酸，例如丙胺酸。
在一些實施例中，當在活體外藉由發色分析量測因子VIII活性時，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽具有程度與由兩個Fc部分及融合於該兩個Fc部分中一者之經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子VIII活性。在其他實施例中，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽在活體內具有與由兩個Fc部分及融合於該兩個Fc部分中一者之經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子VIII活性。在其他實施例中，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽具有與由兩個Fc部分及融合於該兩個Fc部分中一者之經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子Xa產生速率。在某些實施例中，嵌合多肽中之單鏈因子VIII由活化之蛋白質C不活化之程度與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當。在其他實施例中，嵌合多肽中之單鏈因子VIII具有與由兩個Fc部分及經加工因
子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當之因子IXa相互作用速率。在其他實施例中，嵌合多肽中之單鏈因子VIII以與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當之程度結合血友病因子(von Willebrand Factor)。
本發明進一步包括包含具有因子VIII活性之嵌合多肽之組合物，其中該多肽之至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%包含為單鏈因子VIII之因子VIII部分及第二部分，其中該單鏈因子VIII與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)至少90%或95%一致。在一實施例中，第二部分可為Fc。在另一實施例中，多肽呈包含第二多肽之雜交物形式，其中該第二多肽基本上由Fc組成。在其他實施例中，該多肽具有由該因子VIII組成之多肽之至少一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長的半衰期。
亦提供治療出血病狀之方法，其包括投與治療有效量之組合物。該治療可為預防性治療或按需治療或手術前後治療。出血凝血病症可為血友病。在一實施例中，所治療之受試者為小兒科受試者。
本發明亦針對預防、減少或治療受試者之出血事件之方法，其包括向該受試者投與有效量之長效因子
VIII(FVIII)蛋白，其中該受試者在血漿中表現高含量之血友病因子(VWF)。在一實施例中，受試者已鑒別為在血漿中表現高含量之VWF。本發明亦針對預防、減少或治療受試者之出血事件之方法，其包括：(a)藉由量測受試者血漿中VWF之含量鑒別具有高VWF含量之該受試者，其中至少約100 IU/dL之VWF含量將該受試者鑒別為具有高VWF含量；及(b)向該受試者投與有效量之長效FVIII蛋白。
在一實施例中，受試者為人類。在另一實施例中，受試者為小兒科受試者。在另一實施例中，受試者患有血友病A。
在一實施例中，VWF之高含量為至少約100 IU/dL。在另一實施例中，VWF之高含量在約100 IU/dL與約200 IU/dL之間。在另一實施例中，VWF之高含量為約110 IU/dL、約120 IU/dL、約130 IU/dL、約140 IU/dL、約150 IU/dL、約160 IU/dL、約170 IU/dL、約180 IU/dL、約190 IU/dL或約200 IU/dL。
在一實施例中，受試者具有血液血清型A、B或AB。
在一實施例中，長效FVIII蛋白在該受試者體內具有約20與約40小時之間的半衰期。在另一實施例中，長效FVIII蛋白具有約21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時或40小時之
半衰期。在另一實施例中，長效FVIII蛋白具有約20與約27小時之間的半衰期。在另一實施例中，長效FVIII蛋白具有為該該長效FVIII蛋白投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期之至少約1.2倍大的半衰期。在另一實施例中，長效FVIII蛋白具有為該該長效FVIII蛋白投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期之至少約約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大的半衰期。
在一實施例中，所投與之長效FVIII蛋白之有效量為至少約20 IU/kg、至少約25 IU/kg、至少約30 IU/kg、至少約35 IU/kg、至少約40 IU/kg、至少約45 IU/kg、至少約50 IU/kg、至少約55 IU/kg、至少約60 IU/kg、至少約65 IU/kg、至少約70 IU/kg、至少約75 IU/kg、至少約80 IU/kg、至少約85 IU/kg或至少約90 IU/kg。在另一實施例中，有效量為至少約65 IU/kg至至少約90 IU/kg。在另一實施例中，有效量為80 IU/kg。
在一實施例中，長效FVIII蛋白每72小時或更長時間投與一次。在另一實施例中，長效FVIII蛋白約一週或更長時間投與一次。在另一實施例中，長效FVIII蛋白約每10天投與一次、約每兩週投與一次、約每15天投與一次、約每20天投與一次、約每三週投與一次、約每25天投與一次、約每四週投與一次或約每一個月投與一次。
在一實施例中，長效FVIII以80 IU/kg之劑量每72小時投與一次。在另一實施例中，長效FVIII向小兒科受
試者以80 IU/kg之劑量每72小時投與一次。
在一實施例中，投與長效FVIII蛋白消退多於5-20%、多於5-15%、多於5-10%、多於10-20%或多於10-15%之出血事件。在一實施例中，受試者體內血漿因子VIII：C之穀含量維持高於1-3或3-5 IU/dl。在一實施例中，該投與預防受試者之出血事件。在另一實施例中，出血事件為自發性的。在另一實施例中，該投與消退多於80-100%、多於80-90%、多於85-90%、多於90-100%、多於90-95%或多於95-100%之出血事件。
在一實施例中，該投與在需要手術之受試者之群體中維持止血。在另一實施例中，長效FVIII蛋白在手術之前、期間或之後投與。在另一實施例中，手術為小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。在另一實施例中，手術為急救外科手術。
在一實施例中，長效FVIII蛋白具有長於由FVIII組成之多肽的半衰期。在另一實施例中，長效FVIII蛋白經聚乙二醇化、羥乙基澱粉化或聚唾液酸化。
在一實施例中，長效FVIII蛋白為包含FVIII部分及第二部分之嵌合蛋白。在另一實施例中，第二部分為Fc區、白蛋白、PAS序列、轉鐵蛋白、CTP(具有4個O-聚醣之hCG之28個胺基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合多肽、白蛋白結合
小分子或其兩個或兩個以上組合。在另一實施例中，第二部分融合於FVIII部分之胺基端或羧基端。在另一實施例中，第二部分插入於FVIII部分中之兩個胺基酸之間。在另一實施例中，嵌合蛋白為FVIIIFc單體二聚體雜交物。在另一實施例中，FVIII部分為單鏈。在另一實施例中，FVIII部分包含重鏈及輕鏈。在另一實施例中，FVIII部分包含全長因子VIII、成熟因子VIII或B域完全或部分缺失之因子VIII。在另一實施例中，FVIII部分包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2332至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在另一實施例中，FVIII部分包含SEQ ID NO：2之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2332。在另一實施例中，嵌合多肽包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1439至1665或SEQ ID NO：6之胺基酸2333至2559至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的Fc區。在另一實施例中，第二部分包含SEQ ID NO：2之胺基酸1439至1665或SEQ ID NO：6之胺基酸2333至2559。在另一實施例中，長效FVIII多肽作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物之一部分投與。
本發明亦提供治療診斷患有出血病症之受試者的方法，其包括量測該受試者體內FVIII-Fc之半衰期，其中為正常受試者體內FVIII-Fc半衰期之至少約1.2倍大之半衰期指示該受試者為長間隔給藥之候選者，及以有效量及至
少3天之給藥間隔投與FVIII-Fc多肽。
本發明亦提供治療診斷患有出血病症之受試者之方法，其包括以有效量及至少3天之給藥間隔向受試者投與FVIII-Fc多肽，其中該受試者體內FVIII-Fc之半衰期為FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期的至少約1.2倍大。
在一實施例中，該受試者體內FVIII-Fc之血漿半衰期為FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之血漿半衰期的至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。在另一實施例中，FVIII-Fc血漿半衰期在20-40小時之間。在另一實施例中，長效FVIII蛋白具有約21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時或40小時之半衰期。在另一實施例中，長效FVIII蛋白具有約20與約27小時之間的半衰期。
本發明亦提供治療診斷患有出血病症之受試者的方法，其包括量測投與該受試者之短效FVIII之半衰期，其中為該短效FVIII在具有平均VWF含量之受試者體內之半衰期的至少約1.2倍大之半衰期指示該受試者為長間隔給藥之候選者，及以有效量及至少3天之給藥間隔投與長效FVIII-Fc多肽。在一實施例中，該受試者體內短效FVIII之半衰期為短效FVIII投與具有平均含量VWF之受
試者時之半衰期的至少約1.3、14、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
在一實施例中，受試者為人類。在另一實施例中，受試者為小兒科受試者。在另一實施例中，受試者患有血友病A。在另一實施例中，受試者具有血液血清型A、B或AB。
在一實施例中，長效FVIII-Fc以以下有效量投與：至少約20 IU/kg、至少約25 IU/kg、至少約30 IU/kg、至少約35 IU/kg、至少約40 IU/kg、至少約45 IU/kg、至少約50 IU/kg、至少約55 IU/kg、至少約60 IU/kg、至少約65 IU/kg、至少約70 IU/kg、至少約75 IU/kg、至少約80 IU/kg、至少約85 IU/kg或至少約90 IU/kg。在另一實施例中，有效量為至少約65 IU/kg至至少約90 IU/kg。
在一實施例中，有效量之FVIII-Fc蛋白約每週投與一次、約每10天投與一次、約每兩週投與一次、約每15天投與一次、約每20天投與一次、約每三週投與一次、約每25天投與一次、約每四週投與一次或約每一個月投與一次。
在一實施例中，該投與消退多於5-20%、多於5-I5%、多於5-10%、多於10-20%或多於10-15%之出血事件。在一實施例中，受試者體內血漿因子VIII：C之穀含量維持高於1-3或3-5 IU/dl。
在一實施例中，該投與預防受試者之出血事件。在一實施例中，出血事件為自發性的。在一實施例中，該投與
消退多於80-100%、多於80-90%、多於85-90%、多於90-100%、多於90-95%或多於95-100%之出血事件。在一實施例中，該投與在需要手術之受試者之群體中維持恆定。在一實施例中，FVIII-Fc蛋白在手術之前、期間或之後投與。在一實施例中，手術為小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。在一實施例中，手術為急救外科手術。
在一實施例中，FVIII-Fc蛋白具有長於由FVIII組成之多肽的半衰期。在一實施例中，FVIII-Fc蛋白經聚乙二醇化、羥乙基澱粉化或聚唾液酸化。在一實施例中，FVIII-Fc蛋白為FVIIIFc單體二聚體雜交物。在一實施例中，FVIII部分為單鏈。在一實施例中，FVIII部分包含重鏈及輕鏈。在一實施例中，FVIII部分包含全長因子VIII、成熟因子VIII或B域完全或部分缺失之因子VIII。在一實施例中，FVIII部分包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2332至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一實施例中，FVIII部分包含SEQ ID NO：2之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2332。在一實施例中，嵌合多肽之第二部分包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1439至1665或SEQ ID NO：6之胺基酸2333至2559至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、
98%、99%或100%一致的Fc區。在一實施例中，第二部分包含SEQ ID NO：2之胺基酸1439至1665或SEQ ID NO：6之胺基酸2333至2559。
在一實施例中，FVIII-Fc多肽作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物之一部分投與。
本發明亦提供用於確定診斷患有出血病症之受試者是否為用於長間隔給予長效FVIII多肽之候選者的方法，其包括量測血漿VWF之表現量，其中至少100 IU/dL之VWF表現量指示該受試者為使用長效FVIII多肽進行長間隔給藥的候選者。在一實施例中，VWF表現量為至少約110 IU/dL、約120 IU/dL、約130 IU/dL、約140 IU/dL、約150 IU/dL、約160 IU/dL、約170 IU/dL、約180 IU/dL、約190 IU/dL或約200 IU/dL。
本發明亦提供用於確定診斷患有出血病症之受試者是否為用於長間隔給予長效FVIII多肽之候選者的方法，其包括量測該受試者體內FVIII-Fc之半衰期，其中為FVIII-Fc投與具有平均VWF含量之受試者時之半衰期的至少約1.2倍大之半衰期指示該受試者為長間隔給藥之候選者。在一實施例中，FVIII-Fc之半衰期為FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期的至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
本發明亦提供用於確定診斷患有出血病症之受試者是否為用於長間隔給予長效FVIII多肽之候選者的方法，其
包括量測該受試者體內短效FVIII之半衰期，其中為短效FVIII投與具有平均VWF含量之受試者時之半衰期的至少約1.2倍大之半衰期指示該受試者為長間隔給藥之候選者。在一實施例中，半衰期為FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期的至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
本發明提供利用因子VIII(經加工、單鏈或其組合)使用比用當前已知之因子VIII產品可能使用者長之給藥間隔及/或大之AUC治療血友病A的方法。本發明亦提供改良之因子VIII嵌合多肽及製造方法。
治療血友病A係藉由目標在於使FVIII活性恢復至正常程度之1至5%以預防自發性出血的替代療法(Mannucci,P.M.等人，N.Engl.J.Med.344：1773-1779(2001)，其以全文引用之方式併入本文中)。存在可用於按需治療出血事件或藉由預防性治療來防止出血事件發生的血漿來源及重組FVIII產品。基於此等產品之短半衰期(例如8-12小時)(White G.C.等人，Thromb.Haemost.77：660-7(1997)；Morfini,M.,Haemophilia 9(增刊1)：94-99；discussion 100(2003))，治療方案需要頻繁靜脈內投與，通常對於預防而言為每週兩次至三次且對於按需治療而言為每日一次至三次(Manco-Johnson,M.J.等人，N.Engl.J.Med.357：535-544(2007))，各自以全文引用之方式併入本文中。該
頻繁投與致人痛苦且不便。
本發明提供向有需要之人類受試者(例如人類患者)投與因子VIII之方法，其包括向該受試者投與治療劑量之嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽，或該種多肽之雜交物，給藥間隔為相等劑量之無非因子VIII部分之該因子VIII(由該因子VIII部分組成之多肽)(例如無Fc部分)所需要的給藥間隔之至少約一倍半長。本發明亦針對增加因子VIII投與在有需要之人類受試者中之給藥間隔的方法，其包含投與嵌合因子VIII多肽。
給藥間隔可為相等劑量之無非因子VIII部分之該因子VIII(由該因子VIII部分組成之多肽)(例如無Fc部分)所需要的給藥間隔之至少約一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長。給藥間隔可為相等劑量之無非因子VIII部分之該因子VIII(由該因子VIII部分組成之多肽)(例如無Fc部分)所需要的給藥間隔之至少約一倍半、兩倍、兩倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍長。給藥間隔可為約每三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天或更長時間一次。
給藥間隔可為至少約一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更長時間。
本發明亦提供向有需要之人類受試者投與因子VIII之方法，其包括向該受試者投與治療劑量之嵌合因子VIII
多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽，或該種多肽之雜交物，以獲得由相等劑量之無非因子VIII部分之該因子VIII(由該因子VIII部分組成之多肽)(例如無Fc部分)所獲得的血漿濃度對時間曲線下面積(AUC)之至少約一又四分之一倍大的AUC。本發明因此包括增加或延長因子VIII活性在有需要之人類受試者中之AUC的方法，其包括投與嵌合因子VIII多肽。
本發明亦提供向有需要之受試者投與因子VIII之方法，其包括向該受試者投與治療劑量之包含因子VIII及Fc的多肽或該種多肽之雜交物，給藥間隔為約每三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天或更長時間一次。
本發明之方法可對需要預防性治療或按需治療之受試者實施。
如本文所用之「投與」意謂經由醫藥學上可接受之途徑向受試者給予本發明之醫藥學上可接受之因子VIII多肽。投與途徑可為靜脈內，例如靜脈內注射及靜脈內輸注。其他投與途徑包括例如皮下、肌肉內、經口、經鼻及肺部投與。嵌合多肽及雜交蛋白可作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物的一部分投與。
如本文所用之「血漿濃度對時間曲線下面積(AUC)」與藥理學技術中之術語相同，且係基於投與後因子VIII吸收之速率及程度。AUC係針對指定時期(諸如12、18、24、36、48或72小時)測定，或使用外推法基於曲線之斜
率針對無窮大測定。除非本文另外說明，否則AUC係針對無窮大測定。AUC之測定可在單一受試者中進行，或在受試者群體中進行，其中針對該受試者群體計算平均值。
如本文所用，因子VIII之「B域」與此項技術中已知藉由內部胺基酸序列一致性及凝血酶蛋白水解裂解位點界定之B域相同，例如全長人類因子VIII之殘基Ser741-Arg1648。其他人類因子VIII域由以下胺基酸殘基界定：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基Arg2033-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。其餘序列(殘基Glu1649-Arg1689)通常稱為因子VIII輕鏈活化肽。豬、小鼠及犬因子VIII之所有域(包括B域)之邊界的位置在此項技術中亦已知。在一實施例中，因子VIII之B域缺失(「B域缺失因子VIII」或「BDD FVIII」)。BDD FVIII之一實例為REFACTO®(重組BDD FVIII)，其具有與表2A(i)中序列之因子VIII部分相同之序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或20至1457)。在另一實施例中，B域缺失因子VIII含有完整細胞內加工位點，其對應於B域缺失因子VIII殘基754處之精胺酸(其對應於SEQ ID NO：2之精胺酸殘基773)或全長因子VIII殘基1648處之精胺酸(其對應於SEQ ID NO：6之精胺酸殘基1667)。除非另外指示，否則未提及任何SEQ ID編號時本文所用之序列殘基編號對應於無信號肽序列(19個胺基酸)之因子VIII序列。舉例而言，歸因於19個胺基酸之信
號肽序列，全長因子VIII之S743/Q1638對應於SEQ ID NO：6之S762/Q1657。在其他實施例中，B域缺失FVIII包含對應於精胺酸1645之胺基酸位置處之取代或突變、對應於精胺酸1648之胺基酸位置處之取代或突變，或對應於全長因子VIII中精胺酸1645與精胺酸1648之胺基酸位置處之取代或突變。在一些實施例中，在對應於精胺酸1645之胺基酸位置處取代之胺基酸為與在對應於精胺酸1648之胺基酸位置處取代之胺基酸不同的胺基酸。在某些實施例中，取代或突變為除精胺酸以外之胺基酸，例如丙胺酸。
「B域缺失因子VIII」可具有以下文獻中揭示之完全或部分缺失：美國專利第6,316,226號、第6,346,513號、第7,041,635號、第5,789,203號、第6,060,447號、第5,595,886號、第6,228,620號、第5,972,885號、第6,048,720號、第5,543,502號、第5,610,278號、第5,171,844號、第5,112,950號、第4,868,112號及第6,458,563號，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之B域缺失因子VIII序列包含美國專利第6,316,226號(亦在US 6,346,513中)之第4欄第4行至第5欄第28行及實例1-5所揭示之任一缺失。在一些實施例中，本發明的B域缺失因子VIII具有美國專利第5,789,203號(亦為US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620)之第2欄第26-51行及實例5-8所揭示之缺失。在一些實施例中，B域缺失因子VIII具有
以下中所述之缺失：美國專利第5,972,885號之第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利第6,048,720號之第6欄第1-22行及實例1；美國專利第5,543,502號之第2欄第17-46行；美國專利第5,171,844號之第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利第5,112,950號之第2欄第55-68行、第2圖及實例1；美國專利第4,868,112號之第2欄第2行至第19欄第21行及表2；美國專利第7,041,635號之第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利第6,458,563號之第4欄第25-53行。在一些實施例中，B域缺失因子VIII已缺失大部分B域，但仍含有B域中為初級轉譯產物活體內蛋白水解加工成兩條多肽鏈所必需至胺基端序列(亦即細胞內加工位點)，如WO 91/09122中所揭示，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，B域缺失因子VIII構建成缺失胺基酸747-1638，亦即B域幾乎完全缺失。Hoeben R.C.等人，J.Biol.Chem.265(13)：7318-7323(1990)，以全文引用之方式併入本文中。B域缺失因子VIII亦可含有因子VIII至胺基酸771-1666或胺基酸868-1562之缺失。Meulien P.等人，Protein Eng.2(4)：301-6(1988)，以全文引用之方式併入本文中。作為本發明之一部分之其他B域缺失包括例如缺失胺基酸982至1562或760至1639(Toole等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：5939-5942(1986))、797至1562(Eaton等人， Biochemistry 25：8343-8347(1986))、741至1646(Kaufman(PCT公開申請案第WO 87/04187號))、747-1560(Sarver等人，DNA 6：553-564(1987))、741至1648(Pasek(PCT申請案第88/00831號))、816至1598或741至1689(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82：16-25,EP 295597))，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。前述各缺失可在任何因子VIII序列中進行。
在一實施例中，嵌合多肽中之B域缺失因子VIII部分經加工為由金屬鍵連接(或締合)之兩條鏈，第一鏈包含重鏈(A1-A2-部分B)且第二鏈包含輕鏈(A3-C1-C2)。在另一實施例中，B域缺失因子VIII部分為單鏈因子VIII。單鏈因子VIII可包含細胞內加工位點，其對應於B域缺失因子VIII之殘基754(SEQ ID NO：2之殘基773)或全長因子VIII之殘基1648(SEQ ID NO：6之殘基1657)處之精胺酸。
重鏈與輕鏈之間的金屬鍵可為此項技術中已知之任何金屬。舉例而言，適用於本發明之金屬可為二價金屬離子。可用於締合重鏈與輕鏈之金屬包括(但不限於)Ca2+、Mn2+或Cu2+。Fatouros等人，Intern.J.Pharm.155(1)：121-131(1997)；Wakabayashi等人，JBC.279(13)：12677-12684(2004)。
如本文所用，「嵌合多肽」意謂其中包括來自不同來源之至少兩種多肽(或子序列或肽)之多肽。嵌合多肽可包括例如來自不同來源(諸如不同基因、不同cDNA或不同
動物或其他物種)之兩種、三種、四種、五種、六種、七種或七種以上多肽。嵌合多肽可包括例如連接不同子序列之一或多個連接子。因此，在單一嵌合多肽內，子序列可直接連接或其可經由連接子間接連接或兩者。嵌合多肽可包括例如其他肽，諸如信號序列及有助於蛋白質純化或偵測之序列(諸如6His及FLAG)。此外，嵌合多肽可在N端及/或C端具有胺基酸或肽添加。
在一些實施例中，嵌合多肽包含因子VIII部分及非因子VIII部分。示範性非因子VIII部分包括例如Fc、XTEN、白蛋白、PAS序列、轉鐵蛋白、CTP(具有4個O-聚醣之人類絨毛膜促性腺素(hCG)之28個胺基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合多肽及白蛋白結合小分子。本發明之示範性嵌合多肽包括例如嵌合因子VIII-Fc多肽、嵌合因子VIII-XTEN多肽、嵌合因子VIII-白蛋白多肽、嵌合因子VIII-PAS多肽、嵌合因子VIII-轉鐵蛋白多肽、嵌合因子VIII-CTP多肽、嵌合因子VIII-PEG多肽、嵌合因子VIII-HES多肽、嵌合因子VIII-白蛋白結合多肽多肽及嵌合因子VIII-白蛋白結合小分子多肽。
示範性嵌合因子VIII-Fc多肽包括例如有或無信號序列之SEQ ID NO：2或6(表2)及SEQ ID NO：4之嵌合Fc多肽(表2)。
嵌合多肽可包含與表2A(i)中所示無信號序列之因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)
至少90%或95%一致或與表2A(i)中所示有信號序列之因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列，其中該序列具有因子VIII活性。因子VIII活性可藉由活化部分凝血酶原激酶時間(aPPT)分析、發色分析或其他已知方法量測。嵌合多肽可包含與表2A(i)中所示無信號序列之因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)相同或與表2A(i)中所示有信號序列之因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)相同的序列。
如上文所論述，示範性嵌合多肽包括融合於一或多個XTEN多肽之因子VIII。Schellenburger等人，Nat.Biotech.27：1186-90(2009)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。XTEN多肽可融合於FVIII之N端或FVIII之C端。可在XTEN部分與因子VIII部分之間包括蛋白酶位點以允許該加工。XTEN多肽包括例如以下文獻中揭示者：WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO 2007/103515、US 2010/0189682及US 2009/0092582，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。
如上文所論述，示範性多肽亦包括融合於一或多個白蛋白多肽、白蛋白結合多肽或白蛋白結合小分子之因子VIII。在一實施例中，白蛋白為人類白蛋白。白蛋白或白蛋白結合蛋白可融合於FVIII之N端或FVIII之C端，或插入FVIII中之兩個胺基酸之間。可用於本發明中之白蛋白(例如其片段)之實例為已知的。例如美國專利第
7,592,010號；美國專利第6,686,179號；及Schulte,Thrombosis Res.124增刊2：S6-S8(2009)，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。
白蛋白結合多肽可包含(但不限於)細菌白蛋白結合域、白蛋白結合肽或可結合白蛋白之白蛋白結合抗體片段。如Kraulis等人，FEBS Lett.378：190-194(1996)及Linhult等人，Protein Sci.11：206-213(2002)所揭示來自鏈球菌蛋白質G之域3為白蛋白結合域之一實例。白蛋白結合肽之實例包括具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：7)之一系列肽。參見例如Dennis等人，J.Biol.Chem.2002,277：35035-35043(2002)。白蛋白結合抗體片段之實例揭示於以下文獻中：Muller及Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9：319-326(2007)；Rooverset等人，Cancer Immunol.Immunother.56：303-317(2007)；及Holt等人，Prot.Eng.Design Sci.,21：283-288(2008)，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
在某些態樣中，本發明之重組FVIII多肽包含至少一個用於非多肽小分子、變異體或其可結合白蛋白之衍生物的連接位點。該等白蛋白結合部分之一實例為2-(3-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標籤)，如Trusselet等人，Bioconjugate Chem.20：2286-2292(2009)所揭示。
如上文所論述，示範性嵌合多肽亦包括融合於至少一個人類絨毛膜促性腺素之C端肽(CTP)之β次單元或其片
段、變異體或衍生物的因子VIII。CTP可在FVIII之N端或FVIII之C端融合於因子VIII，或插入FVIII中之兩個胺基酸之間。融合於重組蛋白或插入重組蛋白中之抑或多個CTP肽已知增加該蛋白質之活體內半衰期。參見例如美國專利第5,712,122號，以全文引用之方式併入本文中。示範性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO：8)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：9)。參見例如美國專利申請公開案第US 2009/0087411 A1號，以引用之方式併入本文中。
如上文所論述，示範性嵌合多肽亦包括融合於至少一個PAS序列或其片段、變異體或衍生物的因子VIII。PAS序列可融合於FVIII之N端或FVIII之C端，或插入FVIII中之兩個胺基酸之間。如本文所用之PAS肽或PAS序列意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸或脯胺酸殘基之胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成隨機螺旋構形。因此，PAS序列為包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸、基本上由丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸組成或由丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸組成之構築嵌段、胺基酸聚合物或序列卡匣，其可用作嵌合蛋白質中異源部分之一部分。胺基酸聚合物亦可在添加除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之殘基作為PAS序列中之次要成分時形成隨機螺旋構形。「次要成分」意謂除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之胺基酸可以某一程度添加於PAS序列中，例如至多
約12%，亦即PAS序列之100個胺基酸中約12個，至多約10%、至多約9%、至多約8%、約6%、約5%、約4%、約3%，亦即約2%或約1%之胺基酸。不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸可選自由以下組成之群：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val。在生理條件下，PAS肽形成隨機螺旋構形且由此可介導增加本發明重組蛋白之活體內及/或活體外穩定性，且具有促凝血活性。
PAS肽之非限制性實例包括ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO：10)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO：11)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO：12)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO：13)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO：14)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO：15)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO：16)或其任何變異體、衍生物、片段或組合。PAS序列之其他實例自例如美國專利公開案第2010/0292130 A1號及PCT申請公開案第WO 2008/155134 A1號、歐洲頒予專利EP2173890知曉。
如上文所論述，示範性嵌合多肽亦包括融合於至少一個轉鐵蛋白肽或其片段、變異體或衍生物的因子VIII。至少一個轉鐵蛋白肽可融合於FVIII之N端或FVIII之C端，或插入FVIII中之兩個胺基酸之間。任何轉鐵蛋白可融合於本發明之重組FVIII蛋白或插入本發明之重組
FVIII蛋白中。作為一實例，野生型人類Tf(Tf)為約75 KDa(未計算糖基化)之679個胺基酸之蛋白質，具有兩個主要域N(約330個胺基酸)及C(約340個胺基酸)，該等域似乎來源於基因重複。參見GenBank寄存編號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，全部以全文引用之方式併入本文中。
轉鐵蛋白經由轉鐵蛋白受體(TfR)介導之內吞作用來轉運鐵。在鐵釋放至內體代謝區中且Tf-TfR複合物再循環至細胞表面後，Tf再釋放至細胞外間隙以進行下一鐵轉運循環。Tf具有超過14-17天之長半衰期(Li等人，Trends Pharmacol.Sci.23：206-209(2002))。已針對半衰期延長、用於癌症療法之靶向傳遞、經口傳遞及胰島素原之持續活化對轉鐵蛋白融合蛋白進行了研究(Brandsma等人，Biotechnol.Adv.,29：230-238(2011)；Bai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：7292-7296(2005)；Kim等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,334：682-692(2010)；Wang等人，J.Controlled Release155：386-392(2011))。
如上文所論述，示範性嵌合多肽亦包括融合於至少一個聚乙二醇(PEG)部分之因子VIII。
聚乙二醇化FVIII可指FVIII與至少一個聚乙二醇(PEG)分子之間形成的結合物。PEG可以多種分子量及平均分子量範圍購得。PEG平均分子量範圍之典型實例包括但不限於約200、約300、約400、約600、約1000、約
1300-1600、約1450、約2000、約3000、約3000-3750、約3350、約3000-7000、約3500-4500、約5000-7000、約7000-9000、約8000、約10000、約8500-11500、約16000-24000、約35000、約40000、約60000和約80000道爾頓(dalton)。該等平均分子量僅作為實例提供且不欲以任何方式具有限制性。
本發明之重組FVIII蛋白可經聚乙二醇化以包括單個或多個(例如2-4個)PEG部分。聚乙二醇化可藉由此項技術中已知之任何聚乙二醇化反應進行。製備聚乙二醇化蛋白質產物之方法通常包括(i)時多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使得本發明之肽連接至一或多個PEG基團之條件下反應；及(ii)獲得反應產物。一般而言，用於該等反應之最佳反應條件將基於已知參數及所要結果逐項確定。
存在多種熟習此項技術者可用之PEG連接方法，例如Malik F等人，Exp.Hematol.20：1028-35(1992)；Francis,Focus on Growth Factors 3(2)：4-10(1992)；歐洲專利公開案第EP0401384號、第EP0154316號及第EP0401384號；及國際專利申請公開案第WO92/16221號及第WO95/34326號。作為一非限制性實例，FVIII變異體可在FVIII中之一或多個插入位點中含有半胱胺酸取代，且該等半胱胺酸可進一步結合於PEG聚合物。參見Mei等人，Blood 116：270-279(2010)及美國專利第7,632,921號，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
如上文所論述，示範性嵌合多肽亦包括融合於至少一個羥乙基澱粉(HES)聚合物之因子VIII。HES為天然存在之支鏈澱粉之衍生物且在體內由α-澱粉酶降解。HES展現有利生物性質且用作血容量替代劑且在臨床上用於血液稀釋療法中。參見例如Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie 8：271-278(1987)；及Weidler等人，Arzneim.-Forschung/Drug Res.41：494-498(1991)。
HES之主要特徵在於分子量分佈及取代度。HES具有1至300 kD、2至200kD、3至100 kD或4至70 kD之平均分子量(分子量平均值)。羥乙基澱粉可進一步展現0.1至3、0.1至2、0.1至0.9或0.1至0.8之莫耳取代度，及關於羥乙基2至20範圍內之C2：C6取代比率。平均分子量為約130 kD之HES為來自Fresenius之Voluven®。Voluven®為人工膠體，用於例如治療及預防低血容量症之治療指示中所用之容量替代。存在多種熟習此項技術者可用之HES連接方法，例如與上文所述之PEG連接方法相同。
在一些實施例中，包含因子VIII部分之嵌合多肽具有相比於由相同因子VIII部分組成而無非因子VIII部分之多肽增加之半衰期(t1/2)。t1/2增加之嵌合因子VIII多肽在本文中可稱為長效因子VIII。長效嵌合因子VIII多肽包括例如融合於Fc之因子VIII(包括例如呈雜交物形式之嵌合因子VIII多肽，諸如FVIIIFc單體二聚體雜交物；參見實例1、第1圖及表2A；及美國專利第7,404,956號
及第7,348,004號)、融合於XTEN之因子VIII，及融合於白蛋白之因子VIII。
如本文所用，「培養(Culture/to culture/culturing)」意謂在允許細胞生長或分裂或維持細胞呈活性狀態之活體外條件下培育細胞。如本文所用，「培養細胞」意謂活體外繁殖之細胞。
除非另外說明，否則如本文所用之「因子VIII」意謂在凝血中發揮正常作用之功能性因子VIII多肽。因此，術語因子VIII包括具有功能性之變異型多肽。因子VIII蛋白可為人類、豬、犬及鼠類因子VIII蛋白。如背景技術部分中所描述，全長多肽及多核苷酸為已知的，許多功能性片段、突變體及經修飾型式亦已知。人類因子VIII序列之實例展示為SEQ ID NO：2或6中之子序列(表2)。因子VIII多肽包括例如全長因子VIII、在N端減去Met之全長因子VIII、成熟因子VIII(減去信號序列)、在N端具有附加Met之成熟因子VIII及/或B域完全或部分缺失之因子VIII。因子VIII變異體包括B域缺失，無論為部分或完全缺失。
大量功能性因子VIII變異體為已知的，如上文及下文所論述。另外，已在血友病患者中鑒別出因子VIII中之數百種非功能性突變，且已確定該等突變對因子VIII功能之影響更多地歸因於其在因子VIII之3維結構中所處的位置而非取代之性質(Cutler等人，Hum.Mutat.19：274-8(2002))，以全文引用之方式併入本文中。另外，來
自人類及其他物種之因子VIII之間的比較已鑒別出可能為功能所需之保守殘基(Cameron等人，Thromb.Haemost.79：317-22(1998)；US 6,251,632)，以全文引用之方式併入本文中。
在哺乳動物細胞中分離及表現了人類因子VIII基因(Toole,J.J.等人，Nature 312：342-347(1984)；Gitschier,J.等人，Nature 312：326-330(1984)；Wood,W.I.等人，Nature 312：330-337(1984)；Vehar,G.A.等人，Nature 312：337-342(1984)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；美國專利第4,757,006號)，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中，且由cDNA推導出了胺基酸序列。以全文引用之方式併入本文中之Capon等人，美國專利第4,965,199號揭示用於在哺乳動物宿主細胞中製造因子VIII及純化人類因子VIII之重組DNA方法。已報導在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞及BHKC(幼倉鼠腎細胞)中之人類因子VIII表現。已對人類因子VIII進行修飾以缺失部分或全部B域(美國專利第4,994,371號及第4,868,112號，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中)，已將人類因子VIII B域用人類因子V B域置換(美國專利第5,004,803號，以全文引用之方式併入本文中)。編碼人類因子VIII之cDNA序列及預測胺基酸序列分別展示於美國申請公開案第2005/0100990號(以全文引用之方式併入本文中)之SEQ ID NO：1及2中。
以全文引用之方式併入本文中之美國專利第
5,859,204號，Lollar,J.S.報導免疫原性降低且免疫反應性降低之因子VIII之功能性突變體。以全文引用之方式併入本文中之美國專利第6,376,463號，Lollar,J.S.亦報導免疫反應性降低之因子VIII之突變體。以全文引用之方式併入本文中之美國申請公開案第2005/0100990號，Saenko等人報導因子VIII之A2域中之功能性突變。
多種功能性因子VIII分子(包括B域缺失)揭示於以下專利中：US 6,316,226及US 6,346,513(均頒予Baxter)；US 7,041,635(頒予In2Gen)；US 5,789,203、US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620(頒予Chiron)；US 5,972,885及US 6,048,720(頒予Biovitrum)、US 5,543,502及US 5,610,278(頒予Novo Nordisk)；US 5,171,844(頒予Immuno Ag)；US 5,112,950(頒予Transgene S.A.)；US 4,868,112(頒予Genetics Institute)，該等專利各自以全文引用之方式併入本文中。
豬因子VIII序列已公開(Toole,J.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5939-5942(1986))，以全文引用之方式併入本文中，且已報導由PCR擴增來自豬脾cDNA文庫之因子VIII序列獲得之完全豬cDNA序列(Healey,J.F.等人，Blood 88：4209-4214(1996)，以全文引用之方式併入本文中)。所有域、所有次單元及特定胺基酸序列經取代之雜交人類/豬因子VIII揭示於Lollar及Runge之美國專利第5,364,771號及WO 93/20093中，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。最近，豬因子VIII之A1及A2域以
及用豬A1及/或A2域取代相應人類域之嵌合因子VIII的核苷酸及相應胺基酸序列報導於WO 94/11503中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。美國專利第5,859,204號，Lollar,J.S.亦揭示豬cDNA及推導之胺基酸序列。以全文引用之方式併入本文中之美國專利第6,458,563號(頒予Emory)揭示B域缺失之豬因子VIII。
因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)可與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457；及SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)至少90%或95%一致，其中該因子VIII部分具有因子VIII活性。因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)可與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457；及SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)相同。
因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)可與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457；及SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)至少90%或95%一致，其中該因子VIII部分具有因子VIII活性。因子VIII(或嵌合多肽之因子VIII部分)可與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457及SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)相同。
如本文所用，「相等劑量」意謂以國際單位表述之相同劑量之因子VIII活性，其與所述多肽之分子量無關。一個國際單位(IU)之因子VIII活性大致對應於一毫升正常
人類血漿中因子VIII之量。若干種分析可用於量測因子VIII活性，包括歐洲藥典(European Pharmacopoeia)發色受質分析及單級凝結分析。
除非另外說明，否則如本文所用之「Fc」意謂功能性新生兒Fc受體(FcRn)結合搭配物。FcRn結合搭配物為可由FcRn受體特異性結合之任何分子且隨後由FcRn受體活性轉運該FcRn結合搭配物。因此，術語Fc包括IgG Fc之任何功能性變異體。IgG之Fc部分中結合FcRn受體之區已基於X射線結晶學進行了描述(Burmeister等人，Nature 372：379(1994)，以全文引用之方式併入本文中)。Fc與FcRn之主要接觸區在CH2與CH3之接點附近。Fc-FcRn接觸全部在單一Ig重鏈內。FcRn結合搭配物包括例如完整IgG、IgG之Fc片段及包括完整FcRn結合區之其他IgG片段。主要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314以及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。提及免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區之胺基酸編號均係基於Kabat等人1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda；MD，以全文引用之方式併入本文中。(FcRn受體已自若干哺乳動物物種(包括人類)分離。人類FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列為已知的(Story等人，J.Exp.Med.180：2377(1994)，以全文引用之方式併入本文中)。Fc可包含免疫球蛋白之CH2及CH3域，有或無免疫球蛋
白之鉸鏈區。示範性Fc變異體提供於WO 2004/101740及WO 2006/074199中，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
Fc(或嵌合多肽之Fc部分)可含有一或多個突變及突變之組合。
Fc(或嵌合多肽之Fc部分)可含有使半衰期增加之突變，諸如M252Y、S254T、T256E及其組合，如Oganesyan等人，Mol.Immunol.46：1750(2009)中所揭示，該文獻以全文引用之方式併入本文中；H433K、N434F及其組合，如Vaccaro等人，Nat.Biotechnol.23：1283(2005)中所揭示，該文獻以全文引用之方式併入本文中；US 2009/0264627 A1之第1-2頁第[0012]及實例9及10所揭示之突變體，該文獻以全文引用之方式併入本文中；及US 20090163699 A1之第2頁第[0014]至[0021]段揭示之突變體，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
Fc(或嵌合多肽之Fc部分)亦可包括例如以下突變：IgG之Fc區可根據諸如定點突變誘發及其類似程序之公認程序進行修飾以產生將由FcRn結合之經修飾IgG或其Fc片段或部分。該等修飾包括例如遠離FcRn接觸位點之修飾以及接觸位點內保留或甚至增強與FcRn之結合的修飾。舉例而言，人類IgG1 Fc(Fcy1)中之以下單個胺基酸殘基可經取代而不顯著損失Fc對FcRn之結合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、
E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A及K447A，其中例如P238A表示在位置編號238處野生型脯胺酸取代為丙胺酸。除丙胺酸外，其他胺基酸亦可取代上文指定位置處之野生型胺基酸。突變可單獨引入Fc中，從而產生一百種以上不同於天然Fc之FcRn結合搭配物。另外，可一起引入兩個、三個或三個以上該等個別突變之組合，從而產生數百種更多FcRn結合搭配物。某些該等突變可對FcRn結合搭配物賦予新功能性。舉例而言，一實施例併入N297A，從而移除高度保守之N糖基化位點。該突變之作用在於降低免疫原性由此增強FcRn結合搭配
物之循環半衰期，及時FcRn結合搭配物不能結合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB及FcyRIIIA而不有損對FcRn之親和力(Routledge等人1995,Transplantation 60：847，其以全文引用之方式併入本文中；Friend等人1999,Transplantation 68：1632，其以全文引用之方式併入本文中；Shields等人1995,J.Biol.Chem.276：6591，其以全文引用之方式併入本文中)。此外，至少三種人類Fcγ受體似乎識別IgG上下鉸鏈區內之結合位點，通常為胺基酸234-237。因此，新功能性及免疫原性可能降低之另一實例可藉由使此區突變，如藉由將人類IgG1之胺基酸233-236「ELLG」置換為來自IgG2之相應序列「PVA」(具有一個胺基酸缺失)來產生。已顯示介導各種效應功能之FcyRI、FcyRII及FcyRIII在引入該等突變時將不結合IgG1(Ward及Ghetie,Therapeutic Immunology 2：77(1995)，其以全文引用之方式併入本文中；及Armour等人，Eur.J.Immunol.29：2613(1999)，其以全文引用之方式併入本文中)。作為由上述突變產生之新功能性之另一實例，在一些情況下，對FcRn之親和力可增加超過野生型之親和力。此增加之親和力可反映增加之「締合」速率、降低之「解離」速率或增加之「締合」速率與降低之「解離」速率兩者。咸信使對FcRn之親和力增加之突變包括例如T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591(2001)，其以全文引用之方式併入本文中)。
Fc(或嵌合多肽之Fc部分)可與表2中所示之Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)至少90%或95%一致。Fc(或嵌合多肽之Fc部分)可與表2中所示之Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684及SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)相同。
如本文所用，「雜交」多肽及蛋白質意謂嵌合多肽與第二多肽之組合。雜交物中之嵌合多肽及第二多肽可經由蛋白質-蛋白質相互作用(諸如電荷-電荷相互作用或疏水性相互作用)彼此締合。雜交物中之嵌合多肽及第二多肽可經由二硫鍵或其他共價鍵彼此締合。雜交物描述於WO 2004/101740及WO 2006/074199中，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。亦參見美國專利第7,404,956號及第7,348,004號，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。第二多肽可為相同嵌合多肽之第二複本或其可為不相同嵌合多肽。參見例如第1圖、實例1及表2。在一實施例中，第二多肽為包含Fc之多肽。在另一實施例中，嵌合多肽為嵌合因子VIII-Fc多肽且第二多肽基本上由Fc組成，例如實例1之雜交多肽，其為由單一分子之重組B域缺失人類FVIII(BDD-rFVIII)融合於人類IgG1之二聚Fc域且無插入連接子序列組成的rFVIIIFc重組融合蛋白。此雜交多肽在本文中稱為FVIIIFc單體Fc融合蛋白、FVIIIFc單體雜交物、單體FVIIIFc雜交物及FVIIIFc單體-二聚體。參見實例1、第1圖及表2A。該等實例提
供此雜交多肽之臨床前及臨床資料。
雜交物中之第二多肽可包含以下或基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)至少90%或95%一致或與表2A(ii)中所示有信號序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。第二多肽可包含以下或基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)相同或與表2A(ii)中所示有信號序列之胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)相同的序列。
第1圖為展示B域缺失因子VIII-Fc嵌合多肽及其與為Fc多肽之第二多肽之締合之結構的示意圖。為獲得此雜交物，使用FVIII特異性引子藉由逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)自人類肝臟poly A RNA(Clontech)獲得人類重組B域缺失FVIII之編碼序列。FVIII序列包括FVIII之天然信號序列。B域缺失為自絲胺酸743(S743；2287 bp)至麩胺酸1638(Q1638；4969 bp)以便總共缺失2682 bp。接著，使用Fc特異性引子藉由RT-PCR自人類白細胞cDNA文庫(Clontech)獲得人類重組Fc之編碼序列。引子設計成使得B域缺失FVIII序列直接融合於Fc序列之N端而無插入連接子。將FVIIIFc DNA序列選殖至哺乳動物雙重表現載體pBUDCE4.1(Invitrogen)中受CMV啟動子控制。藉由RT-PCR獲得包括小鼠Igk信號序列之第二相同Fc序列且選殖於表現載體pBUDCE4.1中第二啟動子EF1α之下
游。
使用轉染胺2000(Lipofectamine 2000)轉染試劑(Invitrogen)將rFVIIIFc表現載體轉染至人類胚腎293細胞(HEK293H；Invitrogen)中。藉由用博萊黴素(Zeocin)(Invitrogen)進行選擇來產生穩定純系細胞系。一個純系細胞系3C4-22用於產生FVIIIFc以供在活體內表徵。在Biogen Idec(Cambridge,MA)產生重組FVIIIFc並進行純化(McCue等人2009)。預期上述轉染策略產生三種產物，亦即單體rFVIIIFc雜交物、二聚rFVIIIFc雜交物及二聚Fc。然而，在來自此等細胞之條件培養基中基本上未偵測到二聚rFVIIIFc。相反，條件培養基含有Fc及單體rFVIIIFc。有可能二聚rFVIIIFc之尺寸過大且妨礙細胞有效分泌。此結果為有益的，因為相比於所有三種蛋白質均存在，其使得單體純化之複雜程度較低。此等研究中所用之材料具有約9000 IU/mg之比活性。
在一實施例中，向表現高含量血友病因子(VWF)之患者投與本發明之多肽。如本文所用之「受試者」或「患者」意謂人類受試者。受試者可為當前正罹患出血病症或預期有該種治療需要之患者。「受試者」可包括成人或小兒科受試者。小兒科受試者可為年齡小於12歲之小兒科患者。如本文所用之術語「小兒科」為醫學上之分支，其處理嬰兒及兒童之護理及其疾病之治療。在一實施例中，受試者為已診斷出重度血友病A之小兒科患者。在某些實施例中，小兒科受試者用本發明之長效因子VIII多肽治
療。
VWF為具有多聚體結構之血漿蛋白質，其中各種形式之分子量在各單體次單元之約230 kDa與呈具有較大分子量之多聚體形式之高達超過2千萬Da之間變化，因此形成最大的已知可溶性蛋白質。其血漿濃度為約5-10 μg/ml左右(Siedlecki等人，Blood，第88卷：2939-2950(1996))且具有較小大小之血漿形式為對應於二聚體者，大致大小為500 kDa。
VWF在初級止血中其必不可少之作用，負責使血小板黏附至受損之血管表面且因此形成血小板栓塞，在該血小板栓塞上發展形成纖維蛋白凝結物之機制。已提出較高分子量多聚體支持血小板黏附機制對內皮下層具有較高效率，且已發現VWF濃縮物之臨床功效與該等較高分子量多聚體之濃度有關(Metzner等人，Haemophilia 4：25-32(1998)。
因此，表現高含量VWF之受試者將需要與表現較低或正常含量之VWF之受試者相比頻率較低的FVIII給藥。VWF在血漿中之平均範圍在約50 IU/dL與約200 IU/dL之間。在一實施例中，VWF在血漿中之平均含量為約50 IU/dL。在另一實施例中，血漿中至少約100 IU/dL之VWF含量視為高VWF含量。在另一實施例中，VWF在血漿中之高含量在約100 IU/dL與約200 IU/dL之間。在另一實施例中，VWF在血漿中之高含量為至少約110 IU/dL、約120 IU/dL、約130 IU/dL、約140 IU/dL、約
150 IU/dL、約160 IU/dL、約170 IU/dL、約180 IU/dL、約190 IU/dL或約200 IU/dL。
因此，在一實施例中，對表現至少約100 IU/dL之血漿VWF的受試者以長間隔給藥方案投與本發明之長效FVIII多肽。在一實施例中，長效FVIII多肽以至少約3天之給藥間隔投與。在另一實施例中，長效FVIII多肽以至少約每一週一次、約每兩週一次、約每15天一次、約每20天一次、約每三週一次、約每25天一次、約每四週一次或約每一個月一次之給藥間隔投與。
在一實施例中，受試者先前鑒別為具有高VWF含量。在某些實施例中，具有除O以外之血液血清型(亦即A、B或AB)之受試者因為長效FVIII在該等受試者中具有較長半衰期而需要較低頻率之長效FVIII給藥。在該等受試者中，半衰期增加係歸因於其較高VWF含量。
此外，藥物動力學資料(定義為藥物吸收、分佈、代謝及排出之時程之研究)可用作適於使用本發明長效FVIII多肽時之較長或較短給藥間隔之受試者的指標。臨床藥物動力學為藥物動力學原理應用於藥物在個別患者中之安全且有效之治療管理。臨床藥物動力學之主要目標包括增強功效及降低患者藥物療法之毒性。藥物濃度與其藥理學反應之間的強相關性之發展使得臨床醫師能夠根據實際患者情形來應用藥物動力學原理。
因此，在一實施例中，使用本發明FVIII-Fc多肽之半衰期來鑒別表現高含量VWF之患者。FVIII-Fc半衰期之
範圍在約10小時與約40小時之間，至少部分視亦存在之VWF之含量而定。然而，FVIII-Fc之半衰期平均為約18小時。一般而言，與FVIII-Fc在投與具有平均含量之VWF之受試者時之半衰期相比，FVIII-Fc在具有高含量VWF之患者體內展現至少約1.2倍之增加之半衰期。在一實施例中，與FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期相比，FVIII-Fc展現至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍之增加之半衰期。在一實施例中，在表現高含量VWF之受試者中，FVIII-Fc之半衰期在至少約20小時與約40小時之間。在另一實施例中，FVIII-Fc之半衰期為至少約21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時或40小時。在一實施例中，在具有高含量VWF之受試者中，FVIII-Fc之半衰期在約20小時與約27小時之間。因此，在一實施例中，FVIII-Fc之半衰期與平均值相比增加指示受試者適於在使用本發明之長效FVIII多肽時之較長給藥間隔。
在另一實施例中，使用短效FVIII多肽之半衰期來鑒別表現高含量VWF之患者。如本文所用，術語「短效FVIII」係指未添加半衰期延長劑之FVIII多肽。在一實施例中，短效FVIII多肽由全長或B域缺失FVIII組成。短效FVIII多肽之實例為Advate®及ReFacto®。
因為短效FVIII之半衰期亦至少部分視VWF含量而變化，因此短效FVIII多肽亦可用於鑒別適於本發明長效FVIII多肽之較長給藥間隔的患者。在一實施例中，與短效FVIII在投與具有平均含量之VWF之受試者時之半衰期相比，短效FVIII在表現高含量VWF之受試者體內展現至少約1.2倍之增加之半衰期。在另一實施例中，與短效FVIII在投與具有平均含量之VWF之受試者時之半衰期相比，短效FVIII在表現高含量VWF之受試者體內展現至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍之增加之半衰期。因此，在投與短效FVIII時顯示至少約1.2倍之增加之半衰期的受試者適於在使用本發明長效FVIII多肽時之較長給藥間隔。
如本文所用，「給藥間隔」意謂投與受試者之多次劑量之間逝去的時間量。給藥間隔之比較可在單一受試者中或在受試者群體中進行，且接著可計算在該群體中獲得之平均值。
投與嵌合因子VIII多肽，例如本發明之嵌合因子VIII-Fc多肽(包含因子VIII之多肽或雜交物)時之給藥間隔可為相等劑量之無非因子VIII部分(例如無Fc部分)之該因子VIII(由該因子VIII組成之多肽)所需要的給藥間隔之至少一倍半長。給藥間隔可為相等劑量之無非因子VIII部分(例如無Fc部分)之該因子VIII(由該因子VIII組成之多肽)所需要的給藥間隔之至少約一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半
至兩倍長。給藥間隔可為相等劑量之無非因子VIII部分(例如無Fc部分)之該因子VIII(由該因子VIII組成之多肽)所需要的給藥間隔之至少約一倍半、兩倍、兩倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍長。給藥間隔可為約每三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天或更長時間一次。給藥間隔可為至少約一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更長時間。對於按需治療，該嵌合多肽或雜交物之給藥間隔為約每24-36、24-48、24-72、24-96、24-120、24-144、24-168、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
在一實施例中，有效劑量為25-80 IU/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 IU/kg)且給藥間隔為每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8天或更多天一次，或每週三次，或每週不超過三次。在一實施例中，有效劑量為80 IU/kg且給藥間隔為每3天一次。在另一實施例中，向小
兒科受試者投與以每3天之給藥間隔給予之80 IU/kg之有效劑量。在另一實施例中，有效劑量為65 IU/kg且給藥間隔為每每週一次或每6-7天一次。只要需要，即可重複投與劑量(例如至少10、20、28、30、40、50、52或57週、至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。
在某些實施例中，用於按需治療之有效劑量為20-50 IU/Kg(20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 IU/kg)。按需治療可為一次給藥或重複給藥。對於重複給藥，給藥間隔可為每12-24小時一次、每24-36小時一次、每24-48小時一次、每36-48小時一次或每48-72小時一次。
「長效因子VIII」為相比於參考因子VIII具有增加之半衰期(在本文中亦稱為t1/2、t1/2β、消除半衰期及HL)的因子VIII。長效因子VIII之半衰期增加可歸因於融合於一或多個非因子VIII多肽，諸如Fc、XTEN、白蛋白、PAS序列、轉鐵蛋白、CTP(具有4個O-聚醣之hCG之28個胺基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合多肽、白蛋白結合小分子或其兩個或兩個以上組合。半衰期增加可歸因於一或多個修飾，諸如聚乙二醇化。示範性長效因子VIII多肽包括例如包含Fc之嵌合因子VIII多肽、包含XTEN之嵌合因子VIII多肽及包含白蛋白之嵌合因子VIII多肽。其他示範性長效因子VIII多肽包括例如聚乙二醇化因子VIII。
在長效嵌合因子VIII多肽之情況下，「參考」多肽為基本上由嵌合多肽之因子VIII部分組成之多肽，例如無Fc部分、無XTEN部分或無白蛋白部分之相同因子VIII。同樣，在經修飾因子VIII之情況下，參考多肽為無修飾之相同因子VIII，例如無聚乙二醇化之因子VIII。
在一些實施例中，長效因子VIII當投與受試者時具有一或多種以下性質：
在該受試者中之平均滯留時間(MRT)(活性)為約14-41.3小時；在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.22-5.19 mL/h/kg或1.22-5.19 mL/h/kg以下；在該受試者中之t1/2β(活性)為約11-26.4小時；在該受試者中之增量回收率(K值)(活性；觀測值)為約每IU/kg 1.38-2.88 IU/dL；在該受試者中之Vss(活性)為約37.7-79.4 mL/kg；及在該受試者中之AUC/劑量為約每IU/kg 19.2-81.7 IU*h/dL。
在一些實施例中，長效因子VIII當投與患者群體時具有一或多種以下性質：平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)大於每IU/kg 1.38 IU/dL；平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)為每IU/kg至少約1.5、至少約1.85或至少約2.46 IU/dL；在該患者群體中之平均清除率(CL)(活性)為約
2.33±1.08 mL/h/kg或2.33±1.08 mL/h/kg以下；在該患者群體中之平均清除率(CL)(活性)為約1.8-2.69 mL/h/kg；在該患者群體中之平均清除率(CL)(活性)為包含無修飾之該因子VIII之多肽之清除率的65%；在該患者群體中之平均平均滯留時間(MRT)(活性)為至少約26.3±8.33小時；在該患者群體中之平均MRT(活性)為約25.9-26.5小時；在該患者群體中之平均MRT(活性)為包含無修飾之該因子VIII之多肽之平均MRT的約1.5倍長；在該患者群體中之平均t1/2β(活性)為約18.3±5.79小時；在該患者群體中之平均t1/2β(活性)為約18-18.4小時；在該患者群體中之平均t1/2β(活性)為包含無修飾之該因子VIII之多肽之平均t1/2β的約1.5倍長；在該患者群體中之平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)為約每IU/kg 2.01±0.44 IU/dL；在該患者群體中之平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)為約每IU/kg 1.85-2.46 IU/dL；在該患者群體中之平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)為包含無修飾之該因子VIII之多肽之平均增量回收率的約90%；
在該患者群體中之平均Vss(活性)為約55.1±12.3 mL/kg；在該患者群體中之平均Vss(活性)為約45.3-56.1 mL/kg；在該患者群體中之平均AUC/劑量(活性)為約每IU/kg 49.9±18.2 IU*h/dL；在該患者群體中之平均AUC/劑量(活性)為約每IU/kg 44.8-57.6 IU*h/dL。
在其他實施例中，長效因子VIII當投與患者群體時具有一或多種以下性質：當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析量測時，投與嵌合多肽之該受試者中的Cmax_OBS與投與相同量之由全長、成熟因子VIII組成之多肽之受試者中的Cmax_OBS相當；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約60.5 IU/dL、約60.5±1 IU/dL、約60.5±2 IU/dL、約60.5±3 IU/dL、約60.5±4 IU/dL、約60.5±5 IU/dL、約60.5±6 IU/dL、約60.5±7 IU/dL、約60.5±8 IU/dL、約60.5±9 IU/dL或約60.5±10 IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約53.1-69 IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分
析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約119 IU/dL、約119±1 IU/dL、約119±2 IU/dL、約119±3 IU/dL、約119±4 IU/dL、約119±5 IU/dL、約119±6 IU/dL、約119±7 IU/dL、約119±8 IU/dL、約119±9 IU/dL、約119±10 IU/dL、約119±11 IU/dL、約119±12 IU/dL、約119±13 IU/dL、約119±14 IU/dL、約119±15 IU/dL、約119±16 IU/dL、約119±17 IU/dL或約119±18 IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約103-136 IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約76.5 IU/dL、約76.5±1 IU/dL、約76.5±2 IU/dL、約76.5±3 IU/dL、約76.5±4 IU/dL、約76.5±5 IU/dL、約76.5±6 IU/dL、約76.5±7 IU/dL、約76.5±8 IU/dL、約76.5±9 IU/dL、約76.5±10 IU/dL、約76.5±11 IU/dL、約76.5±12 IU/dL、約76.5±13 IU/dL、約76.5±14 IU/dL或約76.5±15 IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約64.9-90.1 IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約182 IU/dL、約182±2 IU/dL、約182±4 IU/dL、約182±6 IU/dL、約182±8 IU/dL、約182±10 IU/dL、約182±12 IU/dL、約182±14
IU/dL、約182±16 IU/dL、約182±18 IU/dL或約182±20 IU/dL；或當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約146-227 IU/dL、約146±5 IU/dL、約146±10 IU/dL、約227±5 IU/dL或約146±10 IU/dL。
在某些實施例中，長效因子VIII當投與患者群體時具有一或多種以下性質：當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析所量測時，在該受試者中之t1/2β(活性)為投與相同量之由全長、成熟因子VIII組成之多肽的受試者中之t1/2β(活性)的至少1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89或1.90倍高；如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約18.8小時、18.8±1小時、18.8±1小時、18.8±2小時、18.8±3小時、18.8±4小時、18.8±5小時、18.8±6小時、18.8±7小時、18.8±8小時、18.8±9小時、18.8±10小時或18.8±11小時；如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約14.3-24.5小時；
如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約16.7小時、16.7±1小時、16.7±2小時、16.7±3小時、16.7±4小時、16.7±5小時、16.7±6小時、16.7±7小時、16.7±8小時、16.7±9小時、16.7±10小時或16.7±11小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約13.8-20.1小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約19.8小時、19.8±1小時、19.8±2小時、19.8±3小時、19.8±4小時、19.8±5小時、19.8±6小時、19.8±7小時、19.8±8小時、19.8±9小時、19.8±10小時或19.8±11小時；或如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約14.3-27.5小時。
在某些實施例中，長效因子VIII當投與患者群體時具有一或多種以下性質：當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析所量測時，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為投與相同量之由全長、成熟因子VIII組成之多肽的受試者中之清除率的0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69或0.70倍低；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.68
mL/h/kg、1.68±0.1 mL/h/kg、1.68±0.2 mL/h/kg、1.68±0.3 mL/h/kg、1.68±0.4 mL/h/kg、1.68±0.5 mL/h/kg、1.68±0.6 mL/h/kg或1.68±0.7 mL/h/kg；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.31-2.15 mL/h/kg；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約2.32 mL/h/kg、2.32±0.1 mL/h/kg、2.32±0.2 mL/h/kg、2.32±0.3 mL/h/kg、2.32±0.4 mL/h/kg、2.32±0.5 mL/h/kg、2.32±0.6 mL/h/kg或2.32±0.7 mL/h/kg；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.64-3.29 mL/h/kg；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.49 mL/h/kg、1.49±0.1 mL/h/kg、1.49±0.2 mL/h/kg、1.49±0.3 mL/h/kg、1.49±0.4 mL/h/kg、1.49±0.5 mL/h/kg、1.49±0.6 mL/h/kg或1.49±0.7 mL/h/kg；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.16-1.92 mL/h/kg；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.52
mL/h/kg、1.52±0.1 mL/h/kg、1.52±0.2 mL/h/kg、1.52±0.3 mL/h/kg、1.52±0.4 mL/h/kg、1.52±0.5 mL/h/kg、1.52±0.6 mL/h/kg或1.52±0.7 mL/h/kg；或當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.05-2.20 mL/h/kg。
在一些實施例中，長效因子VIII當投與患者群體時具有一或多種以下性質：當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析所量測時，在該受試者中之MRT為投與相同量之由全長、成熟因子VIII組成之多肽的受試者中之MRT的至少1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92或1.93倍高；如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約27小時、27±1小時、27±2小時、27±3小時、27±4小時、27±5小時、27±6小時、27±7小時、27±8小時、27±9小時或27±10小時；如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約20.6-35.3小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之
MRT(活性)為約23.9-28.5小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約19.8-28.9小時；或如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約20.5-39.6小時。
在其他實施例中，長效因子VIII當投與患者群體時具有一或多種以下性質：當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析量測時，在該受試者中之增量回收率與投與相同量之由全長、成熟因子VIII組成之多肽之受試者中的增量回收率相當；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.44 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.1 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.2 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.3 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.4 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.5 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.6 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.7 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.8 IU/dL、每IU/kg 2.44±0.9 IU/dL、每IU/kg 2.44±1.0 IU/dL、每IU/kg 2.44±1.1 IU/dL或每IU/kg 2.44±1.2 IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.12-2.81 IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 1.83
IU/dL、每IU/kg 1.83±0.1 IU/dL、每IU/kg 1.83±0.2 IU/dL、每IU/kg 1.83±0.3 IU/dL、每IU/kg 1.83±0.4 IU/dL、每IU/kg 1.83±0.5 IU/dL、每IU/kg 1.83±0.6 IU/dL、每IU/kg 1.83±0.7 IU/dL、每IU/kg 1.83±0.8 IU/dL、每IU/kg 1.83±0.9 IU/dL、每IU/kg 1.83±1.0 IU/dL或每IU/kg 1.83±1.1 IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 1.59-2.10 IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 3.09 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.1 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.2 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.3 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.4 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.5 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.6 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.7 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.8 IU/dL、每IU/kg 3.09±0.9 IU/dL、每IU/kg 3.09±1.0 IU/dL、每IU/kg 3.09±1.1 IU/dL、每IU/kg 3.09±1.2 IU/dL或每IU/kg 3.09±1.3 IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.80 IU/dL、每IU/kg 2.80±0.1 IU/dL、每IU/kg 2.80±0.2 IU/dL、每IU/kg 2.80±0.3 IU/dL、每IU/kg 2.80±0.4 IU/dL、每IU/kg 2.80±0.5 IU/dL、每IU/kg 2.80±0.6 IU/dL、每IU/kg 2.80±0.7 IU/dL、每IU/kg 2.80±0.8
IU/dL、每IU/kg 2.80±0.9 IU/dL、每IU/kg 2.80±1.0 IU/dL、每IU/kg 2.80±1.1 IU/dL或每IU/kg 2.80±1.2 IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.61-3.66 IU/dL；或當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.24-3.50 IU/dL。
在其他實施例中，長效因子VIII當投與患者群體時具有一或多種以下性質：當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析量測時，在該受試者中之Vss(活性)與投與相同量之由全長、成熟因子VIII組成之多肽之受試者中的Vss(活性)相當；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約45.5 mL/kg、45.5±1 mL/kg、45.5±2 mL/kg、45.5±3 mL/kg、45.5±4 mL/kg、45.5±5 mL/kg、45.5±6 mL/kg、45.5±7 mL/kg、45.5±8 mL/kg、45.5±9 mL/kg、45.5±10 mL/kg或45.5±11 mL/kg；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約39.3-52.5 mL/kg；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分
析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約62.8 mL/kg、62.8±1 mL/kg、62.8±2 mL/kg、62.8±3 mL/kg、62.8±4 mL/kg、62.8±5 mL/kg、62.8±6 mL/kg、62.8±7 mL/kg、62.8±8 mL/kg、62.8±9 mL/kg、62.8±10 mL/kg、62.8±11 mL/kg、62.8±12 mL/kg、62.8±13 mL/kg、62.8±14 mL/kg、62.8±15 mL/kg或62.8±16 mL/kg；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約55.2-71.5 mL/kg；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約35.9 mL/kg、35.9±1 mL/kg、35.9±2 mL/kg、35.9±3 mL/kg、35.9±4 mL/kg、35.9±5 mL/kg、35.9±6 mL/kg、35.9±7 mL/kg、35.9±8 mL/kg、35.9±9 mL/kg、35.9±10 mL/kg、35.9±11 mL/kg、35.9±12 mL/kg或35.9±13 mL/kg；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約30.4-42.3 mL/kg；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約43.4 mL/kg、43.4±1 mL/kg、43.4±2 mL/kg、43.4±3 mL/kg、43.4±4 mL/kg、43.4±5 mL/kg、43.4±6 mL/kg、43.4±7 mL/kg、43.4±8 mL/kg、43.4±9 mL/kg、43.4±10 mL/kg、43.4±11 mL/kg、43.4±12 mL/kg、43.4±13 mL/kg、43.4±14
mL/kg、43.4±15 mL/kg或43.4±16 mL/kg；或當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約38.2-49.2 mL/kg。
在其他實施例中，長效因子VIII當投與患者群體時具有一或多種以下性質：當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析所量測時，在該受試者中之AUCINF為投與相同量之由全長、成熟因子VIII組成之多肽的受試者中之AUCINF的至少1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90倍高；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1440±316 hr*IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1160-1880 hr*IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1480 hr*IU/dL、每IU/kg 1480±100 hr*IU/dL、每IU/kg 1480±
200 hr*IU/dL、每IU/kg 1480±300 hr*IU/dL、每IU/kg 1480±400 hr*IU/dL、每IU/kg 1480±500 hr*IU/dL、每IU/kg 1480±600 hr*IU/dL、每IU/kg 1480±700 hr*IU/dL、每IU/kg 1480±800hr*IU/dL、每IU/kg 1480±900 hr*IU/dL或每IU/kg 1480±1000 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 2910±1320 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1980-3970 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 2800 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±100 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±200 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±300 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±400 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±500 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±600 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±700 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±800 hr*IU/dL、每IU/kg 2800±900 hr*IU/dL或每IU/kg 2800±1000 hr*IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1660 hr*IU/dL、每IU/kg 1660±100 hr*IU/dL、每IU/kg 1660±200 hr*IU/dL、每IU/kg 1660±300 hr*IU/dL、每IU/kg 1660±400 hr*IU/dL、每IU/kg 1660±500 hr*IU/dL、每
IU/kg 1660±600 hr*IU/dL、每IU/kg 1660±700 hr*IU/dL、每IU/kg 1660±800 hr*IU/dL、每IU/kg 1660±900 hr*IU/dL或每IU/kg 1660±1000 hr*IU/dL；當投與約25 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1300-2120 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 4280 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±100 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±200 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±300 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±400 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±500 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±600 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±700 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±800 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±900 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±1000 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±1100 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±1200 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±1300 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±1400 hr*IU/dL、每IU/kg 4280±1500 hr*IU/dL或每IU/kg 4280±1600 hr*IU/dL；或當投與約65 IU/kg嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 2960-6190 hr*IU/dL。
如本文所用，「按需治療」意謂意欲在短時程內進行且係回應於現有病狀(諸如出血事件)或認為需要(諸如計畫手術)之治療。可能需要按需治療之病狀包括例如出血事件、關節血腫、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內流
血、口腔流血、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內流血、腹內流血、胸內流血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血或髂腰肌鞘出血。受試者可能需要手術預防、手術前後管理或手術預備治療。該等手術包括例如小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。
在一實施例中，按需治療在單一劑量中消退多於80%(多於80%、多於81%、多於82%、多於83%、多於84%、多於85%、多於86%、多於87%、多於88%、多於89%、多於90%、多於91%、多於92%、多於93%、多於94%、多於95%、多於96%、多於97%、多於98%、多於99%或100%)或80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%之出血(例如自發性出血)。在另一實施例中，在按需治療後多於80%(多於81%、多於82%、多於83%、多於84%、多於85%、多於86%、多於87%、多於88%、多於89%、多於90%、多於91%、多於92%、多於93%、多於94%、多於95%、多於96%、多於97%、多於98%或100%)或80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%之出血事件由醫師評級為優良或良好。在其他實施例中，在按需治療後多於5%(多於6%、多於7%、多於8%、多於9%、多於10%、多於11%、多於12%、多於13%、多於14%、多於15%、多於
16%、多於17%、多於18%、多於19%、多於20%)或5-20%、5-15%、5-10%、10-20%或10-15%之出血事件由醫師評級為合格。
「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用且指由共價連接之胺基酸殘基構成之聚合化合物。
「多核苷酸」及「核酸」可互換使用且指由共價連接之核苷酸殘基構成之聚合化合物。多核苷酸可為DNA、cDNA、RNA、單股或雙股、載體、質體、噬菌體或病毒。多核苷酸包括例如表1中之多核苷酸，其編碼表2之多肽(參見表1)。多核苷酸亦包括例如表1之多核苷酸之片段，例如編碼表2之多肽之片段者，該等多肽片段為諸如因子VIII、Fc、信號序列、6His及表2多肽之其他片段。
如本文所用，「預防性治療」意謂經歷一定時程向受試者以多個劑量投與因子VIII多肽以增加受試者血漿中因子VIII活性之程度。增加之程度可足以降低自發性出血之發生率或預防出血，例如在以外損傷事件中。在預防性治療期間，受試者體內之血漿蛋白質含量可能並不下降低於該受試者之基線含量，或低於表徵重度血友病之因子VIII含量(<1 IU/dl[1%])。
在一實施例中，預防方案係根據個別患者例如藉由測定各患者之PK資料且以維持1-3% FVIII活性之穀含量之給藥間隔投與本發明因子VIII來「定製」。可在受試者經歷不可接受之出血事件(定義為在連續兩個月之時間內
2次自發性出血事件)時進行調整。在此情況下，調整之目標為3-5%之穀含量。在另一實施例中，預防性治療使得出血得到預防及控制、出血得到持續控制、持續防止出血及/或持續效益。預防(例如持續保護)可由至最後量測時間點之AUC(AUC-LAST)增加及清除率降低證明，從而使得終末t1/2相比於短效FVIII增加。預防可由相比於短效FVIU而言Cmax較佳、Tmax較佳及/或平均滯留時間較長證明。在一些實施例中，預防使得在注射(例如最後之注射)後約24、36、48、72或96小時(例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96小時)小時內無自發性出血事件。在某些實施例中，預防使得在每週一次給藥(例如65 IU/kg)之情況下每年之出血事件平均減少多於30%(例如多於31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89或90%，例如多於50%)如本文所用，「治療劑量」意謂如本文所述達成治療目標之劑量。因子VIII之
所需劑量的計算係基於根據經驗發現每公斤體重1 IU之因子VIII平均使血漿因子VIII活性升高約2 IU/dL。所需劑量使用下式進行確定：所需單位=體重(kg)×所要因子VIII升高(IU/dL或正常值之%)×0.5(每IU/dL之IU/kg數)
可用於本發明方法中之治療劑量為約10-100 IU/kg，更特定言之為10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100 IU/kg，且更特定言之為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 IU/kg。
可用於本發明方法中之其他治療劑量為約10至約150 IU/kg，更特定言之為約100-110、110-120、120-130、130-140、140-150 IU/kg，且更特定言之為約110、115、120、125、130、135、140、145或150 IU/kg。
如本文所用，「變異體」係指不同於原始多核苷酸或多肽，但保留其基本性質(例如因子VIII凝血劑活性或Fc(FcRn結合)活性)之多核苷酸或多肽。一般而言，變異體總體上接近類似，且在許多區中與原始多核苷酸或多肽相同。變異體包括例如多肽及多核苷酸片段、缺失、插入及原始多肽之經修飾型式。
變異型多核苷酸可包含以下或者由以下組成：與例如SEQ ID NO：1、3或5中之核苷酸編碼序列(個別地或一起之因子VIII部分、Fc部分)或其互補股至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列、已知突
變體及重組因子VIII或Fc(諸如本文引用之公開案及專利中揭示者)之核苷酸編碼序列或其互補股、編碼SEQ ID NO：2、4或6之多肽(個別地或一起之因子VIII部分、Fc部分)之核苷酸序列，及/或該等核酸分子中任一者之多核苷酸片段(例如本文所述之彼等片段)。亦包括在嚴格雜交條件或較低嚴格度條件下與該等核酸分子雜交之多核苷酸作為變異體，由該等多核苷酸編碼之多肽亦如此，只要其具功能性即可。
變異型多肽可包含以下或者由以下組成：與例如SEQ ID NO：2、4或6中所示之多肽序列(個別地或一起之因子VIII部分、Fc部分)至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%一致之胺基酸序列，及/或該等多肽中任一者之多肽片段(例如本文所述之彼等片段)。
至於具有與參考核苷酸序列至少例如95%「一致」之核苷酸序列的核酸，意欲除該核酸之核苷酸序列可在每100個參考核苷酸序列之核苷酸中包括至多五個點突變外，該核苷酸序列與參考序列相同。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列的核酸，參考序列中之至多5%核苷酸可缺失或取代為另一核苷酸，或數目為參考序列中總核苷酸之至多5%的核苷酸可插入參考序列中。查詢序列可為例如SEQ ID NO：1或3中所示之完整序列、ORF(開放閱讀框)或如本文所述指定之任何片段。
實際上，任何特定核酸分子或多肽是否本發明之核苷
酸序列或多肽至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致可使用已知之電腦程式便利地確定。在一實施例中，用於確定查詢序列(參考或原始序列)與主題序列之間的最佳總體匹配之方法(亦稱為全面序列比對)可使用基於Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6：237-245(1990)之算法的FASTDB電腦程式確定，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一序列比對中，查詢及主題序列均為DNA序列。RNA序列可藉由將U轉換為T來進行比較。該全面序列比對之結果為一致性百分比。在另一實施例中，DNA之FASTDB比對中用於計算一致性百分比之參數為：矩陣=單一，k-元組=4，失配罰分=1，連接罰分=30，隨機化組長度=0，截止計分=1，空隙罰分=5，空隙尺寸罰分0.05，窗口尺寸=500或主題核苷酸序列長度中之較短者。
若主題序列由於5’或3’缺失而非由於內部缺失而比查詢序列短，則須對結果進行人工校正。此係因為FASTDB程式在計算一致性百分比時不計入主題序列之5’及3’截短。對於相對於查詢序列在5’或3’端截短之主題序列，藉由將位於主題序列之5’及3’之不匹配/對準的查詢序列之鹼基數目計算為查詢序列總鹼基之百分比來校正一致性百分比。核苷酸是否匹配/對準由FASTDB序列比對之結果確定。接著將此百分比自藉由上述FASTDB程式使用指定參數計算之一致性百分比中扣除以獲得最終一致性百分比計分。此校正之計分為用於本發明目的之計分。僅計算未與查詢序列匹配/對準之如由FASTDB比對所顯示位於主
題序列5’及3’鹼基外部之鹼基用於人工調整一致性百分比計分之目的。
舉例而言，將90個鹼基之主題序列與100個鹼基之查詢序列比對以確定一致性百分比。缺失發生於主題序列之5’端且因此FASTDB比對不顯示5’端前10個鹼基之匹配/對準。該10個未配對鹼基佔序列之10%(位於5’及3’端之不匹配鹼基之數目/查詢序列中鹼基之總數)，因此將10%自由FASTDB程式計算之一致性百分比計分扣除。若剩餘90個鹼基完全匹配，則最終一致性百分比將為90%。在另一實例中，將90個鹼基之主題序列與100個鹼基之查詢序列比較。此時缺失為內部缺失，因此在主題序列之5’或3’不存在不與查詢序列匹配/對準之鹼基。在此情況下，不對由FASTDB計算之一致性百分比進行人工校正。再次，僅人工校正不與查詢序列匹配/對準之主題序列之5’及3’之鹼基。出於本發明之目的，不進行其他人工校正。
至於具有與本發明之查詢胺基酸序列至少例如95%「一致」之胺基酸序列的多肽，意欲除主題多肽序列可在每100個查詢胺基酸序列之胺基酸中包括至多五個胺基酸改變外，主題多肽之胺基酸序列與查詢序列相同。換言之，為獲得具有與查詢胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列的多肽，主題序列中之至多5%之胺基酸殘基可插入、缺失(插入/缺失)或取代為另一胺基酸。參考序列之該等改變可發生於參考胺基酸序列之胺基或羧基端位置或該
等末端位置之間個別地散佈於參考序列中之殘基之間或以一或多個連續群組散佈於參考序列內的任何位置。
實際上，任何特定多肽是否與例如SEQ ID NO：2(個別地或一起之因子VIII部分、Fc部分)或4或已知因子VIII或Fc多肽序列之胺基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致可使用已知電腦程式便利地確定。在一實施例中，用於確定查詢序列(參考或原始序列)與主題序列之間的最佳總體匹配之方法(亦稱為全面序列比對)可使用基於Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6：237-245(1990)之算法的FASTDB電腦程式確定，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一序列比對中，查詢序列與主題序列均為核苷酸序列或均為胺基酸序列。該全面序列比對之結果為一致性百分比。在另一實施例中，FASTDB胺基酸比對中所用之參數為：矩陣=PAM 0，k-元組=2，失配罰分=1，連接罰分=20，隨機化組長度=0，截止計分=1，窗口尺寸=序列長度，空隙罰分=5，空隙尺寸罰分=0.05，窗口尺寸=500或主題胺基酸序列長度中之較短者。
若主題序列由於N或C端缺失而非由於內部缺失而比查詢序列短，則須對結果進行人工校正。此係因為FASTDB程式在計算全面一致性百分比時不計入主題序列之N及C端截短。對於相對於查詢序列在N或C端截短之主題序列，藉由將位於主題序列之N及C端之與相應主題殘基不匹配/對準的查詢序列之殘基數目計算為查詢序
列總鹼基之百分比來校正一致性百分比。殘基是否匹配/對準由FASTDB序列比對之結果確定。接著將此百分比自藉由上述FASTDB程式使用指定參數計算之一致性百分比中扣除以獲得最終一致性百分比計分。此最終一致性百分比計分為用於本發明目的之計分。僅考慮位於主題序列N及C端之與查詢序列不匹配/對準之殘基用於人工調整一致性百分比計分之目的。亦即，僅主題序列之最遠N及C端殘基以外之查詢殘基位置。
舉例而言，將90個胺基酸殘基之主題序列與100個殘基之查詢序列比對以確定一致性百分比。缺失發生於主題序列之N端且因此FASTDB比對不顯示N端前10個殘基之匹配/對準。該10個未配對鹼基佔序列之10%(位於N及C端之不匹配殘基之數目/查詢序列中殘基之總數)，因此將10%自由FASTDB程式計算之一致性百分比計分扣除。若剩餘90個殘基完全匹配，則最終一致性百分比將為90%。在另一實例中，將90個殘基之主題序列與100個殘基之查詢序列比較。此時缺失為內部缺失，因此在主題序列之N或C端不存在不與查詢序列匹配/對準之鹼基。在此情況下，不對由FASTDB計算之一致性百分比進行人工校正。再次，僅人工校正不與查詢序列匹配/對準之如FASTDB比對中所顯示之主題序列N及C端以外之殘基位置。出於本發明之目的，不進行其他人工校正。
多核苷酸變異體可在編碼區、非編碼區或兩者中含有改變。在一實施例中，多核苷酸變異體含有產生沈默取
代、添加或缺失，但不改變所編碼多肽之性質或活性的改變。在另一實施例中，核苷酸變異體因遺傳密碼之簡併性而由沈默取代產生。在其他實施例中，在變異體中，5-10、1-5或1-2個胺基酸以任何組合取代、缺失或添加。多核苷酸變異體可出於多種原因而產生，例如以針對特定宿主來最佳化密碼子表現(將人類mRNA中密碼子改變為其他，例如細菌宿主，諸如大腸桿菌(E.coli))。
天然存在之變異體稱為「對偶基因變異體」，且指佔據生物體染色體上特定基因座之基因的若干種替代形式之一(Genes II,Lewin,B.編，John Wiley & Sons,New York(1985))。該等對偶基因變異體可在多核苷酸及/或多肽層面不同且包括於本發明中。或者，可藉由突變誘發技術或直接合成產生非天然存在之變異體。
使用蛋白質工程改造及重組DNA技術之已知方法，可產生變異體以改良或改變多肽之特徵。舉例而言，可在不實質性損失生物功能之情況下自分泌蛋白質之N端或C端缺失一或多個胺基酸。Ron等人，J.Biol.Chem.268：2984-2988(1993)(以全文引用之方式併入本文中)報導甚至在缺失3、8或27個胺基端胺基酸殘基後仍具有髮夾結合活性之變異型KGF蛋白。類似地，干擾素γ在自該蛋白質之羧基端缺失8-10個胺基酸殘基後顯示高達高十倍之活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology 7：199-216(1988)，以全文引用之方式併入本文中)。
此外，大量證據證明變異體通常保留與天然存在之蛋
白質之生物活性類似的生物活性。舉例而言，Gayle與合作者(J.Biol.Chem 268：22105-22111(1993)，以全文引用之方式併入本文中)對人類細胞激素IL-1a進行了廣泛的突變分析。其使用隨機突變誘發以產生超過3,500種個別IL-1a突變體，該等突變體在分子之整個長度上平均每個變異體具有2.5個胺基酸變化。在每個可能的胺基酸位置檢查了多種突變。研究者發現「可在對[結合或生物活性]之影響極小的情況下改變[大部分]分子」。(參見摘要)。實際上，在所檢查的超過3,500種核苷酸序列中，僅23種獨特胺基酸序列產生了活性與野生型顯著不同之蛋白質。
如上文所述，多肽變異體包括例如經修飾之多肽。修飾包括例如乙醯化、醯化、ADP核糖基化、醯胺化、共價連接黃素、共價連接血紅素部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂質或脂質衍生物、共價連接磷脂醯基肌醇、交聯環化、二硫鍵形成、去甲基化、形成共價交聯、形成半胱胺酸、形成焦麩胺酸、甲醯化、γ-羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人，Blood 116：270-79(2010)，其以全文引用之方式併入本文中)、蛋白水解加工、磷醯化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、蛋白質的轉移RNA介導之胺基酸添加，諸如精胺醯化，及泛素化。在一些實施例中，因子VIII在任何適宜位置經修飾(例如聚乙二醇化)。在一些實施例中，因子VIII在因
子VIII之表面暴露胺基酸(例如表面暴露半胱胺酸，其可為工程改造之半胱胺酸)上經聚乙二醇化。同上。在一些實施例中，經修飾之因子VIII(例如經聚乙二醇化之因子VIII)為長效因子VIII。
如本文所用，「穩態下之分佈體積(Vss)」具有與藥理學中所用之術語相同之含義，其為藥物分佈進入之表觀空間(體積)。Vss=體內藥物之量除以穩態下之血漿濃度。
如本文關於範圍所用，「約」修飾範圍之兩端。因此，「約10-20」意謂「約10至約20」。
本文所用之嵌合多肽可包含經加工之因子VIII或單鏈因子VIII或其組合。如本文所用，「經加工之因子VIII」意謂已在精胺酸1648(對於全長因子VIII)或精胺酸754(對於B域缺失因子VIII)(亦即細胞內加工位點)處裂解之因子VIII。由於在細胞內加工位點處之裂解，因此經加工之因子VIII包含兩條多肽鏈，第一鏈為重鏈且第二鏈為輕鏈。舉例而言，經加工之因子VIII-Fc融合蛋白(亦即重鏈及輕鏈融合於Fc)在非還原性SDS-PAGE上分別遷移至約90 kDa及130 kDa且在還原性SDS-PAGE上分別遷移至90 kDa及105 kDa。因此，在一實施例中，嵌合多肽中因子VIII部分之至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%為經加工之因子VIII。在另一實施例中，嵌合多肽中因子VIII部分之約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約
95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%為經加工之因子VIII。在一特定實施例中，自包含單鏈因子VIII之嵌合多肽純化(或分離)包含經加工因子VIII之嵌合多肽，且嵌合多肽中因子VIII部分之至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%為經加工之因子VIII。
如本文所用，「單鏈因子VIII」、「SC因子VIII」或「SCFVIII」意謂尚未在精胺酸位點(對於全長因子VIII而言為殘基1648(亦即SEQ ID NO：6之殘基1667)或對於B域缺失因子VIII而言為殘基754(亦即SEQ ID NO：2之殘基773))處裂解之因子VIII。因此，本文所用之嵌合多肽中之單鏈因子VIII包含單鏈。在一實施例中，單鏈因子VIII含有完整細胞內加工位點。在另一實施例中，本發明之單鏈因子VIII包含對應於精胺酸1645之胺基酸位置處之取代或突變、對應於精胺酸1648之胺基酸位置處之取代或突變，或對應於全長因子VIII中精胺酸1645與精胺酸1648之胺基酸位置處之取代或突變。在其他實施例中，在對應於精胺酸1645之胺基酸位置處取代之胺基酸為與在對應於精胺酸1648之胺基酸位置處取代之胺基酸不同的胺基酸。在某些實施例中，取代或突變為除精胺酸以外之胺基酸，例如異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酥胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、脯胺酸、硒半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸、組胺酸、鳥
胺酸、吡咯離胺酸或牛磺酸。單鏈因子VIII-Fc融合蛋白可在非還原性SDS-PAGE上遷移至約220 kDa且在還原性SDS-PAGE上遷移至約195 kDa。
在一實施例中，自包含經加工因子VIII之嵌合多肽純化(或分離)包含單鏈因子VIII之嵌合多肽，且本文所用嵌合多肽之因子VIII部分之至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或約100%為單鏈因子VIII。在另一實施例中，嵌合多肽之因子VIII部分之至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%或約35%為單鏈因子VIII。在其他實施例中，本文所用嵌合多肽之因子VIII部分之約1%-約10%、約5%-約15%、約10%-約20%、約15%-約25%、約20%-約30%、約25%-約35%、約30%-約40%為單鏈因子VIII。在一特定實施例中，本文所用嵌合多肽之因子VIII部分之約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%為單鏈因子VIII。在其他實施例中，本文所用嵌合多肽之因子VIII部分之約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%為單鏈因子VIII。在一些實施例中，嵌合多肽之單鏈因子VIII與經加工因子VIII之比率為(a)約25%單鏈因子VIII與約75%經加工因子VIII；(b)約20%單鏈因子VIII與約80%經加工因子VIII；(c)約15%單鏈因子VIII與約85%經加工因子VIII；(d)約10%單鏈因子VIII
與約90%經加工因子VIII；(e)約5%單鏈因子VIII與約95%經加工因子VIII；(f)約1%單鏈因子VIII與約99%經加工因子VIII；(g)約100%經加工因子VIII；(h)約30%單鏈因子VIII與約70%經加工因子VIII；(i)約35%單鏈因子VIII與約65%經加工因子VIII；或(j)約40%單鏈因子VIII與約60%經加工因子VIII。在其他實施例中，嵌合多肽之單鏈因子VIII與經加工因子VIII之比率為(a)約30%單鏈因子VIII與約70%經加工因子VIII；(b)約40%單鏈因子VIII與約60%經加工因子VIII；(c)約50%單鏈因子VIII與約50%經加工因子VIII；(d)約60%單鏈因子VIII與約40%經加工因子VIII；(e)約70%單鏈因子VIII與約30%經加工因子VIII；(f)約80%單鏈因子VIII與約20%經加工因子VIII；(g)約90%單鏈因子VIII與約10%經加工因子VIII；(h)約95%單鏈因子VIII與約5%經加工因子VIII；(i)約99%單鏈因子VIII與約1%經加工因子VIII；或(j)約100%單鏈因子VIII。
本文所用嵌合多肽中之因子VIII具有因子VIII活性。因子VIII活性可藉由此項技術中之任何已知方法量測。舉例而言，一種彼等方法可為發色分析。發色分析機制係基於凝血級聯之原理，其中活化之因子VIII加速在活化因子IX、磷脂及鈣離子存在下因子X向因子Xa之轉化。因子Xa活性係藉由對因子Xa具有特異性之對硝基醯基苯胺(pNA)受質之水解評估。在405 nM下測得之對硝基苯胺之初始釋放速率與因子Xa活性正相關且因此與樣品
中之因子VIII活性正相關。發色分析由國際血栓症及止血協會(International Society on Thrombosis and Hemostatsis；ISTH)之科學標準化委員會(Scientific and Standardization Committee；SSC)之因子VIII與因子IX下屬委員會(Factor VIII and Factor IX Subcommittee)推薦。自1994年以來，發色分析亦已成為歐洲藥典關於FVIII濃縮物效能指定之參考方法。因此，在一實施例中，當藉由發色分析活體外量測因子VIII活性時，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽具有與包含經加工因子VIII之嵌合多肽(例如基本上由或由兩個Fc部分與經加工因子VIII組成之嵌合多肽，其中該經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分之一)相當之因子VIII活性。
在另一實施例中，本發明之包含單鏈因子VIII之嵌合多肽具有與包含經加工因子VIII之嵌合多肽(例如基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽，其中經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的因子Xa產生速率。
為將因子X活化為因子Xa，活化之IX(因子Ixa)在Ca2+、膜磷脂及因子VIII輔因子存在下將因子X中之一個精胺酸-異白胺酸鍵水解以形成因子Xa。因此，因子VIII與因子IX之相互作用為凝血路徑中之關鍵。在某些實施例中，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽可以與包含經加工因子VIII之嵌合多肽(例如基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽，其中經加工因子
VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的速率與因子IXa相互作用。
另外，因子VIII結合於血友病因子，此時在循環中無活性。因子VIII在未結合於vWF時快速降解且藉由凝血酶之作用而自vWF釋放。在一些實施例中，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽可以與包含經加工因子VIII之嵌合多肽(例如基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽，其中經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的程度結合於血友病因子。
因子VIII可由活化之蛋白質C在鈣及磷脂存在下不活化。活化之蛋白質C在A1域中精胺酸336後方裂解因子VIII重鏈，此舉破壞因子X受質相互作用位點，且在A2域中精胺酸562後方裂解，此舉增強A2域之解離並且破壞與因子Ixa之相互作用位點。此裂解亦將A2域(43 kDa)一分為二且產生A2-N(18 kDa)及A2-C(25 kDa)域。因此，活化之蛋白質C可催化重鏈中之多個裂解位點。在一實施例中，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽可以與包含經加工因子VIII之嵌合多肽(例如基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽，其中經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的程度由活化之蛋白質C不活化。
在其他實施例中，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽在活體內具有與包含經加工因子VIII之嵌合多肽(例如基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多
肽，其中經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的因子VIII活性。在一特定實施例中，在HemA小鼠尾靜脈橫斷模型中，包含單鏈因子VIII之嵌合多肽能夠以與包含經加工因子VIII之嵌合多肽(例如基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽，其中該經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的程度保護HemA小鼠。
如本文所用之術語「相當」意謂藉由使用嵌合多肽產生之比較速率或程度等於、實質上等於或類似於參考速率或程度。如本文所用之術語「類似」意謂比較速率或程度與參考速率或程度(例如基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽之FXa產生速率，其中該經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)之差異不超過10%或不超過15%。術語「實質上相等」意謂比較速率或程度與參考速率或程度之差異不超過0.01%、0.5%或1%。
本發明進一步包括包含具有因子VIII活性之嵌合多肽之組合物，其中至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%之嵌合多肽包含為單鏈因子VIII之因子VIII部分及第二部分。在另一實施例中，組合物中嵌合多肽之約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%為單鏈因子VIII。在其他實施例中，第二部分為Fc、
XTEN、白蛋白、PAS序列、轉鐵蛋白、CTP(具有4個O-聚醣之hCG之28個胺基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合多肽、白蛋白結合小分子或其兩個或兩個以上組合。在其他實施例中，本發明之組合物包含含經加工因子VIII之嵌合多肽與含單鏈因子VIII之嵌合多肽的組合，(a)其中嵌合多肽之約30%因子VIII部分為單鏈因子VIII，且嵌合多肽之約70%因子VIII部分為經加工因子VIII；(b)其中嵌合多肽之約40%因子VIII部分為單鏈因子VIII且嵌合多肽之約60%因子VIII部分為經加工因子VIII；(c)其中嵌合多肽之約50%因子VIII部分為單鏈因子VIII且嵌合多肽之約50%因子VIII部分為經加工因子VIII；(d)其中嵌合多肽之約60%因子VIII部分為單鏈因子VIII且嵌合多肽之約40%因子VIII部分為經加工因子VIII；(e)其中嵌合多肽之約70%因子VIII部分為單鏈因子VIII且嵌合多肽之約30%因子VIII部分為經加工因子VIII；(f)其中嵌合多肽之約80%因子VIII部分為單鏈因子VIII且嵌合多肽之約20%因子VIII部分為經加工因子VIII；(g)其中嵌合多肽之約90%因子VIII部分為單鏈因子VIII且嵌合多肽之約10%因子VIII部分為經加工因子VIII；(h)其中嵌合多肽之約95%因子VIII部分為單鏈因子VIII且嵌合多肽之約5%因子VIII部分為經加工因子VIII；(i)其中嵌合多肽之約99%因子VIII部分為單鏈因子VIII且嵌合多肽之約1%因子VIII部分為經加工因子VIII；或(j)其中嵌合多肽之約
100%因子VIII部分為單鏈因子VIII。
在某些實施例中，當藉由發色分析活體外量測因子VIII活性時，本發明之組合物具有與包含經加工因子VIII之組合物(例如包含基本上由或由兩個Fc部分與經加工因子VIII組成之嵌合多肽的組合物，其中該經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分之一)相當之因子VIII活性。
在其他實施例中，本發明之組合物具有與包含經加工因子VIII之組合物(例如包含基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽的組合物，其中經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的因子Xa產生速率。在其他實施例中，包含單鏈因子VIII之組合物可以與包含經加工因子VIII之組合物(例如包含基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽的組合物，其中經加工因子VIII融合於一個Fc)相當的速率與因子IXa相互作用。在其他實施例中，本發明組合物之嵌合多肽中的單鏈因子VIII以與組合物之嵌合多肽中的經加工因子VIII(例如包含基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽的組合物，其中經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的程度由活化之蛋白質C不活化。在一特定實施例中，包含單鏈因子VIII之組合物在活體內具有與包含經加工因子VIII之組合物(例如包含基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽的組合物，其中經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的因子VIII活
性。在一些實施例中，在HemA小鼠尾靜脈橫斷模型中，本發明之包含單鏈因子VIII之組合物能夠以與包含經加工因子VIII之組合物(例如包含基本上由或由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽的組合物，其中該經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc)相當的程度保護HemA小鼠。
本發明進一步提供使用本發明之組合物治療人類受試者之出血病狀的方法。一示範性方法包括向有需要之受試者投與治療有效量的包含具有因子VIII活性之嵌合多肽之醫藥組合物/調配物，其中至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%之嵌合多肽包含為單鏈因子VIII之因子VIII部分及第二部分。
出血病狀可由凝血病症引起。凝血病症亦可稱為凝血機能病變。在一實例中，可用本發明之醫藥組合物治療之凝血病症為血友病或血管性血友病(von Willebrand disease；vWD)。在另一實例中，可用本發明之醫藥組合物治療之凝血病症為血友病A。
在一些實施例中，與出血病狀相關之出血之類型係選自關節血腫、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內流血、口腔流血、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內流血、腹內流血、胸內流血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血及髂腰肌鞘出血。
在其他實施例中，罹患出血病狀之受試者需要手術預
備治療，包括例如手術預防或手術前後管理。在一實例中，手術係選自小手術及大手術。示範性手術程序包括拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術(例如全膝置換、髖關節置換及其類似手術)、心臟手術及剖腹產。
在另一實例中，受試者伴隨用FIX治療。因為本發明之化合物能夠活化FIXa，所以其可用於在向受試者投與FIXa前預活化FIXa多肽。
本發明之方法可對需要預防性治療或按需治療之受試者實施。
包含至少30%單鏈因子VIII之醫藥組合物可調配用於任何適當投藥方式，包括例如局部(例如經皮或眼部)、經口、經頰、經鼻、陰道、直腸或非經腸投藥。
如本文所用之術語非經腸包括皮下、皮內、血管內(例如靜脈內)、肌肉內、脊柱、顱內、鞘內、眼內、眼周、眼眶內、滑膜內及複膜內注射以及任何類似注射或輸注技術。組合物亦可為例如懸浮液、乳液、持續釋放調配物、乳膏、凝膠或粉末。組合物可用傳統黏合劑及載劑(諸如甘油三酯)調配為栓劑。
在一實例中，醫藥調配物為液體調配物，例如經緩衝之等張水溶液。在另一實例中，醫藥組合物具有生理或接近生理之pH值。在其他實例中，水性調配物具有生理或接近生理之滲透壓及鹽度。其可含有氯化鈉及/或乙酸
鈉。在一些實例中，本發明之組合物經凍乾。
現已詳細描述了本發明，其將藉由參考以下實例得到更清楚之理解，該等實例包括於本文僅用於說明之目的且不欲限制本發明。本文提及之所有專利及公開案明確以引用之方式併入本文中。
所有分子生物學程序均根據標準技術執行。人類FVIII之編碼序列(Genbank寄存編號NM_000132)(包括其原生信號序列)係藉由逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)自人類肝臟polyA RNA獲得。歸因於FVIII之大尺寸，編碼序列以若干區段自各別RT-PCR反應獲得，且經由一系列PCR反應進行組裝，限制性消化且連接至含有B域缺失(BDD)FVIII編碼區之中間選殖載體中，其中在該編碼區中，絲胺酸743(S743)融合於麩胺醯胺1638(Q1638)，從而自全長FVIII之B域消除2682 bp。人類IgG1 Fc序列(例如GenBank寄存編號Y14735)藉由PCR自白細胞cDNA文庫獲得，且製備最終表現卡匣之方式應使得BDD FVIII序列直接融合於Fc序列(鉸鏈、CH2及CH3域，始於IgG1序列之D221，EU編號)之N端而無插入連接子。為僅表現Fc鏈，以合成寡核苷酸產生小鼠Igκ(kappa)輕鏈信號序列且使用PCR添加至Fc編碼序列以使得該蛋白質產物
能夠分泌。將FVIIIFc及Fc鏈編碼序列選殖至雙重表現載體pBudCE4.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。
使用轉染胺轉染試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)用pSYN-FVIII-013質體轉染HEK 293H細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)，且利用博萊黴素選擇穩定細胞系。細胞在無血清懸浮培養物中生長且使用包括FVIII特異性親和純化步驟之四管柱純化方法(McCue J.等人，J.Chromatogr.A.,1216(45)：7824-30(2009))，接著進行陰離子交換管柱及疏水性相互作用管柱之組合自澄清之收集培養基純化rFVIIIFc蛋白。
經加工重組FVIII-Fc(rFVIIIFc)合成為兩條多肽鏈，一條鏈由BDD-FVIII(S743-Q1638融合體，1438個胺基酸)融合於IgG1之Fc域(鉸鏈、CH2及CH3域)(226個胺基酸，自D221延伸至G456，EU編號)組成，總鏈長度為1664個胺基酸，另一條鏈由單獨之相同Fc區組成(226個胺基酸)。儘管預期經FVIIIFc/Fc雙重表現質體轉染之細胞分泌三種產物(FVIIIFc二聚體、FVIIIFc單體及Fc二聚體)，但在條件培養基中僅偵測到FVIIIFc單體及Fc二聚體。藉由非還原性及還原性SDS-PAGE分析對經純化之FVIIIFc進行分析(第2A圖及第2B圖)。對於非還原性SDS-PAGE，發現條帶遷移至約90 kDa及130 kDa，與
FVIIIFc重鏈(HC)及輕鏈-二聚Fc融合體(LCFc2)之預測分子量一致(第2A圖，泳道3)。亦在約220 kDa偵測到第三條帶，與單鏈FVIIIFc(SC FVIIIFc；HC+LCFc2)之預測分子量一致，其中位置754(對於全長序列而言為1648)上之精胺酸殘基在分泌期間未裂解。對於還原性SDS-PAGE分析，見到主要條帶遷移至約25 kDa、90 kDa、105 kDa及195 kDa，與單鏈Fc、HC、LCFc及SC FVIIIFc之預測分子量一致(第2B圖，泳道3)。用人類PC5(前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶(subtlisin)/kexin(PCSK)型蛋白酶之成員)共轉染引起rFVIIIFc產物之完全加工(第2A圖、第2B圖，泳道2)。
SDS-PAGE後若干批rFVIIIFc之密度測定分析指示預期條帶之純度大於98%。亦使用尺寸排阻層析(SEC)來評定所存在聚集之程度，並且發現所有批次均具有0.5%或0.5%以下之聚集物含量。
藉由凝血酶裂解、還原及LC/UV與LC/MS分析進一步分析rFVIIIFc結構。藉由UV吸光度可偵測到由凝血酶產生之四個因子VIII片段(藉由在位置372、740及795(795對應於相對於全長FVIII序列之1689)處之三個精胺酸殘基處裂解)，對應於以下蛋白質區段：Fc(峰1)、輕鏈-Fc(峰2)、來自重鏈之A1域(峰3)及來自重鏈之A2域(峰4)。14個胺基酸之B域連接子及約6 kDa之a3相關肽因其尺寸小而未由UV吸光度偵測到。
藉由HPLC/MS分析rFVIIIFc之凝血酶消化提供四個
主要域以及約6 kDa a3相關肽之其他詳細資訊，且使用相同方法與REFACTO®(CHO來源之重組BDD-FVIII蛋白(rBDD FVIII))進行比較。使FVIII樣品穿過Detergent-OUTDTG-100X管柱(GBioscience,Maryland Heights,MO)以便移除Tween，用凝血酶充分消化，還原且藉由RP-HPLC-UV(POROS R1/10,Applied Biosystems)或RP-HPLC-MS(與Agilent 6210TOF質譜儀偶聯之Agilent 1200)使用乙腈於水+0.1%甲酸中梯度進行分析。亦藉由LysC肽定位證實肽序列，藉由RP-HPLC/MS(Thermo Finnigan LTQ-XL-ETD)進行分析。
如所預期，rFVIIIFc之總離子流(TIC)層析圖(第2D圖)似乎與UV層析圖(第2C圖)類似。藉由LC/MS可偵測到預期六種產物中之五種，包括由經加工及單鏈同功異型物產生之a3酸性區之兩種形式，以及用於消化之凝血酶。亦觀察到a3酸性區之另一截短形式，且在下文更詳細描述。rBDD FVIII產生類似TIC層析圖，但與rFVIIIFc LC-Fc相比無遊離Fc鏈且具有不同LC質量，此與缺乏Fc區一致(資料未示)。
歸因於大多數蛋白質上糖基化之異質性，故A1、LC-Fc及Fc區之反摺積質譜為複雜的且因此未確立所有分子離子之密度。然而，發現來自Fc區之三個主要峰之觀測質量匹配IgG分子上發現之G0、G1及G2，對應於終止於0、1或2個半乳糖殘基之雙觸角寡醣。a3相關肽及A2域之反摺積質譜提供最具確定性之資料，因為在該等區中之
轉譯後修飾中不存在異質性，從而允許明確鑒別預期質量。
若自經加工同功異型物衍生，則預期R1689裂解後自LC釋放之6 kDa N端肽包含a3酸性區(胺基酸E1649至R1689)，且若自單鏈同功異型物衍生，則包含融合於a3酸性區之14個胺基酸之截短B域。發現rFVIIIFc與rBDD FVIII均含有a3區之兩種形式，與基於SDS-PAGE分析之預期含量成比例。此外，兩種蛋白質均含有對應於胺基酸D1658-R1689之a3區之截短形式，對於其他FVIII產物亦已報導如此，不過發現其在rBDD FVIII中之豐度比在rFVIIIFc中高。
A2域含有三個潛在酪胺酸硫酸化位點，但無可能導致複雜異質性之糖基化位點，且因此可計算此區之確切質量。除rFVIIIFc之反摺積質譜中對應於S373至R740序列之質量的主要預期峰外(第2E圖)，亦鑒別出對應於與在E720及Y729截短之A2域相關之FVIII HC之已知截短的兩種其他形式。在rBDD FVIII A2之反摺積質譜中亦直接觀察到該等報導之截短形式(第2E圖)。rFVIIIFc與rBDD FVIII A2均含有類似相對量之在Y729截短之形式，而與rFVIIIFc中之相同形式相比，rBDD FVIII A2域含有顯著較大量之在E720處截短之形式。
藉由利用離胺醯基內肽酶(Lys-C)消化產物進行肽定位並隨後進行UV及質譜偵測確認rFVIIIFc之一級序列。在由rFVIIIFc產生之99種理論肽中，偵測到81種，對應於
總序列之98%。亦藉由此方法表徵rFVIIIFc之轉譯後修飾。FVIII含有6個潛在酪胺酸硫酸化位點，對應於位置346、718、719、723、1664及1680。當藉由將總離子層析圖整合於質譜中進行評定時，發現對應於該等六個位點之完全硫酸化肽，同時存在痕量對應於位置1680之非硫酸化肽，且無可偵測之對應於其他位置之非硫酸化肽。BDD FVIII亦含有6個潛在N糖基化位點，其中四個已報導在重組FVIII產物中糖基化。與此一致，發現rFVIIIFc在相同的4個位點糖基化；發現N239及N2118含有高甘露糖結構，同時發現N41及N1810含有更複雜的碳水化合物，與在rBDD FVIII上發現者類似。藉由LC/MS發現Fc區N連接型糖基化匹配利用凝血酶定位發現之G0、G1及G2同功異型物。已報導FVIII具有部分佔據之Ser 741及743上之O糖基化位點，且在rFVIIIFc之情況下亦發現此情況。
在未共轉染加工酶之情況下產生之rFVIIIFc多肽顯示15-25%單鏈FVIIIFc(SC FVIIIFc)，此與經加工rFVIIIFc之不同之處在於R754與E755(相對於全長FVIII而言為R1648/E1649)之間的單一肽鍵。純化此同功異型物且在所有上述生物化學分析中表徵，且如下所示發現與rFVIIIFc相當。在發色分析中以及根據下文所述之各種功能分析，發現經純化單鏈FVIIIFc之活性與rFVIIIFc類似。
藉由FVIII發色分析量測FVIII活性。藉由發色分析發現來自四個單獨批次rFVIIIFc之平均比活性為9762±449 IU/mg，對應於2148±99 IU/nmol。藉由aPTT分析發現來自十四個單獨批次rFVIIIFc之平均比活性為8460±699 IU/mg，且藉由發色分析發現為9348±1353 IU/mg，分別對應於1861±154及2057±298 IU/nmol。亦藉由發色分析量測單鏈FVIII：Fc之FVIII活性且與完全加工之rFVIII：Fc或rFVIII：Fc DS(含有約25%單鏈rFVIII：Fc)進行比較。如表3A所示，根據發色分析，在存在及不存在血友病因子(VWF)之情況下，單鏈rFVIIIFc顯示FVIII活性與完全加工之FVIIIFc或rFVIIIFc DS之FVIII活性無顯著差異。表3B展示如藉由單級活化部分凝血酶原激酶時間(aPTT)分析所量測，在VWF不存在下觀測到SCrFVIIIFc之完全活性。
在單級凝結分析(APTT)中，當血漿具有正常VWF含量時，SC rFVIIIFc顯示活性降低60%，表明VWF在活化SC rFVIIIFc中之潛在作用。此觀測結果藉由再向FVIII/VWF耗乏血漿中添加人類VWF得到進一步證實(表3)，其中SC rFVIIIFc之凝血劑活性降至與先天FVIII缺乏血漿相同之程度。
亦藉由在鈣存在下在磷脂表面上培育活化之FIX及凝血酶活化之REFACTO®或rFVIIIFc蛋白且如藉由發色或螢光受質之裂解(自其測定FXa產生速率)所量測監測FX向FXa之轉化在Xase複合物之情形下量測FVIII活性。接著藉由改變該分析之一種組分，同時使其他組分保持恆定來對該分析加以修改以便檢查與各個別組分之相互作用。
對於rFVIIIFc DS、rBDD FVIII及單鏈rFVIIIFc(第3A圖)而言，Fxa產生速率使用合成磷脂囊泡(25%磷脂醯絲胺酸/75%磷脂醯膽鹼)測定為不同磷脂濃度之函數。發現兩種蛋白質具有類似活性概況，其中峰值活性位於約156 μM磷脂。
接著將FXa產生速率測定為不同FX濃度之函數，且計算Km及Vmax值(第3B圖)。發現rFVIIIFc DS、rBDD FVIII及單鏈rFVIIIFc之活性概況類似，具有類似之Km及Vmax(表4)。最後，FXa產生速率測定為不同FIX濃度之函數(第3C圖)。活性概況看起來類似，具有類似之Kd及Vmax(表4)。使用血小板作為磷脂源獲得類似結果(未公開資料，2009年6月)。
呈活性時，FVIII藉由由活化之蛋白質C(APC)裂解以及A2域解離而不活化。rFVIIIFc及rBDD FVIII均由凝血酶活化，接著與APC一起培育不同時間且在FXa產生分析中測定活性(第4圖)。在不存在凝血酶活化之情況下，偵測到極少FXa產生，且其在凝血酶消化下顯著增加。用APC處理90分鐘導致FXa產生速率顯著降低，與未活化樣品類似，且該等結果對於rFVIIIFc DS、rBDD FVIII及單鏈rFVIIIFc而言為類似的。
藉由即時生物分子相互作用分析(BIAcore)基於表面電漿子共振(SPR)技術量測FVIII與血友病因子(vWF)之相互作用，以測定rFVIIIFc及rBDD FVIII對vWF之結合的動力學(表6)。在相同條件下測定各FVIII相互作用之動力學速率參數Ka(結合速率)及Kd(解離速率)以及親和力(Kd/Ka)。發現rFVIIIFc及rBDD FVIII均對vWF具有低nM結合親和力(KD)，分別為1.64±0.37及0.846±0.181 nM。該等蛋白質具有類似解離速率，其中結合速率之兩倍
差異導致親和力之兩倍差異。
如表6中所示，發現rFVIII：Fc DS或單鏈rFVIIIFc與vWF之親和力處於低nM範圍，約為僅BDD FVIII之親和力之兩倍大。在生理濃度下，此將導致與vWF複合之rFVIIIFc(經加工或單鏈)之百分比與遊離FVIII相比稍微降低，然而活體內研究表明，儘管存在此稍微較低之親和力，但rFVIIIFc之半衰期比全長或BDD FVIII顯著延長，且因此其似乎並不有損分子之半衰期。遊離rFVIIIFc有可能更有效地經由FcRn路徑再循環，且因此其可有助於半衰期更加延長。
在HEK293細胞中表現重組B域缺失因子VIIIFc(rFVIIIFc)。在HEK293細胞中生物合成期間，藉由限制蛋白水解加工大部分rFVIIIFc以產生FVIII重鏈(HC)及Fc部分所連接之FVIII輕鏈(LC)。認為HC及LC在血漿中及在FVIII藥品儲存期間之自發性解離造成FVIII活性降低。未加工之生物合成rFVIIIFc之剩餘部分形成rFVIIIFc之單鏈同功異型物(SC rFVIIIFc)，其可提供與經
加工之rFVIIIFc相比增強之可製造性及穩定性。
此實例描述比較SC rFVIIIFc與血友病因子(vWF)之相互作用同rFVIIIFc與vWF之相互作用的分析。藉由即時生物分子相互作用分析(BIAcore)基於表面電漿子共振(SPR)技術量測與vWF之相互作用，以測定rFVIIIFc及SC rFVIIIFc對vWF之結合的動力學(表11及第16A圖)。藉由胺偶合將無FVIII人類血漿來源vWF亦足夠低以防止質量轉運限制之含量固定於生物感測器表面上。rFVIIIFc及SC rFVIIIFc依序以0.13至5.0 nM範圍內之濃度以單循環動力學模式注射。將感測器圖資料擬合至1：1相互作用模型。
在相同條件下測定各FVIII相互作用之動力學速率參數Ka(結合速率)及Kd(解離速率)以及親和力(Kd/Ka)。發現rFVIIIFc及SC rFVIIIFc均對vWF具有低nM結合親和力(KD)，分別為0.34±0.1及0.31±0.1 nM。兩種同功異型物亦具有類似之結合速率及解離速率。
接著，在25℃及37℃下量測rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及缺乏Fc部分之B域缺失FVIII(rBDD FVIII)之凝血酶介導之釋放。藉由胺偶合將人類vWF以類似含量固定於生
物感測器表面上之三個流量槽上。剩餘流量槽用作空白用於參考目的。rFVIIIFc及SC rFVIIIFc蛋白由vWF捕捉且允許緩慢解離，且調整rFVIIIFc及SC rFVIIIFc之濃度以在解離相結束時獲得等莫耳捕捉含量。藉由2倍連續稀釋製備人類α-凝血酶溶液且以0.005至20 U/mL範圍內之濃度應用，從而使FVIIIa物質自vWF蛋白水解釋放。使用基於SPR之光學生物感測器即時監測凝血酶介導之活化rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及rBDD FVIII自vWF之釋放(第16B圖)。扣除空白參考(第16C圖)後，確定作為α-凝血酶濃度之函數之釋放速率(第16D圖)。在25℃下SC rFVIIIFc之凝血酶半最大有效濃度(EC50)為12±1 U/mL，相比之下rFVIIIFc為3.9±0.3 U/mL，且在37℃下SC rFVIIIFc之凝血酶半最大有效濃度(EC50)為15±1 U/mL，相比之下rFVIIIFc為4.8±0.2 U/mL(第16E圖)。rFVIIIFc具有與rBDD FVIII類似之凝血酶EC50值，在25℃下所具有之值分別為3.9±0.3 U/mL及3.3±0.3 U/mL，且在37℃下所具有之值分別為4.8±0.2 U/mL及4.0±0.2 U/mL。SC rFVIIIFc具有約為rFVIIIFc之3倍高的凝血酶EC50值。凝血酶介導之自vWF之釋放的此降低可為存在vWF之aPTT分析中所觀察到的SC rFVIIIFc之比活性特異性降低的基礎(表3B)。
設計I/IIa期開放標記交叉劑量遞增多中心首次人類
(first-in-human)研究以評估單劑rFVIIIFc在患有重度(定義為<1 IU/dL[1%]內源性因子VIII[FVIII])血友病A之受試者中的安全性、耐受性及藥物動力學。總共約12名先前接受治療之患者入選且給予25或65 IU/kg之rFVIIIFc。篩選(安排在第一劑參考比較藥劑ADVATE®[rFVIII]之前28天)及第一次注射前無FVIII治療情況下經過最少4天(96小時)後，約6名受試者接受單次25 IU/kg劑量之ADVATE®，接著為3天(72小時)藥物動力學(PK)概況，隨後交叉且接受25 IU/kg單次開放標記劑量之rFVIIIFc用於7天(168小時)PK概況研究。對前3名受試者依序給藥。對給予25 IU/kg rFVIIIFc之前三名(3)受試者，各受試者在注射rFVIIIFc後14天(336小時)進行抑制劑評定。一旦完成抑制劑測試，即進行下一受試者之給藥(僅對於前三名受試者)。第3名受試者完成14天抑制劑評定後，25 IU/kg之剩餘三名受試者及65 IU/kg之六名受試者在各劑量組內依序間隔至少1天開始參與。
最後一名受試者接受25 IU/kg劑量之rFVIIIFc一週後，招募約6名獨特受試者作為65 IU/kg組。65 IU/kg組中之各受試者接受單次65 IU/kg劑量之ADVATE®，接著為4天(96小時)PK概況研究，隨後交叉且接受65 IU/kg單次開放標記劑量之rFVIIIFc用於10天(240小時)概況研究。若在任何組中在第一次注射rFVIIIFc前發生出血事件，則使用受試者之先前研究FVIII產物進行治療且在接受第一次rFVIIIFc注射用於PK概況前必須經過至少4天
之間隔。
所有受試者接著在投與用於安全性之rFVIIIFc 25 IU/kg或65 IU/kg後經歷14天(336小時)及28天安全性評估期。所有受試者在給藥前及給藥後在指定時間點隨同用於分析FVIII活性之血樣進行藥物動力學取樣。
I/IIa期臨床試驗之藥物動力學資料對於FVIIIFc顯示以下結果。相比於ADVATE®(全長rFVIII)，FVIIIFc之全身性暴露(AUCINF)增加約50%，清除率(Cl)降低約50%，且終末半衰期及MRT增加約50-70%。此外，FVIIIFc顯示與ADVATE®相比C168、TBLP1、TBLP3及TBLP5值增加。
AUCINF 自零至無窮大之濃度-時間曲線下面積
βHL 消除相半衰期；亦稱為t1/2β
C168 給藥後約168小時時高於基線之估算FVIIIFc活性
Cl 清除率
MRT 平均滯留時間
TBLP1 給藥後當FVIIIFc活性降至高於基線約1 IU/dL時之模型預測時間
TBLP3 給藥後當FVIIIFc活性降至高於基線約3 IU/dL時之模型預測時間
TBLP5 給藥後當FVIIIFc活性降至高於基線約5 IU/dL時之模型預測時間
亦產生重組B域缺失因子VIII-Fc(rFVIIIFc)融合蛋白作為延長FVIII之半衰期之方法。在血友病A小鼠中比較rFVIIIFc與rFVIII之藥物動力學(PK)。吾等發現rFVIIIFc之終末半衰期為rFVIII之兩倍長。為證實半衰期延長之潛在機制係歸因於rFVIIIFc受到FcRn保護，在FcRn基因剔除及人類FcRn轉殖基因小鼠中評估PK。投與單次靜脈內劑量(125 IU/kg)且使用發色活性分析量測血漿濃度。在兩種小鼠品系中Cmax在rFVIIIFc與rFVIII(XYNTHA®)之間類似。然而，雖然在FcRn基因剔除小鼠中rFVIIIFc之半衰期與rFVIII相當，但在hFcRn轉殖基因小鼠中rFVIIIFc之半衰期延長至rFVIII半衰期之約兩倍長。該等結果證實FcRn介導或負責使rFVIIIFc之半衰期相比於rFVIII延長。因為在血友病小鼠之出血模型中以及在臨床應用中已顯示藉由旋轉血栓彈性描計法(ROTEM®)測得之全血中之凝血與凝血因子之功效有關，因此吾等尋求在血友病A小鼠中使用ROTEM®評估rFVIIIFc之離體功效。向血友病A小鼠投與單次靜脈內劑量之50 IU/kg rFVIIIFc、XYNTHA®(FVIII)或ADVATE®(FVIII)。給藥後5分鐘時，凝塊形成之凝結時間(CT)、凝塊形成時間(CFT)及α角類似。然而，與XYNTHA®(FVIII)及ADVATE®(FVIII)兩者相比，rFVIIIFc顯示在給藥後72及96小時時CT顯著改良，且CFT及α角在96小時時亦改良，此與rFVIIIFc之PK延長一致。因此，構建FVIII之Fc融合體
產生具有確定作用機制之分子，其具有增加之半衰期及提供延長之出血保護的潛能。
本實例呈示來自用25及65 IU/kg FVIII產品治療之16名患者之最終FVIII活性分析結果。參見實例3。
在本實例中，rFVIIIFc為由單個分子之重組B域缺失人類FVIII(BDD-rFVIII)融合於人類IgG1之二聚Fc域構成而無插入連接子序列之重組融合蛋白。此蛋白質構築體在本文中亦稱為rFVIIIFc異二聚雜交蛋白、FVIIIFc單體Fc融合蛋白、FVIIIFc單體雜交物、單體FVIIIFc雜交物及FVIIIFc單體-二聚體。參見實例1、第1圖及表2A。
利用rFVIIIFc進行之臨床前研究顯示rFVIII活性之半衰期與市售rFVIII產品相比延長約2倍。此研究之基本原理為評估於冷凍液體調配物中單次劑量之rFVIIIFc之安全性及耐受性，且提供重度血友病A受試者中PK之資料。對於此研究，可獲得16名可評估受試者用於PK評估。每公斤體重25(n=6)及65 IU(n=10)標稱劑量之rFVIIIFc與ADVATE®兩者之兩次劑量的單次投與係歷經約10分鐘靜脈內輸注。在輸注前以及直至給藥後10天獲得用於血漿PK評定之血樣。在此研究中使用依賴於模型之方法表徵ADVATE®與rFVIIIFc兩者之FVIII活性之PK。
此研究之主要目標為評定在先前經治療之12歲患者(PTP)及患有重度血友病A之上述患者中單次投與兩次劑量之rFVIIIFc(25及65 IU/kg)的安全性及耐受性。
第二目標為確定在單級凝結及發色分析中由與ADVATE®相比在單次投與25或65 IU/kg rFVIIIFc後FVIII隨時間之藥效學(PD)活性確定的藥物動力學(PK)參數。
在篩選訪問(在給予ADVATE®前28天以內)；第0天(注射ADVATE®)，注射前及注射後10及30分鐘及1、3、6及9小時；第1天，注射ADVATE®後24小時；第2天，注射ADVATE®後48小時；第3天，注射ADVATE®後72小時；及第4天，注射高劑量ADVATE®(僅組B)後96小時，收集用於FVIII活性PK評估之血樣。
在rFVIIIFc注射日，恰在投與rFVIIIFc之前、注射rFVIIIFc後10及30分鐘及1、3、6及9小時；第1天，注射rFVIIIFc後24小時；第2至5天，注射rFVIIIFc後48、72、96及120小時；第7天，注射rFVIIIFc後168小時；第8、9及10天，注射高劑量rFVIIIFc(僅組B)後192、216及240小時，收集用於FVIII活性PK評估之血樣。亦在最終研究訪問(注射rFVIIIFc後28天)，注射rFVIIIFc後672小時時量測FVIII活性。
TBLP1=給藥後當FVIII活性降至高於基線約1 IU/dL時之模型預測時間。
TBLP3=給藥後當FVIII活性降至高於基線約3 IU/dL時之模型預測時間
KV_M=Cmax_M/實際劑量(IU/kg)
KV_OB=Cmax_OB/實際劑量(IU/kg)
IVR_M=100×Cmax_M×血漿體積(dL)/總劑量(IU)；其中血漿體積(mL)=(23.7×Ht(cm))+(9.0×Wt(kg))-1709。
IVR_OB=100×Cmax_OB×血漿體積(dL)/總劑量(IU)；其中血漿體積(mL)=(23.7×Ht(cm))+(9.0×Wt(kg))-1709。
觀測到之FVIII活性在短期靜脈內輸注ADVATE®或rFVIIIFc後急劇增加，其中分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測Cmax值對於ADVATE®而言為56.6±4.74及121±28.2 IU/dL且對於rFVIIIFc而言為55.6±8.18及108±16.9 IU/dL。所有經ADVATE®及rFVIIIFc治療之患者之FVIII活性均具有劑量相關性增加。觀測到之Cmax與AUCINF兩者之增加在比例上均與所評估劑量範圍內之劑量相比稍低。
在輸注結束時，觀測FVIII活性之下降顯示單指數衰減特徵，直至達到基線程度。rFVIIIFc之FVIII活性衰減之速率低於ADVATE®，其中分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測消除半衰期值對於ADVATE®而言為11.9±2.98及10.4±3.03小時且對於rFVIIIFc而言為18.0±3.88及18.4±6.99小時。消除半衰期值在對於兩種FVIII產品所評估之劑量範圍內似乎與劑量無關。
在25及65 IU/kg劑量下，rFVIIIFc投與後之總全身性FVIII暴露量(藉由AUCINF所評定)分別比ADVATE®高約48%及61%。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測AUCINF值對於ADVATE®而言為974±259及1810±606 hr*IU/dL且對於rFVIIIFc而言為1440±316及2910±1320 hr*IU/dL。
類似於消除半衰期，rFVIIIFc之MRT相對於ADVATE®延長。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測MRT值對於ADVATE®而言為17.1±4.29及14.9±4.38小時且對於rFVIIIFc而言為25.9±5.60及26.5±10.1小時。MRT在對於兩種FVIII產品所評估之劑量範圍內似乎與劑量無關。
此外，測定CL及V之主要PK參數值。在相等劑量下，rFVIIIFc之CL值僅佔對於ADVATE®所觀測到之CL值的約66%。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測CL值對於ADVATE®而言為2.70±0.729及4.08±1.69 mL/hr/kg且對於rFVIIIFc而言為1.80±0.409及
2.69±1.25 mL/hr/kg。V值在ADVATE®與rFVIIIFc之間相當，其中分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測V值對於ADVATE®而言為43.9±4.27及56.1±13.4 mL/kg且對於rFVIIIFc而言為45.3±7.23及61.6±10.6 mL/kg。隨ADVATE®及rFVIIIFc之劑量增加注意到平均CL及V值之稍微增加；然而，在65 IU/kg劑量下與有限劑量偶聯之標準偏差增加干擾對該等參數之劑量依賴性的評定。舉例而言，rFVIIIFc治療組之CV%幾何平均CL值自23.0%(25 IU/kg)增加至48.6%(65 IU/kg)。
除主要PK參數外，亦測定次級PK參數(例如K值、IVR等)以評估FVIII作用持續時間。在rFVIIIFc之情況下亦觀測到PK差異之跡象，表明在相等劑量下與ADVATE®相比，TBLPI及TBLP3值增加。ADVATE®與rFVIIIFc之IVR及K值似乎相當。隨ADVATE®及rFVIIIFc之劑量增加觀測到TBLP1及TBLP3值稍微增加。相反，隨ADVATE®及rFVIIIFc之劑量增加注意到平均IVR及K值稍微降低。如先前所指示，該等參數之劑量依賴性之評定受到有限劑量干擾。
分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)觀測TBLP1對於ADVATE®而言為每IU/kg 2.88±0.733及2.93±0.848 IU/dL且對於rFVIIIFc而言為每IU/kg 4.28±0.873及5.16±2.02 IU/dL。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)觀測TBLP3對於ADVATE®而言為每IU/kg 2.06±0.527及2.26±0.666 IU/dL且對於rFVIIIFc而
言為每IU/kg 3.09±0.623及3.93±1.59 IU/dL。
使用觀測Cmax值(扣除基線及模型內之殘餘藥物)計算之平均IVR及K值通常大於使用模型預測Cmax值測定之值；與使用單隔室模型會稍微低估觀測峰值活性一致。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)觀測K值對於ADVATE®而言為每IU/kg 2.57±0.198及2.13±0.598 IU/dL且對於rFVIIIFc而言為每IU/kg 2.46±0.330及1.85±0.332 IU/dL。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)觀測IVR值對於ADVATE®而言為94.1±15.6及85.8±16.5%且對於rFVIIIFc而言為89.5±11.9及74.8±6.72%。
觀測到之FVIII活性在短期靜脈內輸注ADVATE®或rFVIIIFc後急劇增加，其中分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測Cmax值對於ADVATE®而言為70.2±9.60及157±38.6 IU/dL且對於rFVIIIFc而言為70.3±10.0及158±34.7 IU/dL。
所有經ADVATE®及rFVIIIFc治療之患者之FVIII活性均具有劑量相關性增加。觀測到之Cmax與AUCINF兩者之增加在比例上均與所評估劑量範圍內之劑量相比稍低。
在輸注結束時，觀測FVIII活性之下降顯示單指數衰減特徵，直至達到基線程度。rFVIIIFc之FVIII活性衰減
之速率低於ADVATE®，其中分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測消除半衰期值對於ADVATE®而言為10.7±1.98及10.3±3.27小時且對於rFVIIIFc而言為16.2±2.92及19.0±7.94小時。消除半衰期值在對於兩種FVIII產品所評估之劑量範圍內似乎與劑量無關。
在25及65 IU/kg劑量下，rFVIIIFc投與後之總全身性FVIII暴露量(藉由AUCINF所評定)分別比ADVATE®高約53%及84%。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測AUCINF值對於ADVATE®而言為1080±236及2320±784 hr*IU/dL且對於rFVIIIFc而言為1650±408及4280±1860 hr*IU/dL。
類似於消除半衰期，rFVIIIFc之MRT相對於ADVATE®延長。分別對於23及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測MRT值對於ADVATE®而言為15.3±2.86及14.8±4.72小時且對於rFVIIIFc而言為23.4±4.22及27.3±11.4小時。MRT在對於兩種FVIII產品所評估之劑量範圍內似乎與劑量無關。
此外，測定CL及V之主要PK參數值。在相等劑量下，rFVIIIFc之CL值僅佔對於ADVATE®所觀測到之CL值的約58-66%。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模型預測CL值對於ADVATE®而言為2.39±0.527及3.21±1.40 mL/hr/kg且對於rFVIIIFc而言為1.57±0.349及1.86±0.970 mL/hr/kg。V值在ADVATE®與rFVIIIFc之間相當，其中分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)模
型預測V值對於ADVATE®而言為35.8±5.52及43.6±11.2 mL/kg且對於rFVIIIFc而言為35.9±6.65及42.7±8.91 mL/kg。隨ADVATE®及rFVIIIFc之劑量增加注意到平均CL及V值之增加；然而，在65 IU/kg下與有限劑量偶聯之標準偏差增加干擾對該等參數之劑量依賴性的評定。
除主要PK參數外，亦測定次級PK參數(例如K值、IVR等)以評估FVIII作用持續時間。在rFVIIIFc之情況下亦觀測到PK差異之跡象，表明在相等劑量下與ADVATE®相比，TBLP1及TBLP3值增加。ADVATE®與rFVIIIFc之IVR及K值似乎相當。
隨ADVATE®及rFVIIIFc之劑量增加觀測到TBLP1及TBLP3值稍微增加。相反，隨ADVATE®及rFVIIIFc之劑量增加注意到平均IVR及K值稍微降低。如先前所指示，該等參數之劑量依賴性之評定受到有限劑量干擾。
分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)觀測TBLP1對於ADVATE®而言為每IU/kg 2.70±0.511及3.09±0.978 IU/dL且對於rFVIIIFc而言為每IU/kg 4.06±0.798及5.66±2.38 IU/dL。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)觀測TBLP3對於ADVATE®而言為每IU/kg 1.98±0.377及2.39±0.718 IU/dL且對於rFVIIIFc而言為每IU/kg 3.04±0.598及4.44±1.84 IU/dL。
使用觀測Cmax值(扣除基線及模型內之殘餘藥物)計算之平均IVR及K值通常大於使用模型預測Cmax值測定之值；與使用單隔室模型會稍微低估觀測峰值活性一致。
分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)觀測K值對於ADVATE®而言為每IU/kg 3.08±0.429及2.85±0.721 IU/dL且對於rFVIIIFc而言為每IU/kg 3.12±0.451及2.92±0.985 IU/dL。分別對於25及65 IU/kg劑量組，平均(±SD)觀測IVR值對於ADVATE®而言為112±14.5及116±26.9%且對於rFVIIIFc而言為113±16.3及117±33.6%。
所有經ADVATE®及rFVIIIFc治療之患者在所評估之劑量範圍內均具有相當之劑量相關性Cmax及AUCINF增加。在輸注結束後第一小時內觀測到ADVATE®及rFVIIIFc活性之峰值血漿含量且在給藥後若干天保持可偵測。在輸注結束後，基線校正之FVIII活性的下降顯示單指數衰減直至達到兩種產品之基線。消除半衰期及MRT之參數值在對於兩種FVIII產品所評估之劑量範圍內似乎與劑量無關。隨ADVATE®及rFVIIIFc之劑量增加注意到平均CL及V值之稍微增加；然而，在65 IU/kg下與有限劑量偶聯之受試者間可變性增加干擾對該等參數之劑量依賴性的評定。
rFVIIIFc與ADVATE®活性PK之比較揭示在相當之劑量下，rFVIIIFc與ADVATE®與相比全身性暴露量增加約48-61%(單級分析)或53-84%(發色分析)，清除率降低約30-40%且消除半衰期及MRT均增加約50-80%。在rFVIIIFc之情況下亦觀測到PK差異之跡象，表明在相等
劑量下與ADVATE®相比，TBLP1及TBLP3值增加。ADVATE®與rFVIIIFc之IVR及K值似乎相當。
由發色分析結果獲得之PK參數通常與由單級分析獲得者一致，除發色分析得到暴露量參數(例如Cmax、AUCINF等)之較高估算以外。
鑒於觀測到PK之改良，因此rFVIIIFc可提供延長之出血保護，從而允許對於患有血友病A之受試者給予較低頻率之注射。
基於由rFVIII：Fc之首次人類研究(實例3)獲得之臨時PK分析，設計A-LONG研究。A-LONG為重組因子VIII Fc融合體(FVIII：Fc)在先前經治療之患有重度血友病A(定義為<1 IU/dL[<1%]內源性FVIII)之受試者中預防及治療出血之安全性、藥物動力學及功效的開放標記多中心評估。
約106名受試者將入選三種方案之一：定製預防方案(小組1)、每週給藥方案(小組2)及按需方案(小組3)。
小組1將包括整個群組及PK子群。約66名受試者將入選。最初之方案為每週兩次，在第一天25 IU/kg，接著在該週之第四天50 IU/kg。受試者將在此每週預防方案中投與rFVIIIFc直至獲得rFVIIIFc之PK結果。基於該等結
果，將對各受試者建立定製預防方案，其中將確定劑量及間隔以維持1-3% FVIII活性之穀含量。各受試者接著將在整個該研究中投與其個別定製之預防方案。
將在整個該研究中監測受試者且進行不間斷之劑量及間隔調整。僅在受試者經歷不可接受之出血事件(定義為在連續兩個月之時間內2次自發性出血事件)時進行調整。在此情況下，調整之目標為3-5%之穀含量。
約20名受試者將入選/隨機化且如下進行簡短rFVIIIFc PK概況分析：洗脫(Washout)至少96小時；單次劑量之rFVIIIFc 65 IU/kg；在rFVIIIFc第0天開始簡短取樣，包括注射前及注射開始後10(±2)分鐘、3小時(±15分鐘)、72(±2)小時[第3天]及96(±2)小時[第4天]。簡短PK概況分析後，受試者接著將每隔7天投與固定劑量之65 IU/kg rFVIIIFc至少持續28週且直至52週。
在該研究中將評估至少5名受試者中之最少10次大手術。大手術定義為涉及全身麻醉及/或呼吸輔助之任何手術程序(選擇性或緊急性)，其中穿透及暴露主要體腔，或身體或生理功能受到實質性損害(例如剖腹術、開胸術、開顱術、關節置換及截肢)。
對於手術期間之預防，受試者將每12至24小時用20
至50 IU/kg rFVIIIFc治療。手術前，醫師將審查受試者之rFVIIIFc PK概況且評定該類型之計畫手術通常需要之因子VIII替代的劑量方案及受試者之臨床狀態。手術治療期(包括任何康復時間)中rFVIIIFc適當給藥之推薦將考慮該等因素。
該研究之主要目標為(a)評估作為預防、按需及手術治療方案投與之rFVIIIFc之安全性及耐受性；及(b)評估作為預防、按需及手術治療方案投與之rFVIIIFc之功效。該研究之次級目標為(a)表徵rFVIIIFc之PK概況且將rFVIIIFc之PK概況與當前市售之產品ADVATE®進行比較；(b)評估與FVIIIFc之個別反應；及(c)評估FVIIIFc消耗。
評估作為預防、每週、按需及手術治療方案投與之rFVIIIFc之安全性及耐受性
評估作為定製預防、按需及手術治療方案投與之rFVIIIFc之功效
表徵rFVIIIFc之PK概況且將rFVIIIFc之PK概況與當前市售之產品ADVATE®進行比較
評估與rFVIIIFc之個別反應
表徵在預防方案中充分預防出血；在手術配置中維持
止血；或在按需、每週治療或預防配置中治療出血事件所需要之劑量範圍及時程
評估rFVIIIFc消耗(例如每名受試者每年總rFVIIIFc消耗)
在實例7中之研究中，除藉由單級活化部分凝血酶原激酶時間(aPTT)分析量測血漿FVIII活性外，亦利用全血旋轉血栓彈性描計法(ROTEM®)來在2名受試者中(特定言之，1名在低劑量組中且1名在高劑量組中)藉由rFVIIIFc及ADVATE®評定全面止血之改良。
rFVIIIFc與ADVATE®當在rFVIIIFc治療前添加至受試者之血液中時在凝塊形成方面似乎具有類似活性。凝結時間(CT)關於rFVIIIFc及ADVATE®之劑量在正常值之100%之約1%範圍內呈線性，且劑量反應在同一受試者中在rFVIIIFc與ADVATE®之間相當。
給予ADVATE®且隨後給予rFVIIIFc後，在不同時間點對檸檬酸化全血進行取樣且藉由ROTEM®監測再鈣化後之凝塊形成。儘管在給予ADVATE®或rFVIIIFc前歸因於殘餘FVIII含量而具有可變基線CT，但兩種產品均在注射後30分鐘在類似之程度上有效校正CT。此外，在注射25 IU/kg rFVIIIFc後3小時時及之後，相比於ADVATE®，在以此低劑量給藥之受試者中CT之改良得到
更佳之維持。然而，rFVIIIFc與ADVATE®之改良差異在65 IU/kg劑量下明顯程度低得多。
使用HemA小鼠進行尾夾研究。首先麻醉小鼠且接著注射4.6 μg/kg、1.38 μg/kg或0.46 μg/kg之經加工rFVIIIFc(藥物，其含有約75%-85%經加工rFVIIIFc)及經純化之單鏈rFVIIIFc。注射後，將尾自尖端切斷且即刻置於管中以收集血液。量測經加工FVIIIFc(藥物)及單鏈FVIIIFc之存活保護百分比，如表7及第7圖中所示。
如表7及第7圖中所示，單鏈rFVIIIFc之存活保護與經加工rFVIIIFc(DS)相當。
進一步在全血旋轉血栓彈性描計法(ROTEM)中在一定濃度範圍內研究rFVIIIFc之凝結效能且與rBDD FVIII(Xyntha)及重組全長FVIII(rflFVIII；Advate)兩者進行比較。對於活體外ROTEM，將rFVIII蛋白以三份重複添加至自5-6只HemA小鼠之腔靜脈收集之檸檬酸化彙集血液中至最終濃度為正常血漿FVIII含量之0、0.1、1、10及
100%。藉由添加CaCl2(NATEM)起始凝塊且在ROTEM系統(Pentapharm GmbH,Munich,Germany)上記錄凝結時間(CT)、凝塊形成時間(CFT)、α角及最大凝塊堅實度(MCF)。以正常FVIII含量之0.1-100%之遞增劑量添加至HemA小鼠血液中之三種蛋白質的凝結時間(CT)、凝塊形成時間(CFT)及α角展示於第14圖中。在正常值之0.1至100%之寬範圍中，CT及CFT在rFVIIIFc、rBDD FVIII及rflFVIII間相當。α角僅在10%之rFVIIIFc與rBDD FVIII之間顯著不同(p<0.05)。
在單次靜脈內注射至血友病A小鼠中後將藉由ROTEM量測之rFVIIIFc之藥效學與rBDD FVIII及rflFVIII進行比較。對於離體ROTEM，向雄性HemA小鼠靜脈內注射單次劑量之50 IU/kg rFVIIIFc、ADVATE®或XYNTHA®，且在各時間點(給藥後5分鐘、24、48、72及96小時)處死5只小鼠。即刻在ROTEM系統上藉由NATEM分析自腔靜脈收集之個別檸檬酸化全血且如上所述量測參數。測定給藥後5分鐘至96小時獲取之樣品的CT、CFT及α角，且展示於第15圖中。5分鐘時，全部之有效性相當，得到類似之CT、CFT及α角(第15A圖-第15C圖)。然而，相對於rBDD FVIII及rflFVIII，rFVIIIFc顯示顯著改良(p<0.05)72及96小時時之CT及96小時時之CFT及α角(第15A圖-第15C圖)。
重組因子VIIIFc(rFVIIIFc)由遺傳融合於人類免疫球蛋白G1(IgG1)之Fc域的B域缺失(BDD)rFVIII蛋白構成。在自HEK 293細胞分泌前，大部分rFVIIIFc加工成FVIII重鏈(HC)及輕鏈(LC+Fc)。在循環中，rFVIIIFc與血友病因子(VWF)複合且在活化後以不可與天然FVIII區分之方式釋放。認為HC及LC之自發性解離造成FVIII活性在血漿中及在FVIII藥品儲存期間的降低。此處吾等描述rFVIIIFc之單鏈未加工同功異型物(SC rFVIIIFc)，其可提供與天然FVIII相比優良之可製造性及增強之穩定性。
自含有一部分未加工同功異型物之rFVIIIFc純化SC rFVIIIFc。與rFVIIIFc相比，SC rFVIIIFc顯示相等發色活性，但在單級(aPTT)分析中活性降低約60%(表3A-B)。使用校準之自動化凝血酶曲線(calibrated automated thrombogram)(來自Thrombinoscope®)進行凝血酶產生分析(TGA)。在凝血酶產生分析(TGA)中，SC rFVIIIFc亦顯示與rFVIIIFc相比降低之凝血酶潛能(第13A圖)及峰值凝血酶(第13B圖)。然而，如表3B中所示，在vWF不存在下藉由aPTT觀測到SC rFVIIIFc之完全活性，表明自vWF之釋放可因在SC rFVIIIFc中之Arg 1680裂解後a3酸性區共價連接於HC而延遲，相比之下a3自完全加工之FVIII之釋放及解離。自vWF之解離延遲可解釋在aPTT分析及TGA中觀測到之活性降低，而在兩級發色分析中
觀測到完全活性。在vWF存在下活化速率降低在利用限制凝血酶作為FVIII活化因子之經修改之發色受質分析中證實。
在HemA小鼠尾靜脈橫斷(TVT)模型中評定SC rFVIIIFc之活體內功能。在TVT前48小時將HemA雄性小鼠用指定劑量之rFVIIIFc藥品或SC rFVIIIFc處理。TVT後每小時監測尾再出血及存活直至12小時，其中最後一次觀測在TVT後24小時進行。當在輸注後48小時進行TVT時，SC rFVIIIFc與rFVIIIFc在此模型中顯示相等之活體內功效，其中ED50分別為1.17 μg/kg及1.23 μg/kg。對於各測試劑量下之SC rFVIIIFc及rFVIIIFc，在HemA小鼠中觀測到相當之TVT後24小時存活曲線(p0.65)(第7(B)圖)及再出血速率(第7(C)圖)，表明SC rFVIIIFc儘管具有較低表觀aPTT活性，但其與rFVIIIFc同樣有效。因此在vWF存在下SC rFVIIIFc之活體外活化延遲似乎對其活體內功效並無顯著影響。因此，SC rFVIIIFc代表一種具有潛在臨床應用之rFVIIIFc之新穎且有效的同功異型物。將需要其他研究來證明在此Fc融合蛋白之情形下產品之穩定性增強。
現有因子VIII(FVIII)產品顯示約8-12小時之半衰期(t1/2)，從而需要頻繁靜脈內注射以便預防及治療血友病A患者。rFVIIIFc為由單個FVIII分子共價連接於用於延長
循環rFVIII半衰期之人類IgG1之Fc域構成的重組融合蛋白。在患有重度血友病A之先前經治療之雄性受試者中進行的此首次人類研究對rFVIIIFc之安全性及藥物動力學進行研究。十六名受試者接受單次劑量之25或65 IU/kg之ADVATE®，接著接受相等劑量之rFVIIIFc。大部分不良事件與研究藥物無關。無研究受試者發展出抗FVIIIFc抗體或抑制劑。在整個劑量範圍內，與ADVATE®相比，rFVIIIFc顯示1.54至1.71倍長之消除t1/2及平均滯留時間、1.49至1.56倍低之清除率及1.48至1.56高之總全身性暴露量。ADVATE®與rFVIIIFc具有相當之劑量依賴性峰值血漿濃度及回收率。在整個劑量範圍內達到FVIII活性比基線高1%之時間為ADVATE®之約1.53至1.68倍長。因此，rFVIIIFc可提供切實可行的在患有血友病A之患者中獲得延長之止血保護作用且給藥頻率較低的治療方法。
血友病A為導致關節及軟組織中頻繁自發性及創傷性出血之遺傳性出血病症。Mannucci PM,Tuddenham EGD,N Engl J Med,344：1773-1779(2001)。當治療不充分時，此出血導致慢性關節病變、失能及死亡風險增加。Soucie JM等人，Blood.96(2)：437-442(2000)。
利用血漿來源之FVIII(pdFVIII)及重組人類FVIII(rFVIII)產品來治療(按需療法)及預防(預防療法)出血事件。開發rFVIII以降低血漿產品受HIV及肝炎病毒廣泛污染後血源性病原體傳播之風險及確保FVIII產品之
充分供應。然而，利用當前FVIII產品獲得之止血保護因約8-12小時之短半衰期(t1/2)而在時間上受到限制，對於大部分患者而言需要預防性注射每週三次或每隔一天一次，以維持FVIII含量高於1%，已確定該含量對大部分自發性出血事件具有保護性。Manco-Johnson等人，New Engl J Med.357(6)：535-44(2007)。
許多研究顯示，甚至在高劑量下，按需療法在預防關節病變方面亦無效。Aledort L.等人，J Intern Med.236：391-399(1994)；Petrini P.等人，Am J Pediatr Hematol Oncol.13：280-287(1991)。在眾多臨床研究中4,6-15及Manco-Johnson等人，同上已證明預防性療法之效益，確定在首次關節出血後開始初級預防之兒童具有比按需治療之兒童顯著較少之出血及較少關節損傷。
與按需治療相比，預防性療法亦減少失能、住院率及自學校或工作損失之時間6,16；且改良患者及其家人之生活品質17。然而，預防性療法在兒童中通常需要使用中樞性神經接入裝置，且其伴隨感染、敗血症及血栓症之風險。此外，儘管具有效益，但部分歸因於不便利性及侵入性，故預防之接受度及順應性隨年齡而降低18,19。因此，具有延長之血漿t1/2的rFVIII產品將可能為有益的。Lillicrap D.,Current Opinion in Hematology 17：393-397(2010)。
rFVIIIFc為由單個B域缺失rFVIII分子共價連接於人類IgG1 Fc域構成的重組融合蛋白。Fc融合蛋白之潛在
益處包括較佳耐受性及延長之止血保護，且Fc域代表無已知固有毒性之天然分子21,22。連接於IgG 1 Fc域允許結合在多種細胞類型(包括內皮細胞)中表現之新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn表現在一生中保持穩定且負責保護IgG1及Fc融合蛋白免於溶酶體降解，因此延長蛋白質之t1/2 21,23。循環內之眾多蛋白質經由非特異性胞飲作用內化至襯於血管上之細胞中且轉運至內體及溶酶體降解路徑。
Fc蛋白與駐留於內體中之FcRn相互作用。含有FcRn之內體引導Fc融合蛋白返回至質膜，以pH值依賴性方式將其釋放至循環中24，由此避免溶酶體降解。此再循環方法已成功用於延長治療性生物劑之t1/2；多種基於Fc融合體之藥物已批准用於臨床用途(例如伊納西普(etanercept)、羅米斯汀(romiplostim))且其他正在開發25,26。
rFVIIIFc之臨床前資料表明FVIII可藉由天然的由FcRn介導之保護路徑自降解救回，因此延長t1/2。在血友病A小鼠及狗中，rFVIIIFc之終末血漿t1/2為rFVIII之約2倍長27,28。基於此等資料，吾等進行首次人類臨床研究以在患有血友病A之受試者中研究持久rFVIIIFc融合蛋白之安全性及PK。
研究設計：在先前經治療之患有重度血友病A之患者中之此開放標記劑量遞增多中心1/2a期研究在與ADVATE®(抗血友病因子[重組]，血漿/無白蛋白方法，octocog alfa,Baxter Healthcare)比較之情況下研究
rFVIIIFc之安全性及其藥物動力學(PK)。根據US CFR及ICH良好臨床規範指南(Guidelines on Good Clinical Practices)執行此研究。在任何測試前，自參與倫理審查委員會(participating Institutional Review Boards)獲得批准及自所有受試者獲得書面知情同意書。研究設計為依序的；以25或65 IU/kg投與單次劑量之ADVATE®，接著為相等劑量之rFVIIIFc(第8圖)。兩種藥物皆經約10分鐘靜脈內注射。預期該兩種劑量囊括典型治療劑量範圍。受試者在接受rFVIIIFc後跟蹤28天以進行安全性分析，包括在注射後14及28天測試抗FVIII抗體及抑制劑。在注射前、rFVIIIFc注射後10及30分鐘、1、3、6、9、24、48、72、96、120及168小時(7天)量測受試者中之血漿FVIII活性，其中對於給予65 IU/kg rFVIIIFc之受試者另外在192、216及240小時(10天)取樣。在ADVATE®治療後之相同時間點量測血漿FVIII活性，對於25 IU/kg組至72小時且對於65 IU/kg組至96小時。
受試者：男性受試者為至少12歲，患有重度血友病A(定義為FVIII活性程度<1%)且具有至少100次有記錄之先前FVIII濃縮物(pdFVIII或rFVIII)暴露日。排除對於小鼠或倉鼠蛋白質具有已知過敏性、篩選時具有抑制劑或可偵測抑制劑效價病史或服用任何可能影響止血之藥物或全身性免疫抑制性藥物或者在篩選30天以內經歷活動性細菌或病毒感染(除肝炎或HIV以外)之受試者。當已知時，在研究登記時記錄受試者之基因型。
治療產品：人類rFVIIIFc及Fc轉殖基因穩定轉染至HEK293細胞中且廣泛測試細胞系之穩定性、無菌性及病毒污染以確保安全性。純化之藥品由單體B域缺失FVIII經由其羧基端共價連接至Fc單體之N端構成，該Fc單體之N端在合成及自細胞分泌期間與第二Fc單體形成二硫鍵。藉由層析及奈米過濾純化rFVIIIFc，且在單級及發色凝結分析中相對於市售rFVIII製劑完全具有活性。其係作為每2 mL溶液含有1000 IU且用L-組胺酸(pH 7)、氯化鈉、氯化鈣、蔗糖、甘露糖醇及聚山梨醇酯20調配之冷凍液體供應。對於注射，將產品用生理食鹽水溶液(0.9% NaCl)稀釋。
結果指標：該研究之主要目標為安全性，經由身體檢查、治療緊急性不良事件(AE)之報導、抗體之發展及隨時間之實驗室監測進行評估。次級目標包括自PK分析獲得之參數。實驗室評定包括凝血酶原時間、活化部分凝血酶原激酶時間(aPTT)、國際正規化比率、D二聚體含量、血友病因子(vWF)抗原、標準血液學及血液化學測試以及尿分析。
在Siemens BCS-XP分析儀上使用市售試劑(Dade Actin FSL)在針對可追蹤至關於人類血漿之世界衛生組織(WHO)第5版國際標準(IS)之正常參考血漿(Precision Biologics CRYOcheckTM)校準下藉由單級凝結(aPTT)分析來量測FVIII活性。除aPTT分析外，亦使用符合歐洲藥典推薦之市售套組(Aniara BIOPHEN FVIII：C)藉由發色受
質分析29來量測FVIII活性。針對亦具有針對WHO第5版IS人類血漿標準物之效能的正常人類參考血漿(Instrumentation Laboratories ORKE45)校準發色分析。
單級及發色分析之定量下限(LLOQ)分別為0.5 IU/dL及0.4 IU/dL。藉由經-*Nijmegen修改之貝塞斯達(Bethesda)分析量測FVIII抑制劑且少於0.6 BU/mL視為陰性。使用特異性橋接電化學發光免疫分析評定抗rFVIIIFc抗體，該電化學發光免疫分析使用生物素及經磺基標記之rFVIIIFc。使用抗人類FVIII單株抗體作為替代對照側得分析敏感性為89 ng/mL。在各種時間點在兩名受試者(各劑量一名)中進行探索性全血旋轉血栓彈性描計法(ROTEM®)以評定注射ADVATE®及rFVIIIFc後全面止血作用之改良。
藥物動力學分析：在WinNonLin中利用使用者定義之單隔室配置模型(其自動估算內源性FVIII含量及後續殘餘衰減)以便分析單次投與ADVATE®或rFVIIIFc後之個別受試者血漿FVIII活性對時間資料。實際取樣時間、劑量及注射持續時間用於計算參數，包括最大活性(Cmax)、t1/2、清除率(CL)、穩態分佈體積(Vss)、曲線下面積(時間零外推至無窮大[AUCINF])、平均滯留時間(MRT)及增量回收率。
rFVIIIFc活性對時間曲線之蒙特卡洛模擬(Monte Carlo Simulation)-為在25 IU/kg或65 IU/kg之給藥方案後構建FVIII活性-時間曲線，使用ADVATF®及rFVIIIFc
之群體PK模型進行蒙特卡洛模擬。在此1/2a期研究中基於來自16名受試者之ADVATE®及rFVIIIFc之單級(aPTT)凝結分析估算所測試群體中模型參數(CL、分佈體積)之平均估算值、受試者間變異及殘餘可變性。對於每個給藥方案以每名受試者之15個取樣點模擬五百名受試者。估算在ADVATE®或rFVIIIFc之不同給藥方案後之不同時間點FVIII活性高於或等於1%及3%之群體的百分比。
統計分析-使用變異數模型之分析比較rFVIIIFc及ADVATE®之所選PK參數。對於此等分析將PK參數進行對數轉化，且轉化對數尺度上之估算平均值、平均差異及信賴區間以分別獲得原始尺度上之幾何平均值、幾何平均比率(GMR)及信賴區間。GMR為rFVIIIFc PK參數值與ADVATE® PK參數值之受試者內比率之幾何平均值。
受試者配置-十九名受試者入選該研究；16名進行ADVATE®及rFVIIIFc兩者之PK評估。一名受試者在給予ADVATE®後之洗脫期前自己投與其先前產品且因此自PK分析排除，但包括於安全性分析中。三名受試者在接受研究藥物前中斷研究：一名自願退出；第二名因無順應性而由研究者排除；且一名因完成研究入選而在資助者要求下退出。在給藥之受試者中，六名受試者接受25 IU/kg且10名受試者接受65 IU/kg之ADVATE®與rFVIIIFc兩者。平均年齡為40.3歲(23至61歲)。收集七名受試者之基因
型鑒別；在六名受試者中報導內含子22倒位。九名受試者之基因型未知。十三名受試者具有C型肝炎抗體，其中四名亦為HIV陽性。
安全性-在治療及追蹤期期間由11(69%)名受試者報導四十四次治療緊急性AE。其包括Advate或rFVIIIFc給藥日至給藥後觀察期28天。大部分事件視為輕度且無一者導致自研究退出。一次事件味覺障礙在一名受試者中在接受65 IU/kg劑量之rFVIIIFc時短暫發生且認為與rFVIIIFc有關。
一名受試者在接受65 IU/kg rFVIIIFc後經歷焦慮發作，65 IU/kg rFVIIIFc導致21次AE，其中19次分級為輕度，且其中兩次(頭痛及畏光)分級為中度。無一者在研究者看來與rFVIIIFc有關。
未報導嚴重出血事件。未偵測到對注射之過敏性反應之跡象。所有所測試之血漿樣品對於FVIII抑制劑及抗rFVIIIFc抗體呈陰性。未觀察到注射部位反應跡象。未報導異常實驗室值之臨床上有意義之變化。
藥物動力學：血漿中rFVIIIFc之aPTT與發色活性之間的相關性-在相同分析中使用市售試劑及針對正常人類血漿標準物之校準測定ADVATE®及rFVIIIFc活性。在具有高於LLOQ之活性之樣品中藉由單級凝結分析及發色分析獲得之結果之間存在強相關性。在給予ADVATE®後之151個樣品與給予rFVIIIFc後之185個樣品分別之兩個分析結果之間觀察到0.94及0.95之相關性係數(Pearson
R2)。與aPTT結果相比，發色FVIII活性平均高21%(對於ADVATE®)及高32%(對於rFVIIIFc)，無統計顯著性(第9圖)。此觀測結果導致由兩種藥物之發色評定獲得之暴露量參數之評估稍高。由發色分析獲得之明顯較高FVIII回收率對於在臨床分析中所測試之重組FVIII產品為典型的，且與大部分其他市售FVIII產品一致30-32。
rFVIIIFc之改良之藥物動力學-自單級(aPTT)凝結分析活性資料推導出初級PK估算值。在相等劑量之rFVIIIFc後接受25或65 IU/kg ADVATE®之受試者中，血漿FVIII活性急劇上升且在給藥後一小時內達到Cmax。觀測到之FVIII活性之後續下降展現單指數衰減特徵，直至達到基線FVIII活性(第10圖)。Cmax與劑量成比例增加，但在相等劑量之ADVATE®與rFVIIIFc之間相當(表8)。總暴露量(AUCINF)亦與劑量成比例增加。然而，rFVIIIFc之AUCINF分別為25 IU/kg(p=0.002)及65 IU/kg(p<0.001)之ADVATE®之AUCINF的1.48及1.56倍高(表8)。
t1/2、MRT、CL及Vss似乎與劑量無關(表8)。rFVIIIFc之t1/2幾何平均值對於25 IU/kg及65 IU/kg劑量組均為18.8小時。此表示在相等劑量(p<0.001)下，相比
於ADVATE®(12.2小時及11.0小時)分別得到1.54及1.70倍改良(表8)。比較rFVIIIFc之MRT(對於兩個劑量組為27.0小時)與ADVATE®之MRT(對於25 IU/kg為17.5小時且對於65 IU/kg為15.8小時)觀察到相同受試者內改良(p<0.001)。與t1/2及MRT之改良一致，在25 IU/kg(p=0.002)及65 IU/kg(p<0.001)劑量下受試者內CL分別產生相應1.49及1.56倍降低。在ADVATE®與rFVIIIFc之間，Vss及增量回收率無顯著差異。因此，在各受試者中，rFVIIIFc顯示與ADVATE®相比，PK概況得到改良。亦觀察到，在ADVATE®時具有較短半衰期之患者在rFVIIIFc時具有較短半衰期，且在ADVATE®時具有較長半衰期之患者在rFVIIIFc時具有較長半衰期。
rFVIIIFc之PK概況改良使得給藥後到達1% FVIII活性之時間增加，該時間在25 IU/kg(p<0.001)及65 IU/kg(p<0.001)下分別為ADVATE®時之1.53及1.68倍長(資料未展示)，表明rFVIIIFc之潛在較長治療持續時間。
rFVIIIFc相對於ADVATE®有利之PK概況亦藉由在發色分析中量測之FVIII活性證明(表9)，其與由aPTT分析得到之資料相當。然而，ADVATE®及rFVIIIFc兩者基於發色分析之暴露量(亦即Cmax及AUCINF)之估算稍高於單級(aPTT)凝結分析。
血友病因子與rFVIIIFc配置之間的相關性-因為循環中之大部分FVIII與VWF複合33且因為基因體範圍之締合研究已鑒別出FVIII層面之遺傳決定子主要取決於VWF
含量34，吾等檢查了VWF與rFVIIIFc之間的締合。在VWF含量與rFVIIIFc及ADVATE®兩者之CL及t1/2之間觀察到強相關性。如第10圖中所示，隨著VWF之含量增加，rFVIIIFc(p=0.0016)及ADVATE®(p=0.0012)之CL降低。
在VWF之含量與t1/2之間觀察到相反關係。隨著之含量增加，rFVIIIFc(p=0.0003)及ADVATE®(p<0.0001)之t1/2增加。此相關性表明rFVIIIFc之Fc部分不改變VWF在保護FVIII以免清除方面之作用。
全血ROTEM®上rFVIIIFc之延長之PK之作用-在投與研究藥物之前，向來自各劑量組中一名受試者之血液中添加相等劑量之rFVIIIFc或ADVATE®且藉由全血ROTEM®進行分析。凝結時間(CT)在正常值之約1%至100%之範圍內關於劑量呈線性，且劑量反應在同一受試者中在rFVIIIFc與ADVATE®之間相當(資料未示)，表明在凝塊形成中rFVIIIFc與ADVATE®具有相當之效能。
儘管在投與ADVATE®或rFVIIIFc前歸因於殘餘FVIII含量而具有可變基線CT，但兩種產品均在給藥後30分鐘在類似之程度上有效校正CT(第12圖)。在25 IU/kg之劑量3小時後(第12A圖)且在65 IU/kg之劑量24小時後(第12B圖)，CL之改良由rFVIIIFc獲得之維持優於ADVATE®。
rFVIIIFc在兩種劑量下受試者均良好耐受。在臨床上未觀測到血液學、血液化學及尿分析參數之顯著變化。大
部分AE為輕度的，與rFVIIIFc無關且可消退並無後遺症。在研究期間未發生嚴重AE或死亡，且任一劑量之受試者均未發展針對rFVIIIFc之中和或結合抗體。
rFVIIIFc顯示相對於ADVATE®顯著改良FVIII活性PK概況，其中如藉由單級(aPTT)凝結分析所量測t1/2及MRT在整個劑量範圍內為1.54至1.71倍長且藉由兩級發色分析量測時為1.59至1.84倍長。rFVIIIFc之活性延長預示可能之功效延長，從而允許在預防性治療患有血友病A之患者時以較低頻率給藥之方案。
採用由此研究獲得之PK參數，蒙特卡洛模擬預測與接受相等劑量之ADVATE®之患者相比，較高百分比之接受rFVIIIFc之患者將維持FVIII含量高於1%或3%(表10)。舉例而言，在25 IU/kg之劑量下，預測12.2%之ADVATE®患者與71.2%之rFVIIIFc患者在第4天時具有高於1%之FVIII穀含量；在65 IU/kg之劑量下，預測11.0%之ADVATE®患者與66.4%之rFVIIIFc患者在第4天時具有高於3%之FVIII含量。計畫在大量患者中進行臨床試驗以證實由此1/2a期研究及蒙特卡洛模擬預測獲得之結果。
儘管對於多種蛋白質治療劑，Fc融合體技術在延長循環t1/2中獲得成功，但認為rFVIII太大從而不能成功產生二聚Fc融合體。吾等產生單體Fc融合蛋白，由此將單個效應分子共價連接於二聚Fc，使得能夠結合細胞內FcRn且後續再循環21,22。活體外凝血分析藉由凝結或發色分析使用市售試劑及常用FVIII參考標準物證明與B域缺失或天然FVIII相比，對於rFVIIIFc之比活性未降低(JAD,TL,SCL等人，2011年8月提交之原稿)。此外，該等結果指示rFVIIIFc可在臨床配置中藉由單級分析或發色方法可靠地分析。
總之，此1/2a期臨床試驗為第一次證明rFVIIIFc在患有重度血友病A之患者中之安全性及延長之t1/2的試驗。關鍵之第3期研究正利用rFVIIIFc在進行以建立用於
患有血友病A之受試者的有效預防給藥方案。
由在生物合成期間在殘基R1648處不完全蛋白水解產生之因子VIII(FVIII)之新穎單鏈(SC)同功異型物可提供相對於天然FVIII優良之可製造性及穩定性。融合於免疫球蛋白Fc域之單一重組B域缺失因子VIII分子(rFVIIIFc)及其經純化SC對應物(SC-rFVIIIFc)在使用去除血友病因子(VWF)之血漿之單級凝結分析中顯示類似比活性，但SC-rFVIIIFc在VWF存在下顯示較低之比活性。進行此研究以確定VWF結合之rFVIIIFc、SC-rFVIIIFc及rBDD-FVIII(XYNTHA®，REFACTO AF®)在凝血酶介導之自VWF蛋白水解釋放方面是否不同。
將等莫耳量之rFVIIIFc、SC-rFVIIIFc及rBDD-FVIII捕捉於藉由胺偶合固定有人類VWF之光學生物感測器晶片上。將一定濃度範圍之人類α-凝血酶輸注於晶片表面上，且即時監測FVIII自固定之VWF釋放之速率。測定各FVIII物質之α-凝血酶之半最大有效濃度(EC50)。
rFVIIIFc及rBDD-FVIII之α-凝血酶EC50值相當(分別為3.7±0.2 U/mL及3.2±0.3 U/mL)，而SC-rFVIIIFc之EC50值大於3倍高(11.7±0.9 U/mL)。SC-rFVIIIFc自VWF之釋放比rFVIIIFc或rBDD-FVIII緩慢之此發現與先前觀測到之在單級凝結分析(aPTT)中關於rFVIIIFc及SC-rFVIIIFc之發現一致，在該分析中，僅當在分析血漿樣品
中存在VWF時，SC-FVIIIFc具有較低表觀活性。然而，所有樣品在小鼠出血模型中具有相等活性，指示在FVIII自VWF之釋放中FVIII製劑對凝血酶之反應性與活體內功效不相關。
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第1圖 rFVIIIFc單體之示意性圖示。
第2A圖-第2E圖 A-B.rFVIIIFc(經加工或單鏈)之非還原性及還原性SDS-PAGE分析。C.藉由LC/UV及LC/MS分析之rFVIIIFc結構。D.凝血酶裂解後rFVIIIFc之總離子流(TIC)層析圖(LC/MS圖)。指示主要消化產物。E.rFVIIIFc及rBDDFVIII之A2域之反摺積質譜。指示對應於凝血酶裂解之A2域(S373至R740)及兩個截短產物S373至Y729及S373至E720之主要產物及其同源質量。
第3A圖-第3C圖 rFVIII-Fc之生物化學表徵：A.作為磷脂囊泡濃度之函數之因子X之活化；B.作為FX濃度之函數之因子X之活化。C.作為因子IXa濃度之函數之因子X之活化。
第4圖 因子X由活化之蛋白質C裂解後之活化。
第5A圖-第5D圖 根據劑量分選、根據化合物分組(單級分析，25 IU/kg(A)或65 IU/kg(B)；及發色分析，25 IU/kg(C)或65 IU/kg(D))之相對於時間之觀測到之組平均FVIII活性(±SE)對時間曲線。
第6A圖-第6B圖 根據劑量及化合物分組(單級分析(A)或發色分析(B))之相對於時間之觀測到之組平均FVIII活性(±SE)對時間曲線。
第7(A)圖-第7(C)圖 單鏈FVIII：Fc在HemA小鼠尾靜脈橫斷模型中之活體內功效。(A)單鏈rFVIII：Fc劑量展示為方塊，且經加工rFVIII：Fc劑量展示為圓形。(B)尾靜脈橫斷後4.6 μg/kg、1.38 μg/kg及0.46 μg/kg之rFVIIIFc或SC rFVIIIFc之存活百分比。(C)尾靜脈橫斷後4.6 μg/kg(黑色圓形或倒三角形)、1.38 μg/kg(三角形或菱形)及0.46 μg/kg(方塊及灰色圓形)之rFVIIIFc或SC rFVIIIFc分別之非出血者百分比。
第8圖 研究設計。第8圖描繪1/2a期研究之研究設計，該研究為劑量遞增依序設計，以評估25 IU/kg(低劑量組A)或65 IU/kg(高劑量組B)之單次靜脈內劑量後rFVIIIFc與ADVATE®之安全性及PK之比較。
第9圖 單級(aPTT)及發色分析測定之rFVIII活性之相關性。注射ADVATE®(◆)及rFVIIIFc(□)後量測FVIII活性(IU/mL)之單級凝血(aPTT)與發色分析結果之間的相關性。
第10(A)圖-第10(B)圖 低劑量及高劑量組之組平均血漿FVIII活性藥物動力學概況。展示(A)25 IU/kg(低劑量組，n=6)；及(B)65 IU/kg(高劑量組，n=10[ADVATE®]；n=9[rFVIIIFc])之單次靜脈內注射rFVIIIFc或ADVATE®後之血漿FVIII活性(單級aPTT分析)對時間曲線。所示結果為組平均值±平均值之標準誤差(SEM)。
第11(A)圖-第11(B)圖 VWF抗原含量對注射ADVATE®或rFVIIIFc後FVIII活性之C1及t1/2的影響。VWF抗原含量與(A)ADVATE®(R2=0.5415且p=0.0012)及rFVIIIFc(R2=0.5492且p=0.0016)之權重調整之C1；及(B)ADVATE®(R2=0.7923且p<0.0001)及rFVIIIFc(R2=0.6403且p=0.0003)之t1/2之間的相關性。各點表示個別受試者。
第12(A)圖-第12(B)圖 個別受試者在注射ADVATE®或rFVIIIFc後之離體全血ROTEM®結果。在指定時間點在以(A)25 IU/kg ADVATE®及rFVIIIFc；及(B)65 IU/kg ADVATE®及rFVIIIFc之劑量治療之前及之後自受試者取血液樣品。在ROTEM®儀器上藉由以Ca++起始之NATEM測定凝結時間。所示結果為來自各個別樣品之三重複通道讀數的平均值±平均值之標準誤差(SEM)。
第13(A)圖-第13(B)圖 凝血酶產生分析(TGA)中之活性比較。(A)SC rFVIIIFc展示內源性凝血酶潛能(ETP)降低，及(B)與rFVIIIFc相比峰值凝血酶降低。
第14(A)圖-第14(C)圖：活體外ROTEM資料。添加至自未處理HemA小鼠獲得之彙集全血中之不同濃度之XYNTHA、ADVATE<及rFVIIIFc的ROTEM(NATEM)結果(平均值±SD)。(A)平均凝結時間(CT)(第圖14A)，(B)凝塊形成時間(CFT)，及(C)α角。
第15(A)圖-第15(C)圖 離體ROTEM資料。在單次靜脈內投與50 IU/kg之XYNTHA、ADVATE或rFVIIIFc後在給藥後5分鐘、24、48、72及96小時自小鼠獲得之ROTEM(NATEM)結果(平均值±SD)。(A)平均凝結時間(CT)，(B)凝塊形成時間(CFT)，及(C)α角。
第16(A)圖-第16(E)圖：rFVIIIFc及單鏈(SC)rFVIIIFc與vWF之相互作用之即時評估，及凝血酶介導之rFVIIIFc及SC rFVIIIFc自vWF釋放之即時評估。(A).rFVIIIFc及SC rFVIIIFc對vWF之親和力之表面電漿子共振(SPR)分析。描繪結合曲線及1：1擬合相互作用模型。x軸展示時間(秒)且y軸展示反應(反應單位(RU))。(B).在25℃(上圖)及37℃(下圖)下凝血酶介導之活化rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及缺乏Fc部分之B域缺失rFVIII(rBDD FVIII)釋放的參考扣除感測器圖。x軸展示時間(秒)且y軸展示反應(反應單位(RU))。個別線指示在不同α-凝血酶濃度下之反應。最上方之線為在0 U/mLα-凝
血酶下之反應，且後續各線依序針對0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.3、2.5、5、10及20 U/mL之α-凝血酶濃度。(C).在25℃(上圖)及37℃(下圖)下rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及rBDD FVIII之凝血酶介導釋放相之雙重參考扣除感測器圖。x軸展示時間(秒)且y軸展示反應(反應單位(RU))。個別線指示在不同α-凝血酶濃度下之反應。最上方之線為在0 U/mL α-凝血酶下之反應，且後續各線依序針對0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.3、2.5、5.0、10及20 U/mL之α-凝血酶濃度。(D).在25℃(上圖)及37℃(下圖)下rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及rBDD FVIII之作為時間之函數的凝血酶介導釋放速率。x軸展示時間(秒)且y軸展示反應(反應單位(RU))。個別線指示在不同α-凝血酶濃度下之反應。最上方之線為在20 U/mL α-凝血酶下之反應，且後續各線依序針對10、5、2.5、1.3、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01及0.005 U/mL之α-凝血酶濃度。(E).在25℃(上圖)及37℃(下圖)下rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及rBDD FVIII之作為凝血酶濃度之函數的峰值凝血酶介導釋放速率。EC50為半最大有效濃度。x軸為α-凝血酶濃度(U/mL)且y軸為最大釋放速率(RU/秒)。
<110> DUMONT, Jennifer A. LOW, Susan BITONTI, Alan J. PIERCE, Glenn LUK, Alvin JIANG, Haiyan MCKINNEY, Byron OTTMER, Matt SOMMER, Jurg NUGENT, Karen LI, Lian PETERS, Robert
<120> 因子VIII嵌合及雜交多肽，及其使用方法
<130> 2159.354TWO7/EKS/C-K
<140> 待指定
<141> 與本文一起
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B域缺失FVIIIFc鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> FVIII信號
<220>
<221> misc_feature
<222> (4372)..(5052)
<223> Fc區
<400> 1
<210> 2
<211> 1684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B域缺失FVIII-Fc鏈
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> 信號
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(753)
<223> 重鏈(HC)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (760)..(773)
<223> B域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1457)..(1684)
<223> Fc區
<400> 2
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc區
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(60)
<223> 小鼠Igκ信號
<400> 3
<210> 4
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc鏈
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> 來自小鼠Igκ鏈之異源信號
<400> 4
<210> 5
<211> 7734
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長FVIIIFc
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(57)
<223> FVIII信號
<220>
<221> misc_feature
<222> (7054)..(7734)
<223> Fc區
<400> 5
<210> 6
<211> 2578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長FVIIIFc信號
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> FVIII信號
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(759)
<223> HC
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (760)..(1667)
<223> B域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2352)..(2578)
<223> Fc區
<400> 6
Claims (264)
- 一種向有需要之人類受試者投與因子VIII之方法，其包括向該受試者投與治療劑量之包含因子VIII部分及第二部分之嵌合多肽，給藥間隔為相等劑量之由該因子VIII部分組成之多肽所需要的給藥間隔之至少約一倍半長，其中該因子VIII部分包含經加工之因子VIII，該經加工之因子VIII具有兩條鏈，第一鏈包含重鏈且第二鏈包含輕鏈，其中該第一鏈及該第二鏈藉由金屬鍵締合。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第2項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約100%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第1項或第2項中任一項之方法，其中該因子VIII部分包含單鏈因子VIII，其為單鏈。
- 如申請專利範圍第4項之方法，其中該單鏈因子VIII含有完整細胞內加工位點。
- 如申請專利範圍第5項之方法，其中該細胞內加工位點對應於全長因子VIII之殘基1648處之精胺酸(SEQ ID NO：6之胺基酸20-2351之精胺酸殘基1667)。
- 如申請專利範圍第3項至第6項中任一項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之至少約1%、約 5%、約10%、約15%、約20%或約25%為單鏈因子VIII。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約25%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約75%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約20%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約80%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約15%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約85%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約10%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約90%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約5%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約95%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約1%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約99%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第3項至第6項中任一項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或約99%為單鏈因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多 肽之該因子VIII部分之約30%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約70%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約40%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約60%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約50%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約50%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約60%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約40%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約70%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約30%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約80%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約20%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多 肽之該因子VIII部分之約85%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約15%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約90%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約10%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約95%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約5%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約99%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約1%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約100%為單鏈因子VIII。
- 如申請專利範圍第4項至第25項中任一項之方法，其中當在活體外藉由發色分析量測因子VIII活性時，包含單鏈因子VIII之該嵌合多肽具有程度與由兩個Fc部分及融合於該兩個Fc部分中一者之經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子VIII活性。
- 如申請專利範圍第4項至第26項中任一項之方法，其中包含單鏈因子VIII之該嵌合多肽在活體內具有與由兩個Fc部分及融合於該兩個Fc部分中一者之經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子VIII活性。
- 如申請專利範圍第4項至第27項中任一項之方法，其中包含單鏈因子VIII之該嵌合多肽具有與由兩個Fc部分及融合於該兩個Fc部分中一者之經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子Xa產生速率。
- 如申請專利範圍第4項至第28項中任一項之方法，其中該嵌合多肽中之該單鏈因子VIII由活化之蛋白質C不活化之程度與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當。
- 如申請專利範圍第4項至第29項中任一項之方法，其中該嵌合多肽中之該單鏈因子VIII具有與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當之因子IXa相互作用速率。
- 如申請專利範圍第4項至第30項中任一項之方法，其中該嵌合多肽中之該單鏈因子VIII以與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當之程度結合血友病因子(von Willebrand Factor)。
- 如申請專利範圍第1項至第31項中任一項之方法，其中該嵌合多肽具有選自由以下組成之群之一或多個特徵：與由該因子VIII部分組成之多肽之能力相當的與磷脂囊泡相互作用之能力；與由該因子VIII部分組成之多肽之能力相當的形成活化因子X之Xase複合物之能力； 與由該因子VIII部分組成之多肽之能力相當的在五分鐘內由α-凝血酶活化之能力；及與由該因子VIII部分組成之多肽之能力相當的與因子IXa相互作用之能力。
- 如申請專利範圍第32項之方法，其中該嵌合多肽具有選自由以下組成之群之一或多個特徵：形成活化因子X之Km在由該因子VIII部分組成之多肽之Km的約一個、約一個半或約兩個標準偏差以內的Xase複合物，其中Km量測為因子X濃度之函數；形成活化因子X之Vmax在由該因子VIII部分組成之多肽之Vmax的約一個、約一個半或約兩個標準偏差以內的Xase複合物，其中Vmax量測為因子X濃度之函數；形成活化因子X之Kd在由該因子VIII部分組成之多肽之Kd的約一個、約一個半或約兩個標準偏差以內的Xase複合物，其中Kd量測為因子IXa濃度之函數；及形成活化因子X之Vmax在由該因子VIII部分組成之多肽之Vmax的約一個、約一個半或約兩個標準偏差以內的Xase複合物，其中Vmax量測為因子IXa濃度之函數。
- 如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法，其中該劑量具有大於每IU/kg 1.38 IU/dL之平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)。
- 如申請專利範圍第34項之方法，其中該劑量具有每IU/kg至少約1.5、至少約1.85或至少約2.46 IU/dL 之平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)。
- 如申請專利範圍第1項至第35項中任一項之方法，其中該嵌合多肽在該患者群體中或在該受試者中展現選自由以下組成之群之一或多種藥物動力學參數：當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析量測時，在投與25 IU/kg之該嵌合多肽之該受試者中的Cmax_OBS與投與25 IU/kg之由該全長、成熟因子VIII組成之多肽之受試者中的Cmax_OBS相當；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約60.5 IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約53.1-69 IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約119 IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約103-136 IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約76.5 IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約64.9-90.1 IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約182 IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Cmax_OBS為約146-227 IU/dL；在該患者群體中之平均清除率(CL)(活性)為約2.33±1.08 mL/h/kg或2.33±1.08 mL/h/kg以下；在該患者群體中平均清除率(CL)(活性)為約1.8-2.69 mL/h/kg；在該患者群體中之平均清除率(CL)(活性)為由該因子VIII部分組成之多肽之清除率的65%；在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.22-5.19 mL/h/kg；當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析所量測時，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為投與相同量之由該全長、成熟因子VIII組成之多肽的受試者中之清除率的0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69或0.70倍低；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.68 mL/h/kg；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT) 分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.31-2.15 mL/h/kg；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約2.32 mL/h/kg；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.64-3.29 mL/h/kg；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.49 mL/h/kg；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.16-1.92 mL/h/kg；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.52 mL/h/kg；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之清除率(CL)(活性)為約1.05-2.20 mL/h/kg；在該患者群體中之平均平均滯留時間(MRT)(活性)為至少約26.3±8.33小時；在該患者群體中之平均MRT(活性)為約25.9-26.5小時； 在該患者群體中之平均MRT(活性)為由該因子VIII部分組成之多肽之平均MRT之約1.5倍長；在該受試者中之平均滯留時間(MRT)(活性)為約14-41.3小時；當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析所量測時，在該受試者中之MRT為投與相同量之由該全長、成熟因子VIII組成之多肽的受試者中之MRT的至少1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89或1.90倍高；如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約27小時；如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約20.6-35.3小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約23.9-28.5小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約19.8-28.9小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之MRT(活性)為約20.5-39.6小時；在該患者群體中之平均t1/2β(活性)為約18.3±5.79小 時；在該患者群體中之平均t1/2β(活性)為約18-18.4小時；在該患者群體中之平均t1/2β(活性)為由該因子VIII部分組成之多肽之平均t1/2β的約1.5倍長；在該受試者中之t1/2β(活性)為約11-26.4小時；當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析所量測時，在該受試者中之t1/2β(活性)為投與相同量之由該全長、成熟因子VIII組成之多肽的受試者中之t1/2β(活性)的至少1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86或1.87倍高；如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約18.8小時；如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約14.3-24.5小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約16.7小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約13.8-20.1小時；如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約19.8小時； 如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之t1/2β(活性)為約14.3-27.5小時；在該患者群體中之平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)為約每IU/kg 2.01±0.44 IU/dL；在該患者群體中之平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)為約每IU/kg 1.85-2.46 IU/dL；在該患者群體中之平均增量回收率(K值)(活性；觀測值)為由該因子VIII部分組成之多肽之平均增量回收率的約90%；在該受試者中之增量回收率(K值)(活性；觀測值)為約每IU/kg 1.38-2.88 IU/dL；當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析量測時，在該受試者中之增量回收率與投與由該全長、成熟因子VIII組成之多肽之受試者中的增量回收率相當；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.44 IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.12-2.81 IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 1.83 IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT) 分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 1.59-2.10 IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 3.09 IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.80 IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.61-3.66 IU/dL；及當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之增量回收率為約每IU/kg 2.24-3.50 IU/dL；在該患者群體中之平均Vss(活性)為約55.1±12.3 mL/kg；在該患者群體中之平均Vss(活性)為約45.3-56.1 mL/kg；在該受試者中之Vss(活性)為約37.7-79.4 mL/kg；當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析量測時，在該受試者中之Vss(活性)與投與相同量之由該全長、成熟因子VIII組成之多肽之受試者中的Vss(活性)相當；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約45.5 mL/kg；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約39.3-52.5 mL/kg；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約62.8 mL/kg；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約55.2-71.5 mL/kg；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約35.9 mL/kg；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約30.4-42.3 mL/kg；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約43.4 mL/kg；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之Vss(活性)為約38.2-49.2 mL/kg；在該患者群體中之平均AUC/劑量(活性)為約每IU/kg 49.9±18.2 IU*h/dL； 在該患者群體中之平均AUC/劑量(活性)為約每IU/kg 44.8-57.6 IU*h/dL，及在該受試者中之AUC/劑量為約每IU/kg 19.2-81.7 IU*h/dL；當藉由單級(aPTT)分析或兩級(發色)分析所量測時，在該受試者中之AUCINF為投與相同量之由該全長、成熟因子VIII組成之多肽的受試者中之AUCINF的至少1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90倍高；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1440±316 hr*IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1160-1880 hr*IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1480 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 2910±1320 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1980-3970 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由單級(aPTT)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 2800 hr*IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1660 hr*IU/dL；當投與約25 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 1300-2120 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 4280 hr*IU/dL；當投與約65 IU/kg該嵌合多肽時，如藉由兩級(發色)分析所量測，在該受試者中之AUCINF為約每IU/kg 2960-6190 hr*IU/dL。
- 如申請專利範圍第1項至第36項中任一項之方法，其中該治療劑量為約10至約150、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、110、115、120、125、130、135、140、145或150 IU/kg。
- 如申請專利範圍第1項至第37項中任一項之方 法，其中該給藥間隔為一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更長。
- 一種組合物，其包含具有因子VIII活性之嵌合多肽，其中該多肽之至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%包含為單鏈因子VIII之因子VIII部分及第二部分，其中該單鏈因子VIII與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第39項之組合物，其中該單鏈因子VIII與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)相同。
- 一種組合物，其包含具有因子VIII活性之嵌合多肽，其中該多肽之至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%包含為單鏈因子VIII之因子VIII部分及第二部分，其中該單鏈因子VIII與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第41項之組合物，其中該單鏈因子VIII與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序 列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)相同。
- 如申請專利範圍第39項至第42項中任一項之組合物，其中該第二部分為Fc區、白蛋白、PAS序列、轉鐵蛋白或CTP(具有4個O-聚醣之hCG之28個胺基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合多肽、白蛋白結合小分子或其任何組合。
- 如申請專利範圍第43項之組合物，其中該第二部分為Fc區。
- 如申請專利範圍第44項之組合物，其中該Fc與表2中所示之該Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第45項之組合物，其中該Fc與表2中所示之該Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)相同。
- 如申請專利範圍第39項之組合物，其中該多肽包含與表2A(i)中所示無信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)至少90%或95%一致或與表2A(i)中所示有信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第39項之組合物，其中該多肽 包含與表2A(i)中所示無信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)相同或與表2A(i)中所示有信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第39項至第48項中任一項之組合物，其中該多肽呈包含第二多肽之雜交物形式，其中該第二多肽基本上由Fc組成。
- 如申請專利範圍第49項之組合物，其中該第二多肽基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)至少90%或95%一致或與表2A(ii)中所示有信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第50項之組合物，其中該第二多肽基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)相同或與表2A(ii)中所示有信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第39項至第51項中任一項之組合物，其中該多肽具有由該因子VIII組成之多肽之至少一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長的半衰期。
- 如申請專利範圍第39項至第52項中任一項之組 合物，其具有選自由以下組成之群之一個、約一個半或約兩個或兩個以上特徵：與由該因子VIII部分組成之多肽之能力相當的與磷脂囊泡相互作用之能力；與由該因子VIII部分組成之多肽之能力相當的形成活化因子X之Xase複合物之能力；與由該因子VIII部分組成之多肽之能力相當的在五分鐘內由α-凝血酶活化之能力；及與由該因子VIII部分組成之多肽之能力相當的與因子IXa相互作用之能力。
- 如申請專利範圍第39項至第53項中任一項之組合物，其中該多肽之該因子VIII部分之約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第54項中任一項之組合物，其中當在活體外藉由發色分析量測因子VIII時，包含單鏈因子VIII之該嵌合多肽具有與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子VIII活性，其中該經加工因子VIII融合於該兩個Fc部分中之一個Fc。
- 如申請專利範圍第39項至第55項中任一項之組合物，其中包含單鏈因子VIII之該嵌合多肽具有與經加工因子VIII相當之因子Xa產生速率。
- 如申請專利範圍第39項至第56項中任一項之組 合物，其中包含單鏈因子VIII之該嵌合多肽具有與由兩個Fc部分及融合於該兩個Fc部分中一者之經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子Xa產生速率。
- 如申請專利範圍第39項至第57項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽中之該單鏈因子VIII具有與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當之因子IXa相互作用速率。
- 如申請專利範圍第39項至第58項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽中之該單鏈因子VIII由活化之蛋白質C不活化之程度與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當。
- 如申請專利範圍第39項至第59項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽中之該單鏈因子VIII以與由兩個Fc部分及經加工因子VIII組成之嵌合多肽中的經加工因子VIII相當之程度結合血友病因子。
- 如申請專利範圍第39項至第60項中任一項之組合物，其中包含單鏈因子VIII之該嵌合多肽在活體內具有與由兩個Fc部分及融合於該兩個Fc部分中一者之經加工因子VIII組成之嵌合多肽相當的因子VIII活性。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約30%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約70%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組 合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約40%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約60%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約50%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約50%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約60%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約40%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約70%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約30%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約80%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約20%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約90%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約10%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組 合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約95%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約5%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約99%為單鏈因子VIII，且該嵌合多肽之該因子VIII部分之約5%為經加工之因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第61項中任一項之組合物，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分之約100%為單鏈因子VIII。
- 如申請專利範圍第39項至第71項中任一項之組合物，其為進一步包含賦形劑之醫藥組合物。
- 一種治療出血病狀之方法，其包括投與治療有效量之如申請專利範圍第39項至第72項中任一項之組合物。
- 如申請專利範圍第73項之方法，其中該治療為預防性治療。
- 如申請專利範圍第73項之方法，其中該治療為按需治療。
- 如申請專利範圍第73項至第75項中任一項之方法，其中該出血病狀係選自由以下組成之群：出血凝血病症、關節血腫、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內流血、口腔流血、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內流血、腹內流血、胸內流血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間 隙出血、腹膜後間隙出血及髂腰肌鞘出血。
- 如申請專利範圍第76項之方法，其中該出血凝血病症為血友病。
- 如申請專利範圍第77項之方法，其中該出血凝血病症為血友病A。
- 如申請專利範圍第1項至第38項及第73項至第78項中任一項之方法，其中該投與使該患者群體之至少90%中之因子VIII穀含量維持在高於1%之含量。
- 如申請專利範圍第1項至第38項及第73項至第78項中任一項之方法，其中該投與使該群體之至少60%中之因子VIII穀含量維持在高於3%之含量。
- 一種使患者群體中之因子VIII維持在高於1%之含量持續至少一天、兩天或三天之方法，其包括向該群體投與治療有效量之rFVIIIFc，其中該治療有效量為至少25 IU/kg之rFVIIIFc且該群體之至少90%維持該因子VIII穀含量為至少1%或1%以上。
- 一種使患者群體中之因子VIII維持在高於3%之含量持續至少一天、兩天、三天之方法，其包括向該群體投與治療有效量之rFVIIIFc，其中該治療有效量為至少65 IU/kg之rFVIIIFc且該群體之至少90%維持該因子VIII穀含量為至少3%或3%以上。
- 如申請專利範圍第4項至第38項及第73項至第82項中任一項之方法，其中該單鏈因子VIII在對應於精胺酸1645之胺基酸位置處包含取代或突變。
- 如申請專利範圍第4項至第38項及第73項至第83項中任一項之方法，其中該單鏈因子VIII在對應於精胺酸1648之胺基酸位置處包含取代或突變。
- 如申請專利範圍第4項至第38項及第73項至第84項中任一項之方法，其中該單鏈因子VIII在對應於全長因子VIII之精胺酸1645及精胺酸1648之胺基酸位置處包含取代或突變。
- 如申請專利範圍第85項之方法，其中在對應於精胺酸1645之該胺基酸位置處取代之胺基酸為與在對應於精胺酸1648之該胺基酸位置處取代之胺基酸不同的胺基酸。
- 如申請專利範圍第83項至第86項中任一項之方法，其中該取代或突變為除精胺酸以外之胺基酸。
- 如申請專利範圍第39項至第72項中任一項之組合物，其中該單鏈FVIII包含完整細胞內加工位點。
- 如申請專利範圍第39項至第72項中任一項之組合物，其中該單鏈因子VIII在對應於全長成熟因子VIII中之精胺酸1645之胺基酸位置處包含取代或突變。
- 如申請專利範圍第39項至第72項中任一項之組合物，其中該單鏈因子VIII在對應於全長成熟因子VIII中之精胺酸1648之胺基酸位置處包含取代或突變。
- 如申請專利範圍第39項至第72項中任一項之組合物，其中該單鏈因子VIII在對應於全長因子VIII中之精胺酸1645及精胺酸1648之胺基酸位置處包含取代或突 變。
- 如申請專利範圍第91項之組合物，其中在對應於精胺酸1645之該胺基酸位置處取代之胺基酸為與在對應於精胺酸1648之該胺基酸位置處取代之胺基酸不同的胺基酸。
- 如申請專利範圍第89項至第92項中任一項之組合物，其中該取代或突變為除精胺酸以外之胺基酸。
- 如申請專利範圍第73項至第82項中任一項之方法，其中該單鏈因子VIII包含完整細胞內加工位點。
- 如申請專利範圍第73項至第82項中任一項之方法，其中該單鏈因子VIII在對應於全長成熟因子VIII中之精胺酸1645之胺基酸位置處包含取代或突變。
- 如申請專利範圍第73項至第82項中任一項之方法，其中該單鏈因子VIII在對應於全長成熟因子VIII中之精胺酸1648之胺基酸位置處包含取代或突變。
- 如申請專利範圍第73項至第82項中任一項之方法，其中該單鏈因子VIII在對應於全長因子VIII中之精胺酸1645及精胺酸1648之胺基酸位置處包含取代或突變。
- 如申請專利範圍第97項之方法，其中在對應於精胺酸1645之該胺基酸位置處取代之胺基酸為與在對應於全長因子VIII中之精胺酸1648之該胺基酸位置處取代之胺基酸不同的胺基酸。
- 如申請專利範圍第95項至第98項中任一項之方 法，其中該取代或突變為除精胺酸以外之胺基酸。
- 如申請專利範圍第87項或第99項之方法，其中除精胺酸以外之該胺基酸殘基係選自由以下組成之群：異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酥胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、脯胺酸、硒半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸、組胺酸、鳥胺酸、吡咯離胺酸或牛磺酸。
- 如申請專利範圍第93項之組合物，其中除精胺酸以外之該胺基酸殘基係選自由以下組成之群：異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酥胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、脯胺酸、硒半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸、組胺酸、鳥胺酸、吡咯離胺酸或牛磺酸。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項或第94項至第100項中任一項之方法，其中該受試者為小兒科受試者。
- 一種預防、減少或治療受試者之出血事件之方法，其包括向該受試者投與有效量之長效因子VIII(FVIII)蛋白，其中該受試者在血漿中表現高含量之血友病因子(VWF)。
- 如申請專利範圍第103項之方法，其中該受試者已鑒別為在血漿中表現高含量之VWF。
- 一種預防、減少或治療受試者之出血事件之方法，其包括：(a)藉由量測受試者之血漿中VWF之含量鑒別具有高VWF含量之該受試者，其中至少約100 IU/dL之VWF含量將該受試者鑒別為具有高VWF含量；及(b)向該受試者投與有效量之長效FVIII蛋白。
- 如申請專利範圍第103項至第105項中任一項之方法，其中該受試者為人類。
- 如申請專利範圍第103項至第106項中任一項之方法，其中該受試者為小兒科受試者。
- 如申請專利範圍第103項至第107項中任一項之方法，其中該受試者患有血友病A。
- 如申請專利範圍第103項至第108項中任一項之方法，其中VWF之該高含量為至少約100 IU/dL。
- 如申請專利範圍第103項至第109項中任一項之方法，其中VWF之該高含量在約100 IU/dL與約200 IU/dL之間。
- 如申請專利範圍第110項之方法，其中VWF之該高含量為約110 IU/dL、約120 IU/dL、約130 IU/dL、約140 IU/dL、約150 IU/dL、約160 IU/dL、約170 IU/dL、約180 IU/dL、約190 IU/dL或約200 IU/dL。
- 如申請專利範圍第103項至第111項中任一項之方法，其中該受試者具有血液血清型A、B或AB。
- 如申請專利範圍第103項至第112項中任一項 之方法，其中該長效FVIII蛋白在該受試者體內具有約20與約40小時之間的半衰期。
- 如申請專利範圍第113項之方法，其中該長效FVIII蛋白具有約21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時或40小時之半衰期。
- 如申請專利範圍第114項之方法，其中該長效FVIII蛋白具有約20與約27小時之間的半衰期。
- 如申請專利範圍第103項至第115項中任一項之方法，其中該長效FVIII蛋白具有為該該長效FVIII蛋白投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期之至少約1.2倍大的半衰期。
- 如申請專利範圍第116項之方法，其中該長效FVIII蛋白具有為該該長效FVIII蛋白投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期之至少約約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大的半衰期。
- 如申請專利範圍第103項至第117項中任一項之方法，其中該有效量為至少約20 IU/kg、至少約25 IU/kg、至少約30 IU/kg、至少約35 IU/kg、至少約40 IU/kg、至少約45 IU/kg、至少約50 IU/kg、至少約55 IU/kg、至少約60 IU/kg、至少約65 IU/kg、至少約70 IU/kg、至少約75 IU/kg、至少約80 IU/kg、至少約85 IU/kg或至少約90 IU/kg。
- 如申請專利範圍第103項至第118項中任一項之方法，其中該有效量為至少約65 IU/kg至至少約90 IU/kg。
- 如申請專利範圍第119項之方法，其中該有效量為80 IU/kg。
- 如申請專利範圍第103項至第120項中任一項之方法，其中該長效FVIII蛋白每72小時或更長時間投與一次。
- 如申請專利範圍第121項之方法，其中該長效FVIII蛋白約一週或更長時間投與一次。
- 如申請專利範圍第121項之方法，其中該有效量之該長效FVIII蛋白約每10天投與一次、約每兩週投與一次、約每15天投與一次、約每20天投與一次、約每三週投與一次、約每25天投與一次、約每四週投與一次或約每一個月投與一次。
- 如申請專利範圍第121項之方法，其中該長效FVIII以80 IU/kg之劑量每72小時投與一次。
- 如申請專利範圍第124項之方法，其中該受試者為小兒科受試者。
- 如申請專利範圍第103項至第125項中任一項之方法，其中該投與消退多於5-20%、多於5-15%、多於5-10%、多於10-20%或多於10-15%之出血事件。
- 如申請專利範圍第103項至第126項中任一項之方法，其中該受試者體內血漿因子VIII：C之穀含量維持高於1-3或3-5 IU/dl。
- 如申請專利範圍第103項至第127項中任一項之方法，其中該投與預防該受試者之出血事件。
- 如申請專利範圍第128項之方法，其中該出血事件為自發性的。
- 如申請專利範圍第129項之方法，其中該投與消退多於80-100%、多於80-90%、多於85-90%、多於90-100%、多於90-95%或多於95-100%之出血事件。
- 如申請專利範圍第103項至第130項中任一項之方法，其中該投與在需要手術之該等受試者之群體中維持止血。
- 如申請專利範圍第103項至第131項中任一項之方法，其中該長效FVIII蛋白在該手術之前、期間或之後投與。
- 如申請專利範圍第132項之方法，其中該手術為小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。
- 如申請專利範圍第131項至第133項之方法，其中該手術為急救外科手術。
- 如申請專利範圍第103項至第134項中任一項 之方法，其中該長效FVIII蛋白具有比由FVIII組成之多肽長之半衰期。
- 如申請專利範圍第103項至第135項中任一項之方法，其中該長效FVIII蛋白經聚乙二醇化、羥乙基澱粉化或聚唾液酸化。
- 如申請專利範圍第103項至第136項中任一項之方法，其中該長效FVIII蛋白為包含FVIII部分及第二部分之嵌合蛋白。
- 如申請專利範圍第137項之方法，其中該第二部分為Fc區、白蛋白、PAS序列、轉鐵蛋白或CTP(具有4個O-聚醣之hCG之28個胺基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合多肽、白蛋白結合小分子或其任何組合。
- 如申請專利範圍第137項或第138項之方法，其中該第二部分係融合於該FVIII部分之胺基端或羧基端。
- 如申請專利範圍第137項或第138項之方法，其中該第二部分係插入該FVIII部分中之兩個胺基酸之間。
- 如申請專利範圍第137項至第140項中任一項之方法，其中該嵌合蛋白為FVIIIFc單體二聚體雜交物。
- 如申請專利範圍第141項之方法，其中該FVIII部分為單鏈。
- 如申請專利範圍第142項之方法，其中該FVIII 部分包含重鏈及輕鏈。
- 如申請專利範圍第137項至第143項中任一項之方法，其中該FVIII部分包含全長因子VIII、成熟因子VIII或B域完全或部分缺失之因子VIII。
- 如申請專利範圍第141項之方法，其中該FVIII部分包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2332至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第145項之方法，其中該FVIII部分包含SEQ ID NO：2之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2332。
- 如申請專利範圍第137項至第146項中任一項之方法，其中該嵌合多肽之該第二部分包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1439至1665或SEQ ID NO：6之胺基酸2333至2559至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的Fc區。
- 如申請專利範圍第147項之方法，其中該第二部分包含SEQ ID NO：2之胺基酸1439至1665或SEQ ID NO：6之胺基酸2333至2559。
- 如申請專利範圍第103項至第148項中任一項之方法，其中該長效FVIII多肽係作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物之一部分投與。
- 一種治療診斷患有出血病症之受試者的方法，其包括量測該受試者體內FVIII-Fc之半衰期，其中為正常 受試者體內FVIII-Fc半衰期之至少約1.2倍大之半衰期指示該受試者為長間隔給藥之候選者，及以有效量及至少3天之給藥間隔投與FVIII-Fc多肽。
- 一種治療診斷患有出血病症之受試者的方法，其包括以有效量及至少3天之給藥間隔向受試者投與FVIII-Fc多肽，其中該受試者體內FVIII-Fc之半衰期為FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期的至少約1.2倍大。
- 如申請專利範圍第150項或第151項之方法，其中該受試者體內FVIII-Fc之血漿半衰期為FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之血漿半衰期的至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
- 如申請專利範圍第150項至第152項中任一項之方法，其中該FVIII-Fc血漿半衰期在20-40小時之間。
- 如申請專利範圍第153項之方法，其中該長效FVIII蛋白具有約21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時或40小時之半衰期。
- 如申請專利範圍第154項之方法，其中該長效FVIII蛋白具有約20與約27小時之間的半衰期。
- 一種治療診斷患有出血病症之受試者的方法， 其包括量測投與該受試者之短效FVIII之半衰期，其中為該短效FVIII在具有平均VWF含量之受試者體內之半衰期的至少約1.2倍大之半衰期指示該受試者為長間隔給藥之候選者，及以有效量及至少3天之給藥間隔投與長效FVIII-Fc多肽。
- 如申請專利範圍第156項之方法，其中該受試者體內該短效FVIII之該半衰期為短效FVIII投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期的至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
- 如申請專利範圍第150項至第157項中任一項之方法，其中該受試者為人類。
- 如申請專利範圍第150項至第158項中任一項之方法，其中該受試者為小兒科受試者。
- 如申請專利範圍第150項至第159項中任一項之方法，其中該受試者患有血友病A。
- 如申請專利範圍第150項至第160項中任一項之方法，其中該受試者具有血液血清型A、B或AB。
- 如申請專利範圍第150項至第161項中任一項之方法，其中該長效FVIII-Fc以以下有效量投與：至少約20 IU/kg、至少約25 IU/kg、至少約30 IU/kg、至少約35 IU/kg、至少約40 IU/kg、至少約45 IU/kg、至少約50 IU/kg、至少約55 IU/kg、至少約60 IU/kg、至少約65 IU/kg、至少約70 IU/kg、至少約75 IU/kg、至少約80 IU/kg、至少約85 IU/kg或至少約90 IU/kg。
- 如申請專利範圍第150項至第161項中任一項之方法，其中該有效量為至少約65 IU/kg至至少約90 IU/kg。
- 如申請專利範圍第150項至第163項中任一項之方法，其中該有效量之該FVIII-Fc蛋白約每週投與一次、約每10天投與一次、約每兩週投與一次、約每15天投與一次、約每20天投與一次、約每三週投與一次、約每25天投與一次、約每四週投與一次或約每一個月投與一次。
- 如申請專利範圍第150項至第164項中任一項之方法，其中該投與消退多於5-20%、多於5-15%、多於5-10%、多於10-20%或多於10-15%之出血事件。
- 如申請專利範圍第150項至第165項中任一項之方法，其中該受試者體內血漿因子VIII：C之穀含量維持高於1-3或3-5 IU/dl。
- 如申請專利範圍第150項至第166項中任一項之方法，其中該投與預防該受試者之出血事件。
- 如申請專利範圍第167項之方法，其中該出血事件為自發性的。
- 如申請專利範圍第167項之方法，其中該投與消退多於80-100%、多於80-90%、多於85-90%、多於90-100%、多於90-95%或多於95-100%之出血事件。
- 如申請專利範圍第150項至第169項中任一項 之方法，其中該投與在需要手術之該等受試者之群體中維持止血。
- 如申請專利範圍第150項至第170項中任一項之方法，其中該FVIII-Fc蛋白在該手術之前、期間或之後投與。
- 如申請專利範圍第170項或第171項之方法，其中該手術為小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。
- 如申請專利範圍第170項至第172項中任一項之方法，其中該手術為急救外科手術。
- 如申請專利範圍第150項至第173項中任一項之方法，其中該FVIII-Fc蛋白具有比由FVIII組成之多肽長之半衰期。
- 如申請專利範圍第150項至第174項中任一項之方法，其中該FVIII-Fc蛋白經聚乙二醇化、羥乙基澱粉化或聚唾液酸化。
- 如申請專利範圍第174項或第175項之方法，其中該FVIII-Fc蛋白為FVIIIFc單體二聚體雜交物。
- 如申請專利範圍第172項至第176項中任一項之方法，其中該FVIII部分為單鏈。
- 如申請專利範圍第177項之方法，其中該FVIII部分包含重鏈及輕鏈。
- 如申請專利範圍第174項至第178項中任一項之方法，其中該FVIII部分包含全長因子VIII、成熟因子VIII或B域完全或部分缺失之因子VIII。
- 如申請專利範圍第179項之方法，其中該FVIII部分包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2332至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第180項之方法，其中該FVIII部分包含SEQ ID NO：2之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2332。
- 如申請專利範圍第174項至第181項中任一項之方法，其中該嵌合多肽之該第二部分包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1439至1665或SEQ ID NO：6之胺基酸2333至2559至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的Fc區。
- 如申請專利範圍第182項之方法，其中該第二部分包含SEQ ID NO：2之胺基酸1439至1665或SEQ ID NO：6之胺基酸2333至2559。
- 如申請專利範圍第150項至第183項中任一項之方法，其中該FVIII-Fc多肽係作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物之一部分投與。
- 一種確定診斷患有出血病症之受試者是否為用於長間隔給予長效FVIII多肽之候選者的方法，其包括量測血漿VWF之表現量，其中至少100 IU/dL之VWF表現 量指示該受試者為使用長效FVIII多肽進行長間隔給藥的候選者。
- 如申請專利範圍第185項之方法，其中該VWF表現量為至少約110 IU/dL、約120 IU/dL、約130 IU/dL、約140 IU/dL、約150 IU/dL、約160 IU/dL、約170 IU/dL、約180 IU/dL、約190 IU/dL或約200 IU/dL。
- 一種確定診斷患有出血病症之受試者是否為用於長間隔給予長效FVIII多肽之候選者的方法，其包括量測該受試者體內FVIII-Fc之半衰期，其中為FVIII-Fc投與具有平均VWF含量之受試者時之半衰期的至少約1.2倍大之半衰期指示該受試者為用於長間隔給藥之候選者。
- 如申請專利範圍第187項之方法，其中FVIII-Fc之該半衰期為FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期的至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
- 一種確定診斷患有出血病症之受試者是否為用於長間隔給予長效FVIII多肽之候選者的方法，其包括量測該受試者體內短效FVIII之半衰期，其中為短效FVIII投與具有平均VWF含量之受試者時之半衰期的至少約1.2倍大之半衰期指示該受試者為用於長間隔給藥之候選者。
- 如申請專利範圍第189項之方法，其中該半衰期為FVIII-Fc投與具有平均含量VWF之受試者時之半衰期的至少約1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第190項中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含Fc部分。
- 如申請專利範圍第191項之方法，其中該給藥間隔為相等劑量之由該因子VIII組成之多肽所需要的給藥間隔之至少約一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長。
- 如申請專利範圍第192項之方法，其中該給藥間隔為相等劑量之由該因子VIII部分組成之多肽所需要的給藥間隔之至少約一倍半、兩倍、兩倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍長。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第193項中任一項之方法，其中該嵌合多肽之該給藥間隔為約每三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天或更長時間一次。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第194項中任一項之方法，其中該受試者需要預防性治療。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第193項中任一項之方法，其中該受試者需要按需治療。
- 如申請專利範圍第196項之方法，其中該受試者需要治療出血事件。
- 如申請專利範圍第197項之方法，其中該受試者需要治療關節血腫、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內流血、口腔流血、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內流血、腹內流血、胸內流血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血或髂腰肌鞘出血。
- 如申請專利範圍第196項之方法，其中該受試者需要手術預防、手術前後管理或手術預備治療。
- 如申請專利範圍第199項之方法，其中該手術為小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。
- 如申請專利範圍第196項至第200項中任一項之方法，其中該嵌合多肽之該給藥間隔為約每24-36、24-48、24-72、24-96、24-120、24-144、24-168、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第201項中任一項之方法，其中該治療劑量為10-100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第201項之方法，其中該治療 劑量為10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第202項之方法，其中該治療劑量為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第204項中任一項之方法，其中該因子VIII為人類因子VIII。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第205項中任一項之方法，其中該因子VIII之B域完全或部分缺失。
- 如申請專利範圍第205項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457；SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第207項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)相同。
- 如申請專利範圍第205項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第209項之方法，其中該嵌合 多肽之該因子VIII部分與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)相同。
- 如申請專利範圍第205項或第206項之方法，其中該嵌合多肽之該第二部分與表2中所示之該Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第211項之方法，其中該嵌合多肽之該第二部分與表2中所示之該Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)相同。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第212項中任一項之方法，其中該嵌合多肽呈包含第二多肽與該嵌合多肽締合之雜交物形式，其中該第二多肽基本上由Fc組成。
- 如申請專利範圍第213項之方法，其中該嵌合多肽包含與表2A(i)中所示無信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)至少90%或95%一致或與表2A(i)中所示有信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第214項之方法，其中該嵌合多肽包含與表2A(i)中所示無信號序列之該因子VIII及Fc 胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)相同或與表2A(i)中所示有信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)相同的序列。
- 如申請專利範圍第213項至第215項中任一項之方法，其中該第二多肽基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)至少90%或95%一致或與表2A(ii)中所示有信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第216項之方法，其中該第二多肽基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)相同或與表2A(ii)中所示有信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)相同的序列。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第217項中任一項之方法，其中該嵌合多肽係作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物之一部分投與。
- 一種向有需要之人類受試者投與因子VIII之方法，其包括向該受試者投與治療劑量之包含因子VIII部分及第二部分之嵌合多肽，以獲得為藉由相等劑量之由該因子VIII部分組成之多肽獲得之血漿濃度對時間曲線下面積(AUC)之至少約一又四分之一倍大的AUC。
- 如申請專利範圍第219項之方法，其中該嵌合 多肽係以約每三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天或更長時間一次之給藥間隔投與。
- 如申請專利範圍第219項或第220項之方法，其中該受試者需要預防性治療。
- 如申請專利範圍第219項或第220項之方法，其中該受試者需要按需治療。
- 如申請專利範圍第219項至第222項中任一項之方法，其中該受試者需要治療出血事件。
- 如申請專利範圍第219項至第222項中任一項之方法，其中該受試者需要治療關節血腫、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內流血、口腔流血、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內流血、腹內流血、胸內流血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血或髂腰肌鞘出血。
- 如申請專利範圍第222項之方法，其中該受試者需要手術預防、手術前後管理或手術預備治療。
- 如申請專利範圍第225項之方法，其中該手術為小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝氣切開術、滑膜切除術、全膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷外科手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換手術。
- 如申請專利範圍第219項至第226項中任一項之方法，其中該嵌合多肽之該給藥間隔為約每24-36、24- 48、24-72、24-96、24-120、24-144、24-168、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或更長時間一次。
- 如申請專利範圍第219項至第227項中任一項之方法，其中該治療劑量為10-100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第228項之方法，其中該治療劑量為10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第229項之方法，其中該治療劑量為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第219項至第230項中任一項之方法，其中該因子VIII為人類因子VIII。
- 如申請專利範圍第219項至第231項中任一項之方法，其中該因子VIII之B域完全或部分缺失。
- 如申請專利範圍第231項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第233項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分與表2中所示無信號序列之因子 VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)相同。
- 如申請專利範圍第231項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第235項之方法，其中該嵌合多肽之該因子VIII部分與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)相同。
- 如申請專利範圍第231項或第232項之方法，其中該嵌合多肽之該第二部分與表2中所示之該Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第237項之方法，其中該嵌合多肽之該第二部分與表2中所示之該Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：之胺基酸1458至1684或；SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)相同。
- 如申請專利範圍第219項至第238項中任一項之方法，其中該嵌合多肽呈包含第二多肽與該嵌合多肽締合之雜交物形式，其中該第二多肽基本上由Fc組成。
- 如申請專利範圍第239項之方法，其中該嵌合多肽包含與表2A(i)中所示無信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)至少90% 或95%一致或與表2A(i)中所示有信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第240項之方法，其中該嵌合多肽包含與表2A(i)中所示無信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)相同或與表2A(i)中所示有信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第239項至第241項中任一項之方法，其中該第二多肽基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)至少90%或95%一致或與表2A(ii)中所示有信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第242項之方法，其中該第二多肽基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)相同或與表2A(ii)中所示有信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第219項至第243項中任一項之方法，其中該嵌合多肽係作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物之一部分投與。
- 一種向有需要之人類受試者投與因子VIII之方 法，其包括以約每三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天或十四天或更長時間一次之給藥間隔向該受試者投與治療劑量的包含因子VIII及Fc之多肽。
- 如申請專利範圍第245項中任一項之方法，其中該受試者需要預防性治療。
- 如申請專利範圍第245項或第246項之方法，其中該治療劑量為10-100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第247項之方法，其中該治療劑量為10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第248項之方法，其中該治療劑量為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 IU/kg。
- 如申請專利範圍第245項至第249項中任一項之方法，其中該因子VIII為人類因子VIII。
- 如申請專利範圍第245項至第250項中任一項之方法，其中該因子VIII之B域完全或部分缺失。
- 如申請專利範圍第250項之方法，其中該因子VIII與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第252項之方法，其中該因子 VIII與表2中所示無信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸20至2351)相同。
- 如申請專利範圍第250項之方法，其中該因子VIII與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸I至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第254項之方法，其中該因子VIII與表2中所示有信號序列之因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1457或SEQ ID NO：6之胺基酸1至2351)相同。
- 如申請專利範圍第250項或第251項之方法，其中該第二部分與表2中所示之該Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)至少90%或95%一致。
- 如申請專利範圍第256項之方法，其中該第二部分與表2中所示之該Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1458至1684或SEQ ID NO：6之胺基酸2352至2578)相同。
- 如申請專利範圍第245項至第257項中任一項之方法，其中該嵌合多肽為呈包含第二多肽與該嵌合多肽締合之雜交物形式的因子VIII-Fc嵌合多肽，其中該第二多肽基本上由Fc組成。
- 如申請專利範圍第258項之方法，其中該嵌合 多肽包含與表2A(i)中所示無信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)至少90%或95%一致或與表2A(i)中所示有信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第259項之方法，其中該嵌合多肽包含與表2A(i)中所示無信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸20至1684)相同或與表2A(i)中所示有信號序列之該因子VIII及Fc胺基酸序列(SEQ ID NO：2之胺基酸1至1684)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第258項至第260項中任一項之方法，其中該第二多肽基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)至少90%或95%一致或與表2A(ii)中所示有信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第261項之方法，其中該第二多肽基本上由以下組成：與表2A(ii)中所示無信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)相同或與表2A(ii)中所示有信號序列之該胺基酸序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1至247)至少90%或95%一致的序列。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第262項中任 一項之方法，其中該多肽係作為包含至少一種賦形劑之醫藥組合物之一部分投與。
- 如申請專利範圍第1項至第38項、第73項至第87項、第94項至第100項及第102項至第263項中任一項之方法，其中該嵌合多肽具有因子VIII活性。
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