TW201217527A

TW201217527A - Processable single chain molecules and polypeptides made using same

Info

Publication number: TW201217527A
Application number: TW100124536A
Authority: TW
Inventors: Joe Salas; Robert T Peters
Original assignee: Biogen Idec Hemophilia Inc
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2011-07-11
Publication date: 2012-05-01
Also published as: US20130216513A1; HRP20191305T1; HUE044419T2; PT2591006T; NZ605400A; US20210292729A1; US9856468B2; US20130202596A1; PL2591006T3; LT2591006T; EP3560962A1; US10927362B2; CY1122044T1; EA201291482A1; MX2013000301A; WO2012006635A1; TW201217526A; EP2591099A1; SI2591006T1; US20180320159A1

Description

201217527 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明關於可予處理之單鏈分子類及利用彼等所製備之多肽類》【先前技術】

免疫球蛋白的Fc區調節了效應器的功能，該效應器的功能分爲兩類。首先爲與抗原結合無關而發生的功能；這些功能賦予了持續的迴圈以及通過胞轉作用而穿過細胞屏障的轉移能力（參見 Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94, 1 995, Capon et a 1. Nature 1 989 ) ° 免疫球蛋白的IgG亞類的迴圈半衰期受到針對新生Fc受體的Fc區（對於FcRn而言）的親和性的調控（Ghetie et al.

Nature Biotechnol. 15:637-640, 1 9 9 7; Kim et. al., Eur. J.

Immunol. 24:542-548, 1 994; Dall’Acqua et al. (J.

Immunol. 1 69:5 1 7 1 -5 1 80，2002 )。第二個普通種類的效應器的功能包括在免疫球蛋白與抗原結合後操作的那些。在 IgG的情況下，所述之功能涉及補體級聯反應或具有Fq受體（FqR)的細胞的參與。Fc區與FcYR的結合產生了某些免疫作用，例如免疫絡合物的胞吞作用、包覆免疫球蛋白的粒子或微生物的吞沒和破壞（也稱爲抗體依賴的吞噬作用或ADCP )、免疫絡合物的清除、包覆免疫球蛋白的靶細胞被殺傷細胞的溶解（稱爲抗體依賴的細胞調節的細胞毒性或ADCC )、炎性調節劑的釋放、免疫系統細胞活化的 -5- 201217527 調控以及免疫球蛋白生成的調控。

儘管可以產生包含Fc的異源二聚體多肽’但是’目前的方法需要異源二聚'體的Fc區的兩條重鏈部分共表達，或者異源Fc區（例如Fab結構域）與一個或多個結合位元點發生化學綴合。這些構建體的共表達得以產生絡合混合物，該絡合混合物除了聚集體和失活的蛋白質，還代表了起始材料所有可能的配對。因此，所需功能多肽的產生是相對低的。近來，已經硏發出克服了許多所述之問題的單鏈 Fc分子。這些分子包含單鏈Fc區，其中多個成分Fc部分基因融合在多肽的單鏈中，使得它們形成了功能性的二聚化 Fc區。這些單鏈多肽包含了在天然形成的Fc構建體中並不存在的、並因此可能產生不需要的免疫應答或者可能阻止其他蛋白質：蛋白質相互作用的連接體。此外，這些單鏈 Fc構建體還可能由於由共價連接體所強加的限制而潛在地具有較低的穩定性。

因此，需要這樣的包含Fc的異源二聚體多肽，其可以高效且強健地生產，並且最低地且優選的是不包含外來的氨基酸序列。【發明內容】本發明尤其特徵在於異源二聚體多肽，在其未經加工的形式中包含一個或多個基因融合的Fc區。特別是，本發明的未經加工的分子包含單鏈Fc區（“scFc”），其中多個成分Fc部分基因融合在多肽的單鏈中，使得它們形成了功能

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性的單鏈二聚化Fc區》本發明的單鏈Fc分子包含至少2個 Fc部分，在單鏈多肽中由氨基末端至羧基末端編號爲F1和 F2。scFc的多個成分Fc部分通過多肽連接體（可切割的 SCFC(CSCFC)連接體）而形成基因融合。cscFc連接體插在包含Fc區的Fc部分之間。在一個末端處，形成了單鏈Fc區的cscFc連接體通過與酶切位點（P1)鍵合的肽直接連接，其中所述之酶切位點與所述多肽的Fc部分相鄰。在一個實施方案中，所述之切割位點通過細胞內加工酶所切割。在一個實施方案中，所述之cscFc連接體的另一個末端與第二酶切位點（P2)直接連接。在另一個實施方案中，所述之 cscFc連接體的另一個末端與生物學活性部分或靶向部分連接。在一個實施方案中，在細胞對包含scFc的多肽進行加過的工程中的切割可以對所述之連接體進行切割和/或將所述之連接體基本切除。或者，所述之多肽包含可以在所述之多肽被細胞分泌出來後或者在所述之多肽給予受試者後切割的可切割的scFC(CSdFC)連接體。因此，雖然本發明的多肽在未經加工的形式下在相鄰的多肽序列中包含scFc 區，但是cscFc連接體是經酶切的（例如在細胞中的加工過程中，在給藥之前的體外或者給藥之後的體內），從而得到包含至少2條多肽鏈、並且包含並非融合在單一的氨基酸鏈中的Fc區的、經加工的多肽。由於由兩條或多條鏈的共表達說的得到的分子的絡合混合物得以避免，所以與常規的異源具體Fc的多肽相比， 201217527

本發明的異源二聚體多肽具有改善的製造性。此外，外來連接體序列的基本去除降低了免疫原性的風險。這在需要反復給予受試者多肽的情況（例如在凝血級聯的成分的情況下）下是特別重要的。此外，外來連接體序列的基本去除還可以減少在共價連接形式中存在的任何空間應力或阻礙。此外，cscFc連接體的切割可以得到與具有游離的N末端的各個Fc部分的氨基末端融合的生物學活性部分。這在與第二Fc部分相連的生物學活性部分的情況（例如絲氨酸蛋白酶結構域，其需要游離的N末端以具有催化活性或部分，而該部分可能由於未切割的多肽連接體的存在而在空間上被阻礙）下是特別有價値的。

在一個方面中，本發明涉及多肽，該多肽包含：（i )至少一個生物學活性部分；（ii)包含至少兩個Fc部分的Fc區；以及（iii )插在兩個Fc部分之間的可切割的 scFC(CSdFc)連接體，其中所述之CSCFC連接體與至少一個酶切位點（其使得cscFc連接體被切割）連接（例如直接連接或與其相鄰）。在一個實施方案中，至少一個生物學活性部分包含凝血因數。在一個實施方案中，所述之凝血因數選自：？乂11· FVIIa、FVIII、FIX、FIXa、FX 和 FXa。在一個實施方案中，所述之多肽包含部分A-Fl-PI-L-P2-B-F2，其中A爲生物學活性部分，F1爲第一 Fc部分或結構域，P1爲酶切位點，L爲cscFc連接體，P2爲酶切位元點

S -8- 201217527 ，B爲生物學活性部分，F2爲第二Fc部分或結構域，而“ _ ’’表示肽鍵。式（I)至少包含A或B、以及可任選的是包含运—者。如果A和B都存在，則它們可以相同或不同。式 (I)至少包含P1或P2、以及可任選的是包含這二者。如果ρι 和P 2都存在’則它們可以相同或不同。式⑴至少包含F i或 F2。F1和F2可以相同或不同。在—個實施方案中，^^和^之均包含CH2和CH3結構域。在一個實施方案中，a和/或b與 F1或F2直接連接。在另一個實施方案中，a和/或b通過隔離物部分與F1或F2連接。在一個實施方案中’ A存在，並且選自：抗體的抗原結合部分；非免疫球蛋白結合分子；配體的結合部分；受體的結合部分；以及凝血因數。在一個實施方案中，A包含凝血因數的輕鏈，而b包含凝血因數（其在結合時形成活性分子）的重鏈。

在一個實施方案中，B存在，並且選自：抗體的抗原結合部分；非免疫球蛋白結合分子，配體的結合部分；受體的結合部分：以及凝血因數。在一個實施方案中，F1和F2均包含CH2和CH3結構域在一個實施方案中，所述之多肽包含部分A-F1-B-P1-L-P2-F2，或者由氨基末端至羧基末端包含A-Fl- -P1-L-P2 B_F2的線性序列。在一個實施方案中，所述之多肽包含由下式所表示的結構，其中所述之式選自（由氨基末端至羧基末端的線性 -9 - 201217527 序歹IJ ) ： A-F1-P1-L-P2-F2 ； Fl-Pl- L-P2-B-F2 ； A-F1-P1- L- F2; Fl-Pl- L- B-F2; A-Fl- L-P2-F2: F1-L-P2-B-F2以及 A-F1-P1-L-P2-B-F2 » 在一個實施方案中，所述之多肽包含一個生物學活性部分。在一個實施方案中，A和B均存在，並且爲不同的生物學活性部分。

在一個實施方案中，P1和P2均存在，並且被相同的或不同的酶所識別。在一個實施方案中，P1或P2中的至少一者包含氨基酸序歹IJ Arg-Arg-Arg-Arg。在一個實施方案中，P1或P2中的至少一者包含氨基酸序歹[J Arg-Lys-Arg-Arg-Lys〜Arg。在一個實施方案中，P1或P2中的至少一者包含氨基酸序歹fj Arg-Arg-Arg-Arg-Ser。

在一個實施方案中，P1和P2均存在，並且P1包含序列 Arg-Arg-Arg-Arg，而 P2 包含序列 Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg。在一個實施方案中，P1或P2中的至少一者包含選自 TQSFNDFTR 、 SVSQTSKLTR ' DFLAEGGGVR 、 TTKIKPR 、LVPRG和ALRPR中的氨基酸序歹IJ ^ 在一個實施方案中，所述之cscFc連接體的長度爲大約1至大約50個氨基酸。在一個實施方案中，所述之cscFc連接體的長度爲大

S -10- 201217527 約20至大約30個氨基酸。在一個實施方案中，所述之cscFc連接體包含gly/ser 肽。在一個實施方案中，所述之gly/ser肽爲式（Gly4Ser)n 或 S(Gly4Ser)n，其中 η 爲選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和10中的正整數。

在一個實施方案中，3(0卜436〇11連接體爲S(Gly4Ser)6 或 S(Gly4Ser)4。在另一個方面中，本發明涉及包含兩條多肽鏈的多肽，其中所述之第一多肽鏈包含與第一Fc部分連接的凝血因數的輕鏈，而所述之第二多肽鏈包含與第二Fc部分連接的凝血因數的重鏈，其中所述之輕鏈與所述之重鏈結合從而形成酶活性凝血因數》在一個實施方案中，所述之凝血因數的輕鏈與所述之第一 Fc部分連接，而所述之凝血因數的重鏈與所述之第二 Fc部分連接，並且其中所述之凝血因數在被細胞所分泌時是具有酶活性的。在一個實施方案中，其中所述之凝血因數選自： FVII，FVIIa，FIX, FIXa, FX和FXa。在另一個實施方案中，至少一個生物學活性部分爲因數VII、因數Vila或它們的一部分。在一個實施方案中，至少一個生物學活性部分爲因數IX '因數IXa或它們的一部分。在一個實施方案中，至少一個生物學活性部分爲因數VIII、因數Villa或它們的一部分。在一個實施方案中，至少一個生物學活性部分 -11 - 201217527 爲因數X、因數X a或它們的一部分。在一個實施方案中，本發明的多肽爲靶向部分。在一個實施方案中，所述之靶向部分與靜息血小板結合。在一個實施方案中，所述之靶向部分選擇性地與活化的血小板結合。

在一個實施方案中，所述之靶向部分選擇性地與靶結合，其中所述之靶選自：GPIba、GPVI以及非活性形式的 GPIIb/IIIa。在一個實施方案中，其中所述之靶向部分選擇性地與靶結合，其中所述之靶選自：活性形式的GPIIb/IIIa、P選擇蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2 ' CD40L以及 LOX-1 在一個實施方案中，所述之靶向部分與GPIb絡合物結合。

在一個實施方案中，包含靶向部分，其中所述之靶向部分爲選自：PS4、OS1和OS2中的肽。在一個實施方案中，所述之靶向部分包含得自抗體的抗體可變區，所述抗體選自：SCE5，MB9和AP3。在一個實施方案中，A爲FVII的輕鏈，B爲FVII的重鏈在另一個方面中，本發明涉及包含本發明的多肽的組合物β 在一個實施方案中，本發明的組合物包含細胞培養上

S -12- 201217527 清液。在另一個方面中，本發明涉及編碼本發明的多肽的核酸分子。

在另一個方面中，本發明涉及編碼多肽的核酸分子、以及由此編碼的多肽，其中所述之多狀包含：（i)至少 —個生物學活性部分；（Π)包含至少兩個Fc部分的Fc區 :以及（iii)插在兩個Fc部分之間的可切割的scFc連接體，其中所述之scFc連接體與至少一個酶切位點（例如使得 cscFc連接體被切割細胞內加工位點）相鄰。在一個實施方案中，cscFc連接體與兩個酶切位點相鄰，例如位於 cscFc連接體（其連接所述之Fc區的Fc部分）的上游及下游的酶切位點的一側，並且這兩個位點的切割基本除去了 cscFc連接體。在一個實施方案中，本發明渉及包含兩條核酸鏈的異源二聚體多肽，其中所述之多肽由本發明的核酸分子編碼在另一個實施方案中，本發明涉及異源二聚體多肽，其中所述之異源二聚體多肽是通過使包含本發明的核酸分子的載體在培養於細胞培養基中的細胞中表達、並由所述之培養基中分離所述之多肽而制得。在一個實施方案中，所述之多肽爲包含至少兩條氨基酸鏈的經加工的多肽。在一個實施方案中，本發明涉及存在於載體中的本發明的核酸分子。在一個實施方案中，所述之載體進一步包含編碼酶的 -13- 201217527 核苷酸序列，其中所述之酶切割至少一個細胞內加工位點在另一個方面中，本發明涉及包含至少兩條氨基酸鏈的經加工的多肽，其中所述之多肽由請求項3 7所述之核酸分子所編碼》

在一個實施方案中，本發明涉及包含請求項38所述之載體的宿主細胞，其中所述之宿主細胞表達了切割所述之多肽連接體的酶。在一個實施方案中，所述之酶對於所述之細胞而言是內源的。在另一個實施方案中，所述之酶對於所述之細胞而言是外源的。在另一個方面中’本發明涉及生產多肽的方法，該方法包括在培養物中培養請求項42或43所述之宿主細胞，使得產生包含兩條氨基酸鏈的成熟多肽。

在一個方面中’本發明涉及包含兩條多肽鏈的經加工的異源二聚體多肽，其中所述之經加工的異源二聚體多肽是通過使本發明的載體在培養於細胞培養基中的細胞中表達、並由所述之培養基中分離所述之成熟的異源二聚體多肽而制得。在實施方案中，本發明涉及包含本發明的經加工的多肽以及可藥用的載體的組合物》在另一個實施方案中，本發明涉及包含本發明的核酸分子以及可藥用的載體的組合物。在一個實施方案中，本發明涉及用於治療或預防受試

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201217527 者的疾病或紊亂的方法’該方法包括向受試者給藥本發的組合物。在一個實施方案中’所述之疾病或紊亂選自：凝血亂、神經病學紊亂、炎症紊亂、自身免疫紊亂以及贅生紊亂。在另一個實施方案中，所述之疾病或紊亂爲影響止的紊亂。在另一個實施方案中，所述之組合物促進血塊形成。本發明通過提供分子（例如核酸和多肽分子）而優本領域的現有技術，包括：（i)至少一個生物學活性分（例如抗原結合位元點或結合結構域、配體的受體結部分、受體的配體結合部分或調節凝血的部分）以及（ )包含可切割的scFc(cscFc)連接體的至少一個Fc區（即單鏈Fc(“scFc”）區）。但是，與現有技術的^!^分子 scFc連接體相比，本發明的cscFc連接體（其連接了形 scFc區的Fc部分）與至少一個酶切位點（例如該位點可通過細胞內加工酶來切割）相鄰，從而得到包含兩條鏈區的二聚體分子，其中所述之csFc連接體被切割或基本去。在所述之多肽被細胞分泌之前、在給藥受試者之前者在給藥之後在體內可以發生這種切割步驟。在一個實施方案中，所述之多肽由下式所表示（並圖1A中的圖示所示）： A-F 1-P 1 - L-P2-B-F2 (I) 明紊物血的於部合的成以 Fc 除或由 -15- 201217527

其爲由氨基末端至羧基末端的線性序列，其中A爲生物學活性部分，F1爲第一Fc部分或結構域，P1爲酶切位點 ’ L爲cscFc連接體’ P2爲酶切位元點，B爲生物學活性部分’ F2爲第二Fc部分或結構域，而“表示肽鍵。式⑴ 至少包含A或B、以及可任選的是包含這二者。如果A和B 都存在，則它們可以相同或不同。此外，A和B還可以爲分子的亞單元或鏈’從而當A和B都存在或者彼此結合時，它們形成了功能及活性分子。式（I)至少包含P 1或P 2、以及可任選的是包含這二者。如果P 1和P2都存在，則它們可以相同或不同。式（I)至少包含F1或F2。如果F1和F2都存在，則它們可以相同或不同》根據式I的示例性多肽包括：A-F1-P1- L-P2-F2; Fl-ph L-P2-B-F2; A-F1-P1- L- F2; Fl-Pl- L- B-F2; A-Fh L-P2-F2和 FI- L-P2-B-F2。

在一個實施方案中，F1和F2均包含CH2和CH3部分。在另一個實施方案中，F1和F2二聚化從而形成Fc區，並且其中A和B可任選地存在並且爲生物學活性部分。在一個實施方案中，P1和P2均存在，並且被相同的或不同的酶所識別。在一個實施方案中，P1和P2中的至少一者爲細胞內加工位點，其包含精氨酸kex2/furin酶所識別的鹼性氨基酸殘基簇。該酶立即切割C末端從而形成精氨酸殘基。在一個實施方案中，P1和P2細胞內加工位點中的至少一者爲酶切位點，其被凝血酶所識別。在另一個實施

S -16- 201217527

方案中，至少一個位點爲體內切割的酶切位點，例如被（例如）凝血酶、因數IXa或XIa所識別的酶切位點。示例性的FXIa酶切位點包括（例如）TQSFNDFTR (SEQ ID NO:7) 和SVSQTSKLTR (SEQ ID NO:8)。示例性的凝血酶酶切位點包括：DFLAEGGGVR (SEQ ID Ν Ο : 9)、Τ Τ ΚΙ KP R (SEQ ID NO: 10)，以及包含或由 ALRPR (例如 ALRPRVVGGA

(SEQ ID NO: 1 1))構成的序列。本領域的技術人員可以根據本文的教導容易地選擇其他酶切位點。題述多肽包含至少一個生物學活性部分（式I中的A和 B所表示）。該生物學活性部分可以與本發明分子的Fc區中存在的一個或兩個Fc部分融合。這種融合可以發生在Fc 部分的C末端、N末端或這兩個末端。這種融合可以通過肽連接體（例如多肽隔離物，其賦予分子以撓性）、化學綴合或本領域所知的其他方法來直接進行（例如通過肽鍵）在一個實施方案中，表達編碼本發明的多肽的構建體的細胞以內源方式表達加工cscFc連接體（L)、從而得到多聚體分子的酶’其中所述之多聚體分子包含至少兩條多肽鏈，例如包含兩條多肽鏈的二聚體分子。在另一個實施方案中，表達本發明多肽的構建體的細胞以重組方式表達在酶切位元點處加工（即，切割）cscFc連接體的酶。得自單個連‘續的基因構建體的本發明多肽的表達具有優於傳統蛋白質表達方法的多個益處，其中所述之傳統蛋白質表達方法涉及兩個基因的共表達（一個基因編碼了包 -17- 201217527

含第一 Fc結構域的多肽鏈，而分開的第二個基因編碼了包含第二Fc結構域的多肽鏈，其中由二硫鍵連接所述之兩條多肽鏈）。與所述之這種傳統構建體有關的潛在問題包括在所得分子的群體中存在顯著的異質性，由此所需的分子必須由不需要的分子中純化出來，從而不可避免地導致所需分子的總產量的下降。例如，錯誤折疊的Fc融合蛋白質難以與正確折疊的二價Fc蛋白質分離，這是因爲這二者之間的唯一差異通常爲不同的錯誤折疊事件。題述多肽不能承受所述蛋白質結構的不規則性，這是因爲這種構造在折疊過程中在所述分子彼此密切臨近中不能固定所述之分子。此外，除去外源連接體序列還可以減少在共價連接形式中存在的任何空間應力或阻礙。此外，切割cscFc連接體可以使得生物學活性部分與具有游離N末端的各個Fc部分的氨基末端融合。這在生物學活性部分具有催化活性（例如絲氨酸蛋白酶結構域（其需要游離的N末端以便具有催化活性）或部分）、或者由於未切割多肽連接體的存在而使得空間受阻的情況下是特別有價値的。本發明的示例性構建體在附圖以及序列表中說明。在 —個實施方案中，本發明涉及具有所述附圖中列出的結構的多肽。在另一個實施方案中，本發明涉及具有在所附的序列表中列出的序列的多肽。應該理解的是這些構建體以及編碼它們的核酸分子可以用於改善受試者的止血。爲了提供對說明書和請求項書的清除的理解，提供以下定義。

S -18- 201217527 I.定義如本文所用，術語“蛋白質”或“多肽”是指兩個或多個天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。

術語“氨基酸”包括丙氨酸（Ala或Α);精氨酸（Arg 或R);天冬醯胺（Asn或N);天冬氨酸（Asp或D);半胱氨酸（Cys或C);穀氨醯胺（Gin或Q);谷氨酸（Glu或E) ;甘氨酸（Gly或G);組氨酸（His或H);異亮氨酸（Ile 或I);亮氨酸（Leu或L);賴氨酸（Lys或K);蛋氨酸 (Met或M);苯丙氨酸（Phe或F);脯氨酸（Pro或P);絲氨酸（Ser或S);蘇氨酸（Thr或T):色氨酸（Trp或W);酪氨酸（Tyr或Y)以及纈氨酸（Val或V)。非傳統的氨基酸也在本發明的範圍內，並且包括正亮氨酸、賴氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸以及其他氨基酸殘基類似物，例如在Ellman et al. Meth. Enzym. 202:3 0 1 -3 3 6 ( 1 99 1 )中所述之那些。爲了形成這種非天然形成的氨基酸殘基，可以使用Noren et al. Science 244:1 82 (1 989)和 Ellman et al_(上文）的工藝。簡言之，這些工藝涉及使用非天然形成的氨基酸殘基對抑制劑tRNA進行化學活化，然後將所述之RNA進行體外轉錄和翻譯。此外，還可以使用本領域已知的肽化學來引入非傳統的氨基酸。 “氨基酸取代”是指使用第二個不同的“替代”氨基酸殘基來替代預定氨基酸序列（起始多肽的氨基酸序列）中的至少一個存在的氨基酸殘基。“氨基酸插入”是指將 •19- 201217527 至少一個額外的氨基酸引入到預定的氨基酸序列中。雖然所述之插入通常由插入一個或兩個氨基酸殘基構成，但是可以實施目前較大的“肽的插入”，例如插入大約3至大約5個、或者甚至大約10、15或20個氨基酸殘基。按照上文所述，插入的殘基可以是天然形成的或非天然形成的。 “氨基酸刪除”是指由預定的氨基酸序列中除去至少一個氨基酸殘基。

多肽可以爲單體或多聚體。例如，在一個實施方案中，本發明的蛋白質爲二聚體。在一個實施方案中，本發明的二聚體爲同源二聚體，其包含兩個一致的單體亞單元或多肽（例如兩個一致的F c部分或兩個一致的生物學活性部分）。在另一個實施方案中，本發明的二聚體爲異源二聚體，其包含兩個不一致的單體亞單元或多肽（例如包含兩個不同的生物學活性部分，僅一個爲生物學活性部分，和 /或Fc區包含不同Fc部分，所述Fc部分二聚化以形成異源 Fc區）。如本文所用，術語“ scFc多肽”是指包含單鏈Fc區 (scFc)的多肽。本發明的多肽包含連接scFc區的Fc部分的 cscFc連接體（L) »所述之cscF(^接體插在包含scFc區的Fc 部分之間’並在至少一個酶切位點（例如細胞內的酶加工位點）的一側。如本文所用，術語scFc多肽是指包含單鏈 Fc區（scFc)的多肽。所述多肽的以部分可以直接連接或者間接連接。如果所述之scFc連接體在線性多肽序列中連接臨近的兩個Fc部分’則其爲“直接”連接。相反，所述之

S -20- 201217527 scFc連接體可以將第一Fc部分與不同的部分（例如結合部分、靶向部分或功能部分）連接，其中所述之不同的部分轉而連接第二Fc部分，由此形成間接連接。在一個實施方案中，本發明的多肽包含額外的修飾》示例性的修飾在下文中更詳細地描述。例如，在一個實施方案中，多肽可以被修飾爲加入了功能部分（例如PEG、藥品或標記）。

就生物學方面而言，“生物學活性部分”是指能夠實施功能、作用或反應中的一者或多者的分子，分子的部分、片段、衍生物或成分。生物學活性部分可以包含完整的蛋白質或其生物學活性部分。例如，術語“生物學活性部分”包括活性及功能分子、與生物學系統的成分（例如血清中、細胞表面上或細胞基質中的蛋白質）結合並且這種結合會產生生物學作用（例如通過活性部分和/或所述分子所結合的成分的變化（例如活性部分和/或所述分子所結合的成分的切割、信號的傳播、細胞或受試者中生物學應答的增強或抑制）來測量）的分子的結合結構域。示例性的生物學活性部分可以包含天然分子，例如凝血級聯的成分、抗體分子的抗原結合位點或片段（例如F(ab)或scFv ) (例如賦予、誘導或阻斷生物學應答）、受體的配體結合部分、配體的受體結合部分或催化結構域。在一個實施方案中，生物學活性部分包含成熟形式的蛋白質。在另一個實施方案中，生物學活性部分包含全長蛋白質或者保留了生物學活性的全長蛋白質的部分。 -21 - 201217527

如本文所用，術語“生物學活性部分”包括（例如）就本發明的構建體而言，當以單體形式單獨存在時不具有活性、但是當其與第二部分配對時具有生物學活性的第一部分。在一些此類實施方案中，所述之第一部分可以由式 I中的A (或B)來表示，而所述之第二部分可以由B (或A )來表示。當和B然後在多肽中締合時，它們形成了功能分子（其實例包括（例如）FVII的輕鏈和重鏈，或者例如 FSH的亞單元）。術語“生物學活性部分”包括需要酶活性以便具有完整的生物學活性的部分。例如，無論是酶原形式的凝血因數還是完整活化形式的凝血因數（例如FVII、FVIIa、FIX 、FIXa、FX或FXa ) ’都被包含在術語“生物學活性部分 ”的範圍內。

如本文所用，術語“配體結合結構域”是指天然受體 (例如細胞表面受體）或者保留了至少定性的配體結合能力（優選的是相應天然受體的生物學活性）的區域或衍生物。如本文所用’術語“受體結合結構域”是指天然配體或者保留了至少定性的受體結合能力（優選的是相應天然配體的生物學活性）的區域或衍生物。在一個實施方案中’本發明的多肽包含與靶向減少或刪除的分子結合的至少一個生物學活性部分，例如細胞表面抗原或可溶性抗原。在~個實施方案中，所述之生物學部分包含或由抗原結合位點構成（例如包含可變重鏈序列和可變輕鏈序列’或者得自抗體的、置於可選的構架區（

S -22- 201217527 例如可任選地包含一個或多個氨基酸取代的人類構架區）中的6個CDR)。在另一個優選的實施方案中，生物學活性部分包含凝血級聯的成分的生物學活性部分。

術語“特異性”包括特異性結合（例如免疫反應）給定靶的潛在結合位點的數量。多肽可以爲單特異性的，並且包含特異性結合相同靶的一個或多個結合位點（例如相同的抗原決定部位），或者所述之多肽可以爲多特異性的，並且包含特異性結合相同靶或不同靶的不同區域的兩個或多個結合位點（例如不同的抗原決定部位）。如本文所用，術語“化合價”是指多肽或蛋白質中生物學活性部分（例如結合結構域）的數量。當多肽包含多於一個生物學活性部分時，各個結合結構域可以特異性地結合相同或不同的分子（例如可以結合不同的配體或不同的抗原，或者相同抗原上的不同抗原決定部位）。在_個實施方案中，本發明的多肽爲一價的。在另一個實施方案中，本發明的多肽爲多價（例如二價）的。如本文所用，術語“多肽連接體”是指結合多肽鏈的線性氨基酸序列中的兩個結構域的肽或多肽序列（例如合成肽或多肽序列）。優選的連接體包括（例如）gly-serf 肽連接體。本發明的多肽是由核酸分子直接或間接編碼的，其中所述之核酸分子包含編碼多肽連接體的核苷酸序列，其中所述之連接體連接構成所述構建體的兩個Fc部分。這些連接體在本文中稱爲“ cscFc連接體”。並非連接線性多肽序列中臨近的兩個Fc部分，所述之cscFc連接體可 -23- 201217527 以（例如）將所述之第一 Fc部分與不同的部分（例如生物學活性部分、靶向部分或功能部分）連接，其中所述之不同部分轉而連接所述之第二Fc部分。這些cscFc連接體（L) 導致單鏈基因構建體的形成。但是，所述之多肽還包含酶切位點，該酶切位點使得cscFc連接體被切割，並且在一個實施方案中，所述之連接體被基本切除（例如在細胞的加工過程中）。因此，所述之經加工的分子爲包含至少兩條氨基酸鏈並且基本缺乏外源連接體氨基酸序列的二聚體分子。在一些實施方案中，所有的或基本所有的連接體被切除，而在一些實施方案中，一部分酶切位點可以保留，例如RRRR酶切位點的4個精氨酸。在另一個實施方案中，另一種類型的多肽連接體（本文稱爲“隔離物”）可以用於將不同的部分（例如生物孿活性部分）與Fc部分連接。這種類型的多肽連接體可以爲所述之多肽分子提供撓性。隔離物通常不被切割；但是所述之切割可能是需要的。隔離物的示例性的位置示於附圖中〇如本文所用，術語“gly-ser多肽連接體”是指由甘氨酸和絲氨酸殘基構成的多肽連接體。示例性的gly/ser多肽連接體包含氨基酸序列（Gly4 Ser)n. (SEQ ID NO:4)。另一種示例性的gly/ser多肽連接體包含氨基酸序列S(Gly4 Ser)n ο 在一個實施方案中，η=1。在一個實施方案中，η = 2。在另一個實施方案中，η = 3，即，（Gly4 Ser)3。在另一個 201217527

實施方案中，n = 4，即，（Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO:6)。在另 —個實施方案中，n = 5。在另一個實施方案中，n = 6。在另一個貫施方案中，n = 7。在另一個實施方案中，n = 8。在另 —個實施方案中，n = 9。在另一個實施方案中，n=10。另一種示例性的gly/ser多肽連接體包含氨基酸序列 Ser(Gly4Ser)n (SEQ ID NO:26)。在一個實施方案中，n=l 。在一個實施方案中，n = 2。在優選的實施方案中，n = 3。在另一個實施方案中，n = 4。在另一個實施方案中，n = 5。在另一個實施方案中，n = 6。 “衍生自”指定多肽或蛋白質的多肽或氨基酸序列是指多狀的起源。優選的是，衍.生自特定序列的多肽或氨基酸序列具有氨基酸序列，該序列與所述之序列或其部分基本一致的，其中所述之部分由至少10-20個氨基酸、優選的是由至少20-30個氨基酸、更優選的是至少30-50個氨基酸構成；或者否者其等同于本領域技術人員認爲序列中具有其起源的一者。衍生自另一種肽的多肽相對於起始多肽可以具有一個或多個突變，例如已經被另一種氨基酸殘基取代或者具有一個或多個氨基酸殘基的插入或刪除的一個或多個氨基酸殘基。優選的是，所述之多肽包含非天然形成的氨基酸序列。這種變體必須與所述之起始抗體具有低於1 00%的序列一致性或者相似性。在優選的實施方案中，所述之變體具有與所述之起始多肽的氨基酸序列大約7 5 %至低於100%、更優選的是大約80%至低於100%、更優選的是大約85%至 -25- 201217527

低於1 0 0 %、更優選的是大約9 0 %至低於1 0 0 % (例如，9 1 % 、92% ' 93% ' 94%、95% ' 9 6%、97%、98%、99%) > 並且最優選的是大約95%至低於100% (例如在所述變體分子的長度上）氨基酸序列一致性或相似性的氨基酸序列。在一個實施方案中，在起始多肽序列與其衍生序列之間存在一個氨基酸的差異。就該序列而言，一致性或相似性在本文中定義爲爲了取得最大的百分序列一致性在比對序列並引入缺口（如果需要）之後，備選序列與所述之起始氨基酸殘基一致（即，相同的殘基）的氨基酸殘基的百分率。本發明的優選多肽包含衍生自人類免疫球蛋白序列的氨基酸序列（例如至少一個Fc部分或結構域）。但是，多肽可以包含得自另一種哺乳動物的一種或多種氨基酸。例如，靈長動物的Fc結構域或結合位元點可以包含在所述之題述多肽中。或者，衍生自非人類物種的一種或多種氨基酸可以存在於多肽中。本發明的優選多肽不具有免疫原性〇此外，本領域的一名普通技術人員還應該理解的是可以改變本發明的多肽，使得它們的氨基酸序列與衍生出它們的天然形成的或天然的多肽不同，但是保留了天然多肽的所需的活性。例如，可以在“非必須”氨基酸殘基處形成導致保守性取代或變化的核苷酸或氨基酸取代。可以通過向免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代、加入或刪除使得一個或多個氨基酸取代、加入或刪除被引入到所編碼的蛋白質中來創建編碼多肽非天然變體（

S •26- 201217527 其衍生自所述之免疫球蛋白（例如Fc結構域、部分或抗原結合位元點））的經分離的核苷酸分子。可以通過標準的技術，例如定點突變和PCR調節突變，來引入突變。

本發明的多肽可以在一個或多個氨基酸殘基處（例如在必需的或非必需的氨基酸殘基處）包含保守的氨基酸取代。因此，可以使用得自相同側鏈家族的另一種氨基酸殘基來替代多肽中的非必需氨基酸殘基。在另一個實施方案中，一串氨基酸可以使用次序和/或側鏈家族成員的組成不同的結構相似的一串氨基酸來替代。或者，在另一個實施方案中，可以沿著全部或部分的編碼序列（例如通過飽和突變）隨機地引入突變，並且所得的突變體可以被引入到本發明的多肽中，並針對它們對所需靶的結合能力來進行篩選。就多肽而言，“線性序列”或“序列”爲氨基末端至羧基末端方向上在多肽中的氨基酸順序，其中所述序列中 φ 位於一側或彼此相鄰的殘基在所述多肽的以及結構上是臨近的，即，通過肽鍵連接。如本文所用，術語‘‘連接的”、“融合的”或“融合 ’’是指通過肽鍵、化學綴合或其他方式的連接。術語“基因融合的”、“基因連接的”或“基因融合”可交換使用 ’並且是指通過編碼蛋白質、多肽或其片段的單個多核苷酸分子的基因表達而得到的兩個或多個蛋白質、多肽或其片段通過它們各自的肽主鏈的共線共價連接或附著。這種基因融合使得單個相鄰的基因序列得以表達。優選的基因 -27- 201217527 融合爲框內基因融合，即，兩個或多個開放閱讀框（O RF )融合從而以保持原始ORF的正確閱讀框的方式形成連續的較長的ORF。因此，所得的重組融合蛋白質爲包含兩個或多個蛋白質節段的單個多肽，其中所述之蛋白質節段與原始ORF所編碼的多肽相應（所述節段通常在自然界中並非是如此連接的）。在這種情況下，所述之單個多肽在加工過程中被切割從而得到包含兩條多肽鏈的二聚體分子。

如本文所用，術語“ Fc區”定義爲與天然免疫球蛋白的Fc區相應的多肽部分，即，通過所述蛋白質的兩條重鏈的各個Fc結構域的二聚化結合而形成。天然Fc區爲同源二聚化的，並且包含兩條多肽鏈。相反，如本文所用，術語 “基因融合的Fc區”或“單鏈Fc區”（SCFc區）是指合成的二聚化Fc區，該Fc區由單個多肽鏈中基因連接的Fc結構域或部分構成（即，在單個連續的基因序列中編碼），其中

所述之單個多肽鏈的Fc結構域或部分二聚化從而形成Fc區〇如本文所用，術語“ Fc結構域”是指恰好在木瓜蛋白酶酶切位點上游的鉸鏈區（即，在IgG中的殘基216，將重鏈恒定區的第一殘基作爲114)開始並且在抗體的C末端結束的單個免疫球蛋白重鏈的部分。因此，完整的Fc結構域至少包含鉸鏈結構域、C Η 2結構域和C Η 3結構域* 如本文所用，術語“ Fc結構域部分”或“ Fc部分”包括Fc結構域或衍生自Fc結構域的氨基酸序列。在某些實施方案中，Fc部分至少包含以下一者：鉸鏈（例如上游、中

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游和/或下游鉸鏈區）結構域、CH2結構域、CH3結構域、 CH4結構域，或者它們的變體、部分或片段。在另一個實施方案中，Fc部分包含完整的Fc結構域（即，鉸鏈結構域、CH2結構域和CH3結構域）。在一個實施方案中，Fc部分包含與CH3結構域（或其部分）融合的鉸鏈結構域（或其部分）。在另一個實施方案中，Fc部分包含與CH3結構域（或其部分）融合的CH2結構域（或其部分）。在另一個實施方案中，Fc部分由CH3結構域或其部分構成。在另一個實施方案中，Fc部分由鉸鏈結構域（或其部分）及 CH3結構域（或其部分）構成。在另一個實施方案中，Fc 部分由CH2結構域（或其部分）及CH3結構域。在另一個實施方案中，Fc部分由鉸鏈結構域（或其部分）及CH2結構域（或其部分）構成。在一個實施方案中，Fc部分至少缺少CH2結構域的一部分（例如全部或部分CH2結構域）在一個實施方案中，本發明的Fc部分至少包含FcRn結合所需的本領域已知的Fc分子的一部分，在本文中稱爲新生的受體結合配偶體。技術人員可以理解的是本發明的嵌合蛋白質中使用的部分免疫球蛋白恒定區可以包括其突變體或類似物，或者可以包括化學修飾的免疫球蛋白恒定區 (例如聚乙二醇化）或其片段（例如參見Aslam and Dent 1998，Bioconjugation: Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London ) 〇在一種情況下，突變體可以得到FcRn結合配偶體對FcRn的 -29- 201217527

增強的結合。此外，至少部分免疫球蛋白恒定區的肽模擬物（例如Fc片段的肽模擬物或FcRn結合配偶體的肽模擬物 )也被考慮用於本發明的嵌合蛋白質。在一個實施方案中，使用噬菌體展示或通過化學文庫篩選來鑒定狀模擬物（例如參見 McCafferty et al. 1990，Nature 348:552，Kang et a 1. 1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 8:43 63; EP 0 589 877 Bl)。在另一個實施方案中，本發明的Fc區（scFc區 )至少包含FcYR結合所需的本領域已知的Fc分子的一部分在一個實施方案中，本發明的Fc區（scFc區）至少包含蛋白質A結合所需的本領域已知的Fc分子的一部分。在 —個實施方案中，本發明的Fc區（scFc區）至少包含蛋白質G結合所需的本領域已知的Fc分子的一部分。

如本文所列，本領域的一名普通技術人員應該理解的是Fc結構域還可以被修飾使得其在其他效應器功能中不同于天然形成的免疫球蛋白分子的天然Fc結構域。在某些示例性實施方案中，Fc部分保持了效應器功能（例如FcYR結合）。本發明的Fc結構域或其部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc結構域或部分可以包含衍生自 IgGl分子的CH2和/或CH3結構域以及衍生自IgG3分子的鉸鏈區。在另一個實例中，Fc結構域或其部分可以包含部分衍生自IgGl分子及部分衍生自IgG 3分子的嵌合鉸鏈區。在另一個實例中，Fc結構域或其部分可以包含部分衍生自

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IgGl分子及部分衍生自IgG4分子的嵌合鉸鏈。本文中，重鏈恒定區中氨基酸的位置（包括CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域中的氨基酸的位置）是根據EU索引編號系統編號的（參見Kabat et al.，in “Sequences of

Proteins of Immunological Interest", U.S. De.pt. Health and Human Services, 5th edition, 19 9 1)。相反，本文中

，輕鏈恒定區中氨基酸的位置（例如CL結構域）是根據 Kabat索引編號系統編號的（參見Kabat etal.，ibid)。如本文所用，根據Kabat索引編號系統，術語“VH結構域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結構域，而術語“VL結構域”包括免疫球蛋白輕鏈的氨基末端可變結構域。如本文所用，術語“ CH1結構域”包括（例如）由大約EU位置118-215延伸的免疫球蛋白重鏈的第一恒定區結構域（多爲氨基末端）。該CH1結構域與VH結構域相鄰，並且其氨基末端與免疫球蛋白重鏈分子的鉸鏈區相鄰，而且沒有形成免疫球蛋白重鏈的Fc區的一部分。在一個實施方案中，本發明的多肽包含衍生自免疫球蛋白重鏈分子的 CH1結構域（例如人類IgGl或IgG4分子）》如本文所用，術語“鉸鏈區”包括連接CH 1結構域和 CH2結構域的重鏈分子的一部分。該鉸鏈區包含大約25個殘基，並且是撓性的，由此可以使兩個N末端抗原結合區獨立地移動。鉸鏈區可以細分爲3個不同的結構域：上游鉸鏈結構域、中游鉸鏈結構域和下游鉸鏈結構域（Roux et -31 - 201217527 al. J. Immunol. 1 998, 1 6 1:4083 )。

如本文所用’術語“ CH2結構域”包括（例如）由大約EU位置23 1 -3 40延伸的重鏈免疫球蛋白分子的一部分。該CH2結構域是獨特的，在於其並非與另一個結構域緊密配對。而且，兩個N連接的支化的碳水化合物鏈插在完整的天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。在一個實施方案中’本發明的多肽包含衍生自IgGl分子（例如人類IgGl分子）的CH2結構域。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含衍生自IgG4分子（例如人類IgG4分子）的CH2結構域。在示例性的實施方案中，本發明的多狀包含CH2結構域 (EU位置231-340)或其一部分。

如本文所用，術語“ CH3結構域”包括（例如）由 CH2結構域的N末端延伸大約1 10個殘基（例如大約位置 341_44 6b(EU編號系統））的重鏈免疫球蛋白分子的一部分。所述之CH 3結構域通常形成了所述抗體的C末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，額外的結構域可以由CH3結構域衍生，從而形成所述分子的C末端部分（例如在IgM的 μ鏈以及IgE的ε鏈的CH4結構域）。在一個實施方案中，本發明的多肽包含衍生自IgGl分子的CH3結構域（例如人類 IgGl分子）。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含衍生自IgG4分子的CH3結構域（例如人類IgG4分子）。如本文所用，術語“ CL結構域”包括（例如）由大約 Kabat位置107A-216延伸的免疫球蛋白輕鏈的一恒定區結構域（多爲氨基末端）。所述之CL結構域與VL結構域相鄰

S -32- 201217527 。在一個實施方案中，本發明的多肽包含衍生自kappa輕鏈的CL結構域（例如人類kappa輕鏈）。用於本發明的多肽的Fc部分可以在本領域所識別的位置處進行修飾，從而改變（例如增加或降低）效應器的功能。如本文所用，術語“效應器功能”是指Fc區或其部分

與免疫系統的蛋白質和/或細胞結合以及調節多種生物學作用的功能能力。效應器功能可以是抗原依賴性的或非抗原依賴性的。效應器功能的降低是指一種或多種效應器功能降低的同時，保持了所述抗體（或其片段）的可變區的抗原結合活性。效應器功能的增加或降低（例如Fc與Fc受體或補體蛋白質的結合）可以以倍數變化（例如變化1倍、變化2倍等）來表示，並且可以根據（例如）使用本領域公知的測試方法測定的結合活性的百分變化來計算。用於本發明的多肽的F c部分可以在本領域所識別的位置處進行修飾，從而改變（例如增加或降低）半衰期。如本文所用’術語“半衰期”是指特定多肽在體內的生物學半衰期。半衰期可以由給予受試者的一半的量由動物的迴圈和/或其他組織中清除所需的時間來表示。如本文所用’術語“抗原結合位點”或“抗原結合結構域”包括特異性地結合（免疫反應）抗原（例如細胞表面抗原或可溶性抗原）的位點。在一個實施方案中，所述之結合位點包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區，並由這些可變區所形成的結合位點來測定抗體的特異性。抗原結合位點是由一種多肽與另一種多肽不同的可變區（VH和 -33- 201217527 VL結構域）來形成的。

在某些實施方案中，本發明的多肽包含提供多肽與所選的抗原相結合的至少兩個抗原結合結構域（例如在相同多肽內（例如在單一多肽的N末端或C末端）或者與本發明的多聚體結合蛋白質的各成分結合多肽連接）。所述之抗原結合結構域不必由相同的免疫球蛋白分子衍生得到。就這一點而目’所述之可變區可以或不可以由任何種類的動物所衍生得到，其中所述之動物被誘導從而激起體液的應答並產生對抗所需抗原的免疫球蛋白。例如，所述之可變區可以爲（例如）哺乳動物起源的，例如可以爲人類、鼠科、非人的靈長動物（例如獼猴、恒河猴等）、狼、駱駝（例如來自駱駝、美洲駝以及相關的物種）。

術語“抗體的變體”或“經修飾的抗體”包括這樣的抗體’該抗體並非在自然界中形成並且具有氨基酸序列或氨基酸側鏈化學（其與天然衍生的抗體具有至少一個不同的氨基酸）’或者具有本文所述之氨基酸修飾，或者包含至少一個抗原結合位點的非天然形成的分子。如本文所用 ’術語“抗體變體”包括經改變使得它們並非爲天然形成的合成形式的抗體，例如包含至少兩個重鏈部分但不包含兩個完整的重鏈的抗體（例如結構域被刪除的抗體或微型抗體）；經改變從而結合單一抗原上的兩個或多個不同抗原或不同抗原決定部位的多特異性形式的抗體（例如雙特異性、三特異性等）：與scFv分子連接的重鏈分子；單鏈抗體；雙體；三體；以及具有改變的效應器功能等的抗體 -34- 201217527 如本文所用，術語“ scFv分子”包括由一條輕鏈可變結構域（VL)或其部分以及一條重鏈可變結構域（VH)或其部分構成的結合分子，其中各個可變結構域（或其部分）衍生自相同或不同的抗體。scFv分子優選地包含插在VH結構域和VL結構域之間的scFv連接體。scFv分子是本領域已知的，並且在（例如）美國專利5,892,0 1 9，Ho et al. 1 989.

Gene 7 7:51; Bird et al. 1 98 8 Science 242:423; Pantoliano et al. 19 91. Biochemistry 3 0:10117; Mil eni c et al. 1991.

Cancer Research 5 1:63 63; T akkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837中有所描述。如本文所用，“scFv連接體”是指插在scFv的VL和 VH之間的部分。scFv連接體優選地使scFv分子保持結合抗原的構造。在一個實施方案中，scFv連接體包含或者由 scFv連接體肽構成。在某些實施方案中，scFv連接體肽包含或由gly-ser多肽連接體構成。在另一個實施方案中， scFv連接體包含二硫鍵。術語“糖基化”是指一個或多個碳水化合物與多肽共價連接。通常，糖基化爲轉錄後時間，其可以在細胞的細胞內環境或其提取物中發生。術語糖基化包括（例如）N 連接的糖基化（這種情況下，一個或多個糖與天冬醯胺殘基連接）和/或〇連接的糖基化（這種情況下，一個或多個糖與具有羥基的氨基酸（例如絲氨酸或蘇氨酸）參加連接）。在一個實施方案中，本發明的分子爲糖基化的。在另一 -35- 201217527 個實施方案中，本發明的分子是非糖基化的（ aglycosylated)。在另一個實施方案中，與野生型的Fc區相比’本發明的分子的糖基化減少。如本文所用’術語“二硫鍵”包括在兩個硫原子之間形成的共價鍵。

術語“功能部分”包括優選地將所需的功能加入到所述之多肽中的部分。優選的是，加入所述之功能而沒有顯著地改變所需的所述多肽的固有活性，例如凝血活性、溶解性或所述分子的半衰期。本發明的多肽可以包含一個或多個功能部分，其可以是相同或不同的。可用的功能部分的實例包括但不限於可檢測的部分、功能部分、藥劑部分、親和性部分以及阻斷部分（例如在空間上阻斷與酶的結合或者阻斷與特定受體結合的能力）。可以使用本領域已知的方法（例如通過可切割或不可切割的連接部分）將功能部分與多肽連接。

如本文所用，術語“前藥”是指前體或衍生物形式的藥物活性試劑，與母體藥物相比，所述之試劑具有較低的活性、反應性或副作用傾向，並且能夠被酶活化或者以其他方式在體內轉化成更具有活性的形式。在一個實施方案中，本發明的前藥包含未切割或未加工的scFc區，在對受試者進行給藥時，該scFc區被切割從而形成至少包含兩個多肽鏈的二聚體分子。術語“載體”或“表達載體”在本文中用於指根據本發明作爲媒介物引入到細胞中並在細胞中表達所需的多核

S -36- 201217527 苷酸而使用的載體。如本領域的技術人員已知的那樣’可以由質粒、噬菌體、病毒和逆轉錄病毒中容易地選擇所述之載體。通常，與本發明相容的載體包含選擇標誌物、合適的限制性位點，從而有利於克隆所需的基因以及進入真核或原核細胞和/或在真核或原核細胞中複製的能力。

本發明的構建體可以在單個質粒中表達，從而避免了對多個質粒的需要。可以使用大量的表達載體系統。例如，一類載體使用衍生自動物病毒的DN A元件，其中所述之動物病毒例如爲牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆狀病毒、逆轉錄病毒（RSV、MMTV或MOMLV ) 或SV40病毒。此外，將DNA整合到其染色體中的細胞可以通過引入一種或多種標誌物來選擇，其中所述之標誌物可以對被轉染的宿主細胞進行選擇。所述之標誌物可以提供原養型給營養缺陷型宿主、對生物殺滅劑的抗性（例如抗生素）或者對重金屬（例如銅）的抗性。所述之可選擇的標誌物的基因可以直接與待表達的DNA序列鏈結，或者通過共轉化而被引入到相同的細胞中。在一個實施方案中，可以使用誘導表達系統。此外，需要額外的元件來達到最佳的mRNA的合成。這些元件可以包括信號序列、剪接信號、轉錄啓動子、增強子和終止信號。在一個實施方案中 ’分泌信號（例如多種良好表徵的細菌前導肽（例如pelB 、phoA或ompA)中的任何一者）可以與本發明多肽的n末端進行框內融合，從而得到所述多肽的最佳分泌（Lei et al. (1988), Nature, 331:543; Better et al. (1988) Science, -37- 201217527 240:1 041; Mullinax et al·，（1 990). PNAS, 87:8095 )。

術語“宿主細胞”是指使用重組DNA技術構建的並表達至少一種異源基因的載體轉化的細胞。在對由重組宿主中分離蛋白質的工藝進行描述的過程中，術語“細胞”和 “細胞培養物”可交換使用以指出蛋白質的來源，除非另作清除地說明。換言之，由所述“細胞”回收蛋白質可以指得自離心整個細胞，或者得自包含培養基和懸浮細胞的細胞培養物。用於蛋白質表達的宿主細胞系最優選的是哺乳動物起源的；認爲本領域的那些技術人員具有優選地測定最適用於所需的基因產物在其中表達的特定宿主細胞系的能力。示例性的宿主細胞系包括但不限於D G 4 4和 DUXB11 (中國倉鼠卵細胞系，DHFR-)、HELA (人類宮頸癌細胞）、CVI (猴腎細胞系）、COS (具有SV40 T抗原的 CVI的衍生物）、R1610 (中國倉鼠成纖維細胞）、

BALBC/3T3 (小鼠成纖維細胞）、Η AK (倉鼠腎細胞系）·· SP2/0 (小鼠骨髓瘤細胞）、P3x63-Ag3.653 (小鼠骨髓瘤細胞）、BFA-lclBPT (牛內皮細胞）、RAJI (人類淋巴細胞）和 2 93 (人類腎細胞）。宿主細胞系通常得自商業服務、美國組織培養物保藏所或者得自公開的文獻。此外，本發明的多肽還可以在非哺乳動物細胞（例如細菌、酵母菌或植物細胞）中表達。就這一點而言，應該意識到多種單細胞非哺乳動物微生物（例如細菌）也可以被轉化；即，能夠在培養或發酵下生長的那些。易於轉化的細菌包括腸桿菌科的成員，例如大腸桿菌或沙門氏菌的菌株：桿菌屬，例如

S -38- 201217527 枯草桿菌；肺炎球菌：鏈球菌以及流感嗜血桿菌》進一步意識到，當在細菌中表達時，所述之多肽通常成爲包含體的一部分。所述之多肽必須被分離、純化，然後組裝到功能分子中。

除了原核生物以外，還可以使用真核微生物。在真核微生物中，最通常的是使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae )或普通的麵包酵母，但是大量的其他菌株通常是可獲得的，包括畢赤酵母（Pichia pastoris)。對於在酵母屬中的表達而言，例如通常使用質粒YRp7 (

Stinchcomb et al., ( 1 979), Nature, 2 8 2:3 9; Kingsman et al., ( 1 979), Gene, 7:141; Tschemper et al., (1 980), Gene, 10:157 )。所述之質粒早已包含TRP1基因，該基因爲缺少在色氨酸中生長的能力的酵母菌突變體菌株提供選擇標誌物，例如 ATCC No. 44076 或 PEP4-1 ( Jones, (1 977)， Genetics，85:12)。作爲酵母菌宿主細胞基因組的特徵的 φ trpl損傷的存在則通過在缺乏色氨酸的條件下生長來提供檢測轉化情況的有效環境。如本文所用，術語“內源的”是指在細胞中天然存在的分子（例如核酸和/或蛋白質分子）。相反，術語“外源的”或“異源的”是指在給定環境（例如在細胞或多肽中）下通常不能找到的所述分子。例如，外源的或異源的分子可以被引入到細胞中，並且僅僅在對細胞進行操作（例如通過轉染或其他形式的基因工程改造）後才存在，或者異源的氨基酸序列可以存在於不能在自然界中找到的蛋 -39" 201217527 白質中。

如本文所用，術語“切割位點”或“酶切位點”是指酶所識別的位點。某些酶切位點包含細胞內加工位點。在一個實施方案中，具有酶所切割的酶切位點的多肽爲在凝血級聯過程中活化的多肽，使得此類位點的切割在血塊形成的位點處發生。示例性的此類位點包括凝血酶、因數 XIa或因數Xa所識別的那些。示例性的FXIa切割位點包括 (例如）TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR »示例性的凝血酶切割位點包括（例如）DFLAEGGGVR、TTKIKPR、LVPRG (SEQ ID NO:35)、以及包含或由ALRPR (例如 ALRPRVVGGA)構成的序列。其他可用的切割位點是本領域已知的。

如本文所用，術語“加工位點”或“細胞內加工位點 ”是指多肽中一種類型的酶切位點，該位點爲所述多肽被翻譯後發揮功能的酶的靶。在一個實施方案中，此類酶在由高爾基內腔運送到反式高爾基間質過程中發揮功能。細胞內加工酶在細胞分泌出蛋白質之前切割多肽。加工位元點的一個實例包括肽內切酶的PACE/弗林蛋白酶（其中PACE爲偶合基本氨基酸裂解酶的縮寫）家族所靶向的位點。這些酶定位于高爾基膜上，並切割序列基元Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基末端一側上的許多蛋白質。如本文所用，“弗林蛋白酶”家族的酶包括（例如）弗林蛋白酶、PC2、PC1/PC3、PC4、PACE4、 PC5/PC6以及LPC/PC7/PC8/SPC7。其他可用的加工位點是

S -40-

201217527 本領域已知的。如本文所用，“嵌合蛋白質”或“融合蛋白由衍生自第一來源的第一氨基酸序列構成的任何其中所述之第一氨基酸序列以共價或非共價方式第二來源的第二氨基酸序列鍵合，其中所述之第來源是不同的。不同的第一來源和第二來源可用不同的生物學實體，或者得自相同的生物學實體同的蛋白質，或者爲生物學實體與非生物學實體白質可以包括（例如）衍生自至少2種不同生物蛋白質。生物學來源可以包括任何非合成方式產或氨基酸序列（例如基因組或cDNA序列、質粒體、天然病毒體、或本文進一步描述的上文所述者的突變體或類似物）。合成來源可以包括以化生的（例如氨基酸序列的固相合成）、並非由生產生的蛋白質或核苷酸序列。此外，嵌合蛋白質括衍生自至少2種不同合成來源的蛋白質或者衍一種生物學來源及至少一種合成來源的蛋白質。合蛋白質還可以包含衍生自第一來源的第一氨基其中所述之第一氨基酸序列以共價或非共價方式任何來源的核酸或者衍生自任何來源的有機或無鍵合。嵌合蛋白質可以包含第一與第二氨基酸序或者第一氨基酸序列與核酸之間、或者第一氨基有機或無機小分子之間的連接體分子。嵌合分子括包含異源靶向序列的靶向凝血因數以及包含異質”是指蛋白質，與衍生自 —及第二包括兩種的兩種不。嵌合蛋學來源的生的核酸或病毒載之任意一學方式產物學系統還可以包生自至少此外，嵌酸序列，與衍生自機小分子列之間、酸序列與的實例包源酶切位 -41 - 201217527 點（例如可切割連接體）的可活化凝血因數。如本文所用，術語“凝血因數”是指天然形成或重組產生的分子或其類似物，該分子或其類似物抑制或降低了受試者中流血陣發的持續時間。換言之，其是指其活性形式具有預凝血活性的分子，即，使得纖維蛋白原轉化爲導致血液凝固或形成血塊的不溶性纖維蛋白網。

如本文所用，“凝血活性”是指在生物化學反應的級聯中沉澱的能力，該能力在纖維蛋白血塊的形成中達到極點和/或降低大出血或流血陣發的嚴重程度、持續時間或頻率。如本文所用，“止血”是指停止或減慢流血或大出血 :或者停止或減慢通過血管或肌體部位的血流。

如本文所用，“止血紊亂”是指基因遺傳的或獲得性的狀況，其表徵爲由於形成纖維蛋白血塊的能力受到損傷或者不能形成纖維蛋白血塊自發地或外傷導致的大出血傾向。此類紊亂的實例包括血友病。三種主要的形式爲血友病A (因數VIII缺陷）、血友病B (因數IX缺陷或“ Christmas疾病”）、血友病C (因數XI缺陷，溫和的流血傾向）、Von Willebrand疾病、因數Xi缺陷（PTA缺陷）、因數XII缺陷、纖維蛋白原缺陷或結構異常、凝血素· 因數V、因數VII、因數X或因數XIII，Bernard-Soulier綜合症爲GPIb缺失或缺陷。GPIb ( vWF的受體）可以是缺陷的，並導致一期血塊的形成（一期止血）缺乏，流血傾向增加，以及Glanzman and Naegeli的血小板機能不全（

S -42 - 201217527

Glanzman血小板機能不全）。在肝衰竭（急性或慢性形式 )中，存在肝的凝結因數的生成不足；這可以增加流血風險。如本文所用，術語“靶向部分”是指將本發明的多肽定位或定向於所需的位點或細胞上的多肽分子、其片段或成分。在一個實施方案中，本發明的構建體包含“靶向部

分” ’該部分通過（例如）將所述之分子定位于所需的位點處而增強所述多肽的活性。此類部分可以爲（例如）抗體或其變體（例如scFv)、或者肽。在另一個實施方案中，此類靶向部分可以爲多肽、配體的受體結合部分、受體的配體結合部分（其與本發明的多肽連接，並與（例如）細胞或組織上的所需靶結合）。所述之靶向部分可以與構建體基因融合、與構建體化學綴合、或者通過隔離物與構建體連接。例如，靶向部分可以通過在所述之靶向部分與構建體的Fc部分之間形成鍵而與本發明的構建體連接，其中所述之IE向部分包含第一官能團，而所述之FC部分包含第二官能團，並且所述之第一官能團或所述之第二官能團能夠彼此發生反應從而形成化學鍵（例如參見美國專利 7381408)。在一個實施方案中，如本文更詳細描述的那樣’本發明的靶向部分與血小板結合。如本文所用，短語“受益於給藥多肽的受試者’’包括受益於給藥本發明的多肽（例如治療紊亂）的受試者，例如哺乳動物受試者。例如，在一個實施方案中，所述之受試者可以受益於得自迴圈或血清中的可溶性或特定分子（ -43- 201217527 例如毒素或病原體）的減少或除去，或者受益於表達所述 IG的細胞（例如腫瘤細胞）群體的減少或除去。在另一個實施方案中’受試者可以受益於由所述構建體的結合部分所賦予的生物學活性，例如在包含凝血因數的多肽的情況下。如上文所討論的那樣，所述之多肽可以以非綴合形式使用’或者可以與（例如）功能部分以化學方式綴合或連接’從而形成用於給藥所述之受試者的經修飾的多肽。

如本文所用，動詞性的治療、名詞性的治療、動名詞性的治療是指疾病或狀況的嚴重程度的降低；疾病過程的持續時間的減少；與疾病或狀況有關的一種或多種症狀的減輕；在無需治癒疾病或狀況的條件下向患有疾病或狀況的患者提供的有益作用。在另一個實施方案中，給藥根據本發明製備的組合物可以預防與疾病或狀況有關的一種或多種症狀。

II.包含單鏈Fc(“scFc”）區的分子在一個實施方案中，本發明提供了編碼多肽的核酸分子，其中所述之多肽在單一的多肽鏈（即，包含單鏈 Fc(scFc)區的多肽）中包含至少一個基因融合的Fc區或其 —部分。本發明的核酸分子編碼了多肽，其中所述之Fc部分通過cscFc連接體在氨基酸的連續的線性序列中是基因融合的。此外，本發明還提供了由所述之核酸分子確定的多肽。在一個實施方案中，本發明通過了未經加工的多狀，其

S -44- 201217527 中處於相同的線性多肽鏈中的至少兩個Fc部分或結構域（例如2、3、4、5、6或更多的Fc部分或結構域）能夠折疊 (例如分子內或分子間折疊），從而形成由Fc多肽連接體連接的一個功能scFc區。例如，在一個優選的實施方案中，本發明的多狀能夠通過其scFc區與至少一個Fc受體（例如FcRn、FcYR受體（例如FcyRIII)或者補體蛋白質（例如

Clq))結合，以便改善半衰期或引發免疫效應器的功能（例如抗體依賴的細胞毒性（ADCC)，吞噬作用，補體依賴的細胞毒性（CDCC)和/或改善製造性）。在一個實施方案中，本發明涉及經加工（例如成熟）的多肽，其中與cscFc多肽連接體相鄰的至少一個切割位點已經被切割，使得所述之分子不再爲單一的多肽鏈。所得的經加工的多肽由至少兩條多肽鏈構成（由於在酶切位點P1和/或P2處的切割）。在一個實施方案中，所述之經加工的多肽包含與第二 φ Fc部分（即’在所述之多肽連接體被切割後由氨基末端計數至羧基末端時的第二Fc部分）連接的生物學活性部分，其中所述之第二Fc部分在所述之多肽連接體被切割後具有游離的氨基末端。在一個實施方案中，與所述之第二Fc部分的N末端連接的生物學活性部分包含抗原結合位元點（即，scFv分子 )。在另一個實施方案中，與所述之第二Fc部分的N末端連接的生物學活性部分是催化活性的，即，具有酶活性g 在另一個實施方案中，與所述之第二Fc部分的N末端連接 -45- 201217527 的生物學活性部分以酶原的形式被細胞分泌，該形式需要對生物學活性部分進行進一步的酶加工以便被完全活化，例如FVII、IX或X。

在一個實施方案中，本發明涉及凝血因數，該凝血因數在加工過程中以無需進一步活化的活性或活化形式被細胞所分泌。例如，因數VII通常以酶原形式以重組方式產生，並且在製造過程中需要活化以形成活性形式用於給藥。在一個實施方案中，本發明的多肽被細胞所分泌，其中所述多肽以活性形式被表達以改善製造性。如下文中更詳細列出的那樣，就cscFc分子而言，此類凝血因數可以通過分別表達凝血因數的輕鏈以及凝血因數的重鏈來生產。在加工過程（例如在所述之蛋白質與活性加工酶共同定位于反式高爾基細胞器中時）中，此類構建體的活化在分泌途徑中被延時至晚期。

多種可選設計方案的多肽包含在本發明的範圍內。例如，在一個實施方案中，本發明的核酸分子確定了下式表示的多肽： A-F1-P1- L-P2-B-F2 (I) 其爲由氨基末端至羧基末端的線性序列，其中A爲生物學活性部分，F1爲第一Fc部分或結構域，P1爲酶切位點，連接體，P2爲酶切位元點，B爲生物學活性部分，F2爲第二Fc部分或結構域，而“表示肽鍵。式（I)

S -46- 201217527 至少包含A或B、以及可任選的是包含這二者。如果A和B 都存在，則它們可以相同或不同。式（I)至少包含P 1或P2、以及可任選的是包含這二者。如果P1和P2都存在，則它們可以相同或不同。式（I)至少包含F1或F2。如果F1和F2都存在，則它們可以相同或不同。根據式I的示例性多肽包括：A-F1-P1-L-P2-F2; Fl-pi-L-Pa-B-F。： A-F1-P1-L- F2 ; Fl-Pl-L- B-F2 ; A-F1-L-

P2-F2以及F1-L-P2-B-F2 » 在一個實施方案中，F1和F2均包含CH2和CH3部分。 A. Fc部分或結構域用於生產本發明的多肽的、用作F1和F2的Fc部分可以得自多種不同的來源。在優選的實施方案中，所述多肽的 Fc部分衍生自人類的免疫球蛋白。但是，應該理解的是Fc 部分可以衍生自另外的哺乳動物的免疫球蛋白，其中所述 φ 之哺乳動物包括（例如）齧齒動物物種（例如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠）或者非人的靈長動物物種（例如黑猩猩、恒河猴）。此外，所述多肽的Fc結構域或其一部分可以衍生自任何的免疫球蛋白種類（包括IgM、IgG、IgD、IgA和 IgE )以及任何免疫球蛋白同種型（包括IgGl、IgG2、 IgG3和IgG4)。在優選的實施方案中，使用人類同種型 IgG (例如 IgGl )。多種Fc部分的基因序列（例如人類的恒定區基因序列 )可得自公共可得的保藏所。可以選擇具有特定效應器功 -47- 201217527 能（或者缺少特定效應器功能）或者具有特定修飾以減輕免疫原性的、包含Fc部分序列的恒定區結構域。抗體以及編碼抗體的基因的許多序列都已經被公開，並且可以使用本領域公認的技術由所述之序列衍生得到合適的Fc部分序列（例如鉸鏈、C Η 2和/或C Η 3序列，或者它們的一部分）。然後’可以改變或合成使用之前所述方法的任一種方法來獲得基因材料，從而得到本發明的多肽。更應該理解的是本發明的範圍涵蓋了恒定區DN Α序列的等位基因、變體以及突變體》例如，可以使用聚合酶鏈式反應以及所選的用於擴增所關注的結構域的引物克隆Fc部分的序列。爲了由抗體中克隆Fc部分的序列，由雜交瘤、脾或淋巴細胞中分離 mRNA ’將其逆轉錄成DNA，並通過PCR擴增抗體基因。 PCR擴增方法在美國專利No. 4,6 8 3，195; 4,683,202;

4,800，159; 4,965，188 以及（例如）“PCR Protocols: A

Guide to Methods and Applications” Innis e t al. eds.， Academic Press, San Diego, C A ( 1 990); Ho et al. 19 8«). Gene 77:5 1; Horton et al. 1 993. Methods Enzymol. 217:270中由詳細的描述。通過共有的恒定區的引物或.者通過更特定的引物，根據公開的重鏈和輕鏈DNA、以及氣基酸序列來引發PCR。如上文所討論的那樣，PCR還可以用於分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆子。在這種情況下’可以通過共有引物或較大的同源探針（例如小鼠恒定區探針）來篩選所述之文庫。適用于擴增抗體基因的大量 -48- 201217527 引物組是本領域已知的（例如基於純化抗體的N末端序列的 5’引物（Benhar and Pastan. 1 994. Protein Engineering 7:1 509) ; cDNA 末端的快速擴增（Ruberti，F. et al. 1 994. J.

Immunol. Methods 1 73 : 3 3);抗體的前導序列（Larrick et al. 1 98 9 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 60:1 250))。抗體序列的克隆在Newman et al.的美國專利1^〇· 5,65 8,5 70，1 995年1月25日提交中有進一步的描述，所述

文獻以引用方式倂入本文。本發明的多肽可以包含兩個或多個Fc部分（例如2，3, 4，5, 6，7，8，9，10或更多的Fc部分）。所述之兩個或多個 Fc部分可以形成Fc區。在一個實施方案中，所述之Fc部分可以爲不同的類型。在一個實施方案中，所述多肽中的至少一個Fc部分包含鉸鏈結構域或其一部分。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含至少一個CH2結構域或其一部分。在另一個實施方案中， φ 本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含至少一個 CH3結構域或其一部分。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含至少—個CH4結構域或其一部分。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分’該部分包含至少一個鉸鏈結構域或其一部分、以及至少一個CH2結構域或其一部分（例如鉸鏈_ CH2取向）。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含至少一個c Η 2結構域或其一部分、以及至少一個CH3結構域或其一部分（即，CH2-CH3 -49- 201217527 取向）。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含至少至少一個鉸鏈結構域或其一部分、至少一個CH2結構域或其一部分、以及至少一個CH 3 結構域或其一部分，這些結構域的取向例如爲鉸鏈-CH2-CH3、鉸鏈-CH3-CH2 或 CH2-CH3-鉸鏈。

在某些實施方案中，所述之多肽包含衍生自一個或多個免疫球蛋白重鏈的至少一個完整的Fc區（例如包含鉸鏈、CH2和CH3結構域的Fc結構域，但是它們不必衍生自相同的抗體）》在其他實施方案中，所述之多肽包含衍生自一個或多個免疫球蛋白重鏈的至少兩個完整的Fc區。在優選的實施方案中，所述之完整的Fc部分衍生自人類IgG免疫球蛋白重鏈（例如人類IgGl)。

在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc 部分，該部分包含完整的CH3結構域（根據EU編號的抗體 Fc區的大約氨基酸341-438)。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含完整的CH 2 結構域（根據EU編號的抗體Fc區的大約氨基酸231-3 40 ) 。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含至少一個CH3結構域、以及鉸鏈區和CH:2 結構域中的至少一者（根據EU編號的抗體Fc區的大約氨蕋酸2 1 6-230 )。在一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含鉸鏈和CH3結構域。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分包含鉸鏈、CH2和CH3結構域。在一個實施方案中，Fc部

S -50- 201217527 分包含或由對應於EU編號221-447的氨基酸構成》在優選的實施方案中，所述之Fc部分衍生自人類lgG 免疫球蛋白重鏈（例如人類IgGl)。

在另一個實施方案中，本發明的餓多肽包含至少一個 Fc部分’該部分包含FcRn結合配偶體。FcRn結合配偶體爲可以被FcRn受體特異性地結合並且隨後被FcRn結合配偶體的FcRn受體以活性形式運輸的分子或其一部分。特異性的結合是指兩個分子形成了絡合物，該絡合物在生理學條件下是相對穩定的。特異性的結合可以通過高的親和性、以及低至中度的載量來表徵，所述之親和性和載量與非特異性結合相區分’非特異性的結合通常具有低的親和性以及中度至高的載量。通常，當親和常數KA高於1〇6 Μ·1、更優選的是高於1〇8 M·1時，認爲結合是特異性的。如果需要，可以在基本上不影響特異性結合的條件下，通過改變結合條件來減少非特異性的結合。本領域的技術人員可以使用常規的技術來優化合適的結合條件，例如分子的濃度、溶液的離子強度、溫度、允許結合的時間、封閉劑（例如血清清蛋白、牛乳酪蛋白）的濃度等。已經由多種哺乳動物物種（包括人）中分離出FcRn受體。人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn以及小鼠FcRn的序列是已知的（Story et al. 1994，J. Exp. Med. 1 80:23 77 )。 FcRn受體以相對低的PH結合IgG (但是不結合其他的免疫球蛋白種類，例如IgA、IgM、IgD以及IgE)，在魯米諾中以活性方式將IgG跨膜運送至漿膜方向，然後在相對高的 -51 - 201217527 pH (在空隙流體中得到）下釋放IgG。所述之受體在成人上皮組織中表達（美國專利No. 6,485,726 ; 6,03 0,6 1 3 ; 6,086,875 ； WO 03/077834 ； U S 2 0 0 3 - 0 2 3 5 5 3 6 A 1 ) ’ 其中所述之上皮組織包括肺和腸的上皮（Israel et al. 1 997, Immunology 92:69)，腎近球小管上皮（Kobayashi et al. 2002，Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358)；鼻上皮 :陰道表面以及膽樹表面。

本發明的FcRn結合配偶體涵蓋了可以特異性地被FcRn 受體結合的分子，其中所述之受體包括IgG、IgG的Fc片段、以及包括FcRn受體的完整結合區的其他片段。已經根據 X射線結晶學描述了與FcRn受體結合的IgG的Fc部分的區域（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379)。Fc 與 FcRn 的主要接觸面積接近CH2和CH3結構域的連接處。Fc-FcRn的接觸均位於單個Ig重鏈的範圍內。FcRn結合配偶體包括整個IgG ’ IgG的Fc片段，以及包括FcRn的完整結合區的IgG 的其他片段。主要的結合位元點包括所述CH2結構域的氨基酸殘基 248，250-257，272，285，288，290-291，308-311 和 314 ’以及CH3結構域的氨基酸殘基385-387, 428和433-436 。對於免疫球蛋白、免疫球蛋白的片段或區域的氨基酸編號所作的參考均根據Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of

Public Health, Bethesda，Md。可以根據本領域公認的方法（例如定點突變等）來修飾IgG的Fc區’以得到FcRn所結合的經修飾的1§〇或Fc片段 -52-

S 201217527 或它們的一部分。此類修飾包括遠離FcRn接觸位點的修飾以及在接觸位點範圍內（其保持或者甚至增強了與FcRn的結合）的修飾。例如，人類IgGl Fc (Fql)中以下單個的氨基酸殘基可以被取代而不會使Fc與FcRn的結合親和性受到顯著的損失：P23 8A、S239A、K246A、K248A > D249A 、M252A 、 T256A 、 E258A 、 T260A 、 D265A 、 S267A 、

H268A 、 E269A 、 D270A 、 E272A 、 L274A 、 N276A 、 Y278A 、 D280A 、 V282A 、 E283A 、 H285A 、 N286A 、 T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F 、N297A 、 S298A 、 Y300F 、 R301A 、 V303A 、 V305A 、 T307A 、 L309A 、 Q311A 、 D312A 、 N315A 、 K317A 、 E318A 、 K320A 、 K322A 、 S324A 、 K326A 、 A327Q 、

P329A、A330Q、P331A、E3 33A、K334A、T3 3 5A、S3 3 7A 、K338A 、K340A 、 Q342A 、R344A 、 E345A 、 Q347A 、 R355A 、 E356A 、 M358A 、 T359A 、 K360A > N361A 、 Q362A 、 Y373A、 S375A 、 D376A 、 A378Q 、 E380A 、 E382A 、 S383A 、 N384A 、 Q386A 、 E388A 、 N389A 、 N390A 、 Y391F 、 K392A 、 L398A 、 S400A 、 D401A 、 D413A 、 K414A 、 R416A 、 Q418A 、 Q419A 、 N421A 、 V422A 、 S424A 、 E430A 、 N434A 、 T437A 、 Q438A ' K439A、S440A、S444A 和 K447A，其中例如 P238A表示在位置編號23 8處，野生型的脯氨酸被丙氨酸取代。例如，一個特定的實施方案引入了 N297A突變，除去了高度保守的N糖基化位點。除了丙氨酸，其他氨基酸可以取代上述 -53- 201217527

定義的位置處的野生型氨基酸。突變可以單獨地被引入到 Fc中，從而得到一百多種不同于天然Fc的FcRn結合配偶體。此外’可以一起引入2個、3個或多個所述之這些單獨突變的結合’從而得到幾百多種FcRn結合配偶體。此外，本發明的構建體的FcRn結合配偶體之一可以突變，而其他的 FcRn結合配偶體根本沒有突變，或者它們都可以突變但是具有不同的突變。本文所述之任何突變（包括2 97A )可以用於修飾Fc，而與生物學活性分子（例如EPO、IFN、因數VII、因數IX、T20)無關。

某些上文所述之突變可以賦予FcRn結合配偶體以新的功能。例如，一個實施方案引入了 N297A，從而除去了高度保守的N糖基化位點。該突變的作用是降低了免疫原性，由此增加了 FcRn結合配偶體的迴圈半衰期；並使得FcRn 結合配偶體能夠結合FcyRI, FcyRIIA，FcyRIIB和FcyRIIIA ，而沒有損失對FcRn的親和性（Routledge et al. 199 5, Transplantation 60:847; Friend et al. 1 9 9 9,

Transplantation 68:1 632; Shields et al. 1 995, J. Biol. Chem. 276:659 1 )。由上文所述之突變得到新的功能的另 —個實例爲在一些情況下，可以使得對FcRn的親和性增加至超過野生型的親和性。這種增加的親和性可以反應增加的“開（on ) ”的速率、降低的“關（0ff) ”的速率，或者增加的“開”的速率及降低的“關”的速率這二者。拒信’突變（包括T256A、T307A、E380A和N434A)使得對 FcRn的親和性增加（Shields et al. 2001，J_ Biol. Chem. -54- s 201217527 276:659 1 ) 〇

此外，至少3種人類Fq受體顯示出IgG上位於下游鉸鏈區中的結合位點，通常爲氨基酸234-23 7。因此，新的功能性和潛在降低的免疫原性可以由所述區域的突變引起，例如將人類IgGl "ELLG"的氨基酸23 3 -23 6替代成得自 IgG2 "PVA”的相應序列（具有一個氨基酸刪除）。已經顯示，當引入所述之突變時，調節多種效應器功能的FqRI， FcyRII 和 FcyRIII不會與 IgGl 結合。Ward and Ghetie 1 995, Therapeutic Immunology 2:77 和 Armour et al. 1 9 9 9, Eur. J. Immuno 1 · 2 9 : 2 6 1 3。在一個實施方案中，FcRn結合配偶體爲這樣的多肽，該多肽包括序列PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 12)，並且可任選地進一步包括選自HQSLGTQ (SEQ ID NO: 13)、 HQNLSDGK (SEQ ID NO: 14)、HQNISDGK (SEQ ID NO： 24)或 VISSHLGQ (SEQ ID NO: 25)(美國專利 No. 5,739,277)中的序列。兩個FcRn受體可以結合單一的Fc分子。結晶學資料表明每個FcRn分子結合Fc同源二聚體的單一多肽。在一個實施方案中，將FcRn結合配偶體（例如IgG的Fc片段）與生物學活性分子連接提供了以口服，口腔，舌下，直腸，陰道，鼻腔、肺部途徑或經過眼部途徑給藥的噴霧劑形式傳遞生物學活性分子的方式。在另一個實施方案中，嵌合蛋白質可以以擴散性的方式（例如皮下、靜脈內）的方式給藥。 -55- 201217527

構成了本發明多肽的Fc部分的恒定區結構域或其一部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，本發明的多肽可以包含衍生自IgGl分子的CH2結構域或其一部分、以及衍生自IgG3分子的CH3結構域或其一部分。在另一個實例中，多肽可以包含Fc部分，該部分包含部分衍生自IgGl 分子、以及部分衍生自IgG 3分子的鉸鏈結構域。如本文所列，本領域的一名普通技術人員應該理解的是，可以改變 Fc部分使得其氨基酸序列與天然形成的抗體分子不同。

在另一個實施方案中，本發明的多肽包含scFc區，該區域包含一個或多個截短的Fc部分，但是該部分足以賦予 Fc受體（FcR)結合Fc區的性質。例如，與FcRn結合的Fc結構域的部分（即，FcRn結合部分）包含EU編號的IgGl的大約氨基酸2 82 -43 8 (以及初級接觸位元點爲CH2結構域的氨基酸248、 250-257、 272、 285' 288、 290-291、 308-311 和314，及CH3結構域的氨基酸殘基248、250-257、272, 285、288、290-291、308-311 和 314)。因此，本發明的多肽的Fc部分可以包含或由FcRn結合部分構成。FcRn結合部分可以衍生自任何同種型（包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG 4 )的重鏈。在一個實施方案中，使用了得自人類同種型 IgGl的抗體的FcRn結合部分。在另一個實施方案中，使用了得自人類同種型IgG4的抗體的FcRn結合部分。在一個實施方案中，本發明的多肽缺少完整Fc區的一個或多個恒定區結構域，即，它們被部分或完全刪除。在某些實施方案中，本發明的多肽缺少完整的CH2結構域（

S -56- 201217527 ACH2構建體）。本領域的技術人員應該理解的是由於CH2 結構域對抗體的分解代謝的速率具有調控性質，所以所述之構建體是優選的。在某些實施方案中，本發明的多肽包含刪除了 CH2結構域的Fc區，該區域衍生自編碼了 IgGl人類恒定區結構域的載體（例如得自IDEC Pharmaceuticals，

San Diego ) (例如參見 WO 0 2 / 0 6 0 9 5 5 A2 和 W Ο 02/0 9 69 4 8Α2 )。該示例性的載體經過基因工程改造從而刪除了 CH2結構域，並提供了表達刪除了結構域的IgGl恒定區的合成載體。應該注意的是這些示例性的構建體優選的經過基因工程改造從而將結合CH3結構域與各個Fc結構域的鉸鏈區直接融合。在其他構建體中，理想的是在一個或多個構成部分Fc 部分之間提供隔離物部分。例如，隔離物部分可以置於鉸鏈區與CH2結構域之間和/或CH2和CH3結構域之間。例如，相容性的構建體可以被表達，其中CH2結構域被刪除，而保留的CH3結構域（合成的或非合成的）使用5-20個氨基酸隔離物與鉸鏈區連接。例如，加入這種隔離物以確保恒定區結構域的調控元件保持自由及可接近的，或者確保鉸鏈區保持撓性。優選的是，與本發明相容的任何連接體肽相對而言是非免疫原性的，並且不能妨礙scFc區的正確折疊。在某些實施方案中，本發明的多肽可以包含二聚體Fc 區’該區域包含具有相同、基本相同的序列組成的Fc部分 (本文稱爲“同源二聚體Fc區”）。在其他實施方案中， -57- 201217527 本發明的多肽可以包含二聚體Fc區，該區域包含具有不同的序列組成的至少兩個F c部分（即，本文稱爲“異源二聚體Fc區”）。在一個示例性實施方案中，所述之異源二聚體Fc區在第一Fc分包含氨基酸取代（例如在EU位置297處天冬醯胺的氨基酸取代），但是在第二Fc部分不包含氨基酸取代。

在某些實施方案中，所述之Fc區爲半糖基化的。例如，所述之異源具體scFc區可以包含第一糖基化的Fc部分（例如糖基化的C Η 2區）以及第二非糖基化的F c部分（例如非糖基化的CH2區）’其中連接體插在糖基化的和非糖蕋化的Fc部分之間。在其他實施方案中，所述之Fc區爲全部糖基化的，即，全部的Fc部分是糖基化的。在另一個實施方案中，所述之Fc區可以是非糖基化，即，Fc部分均未糖基化。

在某些實施方案中，例如通過氨基酸突變（例如加入 '刪除或取代）改變在本發明的多肽中使用的Fc部分。如本文所用，術語“變體Fc部分”是指這樣的Fc部分，該Fc 部分與衍生該F c部分的野生型F c相比具有至少一個氨基酸取代。例如，在所述之Fc部分衍生自人類IgG 1抗體的情況下，與人類IgGl Fc區的相應位置處的野生型氨基酸相比，變體包含至少一個氨基酸的突變（例如取代）。

Fc變體的氨基酸取代可以位於Fc部分中的位置處，該位置與抗體的Fc區中給定殘基的位置編號相應（如使用EU 編號協定列出）。本領域的技術人員可以容易地形成排列

S -58- 201217527 ，以確定與Fc部分中的位置相應的EU編號是什麼。在一個實施方案中’所述之Fc變體在位於鉸鏈結構域或其一部分中的氨基酸位置處包含取代。在另一個實施方

案中’所述之Fc變體在位於CH2結構域或其一部分中的氨基酸位置處包含取代。在另一個實施方案中，所述之Fc變體在位於CH3結構域或其一部分中的氨基酸位置處包含取代。在另一個實施方案中，所述之Fc變體在位於CH4結構域或其一部分中的氨基酸位置處包含取代。在某些實施方案中，本發明的多肽包含Fc變體，該變體包含多於1個的氨基酸取代。本發明的多肽可以包含（例如）2、3、4、5、0、7、8、9、10或更多的氨基酸取代。優選的是’所述之氨基酸取代通過彼此間隔至少1個氨基酸位置或者更多（例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或 1〇個氨基酸位置或者更多）而在空間上定位。更優選的是 ’經過基因工程改造的氨基酸通過間隔至少5、1 〇、1 5、 2〇個氣基酸而彼此遠離，從而在空間上定位。在一些實施方案.中，本發明的多肽包含Fc變體，該變體包含多於1個的氛基酸取代。本發明的多肽可以包含（例如）2、3、4 、5、6、7、8、9、10或更多的氨基酸取代。優選的是，所述之氛基酸取代通過彼此間隔至少1個氨基酸位置或更多（例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸位置或者更多）而在空間上定位。更優選的是，經過基因工程改3H的氨基酸通過間隔至少5、1〇、15、20或25或更多個氨基酸而彼此遠離，從而在空間上定位。 -59- 201217527 在某些實施方案中，所述之Fc變體使得由包含所述之野生型Fc結構域的Fc區所賦予的至少一種效應器功能發生變化（例如改善或降低Fc區結合Fc受體（例如FqRl、. FqRII或FqRIII)或補體蛋白質（例如Clq)的能力，或者引發了抗體依賴的細胞毒性（ADCC)、吞噬作用或補體依賴的細胞毒性（CD CC))。在其他實施方案中，所述之Fc變體提供了經過基因工程改造的半胱氨酸殘基。本發明的多肽可以使用本領域公認的Fc變體，已知該變體賦予了效應器功能和/或FcR或FcRn結合的變化（例如增強或降低）。具體而言，本發明的結合分子可以包括（例如）在國際 PCT 公開 W08 8/07089A 1、W Ο 9 6 / 1 4 3 3 9 A 1、 WO98/05 78 7A1 、 W098/23289A1 、 W099/51642 A1 . W099/58572A 1 、 WO00/09560A2 、 WOOO/3 2767 A1 WO00/42072 A2 、 WO02/442 1 5 A2 、 W002/0609 1 9 A2 · WO03/074569 A2 、 W O 0 4 / 0 1 6 7 5 0 A 2 、 W O 0 4 / 0 2 9 2 0 7 A 2 · W004/03 5752 A2 、 W004/063 3 5 1 A2 、 W O 0 4/0 7 44 5 5 A 2 , WO04/099249A2 、 W O 0 5 / 0 4 0 2 1 7 A 2 、 WO04/044859 ‘ W005/070963 A1 、W005/07798 1 A2 、 WO05/092925 A2 、 WO05/1 23780A2 、 WO06/0 1 9447 A 1 、 W O 0 6 / 0 4 7 3 5 0 A 2 < WO06/08 5967A2 ;美國專利公開 N o . U S 2 0 0 7/0 2 3 1 3 2 9、 US2007/023 1 3 29、US2 007/023 776 5、US200 7/0 23 7766 、 US2007/0237767 、 US2007/0243188 、 US20070248603 、 US20070286859 、 US20080057056 ；或美國專利 5,648,260 ；5,739,277 ； 5,834,250 ； 5,869,046 ； 6,096,871 ； -60- 201217527 6,121,022 ； 6,194,551 ； 6,242,195 ； 6,277,375 ； 6,528,624 ;6,538,124 ； 6,737,056 ； 6,821,505 ； 6,998,253 ；

7,083,784和7,317,091中所公開的一個或多個氨基酸位置處的變化（例如取代），其中所述之每一份文獻以引用方式併入本文。在一個實施方案中，可以在一個或多個所公開的氨基酸位置處形成所述之特定的變化（例如在本領域中公開的一個或多個氨基酸的特定取代）》在另一個實施方案中，可以在一個或多個所公開的氨基酸位置處形成不同的變化（例如在本領域中公開的一個或多個氨基酸位置的不同取代）。在某些實施方案中，本發明的多肽包含Fc部分的氨基酸取代，這種取代改變了所述抗體的非抗原依賴的效應器功能，特別是所述抗體的迴圈半衰期。當所述之多肽與缺少所述取代的多肽相比時，其表現出對FcRn的結合增強或減弱，因此在血清中分別具有增加 φ 或減少的半衰期。預計對FcRn的親和性得到改善的Fc變體具有較長的血清半衰期，並且這種分子（其中希望給藥多肽具有較長的半衰期）在治療哺乳動物的方法（例如治療慢性疾病或紊亂）中具有有用的用途（例如參見美國專利 7,348,004 ' 7,404,956 和 7,862,820 )。相反，希望 FcRn 的結合親和性降低的Fc變體具有較短的半衰期’並且這種分子還可以用於（例如）向哺乳動物給藥（其中縮短的迴圈時間可能是有利的（例如體內診斷成像））或者當其時多肽長期存在於迴圈中時會具有毒性副作用的情況中。此外’ -61 - 201217527

FcRn的結合親和性降低的Fc變體較少地可能穿過胎盤，並因此還可以用於治療妊娠婦女的疾病或紊亂。此外，需要降低的FcRn結合親和性的其他應用包括希望定位於腦、腎和/或肝臓的那些應用。在一個示例性實施方案中，本發明的多肽表現爲本發明的多肽由血管穿過腎小球上皮的運送減少。在另一個實施方案中，本發明的多肽表現爲由腦穿過血腦屏障（BBB)進入血管空間的運送減少。在一個實施方案中’ FcRn的結合被改變的多肽包含至少一個Fc部分 (例如一個或兩個Fc部分），該部分在Fc部分的“ FcRn結合環”內具有一個或多個氨基酸取代。所述之FcRn結合環由野生型全長Fc的氨基酸殘基280-299構成（根據EU編號 )。在其他實施方案中，FcRn的結合親和性被改變的多狀包含至少一個Fc部分（例如一個或兩個Fc部分），該部分在I5人FcRn的“接觸區”內具有—愐或多個氨基酸取代。如本文所用’術語1 5人FcRn的“接觸區”包括在野生型全長Fc部分的以下位置處的殘基：243-261，275-28 0, 282-293，3 02-319，336- 348，367，369，372-389，391，39 3, 408，424，425 -440 (EU編號）。在優選的實施方案中，FcR.n 的結合親和性被改變的本發明的多肽包含至少一個F c部分 (例如一個或兩個Fc部分），該部分在相應於以下EU位置的任何一處的氨基酸位置處具有一個或多個氨基酸取代： 256、 277-281 、 283-288、 303-309、 313、 338、 342、 376 、381、384、385、387、434 (例如 N4 3 4A 或 N4 3 4K)以及 43 8。改變了 FcRn的結合親和性的示例性氨基酸取代在國

•62- S 201217527 際PCR公開No· WO05/047327中有所公開，所述文獻以引用方式併入本文。

此外’本發明的多肽還包含改變了所述多肽的糖基化的本領域公認的氨基酸取代。例如，結合多肽的scpc區可以包含Fc部分’該部分具有導致糖塞化（例如n或〇連接的糖基化）減少的突變，或者結合多肽的scFc區可以包含野生型Fc部分的被改變的糖形（例如岩藻糖較少或不含岩藻糖的多糖）。在其他實施方案中，本發明的多肽包含至少一個Fc部分，該部分具有定位于暴露於溶劑的表面上的、經過基因工程改造的半胱氨酸殘基或其類似物。優選的是，所述之經過基因工程改造的半胱氨酸殘基或其類似物不含干擾由所述之scFc區賦予的效應器功能。更優選的是，所述之改變不含干擾scFc區與Fc受體（例如FcyRI、FcyRII或 FqRIII)或補體蛋白質（例如Clq )結合的能力，或者千擾scFc區引發免疫效應器功能（例如抗體依賴的細胞毒性 (ADCC)，吞噬作用或補體依賴的細胞毒性（CDCC))的能力。在一個實施方案中，本發明的未經加工的多肽可以包含基因融合的Fc區（即，scFc區），該區域具有獨立地選自本文所述之Fc部分的兩個或多個構成部分Fc部分。在一個實施方案中，二聚體Fc區的Fc部分是相同的。在另一個實施方案中，至少兩個Fc部分是不同的。例如，本發明多肽的Fc部分包含相同數量的氨基酸殘基’或者它們的長度 -63- 201217527

可以具有一個或多個氨基酸殘基（例如大約5個氨基酸殘基（例如1、2、3、4或5個氨基酸殘基）、大約10個殘基、大約15個殘基、大約20個殘基、大約30個殘基、大約40個殘基、或者大約5 0個殘基）的差異。在另一個實施方案中，本發明多肽的Fc部分可以在序列中在一個或多個氨基酸位置處不同。例如，至少兩個Fc部分在大約5個氨基酸的位置處（例如1、2、3、4或5個氨基酸位置）、大約1 0個位置處、大約15個位置處、大約20個位置處、大約30個位置處、大約40個位置處或者大約50個位置處不同。 B.多肽連接體

本發明的遺傳構建體編碼了多肽，該多肽包含通過 cscFc連接體連接的兩個或多個Fc結構域或部分，從而形成了在單一多肽鏈中包含的Fc區。所述之cscFc連接體位於至少一個酶切位點（例如由細胞內的酶加工的位點）的一側。對所述多肽的至少一個酶切位點進行切割得到了包含至少兩條多肽鏈的多肽。這些連接體在本文中被稱爲“ scFc連接體”並且該scFc連接體插在包含該連接體的多肽的兩個Fc部分之間。如果scFc連接體在線性多肽序列中連接兩個相鄰的Fc部分，則其爲“直接”連接。相反，所述之scFc連接體可以連接第一Fc部分與結合部分，而結合部分轉而連接第二Fc部分，由此形成了間接連接。如上文所列，其他多肽連接體可以可任選地用於本發明的構建體中，例如連接生物學活性部分與Fc部分。這些

S -64- 201217527 多肽連接體在本文中被稱爲隔離物。可以與本發明相關使用的隔離物的一些示例性定位包括（例如）包含GlySer氨基酸的多肽，例如附圖以及下文更加詳細描述的列出的那些。

在一個實施方案中，所述之多肽連接體爲合成的，即非天然形成的。在一個實施方案中，多肽連接體包括包含氨基酸序列的肽（或多肽）（其可以或不可以是天然形成的），其中所述之氨基酸序列將氨基酸的第一線性序列與氨基酸的第二線性序列連接或基因融合，這種連接或基因融合並非是天然連接的或者是自然界中基因融合的。例如 ’在一個實施方案中，所述之多肽可以包含非天然形成的多肽，該多肽爲天然形成多肽的修飾形式（例如包含突變，例如加入、取代或刪除）。在一個實施方案中，所述之多肽連接體可以包含非天然形成的氨基酸。在另一個實施方案中，所述之多肽連接體可以包含天然形成的氨基酸，該氨基酸是在非自然界中形成的線性序列中形成的。在另一個實施方案中，所述之多肽連接體可以包含天然形成的多肽序列。在某些實施方案中，多肽連接體可以用於融合一致的 Fc部分’由此形成同源聚體的scFc區》在其他實施方案中· ，多肽連接體可以用於融合不同的Fc部分（例如野生型Fc 部分和Fc部分的變體），由此形成異源聚體的scFc區。在另一個實施方案中，多肽連接體包含或由gly-ser連接體構成。在一個實施方案中，cscFc連接體至少包含免 -65- 201217527

疫球蛋白較鏈和gb-ser連接體的一部分。如本文所用’術語“ gly-ser連接體”是指由甘氨酸和絲氨酸殘基構成的肽。示例性的gly/ser連接體包含式（Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 4)所示的氨基酸序列，其中n爲正整數（例如1、2、3、4 、5、6、7、8、9或10)。優選的gly/ser連接體爲 (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO:29)、（Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:6)或 (Gly4Ser)6 (SEQ ID NO: 5)。另一個示例性的 gly-ser連接體爲GGGSSGGGSG ( S E Q ID NO : 3 0)。在某些實施方案中，所述之gly-ser連接體可以插在兩條其他多肽連接體序列 (例如本文所述之任何一種多肽連接體序列）之間。在其他實施方案中，gly-ser連接體與另一種多肽連接體序列（例如本文所述之任何一種多肽連接體序列）的一個或兩個末端連接。在其他實施方案中，兩個或多個gly-ser連接體以連續的方式倂入到多肽連接體中。在一個實施方案中，本發明的多肽連接體包含上游鉸鏈區（例如衍生自I g G 1、 IgG2、IgG3或IgG4分子）的至少一部分、中游鉸鏈區（例如衍生自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4分子）的至少一部分以及一系列gly/ser氨基酸殘基（例如gly/ser連接體，例如 (Gly4Ser)n (SEQ ID NO:4))。本發明的多肽連接體的長度爲至少1個氨基酸，並且長度可以爲變化的。在一個實施方案中，本發明的多肽連接體的長度爲大約1至大約50個氨基酸。如這一方面所用 ’術語大約表示+/-2個氨基酸殘基。由於連接體的長度必須爲正整數’所以長度爲大約1至大約5 〇個氨基酸的

S -66 - 201217527

長度是指長度爲1-3至48-52個氨基酸的長度。在另一個實施方案中，本發明的多肽的長度爲大約10-20個氨基酸。在另一個實施方案中，本發明的多肽的長度爲大約15至大約5 0個氨基酸。在另一個實施方案中，本發明的多肽連接體的長度爲大約20至大約45個氨基酸。在另一個實施方案中，本發明的多肽連接體的長度爲大約15至大約35、或者大約2〇至大約30個氨基酸。在另一個實施方案中，本發明的多肽連接體的長度爲大約1、2、3、4、5、6、7、8、9 、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 40、 50或60個氨基酸。在一個實施方案中，本發明的肽連接體的長度爲2 0或 3〇個氨基酸。可以使用本領域已知的技術將多肽連接體引入到多肽序列中。可以通過DN A序列分子來證實修飾情況。質粒 φ DNA可以用於轉化宿主細胞以用於穩定地生產所產生的多肽。 C.酶切位點在一個實施方案中，一個或多個酶切位點位於本發明未經加工的多肽的cscFc連接體（L)的一側（即，與其相鄰（其上游或下游）），從而形成可切割的scFc連接體。例如，在編碼本發明的多肽的構建體的一個實施方案中，切割位點與cscFc連接體（L)的一個或兩個末端融合。例如，在一 -67- 201217527 個實施方案中，所述之多肽由下式表示： A-Fl-P1-L-P2-B-F2 (I)

其爲由氨基末端至羧基末端的線性序列，其中A爲生物學活性部分，F1爲第一Fc部分或結構域，pi爲酶切位點，L爲cscFc連接體，P2爲酶切位元點，B爲生物學活性部分’ F2爲第二Fc部分或結構域，而表示肽鍵。式⑴ 至少包含A或B、以及可任選的是包含這二者。如果八和8 都存在，則它們可以相同或不同。式（I)至少包含P1或P2、以及可任選的是包含這二者。如果P 1和P 2都存在，則它們可以相同或不同。式（I)至少包含F1或F2。如果F1和F2都存在，則它們可以相同或不同。在一個實施方案中，P1和 P2都存在，並且被相同的或不同的酶所識別》

在一個實施方案中，一個或兩個酶切位點爲弗林蛋白酶家族的成員（例如弗林蛋白酶、PC2、PC1/PC3、PC4 · PACE4、PC5/PC6 以及 LPC/PC7/PC8/SPC7 )所識 glj 的細胞內加工位點。該家族的酶的示例性切割位點包括具有基元 Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO:34)的氨基酸序歹IJ。其他的切割位點是本領域已知的。在另一個實施方案中，因數XI a或Xa切割位點可以被引入到本發明的構建體中。示例性的FXIa切割位點包括（例如）TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位點包括（例如）DFLAEGGGVR 、 TTKIKPR 、

-68- S 201217527 LVPRG(SEQ ID N O : 3 5)，並且包含或由A LRP R (例如 ALRPRVVGGA)構成的序歹[J。

在一個實施方案中，所述連接體的一些部分在至少一個酶切位點被切割後得以保留。爲了使外源氨基酸序列的存在最少，本發明的多肽中可以包括兩個切割位點。在一些實施方案中，所有或基本所有的連接體都被切除，然而在一些實施方案中，一部分切割位點可以保留，例如 RRRR切割位點的4個精氨酸〇 D.生物學活性部分本發明的多肽包含至少一個生物學活性部分。單鏈形式的此類部分可以爲生物學活性的，或者可能需要與另外的多肽鏈結合（例如通過二聚化），或者可能需要經過酶切而賦予生物學活性。本發明的多肽可以僅包含一個生物學活性部分（創建一種分子，就生物學活性部分而言，該分子是一價的，但是就在經過加工或切割之後存在的多肽鏈數量而言，所述分子是多聚體的（例如二聚體的））。該分子的實例示於US 7404956中，該文獻以引用方式全文倂入本文。在一個實施方案中，生物學活性部分與Fc部分的C末端和/或N末端可操作地連接（例如通過多肽連接體），或者通過肽鍵直接連接。在某些實施方案中，本發明的多肽可以包含兩個或多個生物學活性部分。在一個實施方案中 ’所述之生物學活性部分是一致的。在另一個實施方案中 -69- 201217527 ，所述之生物學活性部分是不同的’或者均爲一個功能分子的分開的亞單元或鏈。

在某些方面中，本發明的多肽包含多於1個的生物學活性部分，並且是多價的，即，具有第一生物學活性的至少1個生物學活性部分以及具有第二生物學活性的至少1個第二生物學活性部分。在某些實施方案中，本發明的至少 1個生物學活性部分爲抗體的抗原結合區或者其抗原結合片段（例如上文所述之抗體或抗原結合片段）。

在其他實施方案中，兩個或多個相同或不同的生物學活性部分以連續的方式彼此連接（例如通過多狀連接體），並且串聯式陣列的生物學活性部分與單一的基因融合的 Fc區（即，單一的scFc區）或串聯式陣列的基因融合的Fc 區（即，串聯的scFc區）的C末端或N末端可操作地連接（例如化學綴合或基因融合（例如直接方式或者通過多肽連接體））。在其他實施方案中，串聯式陣列的生物學活性部分與單一的基因融合的Fc區或串聯式陣列的基因融合的 Fc區的C末端和N末端可操作地連接。在一個實施方案中，本發明的多肽包含至少一個生物學活性部分’該部分爲抗原結合位元點（例如抗體、抗體變體或抗體的片段的抗原結合位點）'配體的受體結合部分或者受體的配體結合部分。在一個實施方案中’所述之生物學活性部分調節了細胞的活化或抑制（例如通過與細胞表面的受體結合並使得活化或抑制丨§虛的傳輸）。在一個實施.方案中，所述之生

S -70- 201217527

物學活性部分能夠啓動信號的傳導，所述之信號能夠導致細胞死亡（例如通過細胞信號誘導途徑，通過補體結合或暴露于結合分子上存在的負載（例如毒性負載）），或者調節受試者的疾病或紊亂（例如通過介導或促進細胞的殺死、促進纖維蛋白血塊的溶解或促進血塊的形成、或者通過調節可生物利用的物質的量（例如通過增加或減少受試者中配體（例如TNF )的量））。在另一個實施方案中，本發明的多肽具有至少1個對抗原（被靶向以便減少或消除，例如細胞表面抗原或可溶性抗原）具有特異性的結合位點，以及至少1個基因融合的Fc區（即，scFc區）。在另一個實施方案中，本發明的生物學活性部分與耙向分子（例如抗原）的結合導致靶向分子或表達該分子的細胞減少或消除（例如由組織或由迴圈中）。在另一個實施方案中’所述之生物學活性部分具有至少1個對靶向分子具有特異性的結合位點’該位點用於檢測靶向分子的存 φ 在情況（例如檢測污染物或者診斷狀況或紊亂）。在另一個實施方案中，生物學活性部分包含至少i個結合位點，該位點使得所述之分子靶向受試者中的特異性位點（例如腫瘤細胞、免疫細胞或血塊）。示例性的生物學活性部分在下文中進一步討論。 i.抗原結合蛋白在某些實施方案中，本發明的多肽包含至少1個生物學活性部分，該部分爲結合位元點，例如抗體的抗原結合 -71 - 201217527 部分。

在其他實施方案中，本發明的多肽結合位點可以包含抗體的抗原結合部分。術語“抗原結合部分”是指免疫球蛋白、抗體或抗體變體的多肽片段，其中所述之抗體變體會結合抗原，或者與完整的抗體（即，與衍生出這些抗體變體的完整抗體）競爭抗原的結合（即，特異性結合）（，例如，所述之抗原結合部分可以衍生自任何—種本領域已知的抗體或抗體變體》可以通過本領域公知的重組或生物化學方法來生產抗原結合部分。示例性的抗原結合片段包括 VH 和 VL 區、Fv、Fab、Fab，以及（Fab’）2。

在示例性的實施方案中，編碼本發明多肽的基因構建體包含編碼至少1個抗原結合片段的核苷酸序列，其中所述之片段可操作地與基因融合的Fc區（即，scFc區）的C 末端和/或N末端連接（例如化學綴合或基因融合（例如直接融合或者通過多肽連接體融合））。在一個示例性的實施方案中’本發明的未成熟多肽包含抗原結合片段（例如 Fab )，該片段可操作地與至少1個基因融合的Fc區的n末端（或C末端）通過鉸鏈結構域或其一部分（例如IgGl鉸鏈或其一部分，例如人類IgG 1鉸鏈）可操作地連接。示例性鉸鏈結構域部分包含序歹！j DKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO: 28)。在其他實施方案中，本發明的生物學活性部分可以包含得自單鏈結合分子（例如單鏈可變區或scFv )的結合位點。可以採用針對單鏈抗體的生產所描述的技術（美國專

S -72- 201217527 利 No. 4,694,778 ； Bird, Science 242:423-442 (1988)；

Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5 8 79-5 8 83 ( 1 9 8 8);以及 Ward et al·，Nature 3 34:544-554 ( 1 989))來生產單鏈分子。單鏈抗體是通過氨基酸橋連接Fv區的重鏈和輕鏈片段而形成的，從而得到單鏈抗體。還可以使用在 E. coli中組裝功能Fv片段的技術（Skerra et al.，Science 242:1038-1041 (1988))。

單鏈可變區序列包含具有一個或多個抗原結合位點的單一多肽，例如通過撓性連接體與VH結構域連接的vL結構域。所述之VL和/或VH結構域可以衍生自任意一種上文所述之抗體或抗體變體。scFv分子可以以VH-連接體-VL取向或VL-連接體-VH取向構建的。連接VL和VH結構域（構成了所述之抗原結合位點）的撓性連接體優選的是包含大約10 至大約50個氨基酸殘基。在一個實施方案中，所述之多肽連接體爲gly-ser多肽連接體。示例性的gly/ser多肽連接體爲式（Gly4Ser)n，其中η爲正整數（例如1，2，3，4，5或6) 。其他多肽連接體是本領域已知的。具有單鏈可變區序列 (例如單鏈Fv抗體）的抗體以及製備所述單鏈抗體的方法是本領域已知的（例如參見Ho et al. 1 989. Gene 77:51;

Bird et al. 1 9 8 8 Science 2 4 2:423; Pantoliano et al. 1991.

Biochemistry 3 0:10117; Milenic et al. 1991. Cancer

Research 5 1:63 63; T akkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:83 7 )。在某些實施方案中，在本發明的多肽中使用scFv分子 -73- 201217527

爲穩定的scFv分子。在一個實施方案中，穩定的cFv分子可以包含插在VH結構域和VL結構域之間的scFv連接體，其中VH結構域和VL結構域是通過Vh結構域中的氨基酸與結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接的。在其他實施方案中，穩定的scFv分子可以包含具有最佳的長度或組成的 scFv連接體。在其他實施方案中，穩定的scFv分子可以包含具有至少1個穩定的氨基酸取代的乂11或VL結構域。在另一個實施方案中，穩定的scFv分子可以具有至少兩個上文所列的穩定特徵。

穩定的scFv分子具有改善的蛋白質穩定性，或者賦予了它可操作地連接的多肽以改善的蛋白質穩定性》與常規的多肽相比，本發明的優選的scFv連接體將本發明的多肽的熱穩定性改善至少大約2 °C或3 t。例如，可以在本發明的scFv分子之間進行比較。在某些優選的實施方案中，穩定的scFv分子包含連接VH氨基酸44和Vl氨基酸100的 (Gly4Ser)4 scFv連接體和二硫鍵。可以在本發明的多肽中使用的其他示例性的穩定的scFv分子在美國臨時專利申請 No. 60/873,996 (2006年12月8曰提交）或美國專利申請 No. 11/725，970 (2007年3月19日提交）中有所描述，其中每一份文獻均以引用方式併入本文。在某些示例性的實施方案中，本發明的多肽包含至少 1個與基因融合的Fc區（即，scFc區）的C末端和/或N末端可操作地連接（例如化學綴合或基因融合（例如直接融合或通過多肽連接體融合））的scFv分子。在一個示例性的 -74-

S 201217527 實施方案中’本發明的多肽包含至少1個scFv分子（例如 —個或多個穩定的scFv分子），該分子通過gly/ser連接體與至少1個基因融合的Fc區的N末端（或C末端）可操作地連接。本發明的多肽可以包含使用本領域公認的方法衍生自抗體的可變區或其一部分（例如VL和/或VH結構域），或者可以使用標準的分子生物學技術得自本領域公認的抗體此外，本領域的那些技術人員還應該意識到編碼抗體的可變結構域的DN A還可以使用本領域已知的方法而衍生自在噬菌體、酵母菌或細菌中表達的抗體文庫。示例性的方法在（例如）EP 3 68 684 B1;美國專利No. 5,969,1 08 ;

Hoogenboom et a 1., (2000) Immunol. Today 21:371; Nagy et al. (2002) Nat. Med. 8:801; Huie et al. (2001 ), PNAS, 98:2682; Lui et al. (2002)，J. Mol. Biol. 3 1 5:1 063 中列出，其中每一份文獻均以引用方式倂入本文。多個出版物（例如 Marks et al· (1 992)，Bio/Technology 1 0:779-78 3 )已

經描述了通過鏈改組、以及組合感染及體內再結合來生產高親和性的人類抗體以作爲構建大型噬菌體文庫的方法。在另一個實施方案中，核糖體展示可以用於替代噬菌體作爲展示平臺（例如參見Hanes，etal.(1998)，PNAS 9 5:1 4 1 30; Hanes and Pluckthun. (1 999)， Curr. Top. Microbiol. Immunol. 243:1 07; He and Taussig. (1997)，

Nuc. Acids Res., 25:5 1 32; Hanes et al. (2000), Nat. -75- 201217527

Biotechnol. 1 8:1 2 8 7; Wilson et al. (200 1 )， PNAS， 9 8:3750;或 Irving et al. (200 1 ) J. Immunol. Methods 248:31)。

此外，用於生產本發明的生物學活性部分的可變區序列可以得自大量不同的來源。例如，如上文所述，多種人類基因序列可得自公共可得的保藏所。已經公開了許多抗體以及編碼抗體的基因的序列，並且可以使用本領域公認的技術由所述之這些序列來化學合成合適的可變區序列（例如VL和VH序列）。此外，本發明的生物學活性部分可以包含衍生自完整的鼠科，完整的人類，嵌合的、人源的、去免疫（ deimmunized )的非人類靈長動物或靈長目源抗體的可變結構域或CDR。

可以衍生出結合位點以用於本發明的分子的示例性抗體是本領域已知的。例如，目前FDA認可的抗體可以用於衍生結合位點。在一個實施方案中，本發明的多肽與用於治療癌症的分子結合。在其他實施方案中，本發明的生物學活性部分與用於治療自身免疫或炎性疾病或紊亂的分子結合。例如’多肽可以結合免疫細胞（例如Β或Τ細胞）上存在的抗原或者造成自身免疫疾病或素亂的自身抗原。與自身免疫或炎性紊亂有關的抗原可以爲上文所述之腫瘤相關性抗原。因此’腫瘤相關性抗原還可以爲自身免疫或炎性 -76-

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相關性紊亂。如本文所用，術語“自身免疫疾病或紊亂” 是指其中免疫系統攻擊肌體的自身細胞、從而導致受試者中的組織被破壞的紊亂或狀況。自身免疫疾病包括：普通的自身免疫疾病，即，其中所述之自身免疫反應在大量的組織中同時發生；器官特異性自身免疫疾病，即，其中所述之自身免疫反應靶向單一的器官。可以通過本發明的方法或組合物診斷、預防或治療的自身免疫疾病的實例包括但不限於Crohn疾病；炎性腸病（IBD);系統性紅斑狼瘡 :潰瘍性結腸炎；風濕性關節炎；肺出血腎炎綜合征； Grave疾病；慢性淋巴細胞性甲狀腺炎；尋常性天皰瘡；重症肌無力；硬皮病：自身免疫溶血性貧血：自身免疫血小板減少性紫癜；多肌炎和皮肌炎；惡性貧血；Sj6gren綜合症；關節黏連脊椎炎；脈管炎；I型糖尿病；神經紊亂、多發性硬化症以及由自身免疫疾病引起的繼發性疾病。在其他實施方案中，與靶向分子結合的本發明的生物學活性部分與炎性疾病或紊亂有關。如本文所用，術語“ 炎性疾病或紊亂”包括至少部分是由炎症引起或惡化的疾病或紊亂，例如血液流速的增加、水腫、免疫細胞的活化 (例如增殖、細胞因數的產生或吞噬作用的增強）。例如 ’本發明的多肽可以在異常量（例如可以有利於改變（例如有益於受試者的量））的區域中所涉及或存在的炎性因數（例如基質金屬蛋白酶（MMP)，TNFa,白細胞介素，血漿蛋白質，細胞因數，脂質代謝物，蛋白酶，毒性基團，線粒體蛋白質，細胞凋亡蛋白質，黏附分子等）結合。炎 •77- 201217527 症過程爲活體組織對損傷的應答。炎症的起因是由於物理損傷、化學物質、微生物、組織壞疽、癌症或其他試劑。急性炎症持續時間短，例如僅持續幾天。但是，如果炎症持續較長的時間，則可以稱爲慢性炎症。

炎性紊亂包括急性炎性紊亂、慢性炎性紊亂以及復發性炎性紊亂。急性炎性紊亂通常持續相對短的時間，並且持續大約幾分鐘至大約1至2天，但是它們可以持續幾個星期。急性炎性紊亂的主要特徵包括血液流速的增加，液體和血漿蛋白質的滲出（水腫）以及白細胞（例如嗜中性粒細胞）的遷移。慢性炎性紊亂通常持續較長的時間，例如幾星期至幾個月' 至幾年、甚至更長，並且在組織學上與淋巴細胞和巨噬細胞的存在有關並與血管和結締組織的增殖有關。復發性炎性紊亂包括在一段時間後復發或者週期性陣發的紊亂。復發性炎性紊亂的實例包括哮喘和多發性硬化症。一些紊亂可以落入一個或多個類別。炎性紊亂通常表徵爲發熱、發紅、腫脹、疼痛及功能喪失。炎性紊亂的起因的實例包括但不限於：微生物感染（例如細菌、病毒和真菌感染），物理試劑（例如燃燒、輻射和創傷），化學試劑（例如毒素和腐蝕性物質），組織壞疽以及多種類型的免疫應答。炎性紊亂的實例包括但不限於：骨關節炎，風濕性關節炎，急性或慢性感染（細菌、病毒和真菌） ;急性和慢性支氣管炎，鼻寶炎以及其他呼吸道感染（包括普通感冒）：急性和慢性腸胃炎和大腸炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎：急性呼吸窘迫綜合症；囊腫性纖維化；

S -78- 201217527 急性和慢性皮炎；急性和慢性結膜炎；急性和慢性漿膜炎 (心包炎，腹膜炎，滑膜炎，胸膜炎和腱炎）；尿毒癥性心包炎；急性和慢性膽囊炎；急性和慢性陰道炎；急性和慢性葡萄膜炎；藥劑反應：以及燒傷（熱，化學和電）。在其他實施方案中’本發明的生物學活性部分與可用於治療神經疾病或紊亂的分子結合。例如，多肽可以與神經細胞（例如神經元、神經膠質細胞或）上的抗原結合。 φ 在某些實施方案中，與神經紊亂有關的抗原可以爲上文所述之自身免疫或炎性紊亂。如本文所用，術語“神經疾病或紊亂”包括受試者中神經系統退化（例如神經退行性紊亂）的紊亂或狀況’以及神經系統不能適當地發育或者在損傷（例如脊髓損傷）之後不能再生的紊亂。可以通過本發明的方法和組合物來診斷、預防或治療的神經紊亂的實例包括但不限於多發性硬化症、Huntington疾病、 Alzheimer疾病、Parkinson疾病、神經性疼痛、創傷性腦 φ 損傷' 合症以及慢性脫髓鞘多發性神經炎 (CIDP)。在其他方面中，本發明的生物學活性部分可以包含衍生自修飾形式的抗體的抗原結合位點或其一部分。示例性的此類抗體包括（例如）微型抗體、雙體、三體、納米抗體、路駿抗體、Dab、四價抗體、內雙體（例如jen<jreyko et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:478 1 3 )、融合蛋白質（例如抗體細胞因數融合蛋白質、與Fc受體的至少一部分融合的蛋白質）以及雙特異性抗體。其他經修飾的抗體在（例 -79- 201217527 如）美國專利 No. 4,745,055; EP 256,654; Faulkner e:t al.，Nature 298:286 ( 1 982) ； EP 120,694 ； EP 1 2 5,023 ； Morrison, J. Immun. 1 2 3:793 (1979); Kohler et a 1., Pro c：. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980) ; Raso et al·，Cancer Res. 41:2073 ( 1 98 1 ) ; Morrison et al., Ann. Rev. ImmunoL 2:239 ( 1 984) ； Morrison, Science 229:1 202 ( 1 985)；

Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:68 5 1 (1984); EP 255,694; EP 266,663 以及 WO 88/03559 中有所描述。重配的免疫球蛋白鏈也是已知的。例如參見美國專利 No. 4,444,878; WO 88/03565;以及 EP 68,763，並且本文引用了這些參考文獻。

在另一個實施方案中，本發明的生物學活性部分包含作爲雙體或由其衍生的抗原結合位點的抗原結合位元點或區域。雙體爲二聚化的四價分子，每個分子都具有與scFv 分子相似的多肽，但是通常具有連接兩個可變結構域的短 (例如少於1 〇個，並且優選爲1 -5個）的氨基酸殘基連接體，使得同一多肽鏈上的VL和VH結構域不能相互作用。而且，一條多肽鏈的VL和VH結構域與第二多肽鏈上的VH和 VL結構域（分別）結構域相互作用（例如參見WO 0 2/0 2781)。在一個實施方案中，本發明的爲成熟多肽包含與至少1個基因融合的Fc區（即，scFc區）的N末端和/ 或C末端可操作地連接的雙體。在某些實施方案中，本發明的生物學活性部分包含與 scFc連接的單一的結構域結合分子（例如單—的結構域抗

S -80- 201217527 體）°示例性的單一結構域分子包括不具有輕鏈可變結構域的抗體的、經分離的重鏈可變結構域（vH)(即，重鏈可變結構域）以及不具有重鏈可變結構域的抗體的、經分離的輕鏈可變結構域（VL)(即，輕鏈可變結構域）。在本發明的分子中使用的示例性單結構域抗體包括（例如）在 Hamers-Casterman，et al·，Nature 3 63:446-448 ( 1 993 )和

Dumoulin，et al.，Pro tein S ci ence 1 1 : 5 00- 5 1 5 (2 002)中所

述之駱駝重鏈可變結構域（大約118至136氨基酸殘基。其他示例性的單結構域抗體包括單一的VH或VL結構域，也稱爲Dabs® (Domantis Ltd·，Cambridge，UK)。但是，其他單結構域抗體包括鯊魚抗體（例如鯊魚Ig-NAR )。鯊魚 Ig-NAR包含具有1個可變結構域（V-NAR)和5個C樣的恒定結構域（C-NAR)的同源二聚體，其中多樣性集中于長度在5 至23個殘基之間變化的延長的CDR3區。在駱駝物種（例如美洲駝）中，被稱爲VHH的重鏈可變區形成了完整的抗原結合結構域。駱駝VHH可變區與衍生自傳統抗體的那些可變區（VH)之間的主要差異包括：（a)與VHH中相應的區域相比，在VH的輕鏈接觸表面上具有更高疏水性的氨基酸；（b)VHH中較長的CHR3;以及（C)VHH中， CDR1與CDR3之間頻繁形成二硫鍵。製備單結構域分子的方法在美國專利No. 6.005,〇79和6,765,087中有所描述，這兩份文獻均以引用方式倂入本文。包含VHH結構域的示例性單結構域抗體包括Nanobodies® (Ablynx NV，Ghent,

Belgium) -81 - 201217527 在一個實施方案中個，生物學活性部分包含與ΤΝ A受體家族成員結合的抗體的抗原結合部分》多種TNF受'體家族成員的核苷酸和氨基酸序列是本領域已知的，並且至少包括29個人類基因：TNFRSF1A (TNFR1，也稱爲DR1， CD 120a, TNF-R-I p55, TNF-R, TNFRI, TNFAR, TNF-R55, p55TNFR, p55R或 TNFR60, GenBank GI No. 45075 75;還可以參見 US 5,3 95,760))，TNFRSF1B (CD120b,也稱爲 p75, TNF-R, TNF-R-II, TNFR80, TN F R 2 , T N F - R 7 5 , TNFBR 或 p75TNFR; GenBank GI No. 4507577)， TNFRSF3 (淋巴毒素 β受體（LTPR)，也稱爲 TNFR2-RP，CD 1 8, TNFR-RP, TNFCR 或 TNF-R-III; GI No. 450503 8 和 200722 1 2), TNFRSF4 (0X40,也稱爲 ACT35, TXGP 1 L,或 CD134 抗原； GI No. 4507579 和 8926702)，TNFRSF5 (CD40,也稱爲 p50 或 Bp50; GI No. 450758 1 和 23 3 1 237 1 ), TNFRSF6 (FAS,也稱爲 FAS-R, DcR-2, DR2, CD95, APO-1 或 ΑΡΤΙ; GenBank GI No. 4507583, 23510421， 23510423， 23510425, 23 5 1 0427，23 5 1 0429，235 1 043 1 fP 235 1 0434)), TNFRSF6B (DcR3, DR3; GenBank GI No. 4507569, 23200021, 23200023, 23200025, 23200027, 23200029, 23200031, 23200033, 23200035, 23200037 和 23200039), TNFRSF7 (CD27,也稱爲 Tp55 或 S152; GenBank GI No. 4507587), TNFRSF8 (CD30,也稱爲 K i - 1 或 D 1 S 1 6 6 E ; G en B ank G I N o . 4507589 和 23 5 1 043 7)，TNFRSF9 (4-1 -BB,也稱爲 CD137 或 ILA; GI No. 5730095和 72873 8)，TNFRSF1 0A (TRAIL-R1, -82- 201217527 也稱爲 DR4 或 Apo2; GenBank GI No. 2 1 36 1 086)， TNFRSF1 OB (TRAIL-R2,也稱爲 DR5，KILLER，TRICK2 A 或 TRICKB; GenBank GI No. 225471 1 6 和 225471 1 9)， TNFRSF10C (TRAIL-R3,也稱爲 DcRl, LIT 或 TRID; GenBank GI No. 225471 21 ), TNFRSF10D (TRAIL-R4,也稱爲 DcR2 或 TRUNDD)，TNFRSF1 1A (RANK; GenBank GI No. 4507565;參見美國專利No. 6,562,948; 6,537,763;

6,528,482; 6,479,63 5; 6,27 1,349; 6,0 1 7,729), TNFRSF1 1 B (骨保護素（〇PG)，也稱爲 OCIF 或 TR1; GI No. 3 8 53 0 1 1 6, 22547 1 22 和 3 3 8 78056)，TNFRSF12 (轉位鏈-結合膜蛋白 (TRAMP),也稱爲 DR3，WSL-1，LARD，WSL-LR，DDR3, TR3, APO-3, Fnl4或 TWEAKR; GenBank GI No. 77061 86; 美國專利申請公開 No. 2004/0033225A1), TNFRSF12L (DR3L), TNFRSF13B (TACI; GI No. 691 2694), TNFRSF13C (BAFFR; GI No. 1 6445027), TNFRSF 14 (皰疹病毒侵入介質（HVEM)，也稱爲 ATAR，TR2, LIGHTR或 HVEA; GenBank GI No. 2320004 1 , 1 2803895¾ 3 87882 1 ), TNFRSF1 6 (低親和性神經生長因數受體（LNGFR)，也稱爲神經營養因數受體或 p75(NTR); GenBank GI No. 1 28 1 5 6 和 45 053 93 )， TNFRSF 1 7 (BCM,也稱爲 BCMA; GI No. 2323 8 1 92), TNFRSF1 8 (AITR,也稱爲 GITR; GenBank GI No. 4759246, 23238194 ¾ 23238197), TNFRSF19 (Troy/Trade, 也稱爲 TAJ; GenBank GI No. 2323 8202 和 2323 8204), TNFRSF20 (RELT,也稱爲 FLJ 1 4993; GI No. 2 1 3 6 1 8 73 和 -83- 201217527 2323 8200)，TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (SOBa,也稱爲

Tnfrh2 和 2 8 1 0028K06Rik),以及 TNFRSF23 (mSOB,也稱爲 Tnfrhl)。其他 TNF 家族膜包括 EDAR1 (Ectodysplasin A 受體，也稱爲 Downless (DL), ED3, ED5, ED 1R, ED A3, ED A 1 R, EDA-A 1 R; GenBank GI No. 11641231;美國專利 No. 6,3 5 5,78 2)，XEDAR (也稱爲 EDA-A2R; GenBank GI No. 1 1 1 40823 );以及 CD39(GI No. 2135580和 765256)。

Π.非免疫球蛋白結合分子

在某些其他的實施方案中，本發明的生物學活性部分包含一個或多個衍生自非免疫球蛋白結合分子的結合位點。如本文所用，術語“非免疫球蛋白結合分子”爲這樣的結合分子，該分子的結合位點包含衍生自除了免疫球蛋白以外的多肽的部分（例如支架或構架），而且該部分可以經過基因工程改造（例如突變）從而賦予所需的結合特異性。並非衍生自抗體分子的生物學活性部分的其他實例包括在下文中更加詳細討論的受體結合位點和配體結合位點非免疫球蛋白的生物學活性部分可以包含衍生自非免疫球蛋白的免疫球蛋白超家族成員的結合位元點部分（例如T細胞受體或細胞黏附蛋白（例如CTLA-4，N-CAM，端蛋白（telokin)))。此類結合分子包含保留了免疫球蛋白折疊的構造、並能夠特異性地結合IGF 1-R抗原決定部位。在其

S -84 - 201217527 他實施方案中，本發明的非免疫球蛋白結合分子還包含具有蛋白質拓撲學的結合位點，該位點並非基於免疫球蛋白的折疊（例如錨蛋白重複蛋白或纖連蛋白），但是該位點能夠特異性地結合靶（例如IGF-1R抗原決定部位）。

非免疫球蛋白生物學活性部分可以通過由結合分子文庫（具有以人工方式多樣化的結合位元點）中選擇或分離靶結合變體來鑒定。可以使用完全隨機的方法（例如錯誤傾向PCR、外顯子改組或定向進化）來生成多樣化的文庫，或者通過本領域認可的設計方案來輔助。例如，可以通過在編碼結合位元點的核酸中的相應位置處插入簡並密碼子、三核苷酸、隨機肽或完整的環而使得在結合位點與其同源靶分子相互作用時通常所涉及氨基酸位置隨機化（例如參見美國公開No. 20040 1 32028 )。氨基酸位置的定位可以通過硏究與靶分子絡合的結合位元點的晶體結構來識別。用於隨機化的備選位置包括環、平坦表面、螺旋以及結合位點的結合腔。在某些實施方案中，具有可能備選用於多樣化的結合位點中的氨基酸可以通過它們與所述之免疫球蛋白折疊的同源性來識別。例如，可以使纖連蛋白的 CDR狀的環的殘基隨機化，從而形成纖連蛋白結合分子的文庫（例如參見 Koide et al.，J. Mol. Biol.，284: 1141-1 1 5 1 ( 1 998))。可以隨機化的結合位元點的其他部分包括平坦的表面。在隨機化後，接著對多樣化的文庫進行選擇或者篩選過程，從而得到具有所需的結合特徵的結合分子，所述之特徵例如爲與上文所述之IGF-1R抗原決定部分的 -85- 201217527 特異性結合。例如，可以通過本領域認可的方法（例如噬菌體展示、酵母菌展示或者核糖體展示）來進行選擇。

在一個實施方案中，生物學活性部分衍生自纖連蛋白結合分子。纖連蛋白結合分子（例如包含I型、II型或III 型結構域的分子）展示出CDR狀的環，該環與免疫球蛋白相比，並非依賴鏈內二硫鍵。用於製備纖連蛋白多肽的方法在（例如WO 01/64942和美國專利No. 6,673,901、 6,703，199、7,078,490 以及 7，119，171)中有所描述，所述文獻以引用方式倂入本文。在一個實施方案中，纖連蛋白多肽爲 AdNectin® (Adnexus Therpaeutics, Waltham, ΜΑ)

在另一個實施方案中，本發明的生物學活性部分包含得自 Affibody® (Abeam, Cambridge，ΜΑ)的結合位點。親和體（affibody )衍生自金黃色葡萄球菌蛋白A( SPA )的免疫球蛋白結合結構域（例如參見Nord et al.，Nat. Biotechnol., 1 5: 772 -777 ( 1 997))。本發明中使用的親和體結合位點可以通過使衍生自SPA結構域（例如結構域B )的SPA相關性蛋白質（例如蛋白質Z)突變並選擇對IGF-1R抗原決定部位具有結合親和性的突變體SPA相關性多肽來合成。用於製備親和體結合位點的其他方法在美國專利 6,740,734 和 6,602,977 以及 WO 00/63243 中有所描述，這些文獻的每一份均以引用方式倂入本文。在另一個實施方案中，本發明的生物活性部分包含得自 Anticalin® (Pieris AG, Friesing，Germany)的結合位點 s -86- 201217527

。Anticalin (也稱爲lipocalin)爲多種β桶狀蛋白家族的成員，其功能爲在其桶/環區域結合靶分子。Lipocalin結合位點可以通過使連接桶的多條鏈的環序列隨機化而經過基因工程改造，從而形成結合IGF-1R抗原決定部位（例如參見 Schlehuber et al_，藥劑 Discov. Today, 10: 23-33 (2005); Beste et al_，PNAS, 96: 1 898- 1 903 (1 999))。由 lipocalin家族的多肽（其在4個節段中發生突變，這些節段與包含大菜粉蝶（Pieris brassica)的Bilin結合蛋白質 (BBP)的氨基酸位置28/至45、58至60、86至99以及114至 1 29的、線性多肽序列的序列位置相應）開始，在本發明的結合分子中使用的anticalin結合位點是可得的。製備 anticalin結合位點的其他方法在W099/16873和WO 05/0 1 9254中有所描述，所述之每一份文獻均以引用方式倂入本文。在另一個實施方案中，本發明的生物學活性部分包含 φ 得自富含半胱氨酸多肽的結合位點。在本發明的實施過程中使用的富含半胱氨酸的結構域通常不形成α螺旋、β片或 β桶狀結構。通常，二硫鍵促進所述之結構域折疊形成三維結構。通常，富含半胱氨酸的結構域具有至少2個二硫鍵’通常具有至少3個二硫鍵。示例性的富含半胱氨酸的多肽爲Α結構域蛋白質。Α結構域（有時成爲“補體型重複”）包含大約30-50或者30-65個氨基酸。在一些實施方案中，所述之結構域包含大約35-45個氨基酸，並且在一些情況下，爲大約40個氨基酸。在3 0-50個氨基酸中，有 -87- 201217527

大約6個半胱氨酸殘基。在這6個半胱氨酸中，通常在以下半胱氨酸之間找到二硫鍵：C1與C3、C2與C5、C4與C6。所述之A結構域構成了配體結合部分。所述結構域的半胱氨酸殘基爲二硫鍵連接的，從而形成小型的、穩定的功能獨立部分。這些重複的簇構成了配體結合結構域’並且對於配體結合而言，不同的簇可以賦予特異性。包含A結構域的示例性蛋白質包括（例如）補體成分（例如C6、C7、 C8、C9和因數I)、絲氨酸蛋白酶（例如腸激酶、蛋白裂解酶和絲氨酸蛋白酶）、跨膜蛋白（例如ST7、LRP3、 LRP5和LRP6 )、以及胞吞作用的受體（例如S o r t i 1 i η相關性受體、LDL 受體、VLDLR、LRP1 ' LRP2 和 ApoER2 ) » 用於製備具有所需結合特異性的A結構域蛋白質的方法在 (例如）WO 02/08 8 1 7 1和WO 04/0440 1 1中有所公開，所述之每一份文獻均以引用方式倂入本文。

在其他實施方案中，本發明的生物學活性部分包含得自重複蛋白質的結合位點。重複蛋白質爲包含小結構單元 (例如大約20至大約40個氨基酸殘基）的連續拷貝或者堆積在一起從而形成連續結構域的重複的蛋白質。可以通過調節蛋白質中重複的數量而對重複蛋白質進行修飾，從而適用於特定的靶向結合位點。示例性的重複蛋白質包括經設計的錨蛋白重複蛋白質（即，DARPins®，Molecular Partners, Zurich, Switzerland )(例如參見 B i nz et al.， Nat. Biotechnol·，22: 575-5 82 (2004))或富含亮氨酸的重複蛋白質（即，LRRP)(例如參見Pancer et al.，Nature, s -88- 201217527

430: 174-180 (2004))。目前爲止錨蛋白重複單元的所有測定的四級結構共有特徵爲：由β髮夾構成，其後爲兩個反平行的α螺旋，並以將重複單元與下一個重複單元連接的環爲結尾。由錨蛋白重複單元創建的結構域是通過堆積重複單元形成延伸的或彎曲的結構而形成的。得自海生七鰓鰻和其他無顎魚的適應性免疫系統的一部分、以及類似抗體的LRRP結合位點是在淋巴細胞成熟過程中通過重組一套富含亮氨酸的重複基因而形成的。用於製備DARpin或 LRRP結合位點的方法在WO 02/20565和WO 06/083275中有所描述，所述之每一份文獻均以引用方式倂入本文。可以在本發明的分子中使用的其他非免疫球蛋白結合位點包括衍生自Src同源結構域（例如SH2或SH3結構域）、PDZ結構域、β內醯胺酶、高親和性的蛋白酶抑制劑或小型二硫鍵結合蛋白質支架（例如蠍子毒素）的結合位點。用於製備衍生自所述之那些分子的結合位點的方法已經在本領域 (例如參見 Silverman et al.， Nat. Biotechnol.， 23(12): 1493 -4 (2005); Panni et al, J. Biol. Chem·， 277: 21666-21674 (2002), Schneider et al.3 Nat. Biotechnol” -89- 201217527

胰腺胰蛋白酶抑制劑結構域、Kazai型絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域、三葉草（p型）結構域、von wiliebrand因數c型結構域、過敏毒素樣結構域、CUB結構域、甲狀腺球蛋白【型重複、LDL受體A類結構域、Sushi結構域、連接結構域、凝血酶致敏蛋白1型結構域，免疫球蛋白樣結構域、C型外源凝集素結構域、MAM結構域、v〇n Willebrand因數A 型結構域、生長調解素B結構域、W AP型4個二硫鍵核心結構域、F5/8 C型結構域、血液結合素結構域、層黏連蛋白型EGF樣結構域、C2結構域、CTLA-4結構域、及本領域的普通技術人員已知的其他此類結構域、以及它們的衍生物和/或變體。其他非免疫球蛋白多肽包括Avimers® (Avidia, Inc.，Mountain View, CA，參見國際 PCT 公開 No. WO 06/055689和美國專利公開 2006/0234299)，Telobodies® (Biotech Studio, Cambridge, M A), Evibodies® (Evogenix, Sydney, Australia，參見美國專利 No. 7,166,697)，以及 Microbodies® (Nascacell Technologies, Munich, Germany) iH.受體或配體的結合部分在其他方面中，本發明的多肽包含與至少1個基因融合的Fc區可操作地連接的、受體的配體結合位點和/或配體的受體結合部分。在某些實施方案中，配體結合受體的跨膜區或者脂質或磷脂錨蛋白識別序列優選的是在融合之前失活或刪除。

S -90- 201217527 編碼配體或配體結合配偶體的DN A是通過限制性酶在編碼所需的ORF節段的DNA的5’和3’末端處或附近進行切割。所得的DNA片段可以容易地插入（例如框內連接）到編碼基因融合的Fc區的DNA中。進行融合的精確位元點可以根據經驗選擇，從而使可溶性融合蛋白質的分泌或結合特徵達到最優。然後，將編碼融合蛋白質的DN A亞克隆到合適的表達載體中，所述載體可以被轉染到宿主細胞中以用於 ^ 表達。受體或配體的示例性結合部分列出如下： a.細胞因數和細胞因數受體

細胞因數對淋巴細胞的增殖、分化和功能活化具有多效作用。在本發明的融合蛋白質中可以使用多種細胞因數或其受體結合部分作爲生物學活性分子、結合位元點和/ 或結構域。示例性的細胞因數包括白細胞介素（例如IL- 1， IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12，IL-13和IL-18 )、集落刺激因數（CSF )(例如粒細胞 CSF (G-CSF)，粒細胞-巨噬細胞CSF (GM-CSF)和單核細胞巨噬細胞CSF (M-CSF))、腫瘤壞疽因數（TNF) α和β、細胞毒素Τ淋巴細胞抗原4 ( CTLA-4 )以及干擾素（例如干擾如 α，β或 γ (美國專利 No. 4,925,793 和 4,929,554))。細胞因數受體通常由配體特異性的α鏈和普通的β鏈構成。示例性的細胞因數受體包括用於GM-CSF，IL-3 (美國專利 No. 5,63 9,605 ), IL-4 (美國專利 No. 5,599,905)，IL-5 ( 美國專利 No. 5,453,49 1)，IL10受體，IFNY (EP0240975)， -91 - 201217527 以及受體的TNF家族（例如TNFa (例如TNFR-l (EP 417, 5 63)，TNFR-2 (EP 417,014)淋巴毒素β受體）的那些。 b. 黏附蛋白

黏附分子爲可以使細胞彼此相互作用的膜結合蛋白質。多種黏附蛋白（包括白細胞歸巢受體和細胞黏附分子、或者它們的受體結合部分）可以作爲生物學活性分子、結合位元點和/或結構域而被倂入到本發明的融合蛋白質中。在發炎過程中白細胞歸巢受體在白細胞細胞表面上表達，並且包括調節與細胞外基質成分結合的β-1整聯蛋白（例如VLA-1、2、3、4、5和6)，以及與血管內皮上的細胞黏附分子（CAM )結合的β2整聯蛋白（例如LFA-1 ' LPAM-1 ' CR3 和 CR4)。示例性的 CAM 包括 ICAM-1、 ICAM-2、VCAM-1和MAdCAM-Ι»其他CAM包括選擇蛋白家族（包括E-選擇蛋白、L-選擇蛋白和P-選擇蛋白）的那些。

c. 趨化因數此外，趨化因數（刺激白細胞向感染位點遷移的趨化蛋白）也可以被倂入到本發明的融合蛋白質中。示例性的趨化因數包括巨噬細胞炎性蛋白質（MIP-1-a和MIP-1-β)、嗜中性粒細胞趨化因數和RAMTES (通常由所表達和分泌的T細胞通過活化來調控）。 d. 激素用作本發明融合蛋白質中的生物學活性部分的示例性生長激素包括血管緊張肽原酶、人類生長激素（HGH;美

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國專利No. 5,834,598)、N -蛋氨醯人類生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因數；副甲狀腺激素（PTH);甲狀腺刺激激素（TSH);甲狀腺素；胰島素原和胰島素（美國專利 No· 5，1 57,02 1和6,576,608);毛囊刺激激素（FSH);降血鈣素、黃體化激素（LH)、瘦蛋白、胰高血糖素；冷蟾肽；促生長激素；繆勒管抑制物質；鬆弛肽和鬆弛肽原樣蛋白；促性腺激素相關性肽；催乳激素；胎盤催乳激素；OB蛋白質；或繆勒管抑制物質。 e.受體和配體在一個實施方案中，本發明的多狀與具有至少1個基因融合Fc區（即，scFc區）的配體或受體（例如受體的細胞外結構域（ECD))的結合位點結合。在某·些實施方案中 ’受體的配體結合部分的結合位元點或結構域可以衍生自與上文所述之抗體或抗體變體結合的受體。在其他實施方案中，受體的配體結合部分衍生自這樣的受體，該受體選 φ 自：免疫球蛋白（Ig)超家族的受體（例如可溶性T細胞受體，如 mTCR® (Medigene AG，Munich, Germany))，上文所述之TNF受體超家族的受體（例如免疫黏附素的可溶性 TNFa受體），神經膠質細胞衍生的神經營養因數（GDNF)的受體（例如GFRa3)，G蛋白偶聯受體（GPCR)超家族的受體，酪氨酸激酶（TK)受體超家族的受體，配體門控（LG)超家族的受體，趨化因數受體超家族、IL-1/Toll樣受體（TLR)超家族以及細胞因數受體超家族的受體。在其他實施方案中，配體的受體結合部分的結合位元 93 - 201217527

點或結構域可以衍生自與上文所述之抗體或抗體變體結合的配體。例如，所述之配體可以與這樣的受體結合，所述受體選自：免疫球蛋白（Ig)超家族的受體，TNF受體超家族的受體，G蛋白偶聯受體（GPCR)超家族的受體，酪氨酸激酶（TK)受體超家族的受體，配體門控（LG)超家族的受體，趨化因數受體超家族、IL-1/Toll樣受體（TLR)超家族以及細胞因數受體超家族的受體》在一個示例性實施方案中，配體的受體結合部分的結合位元點衍生自屬於上文所述之 TNF配體超家族的配體（例如CD40L)。

生長因數或它們的受體（或者它們的受體結合或配體結合部分）可以倂入到本發明的融合蛋白質中。示例性的生長因數包括：血管內皮生長因數（VEGF)及其同種型（美國專利No. 5,194,596);成纖維細胞生長因數（FGF)，包括aFGF和bFGF;心房利鈉因數（ANF);肝臟生長因數 (HGF;美國專利No. 5,227,158和6,099,841),神經營養因數，例如骨衍生的神經營養因數（BDNF)，神經膠質細胞衍生的神經營養因數配體（例如GDNF，neuturin，artemin和 persephin)，神經營養因數-3、-4、-5 或-6 (NT-3，NT-4, N T - 5或N T - 6 )，或者神經生長因數，例如N G F - β血小板衍生的生長因數（PDGF)(美國專利No. 4,889,9 1 9, 4,845,075, 5,9 1 0,574和 5,8 77,0 1 6);轉化生長因數（TGF)，例如TGF-α和TGF-β (W Ο 9 0/1 4 3 5 9 )，骨誘導性因數，包括骨成型蛋白（BMP);胰島素樣生長因數-I和-II (IGF-I和 IGF-II;美國專利No. 6,403,764和6,506,8 74);紅細胞生成

S -94- 201217527 素（EPO);血小板生成素（TPO;幹細胞因數（SCF)，促血小板生成素（TPO，c-Mpl配體），以及Wnt多肽（美國專利

No. 6,159,462)°

可以用作本發明的生物學活性部分的示例性生長因數受體包括·· EGF受體；VEGF受體（例如Fltl或Flkl/KDR)， PDGF 受體（WO 90/ 1 4425); HGF 受體（美國專利>1〇· 5,648,273和5,6 86,292)，以及神經營養受體，包括低親和性的受體（LNGFR )，也稱爲p75NTR或P75，其與NGF、 BDNF和NT-3結合；和受體酪氨酸激酶的trk家族成員的高親和性受體（例如 trkA，trkB (EP 455,460), trkC (EP 522,530)) ° f.異源二聚體受體在一個實施方案中，可以使用本發明的方法來製備細胞因數的拮抗劑，該拮抗劑使用了 α特異性檢測成分，當該成分與細胞因數結合時，會與第一 β信號傳導成分結合，從而形成非功能性的中間體，接著該中間體與第二β信號傳導成分結合，導致β受體二聚化，並進行隨後的信號傳導。此類分子在本領域中有所描述（例如參見美國專利 6,927,044 )。在一個實例中，受體的可溶性特異性測定成分與細胞因數受體的第一 b信號傳導成分的細胞外結構域結合，從而形成異源二聚體，該二聚體與細胞因數結合從而形成非功能性的絡合物。可以使用此類異源二聚體受體來進行抑制的示例性細胞因數包括：IL1、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-3、IL-4、IL-5、IL-11、IL-15、GMCSF、 -95- 201217527 LIF、INFy和 TGFp。 E.凝血因數用作本發明的融合蛋白質中的生物學活性部分的、示例性的血液凝集因數包括：凝血因數（例如因數V，VII， VIII，IX, X, XI，ΧΠ，XIII，von Willebrand 因數）；組織因數（美國專利 No. 5,346,991， 5,349,991， 5,726，147 和

6,596,8 4);凝血酶和凝血素；纖維蛋白和纖維蛋白原；血纖維蛋白溶酶和血纖維蛋白溶酶原；血纖維蛋白溶酶原活化劑，例如尿激酶或者人尿或組織類型的血纖維蛋白溶酶原活化劑（t-PA)。此外，此類凝血因數的變體和生物學活性部分還可以用作生物學活性分子。此外，還可以使用本發明的scFc區製備的示例性分子在（例如）美國專利 7,404,956和 7,348,004中歹!1出。

因數VII、IX和X在結構上都是相關的，在於在各種因數中，輕鏈的氨基酸末端不易於倂入額外的部分，這是因爲需要提供維生素K依賴性的γ穀氨醯羧化酶的停靠位點的茚肽序列。類似地，這三種凝血因數的重鏈氨基末端除了可切割部分（即，通過切割位點或構成了切割位元點的部分連接的部分，）以外，不易於倂入額外的部分，這是因爲需要游離的Ν末端以便形成具有催化活性的蛋白酶結構域。儘管通常示出因數VII來說明本發明的示例性實施方案，但是可以使用因數IX或X來製備題述構建體。例如，本領域的一名技術人員應該理解的是可以使用FIX或FX部

S -96 - 201217527 分來取代本發明的構建體的FVII部分。本發明的示例性凝血因數構建體在附圖中列出。儘管附圖通常說明了單鏈形式的凝血因數（以其酶原形式），但是應該理解的是在本發明的構建體中，所述之凝血因數還可以以其活性形式（例如兩條鏈、二硫鍵形式）存在。

在一個實施方案中，本發明的凝血因數是以活性形式被細胞所表達。在另一個實施方案中，凝血因數以其非活性形式表達，並且隨後在體外的合適條件下活化，使得活性形式的凝血因數存在於所述之構建體中。在另一個實施方案中，本發明的凝血因數包含非活性形式的凝血因數，並且所述之凝血因數在給藥後在體內被活化。在一個實施方案中，本發明的凝血因數爲成熟形式的因數VII或其變體。因數VII(F VII，F7;也稱爲因數7，凝集因數VII，血清因數VII，血清酶原轉變加速因數SPC A，血清酶原轉變加速因數前體以及依他凝血素α)爲凝集級聯的一部分的絲氨酸蛋白酶。FVII包括Gla結構域，兩個 EGF結構域（EGF-1和EGF-2),以及絲氨酸蛋白酶結構域 (或肽酶S 1結構域），其中所述之絲氨酸蛋白酶結構域在絲氨酸蛋白酶的肽酶S1家族的所有成員中是高度保守的，例如胰凝乳蛋白酶。FVII以單鏈酶原、活化酶原樣雙鏈多肽及完全活化的雙鏈形式形成。如本文所用，“酶原樣”蛋白質或多肽是指通過蛋白水解的切割已經活化、但是仍表現出與酶原有關的多種性質（例如低活性或不具有活性，或者組裝形成酶原形式蛋白質的構造的構造）的蛋白質。 -97- 201217527 例如，當雙鏈活化形式的FVII未與組織因數結合時，其爲酶原樣的蛋白質；它保留了與未切割的FVII酶原相似的構造，並因此表現出極低的活性。當雙鏈活化形式的FVII與組織因數結合時，其發生了構造變化，並且作爲凝集因數需要其全部的活性。

示例性的FVII變體包括具有增加的特異性的活性的那些，例如通過增加FVII的酶活性（Kcat或Km )而增加FVII 的活性的突變。此類變體已經在本領域中有所描述，並且包括（例如）Persson et al. 2001. PNAS 98:1 3 5 83; P etro van and Ruf. 2 001. J. Biol. Chem. 276:661 6; Persson et al. 2 0 0 1 J. Biol. Chem. 276:29195; Soejima et a 1. 2001. J. Biol. Chem. 276:1 7229; Soejima et al. 2002. J. Biol. Chem. 247:49027中所述之突變體形式的分子。在一個實施方案中，變體形式的FVII包括突變。示例性的突變包括 V158D-E296V-M298 Q。在另一個實施方案中，變體形式的 FVII包括使用得自胰島素170-環的氨基酸E AS YPGK替代得自FVII成熟序列的氨基酸608-6 1 9 ( LQQSRKVGDSPN，對應於170-環）。高度特異性活性的FIX變體也是本領域已知的。例如，Simioni et al. (2009 N.E. Journal of Medicine 3 6 1 : 1 6 7 1 )描述了 R 3 3 8 L 突變。Chang et al. (1988 JBC 27 3:1 2 089)和 Pierri et al. (2009 Human Gene Therapy 20 :479)描述了 R3 3 8 A突變。其他突變是本領域已知的，並包括在（例如）Zogg and Brandstetter. 2009 Structure 1 7:1 669; Sichler etl al· 2003. J. Biol. Chem. 27 8:4 1 2 1 和 s -98- 201217527

Sturzebecher et al. 1 997. FEB S L e tt 4 1 2 : 2 9 5 中描述的那些。這些參考文獻的內容以引用方式倂入本文。完全活化，其在構象從酶原樣形式改變時發生，在結合其輔助因數組織因數發生。此外，可以引入在組織因數缺乏下會導致構造改變的突變。因此，對於F Vila包括雙鏈形式、酶原樣形式以及完全活化的雙鏈形式。

在一個實施方案中，本發明的凝血因數爲成熟形式的因數VIII或其變體。FVIII在血液凝集的內在途徑中作爲輔助因數起作用，從而加速因數X被因數Ixa的活化（其爲在鈣離子存在下，在負電荷的磷脂表面上發生的反應）。 FVIII以23 5 1個氨基酸的單鏈多肽形式合成，其具有結構域結構 A1-A2-B-A3-C1-C2。Wehar，G. A. et al.，Nature 312:337-342 (1984)¾ Toole, J. J. et al., Nature 3 1 2:342-347 (1984)。FVIII的結構域結構與同源的凝集因數（因數 V(FV))的結構域結構一致。Kane，W. H. et al·, PNAS (USA) 8 3:6 800-68 04 ( 1 9 8 6)和 Jenny，R. J. et al., PNAS (USA) 84:4846-48 50 ( 1 98 7)。FVIII A結構域爲 3 3 0個氨基酸，並且彼此之間、以及與FV和血漿銅結合蛋白的血漿銅藍蛋白的A結構域具有40%的氨基酸一致性。丁&1£&1^311丨，>^ et al.，PNAS (USA) 8 1:3 90-3 94 ( 1 984)。各個 C 結構域爲 150個氨基酸，並且與FV的C結構域、以及結合糖綴合物及負電荷的磷脂的蛋白質表現出40%的一致性。Stubbs, J. D. et al., PNAS (USA) 8 7:84 1 7-842 1 ( 1 9 9 0)。F V111 B 結構域是由單個外顯子編碼的，並且與任何已知的蛋白質（包 -99- 201217527 括FV B結構域）表現出較少的同源性8 Gitschier，et al.，Nature 3 1 2:326-330 ( 1 984)和 Cripe, L. D. et al·，

Biochemistry 31:3777-3785 (1992)。 FVIII以重鏈（結構域A1-A2-B)和輕鏈（結構域八3-C 1 -C2 )(通過A 1與A3結構域之間的非共價二價金屬離子結合）形成的異源二聚體形式被分泌到血漿中。在血漿中，FVIII是通過與von Willebrand因數結合來穩定的。更具體而言，FVIII輕鏈是通過與von Willebrand因數的氨基末端中的一級結合位點發生非共價的相互作用來結合的。在通過凝血酶進行蛋白水解活化時，FVIII被活化形成2個重鏈片段（Al，50kDa片段：以及A2,43kDa片段）與輕鏈（ A3-C1-C2，73 kDa鏈）的異源三聚體。因此，活性形式的 FVIII(FVIIIa)由A1亞單元與游離的A2亞單元構成，其中A1亞單元通過與凝血酶切割的A3-C1-C2輕鏈連接的二價金屬離子結合，而游離的A2亞單元通過離子結合與A1 結構域結合。Eaton, D. et al.，Biochemistry 25: 505 ( 1 986); Lollar, P. et al., J. Biol. Chem. 266: 1 248 1 (1991);和 Fay, P. J. et al.，J. Biol. Chem. 266: 8 95 7 (1991)。該FVIIIa異源三聚體是不穩定的，並且在生理學條件下通過A2亞單元的解離而快速失活。在一個實施方案中，凝血因數包含删除了 B結構域版本的因數VIII。如本文所用，因數…丨丨的“ b結構域”與本領域抑制的B結構域相同，其中所述之b結構域是通過內部氨基酸序列的一致性以及蛋白水解的裂解位點（例如全長 -100- 201217527

人類因數VIII的殘基Ser74〇-Argl648 )定義的。其他人類因數VIII結構域是通過以下氨基酸殘基定義的：A1，殘基 Alal-Arg372 ; A2 ，殘基 Ser373-Arg740 ; A3 ，殘基 Serl 690-Asn2019 ； Cl，殘基 Lys2020-Asn2172 ; C2，殘基 Ser2173-Tyr23 3 2。A3-CM-C2 序列包括殘基 Serl 690-Tyr23 3 2。剩餘的序列（殘基Glul 649-Argl 68 9 )通常被稱爲a3酸性區。對於豬、小鼠和犬科動物因數VIII而言，所有結構域（包括B結構域）邊界的定位也是本領域已知的。在一個實施方案中，因此VIII的B結構域被刪除（“ B結構域被刪除的因數VIII”或“BDD FVIII” ）。BDD FVIII 的實例爲REFACTO® (具有S 743/Q 1 63 8融合的重組BDD FVIII)，其是本領域已知的。 * “ B結構域被刪除的因數VIII”可以具有在美國專利

No. 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502， 5,610,278， 5,171,844， 5，112,950， 4,868，112和 6,45 8，5 63中所公開的全部或部分刪除，每一份文獻均以引用方式全文倂入本文。在一些實施方案中，本發明的B結構域被刪除的因數VIII序列包含在美國專利No. 6,3 16，226 (也在US 6,346,513中）的第4列第4行至第5列第28行以及實例1-5中公開的任何一種刪除。在另一個實施方案中’ B 結構域被刪除的因數VIII爲S743/Q1638 B-結構域被刪除的因數VI II(SQ版本的因數VIII)(例如具有氨基酸744至氨基酸1 63 7刪除的因數VIII，例如具有SEQ ID NO: 6的氨基酸 -101 - 201217527 1 -743 和氨基酸 1 63 8 -23 3 2 的因數 VIII，即，SEQ ID NO: 2 )。在一些實施方案中，本發明的B結構域被刪除的因數 VIII具有在美國專利 No. 5,789,203 (也在 US 6,060,447, 1^ 5,595,886和1^ 6,228,620中）的第2列第26-51行以及實例5-8中公開的刪除。在一些實施方案中，B結構域被刪除的因數VIII具有在美國專利No. 5，972,8 85的第1列第25行至第2列第40行；美國專利No. 6,048,720的第6列第1-22行以及實例1;美國專利No. 5,543,502的第2列第17-46行；美國專利No. 5,1 7 1,844的第4列第22行；美國專利No. 5，112,95〇的第2列第55-68行附圖2以及實施1;美國專利 No. 4,868，112的第2列第2行至第19列第21行以及表2;美國專利No. 7,04 1,63 5的第2列第1行至第3列第19行、第3列第40行至第4列第67行、第7列第43行至第8列第26行、第 11列第5行至第13列第39行；或者美國專利No. 6,458,563 的第4列第25-53行中所述之刪除。在一些實施方案中，B 結構域被刪除的因數VIII具有大部分B結構域的刪除，但是仍包含B結構域的氨基末端序列，該序列對於初級翻譯產物在體內通過蛋白水解加工從而形成兩條肽鏈是必須的，如WO 9 1/09 1 22中所述，該文獻以引用方式全文倂入本文。在一些實施方案中，B結構域被刪除的因數VIII是使用氨基酸747- 1 63 8刪除（即，實際上爲B結構域的完全刪除）構建的。Hoeben R.C_，et al. J. Biol. Chem. 265 ( 1 3 ): 73 1 8 -73 2 3 ( 1 99 0)，該文獻以引用方式全文倂入本文。此外，B結構域被刪除的因數VIII還可以包含因數VIII的氨基 -102- 201217527

酸 77 1 - 1 666 或氨基酸 86 8 - 1 562 的刪除。Meulien P.，et al. Protein Eng. 2(4): 3 0 1 -6 (1 988)，該文獻以引用方式全文倂入本文。作爲本發明的一部分的其他B結構域刪除包括 :氨基酸982至1562或者760至1 639的刪除（Toole et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ( 1 986) 83，5939-5942))， 797至 1 562 ( Eaton, et al. Biochemistry (1 986) 25:8343-8347)) 、741 至 1646 ( Kaufman (PCT 公開申請 No. WO

87/04 1 87) ) ' 747-1 560 ( Sarver, et al., DNA (1 987) 6:553-564) ) 、 741 至 1648 ( Pasek (PCT 申請

No.88/00831))、或者 816 至 1598 或 741 至 1648 ( Lagner (Behring Inst. Mitt. ( 1 98 8) No 8 2:1 6-25，EP 2 9 5 5 9 7))，每份文獻均以引用方式全文倂入本文。在任何因數VIII序列中可以制得之前所述之各種刪除。在一個實施方案中，本發明的凝血因數爲成熟形式的因數IX或它們的變體。因數IX以41 5個氨基酸的單鏈血漿酶原而形成環狀（Α· Vysotchin et al.，J. Biol. Chem. 268, 843 6 ( 1 9 93 ) ) 。FIX的酶原是由FXIa或通過組織因數 /FVIIa絡合物活化的。精氨酸-丙氨酸145-1 46與精氨酸-纈氨酸180-181之間的特異性切割得到了通過在半胱氨酸132 與半胱氨酸289之間的單個二硫鍵連接的輕鏈和重鏈（3· Bajaj et al.，Biochemistry 22，4047 (1983)) 。FIX的結構組織與維生素K依賴性的血液凝集蛋白質FVII、FX和蛋白質C的結構組織相似（上文所述之B. Furie和B. Furie)。所述氨基末端的大約45個氨基酸包含γ羧基谷氨酸或gl a結構 -103- 201217527 域。其後爲兩個表皮生長因數同源結構域（EGF )、活化肽以及催化“重鏈”（其爲絲氨酸蛋白酶家族的成員）（ A. Vysotchin et al., J. Biol. Chem. 268, 8436 ( 1 993); S. Spitzer et al., Biochemical Journal 265，2 1 9 (1 990); H. Brandstetter et al.，Proc. Natl. Acad Sci. USA 92, 9796 (1995)) ° 在一個實施方案中，本發明的凝血因數爲成熟形式的因數X。因數X爲分子量5 8.5kDa的維生素K依賴性糖蛋白，其以酶原的形式由活細胞分泌到血漿中。最初的因數X 以具有信號肽的前肽形式（共48 8個氨基酸）生產。在輸送至內質網的過程中，信號肽被信號肽酶切除，在成熟N 末端鏈的N末端的第11個谷氨酸殘基處形成γ羧基之後，前肽序列被切除。通過Arg 182與Ser 183之間的切割進行進一步的加工步驟。該加工步驟還同時導致三肽八1^180-Lysl8 1-Argl82的刪除。所得的被分泌的因數X酶原由139 個氨基酸的N末端輕鏈（M，16,200)和306個氨基酸的C末端重鏈（M, 42,000)構成，它們通過Cysl72與Cys342之間的二硫鍵橋共價連接。進一步的翻譯後加工步驟包括Asp 103的 β-羥基化以及N-和0-型糖基化。應該理解的是，除了野生型（WT)版本的這些凝血因數或其生物學活性部分之外，本發明還可以使用具有活性的其前體的截短形式、等位基因的變體和物種變體、剪切變體所編碼的變體、和其他變體，包括與成熟形式的凝血因數具有至少 40% ' 45%、50%、55%、65%、70%、75%、 -104- 201217527 8 0% ' 8 5% ' 90% ' 9 5%、96%、97% ' 98%' 9 9 % 或更高的

序列一致性並保持了促進血塊形成的能力的多肽。例如，可以使用保留了至少一種FVII活性（例如TFFVII的TF結合、因數X結合、磷脂結合和/或凝結活性）的經修飾的FVII 多肽及其變體。就保留的活性而言，可以改變這種活性，例如與野生型凝血因數相比降低或增加所述之活性，只要所保留的活性的水準足以產生可檢測的效果即可。可以在本發明的構建體中使用的凝血因數的示例性序列可以在所附的序列表中找到。示例性的經修飾的多肽包括但不限於組織特異性同種型及其等位基因變體、通過核酸的翻譯而製備的合成分子、通過化學合成（例如合成酶，其包括較短多肽的連接、通過重組方法）而產生的蛋白質、由人類和非人類組織和細胞分離得到的蛋白質、嵌合多肽及其修飾形式。凝血因數的其他變體包括經修飾從而改變了活性的版 φ 本。例如，高特異活性版本的凝血因數是本領域已知的，並且可以用於製備本發明的多肽。示例性的這種高特異活性變體在 Persson et al. PNAS· 200 1. 98:1 3 5 83 和 Soejima et a 1. Journal of Biological Chemistry. 2 0 0 2. 277:49027 中有所描述。例如，在一個實施方案中，高特異活性版本的因數VII除去了 FVII成熟序列的氨基酸311至 3 22(LQQSRKVGDSPN，對應於170-環），並用得自胰島素 170-環啲氨基酸EASYPGK替代它們。這種取代已經顯示出賦予了高特異活性。其他高特異活性版本的因數VII在 -105- 201217527 FVII、V158D、E296V和M298Q的重鏈中包含3個點突變。本發明的凝血因數還可以WT分子的片段或其一部分構成，該片段或部分足夠長或者包括合適的區域從而保留了全長成熟多肽的至少一種活性（如果需要，在活化時）。示例性的凝血因數變體是本領域已知的。示例性的凝血因數爲哺乳動物（例如人類）起源的那些。示例性的凝血因數的序列示於所附的序列表中，例如單獨示出或者在凝血因數構建體中示出。在一個實施方案中，多於一種的凝血因數可以存在于本發明的多肽中。在另一個實施方案中，本發明的多肽包含與本發明的構建體的1個Fc部分基因融合的凝血因數的輕鏈 '以及與本發明的構建體的第二Fc部分基因融合的凝血因數的重鏈。包含凝血因數作爲生物學活性部分的示例性構建體在工作例中示出。例如，在一個實施方案中，凝血因數酶原 (例如因數VII重鏈和輕鏈）通過可任選的連接體（例如 6x(G4S)連接體）連接，或者與第一Fc部分（包含CH1、 CH2和CH3結構域）的氨基末端直接連接。第一 Fc部分的羧基末端具有包含第一加工位點（例如RRRRS加工位點）的cscFc連接體（例如6x(G4S)連接體或4x(G4S)連接體）。 cscFc連接體的其他末端包含第二加工位點（例如RKRRKR 或RRRR加工位點），並且通過隔離物與靶向部分（例如血小板靶向部分）可任選地連接，或者與第二Fc部分直接連接。在靶向部分存在的情況下，其可以通過隔離物（例 -106- 201217527 如6x(G4S))與所述之第二Fc部分連接。本文所述之FVII_ 027、FVII-064和FIX-044分子爲此類構建體的實例。

其他示例性的構建體除了在使用蛋白酶對連接體進行加工之後分泌酶原以外，還分泌活化的凝血因數。例如，在一個實施方案中，凝血因數的輕鏈通過隔離物（例如 4x(G4S)連接體）與第一 Fc部分（包含CHI、CH2和CH3結構域）的氨基末端融合。第一 Fc部分的羧基末端與包含第一加工位點（例如RRRR加工位點）的連接體（例如 6x(G4S) cscFc連接體）連接。所述連接體的其他末端包含第二加工位點（例如RKRRKR加工位點），並且與凝血因數的重鏈（例如FVII重鏈）基因融合，該凝血因數轉而通過第二隔離物（例如4x(G4S)連接體）與第二Fc部分的氨基末端融合。此類構建體的實例爲本文所述之F VII-024構建體並示於圖2中。製備其他構建體以改變凝血因數的重鏈和輕鏈的表達方式。如圖7所示，所述之重鏈和輕鏈可以以單鏈形式（ FV-011 和 FV-003 )或者以分開的方式（FV-010、FVII-013 或 FVII-0 1 8 )表達。可以製備其他構建體來測試以活化形式表達的FVII的能力。FVII-025構建體示於圖9中。其中使用了不同的生物學活性部分（ΚΝβ )的另一種構建體示於圖10中。在製備這種構建體時，使用隔離物分子將IFNb與第一 Fc部分連接。不能表達出具有游離N末端的FVII重鏈使得產生圖1 1 -107- 201217527 中所述之構建體。在這些構建體中，FVIIFc以異源二聚體的形式表達，其中一個亞單元包含FVII輕鏈和Fc部分，而其他亞單元包含位於RKRRKR加工位元點之後的重鏈（ FVII-019 )或者位於輕鏈C末端片段和RKRRKR加工位點之後的重鏈（FVII-020)。 E.靶向部分

在一個實施方案中，所述之抗原結合部分使所述之組合物靶向特定的細胞類型或組織。此類靶向部分可以包含 (例如）抗原結合位點、受體的配體結合部分、或者配體的受體結合部分。在另一個實施方案中，靶向部分爲肽。

在一個實施方案中，本發明的凝血因數被靶向血小板，從而通過使用“靶向部分”（其與血小板上表達的分子結合）將凝血因數定位於凝集位點而增強其效力。優選的是，所述之靶向分子除了在血小板上表達以外，在細胞或組織上並不表達，即，所述之靶向部分特異性地結合血小板。在一個實施方案中，在靜息血小板上發現的受體/構造被靶向。通過如此，對於增加的效力而言，凝集位點成爲首要。靶向此類分子還可以延長凝血因數的半衰期和/ 或防止被清除。此類靶的實例包括（例如）GpIb/V/IX絡合物的Gplb以及GPIIb/IIIa的GpVI和非活性形式。在一個實施方案中，僅僅在活化的血小板上發現的受體/構造被靶向，從而將凝血因數定位於活性凝集的位點

S -108- 201217527 。此類靶的實例包括（例如）活性形式的Gpllb/IIIa以及 CD62P 〇

在一個實施方案中，本發明的多肽包含對血小板具有親和性並與其結合的“靶向部分”。例如，在—個實施方案中，靶向部分與GPIb絡合物（例如GPIb-α )結合。此類靶向部分的實例包括與活性及非活性血小板結合的肽PS4 、OS1 和 OS2 ( Benard et al. 2008 Biochemistry 47:4674 ) 。在另一個實施方案中，靶向部分與GPIIb Ilia的活性構造結合。此列靶向部分的實例包括僅與活性血小板結合的 SCE5和 MB9的可變區（Schwarz et al_ 2004 FASEB Journal express article 1 0.1 096/fj .04-1 5 1 3 fje; Schwarz et al. 2006 Circulation Research. 99:25-33; 美國專利公開 2〇0702 1 8067 )。在另一個實施方案中，靶向部分與 GPIIb Ilia的活性/非活性構造結合。此類靶向部分的實例爲 AP 3 抗體的可變區（P etersοn et a 1 · 2003 . Hemostasis,

Thrombosis, and Vascular Biology 1 0 1:937; WO 20 1 0 1 1 5 8 66 )。本領域的普通技術人員可以容易地選擇與此列靶結合的其他血小板靶或靶向部分。本發明的多肽可以包含1個或多個1個的祀向部分。示例性的構造示於附圖中。此外，2個或多個靶向部分可以以連續方式（例如通過隔離物）彼此連接，並且串聯的陣列與本發明的構建體可操作地連接。當2個或多個靶向部分存在于本發明的凝血因數中時，所述之部分可以相同或 -109- 201217527 不同。在一個實施方案中，靶向部分通過可切割的連接體與本發明的多肽融合，或者可選地在其他實施方案中，所述之多肽進一步包含切割位點，其中所述之連接體及切割位點都可以被切割，從而在血塊位點處除去所述之靶向部分。在另一個實施方案中，靶向部分通過不可切割的隔離物連接，並因此並未在血塊位點處被切割。在一個實施方案中，所述之靶向部分定位於因數VIII 的N末端或c末端上。在另一個實施方案中，靶向部分定位於FVII、FIX、FX的C末端上或者FVIIa、FIXa或Fxa的一條或兩條鏈的C末端上。在其中使用了 Fc區或其一部分的實施方案中’所述之靶向部分可以位於第二Fc鏈的N或C末端’或者位於一條或兩條Fc鏈的C末端。所述之耙向部分可以通過隔離物與生物學活性部分或Fc區連接。在一個實施方案中，靶向部分並沒有通過肽鍵與構建體融合，而是通過化學方式與所述之構建體綴合。例如，靶向部分可以通過在靶向部分與構建體的Fc部分之間形成鍵而與本發明的構建體連接，其中所述之靶向部分包含第一官能團’而所述之Fc部分包含第二官能團，並且所述之第一官能團與所述第二官能團能夠彼此反應從而形成化學鍵（例如參見美國專利738 1 408 )。此外，靶向凝血分子的示例性形式也示於附圖中。在一個實施方案中，本發明的多肽包含抗原結合位點 (例如抗體的抗原結合位點、抗體變體或抗體片段）、多 -110- 201217527 肽、配體的受體結合部分、或者特異性地結合血小板（例如靜息狀態或活化的血小板）的受體的配體結合部分中的至少一者。示例性的靶向部分包括與所靶向的分子結合的 scFv分子或肽。靶向部分的實例在本發明的實例中找到。

在某些實施方案中，本發明的多肽包含至少1個抗體的抗原結合部分（例如結合位元點）。在一個實施方案中，所述之抗原結合部分使所述之組合物靶向血小板。此類抗體可以與所有血小板（例如活化或非活化的）表達的抗原決定部位結合，或者可以與活化的血小板特異性表達的抗原決定部位結合。可以衍生出結合位點的示例性抗體或者用於本發明的多肽分子的抗體結合位點是本領域已知的。如上文所述，已知與血小板結合的抗體可以用於衍生結合位點（例如US 2007/02 1 8067中所述之AP3抗體或MB9 scFv)，或者所述可變區或包含所述可變區的scFv分子可以用於本發明構建 φ 體中的靶向部分。其他示例性抗體結合位點包括SCE5，其靶向在活化血小板上發現的構象。其他可用的抗體可以由本領域已知的那些中容易地選擇。在某些其他的實施方案中，本發明的多肽包含1個或多個衍生自非免疫球蛋白結合分子的結合位點。如本文所用’術語“非免疫球蛋白結合分子”爲這樣的結合分子，其結合位點包含衍生自除了免疫球蛋白以外的其他多肽的部分（例如支架或框架），但是該部分可以經過基因工程改造（例如突變）從而賦予所需的結合特異性。 -111 - 201217527 包含結合位點（並非衍生自抗體分子）的結合分子的其他實例包括與血小板結合的受體結合位點和配體結合位點。非免疫球蛋白結合分子可以通過由結合分子（具有人工多樣化的結合位元點）文庫中選擇或分離靶結合變體來識別。可以使用完全隨機的方法（例如錯誤傾向p c R、外顯子改組或定向進化）來生成多樣化的文庫，或者通過本領域認可的設計方案來輔助。例如，可以通過在編碼結合位元點的核酸中的相應位置處插入簡並密碼子、三核苷酸、隨機肽或完整的環而使得在結合位點與其同源靶分子相互作用時通常所涉及氨基酸位置隨機化（例如參見美國公開No. 20040 1 3 2028 )。氨基酸位置的定位可以通過硏究與靶分子絡合的結合位元點的晶體結構來識別。用於隨機化的備選位置包括環、平坦表面、螺旋以及結合位點的結合腔。在某些實施方案中，具有可能備選用於多樣化的結合位點中的氨基酸可以通過它們與所述之免疫球蛋白折疊的同源性來識別。在隨機化後，接著可以使用本領域已知的方法對多樣化的文庫進行選擇或者篩選過程，從而得到具有所需的結合特徵的結合分子，所述之特徵例如爲特異性結合血小板。例如，可以通過本領域認可的方法（例如噬菌體展示、酵母菌展示或者核糖體展示）來進行選擇。在一個實施方案中，在本發明的構建體中可以使用與血小板結合的本領域已知的分子。例如，可以使用本領域所述之與 GPIba 結合的肽（例如 PS4，0S1 或 0S2)(Benard et al. -112- 201217527 2008. Biochemistry 47:4674-4682 )。 ΙΠ.多肽的製備

多種方法可以用於生產本發明的多肽。在一個實施方案中，本發明涉及包含編碼本發明的多肽分子的核酸序列的核酸構建體。應該理解的是，由於密碼子的簡並性，多種核酸序列可以編碼所述多肽的氨基酸序列。所需的多核苷酸可以通過從頭固相DN A合成或者通過編碼題述多肽的早期製備的多核苷酸的PCR突變來生產。編碼生物學活性分子的核酸可以使用本領域公知的重組技術而容易地合成。或者，所述肽本身是可以化學合成的。本發明的核酸可以通過本領域已知的標準方法合成，例如通過使用自動化的DNA合成儀（例如可購自 Biosearch，Applied Biosystems等）。例如，硫代磷酸寡核苷酸可以通過 Stein et al. 1 98 8，Nucl. Acids Res. 1 6:3209 所述之方法來合成，甲基膦酸酯寡核苷酸可以通過使用 Sarin et al· 1988，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 85:7448 中所述之受控孔隙的玻璃聚合物支撐體來製備。核酸合成的其他方法是本領域已知的（例如參見美國專利No. 6,015,881; 6,28 1,3 3 1 ; 6,469，136)。用於將所需的生物學活性部分（無論衍生自抗體還是其他分子）與可切割的scFv支架連接的方法是本領域已知的。調節寡核苷酸的突變爲這樣一種方法，其用於製備取 -113- 201217527 代、框內插入或改變（例如改變的密碼子）以引入（例如引入到Fc變體部分中）編碼氨基酸取代的密碼子。例如，將編碼所需突變的寡核苷酸與單鏈DNA範本雜交來改變起始多肽的DNA。在雜交後，使用DNA聚合酶來合成所述範本的完整的第二天互補鏈（其引入了寡核苷酸引物）。在 —個實施方案中，基因工程改造（例如基於引物的PCr突變）足以併入改變（如本文所定義），以用於生產編碼本發明的多肽的多核苷酸。對於重組生產而言，將編碼所述多肽的多核苷酸序列插入到合適的表達媒介物中，即包含用於插入密碼序列的轉錄和翻譯的必須元件的載體，或者在RN A病毒載體的情況下，包含用於複製和翻譯的必須元件的載體》在一個實施方案中，將編碼所述蛋白質的核酸分子插入到處於正確閱讀框中的載體中。然後，將該表達載體轉染到表達所述多肽的合適的靶細胞中。轉染技術是本領域已知的，包括但不限於磷酸鈣沉澱（Wigler et al. 1 978, Cell 14 : 7 2 5 )和電穿孔（Neumann et al. 1982，EMBO，J. 1 : 841)。可以使用多種宿主表達載體系統來在真核細胞中表達本文所述之蛋白質。在一個實施方案中’所述之真核細胞爲動物細胞，包括哺乳動物細胞（例如293細胞、 CHO、BHK、Cos、HeLa細胞）。當所述之蛋白質在真核細胞中表達時，編碼所述蛋白質的DNA還可以編碼允許所述蛋白質被分泌出來的信號序列。本領域的—名技術人員應該理解的是在所述蛋白質被翻譯的同時’信號序列被所 -114- 201217527 述之細胞切割從而形成成熟蛋白質。多種信號序列是本領域已知的，例如天然因數VII信號序列、天然因數IX信號序列以及小鼠IgK輕鏈信號序列。或者，在未包含信號序列的情況下，可以通過裂解細胞來回收所述之蛋白質。

本發明的蛋白質可以在轉基因動物（例如齧齒動物、山羊、綿羊、豬或牛）中合成。術語“轉基因動物”是指在其基因組中具有倂入的外源基因的非人類動物。由於所述基因存在於種系組織中，所以其可以由親代傳遞給子代。將外源基因引入到單細胞胚胎中（Brinster et al. 1 98 5,

Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82 : 4438 )。生產轉基因動物的方法是本領域已知的。所述之轉基因包括生產免疫球蛋白分子的轉基因（Wagner et al. 1981，Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 78: 63 76; McKnight et al. 1 983, Cell 34 : 3 3 5; Brinster et al. 1 983，Nature 3 0 6: 3 3 2; Ritchie et al. 1 984, Nature 3 12: 517; B aldassarre et al. 2003，Theriogenology 5 9 : 8 3 1 ; Rob 1 et al. 2003，Theriogenology 59: 1 0 7;

Malassagne et al. 2003，Xenotransplantation 1 0 (3 ): 2 6 7 ) 所述之表達載體可以編碼可易於純化或鑒定重組產生的蛋白質的標籤。其實例包括但不限於載體PUR278 ( Ruther et al. 1 983，EMBO J. 2: 1791)，其中本文所述之蛋白質的編碼序列可以與具有lac z編碼區的載體進行框內連接’從而產生雜交蛋白質；可以使用pGEX載體來表達具有谷胱甘肽S-轉移酶（GST)標籤的蛋白質。這些蛋白質 -115- 201217527 通常是可溶性的’並且可以通過吸附于谷腕甘肽-壞脂糖珠上、然後在游離的谷胱甘肽存在下進行洗脫的方式由細胞中容易地純化。所述載體包括切割位點（例如 PreCission Protease (Pharmacia, Peapack，N. J.))以便在純化後容易地出去所述之標籤。對於本發明的目的而言’可以使用多種表達載體系統。這些表達載體通常在宿主有機體中以附加體或宿主染色體DN A的整合部分的形式複製。表達載體可以包括控制序列，包括但不限於啓動子（例如天然相關的或異源的啓動子）、增強子、信號序列、剪接信號、增強子元件以及轉錄終止序列。優選的是’所述之表達控制序列爲能夠轉化或轉染真核宿主細胞的載體中的真核啓動子系統。表達載體還可以使用衍生自動物病毒（例如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆狀病毒、逆轉錄病毒（RSV、 MMTV或MOMLV)、巨細胞病毒（CMV)或SV40病毒）的 DNA元件。其他涉及具有內部核糖體結合位點的多順反子系統的使用。通常，表達載體包含選擇標記物（例如氨苄青黴素抗性 '潮黴素抗性、四環素抗性或新黴素抗體），從而允許檢測使用所需的D N A序列轉化的這些細胞（例如參見 Itakura et al.，美國專利4,704,362 )。可以通過引入一種或多種可以選擇被轉染的宿主細胞的標記物來選擇所述DNA 整合到其染色體中的細胞。所述之標記物可以爲營養缺陷型宿主提供原養型、生物殺滅劑抗性（例如抗生素）、或 -116- 201217527 對重金屬（例如銅）的抗性。可選擇的標記物基因可以與待表達的DNA序列直接連接，或者通過共轉化而被引入到相同的細胞中。

示例性的表達載體爲NEOSPLA (美國專利No. 6，1 59,73 0 )。該載體包含巨細胞病毒啓動子/增強子，小鼠β球蛋白主要啓動子、複製的SV40起源、牛生長激素的多腺苷酸序列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1和外顯子2、二氫葉酸還原酶基因以及前導序列。已經發現所述載體在倂入可變區和恒定區基因、轉染於細胞中、然後在包含G4 18 和甲氨蝶呤的培養基中選擇並進行擴增從而得到抗體的極高水準表達。此外，在美國專利No. 5,736,1 37和5,658,570 中還教導了載體系統，每一份文獻均以引用方式全文倂入本文。該系統提供了高的表達水準，例如>30 pg/細胞/天。其他示例性載體系統在（例如）美國專利No. 6,413,777 中有所公開。在其他實施方案中，可以使用多順反子構建體表達本發明的多肽。在這些表達系統中，可以由單一的多順反子構建體生產所關注的多基因產物，例如多聚體結合蛋白質的多個多肽。這些系統有利地使用內部核糖體進入位點（ IRES )，從而在真核宿主細胞中提供相對高水準的本發明的多肽。相容性的IRES序列在美國專利No. 6,193,980中有所公開，所述文獻同樣倂入本文。本領域的技術人員應該理解的是，可以使用此類表達系統來有效地生產本申請中公開的全長的多肽。 -117- 201217527

更通常地，一旦已經製備出編碼多肽的載體或DN A序列，則可以將所述之表達載體引入到合適的宿主細胞中。換言之，所述之宿主細胞可以被轉化。可以通過本領域的技術人員公知的多種技術來完成質粒向宿主細胞中的引入。這些技術包括但不限於轉染（包括電泳和電穿孔）、原生質體融合、磷酸鈣沉澱、與包膜DN A的細胞融合、微注射以及使用完整病毒的感染。參見Ridgway，A. A. G. "Mammalian Expression Vectors1' Chapter 2 4.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and D enhard t, Eds. (Butterworths， Boston, Mass· 1 98 8)。更優選的是，質粒向宿主中的引入爲電穿孔。被轉化的細胞是在適合生產輕鏈和重鏈的條件下生長的，並針對重鏈和/或輕鏈蛋白質的合成進行測試。示例性的測試技術包括酶連接的免疫吸附測試（E LI S A )、放射性免疫測試（RIA )、螢光啓動細胞分選分析（ FACS )、免疫組織化學等。

如本文所用，術語“轉化”被廣義使用，其是指將 DN A引入到受體的宿主細胞中，其改變了基因型並隨後使得受體細胞改變。同樣，“宿主細胞”是指已經使用重組DNA技術構建的、並編碼了至少一種異源基因的載體所轉化的細胞。在由重組宿主分離多肽的方法的描述中，術語“細胞”和“ 細胞培養物”可交換使用，從而指出了多肽的來源（除非另作清除的說明）。換言之，由“細胞”中回收多肽可以指由離心的全部細胞或者得自包含培養基和懸浮細胞的細

S -118- 201217527 胞培養物。用於蛋白質表達的宿主細胞系最優選的是哺乳動物起源的；相信，本領域的技術人員能夠優選地測定最適用於其中待表達的所需基因產物的特定宿主細胞系。示例性的宿主細胞系包括但不限於CHO，例如DG44和DUXB 1 1 (中國倉鼠卵細胞系，DHFR- ) 、HELA (人類宮頸癌細胞）

、CVI (猴腎細胞系）、COS (具有SV40T抗原的CVI衍生物）、R16 10 (中國倉鼠成纖維細胞）、BALBC/3T3 (小鼠成纖維細胞）、HAK (倉鼠腎細胞系）、SP2/0 (小鼠骨髓瘤細胞）、P3.times_63-Ag3.653 (小鼠骨髓瘤細胞）、8?人-1£：18?1'(牛內皮細胞）、RAJI (人類淋巴細胞）、Pei：C6和293 (人類腎細胞）。宿主細胞系通常得自商業服務機構（美國典型微生物菌種保藏中心（American Tissue Culture Collection))，或者得自公開的文獻。在一個實施方案中，宿主細胞在以內源方式表達出在加工形成成熟多肽的過程中切割所述多肽連接體（L)的酶 (或者多種酶）。在所述之加工過程中，所述之多肽連接體（L)被基本除去，從而減少了外源氨基酸的存在。在本發明的另一個實施方案中，轉化宿主細胞，從而表達出對於所述細胞而言爲異源的或外源的一種或多種酶，使得對所述多肽連接體（L)的加工得以發生或改善。在一個實施方案中’可以以內源方式或外源方式被細胞表達的酶爲弗林蛋白酶家族的成員。人類弗林蛋白酶的完整cDNA和氨基酸序列（即，PACE)在1990. Van den -119- 201217527

Ouweland A M et al. ( 1 990) Nucleic Acids Res. 1 8:664; Erratum in: Nucleic Acids Res. 1 8:1 3 32 ( 1 990)中公開。

Barr et al.所發佈的美國專利No. 5,460,95 0描述了重組PACE以及PACE與異源蛋白質的底物前體多肽共表達，從而改善了活性的、成熟的異源蛋白質的表達。乂811(16'\^116131.所發佈的美國專利1^〇.5,935,815同樣描述了重組人類弗林蛋白酶（即，PACE )以及弗林蛋白酶與異源蛋白質的底物前體多肽共表達，從而改善了活性的、成熟的異源蛋白質的表達。本專利中所公開的可行的底物前體包括因數IX的前體。除了 PACE以外，哺乳動物弗林蛋白酶/枯草桿菌蛋白酶/Kex2p樣前蛋白轉化酶（PC)家族中的其他家族成員被報導包括PC1/PC3，PC2，PC4, PC5/6 (下文簡稱爲 PC5), P ACE4 以及 LPC/PC7/PC8/SPC7。雖然這些不同的成員均具有某些保守的整體性結構特徵，但是它們在組織分佈、亞細胞定位、切割特異性以及優選的底物方面不同。綜述參見Nakayama K (1997) Biochem J. 327:625-35。與PACE類似，所述之前蛋白轉化酶通常包含 (由氨基末端開始）信號肽、前肽（其可以以自我催化的方式切割）、表徵爲Asp，His，Ser和Asn/Asp殘基的枯草桿菌蛋白酶樣催化結構域、以及Homo B結構域（其同樣爲催化活性所必須的，並且可表徵爲Arg-Gly-Asp (RGD)序列 )。此外，PACE，PACE4和PC5還包括富含Cys的結構域’ 其功能是未知的。此外，PC5具有帶有及不帶有跨膜結構域的同種型；這些不同的同種型分別稱爲PC5B和PC5A。 -120- 201217527 PACE的催化結構域的氨基酸序列與前蛋白轉化酶家族其他成員的催化結構域的氨基酸序列之間的比較表明了以下程度的一致性：與PC4爲70%:與PACE4和PC5爲65%;與 PC1/PC3 爲 61%;與 PC2 爲 54%;以及與 LPC/PC7/PC 8/SPC7 爲 51%° Nakayama K (1997) Biochem J. 327:625-35 °

已經報導PACE與PACE4具有部分重疊，但是底物不同。特別是，與PACE顯著不同的是，已經報導PACE4不能加工 FIX 的前體多肽。Wasley L C et al. (1 993) J Biol Chem. 268:8458-65; Rehemtulla A et al. (1 9 9 3) Biochemistry. 32:1 1 586-90 °

Seidah et al.所發佈的美國專利No. 5,840,529公開了人類PC7的核苷酸和氨基酸序列，以及與其他PC家族成員相比？〇7切割111¥§?160至§?120和8?41的顯著能力。

齧齒動物PC5的核苷酸和氨基酸序列首先被Lusson J et al. (1 993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6691 -5 描述爲 PC5 ，並被 Nakagawa T et al· (1 993) J Biochem (Tokyo) 113:132-5描述爲PC6。Day et al·所發佈的美國專利；^〇· 6,380,171公開人類PC5A的核苷酸和氨基酸序列，其同種型不具有跨膜結構域（例如參見美國專利7,795,400和 7,566,595 )。此外’編碼本發明多肽的基因還可以在非哺乳動物的細胞（例如細菌、酵母菌或植物細胞）中表達。就這一點而言，應該理解的是，多種單細胞非哺乳動物微生物（例如細菌）也可以被轉化；即，能夠在培養或發酵過程中生 -121 - 201217527 長的那些。易於轉化的細菌包括腸桿菌科的成員，例如大腸桿菌或沙門氏菌的株系；芽孢桿菌科，例如枯草桿菌；肺炎球菌；鏈球菌和流感嗜血桿菌。應該進一步理解的是，當在細菌中表達時，所述多肽通常爲包含體的一部分。所述多肽必須被分離、純化，然後組裝到功能分子中。

除了原核生物以外，還可以使用真核微生物。雖然大量的其他株系通常是可得的，但是在真核微生物中，最通常的是使用釀酒酵母（S a c c h a r 〇 m y c e s c e r e v i s i a e )或普通的麵包酵母。對於表達而言，在酵母屬中，通常使用（例如）質粒 YRp7 ( Stinchcomb et al·，Nature, 282:39 (1979); Kingsman et a 1., Gene, 7:1 4 1 (1 979); Tschemper et al.,

Gene，1 0:1 5 7 ( 1 9 8 0))。所述質粒已經包含TRP1基因，該

基因爲在色氨酸缺乏生長能力的酵母突變株系提供選擇標記物，例如 ATCC No. 44076 或 PEP4-1 ( Jones, Genetics, 8 5:1 2 ( 1 977))。作爲酵母宿主細胞基因組特徵的Trpl耗竭的存在通過在色氨酸缺乏的條件下生長來提供檢測轉化的有效環境。此外，還可以使用其他酵母宿主，例如畢赤酵母。具有表達控制序列（例如啓動子）、複製起點、終止序列等的酵母菌表達載體是所需的。典型的啓動子包括 3-磷酸甘油酸激酶以及其他糖解酶。除此之外，可誘導的酵母菌啓動子包括得自醇脫氫酶，異細胞色素C，以及用於甲醇、麥芽糖和半乳糖用途的酶的啓動子。或者，編碼多肽的核苷酸序列可以被倂入到轉基因中，以用於引入到轉基因動物的基因組中，並在隨後在轉基

-122- S 201217527 因動物的milk中表達（例如參見Deboer et al·，US 5,741,9 5 7, Rosen, US 5,304,489 以及 Meade et al·，US 5,849,992 )。合適的轉基因包括與啓動子和增強子可操作地連接的多肽編碼序列，其中所述之啓動子和增強子得自哺乳動物腺體特異性基因，例如酪蛋白或β乳球蛋白。

體外生產可以以按比例增多的方式得到大量的所需多肽。用於在組織培養條件下培養哺乳動物細胞的技術是本領域已知的，並且包括同質的懸浮培養（例如在氣升式反應器中、在連續攪拌反應器中），或固定化或嵌入式細胞培養（例如中空纖維中、微囊中、瓊脂糖微珠上或陶瓷柱上）。如果必須和/或需要的話，可以（例如）在合成鉸鏈區多肽被優選生物合成之後、或者在本文所述之HIC色譜之前或之後，通過傳統的色譜方法來純化多肽溶液，例如凝膠過濾、離子交換色譜、在DEAE纖維素上的色譜或者（免疫）親和色譜。親和性標籤序列（例如His (6)標籤 )可以可任選的連接或包含在所述之多肽序列中，從而有利於下游的純化。在一個實施方案中，本發明的宿主細胞可以包含這樣的基因構建體，該構建體編碼了 scFc多肽以及可以切割多肽連接體（L)的一種或多種酶。可以使用單一的載體或兩個載體表達所述之構建體和酶。當在分離的表達載體上克隆所述多肽時’所述之載體被共轉染，從而獲得表達以及完整的整體蛋白質的組裝。與現有技術的方法相比，對於所需的異源二聚體的兩 -123- 201217527 條鏈成熟蛋白質而言’題述方法得到了基本富集的白質群體。在一個實施方案中，本發明的成熟多肽基本上沒有未加工的（即，單鏈形式的所述多肽）所述之成熟兩條鏈蛋白質一旦被表達，則可以準的方法純化所述之蛋白質，包括硫酸銨沉澱、親譜、HPLC純化、凝膠電泳等（通常參見Scopes， Purification (S p r i n g e r - V e r 1 a g, N.Y., ( 1 98 2))。對用途而言，均一性爲至少大約90至95%的基本純的是優選的，均一性爲98至99%、或更高爲最優選的。體外生產可以以按比例增多的方式得到大量的肽。用於在組織培養條件下培養哺乳動物細胞的技領域已知的，並且包括同質的懸浮培養（例如在氣應器中、在連續攪拌反應器中），或固定化或嵌入培養（例如中空纖維中、微囊中、瓊脂糖微珠上或上）。如果必須和/或需要的話，可以通過傳統的法來純化多肽溶液，例如凝膠過濾、離子交換色譜相互作用色譜（HIC)、在DEAE纖維素上的色譜或者譜。 IV.多肽的純化在一個實施方案中，本發明涉及本發明的成熟子的純化方法，其中所述之多肽分子是以包含非基的Fc的Fc區的雙鏈形式（即，二聚體）表達的。所可以由包含基因融合的Fc區以及其他污染物的未加成熟蛋組合物〇根據標和柱色 Protein 於藥物蛋白質所需多術是本升式反式細胞陶瓷柱色譜方、疏水親和色多肽分因融合述分子工分子 -124- 201217527 中分離得到。純化方法是本領域已知的，並且包括（例如 )體積排阻色譜、凝膠過濾柱、SDS-PAGE等。本發明還涉及雙鏈分子的純化群體。 V.功能部分對多肽的標記或綴合

本發明的多肽可以以非綴合的形式使用，或者可以與多個功能部分中的至少一者綴合，從而（例如）有利於靶的檢測或者用於患者的成像或治療。在進行純化時，本發明的多肽可以在純化前或純化後標記或綴合。具體而言，本發明的多肽可以與功能部分綴合（例如通過基因工程改造的半胱氨酸殘基）。除了結合位元點之外，功能部分優選地與所述多肽的一部分連接（例如基因融合的Fc區的多肽連接體或Fc部分（即，cscFc區））。示例性的功能部分包括細胞毒素（例如放射性同位素、藥劑或毒素）治療試劑、細胞生長抑制劑、生物學毒素、前藥、肽、蛋白質、酶、病毒、脂質以及生物應答修飾劑。 VI·給藥本發明的多肽的方法[加入語：止血紊亂的再治療] 製備本發明的多肽以及向受試者給藥本發明的多肽的方法是公知的，並且本領域的技術人員可以容易地測定。向受試者給藥的組合物包括核酸分子以及多肽分子，其中所述之核酸分子無論是否經過加工都包含編碼本發明 -125- 201217527 的分子的核苷酸序列（用於基因治療應用）。本發明多肽的給橥途徑可以爲口服、腸胃外、吸入或局部。如本文所用，術語“腸胃外”包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或陰道給藥。靜脈內、動脈內、皮下和肌肉內的腸胃外給藥方式通常是優選的。儘管所有這些給藥形式都明確地作爲本發明範圍內的內容來考慮，但是給藥形式對於注射方式而言應該爲溶液，特別是對靜脈內或動脈內注射或滴入更是如此。通常，用於注射的合適的藥物組合物可以包含緩衝劑（例如醋酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑）、表面活性劑（例如聚山梨醇酯 )、可任選的穩定劑（例如人類清蛋白）等。然而，在與本文的教導相容的其他方法中，所述之多肽可以直接被傳遞至不利的細胞群體的位點處，從而增加疾病組織在治療試劑中的暴露》用於腸胃外給藥的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實例爲丙二醇、聚乙二醇、植物油（例如橄欖油）以及可注射的有機酯（例如油酸乙酯）。水性載體包括水、含醇的/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水以及緩衝介質。在題述發明中，可藥用的載體包括但不限於0.01-0.1Μ’並且優選的是0.05Μ磷酸緩衝劑或〇 . 8 %的鹽水。其他普通的腸胃外媒介物包括磷酸鈉溶液、Ringer葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸Ringer或者不揮發性油。靜脈內媒介物包括流體和營養補充物、電解質補充物（例如基於Ringer葡萄的那些）等。此外，還可 -126- 201217527 以存在代表物以及其他添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。

更具體而言，適用於注射用途的藥物組合物包括無菌水性溶液（在可溶于水的情況下）或者分散劑、以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散劑的無菌粉末。在這種情況下，所述之組合物必須是無菌的，並且應該是流動達到可容易地注射（syringability )的程度。所述之組合物在製造和儲存條件是應該是穩定的，並且優選地被保藏以對抗微生物（例如細菌和真菌）的污染作用。所述之載體可以爲包含（例如）水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）以及它們的合適的混合物的溶劑或分散介質。例如，可以通過使用塗料（例如卵磷脂）、在分散劑的情況下通過保持所需的粒徑、以及通過使用表面活性劑來保持合適的流動性。可以通過多種抗細菌劑和抗真菌劑（例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等）來取得抑制微生物的作用。在許多情況下，優選的是所述組合物中包含等滲試劑，例如糖 '多糖（例如甘露醇）、山梨醇或氯化鈉。可以通過在所、述之組合物中包含能夠延遲吸收的試劑（例如單硬脂酸鋁和凝膠來取得可注射組合物的延遲的吸收。在任何情況下，可以根據需要通過在合適的溶劑中（具有本文所列舉的一種成分或多種成分的組合）倂入所需量的活性化合物（例如多肽本身或者是多肽與其他活性試 -127- 201217527 劑相結合）、然後通過過濾除菌來製備無菌可注射溶液。通常，通過將所述之活性化合物倂入到無菌媒介物中來製備分散液，其中所述之無菌媒介物包含鹼性分散介質以及得自上文所列舉的那些的所需其他組分。在使用無菌粉末

I 來製備無菌可注射溶液的情況下，優選的製備方法爲真孔乾燥以及冷凍乾燥，其得到了活性組分以及任何額外的所需組分（得自其之前經過無菌過濾的溶液）的粉末。根據本領域已知的方法，對用於注射的製備物進行加工、過濾到容器（例如安瓿、袋、瓶子、注射器或小瓶）中，並在無菌條件下密封。此外，所述之製備物可以被包裝並以試劑盒的形式（例如在共同未決的U.S.S.N. 09/25 9,3 3 7和 U.S.S.N. 09/2 5 9,3 3 8中所描述的那些，每一份文獻均以引用方式併入本文）出售。此類製造製品優選的是具有表明相關組合物可用於治療患有或易於患有自身免疫或贅生物紊亂的受試者的標記或包裝插入物》用於治療多種狀況的本發明的組合物的有效劑量會根據多種不同因素（包括給藥的方式、靶位元點、患者的生理學狀態、患者爲人類還是動物、所給予的其他醫藥以及治療爲預防性的還是治療性的）而改變。通常，所述患者爲人類，但是非人類的哺乳動物（包括轉基因哺乳動物）也可以治療。可以使用本領域的技術人員已知的常規方法來確定治療劑量，從而使安全性和效力達到最佳。在一個實施方案中，生物學活性部分的劑量可以爲大約 25 至 100 IU/kg，例如 0.417 mg/kg 至 1.67 mg/kg。在另一 -128- 201217527 個實施方案中，生物學活性部分（例如包括FVIII)的劑量可以爲大約25至65 IU/kg，例如0.003 125 mg/kg至 0.008125 mg/kg。在另一個實施方案中，生物學活性部分 (例如包括FVII)的劑量可以爲大約90至270 IU/kg，例如 0.090 mg/kg至 0.270 mg/kg °

在另一個實施方案中，所述之劑量可以爲（例如）大約1 000 ug/kg至0.1 ng/kg體重。在一個實施方案中，所述之劑量範圍爲1 ug/kg至1〇〇 ug/kg。在另一個實施方案中，劑量可以爲0.0001至100 mg/kg、更通常爲0.01至5 mg/kg (例如 0.02 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.75 mg/kg，1 mg/kg，2 mg/kg等）的宿主體重。例如，劑量可以爲1 mg/kg體重或10 mg/kg體重，或者在i_i〇 mg/kg的範圍內，優選爲至少1 mg/kg。此外，處於上述範圍內的劑量也將在本發明的範圍內。受試者可以每天、每隔一天、每星期或根據經驗分析所 ^ 確定的任何其他時間表來給藥上述劑量。示例性的治療方法需要在長時間內（例如至少6個月）以多計量的方式給藥。其他示例性的治療方案需要每兩個星期給藥一次，或者每個月給藥一次，或者每3至6個月給藥一次。示例性的劑量時間表包括在連續多天內給藥1-10 mg/kg或者15 mg/kg，每隔一天給藥30 mg/kg，或者每星期給藥60 mg/kg 。在一些方法中’具有不同結合特異性的兩種或多種多肽可以同時給藥’在這種情況下，給藥的各種多肽的劑量落入所述之範圍內。 -129- 201217527 本發明的多肽可以在多種時機下給藥。單次劑量之間的間隔可以爲每週、每月或每年。此外，間隔還可以爲不規則的’其可以通過測量患者中修飾多肽或抗原的血液水準來表明。在一些方法中，調節劑量，從而得到1-1000 ug/ml的修飾多肽的血漿濃度，並且在某些方法中爲25-300 ug/ml。或者，多肽可以以緩釋配製物的形式給藥，在這種情況下，需要低頻率的給藥。劑量和頻率可以根據患者中多肽的半衰期而改變。給藥劑量和給藥頻率可以根據所述之治療是預防性的還是治療性的而改變。在預防性的應用中，將包含本發明的多肽或其混合物的組合物給予尙未處於疾病狀態的患者 ’從而增強患者的抵抗力。該量定義爲“預防性有效劑量 ”。在治療性應用中，通常需要處於相對短的時間間隔的相對高的劑量（例如大約1至4〇Omg/kg肽/劑量，對於放射性免疫綴合物而言，更通常使用大約5至25 mg的劑量，而對於細胞毒素-藥劑修飾的多肽而言需要更高的劑量），直到疾病進程被減慢或終止，並且優選的是直到患者顯示出疾病症狀部分或完全減輕。因此，可以給予患者預防性的方法。本發明的多肽可以可任選地與可以有效地治療紊亂或狀況（需要治療，例如預防性的或治療性的）的其他試劑結合給藥。儘管本發明的多肽可以直接按照上文所述給藥，但是必須強調的是在其他實施方案中，多肽可以作爲一線治療 -130- 201217527 給藥其他的健康患者。在這種實施方案中，所述之多肽可以給予具有正常或平均紅骨髓儲量的患者，和/或未患病 (undergoing )及沒有正在患病的患者。如本文所述，與輔助治療綴合或結合給藥的本發明的多肽是指依次、同時、同延、並行、伴隨或同期給藥或應用所述之治療以及所公開的多肽。本領域的技術人員應該理解的是，可以將結合治療方案的各種成分的給藥或應用定時，從而增強治療 φ 的整體效果。例如，化療或生物學試劑可以以標準的公知的治療過程與題述分子結合給藥。技術人員（例如醫生）能夠在無需過度的試驗的條件下，根據所選的輔助治療以及本說明書的教導而容易地分辨有效的結合治療方案。就這一點而言，應該理解的是，所述多肽與所述試劑的組合可以以能夠爲患者提供治療益處的任何順序以及在任何時間期限內給藥。換言之，所述之試劑及多肽可以以任何順序或同時給藥。在所選的實施方案中，將本發明的 φ 多肽給予之前經歷過化療的患者。在其他實施方案中，所述之多肽與化療治療基本同時或者同時給予。例如，給予所述患者以所述多肽，同時經歷一段時間的化療。在優選的實施方案中，在任何試劑或治療的1年內給予所述之多肽。在其他優選的實施方案中，在任何試劑或治療的10、 8、6、4或2個月內給予所述之多肽。在其他優選的實施方案中，在任何試劑或治療的4、3、2或1星期內給藥所述之多肽。在其他實施方案中，在所選試劑或治療的5、4、3 、2或1天內給藥所述之多肽。應該進一步理解的是在大約 -131 - 201217527 幾小時或幾分鐘內（即，基本同時）給藥兩種試劑或治療〇在一個實施方案中，本發明的多肽以核酸分子的形式給藥。可以使用本領域已知的技術來給藥核酸分子，包括通過載體、質粒、脂質體、DN A注射、電穿孔、基因槍、靜脈內注射或肝動脈輸注。在基因治療實施方案中使用的載體是本領域已知的。應該進一步理解的是，本發明的分子可以與一種或多種試劑結合或組合使用（例如提供結合治療方案）。本發明的分子可以結合的示例性試劑包括對於待治療的特定紊亂而言、代表了當前的護理標準的試劑。術語“生物學” 或“生物學試劑”是指由活體有機物制得的任何藥物活性試劑和/或將用作治療劑的它們的產品。與本發明的多肽結合使用的試劑的量可以根據受試者的不同而改變，或者可以根據本領域所知來給藥。例如參見 Bruce A Chabner et a 1., Antineoplastic Agents, in

Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1 2 3 3 - 1 28 7 ((Joel G. Hardman et al ·，eds ·，9th ed. 1 996)。在另一個實施方案中，給予符合護理標準的所述試劑的量。如之前討論的那樣，可以以用於體內治療哺乳動物紊亂的藥物有效量來給藥本發明的多肽。就這一點而言，應該理解的是，可以將對本發明的分子進行配製，從而有利於給藥並促進活性試劑的穩定性。優選的是，根據本發明 -132· 201217527

的藥物組合物包含可藥用的無毒無菌載體，例如生理學鹽水、無毒性的緩衝劑、防腐劑等。對於本申請的目的而言，應該保持本發明的多肽（與治療試劑綴合的，或未與治療試劑綴合的）的藥物有效量是指足以取得與抗原有效結合以及足以取得益處（例如減輕疾病或紊亂的症狀，或者檢測物質或細胞）的量。在腫瘤細胞的情況下，優選的是所述多肽能夠與贅生物或免疫反應性細胞上所選的免疫反應性抗原相互作用，並使得這些細胞的死亡增加。當然，本發明的藥物組合物可以以單劑量或多劑量的形式給藥，從而得到藥物有效量的多肽。與本公開的範圍保持一致，可以根據之前所述之治療方法以定以產生治療或預防效果的量來向人類或其他動物給藥本發明的分子。可以將本發明的分子以傳統的劑型給藥所述之人類或其他動物’其中所述之劑型是根據已知的技術，通過將所述之多肽與常規的可藥用載體或稀釋劑相 φ 結合而製備得到的。本領域的技術人員應該認識到’可藥用的載體或稀釋劑的形式和特徵可以由待結合的活性組分的量、給藥的途徑以及其他公知的變數來表示。本領域的技術人員應該進一步理解的是包含本發明的—種或多種多肽的混合物可以證明是特別有效的。通過以下實例進一步說明本發明’所述之實例不應該解釋爲限制性的。本申請全文所引用的所有文獻、專利和公開專利申請的內容均以引用方式倂入本文。 -133- 201217527 【實施方式】在實例的全部內容中，除非另作說明，否則使用以下材料和方法。實例1 : pSYN-FVII-024的克隆使用以下引物，通過與聚合酶鏈式反應偶聯的逆轉錄 ’由人類肝臟mRNA文庫（Ambion，Austin，Texas)得到 FVII的編碼序列，其中所述之引物爲： FVII-F1 GGGAATGTCAACAGGCAGGG (SEQ ID NO: 41) FVII-R1 CTTGGCTTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO:42) 在MJ熱迴圈儀中，根據製造商的標準方法，使用具有 Platinum Taq 系統（Invitrogen， Carlsbad, Calif.)的 Superscript One-step RT-PCR，用均爲 lOpmol的各種引物，進行體積爲50 μΐ的反應。所用的迴圈爲：50°C，30分鐘，用於逆轉錄；然後在94°C下變性，並進行30個迴圈（94 °C，3 0 秒；5 3 °C，3 0 秒；7 2 °C，9 0 秒）；然後在 7 2 °C 下， 10分鐘。所預計的、具有一定尺寸的條帶（〜1 400 bp)爲使用 Gel Extraction試劑盒（Qiagen，Valencia, Calif.)凝膠純化的，並使用 TOPO ΤΑ Cloning 試劑盒（Invitrogen， Carlsbad, Calif.)克隆於pCR2.1 TOPO中，從而得到中間體質粒pSYN-FVΠ-00 1。爲了構建用於表達雙鏈FVII-Fc及Fc 異源二聚體的質粒，使用以下引物PCR擴增所述之FVII編 -134- 201217527 碼序列，所述引物爲‘·

Hindin-Kozak-FVII-F CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG (SEQ ID NO： 43)

Bspel-Fc-FVII-R

CGACTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGGAAATGGGG CTCGCAGG (SEQ ID NO: 44)

正向引物Hindlll-Kozak-FVII-F加入Hindlll限制性位點，其後爲Kozak序列，其下游緊鄰爲FVII編碼區。反向引物Bspel-Fc-FVII-R加入包含氨基酸22 1 -233(EU編號）的 IgGl恒定區的片段（Fc區）。此外，所述方法還利用基因密碼子的簡並性，在氨基酸2 3 1 -23 3處倂入了 BspEI限制性位點，從而保持了正確的氨基酸序列（EU編號）。在MJ熱迴圈儀中，根據製造商的方法，使用Platinum Pfx DNA聚合酶系統，用均爲15 pmol的各種引物和範本pSYN-FV 11-001，進行體積爲50 μΐ的反應，其中所述之反應使用以下迴圈： 9 5 °C，2 分鐘；30 個迴圈(95〇C，15 秒；4 9〇C，30 秒;68 t，90秒）；68°C，10分鐘。使用Hindlll和BspEI消化質粒 pSYN-FIX-027 (pBUD FIXFc/Fc)，使用 Gel Extraction試劑盒（Qiagen，Valencia，Calif.)由FIX插入物（預計尺寸的條帶爲大約1 480bp)中純化出用於載體（大約5 800bp)的、所預計的、具有一定尺寸的條帶（〜1400 bp)。然後，在除去FIX插入物後，將PCR擴增的FVII序列亞克隆到衍生自pSYN-FIX-027的載體的Hindlll和EcoRI位點。該過程形成 pSYN-FVII-002 (pBUD FVIIFc/Fc)。然後，使用以下引 -135- 201217527 物，將（GGGGS)6x多肽連接體插入到pSYN-FVII-002中的 FVII與Fc區編碼序列之間，其中所述引物爲： FVII-連接體-F : CATCCCCAGCACGTACGTCC (SEQ ID NO: 45) FVII-連接體-R : GGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGAT CCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCA CCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG (SEQ ID NO: 46)

Fc-連接體-F : GACAAAACTCACACATGCCCACC (SEQ ID NO: 47)

Fc-連接體-R : GCAGAATTCTCATTTACCCGGAG (SEQ ID NO: 48) 在MJ熱迴圈儀中，根據製造商的標準方法，使用 Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind·)，使用 12pmol 的 FVII-連接體-F 和 FVII-連接體-R (反應1 )、或者Fc-連接體-F和Fc-連接體-R (反應2 )來進行兩個體積爲12 μΐ PCR的反應。使用1 ug的 pSYN-FVII-002作爲範本，使用以下迴圈來進行第一和第二反應：94°C，2 分鐘；14 個迴圏（94°C，30 秒：55°C， 30 秒；72 °C ，2 分鐘）：72°C ，10 分鐘。使用 Gel

Extraction試劑盒（Qiagen，Valencia, Calif.)凝膠純化所預計的、具有一定尺寸的條帶（反應1爲53 2bp，反應2爲 67 0bp )，然後按照上文所述在PCR反應中將所述條帶與25 pmol的FVII-連接體-F和Fc-連接體-R結合，不同之處在於 -136- 201217527 擴增30個迴圈。使用Gel Extraction試劑盒（Qiagen， Valencia，Calif.)凝膠純化所預計的、具有一定尺寸的條帶 (1 200 bp)，並用限制性酶ΚρηΙ和EcoRI消化。按照上文所述凝膠純化所預計的、具有一定尺寸的條帶（92 0 bp)，並將該條帶克隆到pSYN-FVII-002的KpnI/EcoRI位點中’從而得到 pSYN-FVII-003 ( pBUD FVIIFc/6x(GGGGS) (SEQ ID NO: 36)/Fc)。

表達雙鏈異源二聚體的pSYN-FVII-024的克隆生成質粒（pSYN-FVII-024)，以用於雙鏈異源二聚體的表達，其中一條鏈由FVII輕鏈（殘基1-152)構成，所述輕鏈後爲（GGGGS)6x (SEQ ID NO·· 36) 連接體’其後爲Fc區，而另一條鏈包含FVII重鏈（殘基1 53-406 ) ’其後爲（GGGGS)6x (SEQ ID NO: 36)連接體，然後爲Fc區。涉及質粒以使其表達單一多肽形式的異源二聚體，其中所 φ 述FVII重鏈-連接體-Fc鏈的C末端通過以下多肽序列與所述重鏈-連接體-Fc鏈的N末端連接：111111113-(00003)6)(- RKRRKR (SEQ ID NO: 50)，其中 RRRRS (SEQ ID NO: 38) 和RKRRKR (SEQ ID NΟ : 3 9)序列爲前蛋白轉化酶切割位點。前蛋白轉化酶在各個切割位點處的最後一個Arg之後的細胞內切割可以除去所述之多肽連接體。因此，細胞能夠表達2鏈異源二聚體，其中所述之FVII輕鏈-連接體-Fc鏈在C末端具有RRRRS (SEQ ID NO: 38)序列’但是所述連接體與RKRRKR (SEQ ID NO : 3 9)序列的剩餘部分已經另外 -137- 201217527 除去。pSYN-FVII-024和多個中間體質粒的構建需要使用以下引物：

Hindlll-Sall-BpEI-Fc-F AGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACC (SEQ ID NO: 51)

BamHI-連接體(PACE 1 )-Fc-R

CATCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATC CGCCGCCACCGCTCCGGCGGCGCCGTTTACCCGGAGACAGGGAGAGG (SEQ ID NO: 52)

Hindlll-Kozak-FVII-F

CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG (SEQ ID NO: 43) BspEI-Fc-連接體-FVIILC-R GAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCC ACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCC ACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGG (SEQ ID NO: 53)

BamHI-2x 連接-pace-HC-F CAGTCTGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGATCAAGGAAGAGGAG GAAGAGGATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCC (SEQ ID NO: 54)

Fc-EcoRI-R ATGTCTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG (SEQ ID NO: 55) 爲了生成第一個中間體質粒，在MJ熱迴圈儀中，根據製造商的標準方法，使用Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)，使用 2 5 pmol 的弓I 物 Hindlll-Sall-BpEI-Fc-F 和 BamHI-連接體（PACE1)- -138- 201217527

Fc-R、以及範本pSYN-Fc-001來進行PCR反應。使用以下迴圈：9 5 °C，2 分鐘；30 個迴圈(95〇C，30 秒；5 8 °C，30 秒；72°C，1分鐘）；72 °C，10分鐘。按照上文所述將正確尺寸的條帶（大約730bp )凝膠純化，並克隆到 PBUDCE4 載體（Invitrogen， Carlsbad, Calif.)的 Hindlll/BamHI位點中，從而生成pSYN-FVII-014。使用引物 HindIII-SalI-BpEI-Fc-F和 8 3111111-連接體（？八〇丑1)-?〇-11進行PCR擴增，生成編碼Fc區（氨基酸A X-Y)的一部分的DNA 片段，其中所述之Fc區後面爲RRRRS (SEQ ID NO: 38)序列和（GGGGS)2x(SEQ ID NO: 29)多狀連接體。引物 HindIII-SalI-BpEI-Fc-F在所述分子的 5’末端引入了 Hindlll 和Sail限制性位點，而引物BamHI-連接體（PACEl)-Fc-R在 3’末端引入了 BamHI，其中所述之3’末端與編碼GGGGS (SEQ ID NO: 56)連接體的最後2個殘基的密碼子（具有密碼子GGA TCC的殘基GS )部分重疊。接著，按照上文所述，採用與克隆pSYN-FVII-014所述相同的條件（但是退火溫度爲57 °C )，使用引物 HindIII-Kozak-FVII-F和 BspEI-Fc-連接體- FVnLC-R、以及範本pSYN-FVII-002來進行另一個PCR反應。將具有預定尺寸的條帶（大約700bp )凝膠純化，並克隆到pSYN-FVII-014 的 Hindlll 和 BspEI位點處，從而生成 pSYN-FVII-023。弓| 物 HindIII-Kozak-FVII-F 和 BspEI-Fc-連接體-FVIILC-R擴增了編碼FVII輕鏈的DNA片段，其中在所述之輕鏈後爲（GGGGS)6x(SEQIDNO:36)多肽連接體以及達到 -139- 201217527 氨基酸232 ( EU編號）的Fc區的一部分。引物Hindlll-K〇Zak_FVII-F在所述分子的5’末端引入的Hindlll限制性位點（其後爲Kozak序列），而引物BspEI-Fc-連接體-FVIILC-R在所述分子的3’末端加入了 Bspel位點。

在最後一步中，按照上文所述使用引物BamHI-2x連接-pace-HC-F 和 Fc-EcoRI-R、以及弓丨物 pSYN-FVII-003 來實施PCR反應，其中採用以下迴圈：95°C ’ 2分鐘；30個迴圈(95〇C，30 秒；5 5〇C，30 秒：72。。，2 分鐘）；7 2〇C，7 分鐘。該PCR反應生成了編碼（GGGGS)2x (SEQ ID NO: 29) 多肽連接體的DNA分子，其後爲RKRRKR (SEQ ID NO: 39) 序列，然後爲FVII重鏈《引物BamHI-2x連接-pace-HC-F和 Fc-EcoRI-R分別在所述分子的5’末端和3’末端引入了 BamHI位點和EcoRI位點。將預計尺寸的條帶（大約 1 600bp )克隆到 pSYN-F VII-023 的 BamHI和 EcoRI位點中，從而生成pSYN-FVII-024。pSYN-FVII-023的最終翻譯結構示于圖1B中。實例2.包含FIX-Fc的異源二聚體的構建 pSYN-FVII-044的克隆構建質粒pSYN-F IX _ 04 4以用於表達在細胞中以單鏈蛋白質形式生成的2鏈FIX-Fc和Fc異源二聚體，其中編碼 FIX-Fc的DN A區域通過編碼以下多肽序列的DNA片段與第二個 Fc編碼區連接：RRRRS-(GGGGS)4x-RRRR (SEQ ID NO: 57)，其中RRRR (SEQ ID NO: 40)序列爲前蛋白轉化 s -140- 201217527

酶切割位點。然後，前蛋白轉化酶在細胞內切割RRRRS (SEQ ID NO: 38)和RRRR (SEQ ID NO: 40)序列中最後 Arg 的5’末端。由此，細胞表達了 2鏈FIX-Fc/Fc異源二聚體，其中FIX-Fc鏈在C末端具有RRRRS (SEQ ID NO: 38)序列，但是所述連接體和3’ RRRR (SEQ ID NO: 40)序列的剩餘部分已經另外除去。就該目的而W，DNA片段（〇6113(：1^卜 FIX - 0 4 4)的合成是外包的（G e n s c r i p t，P i s c a t a w a y，N J)。該片段由編碼Fc區的一部分（殘基23 1 -447(EU編號））的 DNA序列構成，其中所述之Fc區之後爲RRRRS (SEQ ID NO: 38)序列，其後爲（GGGGS)4x (SEQ ID NO: 6)多肽連接體和RRRR (SEQ ID NO: 40)序歹丨J，其下游爲Fc區的另一部分（殘基22 1 -2 3 0 )。編碼位於所述分子5’端的Fc區殘基 23 1 -233的DNA區域與BspEI位元點部分重疊，而編碼所述分子3’端的Fc區殘基236-238的區域包括RsrII限制性位元點。設計Genscript-FIX-044，採用基因密碼子降解來除去 5’ Fc區的RsrII位點和3’ Fc區的BspEI位點，從而得到正確的氨基酸序列。使用限制性酶BspEI和RsrII切割Genscript-FIX-(M4，並將其克隆到PSYN-FIX-029的同位點中，從而生成pSYN-FIX-〇44。pSYN-FVII-044最終翻譯結構示于圖 1B中。實例3.包含FVII-Fc和MB9-FC的異源二聚體的構建體 pSYN-FVII-027的克隆生成質粒（pSYN-FVII-027)以用於表達FVII-Fc和MB9- -141 - 201217527

Fc異源二聚體，其中MB9爲之前所示的與活性血小板上的受體GPIIb/IIIa結合的scFv。得自pS YN-FVII-027的蛋白質在所述細胞上以單一多肽形式表達，其中所述FVII-Fc亞單元的C末端通過（GGGGS)6x (SEQ ID NO: 36)多肽連接體與MB9-Fc亞單元的N末端連接。此外，RRRRS (SEQ ID NO: 38)和RKRRKR (SEQ ID NO: 39)序列分別插在所述多肽連接體的5’和3’末端，以便通過前蛋白轉化酶在各個序列的最後Arg處進行細胞內切割。因此，細胞表達了 2鏈 FVII-Fc/MB-Fc異源二聚體，其中所述之FVII-Fc鏈在C末端具有RRRRS (SEQ ID NO: 38)序列，但是所述連接體與 RKRRKR (SEQ ID ΝΟ : 3 9)序列的剩餘部分已經另外除去〇在第一個步驟中，使用以下引物生成一系列中間體質企丄 · m ·

HindIII-SalI-BpsEI-Fc-F AGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACC (SEQ ID NO: 51)

BamHI-連接體-Fc-R CATCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATC CGCCGCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGG (SEQ ID NO: 58)

BclI-Fc-F

CAGTCTTGATCAGACAAAACTCACACATGCCCACC (SEQ ID NO: 59) scFc-EcoRI-R ACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG (SEQ ID NO: 60) Hindlll-Kozak-FVII-F: -142- 201217527 CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG (SEQ ID NO: 43) FVII-HC-BspEI-R:

AGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCG

CCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGAC

CCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG (SEQ ID NO: 61)

使用 25 pmo 1 的 Hi nd III - S al I-B p EI-F c-F 和 B amH I-連接體-Fc-R、以及範本pSYN-Fc-001，採用以下迴圈來實施體積爲50μ1的PCR反應：95°C，2分鐘；30個迴圈（95°C，30 秒；54°C，30秒；72°C，1 分鐘）。使用 Gel Extraction試劑盒（Qiagen，Valencia，Calif.)對預計大小的條帶（~700 bp)進行凝膠純化，並將其克隆到pBUDCE4 (Invitrogen， Carlsbad, Calif.)的Hindlll和BamHI限制性位點，從而生成中間體 pSYN-FVII-007。弓| 物 HindIII-SalI-BpEI-Fc-F 和 BamHI-連接體-Fc-R擴增了 Fc區（由氨基酸221 (EU編號）開始），並在緊鄰位點Fc區的上游加入了 Hindlll和Sail限制性酶切位元點、以及編碼（GGGGS)4x (SEQ ID NO: 6)連接體的DNA片段（其後爲緊鄰Fc編碼區下游的BamHI位元點）。然後，使用上文所述之迴圈，使用25pmol的BclI-Fc-F和scFc-EcoRI-R、以及範本pSYN-Fc-011實施體積爲 5〇μ1的反應。按照上文所述對預計尺寸的條帶（〜700 bp)進行凝膠純化，用限制性酶BamHI和EcoRI切割，並克隆到 pSYN-FVII-007的BclI/EcoRI限制性位點中，從而生成中間體質粒 pSYN-FVII-008。引物對 BclI-Fc-F 和 scFc-EcoRI-R -143- 201217527

擴增了 Fc區，同時將Bell和EcoRI限制性位點分別加入到緊鄰Fc編碼區的上游和下游。爲了生成最終的中間體質粒，使用以下迴圈，使用25pmol的HindIII-Kozak-FVII-F和 FVII-HC-BspEI-R、以及範本 pSYN-FVII-001 實施體積爲 50μ1的反應：95°C，2分鐘；30個迴圈（95°C，30秒；55 °C，30秒；72°C，90秒）。引物對擴增了 FVII編碼區，同時將DNA片段加入到了編碼（GGGGS)6x (SEQ ID NO: 36)多肽連接體的分子的3’末端（其後爲在氨基酸221 (EU編號）處結束的Fc區的片段）。引物HindIII-Kozak-FVII-F在所述分子的5’端生成了 Hindlll限制性位點（其後爲緊鄰FVII 編碼區上游的Kozak序列）。FVII-HC-BspEI-R引物引入了編碼所述多肽連接體以及Fc部分的DNA。按照上文所述對預計大小的條帶（〜1 5 00 bp)進行凝膠過濾，並將其克隆到 pSYN-FVII-008 的 Hindlll/BspEI位點中，從而生成 pSYN-FVII-0 1 1。

接著，合成 2 個 DNA 片段：Genescript-FVII-027- 1 和 Genscript-FVII-026-2。Genescript-FVII-027-l 由編碼 Fc 區的一部分的DN A片段（由核苷酸13 06處開始，EU編號）構成，所述之片段之後爲序列RRRRS-(ggggs)6x-rkrrkr (SEQ ID NO: 5 0)，然後爲MB9 scFv (殘基 1-142)的一部分。採用基因密碼子降解將EcoRI位點引入到MB9的編碼序列中，從而保持了正確的氨基酸序列，並與Genescript-FVII-027- 1的最後6個城基部分重疊。此外，5’端的頭6個城基包括在Fc區中找到的SapI位點。Genscript-FVII-026-2 -144-

S 201217527 由編碼MB9的一部分（殘基1 43 -273 )的DNA片段構成’其中所述之DNA片段後爲（GGGGS)6x (SEQ ID NO: 36)連接體，該連接體之後爲Fc區和EcoRI位點。採用基因密碼子降解將EcoRI位點引入到MB9的編碼序列中，從而保持了正確的氨基酸序列，並與Genescript-FVII-026-2的頭6個城基部分重疊。

將 Genescript-FVII-027-l 克隆至IJpSYN-FVII-011 的 SapI 和EcoRI位點中，從而生成pSYN-FVII-03 6。接著，將 Genscript-FVII-026-2 克隆到 pSYN-FVII-036 的 EcoRI 位點中，從而生成pSYN-FVII-027。通過限制性酶分析以及 DNA測序來證實最後克隆步驟的正確取向。pSYN-FVII- 027最終翻譯結構示于圖1B中》實例4.細胞的瞬間轉染使HEK-293 -F細胞在補充有維生素K3 (Sigma Aldrich， St. Louis, MO)至 2 pg/升的 Freestyle培養基（Invitrogen)( 生長培養基）中以懸浮細胞的形式懸浮生長（在37°C /10% C02)。通過以5xl05個細胞/ml的細胞密度接種，使細胞每3至4天傳代培養。在轉染細胞之前的24小時，以補充有LONGtmR3IGF-1 (Sigma Aldrich，St. Louis，MO)至 20 pg/升的生長培養基（轉染培養基）中以7xl05個細胞/ml的密度接種。在轉染當天，製備轉染溶液，使得其體積與待轉染的細胞培養物的總體積的5%體積相等。在轉染溶液中，將DNA (最終濃度爲 -145- 201217527 20mg/L )加入到處於轉染培養基中的新製備的PEI(60 mg/L)溶液中。使所得溶液旋轉30秒，並在室溫下溫育5分鐘，然後直接加入到細胞培養物中。4小時後，將與細胞培養物等體積的補充有維生素K3 (當轉染FIX或F VII構建體時）、LONGTMR3IGF-l和200 mM L-穀氨醯胺的 OptiCHO(Invitrogen)加入到所述之細胞中。按照上文所述使細胞培養物生長，並每天取得培養基樣品來評估蛋白質的表達。實例5 .得自瞬間轉染而生成的蛋白質的分析對於得自瞬間轉染的蛋白質分析而言，將得自轉染的條件培養基進行蛋白質A的免疫沉澱。簡言之，將細胞培養物上清液與大約5 Ομί的蛋白質A -瓊脂糖50%漿料混合，並在搖動下在4 °C下溫育1小時，然後離心形成團粒狀的蛋白質A珠。通過將珠再次懸浮於lml PBS中、離心及抽吸而洗滌2次。在還原或非還原條件下，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE )使所述之珠再次懸浮，在l〇〇t下加熱5分鐘，離心並載入到SDS-PAGE凝膠上，然後根據標準的方法運行。將凝膠轉移至硝酸纖維素膜上，並進行Western印記來檢測FVII輕鏈上的Fc區。對於Fc檢測而言，所用的抗體爲山羊抗人IgG ( Fc特異性 )-辣根過氧化物酶綴合物（Pierce ImmunoPure抗體，編號#3 1413 )。對於FVII輕鏈檢測而言，使用抗輕鏈單克隆抗體（Green Mountain，克隆子6MA-219)。將所述抗體以 -146- 201217527

1:15,000 (對於Fc檢測而言）或者1:200 (對於輕鏈檢測而言）比例稀釋於具有5%脫脂奶粉的PBST (具有〇. 1 % Tween-20 的PBS)中，並在室溫下與所述膜溫育1小時。然後，將所述膜在PBST中洗滌3次’並持續10分鐘，並通過化學發光方法檢測信號以用於Fc檢測。對於FVII輕鏈檢測而言，將所述膜在包含HRP標記的山羊抗小鼠抗體（Southern Biotech，# 1010-05，以1:5000的比例稀釋於PBST中）的溶液中溫育1小時。此外，將所述膜在PBST中再洗滌3次，並持續10分鐘，並通過化學發光方法檢測信號。使用ECL

Plus Western Blotting Detection System (Amersham Biosciences編號#RPN2 13 2)，根據製造商提供的方法，進行化學發光檢測。在 Storm 840 Phosphorimager (Molecular Devices)中，使信號現象。或者，可以通過考馬斯亮藍染色來分析蛋白質凝膠。 φ 實例6.包含備選加工位點的構建體的生成 pSYN-FIX-056 中間體的克隆：DNA 片段 Genscript-FVII-043的合成是外包的（Genscript)。該片段由編碼Fc區的一部分（殘基23 2至447，EU編號）的DN A分子構成，其中所述之Fc區之後爲（GGGGS)4x (SEQ ID NO: 6)多肽連接體以及Fc區的另一部分（殘基22 1至23 8，EU編號）。將所述之DNA片段用BspEI和RsrII消化，並亞克隆到pSYN-FIX-044 的 BspEI/RsrII位點中，從而形成 pSYN-FIX-049。將得自pSYN-FIX-049的Hindlll/EcoRI片段（包含FIX編碼 -147- 201217527 區，其後爲編碼單鏈Fc的區域）亞克隆到pBUDCE4.1 (Invitrogen)的 Hindlll/EcoRI 位點，從而生成 p S YN - F IX-056 ° pSYN-FIX-050、-052 和-05 3 的克隆：DNA 片段 Genscript-FIX-050、-052 和-05 3 的合成是外包的（Genscript) 。所述之片段包含Fc區的一部分（得自pSYN-FIX-05 6中的 Shll 位點）、RRRRS (SEQ ID NO: 3 8)序列、（GGGGS)4x (SEQ ID NO: 6)多肽、可變前肽轉化酶切割位點以及Fc區的一部分（直到pSYN-FIX-056的第二個Fc的RsrII )。每個 DNA片段都編碼了不同的可變前體轉化酶切割位點： g e n s c r i p t - FIX - 0 5 0，R A G R ; g e n s c r i p t - FIX - 0 5 2，R S K R ;以及 genscript-FIX-053，RKRRKR (SEQ ID NO: 39)(因此，除了這些序列，它們與044—致；044包含RRRR(SEQ ID NO: 40)位點）。將得自 Genscript-FIX-050、-052 和-053 的 Sall/RsrII片段亞克隆到 pSYN-FIX-056 的 Sall/RsrII位點中，從而分別生成 pSYN-FIX-050、-052和- 053。實例7:具有cscFc連接體的FIXFc構建體製備包含FIX分子的構建體FIX-044 (圖3A)，其中所述之FIX分子之後爲具有連接兩個Fc部分的cscFc連接體的 Fc區，如圖3A所示。圖3B示出了在轉染和蛋白質A pulldown 之後 FIX-044 的 Western印記資料（Fc Western ) 。FIX-044 與 Kex2、PC7、PACE 或 PC5 共轉染。 -148- 201217527 PC5的克隆通過RT-PCR獲得人類PC5的編碼序列。使用以下引物 (與cDNA退火的區域用黑體表示）：引物 SEQ ID NO 序列 PC5-KpnI-F: 5'-ATCTACACCATCTCCATCAGCAGC-3' PC5 Notl-R: 5*AAGGCGGCCGCTCAGCCTTGAAATGTACATGTTTTGC-3， PC5-UTR-F: 5-AGCGAGGGAGCAGCGAGG-3' PC5-Hindni-R: 5-GGTAGTTGACATGGCGGTTGG-3* PC5-AA2-F: 5-CAGCGACTTAAGCCACCATGGGCTGGGGGAGCCG-3, PC5-KpnI-R: 5GTAGGTTGTGGCCAGCGTGG-3，

分兩段獲得人PC5的編碼序列（GenBank編號.NM-006200)。使用Platinum™ Taq試劑盒根據製造商提供的標準方法，採用 Invitrogen Superscript™ RT-PCR 以及弓| 物 PC5-KpnI-F 和 PC5-NotI-R 來獲得人肝臟 mRNA 的 3’ 〜1750 bp。用於逆轉錄的迴圈爲：50°C，30分鐘；94t：，變性2 分鐘；94°C，15秒，共 35 個迴圈；54°C，30 秒；72°C，3 分鐘；72°C，延伸1〇分鐘；然後儲存在4°C下。在PC5編碼序列中，所述過程由內部ΚρηΙ位元點、通過終止密碼子（在3’末端加入了 Notl位點）生成一個片段。然後，根據製造商提供的方法，將所述片段克隆到PCR2.1 TOPO中，從而生成pSYN-PC5-001 (pCR2.1/PC5 (KpnI-Notl))。然後，使用ΚρηΙ和Notl限制性位點將所述片段亞克隆到 pcDNA3.1/hygro 中，從而生成 p S YN-P C 5 - 0 0 2 ( pcDN A3 .1/hygro/P C 5 (ΚρηΙ-Notl))。在兩個步驟中獲得5’ ~ll〇〇 bp的PC5。使用與上文所述相似的條件（退火溫度爲57°C )，用引物PC5-UTR-F和 -149- 201217527 PC5-HindIII-R通過RT-PCR進行第一次擴增，從而由人肝臟mRN A擴增〜1520 bp的片段。在未翻譯的5'序列以及由內部獨特Hindlll位點的序列3’中，這些引物與天然PC5序列完全同源。注意，所述之Hi ndlll位點由於無聲核苷酸取代而並非存在於最終的構建體中。然後，將所述之DN A片段凝膠純化，並用作第二個PCR反應的範本，其中所述反應使用了 PC5-Afl2-F (其在5’未端的N末端編碼序列中加入了 Aflll克隆位點，及其後的Kozak序列）和PC5-KpnI-R (其將3’端與內部獨特的ΚρηΙ位點退火），從而生成〜1100 bp 片段。使用EXPAND™ High Fidelity System，根據製造商提供的標準方法，在MJ熱迴圈儀中採用以下迴圈來實施所述之反應：94°C，2分鐘；14個迴圈（94°C，30秒；57°C， 30秒；72°C，2分鐘）；然後爲72〇C，10分鐘。然後，使用 Aflll和ΚρηΙ限制性位點將所述之片段亞克隆到pSYN-PC5-〇〇2 中，從而生成 pS YN-PC5-003 (pcDNA3 · 1/hygro/PC5)。在PSYN-PC 5-0 03中編碼PC5的核苷酸序列具有以下序歹 IJ ( S E Q ID Ν Ο :): atgggctggg ctgctcgggg gtcaaaatcg aacataggac aaaaggtcag gaatggatcc gcccagtcta gacaatacac acgggaaaga ctgatgcaaa atgcctcgtt gcagccgctg ggagtgcgaa aacccccagc gtggacggac agaggcctcg tgctcctgtg agcggaaaga ggagccgctg gctgcctgct ccgggggctt agataggggc ttatctcgag aacagcaagt cctatttcaa atccctgcca acattgtggt actacgatgc atgatgcaag caaacaattc tgctggacgg acgtgcacat cagcccccct gctctgtgtt atggctacac aaccttggta ctgctgcccg ccccgtgtgt cccggaggcc cctgaaggac cagagggacc ggtaaaaaag tgatcccaag gtctgacatg cactatcctg tctggcaagt caacgagaac gcactgcaca agatgtcacg ttacagcgcc cacccggcaa tgtttgggca caacagcatc cctggaagag ggacgtttgg cggacgcgcg aaccgtatcg tactaccact cacagtttca cggacaaaga tggcccagta aatatcgaag gatgacggaa tgcgacgtga aagcatggga gtcggaattg gacatggttg agctggggcc gcctttgaaa tctggaaatg tacaccatct tgttcatcca acctgctgtg tctacaccaa ccagcaagta tctaccatag tttcaatgga gggattatga tgtggtatat gagcctggaa ttgagagaac atgggaatga ctcgctgtgc ctttcaacgc aagcaaaatc cggatgatga acggcgttag gtggaaggag ccatcagcag cgctggccac cgtgctggcg ccactgggca cggattcatc caggacgatt accaaaggtg cttcagtcgt gcactgcagt gagaggctac ccatccagat cttggaccca tggagaagtg caagatcgga agttagcttc tggcaagact aatggggcgg caaagaccac cactgcagaa aacctacagc -150- 201217527 ttgcacggac gctggccctg gacttcccgt ggtgagccat gaagtggacc gacaatccgc ccccaaccgc caggagagga ggccaacagg tcattgctgg tcagctaagg cacctccgtg tagccgagtt ccctgagtgc gcactactac ccactaccac tgggagccat caacagctgt ccggaaatgc ggatgggtta caacggccag tgatgggtgc ctgtagtatc atgtgatatc tagtgggtat ggaagagtcc acggaaggtt

agcggggagt cctacgataa gaaaatcatc actacagatc tgaggcagcg aaccacactg ggacgtcagc ctcagccccc atggctgcag gcatcattgc gaagccaatc cgtttctgac ctggagagac gtacagcatg ttattgtcag gcgggacatt tgaacgctaa tgactggaaa accaatgctg ctggttttaa ctttatggat ttggactgat ggacgcagaa gccatggtga tggaggcaga accgttcccc ggcagcacgt gtgtgtggag agcacagacc gacaaatcaa cctaacagtg cagtgcgctc catctacaaa gcctcaggct gctcagataa catgtcaact acctggagca cgtcgttgtg cgcatcacca tcacccaccc gacctggcca tctacctgac ctcgccctct ggaactaggt ctcagctttt ctatttgatc actccatgga aggattcaaa aactgggagt tcatgacoat ggagaaagag ctgctggtga ctgggtcctt gaagtttatg atactccctc aactttaaga ctccaggtaa attgaaagaa tggtctttgg tcctctacgg cagccatatt caccaaccaa tgaatttccg aaagtggaac ggttccgcta gaagacccca cagacgacta tggcacagag gattatgcag gtccctgcga agtgaggttg gctgtgacgg gccaggacca gaccactgca atgactgttt tacaagctga aaaacaatac caggatctgt gtctccagct gcccccctgg gccgacaaga agcgctgcag gaagtgtgcc cccaactgtg agtcctgctt ggtgaccaat gcatgtcctg caaatatgga tactttctga atgaagaaac gttactcact gccctgatgg gtcatatcag gataccaaga aaaatctttg agtgaaaact gcaagacatg tactgaattc cataactgta cagaatgtag agcctgcagg gatcccggtg ctctgtctcc tgtgaagatg gacggtattt gactgccagc cctgccaccg cttctgcgcc acttgtgctg gggcaggagc attaactgca cagagggcta cttcatggag gatgggagat gcgtgcagag agctattact ttgaccactc ttcagagaat ggatacaaat cctgcaaaaa agttgtttga cgtgcaatgg cccaggattc aagaactgta caagctgccc ctcttagact taggaatgtg tcaaatggga gccatttgca aggatgcaac tgggcggaag gaggcttctg tatgcttgtg aaaaagaaca atctgtgcca cttcaacaac tttgctgcaa aacatgtaca tttcaaggc SEQ ID NO:包含對GenBank序列的取代，其不會影響氨基酸編碼序列。具體而言，位置399處（與GenBank編號 No. NM-006200的位置876相應）的核苷酸爲T替代了 C，但是保持氨基酸Serl33(與GenBank編號No.NP-006191的 Φ 氨基酸編號相應）；核苷酸位置1473( GenBank位置195〇 )爲C替代了 T，但是保持氨基酸Ala 491 ;以及核苷酸位置1 48 5 ( GenBank位置1 962 )爲A替代了，但是保持氨基酸Ser 496。位置1 473的核苷酸變化消除了 Hindlll限制性位點。 PACE-SOL的克隆通過RT-PCR獲得人類PACE的編碼序列。使用以下引物（與cDNA退火的區域用黑體表示）： -151 - 201217527 SEQ ID NO PACE-F1: 5,-GGTAAGCTTGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGC-3, PACE-R1: 5,-GTTTTCAATCTCTAGGACCCACTCGCC-3, PACE-F2: 5-GCCAGGCCACATGACTACTCCGC-3, PACE-R2: 5,-GGTGAATTCTCACTCAGGCAGGTGTGAGGGCAGC-3,

引物PACE-F1將Hindlll位點加入到PACE序列的5’末端 (由起始密碼子之前的3個核苷酸開始），而引物PACE-R2將終止密碼子加入到氨基酸71 5之後（其在PACE的細胞外結構域的末端形成並將EcoRI位元點加入到終止密碼子的3’末端）》PACE-Rl和PACE-F2引物分別在內部BamHI位點的3’和5’一側退火。然後使用具有PLATINUM® Taq系統的 SUPERSCRIPT™ One-Step RT-PCR(Invitrogen, Carlsbad, CA.)，根據製造商提供的方法，使用25pmol的各種引物對PACE-F1/R1或PACE-F2/R2、以及20ng的成人肝臟 RNA(Clontech; Palo Alto, Calif.)在 50μ1 的 RT-PCR 反應物中建立2個RT-PCR反應。在MJ熱迴圈儀中，使用以下迴圏實施反應：50 °C，30分鐘；94 °C，2分鐘；30個迴圈 (94 °C ，30秒；5 8°C，3 0秒；7 2°C，2 分鐘）；然後爲 72 °C ，10分鐘。將這些片段中的每一個片段都連接到載體 pGEM T-Easy (Promega，Madison, WI)中，並進行完整的測序。然後，使用BamHI/EcoRI位點，將F2-R2片段亞克隆到 pcDNA6 V5/His (Invitrogen，Carlsbad，CA)中，接著使用Hindlll/BamHI位點，將F1-R1片段克隆到所述之構建體中。最終的質粒pcDNA6-PACE產生了可溶形式的PACE ( 氨基酸1-715)，其跨膜區域已經被刪除。PcDNA6-PACE -152- 201217527 中 PACE 序列基本如 Harrison S et al·，（1998) Semin Hematol 3 5(2 Suppl 2):4-10 中戶斤述 °

Kex2-SOL的克隆使用以下引物，通過RT-PCR由釀酒酵母（ S accharomyces cerevisiae ) ρ ο 1 y A + m RN A (B D Clontech,

編號#6 999-1)獲得用於酵母菌內切蛋白酶KEX2的編碼序列 (與cDNA退火的區域用黑體表示）：引物 SEQ ID NO 序列 KEX2-F: 5，-GCGCTAGCCGTACGGCCGCCACCATGAAAGTGAGGAAATATATTAC- TTTATGC-3' KEX2-Bgin-F: 5-GCTATTGATCACAAAGATCTACATCCTCC-3' KEX2-Bgin-R: 5-GGAGGATGTAGATCTTTGTGATCAATAGC-3, KEX2-675-R: 5'-GCGAATTCCGGTCCGTCATTGCCTAGGGCTCGAGAGTTTTTTAGGA- GTGTTTGGATCAG-3, 這些引物用於與上述實例3的PACE-SOL的相同使用方式獲得兩段KEX2的編碼序列（氨基酸1 -675 )(酵母與 PACE同源）；相似地，跨膜區域都已經被除去從而得到可溶形式的蛋白質。 PC7-SOL的克隆使用以下引物，通過RT-PCR由成人肝臟mRNA獲得 PC7的編碼序列（與cDNA退火的區域用黑體表示）： -153- 201217527 SEQ ID NO PC7-BamMut-F: 5-GCATGGACTCCGATCCCAACG-3' PC7-BamMut-R: S-CGTTGGGATCGGAGTCCATGC^ PC7-F: 5-GGTAAGCTTGCCGCCACCATGCCGAAGGGGAGGCAGAAAG-3, PC7-SOL-R: 5-TTTGAATTCTCAGTTGGGGGTGATGGTGTAACC-3, PC7-Xma-F: 5-GGCACCTGAATAACCGACGG-3' PC7-Xma-R: 5-CGTCACGTTGATGTCCCTGC-3' 這些引物可以用於與上述PACE-SOL的相同使用方式獲得三段PC7的編碼序列（氨基酸1 -663 );相似地，跨膜區域都已經被除去從而得到可溶形式的蛋白質。當PC5與PACE共轉染時（還原條件，泳道1 1和泳道12 )，觀察到cscFc連接體的最有效的切割。在第二加工位點如圖3A所示被修飾的情況下，生成一些列構建體（FIX-050 、 FIX-052 和 FIX-053 ) 。這些構建體被瞬間轉染（與或者未與PC5共轉染），病在蛋白質A pulldown之後，通過Fc Western印記來分析所述之蛋白質，如圖3C所示。對於與PC5共轉染的FIX-052和-053而言，觀察到cscFc的最佳切割。實例8 :在使得活性蛋白酶得以表達的FVIIaFc異源二聚體中，cscFc連接體的細胞內加工圖2示出了以雙鏈異源二聚體形式表達的FVIIFc構建體（FVII-024 )，其中一條鏈由FVII輕鏈構成，其後爲 (GGGGS)6x連接體，然後爲第一 Fc部分，而另一條鏈包含 FVII重鏈，其後爲（GGGGS)6x連接體，然後爲第二Fc部分。設計質粒以便表達單一多肽形式的異源二聚體，其中所 -154- 201217527

述FVII重鏈-連接體-Fc的C末端通過以下多肽序列與所述重鏈-連接體-Fc鏈的N末端連接：RRRRS-(GGGGS)6x-RKRRKR，其中RRRRS和RKRRKR序列爲前蛋白轉化酶切割位點。按照本文所述，FVII-024被克隆、瞬間表達並通過Western印記分析進行分析。表達FVII-024的質粒與PC5 共轉染，從而完全加工了所述之cscFc連接體（如蛋白質序列中所述，其將第一 Fc部分的C末端與所述重鏈的N末端連接）。如圖2所示，測試PC5對FVII-024連接體中前蛋白轉化酶切割位點的加工所產生的影響。在非還原條件下，由於FVII輕鏈-Fc以及FVII重鏈-Fc亞單元在所述之Fc區域中通過2個二硫鍵連接，所以不能檢測到PC5對切割位點加工的影響（泳道2和3 )。在還原條件下，我們觀察到由未與PC5共轉染的細胞所生成的FVII-024的部分加工（泳道4 )，而且當所述細胞與PC5共轉染時的完全加工（泳道5) 。對加工位點的完全切割得以生成活性形式的FVIla，其需要重鏈的游離N末端以採取活性構造。實例9: FVIIIFc中cscFc連接體的加工將圖4所示的FVIIIFc構建體克隆並純化。簡言之，使用FVIII特異性引物，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR)由人肝臟poly A RNA(Clontech)獲得刪除了人重組B結構域的FVIII的編碼序列。FVIII序列包含FVIII的天然信號序列。對於全部刪除的2682bp(SQ版本）而言，刪除的B結構域由絲氨酸743(S 743; 2287 bp)開始並在穀氨醯胺 -155- 201217527 1638(Q1638; 4969 bp)前結束。使用Fc特異性引物，通過RT-PCR由人白細胞cDNA文庫（Clontech )獲得人重組Fc的編碼序列。設計引物，使得刪除了 B結構域的FVIII序列在不具有其間連接體的情況下與Fc序列的N末端直接融合。將FVIIIFc DNA序列在 CMV啓動子控制下克隆到哺乳動物雙重表達載體 pBUDCE4.1 (Invitrogen)中》通過RT-PCR獲得包含小鼠Igk信號序列的第二個一致的Fc序列，並克隆到表達載體pBUDCE4.1中第二啓動子 EFla的下游。該最終的構建體命名爲pSYN-FVIII-013。使用PCR和標準的分子生物學技術由相同的構建體創建第二個質粒，以便表達rFVIIIBDD-Fc-Fc，其中 rFVIIIBDDFc編碼序列通過（GGGGS)4連接體與第二Fc序列融合，從而在瞬間轉染中僅產生rFVIIIBDD-Fc單體-二聚體雜交體。該構建體命名爲pSYN-FVIII-041。爲了製備 pSYN-FVIII-049，通過將得自 pBUD-CE4.1 的 Nhel/Xhol 片段克隆到pSYN-FVIII-013中而生成中間體pSYN-FVIII-048 。包含pSYN-FVni-049的RsrII至Xbal位元點的區域的DNA 片段的合成是外包的。將該片段亞克隆到pSYN-FVIII-048 的 RsrII/Xbal位點中，從而生成pSYN-FVIII-049。按照本文所述，通過瞬間轉染來表達所述之蛋白質。將PC5共轉染，從而完全加工了所述之CSCFC連接體（如蛋白質序列中所述，其將第一Fc部分的C末端與第二Fc部分的N末端連接）。圖4中SDS PAGE分析表明在還原條件下 -156- 201217527 純化FVIII-049的3個不同的條帶：輕鏈-Fc ( LC_Fc )、重鏈（HC)以及Fc。這表明連接兩個Fc部分的連接體已經被加工。實例10: FVII-Fc中cscFc連接體的加工 pSYN-FVII-064的克隆

得自 pSYN-FVII-064的 Hindlll至 EcoRI的 DNA序列的合成是外包的，並將其克隆到PBUDCE4.1的Hindlll/EcoRI位點中（Invitrogen)。 FVII-064的表達和純化按照本文所述，將DNA瞬間轉染。轉染的DNA包含 PC5，從而完全加工了所述之cscFc連接體（如蛋白質序列中所述，其將第一Fc部分的C末端與第二Fc部分的N末端連接）。 FVII-064的cscFc連接體的切割特徵使用離子交換來純化FVII-064 :得自GE healthcare的 Q瓊脂糖4FF。利用shFcRn (可溶性的人FcRn )親和性（具有瓊脂糖4FF珠的NHS偶聯的shFcRn )進行第二次捕獲。所有步驟都在150cm/hrS線性流速下進行。圖5示出了在瞬間表達（與PC5共轉染）和純化後的FVII-064的SDS PAGE分析。在還原條件下，我們觀察至(I FVII-Fc和Fc的2個不同的條帶，從而表明cscFc連接體的完全切割。 -157- 201217527 實例1 1.使用血小板靶向構建體對FVIIFc蛋白質的cscFc 的加工在本實例中’ FVII-〇27(圖6)與PC5的共轉染一起瞬間表達，從而除去所述蛋白質序列中的cscFc連接體。按照本文所述，將所述構建體克隆、表達和純化。圖6中純化蛋白質的SDS PAGE分析表明還原條件下的FVII-Fc和 MB9-FC的2個不同的條帶，從而表明cscFc連接體被完全加工。實例12.千擾素- pFc融合蛋白質的cscFc的加工在本實例中，我們生產出表達干擾素(其後爲連接體）以及Fc區（其中兩個Fc部分通過cscFc連接體連接）的構建體（IFN-P-018)。所述構建體按以下方式克隆：得自 pSY.N-IFN-b-018的BsiWI/BspEI的DNA片段的合成是外包的，並亞克隆到pSYN-FIX-05 3的BsiWI/BspEI位點中，從而生成pSYN-IFN-b-018。圖10示出了在瞬間轉染HEK 293 細胞（與或者未與PC5共轉染）以及蛋白質A pulldown之後的IFN_P_018的Western印記分析。Western印記資料表明當與PC5共轉染時，cscFc連接體被完全切割。實例1 3 ·活化構建體表達的其他嘗試製備多個其他構建體以便表達活性FVII，並示於圖7 中。但是這些構建體不能成功地表達活性分子。 -158 - 201217527 pSYN-FVII-01 0的克隆 FVII-010構建體爲因數VII的重鏈在csFc支架中表達、而輕鏈分開表達的一種構建體。

使用 pSYN-FVII-001 ，用引物對 FVII-HC-Hind3-IggKss-F/FVII-HC-BspEI-R 進行 PCR擴增（參見上文）。在？3丫心？¥11-008的8 3?£1/則11£1111位點中克隆（參見上文 )，從而生成 pSYN-FVII-009。使用引物 FVII-LC-Notl-F/ FVII-LC-XhoI-R，PCR 擴增得自pSYN-FVII-003 (稱爲P08 3 0)的FVII輕鏈，並克隆到 pS YN-FVII-009 中，從而生成 pS YN-FVII-0 1 0。引物

FVII-HC-BspEI-R

AGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCG

CCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGAC

CCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG FVII-HC-Hind3-IggKss-f

ACTGACAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTG

CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTATTGTGGGGGGCAAGGTGTGC

FVII-LC-Notl-F

ACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCTCCCAGG

FVII-LC-XhoI-R

ACTGACCTCGAGTTATCGGCCTTGGGGTTTGCTGG -159- 201217527 pS YN-FVII-0 1 3 的克隆 FVII-013構建體爲輕鏈在csFc支架中表達、而重鏈分開表達的一種構建體。使用得自pSYN-FVII-001的引物對FVII-LC-連接體-BamHI-R/HindIII-Kozak-FVII-F 進行 PCR 擴增。使用以下引物，通過與聚合酶鏈式反應偶聯的逆轉錄，由人肝臟 mRNA文庫（Ambion，Austin，Texas)獲得FVII的編碼序列：

FVII-F1

GGGAATGTCAACAGGCAGGG FVII-R1

CTTGGCTTTCTCTCCACAGGC

使用具有 Platinum Taq system (Invitrogen，Carlsbad, Calif·)的 Superscript One-step RT-PCR，根據製造商提供的標準方法，在熱迴圈儀中，使用lOpmol的各種引物實施體積爲50μ1的反應。所用的迴圈爲：逆轉錄，50 °C，30 分鐘；變性，94 °C，2分鐘；30個迴圈（94 °C，30秒；53 °C，30秒；72°C，90秒）；然後爲72°C，10分鐘。使用 Gel Extraction試劑盒（Qiagen，Valencia, Calif.)對預計尺寸的條帶（〜1 400 bp)進行凝膠純化，並使用ΤΟΡΟ ΤΑ Cloning試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，Calif.)克隆到 pCR2.1 TOPO中，從而得到中間體質粒pSYN-FVII-001，並將其克隆到pSYN-FVII-011的BamHI/Hindlll位點中，從而生成 pSYN-FVII-01 2。使用引物對 FVII-HC-Notl-F/FVII-HC-Xhol-R -將得自 pSYN-FVII-009 的 FVII-HC 進行 PCR 擴增， -160- 201217527 並將其亞克隆到pSYN-FVII-012中，從而生成pSYN-FVII-013。引物 FVII-LC-6X 連接體

-BamHI-RACTGACGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCC

ACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCC

TTGGGGTTTGCTGGC

HindIII-K〇zak-FVII-F

CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG

FVII-HC-Notl-F

ACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGAGACAGAC

FVII-HC-XhoI-R ACTGACCTCGAGTTAGGGAAATGGGGCTCGCAGGAG pSYN-FVII-018的克隆對於FVII-018構建體而言，FVII的重鏈以Fc融合蛋白質的形式表達，而FVII的輕鏈以分開的Fc融合蛋白質的形式分開表達。使用pSYN-FVII-010作爲範本，使用弓丨物FVII-HC-Hind3-IggKss-F/scFc-EcoRI-R 來 PCR 擴增 HCFVII-連接體-Fc。亞克隆到pBUDCE4的Hindlll/EcoRI位點中。該過程制得 pSYN-FVII-017。接著，使用弓[物 FVII-LC-Notl-F/FC-XHOI-R對得自pSYN-FVII-013的序列進行PCR擴增，並亞克隆到FVII-017的Xhol/Notl位點中。該過程制得PSYN- -161 - 201217527 FVII-01 8。引物

scFc-EcoRI-R

ACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG

Fc-Xhol-R

AGCTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGG 圖8示出了在HEK2 93細胞的瞬間轉染以及圖7所示分子的蛋白質A pulldown之後FVIIFc的Western印記分析。 Western印記分析表明使用將異源信號肽與所述重鏈的N末端融合的普通方法不能表達出具有游離N末端的FVII重鏈實例14.表達活性FVII-Fc構建體的備選嘗試表達具有游離N末端的FVII重鏈的失敗，使得我們生成了圖11所述之構建體。在此，FVIIFc以異源二聚體的形式表達，其中一個亞單元包含FVII輕鏈和Fc部分，而另一個亞單元包含所述之重鏈，該重鏈之前爲RKRRKR加工位點（FVII-0 19)或者是輕鏈C末端片段以及RKRRKR加工位點 (FVII-020)。我們假設，這可能有利於重鏈-Fc部分亞單元的表達，這是因爲所述重鏈直到在高爾基中加工位點被切割才能採取活性構造。這些構建體可以在瞬間轉染的材料發生蛋白質A pulldown之後通過Fc Western印記來進行分析。FVII-01 1 (具有單鏈Fc的FVIIFc )用作對照。僅觀察到輕鏈-Fc，表明可能由FVII-019或FVII-020表達重鏈Fc。 -162- 201217527 實例15.單體及異源二聚體結構形式的活性pviIFc蛋白質的表達 pSYN-FVII-025 的克隆

包含Xbal至BsiWI的FVII編碼區的DNA片段（其在 R152至1153(成熟序列編號）之間具有RKRRKR的氨基酸插入序列）的合成是外包的。所述之DNA片段亞克隆到 pSYN-FVII-01 1的Xbal/BsiWI位點（其序列包含于本文中 )中，從而生成 pSYN-FVII-025。圖9示出了異源二聚體cscFc構建體（FVII-024)以及單體Fc構建體（FVII-02 5)。製備這些構建體，並在蛋白質a pulldown以及瞬間表達（與或者未與PC5共轉染）之後進行Western印記。資料表明，異源二聚體或單體中，細胞內活性都能夠表達分開的重鏈，但是異源二聚體（FVII-024)與單體（FVII-025)相比，細胞內活性更有效。

實例1 6 :蛋白質的純化 FVIIFc分子的蛋白質純化使用以下柱的組合，由條件培養基純化FVIIFc分子： 1)離子交換層析，使用假親和洗脫液（例如Q瓊脂糖 4FF(GE Healthcare)，使用水準變化的CaCl2洗脫，從而選擇性地洗脫大部分活性物質）；2 ) shFcRn (可溶性人 FcRn )親和（具有瓊脂糖4FF珠的NHS偶聯的shFcRn )層析，在低pH(例如pH 6.2)下與包含Fc的蛋白質結合，並在 -163- 201217527 中性Ρ Η (例如ρ Η 8.0)下洗脫；3 )疏水作用色譜（例如苯基 FF(高解析度）（GE Healthcare));以及4)陽離子/陰離子交換層析，使用鹽洗脫液。這些純化步驟使用了本領域技術人員已知的標準方法，從而生成純度>9 5 %的經純化的蛋白質（通過SEC分析以及SDS-PAGE)。 FVII構建體的活化如果需要，將FVIIFc級分合倂，並將全部蛋白質濃縮至4mg/ml »將CaCl2的濃度升至5mM，並將所述樣品在4°C 下溫育24至48小時，直到至少80%的FVIIFc被活化。活化程度通過SDS PAGE來評估（圖10)。 FIXFc蛋白質的純化按照之前在美國專利7,5 66,5 65中所述來純化FIXFc蛋白質。 FVIIIFc蛋白質的純化使用兩種或三種柱純化方法由澄清的且化學定義的收穫培養基純化FVIIIFc蛋白質，其中所述之方法包括FVIII 特異性親和純化步驟（McCue 2009)，然後爲以下方法的組合：使用標準NaCl洗脫液的離子交換和/或shFcRn (可溶性人FcRn )親和（具有瓊脂糖4FF珠的NHS偶聯的shFcRn )層析，在低pH(例如pH 6.2)下與包含Fc的蛋白質結合，並在中性pH (例如pH 8.0)下洗脫。這些純化步驟使用了本 -164- 201217527 領域技術人員已知的標準方法，從而生成純度>95 %的經純化的蛋白質（通過SEC分析以及SDS-PAGE)。非正式的序列表 pSYN-FVII-024核苷酸序列

atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaei aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga ggtggcggtg gctccggcgg aggtgggtcc ggtggcggcg gatcaggtgg gggtggatca ggcggtggag gttccggtgg cgggggatca gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa acggcgccgc cggagcggtg gcggcggatc aggtgggggt ggatcaggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggtgggggt ggatcaagga agaggaggaa gaggattgtg gggggcaagg tgtgccccaa aggggagtgt ccatggcagg tcctgttgtt ggtgaatgga gctcagttgt gtggggggac cctgatcaac accatctggg tggtctccgc ggcccactgt ttcgacaaaa tcaagaactg gaggaacctg atcgcggtgc tgggcgagca cgacctcagc gagcacgacg gggatgagca gagccggcgg gtggcgcagg tcatcatccc cagcacgtac gtcccgggca ccaccaacca cgacatcgcg ctgctccgcc tgcaccagcc cgtggtcctc actgaccatg tggtgcccct ctgcctgccc gaacggacgt tctctgagag gacgctggcc ttcgtgcgct tctcattggt cagcggctgg ggccagctgc tggaccgtgg cgccacggcc ctggagctca tggtcctcaa cgtgccccgg ctgatgaccc aggactgcct gcagcagtca cggaaggtgg gagactcccc aaatatcacg gagtacatgt tctgtgccgg ctactcggat ggcagcaagg actcctgcaa gggggacagt ggaggcccac atgccaccca ctaccggggc acgtggtacc tgacgggcat cgtcagctgg ggccagggct gcgcaaccgt gggccacttt ggggtgtaca ccagggtctc ccagtacatc gagtggctgc aaaagctcat gcgctcagag ccacgcccag gagtcctcct gcgagcccca tttcccggtg gcggtggctc cggcggaggt gggtccggtg gcggcggatc aggtgggggt ggatcaggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatcagaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct gggaggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga FV11-024氨基酸序列。信號序列如虛線所示，前肽如雙下劃線所示，將FVII輕鏈或重鏈與Fc區連接的連接體區 -165- 201217527 域如帶有下劃線的序列所示，Fc區如斜體所示，而具有前蛋白轉化酶加工位點的連接體如黑體所示。 AVFVTOEEAH gvlhrrrran afleelrpgs lereckeeqc

SFEEAREIFK DAERTKLFWI SYSDGDQCAS SPCQNGGSCK DQLQSYICFC LPAFEGRNCE THKDDQLICV NENGGCEQYC SDHTGTKRSC RCHEGYSLLA DGVSCTPTVE YPCGKIPILE KRNASKPQGR GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG AC；册RSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSRKRRKRIV GGKVCPKGEC PWQVLLLVNG AQLCGGTLIN TIWWSAAHC FDKIKNWRNL IAVLGEHDLS EHDGDEQSRR VAQVIIPSTY VPGTTNHDIA LLRLHQPWL TDHWPLCLP ERTFSERTLA FVRFSLVSGW GQLLDRGATA LELMVLNVPR LMTQDCLQQS RKVGDSPNIT EYMFCAGYSD GSKDSCKGDS GGPHATHYRG TWYLTGIVSW GQGCATVGHF GVYTRVSQYI EWLQKLMRSE PRPGVLLRAP FPGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK* pSYN-FVII-027DNA 序列

atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc. agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga gccccatttc ccggtggcgg tggctccggc ggaggtgggt ccggtggcgg cggatcaggt caggcggtgg aggttccggt ggcgggggat ccgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagctccgga actcctgggc ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaacggcgcc gccggagcgg tggcggcgga tcaggtgggg gtggatcagg cggtggaggt tccggtggcg ggggatccgg cggtggaggt tccggtgggg gtggatcaag gaagaggagg aagagggcgg aagtgcagct ggtgcagtct ggagctgagg tgaataagcc tggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac accttcaccg gctactatat gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatgga tcaaccctaa cagtggtggc acaaactatg cacagaagtt tcagggctgg gtcaccatga ccagggacac gtccatcagc accgcctaca tggagctgag caggctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgcg agaggccgtg ctttgtataa ccggaacgac cggtccccca actggttcga cccctggggc -166- 201217527 cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggg agtgcatccg ccccaaccct taagcttgaa gaaggtgaat tctcagaagc acgcgtacag gctgtgctga ctcagccgcc ctcggtgtca gtggccccag gacagacggc caggattacc tgtgggggaa acaacattgg aagtaaaagt gtgcagtggt accagcagaa gccaggccag gcccctgtgc tggtcgtcta tgatgatagc gaccggccct cagggatccc tgagcgattc tctggctcca actctgggaa catggccacc ctgaccatca gcagggtcga agccggggat gaggccgact attactgtca ggtgtgggat agtagtagtg atcatgtggt attcggcgga gggaccaagc tgaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg ccgtccgcgg ccgctggtgg cggtggctcc ggcggaggtg ggtccggtgg cggcggatca ggtgggggtg gatcaggcgg tggaggttcc ggtggcgggg gatcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg ggaggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgc gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga

FVII-027氨基酸序列。信號序列如虛線所示，前肽如雙下劃線所示，將FVII或MB9與Fc區連接的連接體區域如帶有下劃線的序列所示，而具有前蛋白轉化酶加工位點的連接體如黑體所示。阶如腦聊-丄碰娜㈣ avfvtoeeah gvlhrrrran afleelrpgs lereckeeqc SFEEAREIFK DAERTKLFWI SYSDGDQCAS SPCQNGGSCK DQLQSYICFC LPAFEGRNCE THKDDQLICV NENGGCEQYC SDHTGTKRSC RCHEGYSLLA DGVSCTPTVE YPCGKIPILE KRNASKPQGR IVGGKVCPKG ECPWQVLLLV NGAQLCGGTL INTIWWSAA HCFDKIKNWR NLIAVLGEHD LSEHDGDEQS RRVAQVIIPS TYVPGTTNHD IALLRLHQPV VLTDHWPLC LPERTFSERT LAFVRFSLVS GWGQLLDRGA TALELMVLNV PRLMTQDCLQ QSRKVGDSPN ITEYMFCAGY SDGSKDSCKG DSGGPHATHY RGTWYLTGIV SWGQGCATVG HFGVYTRVSQ YIEWLQKLMR SEPRPGVLLR APFPGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG KRRRRSGGGG SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SGGGGSRKRR KRAEVQLVQS GAEVNKPGAS VKVSCKASGY TFTGYYMHWV RQAPGQGLEW MGWINPNSGG TNYAQKFQGW VTMTRDTSIS TAYMELSRLR SDDTAVYYCA RGRALYNRND RSPNWFDPWG QGTLVTVSSG SASAPTLKLE EGEFSEARVQ AVLTQPPSVS VAPGQTARIT CGGNNIGSKS VQWYQQKPGQ APVLWYDDS DRPSGIPERF SGSNSGNMAT LTISRVEAGD EADYYCQVWD SSSDHWFGG GTKLTVLGQP KAAPSVTLFP PSAAAGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK*

pSYN-FIX-044DNA 序歹 IJ atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta ggatatctac tcagtgctga atgtacaggt ttgtttcctt ttttaaaata cattgagtat gcttgccttt tagatataga aatatctgat gctgtcttct tcactaaatt ttgattacat gatttgacag caatattgaa gagtctaaca gccagcacgc aggttggtaa gtactgtggg aacatcacag attttggctc catgccctaa agagaaattg gctttcagat tatttggatt aaaaacaaag actttcttaa gagatgtaaa attttcatga tgttttcttt tttgctaaaa ctaaagaatt attcttttac atttcagttt ttcttgatca tgaaaacgcc aacaaaattc tgaatcggcc aaagaggtat aattcaggta aattggaaga gtttgttcaa gggaatctag •167- 201217527 agagagaatg tatggaagaa aagtgtagtt ttgaagaagc acgagaagtt tttgaaaaca ctgaaagaac aactgaattt tggaagcagt atgttgatgg agatcagtgt gagtccaatc catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt tggtgtccct ttggatttga aggaaagaac tgtgaattag atgtaacatg taacattaag aatggcagat gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctgt actgagggat atcgacttgc agaaaaccag aagtcctgtg aaccagcagt gccatttcca tgtggaagag tttctgtttc acaaacttct aagctcaccc gtgctgagac tgtttttcct gatgtggact atgtaaattc tactgaagct gaaaccattt tggataacat cactcaaagc acccaatcat ttaatgactt cactcgggtt gttggtggag aagatgccaa accaggtcaa ttcccttggc aggttgtttt gaatggtaaa gttgatgcat tctgtggagg ctctatcgtt aatgaaaaat ggattgtaac tgctgcccac tgtgttgaaa ctggtgttaa aattacagtt gtcgcaggtg aacataatat tgaggagaca gaacatacag agcaaaagcg aaatgtgatt cgaattattc ctcaccacaa ctacaatgca gctattaata agtacaacca tgacattgcc cttctggaac tggacgaacc cttagtgcta aacagctacg ttacacctat ttgcattgct gacaaggaat acacgaacat cttcctcaaa tttggatctg gctatgtaag tggctgggga agagtcttcc acaaagggag atcagcttta gttcttcagt accttagagt tccacttgtt gaccgagcca catgtcttcg atctacaaag ttcaccatct ataacaacat gttctgtgct ggcttccatg aaggaggtag agattcatgt caaggagata gtgggggacc ccatgttact gaagtggaag ggaccagttt cttaactgga attattagct ggggtgaaga gtgtgcaatg aaaggcaaat atggaatata taccaaggta tcccggtatg tcaactggat taaggaaaaa acaaagctca ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagctccgga actcctggga ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaacggcgcc gccggagcgg tggcggcgga tcaggtgggg gtggatcagg cggtggaggt tccggtggcg ggggatcccg ccggcggcgc gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcaccggaac tcctgggcgg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga FIX-044氨基酸序列。信號序列如虛線所示，前肽如雙下劃線所示，而具有前蛋白轉化酶加工位點的連接體如黑體所示。 MORVNMIMAE SPGLITICLL GYLLSAECTV FLDHENANKI LNRPKRYNSG KLEEFVQGNL ERECMEEKCS FEEAREVFEN TERTTEFWKQ YVDGDQCESN PCLNGGSCKD DINSYECWCP FGFEGKNCEL DVTCNIKNGR CEQFCKNSAD NKWCSCTEG YRLAENQKSC EPAVPFPCGR VSVSQTSKLT RAETVFPDVD YVNSTEAETI LDNITQSTQS FNDFTRWGG EDAKPGQFPW QWLNGKVDA FCGGSIVNEK WIVTAAHCVE TGVKITWAG EHNIEETEHT EQKRNVIRII PHHNYNAAIN KYNHDIALLE LDEPLVLNSY VTPICIMKE YTNIFLKFGS GYVSGWGRVF HKGRSALVLQ YLRVPLVDRA TCLRSTKFTI YNNMFCAGFH EGGRDSCQGD SGGPHVTEVE GTSFLTGIIS WGEECAMKGK YGIYTKVSRY VNWIKEKTKL TDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKRR RRSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSRRRRDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK* -168- 201217527

Genscript-FIX-044DNA 序列 tccggaactc ctgggaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgt tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaac ggcgccgccg gagcggtggc ggcggatcag gtgggggtgg atcaggcggt ggaggttccg gtggcggggg atcccgccgg cggcgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac cggaactcct gggcggaccg

Genscript-FVII-027-1 DNA 序歹 ij

gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaacg gcgccgccgg agcggtggcg gcggatcagg tgggggtgga tcaggcggtg gaggttccgg tggcggggga tccggcggtg gaggttccgg tgggggtgga tcaaggaaga ggaggaagag ggcggaagtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaat aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccggctac tatatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg atggatcaac cctaacagtg gtggcacaaa ctatgcacag aagtttcagg gctgggtcac catgaccagg gacacgtcca tcagcaccgc ctacatggag ctgagcaggc tgagatctga cgacacggcc gtgtattact gtgcgagagg ccgtgctttg tataaccgga acgaccggtc ccccaactgg ttcgacccct ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct cagggagtgc atccgcccca acccttaagc ttgaagaagg tgaattc

Genscript-FVII_026-2 DNA 序歹 IJ gaattctcag aagcacgcgt acaggctgtg ctgactcagc cgccctcggt gtcagtggcc ccaggacaga cggccaggat tacctgtggg ggaaacaaca ttggaagtaa aagtgtgcag tggtaccagc agaagccagg ccaggcccct gtgctggtcg tctatgatga tagcgaccgg ccctcaggga tccctgagcg attctctggc tccaactctg ggaacatggc caecotgacc atcagcaggg tcgaagccgg ggatgaggcc gactattact gtcaggtgtg ggatagtagt agtgatcatg tggtattcgg cggagggacc aagctgaccg tcctaggtca gcccaaggct gccccctcgg tcactctgtt cccgccgtcc gcggccgctg gtggcggtgg ctccggcgga ggtgggtccg gtggcggcgg atcaggtggg ggtggatcag gcggtggagg ttccggtggc gggggatcag acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggagga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ttggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagaattc 刪除了 B結構域的FVIII氨基酸序列：信號肽如帶有下劃線的序列所示；HC與LC序列之間的14個氨基酸的連接體（包含剩餘的B結構域）如雙下劃線所示，並且 S743/Q 1 63 8融合位點如黑體所示。 -169 - 201217527

1 MOIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSVTOYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPR5 FSONPPVLKR HOREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE

801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

851 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1451 CEAQDLY 全長FVIII氨基酸序列：信號肽如帶有下劃線的序列所示。

1 MOIELSTCFF LCLLRFCFSA 51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF 101 151 DTWITLKNM GSHTYVWQVL GSLAKEKTQT ASHPVSLHAV KENGPMASDP 201 LHKFILLFAV 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA 451 TDETFKTREA IQHESGILGP 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG 751 SKNNAIEPRS FSQNSRHPST 801 IQNVSSSDLL MLLRQSPTPH 851 SEMTHFRPQL HHSGDMVFTP 901 951 SNNLISTIPS SGGPLSLSEE DNLAAGTDNT NNDSKLLESG 1001 ALLTKDNALF KVSISLLKTN 1051 ILESDTEFKK VTPLIHDRML 1101 EGPIPPDAQN PDMSFFKMLF 1151 LGPEKSVEGQ NFLSEKNKW 1201 LHENNTHNQE KKIQEEIEKK 1251 TRQNVEGSYD GAYAPVLQDF 1301 NQTKQIVEKY ACTTRISPNT 1351 IVDDTSTQWS KNMKHLTPST

TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL RQKQFNATTI PENDIEKTDP WFAHRTPMPK GLSLSDLQEA KYETFSDDPS PGAIDSNNSL ESGLQLRLNE KLGTTAATEL KKLDFKVSST SSLGPPSMPV HYDSQLDTTL FGKKSSPLTE LMNSQESSWG KNVSSTESGR LFKGKRAHGP KTSNNSATNR KTHIDGPSLL IENSPSVWQN MDKNATALRL NHMSNKTTSS KNMEMVQQKK LPESARWIQR THGKNSLNSG QGPSPKQLVS VGKGEFTKDV GLKEMVFPSS RNLFLTNLDN ETLIQENWL PQIHTVTGTK NFMKNLFLLS RSLNDSTNRT KKHTAHFSKK GEEENLEGLG SQQNFVTQRS KRALKQFRLP LEETELEKRI LTQIDYNEKE KGAITQSPLS DCLTRSHSIP

-170- 201217527 1401 1451 1501 1551 1601 1651 1701 1751 1801 1851 1901 1951 2001 2051 2101 2151 2201 2251 2301 2351

QANRSPLPIA SHFLQGAKKN KPDLPKTSGK AIKWNEANRP SQEKSPEKTA TERLCSQNPP EDENQSPRSF KWFQEFTDG PYSFYSSLIS CKAWAYFSDV IFDETKSWYF LVMAQDQRIR VFETVEMLPS IRDFQITASG HGIKTQGARQ SSGIKHNIFN SKAISDAQIT VDFQKTMKVT VFQGNQDSFT Y

KVSSFPSIRP NLSLAILTLE VELLPKVHIY GKVPFLRVAT FKKKDTILSL VLKRHQREIT QKKTRHYFIA SFTQPLYRGE YEEDQRQGAE DLEKDVHSGL TENMERNCRA WYLLSMGSNE KAGIWRVECL QYGQWAPKLA KFSSLYISQF PPIIARYIRL ASSYFTNMFA GVTTQGVKSL PWNSLDPPL

IYLTRVLFQD MTGDQREVGS QKDLFPTETS ESSAKTPSKL NACESNHAIA RTTLQSDQEE AVERLWDYGM LNEHLGLLGP PRKNFVKPNE IGPLLVCHTN PCNIQMEDPT NIHSIHFSGH IGEHLHAGMS RLHYSGSINA IIMYSLDGKK HPTHYSIRST TWSPSKARLH LTSMYVKEFL LTRYLRIHPQ

NSSHLPAASY LGTSATNSVT NGSPGHLDLV LDPLAWDNHY AINEGQNKPE IDYDDTISVE SSSPHVLRNR YIRAEVEDNI TKTYFWKVQH TLNPAHGRQV FKENYRFHAI VFTVRKKEEY TLFLVYSNKC WSTKEPFSWI WQTYRGNSTG LRMELMGCDL LQGRSNAWRP ISSSQDGHQW SWVHQIALRM

RKKDSGVQES YKKVENTVLP EGSLLQGTEG GTQIPKEEWK IEVTWAKQGR MKKEDFDIYD AQSGSVPQFK MVTFRNQASR HMAPTKDEFD TVQEFALFFT NGYIMDTLPG KMALYNLYPG QTPLGN KVDLI TLMVFFGNVD NSCSMPLGME QVNNPKEWLQ TLFFQNGKVK EVLGCEAQDL

jGMASGH jLAPMII

FIX氨基酸序列。信號序列如虛線所示，前肽如雙下劃線所示。

ERECMEEKCS FEEAREVFEN TERTTEFWKQ FGFEGKNCEL DVTCNIKNGR CEQFCKNSAD VSVSQTSKLT RAETVFPDVD YVNSTEAETI QWLNGKVDA FCGGSIVNEK WIVTAAHCVE PHHNYNAAIN KYNHDIALLE LDEPLVLNSY HKGRSALVLQ YLRVPLVDRA TCLRSTKFTI GTSFLTGIIS WGEECAMKGK YGIYTKVSRY

FLDHENANKI LNRPKRYMSG KLEEFVQGNL· TVDGDQCESN PCLNGGSCKD DINSYECWCP NKWCSCTEG YRLAENQKSC EPAVPFPCGR LDNITQSTQS FNDFTRWGG EDAKPGQFPW TGVKITWAG EHNIEETEHT EQKRNVIRII VTPICIADKE YTNIFLKFGS GYVSGWGRVF YNNMFCAGFH EGGRDSCQGD SGGPHVTEVE VNWIKEKTKL T

FIX DNA序歹IJ

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc acaaaatt ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaatcta gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc acttga FX氨基酸序列。信號序列如虛線所示，前肽如雙下劃線所示。 -171 - 201217527

MnRPT.HLVLL SASLAGLLLL GE5LFIRREO ANNIJ^ARVTR

TCSYEEAREV

CELFTRKLCS

KRSVAQATSS

CKDGECPWQA

AVHEVEWIK

VSGFGRTHEK

GPHVTRFKDT

VITSSPLK

FEDSDKTNEF

LDNGDCDQFC

SGEAPDSITW

LLINEENEGF

HNRFTKETYD

GRQSTRLKML

YFVTGIVSWG

WNKYKDGDQC

HEEQNSWCS

KPYDAADLDP

CGGTILSEFY

FDIAVLRLKT

EVPYVDRNSC

EGCARKGKYG

ETSPCQNQGK

CARGYTLADN

TENPFDLLDF

ILTAAHCLYQ

PITFRMNVAP

KLSSSFIITQ

IYTKVTAFLK

ANSFLEEMKK

CKDGLGEYTC

GKACIPTGPY

NQTQPERGDN

AKRFKVRVGD

ACLPERDWAE

NMFCAGYDTK

WIDRSMKTRG

GHLERECMEE

TCLEGFEGKN

PCGKQTLERR

NLTRIVGGQE

RNTEQEEGGE

STLMTQKTGI

QEDACQGDSG

LPKAKSHAPE FX DNA序列 atggggcgcc ggggaaagtc gccaattcct acctgctcat tggaataaat tgtaaagacg tgtgaattat cacgaggaac ggcaaggcct aagaggtcag aagccatatg aaccagacgc tgcaaggacg tgtggtggaa gccaagagat gcggtgcacg ttcgacatcg gcctgcctcc gtgagcggct gaggtgccct aacatgttct ggcccgcacg gagggctgtg tggatcgaca gtcataacgt cactgcacct tgttcatccg ttcttgaaga acgaagaggc acaaagatgg gcctcgggga tcacacggaa agaactctgt gcattcccac tggcccaggc atgcagccga agcctgagag gggagtgtcc ccattctgag tcaaggtgag aggtggaggt ccgtgctccg ccgagcgtga tcgggcgcac acgtggaccg gtgccggcta tcacccgctt cccgtaaggg ggtccatgaa cctctccatt cgtcctgctc cagggagcag gatgaagaaa ccgcgaggtc cgaccagtgt atacacctgc gctctgcagc ggtgtgctcc agggccctac caccagcagc cctggacccc gggcgacaac ctggcaggcc cgagttctac ggtaggggac ggtcatcaag gctcaagacc ctgggccgag ccacgagaag caacagctgc cgacaccaag caaggacacc gaagtacggg aaccaggggc aaagtga agtgcctccc gccaacaaca ggacacctcg tttgaggaca gagaccagtc acctgtttag ctggacaacg tgcgcccgcg ccctgtggga agcggggagg accgagaacc aacctcacca ctgctcatca atcctaacgg cggaacacgg cacaaccggt cccatcacct tccacgctga ggccggcagt aagctgtcca caggaggatg tacttcgtga atctacacca ttgcccaagg tggctggcct tcctggcgag aaagagagtg gcgacaagac cttgccagaa aaggattcga gggactgtga ggtacaccct aacagaccct cccctgacag ccttcgacct ggatcgtggg atgaggaaaa cagcccactg agcaggagga tcacaaagga tccgcatgaa tgacgcagaa ccaccaggct gcagcttcat cctgccaggg caggcatcgt aggtcaccgc ccaagagcca cctgctgctc ggtcacgagg catggaagag gaatgaattc ccagggcaaa aggcaaaaac ccagttctgc ggctgacaac ggaacgcagg catcacatgg gcttgacttc aggccaggaa cgagggtttc tctctaccaa gggcggtgag gacctatgac cgtggcgcct gacggggatt caagatgctg catcacccag ggacagcggg cagctgggga cttcctcaag tgccccggag pSYN-FIX-〇53的 DNA序列 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561

ATGCAGCGCG GGATATCTAC GCTTGCCTTT GATTTGACAG AACATCACAG AAAAACAAAG CTAAAGAATT TGAATCGGCC AGAGAGAATG CTGAAAGAAC CATGTTTAAA TTGGATTTGA GCGAGCAGTT ATCGACTTGC TTTCTGTTTC ATGTAAATTC TTAATGACTT AGGTTGTTTT GGATTGTAAC AACATAATAT CTCACCi TGGACGJ ACACGAACAT ACAAAGGGAG CATGTCTTCG AAGGAGGTAG GGACCAGTTT

:ACAA 3AACC

TGAACATGAT TCAGTGCTGA TAGATATAGA ATTGAA GGCTC ACTTTCTTAA ATTCTTTTAC AAAGAGGTAT TATGGAAGAA AACTGAATTT TGGCGGCAGT AGGAAAGAAC TTGTAAAAAT ,CCAG TTCT TACTGAAGCT CACTCGGGTT GAATGGTAAA TGCTGCCCAC TGAGGAGACA CTACAATGCA CTTAGTGCTA CTTCCTCAAA ATCAGCTTTA ATCTACAAAG AGATTCATGT CTTAACTGGA

CAATA1 ATTTTG

AGAAAAC ACAAACT

CATGGCAGAA ATGTACAGGT AATATCTGAT GAGTCTAACA CATGCCCTAA GAGATGTAAA ATTTCAGTTT AATTCAGGTA AAGTGTAGTT TGGAAGCAGT TGCAAGGATG TGTGAATTAG AGTGCTGATA AAGTCCTGTG AAGCTCACCC GAAACCATTT GTTGGTGGAG GTTGATGCAT TGTGTTGAAA GAACATACAG GCTATTAATA AACAGCTACG TTTGGATCTG GTTCTTCAGT TTCACCATCT CAAGGAGATA ATTATTAGCT

TCACCAGGCC TCATCACCAT CTGCCTTTTA TTGTTTCCTT TTTTAAAATA CATTGAGTAT GCTGTCTTCT TCACTAAATT TTGATTACAT GCCAGCACGC AGGTTGGTAA GTACTGTGGG AGAGAAATTG GCTTTCAGAT TATTTGGATT TCTTT TTTGCTAAAA CGCC AACAAAATTC

ATTTTCATGA TTCTTGATCA AATTGGAAGA TTGAAGAAGC ATGTTGATGG ACATTAATTC ATGTAACATG ACAAGGTGGT AACCAGCAGT GTGCTGAGAC TGGATAACAT

TGTTTTC TGAAAAC GTTTGTTCAA GGGAATCTAG ACGAGAAGTT TTTGAAAACA AGATCAGTGT GAGTCCAATC CTATGAATGT TGGTGTCCCT TAACATTAAG AATGGCAGAT TTGCTCCTGT ACTGAGGGAT

GCCATTTCCA TGTTTTTCCT CACTCAAAGC AAGATGCCAA ACCAGGTCAA TCTGTGGAGG CTCTATCGTT CTGGTGTTAA AATTACAGTT AGCAAAAGCG AAATGTGATT AGTACAACCA TGACATTGCC TTACACCTAT TTGCATTGCT GCTATGTAAG TGGCTGGGGA ACCTTAGAGT TCCACTTGTT ATAACAACAT GTTCTGTGCT GGCTTCCATG GTGGGGGACC CCATGTTACT GAAGTGGAAG GGGGTGAAGA GTGTGCAATG AAAGGCAAAT

TGTGGAAGAG GATGTGGACT ACCCAATCAT TTCCCTTGGC AATGA GTCGC CGAATTATTC CTTCTGGAAC GACAAGGAAT AGAGTCTTCC GACCGAGCCA

3AAAAAT 3CAGGTG -172- 201217527

1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121

3AACC GTGGG

ATGGAATATA

CTGACAAAAC

TCTTCCTCTT

CATGCGTGGT

ACGGCGTGGA

ACCGTGTGGT

AGTGCAAGGT

AAGGGCAGCC

AGAACCAGGT

AGTGGGAGAG

CCGACGGCTC

GGAACGTCTT

GCCTCTCCCT

GTGGATCAGG

AAACTCACAC

TCTTCCCCCC

TGGTGGTGGA

TGGAGGTGCA

TGGTCAGCGT

AGGTCTCCAA

AGCCCCGAGA

AGGTCAGCCT

AGAGCAATGG

GCTCCTTCTT

TCTTCTCATG

CCCTGTCTCC

TACCAAGGTG

TCACACATGC

CCCCCCAAAA

GGTGGACGTG

GGTGCATAAT

CAGCGTCCTC

CTCCAACAAA

CCGAGAACCA

CAGCCTGACC

CAATGGGCAG

CTTCTTCCTC

CTCATGCTCC

GTCTCCGGGT

CGGTGGAGGT

ATGCCCACCG

AAAACCCAAG

CGTGAGCCAC

TAATGCCAAG

CCTCACCGTC

CAAAGCCCTC

ACCACAGGTG

GACCTGCCTG

GCAGCCGGAG

CCTCTACAGC

CTCCGTGATG

GGGTAAATGA

TCCCGGTATG

CCACCGTGCC

CCCAAGGACA

AGCCACGAAG

GCCAAGACAA

ACCGTCCTGC

GCCCTCCCAG

CAGGTGTACA

TGCCTGGTCA

CCGGAGAACA

TACAGCAAGC

GTGATGCATG

AAACGGCGCC

TCCGGTGGCG

TGCCCAGCAC

GACACCCTCA

GAAGACCCTG

ACAAAGCCGC

CTGCACCAGG

CCAGCCCCCA

TACACCCTGC

GTCAAAGGCT

AACAACTACA

AAGCTCACCG

CATGAGGCTC

TCAACTGGAT

CAGCTCCGGA

CCCTCATGAT

ACCCTGAGGT

AGCCGCGGGA

ACCAGGACTG

CCCCCATCGA

CCCTGCCCCC

AAGGCTTCTA

ACTACAAGAC

TCACCGTCGA

AGGCTCTGCA

GCCGGAGCGG

GGGGATCCAG

CGGAACTCCT

TGATCTCCCG

AGGTCAAGTT

GGGAGGAGCA

ACTGGCTGAA

TCGAGAAAAC

CCCCATCCCG

TCTATCCCAG

AGACCACGCC

TGGACAAGAG

TGCACAACCA

TAAGGAAAAA

ACTCCTGGGA

CTCCCGGACC

CAAGTTCAAC

GGAGCAGTAC

GCTGAATGGC

GAAAACCATC

ATCCCGGGAT

TCCCAGCGAC

CACGCCTCCC

CAAGAGCAGG

CAACCACTAC

TGGCGGCGGA

GAAGAGGAGG

GGGCGGACCG

GACCCCTGAG

CAACTGGTAC

GTACAACAGC

TGGCAAGGAG

CATCTCCAAA

GGATGAGCTG

CGACATCGCC

TCCCGTGTTG

CAGGTGGCAG

CTACACGCAG

ACAAAGCTCA GGACCGTCAG CCTGAGGTCA TGGTACGTGG AACAGCACGT AAGGAGTACA TCCAAAGCCA GAGCTGACCA ATCGCCGTGG GTGTTGGACT TGGCAGCAGG ACGCAGAAGA TCAGGTGGGG AAGAGGGACA TCAGTCTTCC GTCACATGCG GTGGACGGCG ACGTACCGTG TACAAGTGCA GCCAAAGGGC ACCAAG^ GTGGAGI GACTCCGACG CAGGGGAACG AAGAGCCTCT FIX-053氨基酸序列。信號序列如虛線所示，前肽如雙下劃線所示，而具有前蛋白轉化酶加工位點的連接體如黑體所示。

1 MQRVNMIMAE SPGLITICLL GYLLSAECTV FLDHENANKT LNRPKRYNSG KLEEFVQGNL SI ERECMEEKCS FEEAREVFEN TERTTEFWKQ YVDGDQCESN PCLNGGSCKD DINSYECWCP 121 FGFEGKNCEL DVTCNIKNGR CEQFCKNSAD NKWCSCTEG YRLAENQKSC EPAVPFPCGR 181 VSVSQTSKLT RAETVFPDVD YVNSTEAETI LDNITQSTQS FNDFTOWGG EDAKPGQFPW 241 QWLNGKVDA FCGGSIVNEK WIVTAAHCVE TGVKITWAG EHNIEETEHT EQKRNVIRII 301 PHHNYNAAIN KYNHDIALLE LDEPLVLNSY VTPICIADKE YTNIFLKFGS GYVSGWGRVF 361 HKGRSALVLQ YLRVPLVDRA TCLRSTKFTI YNNMFCAGFH EGGRDSCQGD SGGPHVTEVE 421 GTSFLTGIIS WGEECAMKGK YGIYTKVSRY VNWIKEKTKL TOKTHTCPPC PAPELLGGPS 481 VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 541 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT 601 KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 661 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKRR RRSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSRKRRKRD 721 KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG 781 VEVHNAKTKP REEQYWSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG 841 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 901 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK* pSYN-FVII-064的 DNA序列

1 61 121 181 241 301 361 ACGCACAAGG 421 AGTGACCACA 481 GACGGGGTGT 541 AAAAGAAATG 601 GAGTGTCCAT 661 ATCAACACCA 721 AACCTGATCG 781 CGGCGGGTGG 841 ATCGCGCTGC 901 CTGCCCGAAC 961 GGCTGGGGCC

：TCCTCTGC 3AAGCCCAC ：GGGCTCC TCTTCAAG

ATGGTCTCCC AGGCCCTCAG GC GCAGTCTTCG TAACCCAGGA GCGTTCCTGG AGGAGCTGCG GCO TCCTTCGAGG AGGCCCGGGA GAT' TCTTACAGTG ATGGGGACCA GTGTGCCTCA GACCAGCTCC AGTCCTATAT CTGCTTCTGC ATGACCAGCT GATCTGTGTG CGGGCACCAA GCGCTCCTGT CGGTGCCACG CCTGCACACC CACAGTTGAA TATCCATGTG CCAGCAAACC CCAAGGCCGA ATTGTGGGGG

CTTCTGCTTG GGCGTCCTGC CTGGAGAGGG IGGAGA .TGCC CTCCCTGCCT ‘CG

GACGCGG AGTCCAT CCCTGCC CGAGAAC

GGCAGGTCCT TCTGGGTGGT CGGTGCTGGG CGCAGGTCAT TCCGCCTGCA GGACGTTCTC AGCTGCTGGA

GTTGTTGGTG AATGGAGCTC CTCCGCGGCC CACTGTTTCG CGAGCACGAC CTCAGCGAGC CATCCCCAGC ACGTACGTCC CCAGCCCGTG GTCCTCACTG TGAGAGGACG CTGGCCTTCG CCGTGGCGCC ACGGCCCTGG

GGCTTCAGGG ACCGGCGCCG AGTGCAAGGA GGACGAAGCT AGAATGGGGG TCGAGGGCCG GCGGCTGTGA AGGGGTACTC GAAAAATACC GCAAGGTGTG AGTTGTGTGG ACAAAATCAA ACGACGGGGA CGGGCACCAC ACCATGTGGT TGCGCTTCTC AGCTCATGGT

CTGCCTGGCT GCGCGCCAAC GGAGCAGTGC GTTCTGGATT CTCCTGCAAG GAACTGTGAG GCAGTACTGC TCTGCTGG TATTCTAG CCCCAAAGGG GGGGACCCTG GAACTGGAGG TGAGCAGAGC CAACCACGAC GCCCCTCTGC ATTGGTCAGC CCTCAACGTG

3GCA \GPA -173- 201217527

1021 CCCCGGCTGA TGACCCAGGA CTGCCTGCAG CAGTCACGGA AGGTGGGAGA CTCCCCAAAT 1081 ATCACGGAGT ACATGTTCTG TGCCGGCTAC TCGGATGGCA GCAAGGACTC CTGCAAGGGG 1141 GACAGTGGAG GCCCACATGC CACCCACTAC CGGGGCACGT GGTACCTGAC GGGCATCGTC 1201 AGCTGGGGCC AGGGCTGCGC AACCGTGGGC CACTTTGGGG TGTACACCAG GGTCTCCCAG 1261 TACATCGAGT GGCTGCAAAA GCTCATGCGC TCAGAGCCAC GCCCAGGAGT CCTCCTGCGA 1321 GCCCCATTTC CCGGTGGCGG TGGCTCCGGC GGAGGTGGGT CCGGTGGCGG CGGATCAGGT 1381 GGGGGTGGAT CAGGCGGTGG AGGTTCCGGT GGCGGGGGAT CCGACAAAAC TCACACATGC 1441 CCACCGTGCC CAGCTCCGGA ACTCCTGGGA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA 1501 CCCAAGGACA CCCTCTACAT CACCCGGGAG CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG 1561 AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT 1621 GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC 1681 ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACT^AA 1741 GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA 1801 CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC 1861 TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG 1921 CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGTTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC 1981 TACAGCAAGC TCACCGTCGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC 2041 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT 2101 AAACGGCGCC GCCGGAGCGG TGGCGGCGGA TCAGGTGGGG GTGGATCAGG CGGTGGAGGT 2161 TCCGGTGGCG GGGGATCCAG GAAGAGGAGG AAGAGGGACA AAACTCACAC ATGCCCACCG 2221 TGCCCAGCAC CGGAACTCCT GGGCGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG 2281 GACACCCTCT ACATCACCCG GGAGCCTGAG GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC 2341 GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG 2401 ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACT^ACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC 2461 CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC 2521 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG 2581 TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG 2641 GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG 2701 AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGTTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC 2761 AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 2821 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAATGA FVII-064氨基酸序列雙下劃線所示，將FVII與序列所示，而具有前蛋白。信號序列如虛線所示，前肽如 Fc連接的連接體如帶有下劃線的轉化酶加工位點的連接體如黑體所示。 1 61 121 181 241 301 361

AVFVTQEEAH GVLHRRRRAN AFLEELRPGS

SFEEAREIFK DAERTKLFWI SYSDGDQCAS THKDDQLICV NENGGCEQVC SDHTGTKRSC KRNASKPQGR IVGGKVCPKG ECPWQVLLLV NLIAVLGEHD LSEHDGDEQS RRVAQVIIPS LPERTFSERT LAFVRFSLVS GWGQLLDRGA ITEYMFCAGY SDGSKDSCKG DSGGPHATHY 421 YIEWLQKLMR SEPRPGVLLR APFPGGGGSG

481 PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLYITRE 541 AKTKPREEQY NSTYRWSVL TVLHQDWLNG 601 QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD 661 YSKLTVDKSR WC3QGNVFSCS VMHEALHNHY 721 SGGGGSRKRR KRDKTHTCPP CPAPELLGGP 781 EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 841 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL 901 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ

SPCQNGGSCK DQLQSYICFC RCHEGYSLLA DGVSCTPTVE NGAQLCGGTL INTIWWSAA TYVPGTTNHD IALIiRLHQPV TALELMVLNV PRLMTQDCLQ RGTWYLTGXV SWGQGCATVG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG PEVTCWVDV KEYKCKVSNK IAVEWESNGQ TQKSLSLSPG SVFLFPPKPK TYRWSVLTV TKNQVSLTCL QGNVFSCSVM

LERECKEEQC LPAFEGRNCE YPCGKIPILE HCFDKIKNWR VLTDHWPLC QSRKVGDSPN HFGVYTRVSQ GGGSDKTHTC

SHEDPEVKFN ALPAPIEKTI PENNYKTTPP KRRURSGGGG DTLYITREPE LHQDWLNGKE VKGFYPSDIA HEALHNHYTQ WYVDGVEVHN SKAKGQPREP VLDSDGSFFL SGGGGSGGG6 VTCVWDVSH YKCKVSNKAL VEWESNGQPE KSLSLSPGK* pSYN-FVIII-049的 DNA序列 1 ATGCAAATAG 61 ACCAGAAGAT 121 GGTGAGCTGC 181 ACCTCAGTCG 241 GCTAAGCCAA 301 GATACAGTGG 361 GGTGTATCCT 421 GAGAAAGAAG 481 541

AAAGAGAATG GTGGACCTGG

AGCTCTCCAC ACTACCTGGG CTGTGGACGC TGTACAAAAA GGCCACCCTG TCATTACACT ACTGGAAAGC 'AAAGT ,TGGC TAAAAGACTT

ATGATAfl GTCCAAI

CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCAGTGGAA CTGTCATGGG AAGATTTCCT CCTAGAGTGC GACTCTGTTT GTAGAATTCA GATGGGTCTG CTAGGTCCTA TAAGAACATG GCTTCCCATC GGGh GCTGAATATG CTGGT GGAAGCCATA CTCTGACCCA CTGTGCCTTA GAATTCAGGC CTCATTGGAG

TTCTGAG CTTCCCT

TGCGATTCTG TGCA TCTTT CGGATCACCT CCATCCAGGC CTGTCAGTCT ATGATCAGAC CATATGTCTG CCTACTCATA CCCTACTAGT

ACTATAT CAAAATC

CTTTAGTGCC AAGTGATCTC TCCATTCAAC TTTCAACATC TGAGGTTTAT TCATGCTGTT CAGTCAAAGG GCAGGTCCTG TCTTTCTCAT ATGTAGAGAA -174- 201217527

601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1S61 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041

GGGAGTCTGG TTTGATGAAG GCTGCATCTG CTGCCAGGTC ACCACTCCTG CGCCAGGCGT GACCTTGGAC GCTTATGTCA GAAGCGC GATGAC TGGGTACATT CCCGATGACA AAGTACAAAA ATTCAGCATG TTGATTATAT GATGTCCGTC CCAATTCTGC ACTAAATCAG GATCTAGCTT AGAGGAAACC AACCGAAGCT CAGCTTGAGG TTTGATAGTT ATTGGAGCAC ATGGTCTATG ATGGAAAACC ATGACCGCCT AGTTATGAAG TTCTCTCAAA CAGTCAGATC GATTTTGACA CGACACTATT CATGTTCTAA CAGGAATTTA TTGGGACTCC AGAAATCAGG CAGAGGCAAG TTTTGGAAAG GCTTATTTCT CTGGTCTGCC TTTGCTCTGT GAAAGAAACT TATCGCTTCC CAGGATCAAA ATTCATTTCA TCT TGG GTGTACAGCA CAGATTACAG TCCGGATCAA TTGGCACCAA CTCTACATCT CGAGGAAATT AAACACAATA TATAGCATTC

：GGAAG ^CAACT TACAATCT TGGCGGG1

ATGCCATTGG TTTACCAATA AGTAATGCCT AAGACAATGA TATGTGAAGG CAGAATGGCA TCTCTAGACC CAGATTGCCC CACACATGCC CCCCCAAAAC GTGGACGTGA GTGCATAATG AGCGTCCTCA TCCAACAAAG CGAGAACCAC AGCCTGACCT AATGGGCAGC TTCTTCCTCT TCATGCTCCG TCTCCGGGTA

CCAAGGAAAA ‘GTTG ；GCCTG TGATTGGATG

GGAAAAG CTCGGGC

rTGCACAAAT \CAAAGAACT

GACACAGACC Γ GCACTCAGAA A< GCCTAAAATG CACACAGTCA CCACAGGAAA TCAGTCTATT

AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA AGTTTCTACT GTTTTGTCAT AAGTAGACAG CTGTCCAGAG ACTATGATGA TGATCTTACT CTCCTTCCTT TATCCAAATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG

GAAGTTATAA AAGTCAATAT AAGTCCGATT TATGGCATAC

AATCAGGAAT TTAAGAATCA CTTTGTATTC CAGGAGAAAT ATCCTCGGTG CAGGACTCAT AGATAATGTC GGTACCTCAC ATCCAGAGTT TGCAGTTGTC AGACTGACTT AAGACACACT CAGGTCTATG TACTGAAGGT ATATTTCAGC ACCCACCAGT AAGAGGAAAT

CTTGGGACCT AGCAAGCAGA AAGGAGATTA ATTCAAATAT CCTGACCCGC TGGCCCTCTC

TTATACTACT CCTTGATGCA ATGGTTATGT GGCATGTGAT CATTTCTTGT CTGCTCAAAC ATCTCTTCCC ACCAACATGA GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT CCAAGAAGCA TCCTAAAACT ATGCTCCCTT AGTCCTCGCC GCCCTCAGCG GATTGGTAGG CCTTTAAGAC GGGAAGTTGG TCTACCCTCA TAAAACATTT TGACTGTAGA GTTTCGTTAA ACAAAGAATC TGTTTTCTGT TCCCCAATCC ACAGCATCAA CATACTGGTA GATATACCTT GAGAAACTGT

TTTTGCTGTA GGATAGGGAT AAACAGGTCT TGGAATGGGC GAGGAACCAT ACTCTTGATG TGGCATGGAA

CGCTCAGTTG GACTGGGACT TTGAACAATG ACAGATGAAA TTACTTTATG CCATATAACA CCAAAAGGTG AAATGGACAG TATTACTCTA CTCATCTGCT

AGACAAGAGG AATGTCATCC AGAGAATATA CAACGCTTTC

CCAAGCCTCC AGTTTGTTTG CCTTTCTGTC CACCCTATTC GATTCTGGGG TTCTAGTTGT

AACATCATGC CATGAGGTGG TTCTTCTCTG CCATTCTCAG TGCCACAACT GACAAGAACA TCGTGAAGCT AGACACACTG CGGAATCACT GAAGGATTTT AGATGGGCCA TATGGAGAGA TGTAGATCAA ATTTGATGAG AGCTGGAGTG TGGCTATGTT CATTCTAAGC CAAACACAAA CTTCAl

VTGTCG CAGACTTTCG GAACAGAGGC CTGGTGATTA TTACGAGGAC ATACTTGCTG AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC CTTGAAACGC CATCAACGGG AAATi

'AACTCG TACTACTCTT TGACTATGAT GATACCATAT CAGTTGAAAT GAAGAAGGAA CAGAGCCCCC GCAGCTTTCA AAAGAAAACA CTCTGGGATT ATGGGATGAG TAGCTCCCCA TCAGAGTGGC AGTGTCCCTC AGTTCAAGAA AGTTGTTTTC CTTTACTCAG CCCTTATACC GTGGAGAACT AAATGAACAT GAAGTTGAAG ATAATATCAT GGTAACTTTC TATTCTAGCC TTATTTCTTA TGAGGAAGAT TTTGTCAAGC CTAATGAAAC CAAAACTTAC ACTAAAGATG AGTTTGACTG CAAAGCCTGG GATGTGCACT CAGGCCTGAT TGGACCCCTT GACAAGTGAC AGTACAGGAA GGTACTTCAC TGAAAATATG GCAGGGCTCC CTGCAATATC CAGATGGAAG ATCCCACTTT TAAAGAGAAT ATGCAATCAA TGGCTACATA ATGGATACAC TACCTGGCTT AGTAATGGCT GGATTCGATG GTATCTGCTC AGCATGGGCA GCAATGAAAA CATCCATTCT GTGGACATGT GTTCACTGTA CGAAAAAAAG AGGAGTATAA AATGGCACTG ATCCAGGTGT TTTTGAGACA GTGGAAATGT TACCATCCAA AGCTGGAATT AATGCCTTAT TGGCGAGCAT CTACATGCTG GGATGAGCAC ACTTTTTCTG ATAAGTGTCA GACTCCCCTG GGAATGGCTT CTGGACACAT TAGAGATTTT CTTCAGGACA ATATGGACAG TGGGCCCCAA AGCTGGCCAG ACTTCATTAT TCAATGCCTG GAGCACCAAG GAGCCCTTTT CTTGGATCAA GGTGGATCTG TGATTATTCA CGGCATCAAG ACCCAGGGTG CCCGTCAGAA GTTCTCCAGC CTCAGTTTAT CATCATGTAT AGTCTTGATG GGAAGAAGTG GCAGACTTAT CCACTGGAAC CTTAATGGTC TTCTTTGGCA ATGTGGATTC ATCTGGGATA TTTTTAACCC TCCAATTATT GCTCGATACA TCCGTTTGCA CCCAACTCAT GCAGCACTCT TCGCATGGAG TTGATGGGCT GTGATTTAAA GAATGGAGAG TAAAGCAATA TCAGATGCAC AGATTACTGC TGTTTGCCAC CTGGTCTCCT TCAAAAGCTC GACTTCACCT GGAGACCTCA GGTGAATAAT CCAAAAGAGT GGCTGCAAGT AAGTCACAGG AGTAACTACT CAGGGAGTAA AATCTCTGCT AGTTCCTCAT CTCCAGCAGT CAAGATGGCC ATCAGTGGAC AAGTAAAGGT TTTTCAGGGA AATCAAGACT CCTTCACACC CACCGTTACT GACTCGCTAC CTTCGAATTC ACCCCCAGAG TGAGGATGGA GGTTCTGGGC TGCGAGGCAC AGGACCTCTA CACCGTGCCC AGCACCTGAA CTCCTGGGAG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GCCACGAAGA CCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC CCGTCCTGCA CCAGGACTGG CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC CCCTCCCAGC CCCCATCGAG AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGCGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACGCCTCCCG TGTTGGACTC CGACGGCTCC ACAGCAAGCT CACCGTCGAC AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TGATGCATGA GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG AACGGCGCCG CCGGAGCGGT GGCGGCGGAT CAGGTGGGGG TGGATCAGGC

TTTATGATGA GGATGAAAAT TTATTGCTGC AGTGGAGAGG GAAACAGGGC CTGATGGCTC TGGGGCCATA TATAAGAGCA CCTCTCGTCC CTATTCCTTC GAGCAGAACC TAGAAAAAAC TGCAACATCA TATGGCACCC CTGATGTTGA CCTGGAAAAA ACACTAACAC ACTGAACCCT GCTCATGGGA TTTTCACCAT CTTTGATGAG ACCAAAAGCT

TAGTTGCAGC TTCATCCTAC CCAAGGGAGG GGACTTCCAG TACCAGCATG TCTCTTTTTT TGTGGTGAAC TTGGGTGCAC CGAC

^ΟΆΆΆΆΟ rCCTCTT -175- 201217527

5101 GGTGGAGGTT CCGGTGGCGG GGGATCCGGC GGTGGAGGTT CCGGTGGGGG TGGATCAAGG 5161 AAGAGGAGGA AGAGGGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCTCC AGAACTCCTG 5221 GGCGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG 5281 ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC 5341 AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG 5401 TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT 5461 GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC 5521 ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG 5581 GATGAGCTGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC 5641 GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT 5701 CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC 5761 AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC 5821 TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATGA F VIII-049氨基酸序列。信號序列如虛線所示，而具有前蛋白轉化酶加工位點的連接體如黑體所示。

1 MQXE^.SJCPE..liC.ULR?C：F.SA TRRYYLGAVE LSWDYNQSDL GELPVDARFP PRVPKSFPFN SI TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL· LGPTIQAEVY DTWITLKNM ASHPVSLHAV 121 GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH 181 VDLVKDLNSG LIGALLVCRE GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD 241 AASARAWPKM HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE EPQLRMKNNE 361 EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA 421 PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL· 481 LIIFKNQASR PYNIYPHGIT DVRPLySRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP 541 TKSDPRCLTR YYSSFVNMER DLASGLIGPIi LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL HEVAYWYILS 661 IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS MENPGLWILG CHNSDFRNRG 721 MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL· SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL *781 QSDQEEIDYD DTISVEMKKE DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP 841 HVLRNRAQSG SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP TKDEFDCKAW 961 AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTI*NP AHGRQVTVQE FALFFTIFDE TKSWYFTENM 1021 ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS 1081 IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLXGEH LHAGMSTLFL 1141 VYSNKCQTPL GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL· 1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV FFGNVDSSGI 1261 KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS MPLGMESKAI SDAQITASSY 1321 FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM 1381 YVKEFLISSS QDGHQWTLFF QNGiCVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH 1441 QIALRMEVLG CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFIjF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW 1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV 1561 SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES 1621 NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL 1681 SPGKRRRRSG GGGSGGG6SG GGGSGGG6SG GG65GGGGSR KRRKRDKTHT CPPCPAPELL 1741 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 1801 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 1861 DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 1921 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* IFN-b-018 的 DNA序歹！1

1 ATGACCAACA 61 TCCATGAGCT 121 CTCCTGTGGC 181 ATCCCTGAGG 241 TATGAGATGC 301 AATGAGACTA 361 ACAGTCCTGG 421 CTGCACCTGA 481 CACTGTGCCT 541 CTTACAGGTT 601 GGGAGCGACA 661 TCAGTCTTCC 721 GTCACATGCG 781 GTGGACGGCG 841 ACGTACCGTG 901 TACAAGTGCA 961 GCCAAAGGGC

AAGAAAAAC AAAGATATT

AGTGTCTCCT CCAAATTGCT CTCCTGTTGT GCTTCTCCAC TACAGCTCTT ACAACTTGCT TGGATTCCTA CAAAGAAGCA GCAATTTTCA GTGTCAGAAG AATTGAATGG GAGGCTTGAA TATTGCCTCA AGGACAGGAT GAACTTTGAC AGATTAAGCA GCTGCAGCAG TTCCAGAAGG AGGACGCCGC ATTGACCATC TCCAGAACAT CTTTGCTATT TTCAGACAAG ATTCATCTAG CACTGGCTGG TTGTTGAGAA CCTCCTGGCT AATGTCTATC ATCAGATAAA CCATCTGAAG CT GGAGAAAGAA GATTTCACCA GGGGAAAACT CATGAGCAGT TA TGGGAGGATT CTGCATTACC TGAAGGCCAA GGAGTACAGT GGACCATAGT CAGAGTGGAA ATCCTAAGGA ACTTTTACTT CATTAACAGA ACCTCCGAAA CGGTGGCGGC GGCTCCGGTG GAGGCGGGTC CGGCGGTGGA AAACTCACAC ATGCCCACCG TGCCCAGCTC CGGAACTCCT GGGAGGACCG TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG -176- 201217527

1021 ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 1081 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGTTG 1141 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TCGACAAGAG CAGGTGGCAG 1201 CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG 1261 AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAACGG CGCCGCCGGA GCGGTGGCGG CGGATCAGGT 1321 GGGGGTGGAT CAGGCGGTGG AGGTTCCGGT GGCGGGGGAT CCAGGAAGAG GAGGAAGAGG 1381 GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCACCGGAAC TCCTGGGCGG ACCGTCAGTC 1441 TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACA 1501 TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG GTACGTGGAC 1561 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA CAGCACGTAC 1621 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA GGAGTACAAG 1681 TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA 1741 GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGATGA GCTGACCAAG 1801 AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG 1861 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT GTTGGACTCC 1921 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG 1981 AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC GCAGAAGAGC 2041 CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA ATGA IFN-b-018氨基酸序列。信號序列如虛線所示，將 φ IFN-b與Fc區連接的連接體如帶有下劃線的序列所示，而具有前蛋白轉化酶加工位點的連接體如黑體所示。 1 MXMCIiijQIA..liUiCFSTXAIi..5MSYNLLGFL QRSSNFQCQK LLWQLNGRLE YCLKDRMNFD 61 IPEElkQL^b FQK^0Ai0ji'i YEMLQNIFAI FRQDSSSTGW NETIVENLLA NVYHQINHLK 121 TVLEEKLBKE DFTRGKLMSS LHLKRYYGRX LHYLKAKEYS HCAWTIVRVE ILRNFYFINR 181 LTGYLRNGGG GSC3GGC35GGG GSDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE 241 VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE 301 YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 361 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 421 KSLSLSPGKR RSRSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSRKRRKR DKTHTCPPCP APELLGGPSV 481 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY 541 RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK 601 NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG 661 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK* 通過以下實例進一步說明本發明，這些實例不應該解釋爲限定性的。本申請全文中所引用的所有文獻、專利及 ® 公開的專利申請的內容均以引用方式倂入本文。【圖式簡單說明】圖1A和B爲在連接Fc部分的多肽連接體的上游及下游具有蛋白酶加工位點的本發明示例性結構的圖示。

圖2示例說明了因數Vila Fc異源二聚體，其中FVII輕鏈-Fc以及重鏈-Fc以單鏈形式表達’並在蛋白酶對連接體進行處理後以活性蛋白質二聚體的形式分泌。所述附圖包括使用FVII-024 +/- PC5瞬間轉染的細胞的蛋白質A -177- 201217527 pulldown的 Western印記。圖3 A示例說明了 FIX-Fc蛋白質中加工位點的前肽轉化的切割以用於除去cscFc中連接兩個Fc部分的多肽連接體。圖3B示例說明了使用PACE而不使用Kex2，PC5或PC7而得到的FIX-044中加工位點的完全切割，但是PACE的切割導致所述蛋白質的額外切割（參見B、D下方的條帶）。圖 3的面板C示例說明了使用倂入FIX-052和- 053中的可切割的連接體所觀察到的PC5的最佳的加工。圖4的面板A示出了圖表，該圖表示例說明了 FVIII可切割的scFc分子以及該分子的加工形式。圖4的面板B示出了經純化的FVIII-049蛋白質（與PC5共轉染之後）的SDS-PAGE凝膠 > 其證明了所述分子的完全加工。圖5的面板A示出了突變，該圖表示例說明了 FVII可切割的SCFc(FVII-064)構建體以及該分子的加工形式。在該構建體中，所述之生物學活性部分包含單鏈F VII。圖5的面板B示出了經純化的FVIII-064蛋白質（與PC5共轉染之後）的SDS-P AGE凝膠，其證明了所述分子的完全加工。圖6的面板A示例說明了 FVIIFc-027構建體，其包含具有靶向部分MB9的FVII cscFc融合物。圖6的面板B示出了經純化的FVII-027蛋白質（與PC5共轉染之後）的SDS-PAGE凝膠，其證明了所述分子的完全加工。圖7示例說明了所制得的多種其他的構建體，其中 FVII重鏈和輕鏈單獨表達或以單鏈形式表達。圖8示例說明了在瞬間轉染HEK29 3細胞之後FVIIFc種 -178- 201217527 類、以及圖7中示例說明的所述分子的蛋白質A pulldown 的Western印記分析。

圖9示例說明了異源二聚體scFc構建體以及單體Fc構建體。制得這些構建體並實施Western印記。資料顯示與單體（FVII-025)相比，異源二聚體（FVII-024)的細胞內活性是更高效的，並且需要PC5的共轉染以用於完全加工。這些FVII-024資料與圖2中所示的相同，而且示出了 FVII024 與FVII-025之間的直接比較。圖10示出了包含IFN-β作爲所述之生物學活性部分的 scFc分子。該附圖還示出了 Western印記，其實例說明了在缺乏PC共轉染的情況下可加工的連接體的部分切割’但是在共轉染的情況下爲完全切割。圖11示出了 FVIIFc種類在瞬間轉染HEK2 93細胞後以及蛋白質 A pulldown的 Western印記分析（Fc Western )。

-179- 201217527 序列表 <110〉J.薩拉斯 R ·彼得斯 <120〉編碼可切割或可加工的單鏈Fc分子的基因構建體以及使用其製備的多肽

<130> SGG-830PC <150> US 61/363,186 <151〉 2010-07-09 <150> US 61/363,183 <151〉 2010-07-09

<150〉 US 61/442,029 <151> 2010-02-11 <150> US 61/442,150 <151> 2010-02-11 <150> US 61/442,055 <151> 2010-02-11 <150> US 61/467,880 <151> 2011-03-25 〈150〉 US 61/491,762 <151> 2011-05-31

<160> 91 <170> Patentln version 3. 5 <210〉 1 <211> 4 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 1 <400> 201217527

Arg Arg Arg Arg 1 〈210〉 2 <211> 6 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <400> 2

Arg Lys Arg Arg Lys Arg 1 5 〈210〉 3 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400> 3

Arg Arg Arg Arg Ser 1 5 <210〉 4 <211> 50 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <220> <221> misc—feature 〈222〉（6)..(50) s -2- 201217527 <223〉〃Gly Gly Gly Gly Ser"中的任意基圑可以存在或不存在 <400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45

Gly Ser 50 <210> 5 <211> 30 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <400〉 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 6 <211〉 20 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 201217527 <223〉合成肽 <400〉 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser 20 <210〉 7 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <400> 7

Thr Gin Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg 1 5 <210〉 8 〈211〉 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <400> 8

Ser Val Ser Gin Thr Ser Lys Leu Thr Arg 1 5 10 <210〉 9 <211〉 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 -4 201217527 <220〉 <223〉合成肽 <400〉 9

Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg 1 5 10 <210〉 10 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉人工序列

<220〉 <223〉合成肽 <400> 10

Thr Thr Lys lie Lys Pro Arg 1 5 <210〉 11 <211> 10 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成狀 <400〉 11

Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala 1 5 10 <210〉 12 <211> 11 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> 201217527 <223〉合成肽〈400〉 12

Pro Lys Asn Ser Ser Met He Ser Asn Thr Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉

<223〉合成肽 <400〉 13

His Gin Ser Leu Gly Thr Gin 1 5 〈210〉 14 〈211〉 8 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成耽〈400〉 14

His Gin Asn Leu Ser Asp Gly Lys 1 5 <210〉 15 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 -6- 201217527 <400> 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210〉 16 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽

<400〉 16

Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210〉 17 <211〉 8 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400> 17

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 <210〉 18 <211〉 12 〈212〉 PRT <213> 人工序列〈220〉 <223〉合成肽 <400〉 18 201217527

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 1 5 10 <210〉 19 〈211〉 50 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400> 19

Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys 15 10 15

Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro 20 25 30

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 35 40 45

Cys Pro 50

<210〉 20 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400> 20

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 -8- 201217527 <210〉 21 <211〉 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <400〉 21

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 1 5

<210〉 22 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <400> 22

Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 〈210〉 23 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉人工序列〈220〉 <223> 合成狀 <400> 23

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 24 〈211〉 8 201217527 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400〉 24

His Gin Asn lie Ser Asp Gly Lys 1 5

<210〉 25 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400〉 25

Val lie Ser Ser His Leu Gly Gin 1 5

<210〉 26 <211〉 31 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <220〉 <221> misc_feature <222> (2).. (31) <223〉"Gly Gly Gly Gly Ser"中的任意基團可以存在或不存在 <400> 26

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15 s -10- 201217527

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 27 <211〉 15 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽

<400> 27

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 15 10 15 <210〉 28 <211〉 17 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <400> 28

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 15 10 15

Gly <210〉 29 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 -11_ <220〉 201217527 <223〉合成肽 <400〉 29

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210〉 30 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列 <220〉 <223> 合成肽 <400〉 30

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 <210〉 31 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成狀 <400〉 31

lie Gly Lys Thr lie Ser Lys Lys Ala Lys 1 <210〉 32 <211> 25 <212〉 PRT <213> 人工序列 <220> <223〉合成肽 -12- 201217527 <400> 32

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser 20 25 〈210〉 33 〈211〉 7 <212> PRT 〈213>人工序列

<220〉 <223〉合成肽 <400〉 33

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 〈210〉 34 <211> 4 <212> PRT 〈213〉人工序列 <220> 〈223>合成肽 <220〉 <221> misc一feature <222> (2).. (2) <223〉Xaa可以是任何天然存在的氨基酸 <220〉 <221> misc_feature <222> (3).. (3) <223> Xaa is Lys or Arg <400> 34 13- 201217527

Arg Xaa Xaa Arg 1 <210〉 35 <211> 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉〈223>合成肽 <400〉 35

Leu Val Pro Arg Gly 1 5 <210〉 36 <211〉 30 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400> 36

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 〈210〉 37 〈211〉 20 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 s -14- 201217527 <400> 37

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser 20

<210〉 38 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 <400> 38 Arg Arg Arg Arg 1 <210〉 39 <211〉 6 <212> PRT <213〉人工序列〈220〉〈223〉合成肽 <400〉 39 Arg Lys Arg Arg 1 <210〉 40 <211〉 4 <212〉 PRT <213〉人工序列 15- 201217527 <220〉 <223> 合成肽 <400〉 40 Arg Arg Arg Arg 1 <210〉 41 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> 合成引物 <400> 41 gggaatgtca acaggcaggg <210〉 42 〈211〉 21 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220> 〈223〉合成引物 <400〉 42 cttggctttc tctccacagg <210〉 43 <211> 40 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉〈223〉合成引物 <400〉 43

20 21

40 cgacaagctt gccgccacca tggtctccca ggccctcagg s -16- 201217527 <210〉 44. <211〉 61 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉〈223〉合成引物 <400〉 44 cgactccgga gctgggcacg gtgggcatgt gtgagttttg tcgggaaatg gggctcgcag g

<210〉 45 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成引物 <400> 45 catccccagc acgtacgtcc <210〉 46 <211> 132 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223> 合成引物 <400〉 46 gggcatgtgt gagttttgtc tgatcccccg ccaccggaac ctccaccgcc tgatccaccc ccacctgatc cgccgccacc ggacccacct ccgccggagc caccgccacc gggaaatggg gctcgcagga gg <210〉 47 201217527 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成引物 <400〉 47 gacaaaactc acacatgccc acc 23

23

<210> 48 <211〉 23 〈212> DNA 〈213>人工序列 <220〉〈223>合成引物 <400〉 48 gcagaattct catttacccg gag <210> 49 <211> 4 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400〉 49

Ala Leu Ala Leu 1 <210〉 50 <211> 41 <212> PRT 〈213〉人工序列 <220> <223〉合成肽 s -18- 201217527 <400> 50

Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg 35 40

<210> 51 <211〉 37 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成引物 <400〉 51 37 agtcaagctt gtcgactccg gaactcctgg gcggacc <210〉 52 〈211〉 101 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成引物 <400> 52 catcggatcc cccgccaccg gaacctccac cgcctgatcc acccccacct gatccgccgc 60 101 caccgctccg gcggcgccgt ttacccggag acagggagag g <210〉 53 <211〉 152

<212> DNA -19- 201217527 <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成引物 <400〉 53 gagttccgga gctgggcacg gtgggcatgt gtgagttttg tctgatcccc cgccaccgga 60 acctccaccg cctgatccac ccccacctga tccgccgcca ccggacccac ctccgccgga 120 gccaccgcca cctcggcctt ggggtttgct gg 152 <210〉 54 <211〉 82 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成引物 <400〉 54

cagtctggat ccggcggtgg aggttccggt gggggtggat caaggaagag gaggaagagg 60 82 37 attgtggggg gcaaggtgtg cc <210〉 55 <211〉 37 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成引物 <400〉 55 atgtctgaat tctcatttac ccggagacag ggagagg <210〉 56 <211> 5 <212〉 PRT <213> 人工序列 s -20- 201217527 <220〉 <223〉合成肽 <400> 56

Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210〉 57 <211> 29 <212〉 PRT <213〉人工序列

<220〉 <223〉合成肽 <400〉 57

Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg 20 25 〈210〉 58 <211〉 86 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成引物 <400〉 58 60 86 catcggatcc cccgccaccg gaacctccac cgcctgatcc acccccacct gatccgccgc cacctttacc cggagacagg gagagg

<210> 59 <211〉 35 <212> DNA 21 - 201217527 <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成引物 <400> 59 cagtcttgat cagacaaaac tcacacatgc ccacc 35 <210〉 60 <211> 34 <212〉 DNA <213〉人工序列 34

<220〉 <223〉合成引物 <400〉 60 actgacgaat tctcatttac ccggagacag ggag <210> 61 <211> 156 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223〉合成引物 <400> 61 aggagttccg gagctgggca cggtgggcat gtgtgagttt tgtcggatcc cccgccaccg 60

gaacctccac cgcctgatcc acccccacct gatccgccgc caccggaccc acctccgccg 120 156 gagccaccgc caccgggaaa tggggctcgc aggagg <210> 62 <211〉 3000 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成構建體：pSYN-FVII-024核苷酸序列 -22- 60 60

201217527 <400〉 62 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga ggtggcggtg gctccggcgg aggtgggtcc ggtggcggcg gatcaggtgg gggtggatca ggcggtggag gttccggtgg cgggggatca gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 -23- 1260 201217527 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa acggcgccgc cggagcggtg gcggcggatc aggtgggggt 1380 ggatcaggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggtgggggt 1440 ggatcaagga agaggaggaa gaggattgtg gggggcaagg tgtgccccaa aggggagtgt 1500 ccatggcagg tcctgttgtt ggtgaatgga gctcagttgt gtggggggac cctgatcaac 1560 accatctggg tggtctccgc ggcccactgt ttcgacaaaa tcaagaactg gaggaacctg 1620 atcgcggtgc tgggcgagca cgacctcagc gagcacgacg gggatgagca gagccggcgg 1680 gtggcgcagg tcatcatccc cagcacgtac gtcccgggca ccaccaacca cgacatcgcg 1740 ctgctccgcc tgcaccagcc cgtggtcctc actgaccatg tggtgcccct ctgcctgccc 1800 gaacggacgt tctctgagag gacgctggcc ttcgtgcgct tctcattggt cagcggctgg 1860 ggccagctgc tggaccgtgg cgccacggcc ctggagctca tggtcctcaa cgtgccccgg 1920 ctgatgaccc aggactgcct gcagcagtca cggaaggtgg gagactcccc aaatatcacg 1980 gagtacatgt tctgtgccgg ctactcggat ggcagcaagg actcctgcaa gggggacagt 2040 ggaggcccac atgccaccca ctaccggggc acgtggtacc tgacgggcat cgtcagctgg 2100 ggccagggct gcgcaaccgt gggccacttt ggggtgtaca ccagggtctc ccagtacatc 2160 gagtggctgc aaaagctcat gcgctcagag ccacgcccag gagtcctcct gcgagcccca 2220 tttcccggtg gcggtggctc cggcggaggt gggtccggtg gcggcggatc aggtgggggt 2280 ggatcaggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatcagaca aaactcacac atgcccaccg 2340 tgcccagcac ctgaactcct gggaggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 2400 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 2460 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 2520 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 2580

S -24- 201217527 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga

2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 <210〉 63 〈211〉 999 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：FVII-024氨基酸序列 <400〉 63

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60

Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie 65 70 75 80 -25- 201217527

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly 85 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110

Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie 115 120 125

Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140

Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He 165 170 175

Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg Gly Gly 180 185 190

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 245 250 255

S -26- 201217527

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He 325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 -27- 201217527

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg 435 440 445

Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 450 455 460

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 465 470 475 480

Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 485 490 495

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 500 505 510

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 515 520 525

His Cys Phe Asp Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 530 535 540

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 545 550 555 560

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 565 570 575

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 580 585 590

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 595 600 605

S -28- 201217527

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 610 615 620

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 625 630 635 640

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 645 650 655

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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 675 680 685

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 690 695 700

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 705 710 715 720

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 725 730 735

Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 740 745 750

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 755 760 765

Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 770 775 780 -29- 201217527

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 785 790 795 800

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 805 810 815

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 820 825 830

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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 850 855 860

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 865 870 875 880

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 885 890 895

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 900 905 910

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 915 920 925 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 930 935 940

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 945 950 955 960

S -30-

201217527

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 965 970 975

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 980 985 990

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 995 〈210〉 64 <211〉 3819 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉〈223> 合成構建體：pSYN-FVII-027 DNA 序列 <400〉 64 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 31 - 201217527

atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag 1260 tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga 1320 gccccatttc ccggtggcgg tggctccggc ggaggtgggt ccggtggcgg cggatcaggt 1380 gggggtggat caggcggtgg aggttccggt ggcgggggat ccgacaaaac tcacacatgc 1440 ccaccgtgcc cagctccgga actcctgggc ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1500 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1560 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1620 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1680 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1740 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1800 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1860 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1920 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc 1980 s -32-

201217527 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaacggcgcc gccggagcgg tggcggcgga tcaggtgggg gtggatcagg cggtggaggt tccggtggcg ggggatccgg cggtggaggt tccggtgggg gtggatcaag gaagaggagg aagagggcgg aagtgcagct ggtgcagtct ggagctgagg tgaataagcc tggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac accttcaccg gctactatat gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatgga tcaaccctaa cagtggtggc acaaactatg cacagaagtt tcagggctgg gtcaccatga ccagggacac gtccatcagc accgcctaca tggagctgag caggctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgcg agaggccgtg ctttgtataa ccggaacgac cggtccccca actggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggg agtgcatccg ccccaaccct taagcttgaa gaaggtgaat tctcagaagc acgcgtacag gctgtgctga ctcagccgcc ctcggtgtca gtggccccag gacagacggc caggattacc tgtgggggaa acaacattgg aagtaaaagt gtgcagtggt accagcagaa gccaggccag gcccctgtgc tggtcgtcta tgatgatagc gaccggccct cagggatccc tgagcgattc tctggctcca actctgggaa catggccacc ctgaccatca gcagggtcga agccggggat gaggccgact attactgtca ggtgtgggat agtagtagtg atcatgtggt attcggcgga gggaccaagc tgaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg ccgtccgcgg ccgctggtgg cggtggctcc ggcggaggtg ggtccggtgg cggcggatca ggtgggggtg gatcaggcgg tggaggttcc ggtggcgggg gatcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg ggaggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 -33- 201217527 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 3360 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 3420 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 3480 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgc 3540 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 3600 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 3660 cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 3720 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 3780 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 3819 〈210〉 65 <211> 1272 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：FVII-027氨基酸序列 <400〉 65

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60

-34- 201217527

Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie 65 70 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly 85 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110

Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie 115 120 125

Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140

Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie 165 170 175

Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val 180 185 190

Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu 195 200 205

Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie 210 215 220

Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg 225 230 235 240 -35- 201217527

Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly 245 250 255

Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr 260 265 270

Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin 275 280 285

Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300

Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320

Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335

Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser 340 345 350

Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365

Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380

Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val 385 390 395 400

Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415

S -36- 201217527

Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu 420 425 430

Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Gly Gly Gly 435 440 445

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 465 470 475 480

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 485 490 495

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 500 505 510

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 515 520 525

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 530 535 540

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 545 550 555 560

Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 565 570 575

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys 580 585 590 -37- 201217527

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 595 600 605

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 610 615 620

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 625 630 635 640

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 645 650 655

Ser Phe Phe Leu Tyr*Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 660 665 670

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 675 680 685

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Arg Arg 690 695 700

Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 705 710 715 720

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 725 730 735

Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala 740 745 750

Glu Val Asn Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 755 760 765

S -38- 201217527

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 770 775 780

Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly 785 790 795 800

Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp 805 810 815

Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp 820 825 830

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ala Leu Tyr Asn Arg 835 840 845

Asn Asp Arg Ser Pro Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 850 855 860

Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Lys Leu Glu 865 870 875 880

Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gin Ala Val Leu Thr Gin Pro 885 890 895

Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gin Thr Ala Arg lie Thr Cys Gly 900 905 910

Gly Asn Asn He Gly Ser Lys Ser Val Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 915 920 925

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Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 965 970 975

Gin Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr 980 985 990

Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu 995 1000 1005

Phe Pro Pro Ser Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1010 1015 1020

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1025 1030 1035

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 1040 1045 1050

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1055 1060 1065

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 1070 1075 1080

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 1085 1090 1095

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 1100 1105 1110

S -40- 201217527

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 1115 1120 1125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 1130 1135 1140

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu 1145 1150 1155

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 1160 1165 1170

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 1175 1180 1185

Ser Leu Thr Cys Leu-Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 1190 1195 1200

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 1205 1210 1215

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 1220 1225 1230

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 1235 1240 1245

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 1250 1255 1260

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1265 1270 -41 - 201217527 <210〉 66 <211〉 3134 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構建體：卩5丫卜卩^-044 0贴序列 <400〉 66 atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60 ggatatctac tcagtgctga atgtacaggt ttgtttcctt ttttaaaata cattgagtat 120

gcttgccttt tagatataga aatatctgat gctgtcttct tcactaaatt ttgattacat 180 gatttgacag caatattgaa gagtctaaca gccagcacgc aggttggtaa gtactgtggg 240 aacatcacag attttggctc catgccctaa agagaaattg gctttcagat tatttggatt 300 aaaaacaaag actttcttaa gagatgtaaa attttcatga tgttttcttt tttgctaaaa 360 ctaaagaatt attcttttac atttcagttt ttcttgatca tgaaaacgcc aacaaaattc 420 tgaatcggcc aaagaggtat aattcaggta aattggaaga gtttgttcaa gggaatctag 480 agagagaatg tatggaagaa aagtgtagtt ttgaagaagc acgagaagtt tttgaaaaca 540 ctgaaagaac aactgaattt tggaagcagt atgttgatgg agatcagtgt gagtccaatc 600 catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt tggtgtccct 660 ttggatttga aggaaagaac tgtgaattag atgtaacatg taacattaag aatggcagat 720 gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctgt actgagggat 780 atcgacttgc agaaaaccag aagtcctgtg aaccagcagt gccatttcca tgtggaagag 840 tttctgtttc acaaacttct aagctcaccc gtgctgagac tgtttttcct gatgtggact 900 atgtaaattc tactgaagct gaaaccattt tggataacat cactcaaagc acccaatcat 960 ttaatgactt cactcgggtt gttggtggag aagatgccaa accaggtcaa ttcccttggc 1020

S -42- 1080 1080

201217527 aggttgtttt gaatggtaaa gttgatgcat tctgtggagg ctctatcgtt aatgaaaaat ggattgtaac tgctgcccac tgtgttgaaa ctggtgttaa aattacagtt gtcgcaggtg aacataatat tgaggagaca gaacatacag agcaaaagcg aaatgtgatt cgaattattc ctcaccacaa ctacaatgca gctattaata agtacaacca tgacattgcc cttctggaac tggacgaacc cttagtgcta aacagctacg ttacacctat ttgcattgct gacaaggaat acacgaacat cttcctcaaa tttggatctg gctatgtaag tggctgggga agagtcttcc acaaagggag atcagcttta gttcttcagt accttagagt tccacttgtt gaccgagcca catgtcttcg atctacaaag ttcaccatct ataacaacat gttctgtgct ggcttccatg aaggaggtag agattcatgt caaggagata gtgggggacc ccatgttact gaagtggaag ggaccagttt cttaactgga attattagct ggggtgaaga gtgtgcaatg aaaggcaaat atggaatata taccaaggta tcccggtatg tcaactggat taaggaaaaa acaaagctca ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagctccgga actcctggga ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga % 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 -43- 201217527 gcctctccct gtctccgggt aaacggcgcc gccggagcgg tggcggcgga tcaggtgggg 2400 gtggatcagg cggtggaggt tccggtggcg ggggatcccg ccggcggcgc gacaaaactc 2460 acacatgccc accgtgccca gcaccggaac tcctgggcgg accgtcagtc ttcctcttcc 2520 ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg 2580 tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg 2640 tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca 2700 gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct 2760

ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc 2820 gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca 2880 gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 2940 atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc gacggctcct 3000 tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct 3060 catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt 3120 ctccgggtaa atga 3134 〈210〉 67 <211> 944 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉〈223>合成構建體：FIX-044氨基酸序列 <400〉 67

Met Gin Arg Val Asn Met lie Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu lie Thr 15 10 15 lie Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

S -44- 201217527 20 25 30

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Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val.Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80

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Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn lie Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gin Phe 130 135 140

Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gin Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gin Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190

Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu -45- 201217527 195 200 205

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Gin Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser He 245 250 255

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Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn lie Glu Glu Thr Glu 275 280 285

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Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie Cys lie 325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn He Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365

Leu Gin Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg

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Ser Thr Lys Phe Thr He Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly He lie Ser Trp Gly 420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly He Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp He Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Asp Lys Thr 450 455 460

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 465 470 475 480

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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 515 520 525

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 530 535 540

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr -47- 201217527 545 550 555 560

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 565 570 575 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 580 585 590

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 595 600 605

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 645 650 655

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 660 665 670

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Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 690 695 700

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Asp Lys Thr 705 710 715 720

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

S -48 - 201217527 725 730 735

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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 770 775 780

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 785 790 795 800

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 805 810 815

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr 820 825 830 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 835 840 845

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 850 855 860

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 865 870 875 880

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 885 890 895

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser -49- 201217527 900 905 910

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 915 920

Ser Val Met His Glu Ala 925

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 930 935 940 <210〉 68 <211> 790 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：Genscript-FIX-044 DNA 序列 <400> 68 tccggaactc ctgggaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgt tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaac ggcgccgccg gagcggtggc ggcggatcag gtgggggtgg atcaggcggt ggaggttccg gtggcggggg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720

S •50- 780 201217527 atcccgccgg cggcgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac cggaactcct gggcggaccg <210〉 69 <211〉 577 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：Genscript-FVII-027-1 DNA 序列 <400〉 69 gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaacg gcgccgccgg agcggtggcg gcggatcagg tgggggtgga tcaggcggtg gaggttccgg tggcggggga tccggcggtg gaggttccgg tgggggtgga tcaaggaaga ggaggaagag ggcggaagtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaat aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccggctac tatatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg atggatcaac cctaacagtg gtggcacaaa ctatgcacag aagtttcagg gctgggtcac catgaccagg gacacgtcca tcagcaccgc ctacatggag ctgagcaggc tgagatctga cgacacggcc gtgtattact gtgcgagagg ccgtgctttg tataaccgga acgaccggtc ccccaactgg ttcgacccct ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct cagggagtgc atccgcccca acccttaagc ttgaagaagg tgaattc <210〉 70 <211〉 1179 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：Genscript-FVII-026_2DNA 序列 <400> 70 790

60 120 180 240 300 360 420 480 540 577 51 - 60 60 ctgactcagc cgccctcggt gtcagtggcc ggaaacaaca ttggaagtaa aagtgtgcag gtgctggtcg tctatgatga tagcgaccgg tccaactctg ggaacatggc caccctgacc gactattact gtcaggtgtg ggatagtagt aagctgaccg tcctaggtca gcccaaggct gcggccgctg gtggcggtgg ctccggcgga ggtggatcag gcggtggagg ttccggtggc ccgtgcccag cacctgaact cctgggagga aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgatgag ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg tgagaattc 201217527 gaattctcag aagcacgcgt acaggctgtg ccaggacaga cggccaggat tacctgtggg tggtaccagc agaagccagg ccaggcccct ccctcaggga tccctgagcg attctctggc atcagcaggg tcgaagccgg ggatgaggcc agtgatcatg tggtattcgg cggagggacc gccccctcgg tcactctgtt cccgccgtcc ggtgggtccg gtggcggcgg atcaggtggg gggggatcag acaaaactca cacatgccca ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg ttggactccg acggctcctt cttcctctac cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa

<210> 71 <211〉 1457 〈212〉 PRT 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1179

s -52- 201217527 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：B結構域缺失的FVIII氨基酸序列 <400〉 71

Met Gin lie Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn lie 65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr He Gin 85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val He Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu -53- 201217527 145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu lie 180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205

Gin Thr Leu His Lys Phe He Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp 225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu He Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270

Tyr Trp His Val He Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser He 275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser 290 295 300

Leu Glu lie Ser Pro lie Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met 305 310 315 320

Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His lie Ser Ser His Gin His

S •54- 201217527 325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350

Gin Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380

Pro Ser Phe lie Gin lie Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400

Trp Val His Tyr lie Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn 420 425 430

Asn Gly Pro Gin Arg lie Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala He Gin His Glu 450 455 460

Ser Gly lie Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480

Leu lie He Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn lie Tyr Pro 485 490 495

His Gly lie Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys -55- 201217527 500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro lie Leu Pro Gly Glu lie Phe 515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu lie Cys Tyr Lys Glu 565 570 575

Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin lie Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590

He Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605

Asn He Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp 610 615 620

Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn lie Met His Ser lie Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655

Tyr He Leu Ser lie Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr -56- 201217527 675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700

Gly Leu Trp lie Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp He Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750

Asn Asn Ala He Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Pro Pro Val Leu 755 760 765

Lys Arg His Gin Arg Glu lie Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin 770 775 780

Glu Glu He Asp Tyr Asp Asp Thr He Ser Val Glu Met Lys Lys Glu 785 790 795 800

Asp Phe Asp He Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe 805 810 815

Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe lie Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp 820 825 830

Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gin 835 840 845

Ser Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Gin Glu Phe Thr -57- 201217527 850 855 860

Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His 865 870 875 880

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr lie Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn He 885 890 895

Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser 900 905 910

Ser Leu lie Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg 915 920 925

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val 930 935 940

Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp 945 950 955 960

Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu 965 970 975

He Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His 980 985 990

Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr He Phe 995 1000 1005

Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn 1010 1015 1020

Cys Arg Ala Pro Cys Asn He Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys

S 58· 201217527 1025 1030 1035

Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala He Asn Gly Tyr He Met Asp Thr 1040 1045 1050

Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gin Asp Gin Arg lie Arg Trp Tyr 1055 1060 1065

Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn He His Ser lie His Phe 1070 1075 1080

Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1085 1090 1095

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Leu Pro Ser Lys Ala Gly lie Trp Arg Val Glu Cys Leu He Gly 1115 1120 1125

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Met He lie His Gly He Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe 1205 1210 1215

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Ala lie Ser Asp Ala Gin lie Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320

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Phe Phe Gin Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp 1400 1405 1410

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425

Arg Tyr Leu Arg He His Pro Gin Ser Trp Val His Gin lie Ala 1430 1435 1440

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S -64- 201217527

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S -66 - 201217527

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Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu lie His Asp Arg 1055 1060 1065

Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met 1070 1075 1080 67- 201217527

Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gin Gin 1085 1090 1095

Lys Lys Glu Gly Pro lie Pro Pro Asp Ala Gin Asn Pro Asp Met 1100 1105 1110

Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp lie 1115 1120 1125

Gin Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gin Gly Pro 1130 1135 1140

Ser Pro Lys Gin Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu 1145 1150 1155

Gly Gin Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys 1160 1165 1170

Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro 1175 1180 1185

Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu 1190 1195 1200

Asn Asn Thr His Asn Gin Glu Lys Lys lie Gin Glu Glu He Glu 1205 1210 1215

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S -68- 201217527

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Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gin Gly Thr 1535 1540 1545

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S -70- 201217527

Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gin 1580 1585 1590 lie Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu Lys Ser Pro Glu Lys 1595 1600 1605

Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr He Leu Ser Leu Asn Ala Cys 1610 1615 1620

Glu Ser Asn His Ala He Ala Ala lie Asn Glu Gly Gin Asn Lys 1625 1630 1635

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Leu Cys Ser Gin Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gin Arg Glu 1655 1660 1665 lie Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu He Asp Tyr 1670 1675 1680

Asp Asp Thr lie Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp He 1685 1690 1695

Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys 1700 1705 1710

Thr Arg His Tyr Phe He Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr 1715 1720 1725

Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser 1730 1735 1740 201217527

Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Gin Glu Phe Thr 1745 1750 1755

Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu 1760 1765 1770

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S -72- 201217527

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Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly 2000 2005 2010 lie Trp Arg Val Glu Cys Leu He Gly Glu His Leu His Ala Gly 2015 2020 2025

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Trp lie Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met lie lie His Gly lie 2090 2095 2100

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Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gin Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala

S -76- 201217527 180 185 190

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Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gin Phe Pro Trp 225 230 235 240

Gin Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser lie 245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270

Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn He Glu Glu Thr Glu 275 280 285

His Thr Glu Gin Lys Arg Asn Val lie Arg He He Pro His His Asn 290 295 300

Tyr Asn Ala Ala He Asn Lys Tyr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro He Cys lie 325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val -77- 201217527 355 360 365

Leu Gin Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly He He Ser Trp Gly 420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly lie Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460 <210> 74 <211〉 1384 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉合成構建體：FIX DNA序列 <400〉 74 atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa attggaagag tttgttcaag ggaatctaga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca cgagaagttt ttgaaaacac -78- 300 300

201217527 tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgagact gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgggttg ttggtggaga agatgccaaa ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt aaggaaaaaa caaagctcac ttga

<210〉 75 〈211〉 488 <212〉 PRT 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 79- 1384 201217527 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：FX氣基酸序列 <400> 75

Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe lie Arg Arg Glu Gin Ala Asn 20 25 30

Asn lie Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45

Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60

Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80

Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gin Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gin 85 90 95

Asn Gin Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110

Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125

Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gin Phe Cys His Glu Glu Gin 130 135 140

Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn -80- 201217527 145 150 155 160

Gly Lys Ala Cys lie Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gin Thr 165 170 175

Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gin Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190

Glu Ala Pro Asp Ser lie Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205

Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gin Thr Gin 210 215 220

Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg He Val Gly Gly Gin Glu 225 230 235 240

Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu Leu lie Asn Glu Glu 245 250 255

Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr lie Leu Ser Glu Phe Tyr lie Leu 260 265 270

Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gin Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285

Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gin Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300

Val Glu Val Val lie Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320

Phe Asp He Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro He Thr Phe Arg Met 81 - 201217527 325 330 335

Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350

Leu Met Thr Gin Lys Thr Gly lie Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365

Glu Lys Gly Arg Gin Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380

Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe lie lie Thr Gin 385 390 395 400

Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gin Glu Asp Ala Cys Gin 405 410 415

Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430

Val Thr Gly He Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445

Tyr Gly lie Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp He Asp Arg 450 455 460

Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480

Val lie Thr Ser Ser Pro Leu Lys 485 <210〉 76

S -82-

201217527 <211〉 1467 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉〈223>合成構建體：FX DNA序列 <400> 76 atggggcgcc cactgcacct cgtcctgctc agtgcctccc tggctggcct cctgctgctc ggggaaagtc tgttcatccg cagggagcag gccaacaaca tcctggcgag ggtcacgagg gccaattcct ttcttgaaga gatgaagaaa ggacacctcg aaagagagtg catggaagag acctgctcat acgaagaggc ccgcgaggtc tttgaggaca gcgacaagac gaatgaattc tggaataaat acaaagatgg cgaccagtgt gagaccagtc cttgccagaa ccagggcaaa tgtaaagacg gcctcgggga atacacctgc acctgtttag aaggattcga aggcaaaaac tgtgaattat tcacacggaa gctctgcagc ctggacaacg gggactgtga ccagttctgc cacgaggaac agaactctgt ggtgtgctcc tgcgcccgcg ggtacaccct ggctgacaac ggcaaggcct gcattcccac agggccctac ccctgtggga aacagaccct ggaacgcagg aagaggtcag tggcccaggc caccagcagc agcggggagg cccctgacag catcacatgg aagccatatg atgcagccga cctggacccc accgagaacc ccttcgacct gcttgacttc aaccagacgc agcctgagag gggcgacaac aacctcacca ggatcgtggg aggccaggaa tgcaaggacg gggagtgtcc ctggcaggcc ctgctcatca atgaggaaaa cgagggtttc tgtggtggaa ccattctgag cgagttctac atcctaacgg cagcccactg tctctaccaa gccaagagat tcaaggtgag ggtaggggac cggaacacgg agcaggagga gggcggtgag gcggtgcacg aggtggaggt ggtcatcaag cacaaccggt tcacaaagga gacctatgac ttcgacatcg ccgtgctccg gctcaagacc cccatcacct tccgcatgaa cgtggcgcct gcctgcctcc ccgagcgtga ctgggccgag tccacgctga tgacgcagaa gacggggatt 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 -83- 1080 201217527 gtgagcggct tcgggcgcac ccacgagaag ggccggcagt ccaccaggct caagatgctg 1140 gaggtgccct acgtggaccg caacagctgc aagctgtcca gcagcttcat catcacccag 1200 aacatgttct gtgccggcta cgacaccaag caggaggatg cctgccaggg ggacagcggg 1260 ggcccgcacg tcacccgctt caaggacacc tacttcgtga caggcatcgt cagctgggga 1320 gagggctgtg cccgtaaggg gaagtacggg atctacacca aggtcaccgc cttcctcaag 1380 tggatcgaca ggtccatgaa aaccaggggc ttgcccaagg ccaagagcca tgccccggag 1440 gtcataacgt cctctccatt aaagtga 1467

<210〉 77 <400〉 000 77 <210〉 78 <400〉 000 78 〈210〉 79 <400〉 000 79 <210> 80 <400〉 000 80 <210〉 81 <400〉 000 81 <210〉 <211〉 <212〉〈213〉 82 7 PRT 人工序列

S -84 - 201217527 <220> 〈223〉合成肽 <400> 82

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 1 5 <210〉 83 <211〉 7 〈212〉 PRT <213〉人工序列

<220〉 <223〉合成肽 <400> 83

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 1 5 <210〉 84 <211〉 3140 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：pSYN-FIX-053的DNA序列 <400〉 84 60 120 180 240 300 360 atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta ggatatctac tcagtgctga atgtacaggt ttgtttcctt ttttaaaata cattgagtat gcttgccttt tagatataga aatatctgat gctgtcttct tcactaaatt ttgattacat gatttgacag caatattgaa gagtctaaca gccagcacgc aggttggtaa gtactgtggg aacatcacag attttggctc catgccctaa agagaaattg gctttcagat tatttggatt aaaaacaaag actttcttaa gagatgtaaa attttcatga tgttttcttt tttgctaaaa •85- 201217527 ctaaagaatt attcttttac atttcagttt ttcttgatca tgaaaacgcc aacaaaattc 420 tgaatcggcc aaagaggtat aattcaggta aattggaaga gtttgttcaa gggaatctag 480 agagagaatg tatggaagaa aagtgtagtt ttgaagaagc acgagaagtt tttgaaaaca 540 ctgaaagaac aactgaattt tggaagcagt atgttgatgg agatcagtgt gagtccaatc 600 catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt tggtgtccct 660 ttggatttga aggaaagaac tgtgaattag atgtaacatg taacattaag aatggcagat 720 gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctgt actgagggat 780 atcgacttgc agaaaaccag aagtcctgtg aaccagcagt gccatttcca tgtggaagag 840 tttctgtttc acaaacttct aagctcaccc gtgctgagac tgtttttcct gatgtggact 900 atgtaaattc tactgaagct gaaaccattt tggataacat cactcaaagc acccaatcat 960 ttaatgactt cactcgggtt gttggtggag aagatgccaa accaggtcaa ttcccttggc 1020 aggttgtttt gaatggtaaa gttgatgcat tctgtggagg ctctatcgtt aatgaaaaat 1080 ggattgtaac tgctgcccac tgtgttgaaa ctggtgttaa aattacagtt gtcgcaggtg 1140 aacataatat tgaggagaca gaacatacag agcaaaagcg aaatgtgatt cgaattattc 1200 ctcaccacaa ctacaatgca gctattaata agtacaacca tgacattgcc cttctggaac 1260 tggacgaacc cttagtgcta aacagctacg ttacacctat ttgcattgct gacaaggaat 1320 acacgaacat cttcctcaaa tttggatctg gctatgtaag tggctgggga agagtcttcc 1380 acaaagggag atcagcttta gttcttcagt accttagagt tccacttgtt gaccgagcca 1440 catgtcttcg atctacaaag ttcaccatct ataacaacat gttctgtgct ggcttccatg 1500 aaggaggtag agattcatgt caaggagata gtgggggacc ccatgttact gaagtggaag 1560 ggaccagttt cttaactgga attattagct ggggtgaaga gtgtgcaatg aaaggcaaat 1620 atggaatata taccaaggtg tcccggtatg tcaactggat taaggaaaaa acaaagctca 1680

S -86-

201217527 ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagctccgga actcctggga ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtcga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaacggcgcc gccggagcgg tggcggcgga tcaggtgggg gtggatcagg cggtggaggt tccggtggcg ggggatccag gaagaggagg aagagggaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac cggaactcct gggcggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 87- 201217527 gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 3060 tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 3120 ccctgtctcc gggtaaatga 3140 〈210〉 85 <211〉 946 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉

<223〉合成構建體：FIX-053氣基酸序列 <400> 85

Met Gin Arg Val Asn Met lie Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu lie Thr 15 10 15 lie Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys He Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gin Tyr Val Asp Gly Asp Gin 85 90 95

Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp lie 100 105 110

S -88- 201217527

Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asa He Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gin Phe 130 135 140

Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gin Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gin Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190

Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205

Thr lie Leu Asp Asn He Thr Gin Ser Thr Gin Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220

Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gin Phe Pro Trp 225 230 235 240

Gin Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser He 245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270

Val Lys lie Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn lie Glu Glu Thr Glu 275 280 285 -89- 201217527

His Thr Glu Gin Lys Arg Asn Val lie Arg lie He Pro His His Asn 290 295 300

Tyr Asn Ala Ala He Asn Lys Tyr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro lie Cys lie 325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365

Leu Gin Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly lie lie Ser Trp Gly 420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly He Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp He Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Asp Lys Thr 450 455 460

S -90- 201217527

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 465 470 475 480

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 485 490 495

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 500 505 510

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 515 520 525

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 530 535 540

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 545 550 555 560

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 595 600 605

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 610 615 620

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 625 630 635 640 -91 - 201217527

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 645 650 655

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 660 665 670

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 675 680 685

Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 690 695 700

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Asp 705 710 715 720

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 725 730 735

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 740 745 750

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 755 760 765

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 770 775 780

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 785 790 795 800

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 805 810 815

S -92- 201217527

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 820 825 830

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 835 840 845

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 850 855 860

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 865 870 875 880

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 885 890 895

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 900 905 910

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 915 920 925

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 930 . 935 940

Gly Lys 945 <210〉 86 <211〉 2880 <212〉 DNA 〈213>人工序列 -93- <220> 201217527 <223〉合成構建體：pSYN-FVII-064的DNA序列 <400> 86 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600 gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660 atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag 1260

S -94- 1320 1320

201217527 tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga gccccatttc ccggtggcgg tggctccggc ggaggtgggt ccggtggcgg cggatcaggt gggggtggat caggcggtgg aggttccggt ggcgggggat ccgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagctccgga actcctggga ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctctacat cacccgggag cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtcga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaacggcgcc gccggagcgg tggcggcgga tcaggtgggg gtggatcagg cggtggaggt tccggtggcg ggggatccag gaagaggagg aagagggaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac cggaactcct gggcggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctct acatcacccg ggagcctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 •95- 201217527 tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 2640 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 2700 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 2760 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 2820 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 2880

<210〉 87 <211〉 959 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：FVII-064氨基酸序列 <400〉 87

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60

Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie 65 70 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly 85 90 95

S 96- 201217527

Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 HO

Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie 115 120 125

Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140

Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He 165 170 175

Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val 180 185 190

Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu 195 200 205

Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He 210 215 220

Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg 225 230 235 240

Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly 245 250 255

Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr 260 265 270 -97- 201217527

Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin 275 280 285

Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300

Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320

Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335

Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser 340 345 350

Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365

Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380

Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val 385 390 395 400

Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415

Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu 420 425 430

Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Gly Gly Gly 435 440 445

S -98- 201217527

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 465 470 475 480

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 485 490 495

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr lie Thr Arg Glu Pro Glu 500 505 510

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 515 520 525

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 530 535 540

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Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 565 570 575

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys 580 585 590

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 595 600 605

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Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 705 710 715 720

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Asp Lys Thr His 725 730 735

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Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 850 855 860

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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 885 890 895

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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 915 920 925

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 930 935 940

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S -102- 1200 1200

201217527 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 -103- 201217527 cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520 catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580 caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640 ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700 agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760 cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820 ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880 gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940 ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000 tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060 gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120 tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180 caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240 attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300 tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360 tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420 gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480 cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540 tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600 ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660 ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720 cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780

S -104-

201217527 aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctgggag gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgcgatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtcgac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aacggcgccg ccggagcggt ggcggcggat caggtggggg tggatcaggc 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 -105- 201217527 ggtggaggtt ccggtggcgg gggatccggc ggtggaggtt ccggtggggg tggatcaagg 5160 aagaggagga agagggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagctcc agaactcctg 5220 ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 5280 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 5340 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 5400 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 5460 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 5520 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 5580 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 5640 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 5700 cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 5760 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 5820 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 5859 <210〉 89 <211〉 1952 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成構建體：FV111-049氨基酸序列 <400〉 89

Met Gin lie Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 15 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30

s -106- 201217527

Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45

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Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn He 65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr He Gin 85 90 95

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Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140

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Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu lie 180 185 190

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Gin Thr Leu His Lys Phe lie Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220

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S -108- 201217527

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Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn 420 425 430

Asn Gly Pro Gin Arg lie Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala lie Gin His Glu 450 455 460

Ser Gly lie Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480

Leu lie lie Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn lie Tyr Pro 485 490 495

His Gly lie Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro He Leu Pro Gly Glu lie Phe 515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 -109- 201217527

Asp Leu Ala Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu He Cys Tyr Lys Glu 565 570 575

Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin lie Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590

He Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605

Asn He Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp 610 615 620

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Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655

Tyr lie Leu Ser He Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700

Gly Leu Trp lie Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 -110- 201217527

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp lie Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750

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Lys Arg His Gin Arg Glu lie Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin 770 775 780

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Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr lie Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn lie 885 890 895

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Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu 965 970 975

He Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His 980 985 990

Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr lie Phe 995 1000 1005

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Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn lie His Ser He His Phe 1070 1075 1080

S -112- 201217527

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Met lie lie His Gly He Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe 1205 1210 1215

Ser Ser Leu Tyr lie Ser Gin Phe He lie Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230

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Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly lie Lys His Asn 1250 1255 1260 lie Phe Asn Pro Pro He lie Ala Arg Tyr lie Arg Leu His Pro 1265 1270 1275

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Ala lie Ser Asp Ala Gin He Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320

Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin 1325 1330 1335

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Phe Phe Gin Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp 1400 1405 1410

S -114- 201217527

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425

Arg Tyr Leu Arg lie His Pro Gin Ser Trp Val His Gin lie Ala 1430 1435 1440

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr Asp 1445 1450 1455

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1460 1465 1470

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 1475 1480 1485

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 1490 1495 1500

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 1505 1510 1515

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 1520 1525 1530

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 1535 1540 1545

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 1550 1555 1560

Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 1565 1570 1575 115· 201217527

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1580 1585 1590

Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 1595 1600 1605

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 1610 1615 1620

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 1625 1630 1635

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 1640 1645 1650

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 1655 1660 1665

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1670 1675 1680

Lys Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1685 1690 1695

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1700 1705 1710

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Asp Lys Thr 1715 1720 1725

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1730 1735 1740

S -116- 201217527

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 1745 1750 1755

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 1760 1765 1770

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 1775 1780 1785

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 1790 1795 1800

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 1805 1810 1815

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 1820 1825 1830

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 1835 1840 1845

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 1850 1855 1860

Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 1865 1870 1875

Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 1880 1885 1890

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 1895 1900 1905 -117· 201217527

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 1910 1915 1920

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 1925 1930 1935

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1940 1945 1950 <210〉 90 <211〉 2064 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉合成構建體：IFN-b-018的DNA序列 <400〉 90 atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60 tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 120 ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac 180 atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 240 tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg 300 aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 360 acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gatttcacca ggggaaaact catgagcagt 420 ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 480 cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 540 cttacaggtt acctccgaaa cggtggcggc ggctccggtg gaggcgggtc cggcggtgga 600 gggagcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagctc cggaactcct gggaggaccg 660

-118- 720 720

201217527 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tcgacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaacgg cgccgccgga gcggtggcgg cggatcaggt gggggtggat caggcggtgg aggttccggt ggcgggggat ccaggaagag gaggaagagg gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcaccggaac tcctgggcgg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 -119- 201217527 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 2040 ctctccctgt ctccgggtaa atga 2064 <210> 91 〈211〉 687 〈212〉 PRT 〈213>人工序列 <220〉

〈223〉合成構建體：IFN-b-018氨基辦列 <400> 91

Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gin He Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 15 10 15

Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg 20 25 30

Ser Ser Asn Phe Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg 35 40 45

Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp lie Pro Glu Glu 50 55 60 lie Lys Gin Leu Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr lie 65 70 75 80

Tyr Glu Met Leu Gin Asn lie Phe Ala lie Phe Arg Gin Asp Ser Ser 85 90 95

Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr lie Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110

S -120- 201217527

Tyr His Gin lie Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125

Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140

Arg Tyr Tyr Gly Arg lie Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160

His Cys Ala Trp Thr lie Val Arg Val Glu lie Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175

Phe lie Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser 180 185 190

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 195 200 205

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 210 215 220

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu 225 230 235 240

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 245 250 255

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 260 265 270

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 275 280 285 -121 - 201217527

Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 290 295 300

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 305 310 315 320

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 325 330 335

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 340 345 350

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 355 360 365

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 370 375 380

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 385 390 395 400

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 405 410 415

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Arg Arg 420 425 430

Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 435 440 445

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Asp Lys Thr His 450 455 460

S -122- 201217527

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 465 470 475 480

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 485 490 495

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 500 505 510

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 515 520 525

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 530 535 540

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 545 550 555 560

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie 565 570 575

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 580 585 590

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 595 600 605

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 610 615 620

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 625 630 635 640 123- 201217527

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 645 650 655

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 660 665 670

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 675 680 685

S -124-

Claims

201217527 七、申請專利範圍： 1· 一種多肽，包含（i)至少一個生物學活性部分；（ii) 包含至少兩個Fc部分的Fc區；以及（iii)插在所述之兩個Fc 部分之間的可切割的scFc(cscFc)連接體，其中所述之 cscFc連接體與導致該CSCFc連接體被切割的至少一個酶切位點連接。

2. 請求項1所述之多肽，其中所述之至少一個生物學活性部分包含凝血因數。 3. 請求項2所述之多肽，其中所述之凝血因數選自： FVII、FVIIa、FVni、FIX、FIXa、FX和 FXa。 4.請求項1所述之多肽，包含部分A-F1-P1-L-P2-B-F2’其中A可任選地存在，並且如果A存在，則其爲生物學活性部分；F1爲Fc部分或結構域；P1可任選地存在，並且如果P1存在，則其爲酶切位點；L爲多肽連接體；P2可任選地存在，並且如果P2存在，則其爲酶切位點；b可任 φ 選地存在，並且如果B存在，則其爲生物學活性部分；以及F2爲Fc部分。 5_請求項4所述之多肽，其中A存在並且選自：抗體的抗原結合部分；非免疫球蛋白結合分子；配體的結合部分；和受體的結合部分；以及凝血因數。 6.請求項4所述之多肽，其中A包含凝血因數的輕鏈 :並且B包含凝血因數的重鏈，當A與B結合時形成活性分子。 7·請求項4所述之多肽，其中B存在並且選自：抗體 201217527 的抗原結合部分；非免疫球蛋白結合分子；配體的結合部分；受體的結合部分；以及凝血因數。 8.請求項4所述之多肽，其中F1和F2均包含cH2和 CH3結構域。 9·請求項4所述之多肽，其由氨基末端至羧基末端包含線性序列的部分 A-F1-B-P1-L-P2-F2或 A-F1-P1-L-P2 B-F2 〇

1〇·請求項4所述之多肽，其具有選自由氨基末端至羧基末端的線性序列 A-F1-P1- L-P2-F2; Fl-Pl- L-P2-B-F2; A-F1-P1- L- F2; Fl-Pl- L- B-F2; A-Fl- L-P2-F2; FI- L-P2-B-F2，以及 A-F1-P1-L-P2-B-F2中的式。 11.請求項丨所述之多肽，其包含一個生物學活性部分。 12·請求項3所述之多肽，其中A和B均存在，並且爲不同的生物學活性部分。

13. 請求項4所述之多肽，其中^和！*〗均存在，並且被相同或不同的酶所識別。 14. 請求項13所述之多肽，其中Ρ1*Ρ2中的至少一者包含氨基酸序列Arg-Arg-Arg-Arg。 15. 請求項13所述之多肽，其中P1或P2中的至少一者包含氨基酸序列 Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg。 16. 請求項13所述之多肽，其中P1*p2中的至少一者包含氣基酸序列Arg_Arg-Arg-Arg-Ser。 17. 請求項4所述之多肽，其中P1和P2均存在，並且 -2- S 201217527 P1包含序列 Arg-Arg-Arg-Arg和 P2包含序列 Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg。 18. 請求項4所述之多肽，其中P1或P2包含氨基酸序列，該序列選自：TQSFNDFTR 和 SVSQTSKLTR， DFLAEGGGVR，TTKIKPR，LVPRG，以及 ALRPR。 19. 請求項1所述之多肽，其中所述之cscFc連接體的長度爲大約1至大約50個氨基酸。

20. 請求項19所述之多肽，其中所述之cscFc連接體的長度爲大約20至大約30個氨基酸。 2 1.請求項1所述之多肽，其中所述之cscFc連接體包含 gly/ser肽。 22. 請求項21所述之多肽，其中所述之gly/ser肽爲式 (Gly4Ser)n 或 S(Gly4 Ser)n，其中 η 爲選自 1、2、3、4、5、 6、7、8、9和1〇中的正整數。 23. 請求項22所述之多肽，其中所述之S(Gly4 Ser)n φ 連接體爲 S(Gly4 Ser)6或 S(Gly4 Ser)4。 24. —種包含兩條多肽鏈的多肽，其中所述之第一多肽鏈包含與第一Fc部分連接的凝血因數的輕鏈，並且所述之第二多肽鏈包含與第二Fc部分連接的凝血因數的重鏈，其中所述之重鏈與所述之輕鏈結合，從而形成酶活性的凝血因數。 25.請求項24所述之多肽，其中所述之凝血因數的輕鏈與所述之第一 Fc部分連接，並且所述之凝血因數的重鏈與所述之第二Fc部分連接，以及其中所述之凝血因數在被 -3- 201217527 細胞所分泌時是具有酶活性的。 26. 請求項24所述之多肽，其中所述之凝血因數選自 :FVII、FVIIa、FIX、FIXa、FX和 FXa。 27. 請求項1或24所述之多肽，其包含靶向部分。 28. 請求項27所述之多肽，其中所述之靶向部分與靜息血小板結合。 29. 請求項27所述之多肽，其中所述之靶向部分選擇性地與活化血小板結合。 30. 請求項28所述之多肽，其中所述之靶向部分選擇性地與靶結合，所述之靶選自：GPIba、GPVI以及非活性形式的 GPIIb/IIIa。 31. 請求項29所述之多肽，其中所述之靶向部分選擇性地與靶結合，所述之靶選自：活性形式的GPIIb/IIIa、P 選擇蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L 以及 LOX-1 · 32. 請求項27所述之多肽，其中所述之耙向部分與 GPIb絡合物結合。 33. 請求項27所述之多肽’其包含靶向部分’其中所述之靶向部分爲選自PS4、OS1和OS2中的肽。 34. 請求項27所述之多肽’其中所述之靶向部分包含得自抗體的抗體可變區’所述抗體選自：SCE5、MB9和 AP3。 35. 請求項24所述之多肽’其中A gFVI1的輕鏈’而B 爲FVII的重鏈。 201217527 36. —種包含請求項1或24所述之多肽的組合物。 37. 請求項36所述之組合物，其中所述組合物包含細胞培養上清液》 3 8. —種編碼請求項1或24所述之多肽的核酸分子。 39.請求項38所述之核酸分子，其中所述之核酸分子存在於載體中。

40. 請求項39所述之核酸分子，其中所述之載體進一步包含編碼酶的核苷酸序列，所述之酶切割至少一個細胞內加工位點。 41. 一種包含至少兩條氨基酸鏈的經加工的多肽，其中所述多肽被請求項38所述之核酸分子所編碼。 42. —種包含請求項39所述之載體的宿主細胞，其中所述之宿主細胞表達切割所述多狀連接體的酶。 43. 請求項42所述之宿主細胞，其中所述之酶對於所述細胞而言是內源的。 44. 請求項42所述之宿主細胞，其中所述之酶對於所述細胞而言是外源的。 45. —種用於製備多肽的方法，其包括將請求項43或 44所述之宿主細胞在培養狀態下培養，使得製備包含兩條氨基酸鏈的成熟多肽。 46. —種包含兩條多肽鏈的經加工的異源二聚體多月太，其中所述之經加工的異源二聚體多肽是通過使.請求項45 所述之載體在培養於細胞培養基中的細胞中表達、並由該培養基中分離出成熟的異源二聚體多肽而製備得到的。 -5- 201217527 47. —種包含請求項46所述之經加工的多肽以及可藥用的載體的組合物。 48. —種包含請求項38所述之核酸分子以及可藥用的載體的組合物。 49· 一種用於治療或預防受試者的疾病或紊亂的方法 ’包括給藥請求項4 7或4 8所述之組合物。

5 0.請求項49所述之方法，其中所述之疾病或紊亂選自：凝血紊亂、神經病學紊亂、炎症紊亂、自身免疫紊亂以及贅生物紊亂。 51. 請求項49所述之方法，其中所述之疾病或紊亂爲影響止血的紊亂。 52. ί靑求項52所述之方法，其中所述之組合物促進血塊的形成。

S -6-