KR20180032551A - 이뮤노글로불린 융합 단백질 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
융합 단백질이 개시된다. 본 발명의 융합 단백질은 이뮤노글로불린 G의 Fc 단편 및 생물활성 분자를 포함하고, 여기서 Fc는 단일 쇄 Fc이다. Fc의 힌지 내의 아미노산은 돌연변이, 치환 또는 결실되어, Fc의 힌지는 디술피드 결합을 형성할 수 없다. 본 발명의 융합 단백질의 생산 및 사용 방법이 또한 제공된다.
Description
본원은 2015년 6월 12일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/175,186의 이익을 주장하는, 2016년 1월 20일 출원된 미국 특허 출원 번호 15/002,396의 계속 출원인, 2016년 6월 9일 출원된 미국 특허 출원 번호 15/177,605의 이익 및 우선권을 주장하는 국제 PCT 출원이고, 상기 출원은 모두 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 이뮤노글로불린 G의 Fc 단편 및 생물활성 분자를 포함하는 치료용 융합 단백질에 관한 것으로, 상기 Fc 단편은 단일 쇄이다.
이뮤노글로불린은 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉 쇄간 디술피드 결합을 통해 회합된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인, 즉 가변 경쇄 도메인 (VL) 및 불변 경쇄 도메인 (CL)을 갖고, 각각의 중쇄는 2개의 영역, 즉 가변 중쇄 영역 (VH) 및 불변 중쇄 영역 (CH)을 갖는다. 불변 중쇄 영역 (CH)은 숫자에 의해 지정된 불변 중쇄 영역 (예를 들어, CH1, CH2, CH3 등)으로 이루어진다 (예를 들어, US 6,086,875 (블룸버그 알. 에스.(Blumberg R. S.) 등), US 5,624,821 (윈터 (Winter G. P.) 등) 및 US 5,116,964 (카폰 디. 제이.(Capon D. J.) 및 라스키 엘. 에이.(Lasky L. A.)) 참조). 이뮤노글로불린은 그의 생물학적 특성, 유기체 내의 위치 및 상이한 항원을 처리하는 능력에 기초하여 상이한 이소형 (즉, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE)으로 분류된다. 이뮤노글로불린 이소형에 따라, 불변 중쇄 영역 (CH)은 3개 또는 4개의 CH 도메인을 가질 수 있다. 또한, 일부 이소형 (IgA, IgD 및 IgG)에서, 중쇄는 분자에 유연성을 부가하는 힌지 영역을 포함한다 (Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.).
인간에는 4개의 IgG 하위클래스 (IgG1, 2, 3, 4)가 있고, 이들은 혈청에 풍부한 순서에 따라 명명된다 (IgG1이 가장 풍부하다). IgG 이소형은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어지고, 각각의 중쇄는 3개의 불변 중쇄 도메인 (CH1, CH2, CH3)을 포함한다. IgG의 2개의 중쇄는 서로에 대해 및 경쇄에 각각 디술피드 결합 (-S-S-)에 의해 연결되어 있다. IgG의 항원 결합 부위는 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 도메인뿐만 아니라 불변 경쇄 (CL) 및 불변 중쇄 (CH1) 도메인을 포함하는 단편 항원 결합 영역 (Fab 영역)에 위치한다. IgG의 단편 결정화가능 영역 (Fc 영역)은 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 포함하는 특정 세포의 표면에서 발견되는 Fc 수용체에 결합하는 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 중쇄의 일부이다. IgG의 중쇄는 또한 Fab 영역을 Fc 영역으로부터 분리하고 2개의 중쇄를 디술피드 결합을 통해 함께 연결할 때 참여하는, CH1과 CH2 사이의 힌지 영역 (힌지)을 갖는다. 힌지 영역의 구조는 4개의 IgG 하위클래스 각각의 특유한 생물학적 특성에 기여한다.
IgG는 쉽게 조직을 관류할 수 있도록 허용하는 크기가 작은 단량체로 분비된다. 이것은 자궁 내의 태아를 보호하기 위해 인간 태반을 통과하는 것을 촉진하는 수용체 (신생아 Fc 수용체 (FcRn))를 갖는 유일한 이소형이다. 태반을 통해 흡수된 IgG는 그 자체 면역계가 발달하기 전에 체액성 면역을 신생아에게 제공한다.
IgG 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 결합 부위는 항체의 Fc 영역에 위치한다. FcRn은 일반적으로 인간의 태반 및 상피 세포에서 발현되고, IgG의 분해를 막는 세포내이입 샐비지 경로에 참여한다. 이 샐비지 경로는 산성 pH에서 FcRn에 대한 IgG의 높은 pH 의존성 결합 친화도에 의해 매개된다. 산성 pH에서 FcRn에 대한 IgG의 높은 친화도는 산성 엔도솜 내로의 흡수 후에 내재화된 IgG의 FcRn에 대한 결합을 유발하는 것으로 생각된다 ([Goebl NA, et al., 2008]; [Junghans RP, et al., 1996]). 대부분의 가용성 단백질은 내재화 후에 리소솜으로 향하지만, 내재화된 FcRn-결합 IgG는 형질 막으로 되돌아가고, 기본 분해 경로로부터 효과적으로 구출된다. 세포외 공간의 중성 pH에 노출시, IgG는 FcRn으로부터 해리되어 순환계로 되돌아갈 수 있다. 따라서, 항체의 연장된 혈청 반감기 특성은 Fc 단편에서 유지된다.
상기 샐비지 경로는 비변형된 단백질 약물에 비해 혈액 순환에서 반감기가 연장된 차세대 단백질 약물의 개발을 위한 하나의 메커니즘을 제공한다. 특히, 비변형된 단백질 약물은 순환 반감기가 짧고, 따라서 필요한 장기간의 치료 기간에 걸쳐 빈번한 투여가 필요하다. PEG화 융합 단백질 기술 (미국 식품의약국 (Food and Drug Administration), [Osborn BL, et al., 2002])을 포함한 많은 방법에 의해 단백질 약물의 반감기를 연장하기 위한 광범위한 노력이 이루어졌지만, 이러한 노력의 결과는 이상적이지 않았다.
관심 단백질 또는 그 단편에 연결된 IgG 불변 영역을 포함하는 융합 단백질의 생성이 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 관심 단백질 "X"는 IgG "Fc" 도메인에 연결되어 "Fc-X" 또는 "X-Fc"융합 단백질 (면역융합)을 생성한다. 면역융합 단백질은 일반적으로 융합 단백질의 Fc 모이어티가 세포에 의한 효율적인 분비를 위해 설계되기 때문에 다른 유형의 융합 단백질에 비해 더 많은 양으로 제조 및 정제될 수 있다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 함유하는 융합 단백질은 증가된 단백질 안정성 및 보다 긴 혈청 반감기 (문헌 [Capon et al., 1989, Nature 337:525] 참조), 및 Fc 수용체, 예컨대 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합하는 능력 (예를 들어, US 6,086,875 (블룸버그 알. 에스. 등); US 6,485,726 (블룸버그 알. 에스. 등); US 6,030,613; WO 03/077834 (블룸버그 알. 에스. 등); 및 US 2003-0235536A1 (블룸버그 알. 에스. 등) 참조)을 비롯하여 비-Fc 함유 대응물에 비해 향상된 특징을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다음 특허 문헌이 추가의 예를 기술한다.
US 5,116,964 (카폰 디. 제이. 및 라스키 엘. 에이.)는 림프구 세포 표면 당단백질 (LHR) 및 이뮤노글로불린 쇄를 포함하는 리간드 결합 파트너 단백질을 개시하고 있고, 여기서 리간드 결합 파트너 단백질 및 이뮤노글로불린은 N-말단 아미노 또는 C-말단 카르복실기를 통해 융합된다.
WO 94/04689 (파스탄 아이. 에이치.(Pastan I. H.) 등)에는 리간드 결합 도메인 (CD4 수용체) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A를 포함하는, 반감기가 연장된 독소를 제공하기 위한 이뮤노글로불린의 Fc의 용도가 개시되어 있다. IgG Fc는 CD4 수용체 및 슈도모나스 외독소 A를 연결한다.
US 6,797,493 (순 엘-에이치.(Sun L-H.) 등)은 인간 과립구 콜로니-자극 인자 (hG-CSF), 약 20개 이하의 아미노산의 가요성 펩티드 링커 (L) 및 인간 IgG Fc 변이체를 포함하는 hG-CSF-L-vFc 융합 단백질을 개시하고 있다. Fc 변이체는 비-용해성이고, 바람직하지 않은 Fc 매개 부작용을 최소로 보인다.
US 8,557,232 (길리스 에스. 디.(Gillies S. D.) 등)는 가용성, 생물학적 활성 Fc-IFN-β 융합 단백질 및 그의 변이체 (Fc-IFN-βsol)를 발현하기 위한 방법 및 조성물을 개시하고 있다. Fc-IFN-β 융합 단백질은 이뮤노글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된 IFN-β 단백질을 포함한다.
상기 문헌들은 2개의 생물활성 분자가 서로 근접하여 존재하는 2개 쇄 Fc 융합 단백질 디자인을 갖는 융합 단백질을 기재하고 있다. 이러한 전통적인 융합 단백질의 생물활성 분자는 일반적으로 표적 분자 또는 세포와 상호작용하는 것으로부터 억제되거나 입체적으로 방해받는다. 따라서, 생물활성 분자의 생물활성을 억제하지 않으면서 생물활성 분자의 증가된 생체 내 반감기를 부여할 수 있는, IgG의 변형된 Fc 영역에 연결된 생물활성 분자를 포함하는 융합 단백질을 개발할 필요가 있다. 이러한 변형된 융합 단백질은 관련 친화도 정제 공정에 의한 정제의 용이성에 추가의 이점을 제공할 것이다.
참고문헌:
본 개시내용은 이뮤노글로불린 (Ig) 분자의 일부를 포함하는 신규한 융합 단백질, 그의 조성물, 및 개시된 융합 단백질의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 개시된 융합 단백질은 유기체에서 생물활성 분자의 혈청 반감기를 연장하는데 유용하다.
본 개시내용의 한 측면은 융합 단백질, 하이브리드, 접합체 및 그의 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용의 융합 단백질은 일반적으로 (a) 생물활성 분자 및 (b) Ig 분자로부터 유래된 불변 중쇄 영역 (CH)의 부분 (Ig 단편)을 포함한다. Ig 단편은 하나 이상의 불변 중쇄 도메인, 힌지 영역, Fc 영역 및/또는 이들의 조합을 포함하는 불변 중쇄 영역의 임의의 부분을 포함할 수 있다. (a) 생물활성 분자 및 (b) 융합 단백질의 Ig 단편의 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 개시된 바와 같이 각각의 단편의 야생형 서열로부터 유래된다. 유래된 서열은 야생형 서열뿐만 아니라 야생형 서열의 상동체, 유사체, 단편 및 다른 변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질의 Ig 단편은 이량체를 형성할 수 없는 단량체인 단일 쇄 Fc (sFc 또는 scFc)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 이뮤노글로불린 힌지 영역에 상응하는 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 힌지 영역은 융합 단백질이 또 다른 융합 단백질 또는 또 다른 이뮤노글로불린 분자와 디술피드 결합을 형성하는 것을 방지하는 변형을 함유한다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 디술피드 결합을 형성하는 것을 방지하기 위해 하나 이상의 시스테인 아미노산을 돌연변이 및/또는 결실시킴으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 생물활성 분자는 힌지 영역을 통해 scFc에 연결된다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 돌연변이된 힌지 영역을 통해 scFc에 연결된 생물활성 분자를 그의 N-말단에 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 제약 조성물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 융합 단백질 및 그의 조성물을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 제조하는 방법은 (i) 생물활성 분자, Fc 단편 및 힌지 영역을 제공하는 단계, (ii) 힌지 영역이 디술피드 결합을 형성하지 못하도록 힌지 영역을 변형하는 단계, 및 (iii) 융합 단백질, 하이브리드, 접합체 또는 그의 조성물을 형성하기 위해 생물활성 분자를 돌연변이된 힌지 영역을 통해 Fc 단편에 연결하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 (i) 융합 단백질을 제공하는 단계 및 (ii) 융합 단백질을 단백질 A 또는 단백질 G-기반 크로마토그래피 매질에 의해 정제하는 단계를 포함하는, 융합 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조하여 이하의 실시양태에 제시된다.
도 1a 내지 1d는 본 개시내용의 다양한 실시양태에 따른 단일 쇄 융합 단백질의 디자인을 보여준다. 도 1a는 인간 IgG의 힌지 영역 및 Fc 단편 (CH2 및 CH3 도메인)에 공유 연결된 생물학적 활성 분자를 N-말단에 포함하는 융합 단백질을 보여준다. 도 1b는 링커를 통해 인간 IgG의 힌지 영역 및 Fc 단편 (CH2 및 CH3 도메인)에 공유 연결된 생물학적 활성 분자를 N-말단에 포함하는 융합 단백질을 보여준다. 도 1c는 인간 IgG의 힌지 영역 및 Fc 단편 (CH2 및 CH3 도메인)에 공유 연결된 생물학적 활성 분자를 C-말단에 포함하는 융합 단백질을 보여준다. 도 1d는 링커를 통해 인간 IgG의 힌지 영역 및 Fc 단편 (CH2 및 CH3 도메인)에 공유 연결된 생물학적 활성 분자를 C-말단에 포함하는 융합 단백질을 보여준다.
도 2는 pZD/EPO-sFc 플라스미드의 지도를 보여준다. pZD/EPO-sFc 플라스미드는 본 발명의 실시양태에 따른 EPO-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 3은 pZD/FIX-sFc 플라스미드의 지도를 보여준다. pZD/FIX-sFc 플라스미드는 본 발명의 실시양태에 따른 인자 IX-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 4는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 에리트로포이에틴 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (EPO-sFc)의 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인 M은 분자량 마커이다 (마커는 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 및 250 kDa 크기의 재조합 단백질을 포함한다). 레인 1은 세포 배양 배지 내의 EPO-sFc 융합 단백질이다. 레인 2는 단백질 A 수지 (맙셀렉트 SuRe(MabSelect SuRe)™ 하이트랩 칼럼)에 의해 정제된 EPO-sFc 융합 단백질의 용리액이다. 레인 3은 DEAE 칼럼에 의해 정제된 EPO-sFc 융합 단백질의 용리액이다. EPO-sFc (레인 1 내지 3)의 MW는 글리코실화 함량이 높은 50-70 KDa이다.
도 5는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 인자 IX 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (인자 IX-sFc)의 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인 M은 분자량 마커이다 (마커는 50, 75, 100 및 150 kDa 크기의 재조합 단백질을 포함한다). 레인 1은 원래의 재조합 인간 인자 IX (베네픽스(BeneFIX)®)이다. 레인 2는 단백질 A 수지 (맙셀렉트 SuRe™ 하이트랩 칼럼)에 의해 정제된 인자 IX-sFc 융합 단백질의 용리액이다. 인자 IX-sFc (레인 2)의 MW는 글리코실화 함량이 높은 100-110 KDa이다.
도 6은 래트에서의 에리트로포이에틴 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (EPO-sFc) (검정 원) 및 원래의 재조합 인간 EPO (에프렉스(EPREX)®) (빈 원)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. 16.8 μg/kg의 EPO-sFc의 단일 용량 S.C. 투여시에, EPO-sFc의 반감기는 약 22시간이고, 이것은 에프렉스®보다 3배 더 길다.
도 7은 래트에서의 인자 IX 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (FIX-sFc) (정사각형) 및 원래의 재조합 인간 인자 IX (베네픽스®) (삼각형)의 단일 용량 정맥내 (I.V.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. FIX-sFc의 반감기는 I.V. 투여시에 약 56시간이고, 이것은 베네픽스® (T1/2 = 11.91시간)보다 5배 더 길다.
도 8은 pZD/IFNα-sFc의 플라스미드 지도를 보여준다. pZD/IFNα-sFc 플라스미드는 본 발명의 실시양태에 따른 IFNα-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 9는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 인터페론 알파 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNα-sFc)의 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인 M은 분자량 마커이다 (마커는 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 및 250 kDa 크기의 재조합 단백질을 포함한다). 레인 1 및 2는 각각 0.2 내지 0.4 M의 수크로스를 함유하는 IFNα-sFc 융합 단백질의 용리액이다. 레인 3 및 4는 각각 1.0 내지 2.0 M 우레아를 함유하는 IFNα-sFc 융합 단백질의 용리액이다.
도 10은 래트에서의 페가시스(Pegasys)® (원형), 인터페론 알파 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNα-sFc) (직사각형), Peg-인트론(Intron)® (정삼각형) 및 로페론(Roferon)-A® (역삼각형)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. IFNα-sFc의 반감기는 약 50.2시간이고, 이것은 다른 인터페론 제품보다 더 길다.
도 11은 래트에서의 인터페론 알파 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNα-sFc) (원형), 페가시스® (정삼각형) 및 인터페론 알파 Fc 융합 단백질 (IFNα-Fc) (역삼각형)의 항-바이러스 활성을 보여주는 그래프이다. IFNα-sFc의 항-바이러스 활성 (IC50)은 약 0.0061 nM이고, 이것은 IFNα-Fc (IC50 = 0.0313 nM) 및 페가시스® (IC50 = 0.0894)보다 훨씬 더 우수하다.
도 12a 내지 도 12b는 IFNα-sFc와 인터페론-알파 수용체 1 (IFNAR1) (도 12a) 및 IFNα-Fc와 IFNAR1 (도 12b)의 회합 프로파일을 보여준다.
도 13은 pZD-GCSF-sFc의 플라스미드 지도를 보여준다. pZD/GCSF-sFc 플라스미드는 본 발명의 실시양태에 따른 IFNα8-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 14는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 GCSF 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (GCSF-sFc)의 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인 M은 분자량 마커이다 (마커는 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 및 250 kDa 크기의 재조합 단백질을 포함한다). 레인 1은 GCSF-sFc의 용리액이다.
도 15는 래트에서의 GCSF 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (GCSF-sFc) (원형), 레노그라스팀(Lenograstim) (그라노사이트(Granocyte)®) (삼각형), 및 Peg-필그라스팀(filgrastim) (뉴라스타(Neulasta)®) (직사각형)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. GCSF-sFc의 반감기는 약 17.16시간이고, 이것은 레노그라스팀 (4.1시간) 및 Peg-필그라스팀 (12.0시간)보다 더 길다.
도 16은 레노그라스팀의 단일 용량 (군 B1 및 군 B2) 또는 4회 용량 (군 B3) 피하 (S.C.) 투여 및 GCSF 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (GCSF-sFc)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여 (군 C1 및 C2)의 생물학적 활성을 보여주는 그래프이다. GCSF-sFc는 레노그라스팀보다 마우스에서 호중구 분화 및 증식을 향상시키는 활성이 더 높다.
도 17은 pZD-IFNβ-sFc의 플라스미드 지도이다. pZD-IFNβ-sFc 플라스미드는 본 발명의 한 실시양태에 따른 IFNβ-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 18은 래트에서의 인터페론 β 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNβ-sFc) (직사각형) 및 레비프(Rebif)® (마름모꼴)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. IFNβ-sFc의 반감기는 약 31.89-37.7시간이고, 이것은 레비프®의 반감기 (18.92-23.57시간)보다 더 길다.
도 19는 IFNβ-sFc 융합 단백질 및 레비프®에 의한 오스테오폰틴 (OPN) 억제를 보여주는 그래프이다. IFNβ-sFc 융합 단백질은 1.5 ng/mL 및 10 ng/mL 둘 다에서 각각 73.4±0.8% 및 79.5±3.6%의 유의한 억제 효과를 보였다. IFNβ-sFc의 생물학적 활성은 레비프®와 유사하였다.
도 2는 pZD/EPO-sFc 플라스미드의 지도를 보여준다. pZD/EPO-sFc 플라스미드는 본 발명의 실시양태에 따른 EPO-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 3은 pZD/FIX-sFc 플라스미드의 지도를 보여준다. pZD/FIX-sFc 플라스미드는 본 발명의 실시양태에 따른 인자 IX-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 4는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 에리트로포이에틴 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (EPO-sFc)의 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인 M은 분자량 마커이다 (마커는 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 및 250 kDa 크기의 재조합 단백질을 포함한다). 레인 1은 세포 배양 배지 내의 EPO-sFc 융합 단백질이다. 레인 2는 단백질 A 수지 (맙셀렉트 SuRe(MabSelect SuRe)™ 하이트랩 칼럼)에 의해 정제된 EPO-sFc 융합 단백질의 용리액이다. 레인 3은 DEAE 칼럼에 의해 정제된 EPO-sFc 융합 단백질의 용리액이다. EPO-sFc (레인 1 내지 3)의 MW는 글리코실화 함량이 높은 50-70 KDa이다.
도 5는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 인자 IX 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (인자 IX-sFc)의 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인 M은 분자량 마커이다 (마커는 50, 75, 100 및 150 kDa 크기의 재조합 단백질을 포함한다). 레인 1은 원래의 재조합 인간 인자 IX (베네픽스(BeneFIX)®)이다. 레인 2는 단백질 A 수지 (맙셀렉트 SuRe™ 하이트랩 칼럼)에 의해 정제된 인자 IX-sFc 융합 단백질의 용리액이다. 인자 IX-sFc (레인 2)의 MW는 글리코실화 함량이 높은 100-110 KDa이다.
도 6은 래트에서의 에리트로포이에틴 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (EPO-sFc) (검정 원) 및 원래의 재조합 인간 EPO (에프렉스(EPREX)®) (빈 원)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. 16.8 μg/kg의 EPO-sFc의 단일 용량 S.C. 투여시에, EPO-sFc의 반감기는 약 22시간이고, 이것은 에프렉스®보다 3배 더 길다.
도 7은 래트에서의 인자 IX 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (FIX-sFc) (정사각형) 및 원래의 재조합 인간 인자 IX (베네픽스®) (삼각형)의 단일 용량 정맥내 (I.V.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. FIX-sFc의 반감기는 I.V. 투여시에 약 56시간이고, 이것은 베네픽스® (T1/2 = 11.91시간)보다 5배 더 길다.
도 8은 pZD/IFNα-sFc의 플라스미드 지도를 보여준다. pZD/IFNα-sFc 플라스미드는 본 발명의 실시양태에 따른 IFNα-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 9는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 인터페론 알파 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNα-sFc)의 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인 M은 분자량 마커이다 (마커는 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 및 250 kDa 크기의 재조합 단백질을 포함한다). 레인 1 및 2는 각각 0.2 내지 0.4 M의 수크로스를 함유하는 IFNα-sFc 융합 단백질의 용리액이다. 레인 3 및 4는 각각 1.0 내지 2.0 M 우레아를 함유하는 IFNα-sFc 융합 단백질의 용리액이다.
도 10은 래트에서의 페가시스(Pegasys)® (원형), 인터페론 알파 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNα-sFc) (직사각형), Peg-인트론(Intron)® (정삼각형) 및 로페론(Roferon)-A® (역삼각형)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. IFNα-sFc의 반감기는 약 50.2시간이고, 이것은 다른 인터페론 제품보다 더 길다.
도 11은 래트에서의 인터페론 알파 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNα-sFc) (원형), 페가시스® (정삼각형) 및 인터페론 알파 Fc 융합 단백질 (IFNα-Fc) (역삼각형)의 항-바이러스 활성을 보여주는 그래프이다. IFNα-sFc의 항-바이러스 활성 (IC50)은 약 0.0061 nM이고, 이것은 IFNα-Fc (IC50 = 0.0313 nM) 및 페가시스® (IC50 = 0.0894)보다 훨씬 더 우수하다.
도 12a 내지 도 12b는 IFNα-sFc와 인터페론-알파 수용체 1 (IFNAR1) (도 12a) 및 IFNα-Fc와 IFNAR1 (도 12b)의 회합 프로파일을 보여준다.
도 13은 pZD-GCSF-sFc의 플라스미드 지도를 보여준다. pZD/GCSF-sFc 플라스미드는 본 발명의 실시양태에 따른 IFNα8-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 14는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 GCSF 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (GCSF-sFc)의 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 프로파일을 보여준다. 레인 M은 분자량 마커이다 (마커는 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 및 250 kDa 크기의 재조합 단백질을 포함한다). 레인 1은 GCSF-sFc의 용리액이다.
도 15는 래트에서의 GCSF 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (GCSF-sFc) (원형), 레노그라스팀(Lenograstim) (그라노사이트(Granocyte)®) (삼각형), 및 Peg-필그라스팀(filgrastim) (뉴라스타(Neulasta)®) (직사각형)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. GCSF-sFc의 반감기는 약 17.16시간이고, 이것은 레노그라스팀 (4.1시간) 및 Peg-필그라스팀 (12.0시간)보다 더 길다.
도 16은 레노그라스팀의 단일 용량 (군 B1 및 군 B2) 또는 4회 용량 (군 B3) 피하 (S.C.) 투여 및 GCSF 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (GCSF-sFc)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여 (군 C1 및 C2)의 생물학적 활성을 보여주는 그래프이다. GCSF-sFc는 레노그라스팀보다 마우스에서 호중구 분화 및 증식을 향상시키는 활성이 더 높다.
도 17은 pZD-IFNβ-sFc의 플라스미드 지도이다. pZD-IFNβ-sFc 플라스미드는 본 발명의 한 실시양태에 따른 IFNβ-sFc 융합 단백질을 코딩한다.
도 18은 래트에서의 인터페론 β 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNβ-sFc) (직사각형) 및 레비프(Rebif)® (마름모꼴)의 단일 용량 피하 (S.C.) 투여의 약동학 (PK) 프로파일을 보여주는 그래프이다. IFNβ-sFc의 반감기는 약 31.89-37.7시간이고, 이것은 레비프®의 반감기 (18.92-23.57시간)보다 더 길다.
도 19는 IFNβ-sFc 융합 단백질 및 레비프®에 의한 오스테오폰틴 (OPN) 억제를 보여주는 그래프이다. IFNβ-sFc 융합 단백질은 1.5 ng/mL 및 10 ng/mL 둘 다에서 각각 73.4±0.8% 및 79.5±3.6%의 유의한 억제 효과를 보였다. IFNβ-sFc의 생물학적 활성은 레비프®와 유사하였다.
본 개시내용은 생물활성 분자 및 이뮤노글로불린 분자의 일부를 포함하는 신규한 융합 단백질에 관한 것이다. 본 개시내용의 다양한 측면은 융합 단백질, 그의 조성물, 및 개시된 융합 단백질의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 개시된 융합 단백질은 유기체에서 생물활성 분자의 혈청 반감기를 연장하는데 유용하다.
다음은 본 발명을 실시할 때 관련 기술 분야의 통상의 기술자를 돕기 위해 제공되는 상세한 설명이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본원에 포함된 정보의 취지 또는 범위를 벗어나지 않는, 본원에 명시적으로 기재된 실시양태의 수정 또는 변형이 본 개시내용에 포함됨을 이해할 것이다. 설명에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 아래에서 사용되는 섹션 제목은 단지 조직 구조상의 목적을 위한 것으로서, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 도면 및 다른 참고문헌은 마치 본원 명세서에 완전히 개시되고 언급된 것처럼 그 전체가 참고로 포함된다.
1. 융합 단백질
본원에서 사용되는 바와 같이, "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드"는 자연에서 통상 발견되지 않는 방식으로 함께 연결된 적어도 2개의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드이다.
본 개시내용의 한 측면은 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 단편 및 생물활성 분자를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 개시된 융합 단백질에 포함된 생물활성 분자는 선행 기술에 기재된 비-융합되거나 융합 단백질 (예를 들어, 2개 쇄 Fc 영역을 함유하는 융합 단백질)에 포함된 동일한 생물활성 분자와 비교하여 개선된 생물학적 특성을 갖는다. 예를 들어, 개시된 융합 단백질에 포함된 생물활성 분자는 그의 비-융합된 대응물과 비교하여 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 추가로, 개시된 융합 단백질은 어떠한 기능 저하 없이 생물활성 분자의 완전한 생물학적 활성을 유지하고, 이것은 2개 쇄 Fc 영역으로부터의 입체 방해로 인하여 활성이 감소된 선행 기술의 융합 단백질보다 개선된 것이다.
본 개시내용의 융합 단백질은 비-융합된 생물활성 분자 및 선행 기술에서 기재된 융합 단백질에 포함된 생물활성 분자와 비교하여 생물활성 분자에 유의한 생물학적 이점을 제공한다.
개시된 융합 단백질은 하기 화학식 (도 1a 내지 1d에도 제시됨) 중 임의의 것을 가질 수 있다:
(B)-(힌지)-(CH2-CH3) (화학식 1) (도 1a),
(CH3-CH2)-(힌지)-(B) (화학식 2) (도 1b),
(B)-(L)m-(힌지)-(CH2-CH3) (화학식 3) (도 1c),
(CH3-CH2)-(힌지)-(L)m-(B) (화학식 4) (도 1d).
여기서
"B"는 생물활성 분자이고;
"힌지"는 IgG 분자의 힌지 영역이고;
"CH2-CH3"은 IgG 중쇄의 CH2 및 CH3 불변 영역 도메인이고;
"L"은 선택적 링커이고;
"m"은 임의의 정수 또는 0일 수 있다.
융합 단백질의 다양한 부분/단편은 아래에서 추가로 논의된다.
a.
Fc
영역 및
Fc
단편
본 개시내용의 융합 단백질은 이뮤노글로불린 (Ig) 분자로부터의 Fc 단편을 함유한다.
아래에서 사용되는 바와 같이, "Fc 영역"은 중쇄 불변 영역의 C-말단에 위치한 이뮤노글로불린의 일부를 나타낸다. Fc 영역은 세포 표면 수용체 (Fc 수용체) 및 면역계를 활성화하는 것을 돕는 보체계의 다른 단백질과 상호작용하는 이뮤노글로불린의 일부이다. IgG IgA 및 IgD 이소형에서, Fc 영역은 2개의 중쇄 도메인 (CH2 및 CH3 도메인)을 함유한다. IgM 및 IgE 이소형에서, Fc 영역은 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH2 내지 CH4 도메인)을 함유한다. Fc 부분의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 부분은 대체로 그의 카르복실-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 규정되고, 여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질은 FcRn 결합 단편인 CH2-CH3 도메인을 포함하고, 이는 다시 순환계로 재순환될 수 있다. 이 도메인을 갖는 융합 단백질은 융합 단백질의 생체 내 반감기의 증가를 보인다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Fc 단편"은 임의의 이소형으로부터의 이뮤노글로불린 분자의 Fc 영역에 상응하는 융합 단백질의 부분을 말한다. 일부 실시양태에서, Fc 단편은 IgG의 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 단편은 IgG1의 Fc 영역의 전장 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 단편은 관련 기술 분야에 특징지어지고 기재된 바와 같은 이뮤노글로불린 분자의 전장 Fc 영역을 나타낸다. 다른 실시양태에서, Fc 단편은 전장 Fc 영역의 일부 또는 단편, 예컨대 중쇄 도메인의 일부 (예를 들어, CH2 도메인, CH3 도메인 등) 및/또는 전형적으로 Fc 영역에서 발견되는 힌지 영역을 포함한다. 예를 들어, Fc 단편은 CH2 도메인의 전부 또는 일부 및/또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 단편은 전장 Fc 영역 또는 그의 일부의 기능적 유사체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적 유사체"는 원래 서열과 실질적으로 동일한 기능적 특성 (결합 인식, 결합 친화도 등)을 보유하는 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 변이체를 말한다. 기능적 유사체의 예는 원래 서열과 유사하지만 아미노산 위치에서 보존적 치환을 함유하는 서열; 전체적인 전하의 변화; 또 다른 모이어티에 대한 공유 부착; 또는 작은 부가, 삽입, 결실 또는 보존적 치환 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. Fc 단편의 기능적 유사체는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 합성 방식으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 기능적 유사체는 공지된 아미노산 서열을 부위 지정 돌연변이에 의한 아미노산의 부가, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형시킴으로써 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능적 유사체는 제시된 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 두 서열이 정렬 알고리즘에 따라 최적으로 정렬될 때 ClustalX와 같은 표준 정렬 알고리즘에 의해 결정된다.
이뮤노글로불린 분자는 임의의 동물 (예를 들어, 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 래트, 기니 피그)에서 수득되거나 유래될 수 있다. 추가로, 이뮤노글로불린의 Fc 단편은 임의의 이소형 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 또는 이소형 내의 하위클래스 (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 단편은 IgG로부터 수득되거나 유래되며, 특정 실시양태에서, Fc 단편은 인간화 IgG를 포함하는 인간 IgG로부터 수득되거나 유래된다.
Fc 단편은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득되거나 생산될 수 있다. 예를 들어, Fc 단편은 동물로부터 단리 및 정제되거나, 재조합 방식으로 발현되거나, 또는 합성 방식으로 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 단편은 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA)에서 코딩되고, 세포, 생식계열, cDNA 라이브러리 또는 파지 라이브러리로부터 단리된다.
Fc 영역 및/또는 Fc 단편은 일부 이뮤노글로불린 이소형 (IgA, IgD 및 IgG)에서 발견되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, Fc 단편은 임의의 Cys를 함유하지 않고 디술피드 결합을 형성할 수 없도록 힌지 영역을 돌연변이시킴으로써 변형된다. 힌지 영역은 아래에서 추가로 논의된다.
개시된 융합 단백질의 Fc 단편은 바람직하게는 단일 쇄 Fc이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단일 쇄 Fc" (또는 "sFc")는 Fc 단편이 이량체 형성을 방지하는 방식으로 (예를 들어, 화학적 변형 또는 돌연변이, 아미노산의 부가, 삭제 또는 변이에 의해) 변형되는 것을 의미한다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 단편은 야생형 인간 IgG1 아미노산 서열 또는 그의 변형물을 포함할 수 있는 인간 IgG1로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 단편은 Fc 단편의 잔기 67 (서열식별번호 (SEQ ID NO): 61)에 상응하는 천연 인간 IgG1 분자의 아미노산 위치 297 (미국 특허 7,501,494에서 논의된 바와 같은, IgG1에 대한 유럽 넘버링 시스템을 기초로 함)에서 N-글리코실화 부위로서 작용하는 Asn 아미노산을 함유한다. 다른 실시양태에서, Fc 단편 내의 N-글리코실화 부위는 Asn (N) 잔기를 His (H) (서열식별번호: 62) 또는 Ala (A) (서열식별번호: 63)로 돌연변이시킴으로써 제거된다. N-글리코실화 부위에 가변 위치를 함유하는 Fc 단편을 서열 목록의 서열식별번호: 64로서 제시한다.
일부 실시양태에서, Fc 단편의 CH3-CH2 도메인은 야생형 서열 (서열식별번호: 61에 개시됨)에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, Fc 단편의 CH3-CH2 도메인은 N-글리코실화 부위가 Asn (N) 잔기를 His (H)로 돌연변이시킴으로써 제거된 서열식별번호: 62의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, Fc 단편의 CH3-CH2 도메인은 N-글리코실화 부위가 Asn (N) 잔기를 Ala (A)로 돌연변이시킴으로써 제거된 서열식별번호: 63의 아미노산 서열을 갖는다.
b.
힌지
영역
개시된 융합 단백질은 일부 이뮤노글로불린 이소형 (IgA, IgD 및 IgG)에서 발견되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 Fab 영역으로부터 Fc 영역을 분리하고, 분자에 유연성을 부가하며, 디술피드 결합을 통해 2개의 중쇄를 연결할 수 있다. 2개의 CH2-CH3 도메인을 포함하는 이량체의 형성은 무손상 Fc 영역에 의해 제공되는 기능에 필요하다. 야생형 힌지 영역 내의 시스테인 사이의 쇄간 디술피드 결합은 Fc 분자의 2개 쇄를 함께 결합하여 기능적 단위를 생성하는 데 도움을 준다.
특정 실시양태에서, 힌지 영역은 IgG, 바람직하게는 IgG1로부터 유래된다. 힌지 영역은 전장 또는 변형된 (말단절단된) 힌지 영역일 수 있다.
특정 실시양태에서, 힌지 영역은 융합 단백질이 또 다른 융합 단백질 또는 이뮤노글로불린 분자와 함께 디술피드 결합을 형성하는 것을 방지하는 변형을 함유한다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 디술피드 결합의 형성을 방지하기 위해 하나 이상의 시스테인 아미노산을 돌연변이 및/또는 결실시킴으로써 변형된다. 전장 힌지 영역의 N-말단 또는 C-말단이 절단되어 말단절단된 힌지 영역을 형성할 수 있다. 디술피드 결합의 형성을 피하기 위해, 힌지 영역의 시스테인 (Cys)은 비-Cys 아미노산으로 치환되거나 결실될 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역의 Cys는 Ser, Gly, Ala, Thr, Leu, Ile, Met 또는 Val로 치환될 수 있다. IgG1 내지 IgG4의 야생형 및 돌연변이된 힌지 영역의 예는 표 1에 제시된 아미노산 서열 (서열식별번호: 1 내지 22)을 포함한다. 디술피드 결합은 돌연변이된 서열을 포함하는 두 힌지 영역 사이에 형성될 수 없다. IgG1 힌지 영역은 표 2에 나타낸 서열 (서열식별번호: 23 내지 60)을 갖는 다양한 돌연변이된 힌지 영역을 수용하도록 변형되었다.
c. 링커
융합 단백질은 Fc 단편의 N-말단에 연결된 생물활성 분자를 가질 수 있다. 다르게는, 융합 단백질은 Fc 단편의 C-말단에 연결된 생물활성 분자를 가질 수 있다. 연결은 공유 결합, 바람직하게는 펩티드 결합이다.
본 발명에서, 하나 이상의 생물활성 분자는 Fc 단편의 C-말단 또는 N-말단에 직접 연결될 수 있다. 바람직하게는, 생물활성 분자(들)는 Fc 단편의 힌지에 직접 연결될 수 있다.
추가로, 융합 단백질은 적어도 하나의 링커를 선택적으로 포함할 수 있다. 따라서, 생물활성 분자는 Fc 단편에 직접 연결되지 않을 수 있다. 링커는 생물활성 분자와 Fc 단편 사이에 개재할 수 있다. 링커는 Fc 단편의 N-말단 또는 Fc 단편의 C-말단에 연결될 수 있다.
한 실시양태에서, 링커는 아미노산을 포함한다. 링커는 1-5개의 아미노산을 포함할 수 있다.
d. 생물활성 분자
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 분자"는 단백질, 당단백질 및 이들의 조합물을 의미한다. 생물학적 활성 물질의 예는 항-혈관신생 인자, 시토카인, 성장 인자, 호르몬, 효소, 이들의 수용체 및 이들의 단편을 포함한다.
생물학적 활성 시토카인의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 인터류킨 (IL) (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18); 대식세포 염증성 단백질 (예를 들어, MIP1α, MIP1β); 대식세포 콜로니 자극 인자; 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자; 인터페론 (IFN) (예를 들어, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ); 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-알파, TNF-베타), 림포카인 억제 인자; 혈소판 유래 성장 인자; 줄기 세포 인자; 종양 성장 인자 β; 림프 독소; Fas; 에리트로포이에틴 (EPO); 백혈병 억제 인자; 온코스타틴-M; 섬모 향신경성 인자; 프로락틴; CD40-리간드; CD27-리간드; 및 CD30-리간드; 과립구 및/또는 대식세포 자극 인자를 포함하는 콜로니 자극 인자 및 성장 인자 (GM-CSF, G-CSF 및 CSF-1); 및 혈소판 유래, 표피, 인슐린 유사, 전환 및 섬유모세포 성장 인자. 생물학적 활성 시토카인은 또한 수용체 및/또는 그의 단편을 포함한다. 생물학적 활성 시토카인은 또한 이전에 문헌에 기재된 것을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 6,086,875 및 6,485,726 참조).
FcRn 결합 파트너를 통해 전달될 수 있는 성장 인자, 단백질 호르몬 및 그의 수용체의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 에리트로포이에틴 (EPO), 안지오게닌, 간세포 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 케라티노사이트 성장 인자, 신경 성장 인자, 종양 성장 인자 α, 트롬보포이에틴, 갑상선 자극 인자, 갑상선 방출 호르몬, 뉴로트로핀, 표피 성장 인자, VEGF, 섬모 향신경성 인자, LDL, 소마토메틴, 인슐린 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II. 생물학적 활성 성장 인자는 또한 이전에 문헌에 기재된 것을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 6,086,875 및 6,485,726 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 고려되는 생물학적 활성 분자는 에리트로포이에틴 (EPO), 인자 IX (FIX), 인터페론 (IFN) 및 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF 또는 GCSF)를 포함한다.
한 실시양태에서, 생물학적 활성 분자는 에리트로포이에틴 (EPO)이다. 분자량이 약 34,000 달톤인 산성 당단백질인 에리트로포이에틴은 적혈구 전구 세포가 적혈구로 성숙하는 데 관여하는 당단백질 호르몬이다. 이것은 순환계 내의 적혈구의 수준을 조절하는 데 필수적이다. 천연적으로 발생하는 에리트로포이에틴은 태아 생활 동안 간에 의해 및 성인의 신장에 의해 생산되고, 혈액에서 순환하며, 골수에서 적혈구 생산을 촉진한다. 유럽 약전 (European Pharmacopoeia)의 에리트로포이에틴 농축액을 참조한다. 특정 실시양태에서, EPO 단백질은 서열식별번호: 65의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 생물학적 활성 분자는 인자 IX (FIX)이다. 분자량이 약 70,000 달톤인 구형 단백질인 FIX는 혈액 응고에 참여하는 비타민 K-의존성 단백질이다. 이것은 자이모겐 형태로 합성되고, 혈액으로 분비되기 전에 세 가지 유형의 번역 후 변형을 거친다. 인간에서, 간은 FIX 합성 부위이다. 이 단백질은 혈액 응고 주기에 참여하고, B형 혈우병 환자의 치료에 사용된다. 현재, 상업적으로 이용가능한 FIX의 유일한 공급원은 인간 혈장이다. 유럽 약전의 인간 응고 인자 IX를 참조한다. 특정 실시양태에서, FIX 단백질은 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시양태에서, 생물학적 활성 분자는 인터페론 알파 (IFNα) 또는 인터페론 베타 (IFNβ)이다. 인터페론 (IFN)은 항-바이러스, 면역조절 및 항-증식 효과를 지닌 당단백질 (19-20 KDa)이고, 그의 구조적 상동성 및 이들이 회합하는 특정 수용체에 따라 3가지 클래스 (유형 I, II 및 III)로 나뉜다. 유형 I IFN 패밀리는 많은 IFN 알파 변이체, 단일 IFN 베타 멤버 및 덜 알려진 IFN 엡실론, 카파, 오메가 및 델타를 포함한다. 그러나, 모든 유형 I IFN은 IFN 알파 수용체 (IFNAR)에만 배타적으로 결합한다. IFN 알파는 상이한 자극에 반응하여 백혈구에 의해 생성되는 반면, IFN 베타는 백혈구를 제외한 대부분의 세포 유형에서 생산된다. IFN 베타는 IFN 알파와 30% 아미노산 상동성을 갖지만, IFN 알파와 비교할 때 IFNAR에 대한 더 높은 결합 친화도를 갖는다. IFN 알파 및 베타는 다양한 인간 암 및 바이러스 기원의 질환 치료에 사용된다. 특정 실시양태에서, IFNα 단백질은 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 갖는 IFNα8이다. 특정 실시양태에서, IFNβ 단백질은 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 생물학적 활성 분자는 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF)이다. 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF)는 174개 또는 177개 아미노산의 단일 폴리펩티드 쇄를 갖는 20 KDa 당단백질이다. 보다 짧은 형태는 보다 긴 이소형보다 더 큰 활성 및 안정성을 갖고, 상업용 제약 GCSF 제품의 기초가 된다. GCSF는 호중구 감소성 전구 세포의 증식 및 그의 과립구로의 분화를 자극하고, 성숙 호중구를 활성화한다. GCSF는 화학 요법 유도 호중구 감소증의 치료에 가장 많이 사용된다. 특정 실시양태에서, GCSF 단백질은 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 갖는다.
2. 조성물
특정 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
제약 조성물은 융합 단백질을 선택적인 제약상 허용되는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 용매, 분산매, 등장화제 등을 포함한다. 담체의 예는 물, 염수 용액 또는 다른 완충제 (예컨대, 포스페이트, 시트레이트 완충제), 오일, 알콜, 단백질 (예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴), 탄수화물 (예컨대, 글루코스, 트레할로스, 만노스, 만니톨, 소르비톨 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물), 겔, 지질, 리포솜, 안정화제, 보존제, 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제, 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 형 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 비이온성 계면 활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 또는 이들의 조합물을 포함한다.
제약 조성물은 하나 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 제제는 하나 이상의 융합 단백질 및/또는 하나 이상의 추가의 유익한 화합물(들)을 함유할 수 있다. 활성 성분은 임의의 편리하고 실용적인 방법으로, 예를 들어 혼합, 용해, 현탁, 유화, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합될 수 있고, 분말 (동결건조된 분말 포함), 주사, 주입 등에 적합한 현탁액과 같은 제제로 제조될 수 있다. 서방성 제제도 제조할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 인간 사용을 위한 융합 단백질을 함유한다. 제약 조성물은 적절한 pH에서 시트레이트, 포스페이트, 트리스, 비스-트리스 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 적절한 완충제 내에서 제조될 수 있고, 부형제, 예컨대 당 (50 mM 내지 500 mM의 수크로스, 트레할로스, 만니톨 또는 이들의 혼합물), 계면활성제 (예를 들어, 0.025% - 0.5%의 트윈 20 또는 트윈 80) 및/또는 다른 시약을 함유할 수 있다. 제제는 다양한 양의 융합 단백질을 함유하도록 제조될 수 있다. 일반적으로, 대상체에게 투여하기 위한 제제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL를 함유한다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL; 약 1.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL; 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL; 또는 약 10 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 1.0 mg/mL, 약 5.0 mg/mL, 약 10.0 mg/mL 또는 약 25.0 mg/mL의 융합 단백질을 함유한다.
3. 방법
본 발명의 또 다른 측면은 융합 단백질 및 그의 조성물을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
a. 융합 단백질의 생산
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 제조하는 방법은 (i) 생물활성 분자 및 힌지 영역을 포함하는 Fc 단편을 제공하는 단계, (ii) 힌지 영역이 디술피드 결합을 형성하지 못하도록 힌지 영역을 변형하는 단계, 및 (iii) 융합 단백질, 하이브리드, 접합체 또는 그의 조성물을 형성하기 위해 생물활성 분자를 돌연변이된 힌지 영역을 통해 scFc에 직접 또는 간접적으로 연결하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 (i) 융합 단백질을 제공하는 단계 및 (ii) 융합 단백질을 단백질 A 또는 단백질 G-기반 크로마토그래피 매질에 의해 정제하는 단계를 포함하는, 융합 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.
융합 단백질은 다르게는, 공지된 분자생물학 기술에 의해 발현될 수 있다. 분자 클로닝 기술에 관한 임의의 표준 매뉴얼은 재조합 DNA 및 RNA의 발현에 의해 본 발명의 융합 단백질을 생산하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 유전자를 구축하기 위해, 아미노산 서열은 바람직하게는 유전자가 발현될 유기체에 최적화된 코돈을 사용하여 핵산 서열로 역번역된다. 다음으로, 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를, 전형적으로 융합 단백질 및 필요한 조절 요소를 코딩하는 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 제조한다. 합성 유전자를 조립하여 원하는 발현 벡터에 삽입한다. 본 발명에 포함되는 합성 핵산 서열은 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 것, 및 그에 의해 코딩되는 분자의 생물학적 활성을 변경하지 않는 비-코딩 서열의 변화를 특징으로 하는 핵산 구축물을 포함한다. 합성 유전자를 적절한 클로닝 벡터에 삽입하고, 재조합체를 수득하고 특성을 결정한다. 융합 단백질은 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적합한 조건 하에 발현된다. 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G의 친화도 칼럼 (예를 들어, 소프트맥스(SoftMax)®, 아크로셉(AcroSep)®, 세라-맥(Sera-Mag)® 또는 세파로스(Sepharose)®)에 의해 정제된다.
본 발명의 융합 단백질은 포유동물 세포, 저등 진핵세포 또는 원핵세포에서 생성될 수 있다. 포유동물 세포의 예는 원숭이 COS 세포, CHO 세포, 인간 신장 293 세포, 인간 표피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 3T3 세포, CV-1 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상 이배체 세포, 1차 조직의 시험관 내 배양액으로부터 유래된 세포 스트레인, 1차 외식편, HeLa 세포, 마우스 L 세포, BHK, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 이뮤노글로불린 G의 Fc의 힌지 영역에서 Cys를 돌연변이, 치환 또는 결실시키는 것을 포함하는, IgG의 단일 쇄 Fc (sFc) 영역을 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, Cys는 Ser, Gly, The, Ala, Val, Leu, Ile 또는 Met으로 치환된다. 또 다른 실시양태에서, Cys는 결실된다. 추가의 실시양태에서, 힌지의 단편은 결실된다.
본 발명은 또한 (a) 생물활성 분자 및 힌지 영역을 포함하는 IgG Fc 단편을 제공하는 단계; (b) 디술피드 결합을 형성하지 않으면서 돌연변이된 Fc를 형성하기 위해 아미노산 치환 및/또는 결실에 의해 힌지 영역을 돌연변이시키는 단계; 및 (c) 생물활성 분자 및 돌연변이된 Fc를 조합하는 단계를 포함하는, 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
b. 융합 단백질의 사용
본 발명의 융합 단백질은 정맥 내, 피하, 근육 내 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어 경구, 설하, 협측, 설하, 비강, 직장, 질내 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 용량은 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 필요한 투여량은 융합 단백질, 대상체의 종 및 대상체의 크기를 포함하고 이로 제한되지 않는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 많은 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량은 0.1 내지 100,000 μg/kg (체중)일 수 있다. 융합 단백질은 단일 용량으로, 24시간의 기간에 걸친 다수 용량으로, 또는 연속 주입에 의해 투여할 수 있다. 융합 단백질은 연속적으로 또는 특정 스케줄에 따라 투여될 수 있다. 효과적인 용량은 동물 모델에서 얻은 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
4. 구체적인 실시양태
본 발명의 구체적인 실시양태는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다:
(1) IgG 분자의 Fc 단편 및 생물활성 분자를 포함하며, 여기서 Fc 단편은 단일 쇄 Fc (sFc)인 융합 단백질.
(2) (1)에 있어서, Fc 단편이 힌지 영역을 포함하는 것인 융합 단백질.
(3) (2)에 있어서, 힌지 영역이 돌연변이되고 디술피드 결합을 형성하지 않는 것인 융합 단백질.
(4) (2)에 있어서, 힌지 영역이 서열식별번호: 1-60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
(5) (2)에 있어서, 힌지 영역이 서열식별번호: 23 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
(6) (1)에 있어서, 생물활성 분자가 시토카인, 성장 인자, 호르몬 또는 그의 기능적 부분인 융합 단백질.
(7) (1)에 있어서, 생물활성 분자가 에리트로포이에틴, 인자 IX, IFNα, GCSF 및 IFNβ인 융합 단백질.
(8) (1)에 있어서, 생물활성 분자가 돌연변이된 힌지 영역을 통해 Fc 단편에 연결되는 것인 융합 단백질.
(9) (1)에 있어서, 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열식별번호: 66, 68, 70, 72 및 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 따른 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
(11) 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 생물활성 분자 및 힌지 영역을 포함하는 Fc 단편을 제공하는 단계;
b) 돌연변이된 Fc를 형성하기 위해 아미노산 치환 및/또는 결실에 의해 힌지 영역을 돌연변이시키는 단계; 및
c) 생물활성 분자 및 돌연변이된 Fc를 조합하는 단계.
(12) (11)에 있어서, 힌지 영역이 시스테인 잔기의 치환 및/또는 결실에 의해 돌연변이되는 것인 방법.
(13) (11)에 있어서, 생물활성 분자가 힌지 영역을 통해 돌연변이된 Fc와 조합되는 것인 방법.
(14) (11)에 있어서, 생물활성 분자가 시토카인, 성장 인자, 호르몬 또는 그의 기능적 부분인 방법.
(15) (11)에 있어서, 상기 생물활성 분자가 에리트로포이에틴, 인자 IX, IFNα, GCSF 및 IFNβ인 방법.
본 발명의 추가적인 구체적인 실시양태는 하기 실시예를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
실시예
1
에리트로포이에틴 단일 쇄
Fc
융합 단백질 (EPO-
sFc
)
1. 융합 단백질
본 실시예에서, 상기 논의된 화학식 1의 구조를 갖는 융합 단백질을 제조하였다:
(B)-(힌지)-(CH2-CH3)
여기서
생물활성 분자 (B)는 에리트로포이에틴 (EPO) 단백질 (서열식별번호: 65)이고;
힌지 영역 (힌지)은 돌연변이된 IgG1 힌지 (서열식별번호: 27)이고;
(CH2-CH3)은 IgG1의 CH2-CH3 (서열식별번호: 62)이다.
EPO-sFc 융합 단백질의 전장 아미노산 서열은 서열식별번호: 66으로서 서열 목록에 제시된다.
2. 발현 벡터
EPO-sFc는 DNA 발현 벡터를 사용하여 생산되었다. 에리트로포이에틴 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (EPO-sFc)의 DNA 단편을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 방법에 의해 중첩 프라이머를 사용하여 조립하였다. 이어서, 조립된 EPO-sFc 단편을 pZD 벡터 (pcDNA3.1Neo, 인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드), cat. no. V790-20 (dhfr 유전자 보유))의 PacI 및 EcoRV 부위에 라이게이팅하여 도 2에 제시된 바와 같은 pZD/EPO-sFc를 수득한 후, 이. 콜라이(E. coli) 내로 형질전환시켰다. 발현 벡터 구축물은 제오신-내성 유전자를 선택 마커로서 포함하였다.
실시예
2
EPO-
sFc를
생산하는 안정한 재조합 세포주의 확립
CHOdhfr - 세포를 트립신 처리하고, CP-T 완충제 (사이토 펄스 Cat. CP-T)에 3x106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 0.2 mL의 세포 현탁액 (6x105 세포)을 전기천공 (PA4000 펄스애질(PulseAgile)® 전기천공기, 사이토 펄스 사이언시스(Cyto Pulse Sciences))에 의해 10 μg의 플라스미드 pZD/EPO-sFc로 형질감염시켰다. 비-선택 배지에서 48시간 성장시킨 후, 고수율 zE93을 얻기 위해 형질감염체를 IMDM, 10% 소 태아 혈청, 제오신 (인비트로겐 Cat. 1486406) 및 5 nM MTX (시그마(Sigma) Cat. BCL5707V)를 함유하는 선택 완전 배지에서 인큐베이팅하였다. 배양 배지에서 분비된 융합 단백질의 발현을 Q-ELISA (콴티킨(Quantikine)® IVD® Epo ELISA 키트)에 의해 검출하고 정량하였다.
원래의 zE93 세포를 10% FBS, 제오신 및 0.1 μM MTX가 보충된 IMDM을 함유하는 10 cm 접시에서 배양되었다. 세포를 37℃ 가습 95% 공기/5% CO2 인큐베이터 (모델 3326, 포르마 사이언티픽 (Forma scientific))에서 유지하였다. 무혈청 배양 배지에서 세포를 적응시키기 위해, 배지를 IMDM으로부터 5% FBS, 제오신 및 0.1 μM MTX가 보충된 JRH 무혈청 배지로 교체하였다. 세포가 안정화되면, 세포를 트립신 처리에 의해 10 cm 접시에서 분리하고, 동일한 백분율의 FBS가 보충된 50 mL JRH 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 옮겼다. 융합도가 3-5일 내에 90%에 도달할 때, 세포를 보다 낮은 백분율의 FBS가 보충된 JRH 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 계대배양하였다. 세포를 스피너 플라스크에서 FBS 백분율을 10%로부터 0%로 단계적으로 감소시킴으로써 더 낮은 혈청 조건에 적응시켰다.
혈청 샘플 내의 EPO-sFc 융합 단백질의 농도는 콴티킨® IVD® Epo ELISA 키트 (알&디 시스템즈 인크. (R&D Systems Inc., CN): DEP00)에 의해 정량화되었다. 혈청 희석 배수를 최적화하고, 표준물질, 대조군 및 검체에 대한 플레이트 레이아웃을 결정한 후, 융합 단백질을 사용하여 공식적인 검정을 수행하였다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 (Pro) 5 소프트웨어에 의해 획득되었다.
단일 쇄 Fc에 연결된 재조합 EPO (즉, EPO-sFc)를 포함하는 융합 단백질을 최종적으로 생산하기 위해, 선택, 제한 희석 및 단계적인 MTX 챌린지에 의해 고수율 클론을 성공적으로 수득하였다. 생성된 융합 단백질은 추가의 시험관 내 또는 생체 내 생물학적 활성 검정 및 약동학 연구를 위해 정제되었다.
실시예
3
EPO-
sFc의
크로마토그래피 정제
단백질 A 기반 수지 (맙셀렉트 SuRe™)와 DEAE 수지 (DEAE FF 음이온 교환 칼럼) 둘 다를 사용하여 EPO-sFc를 정제하였다. 정제 후, 상응하는 회수율을 정량적 ELISA에 의해 분석하고, 각각의 순도를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. EPO-sFc에 대한 상세한 정제 공정은 아래에서 기재된다.
1. 맙셀렉트
SuRe
™ 정제
고수율 EPO-sFc 생산 세포주로부터의 배양 배지를 1 mL 수지에 대해 약 4.8 mg의 로딩 비율로 단백질 A 기반 맙셀렉트 SuRe™ 칼럼 (GE; Cat. no.: 11-0034-93)에 적용하였다. 2회 세척 단계 후에, 융합 단백질을 pH 3.0 용리 완충제로 용리시킨 후, 용리액을 pH 8.8로 중화하였다. 맙셀렉트 SuRe™ 용리액을 Q-ELISA (콴티킨® IVD® EPO ELISA 키트)에 의해 분석하여 양 및 회수율을 결정하였다. 회수율은 맙셀렉트 SuRe™ 단백질 A 칼럼에 의해 설계된 EPO-sFc의 효율적인 결합 및 정제를 나타내는 65.8%이었다 (표 3).
2.
DEAE
FF 정제
DEAE FF 1 mL 하이트랩 칼럼에 로딩하기 전에, 완충제를 DEAE FF 평형 완충제로 교환하였다. 그 후, 실시예 2에서 기재된 고수율 세포주로부터 제조된 EPO-sFc 함유 세포 배지를 수지 1 mL에 대해 약 5.92 mg의 로딩 비율로 DEAE FF 1 mL 하이트랩 칼럼에 로딩하였다. 산성 세척 단계 후에, 주 피크는 130 mM NaCl을 함유하는 40 mM 트리스 완충제 (pH 8.0)에 의해 용리되었다. 이어서, DEAE FF 용리액을 Q-ELISA (콴티킨® IVD® EPO ELISA 키트)에 의해 분석하였다. 총 회수율은 15.48%이었다 (표 3).
3. 결과
표 3은 맙셀렉트 SuRe™ 및 DEAE FF로 각각 정제된 EPO-sFc 융합 단백질에 관한 정보를 제시한다. 이 표는 맙셀렉트 SuRe™가 단일 정제 단계에 의해 고순도 EPO-sFc를 효율적으로 생성함을 보여준다.
도 4는 상기 논의된 방법을 사용하여 생산된 EPO-sFc 융합 단백질이 SDS-PAGE에 의해 주요 밴드 (레인 1, 2 및 3)를 나타냄을 보여준다. EPO-sFc의 MW는 50-70 KDa이었고, 높은 글리코실화 함량이 과아이오딘산-쉬프 (Periodic Acid-Schiff; PAS) 염색 방법에 의해 이중 SDS-PAGE 겔에서 제시되었다.
시알산은 체내 순환계에서 그의 반감기에 영향을 미치는 EPO-sFc의 중요한 성분 중 하나이다. EPO-sFc의 MW는 50-70 KDa로서, 글리코실화 함량이 높았다. 표 3에 따르면, EPO-sFc는 각각 맙셀렉트 SuRe™ 및 DEAE FF를 포함하는 상이한 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 맙셀렉트 SuRe™는 단일 정제 단계에 의해 고순도 EPO-sFc를 효율적으로 생산할 수 있었다. DEAE FF 음이온 교환 수지는 EPO-sFc의 반감기에 영향을 줄 수 있는 EPO-sFc의 낮은 시알산 이소형을 제거하기 위해 정제 과정을 더욱 고도화할 것이다.
실시예
4
EPO-
sFc에
대한 약동학 연구
바이오라스코 타이완 코., 엘티디.(BioLASCO Taiwan Co., Ltd.)에서 10마리의 래트 (체중: 276-300 g)를 구입하였다. 모든 래트를 약동학 (PK) 연구를 시작하기 전에 4일 동안 격리하고 순응시켰다. 래트를 PK 연구를 위해 다음과 같이 3개의 시험 군으로 나누었다: (1) DEAE에 의해 정제된 EPO-sFc; (2) 단백질 A에 의해 정제된 EPO-sFc; 및 (3) 원래의 재조합 인간 EPO (에프렉스®). 군 (1) 및 군 (2)의 래트는 16.8 μg/kg으로 투여되었고, 군 (3)의 래트는 3.5 μg/kg으로 투여되었다. 단백질은 피하 (S.C.) 투여를 통해 투여되었다. 래트를 군으로 나누고, 퍼 염료로 표시하였다. 주사용 염수 내의 새로운 샘플 희석제 (0.25% 소 혈청 알부민 (애플리켐 (AppliChem), CN: A0850,0250))를 사용하여 참조 단백질 (에프렉스®, 3.5 μg/mL)과 시험 융합 단백질 EPO-sFc (DEAE 수지) 및 EPO-sFc-(단백질 A 수지) (16.8 μg/mL) 둘 다를 제조하였다. 모든 주사는 S.C. 경로를 위해 등쪽 목 부위를 통해 래트에게 수행되었다.
혈액 샘플을 주사 0.5, 1, 2, 5, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 수집한 다음, 20분 동안 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 -70℃에서 보관하였다.
혈청 샘플의 EPO 농도는 콴티킨® IVD® EPO ELISA 키트 (알&디 시스템즈 인크., CN: DEP00)에 의해 정량되었다. 검정을 수행하기 전에, 혈청 희석 배수를 최적화하고, 플레이트를 표준물질, 대조군 및 검체에 대해 레이아웃하였다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. 혈청 내의 EPO 농도로부터 Cmax, Tmax, AUC 값 및 소실기 반감기 (T1/ 2)를 PK 솔루션즈 (Solutions) 2.0™ 소프트웨어로 계산하였다.
단일 용량 투여 후에 래트에서의 DEAE FF 및 에프렉스®로부터 정제된 EPO-sFc의 피하 (S.C.) 약동학 프로파일을 도 6에 제시하고, 평균 약동학적 특성을 표 5에 제시한다. EPO-sFc-DEAE의 반감기는 22.3±0.38 (hr)이었다. 이와 대조적으로, 에프렉스®의 반감기는 6.182±0.675 (hr)에 불과하였다. EPO-sFc (DEAE) 및 에프렉스®의 AUC는 각각 327.4±15.13 및 161.5±23.64 (ng-hr/mL)이었다. EPO-sFc (DEAE) 및 에프렉스®의 Tmax는 각각 18±0.00 및 9.33±2.31 (hr)이었다.
EPO-sFc의 반감기는 원래의 EPO (에프렉스®) 제품과 비교할 때 3배까지 연장된 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 EPO-sFc는 만성 신장 질환 (CKD) 또는 암 환자에서 주사 빈도를 감소시키고 환자의 삶의 질을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
실시예
5
EPO-
sFc에
대한 생물학적 활성 검정
8마리의 암컷 BALB/c 마우스 (8주령)를 EPO의 생물학적 활성을 결정하기 위해 두 군으로 나누었다. 한 군에는 참조 약물 (에프렉스®)을 투여하였고, 다른 군에는 본 개시내용의 EPO-sFc 융합 단백질 (EPO-sFc)을 투여하였다. 참조 약물 (에프렉스®, 존슨 앤드 존슨 (Johnson and Johnson))을 구입하여 336 μg/mL (40 IU/mL와 동일)의 농도로 새로 제조하였다. 실시예 3에 따라 생산된 EPO-sFc 융합 단백질을 0.336 ng/mL (40 IU/mL의 에프렉스®에 해당하는 몰)의 농도로 새로 제조하였다. 각각의 마우스는 제1일에 0.5 mL의 에프렉스® 또는 EPO-sFc 융합 단백질을 피하 투여한 후, 제4일 내지 제9일, 제11일 및 제13일에 혈액 수집을 수행하였다.
망상적혈구의 수는 최근의 생산을 나타내고 망상적혈구 수 및 에리트로포이에틴 효능의 결정을 가능하게 하기 때문에, 에리트로포이에틴의 생물학적 활성의 좋은 지표이다. 망상적혈구의 수는 FACS에 의해 결정되었다. 1.0 mL의 PBS 및 5.0 μL의 전혈을 비염색된 샘플용 폴리스티렌 튜브에 넣었다. 1.0 mL의 티아졸 오렌지 (Thiazole Orange) (비디 레틱-카운트(BD Retic-Count)™, cn:349204) 및 5.0 μL의 전혈을 염색된 샘플용 폴리스티렌 튜브에 넣었다. 튜브 둘 다를 암실에서 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하고, 인큐베이팅 후 3.5 시간 이내에 분석하였다. 샘플을 분석 직전에 부드럽게 혼합하였다. 망상적혈구를 유동 세포 계측법 (비디 팩스칼리버(BD FACSCalibur)™)으로 측정하고, 셀퀘스트 프로(CellQuest Pro)™ 소프트웨어로 분석하였다. PK 솔루션즈 2.0 소프트웨어 (서밋 (Summit), 미국 콜로라도주 몬트로스)에 의해 곡선 하 효능 면적 (AUC) 및 망상적혈구의 최대 백분율 (RETmax)을 평가하기 위해 각각의 샘플의 망상적혈구 백분율을 계산하였다.
망상적혈구 수는 AUEC 및 RETmax를 측정함으로써 참조 약물 및 EPO-sFc 융합 단백질의 활성을 비교하기 위해 사용되었다 (표 7). 0 내지 13시간의 AUEC는 에프렉스 및 EPO-sFc 융합 단백질에 대해 각각 88.69 및 91.03 ng·hr/ml이었다. 또한, 에프렉스® 및 EPO-sFc 융합 단백질의 RETmax는 각각 11.12% 및 10.48%이었다. AUEC 및 RETmax 의 결과는 EPO-sFc의 생물학적 활성이 본 실시예에서 에프렉스®과 대등하기 때문에, EPO-sFc 융합 단백질의 단일 쇄 Fc 부분이 EPO 부분의 기능을 유의하게 저해하지 않는다는 것을 제시한다.
실시예
6
인자 IX 단일 쇄
Fc
융합 단백질 (FIX-
sFc
)
1. 융합 단백질
본 실시예에서, 상기 논의된 화학식 1의 구조를 갖는 융합 단백질을 제조하였다:
(B)-(힌지)-(CH2-CH3)
여기서
생물활성 분자 (B)는 인자 IX 단백질 (FIX) (서열식별번호: 67)이고;
힌지 영역 (힌지)은 돌연변이된 IgG1 힌지 (서열식별번호: 23)이고;
(CH2-CH3)은 IgG1의 CH2-CH3 (서열식별번호: 61)이다.
FIX-sFc 융합 단백질의 전장 아미노산 서열은 서열식별번호: 68로서 서열 목록에 제시된다.
2. 발현 벡터
FIX-sFc는 DNA 발현 벡터를 사용하여 생산되었다. 인자 IX의 DNA 단편을 조립 PCR 방법에 의해 중첩 프라이머를 사용하여 조립하였다. 인자 IX 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (FIX-sFc)의 전장 유전자를 반응 혼합물로부터 증폭시키고, pZD 벡터 (pcDNA3.1Neo, 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스바드), cat. no. V790-20 (dhfr 유전자 보유))의 PacI 및 ApaI 부위에 라이게이팅하여 도 3에 제시된 바와 같은 pZD/FIX-sFc를 수득한 후, 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 발현 벡터 구축물은 제오신-내성 유전자를 선택 마커로서 포함하였다.
실시예
7
FIX-
sFc를
생산하는 안정한 재조합 세포주의 확립
CHOdhfr - 세포를 트립신 처리하고, CP-T 완충제 (사이토 펄스 Cat. CP-T)에 3x106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 이어서, rhFIX-sFc의 발현을 위해 0.2 mL의 세포 현탁액 (6x105 세포)을 전기천공 (PA4000 펄스애질® 전기천공기, 사이토 펄스 사이언시스)에 의해 15 μg의 플라스미드 pZD/FIX-sFc로 형질감염시켰다. 비-선택 배지에서 48시간 성장시킨 후, 고수율 N18을 얻기 위해 형질감염체를 IMDM, 10% 소 태아 혈청, 게네티신 (인비트로겐 Cat. 10131-027) 및 5 nM MTX (시그마 Cat. M-8407)를 함유하는 선택 완전 배지 하에서 배양하였다. 세포가 96-웰 플레이트에서 융합도를 달성한 후, Q-ELISA에 의해 rhFIX-sFc의 수준을 평가하고, 높은 발현을 갖는 클론을 6-웰 플레이트로 옮겼다. 이들 클론은 웰당 1x105 세포로 계대 배양하고, Q-ELISA에 의해 FIX-sFc 함유 배지 역가를 결정하기 전에 7일간 성장시켰다.
1:1000 (1 μg/mL)의 포획 항체 (마우스 인자 IX 모노클로날 항체, 바이오포르토 (Bioporto), 덴마크, Cat. HYB 133-09)를 사용하기 위해 카르보네이트/비카르보네이트 코팅 완충제 내에서 제조하였다. 100 μl의 희석된 포획 항체를 ELISA 플레이트의 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 검출 항체 (토끼 인자 IX 폴리클로날 Ab, 압캠 (Abcam), (U.K.), Cat. Ab23335)를 1:1,000으로 PBST (0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS) 내에 희석하고, ELISA 플레이트에 첨가하였다. HRP 접합 항체 (퍼옥시다제-아피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-토끼 Ab, 잭슨 이뮤노리서치, (USA), Cat.111-035-144) 및 TMB 퍼옥시다제 기질 (KPL, Cat.53-00-03)를 사용하여 발색시켰다. 마지막으로, 100 μl의 1 N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. FIX-sFc의 농도는 식 (X = [a/(Y-Y0)-1](1/b) x X0)에 의해 결정되었고, C 초기 값, AUC 값 및 소실기 반감기 (T1/2)는 PK 솔루션 2.0™ 소프트웨어를 사용하여 FIX-sFc의 농도에 대해 계산하였다.
원래의 N18 클론을 5% FBS, 제오신 및 0.01 μM MTX가 보충된 IMDM을 함유하는 10 cm 접시에서 배양되었다. 세포를 37℃ 가습 95% 공기/8% CO2 인큐베이터 (모델 3326, 포르마 사이언티픽)에서 유지하였다. 무혈청 배지에서 세포를 적응시키기 위해, 배양 배지를 IMDM으로부터 2% FBS, 제오신 및 0.02 μM MTX가 보충된 EX-CELL® 325 PF CHO 무혈청 배지로 교체하였다. 세포가 안정화되면, 세포를 트립신 처리에 의해 10 cm 접시에서 분리하고, 동일한 백분율의 FBS가 보충된 50 mL EX-CELL® 325 PF CHO 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 옮겼다. 세포 융합도가 3-5일 내에 90%에 도달할 때, 세포를 보다 낮은 백분율의 FBS가 보충된 EX-CELL® 325 PF CHO 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 계대배양하였다. 세포를 스피너에서 FBS 백분율을 2%로부터 0%로 단계적으로 감소시킴으로써 더 낮은 혈청 조건에 적응시켰다. rhFIX-sFc 생산성 및 활성을 추가로 증가시키기 위해, 클론을 pZD/FIX-sFc로 재-형질감염시켰다. 고수율 클론으로부터의 세포 N18-reZB를 이어서 FACS로 분류하여 고수율 세포군을 분리하고 EX-CELL® 325 PF CHO 무혈청 배지에서 성장시켰다. 클론 N18-reZB로부터의 세포를 상이한 MTX 조건에 의해 시험하여 rhFIX-sFc를 고수율로 생산하는 세포를 선택하였다.
한 라운드의 선택 후, Q-ELISA MTX 챌린지에 의해 고수율 클론인 N18-reZB-sp4-sp5를 선택하였다. 이어서, 분류 및 MTX 챌린지에 의해 pZD/FIX-sFc를 사용하여 무혈청 클론을 재형질감염시키고, 기능 선택을 통해 고수율 클론을 만들었다. 이 과정에서 N18-reZB-sp4-sp5가 수득되었다. N18-reZB-sp4-sp5의 배치 배양에서 축적된 역가는 Q-ELISA에 의해 측정시 약 53.4 μg/mL이었다.
실시예
8
FIX-
sFc의
크로마토그래피 정제
단백질 A 수지 (맙셀렉트 SuRe™)와 IX Select 수지 둘 다를 사용하여 FIX-sFc를 정제하였다. 정제 후, 상응하는 회수율을 정량적 ELISA에 의해 분석하고, 각각의 순도를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. FIX-sFc에 대한 상세한 정제 공정은 아래에서 기재된다.
1. 맙셀렉트
SuRe
™ 정제
FIX-sFc 생산 세포주 배양 배지를 1 mL 수지에 대해 약 1.84 mg의 로딩 비율로 단백질 A 기반 맙셀렉트 SuRe™ 칼럼에 적용하였다. 2회 세척 단계 후에, 융합 단백질을 pH 3.0 완충제에 의해 칼럼으로부터 용리시켰다. 맙셀렉트 SuRe™ 용리액을 Q-ELISA에 의해 분석하여 양 및 회수율을 결정하였다. FIX-sFc는 맙셀렉트 SuRe™에 의해 효율적으로 포획되었고, 도 5의 레인 2에 표시된 바와 같이 단일 단계 정제로 이미 고도로 정제된 제제가 수득되었다.
2. IX Select 정제
IX셀렉트 친화도 (GE; no.: 17-5505-01) 수지를 1 mL 칼럼에 채웠다. 수지는 FIX에 대해 작용하는 모노클로날 항체와 커플링되었다. 로딩 pH의 범위는 6.5-8.0이었다. FIX-sFc 배지를 완충제 교환 없이 IX셀렉트 칼럼에 로딩하였다. 로딩 비율은 1 mL 수지에 대해 약 1.69 mg이었다. 결합되지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 주 피크는 2 M MgCl2, pH 7.4 완충제를 함유하는 20 mM 트리스에 의해 용리되었다. 그 후, IX셀렉트 용리액을 Q-ELISA에 의해 분석하였다.
3. 결과
표 4는 맙셀렉트 SuRe™ 및 IX Select 친화도 수지로 각각 정제된 FIX-sFc 융합 단백질에 관한 정보를 제시한다. 이 표는 맙셀렉트 SuRe™ 및 IX Select가 단일 정제 단계에 의해 고순도 FIX-sFc를 효율적으로 생성함을 보여준다.
도 5는 상기 논의된 방법을 사용하여 생산된 FIX-sFc 융합 단백질이 SDS-PAGE에 의해 주요 밴드 (레인 1 및 2)를 나타냄을 보여준다. 인자 IX-sFc의 MW는 100-110 KDa이었고, 높은 글리코실화 함량이 과아이오딘산-쉬프 (PAS) 염색 방법에 의해 이중 SDS-PAGE 겔에서 제시되었다. 맙셀렉트 SuRe™ 및 IX셀렉트의 회수율은 각각 88.34% 및 20.05%이었다 (표 4). 단백질 A 기반 맙셀렉트 SuRe™ 칼럼 크로마토그래피는 FIX-sFc를 설계된 융합 단백질 FIX-sFc로부터 sFc의 예기치 않은 단백질 A/G 결합 특성으로 인해 도 5에 제시된 바와 같은 고수율 및 순도로 단일 단계에 의해 효율적으로 정제하였다.
실시예
9
FIX-
sFc에
대한 약동학 연구
바이오라스코 타이완 코., 엘티디.에서 8마리의 SD 래트 (체중: 315-375 g)를 구입하였다. 래트를 약동학 (PK) 연구를 위해 다음과 같이 2개의 군으로 무작위로 나누었다: (1) 참조 약물로서의 재조합 FIX (베네픽스®); 및 (2) 본 개시내용의 FIX-sFc. 군 (1) 및 (2)의 래트에게 제0일에 꼬리 정맥을 통해 1 mg/kg으로 투여하였다. 주사 후에, 래트를 시험 스케줄에 따라 주사 후 0, 0.25, 4, 8, 24, 48, 72, 96 및 168시간에 채혈하였다. 응고제 미함유 혈액 샘플을 실온에서 적어도 30분 동안 방치하고, 혈청을 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 단리하였다. 혈청 샘플을 분취하고, 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
1:1000 (1 μg/mL)의 희석된 포획 항체 (마우스 인자 IX 모노클로날 항체, 바이오포르토, 덴마크, Cat. HYB 133-09)를 카르보네이트/비카르보네이트 코팅 완충제를 사용하여 제조하였다. 완충제 캡슐 (시그마, Cat. # C-3041)을 100 mL ddH2O에 용해시켜 0.05 M 완충제 (pH 9.6)를 생성하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과하고, 4℃에서 보관하였다. 100 μl의 희석된 포획 항체를 ELISA 플레이트의 웰에 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이팅하였다. 200 μl의 차단 완충제 (2.0% BSA를 함유하는 PBS, pH 7.2)를 사용하여 플레이트를 차단하고, 200 μl의 PBS (PBS, pH 7.2)로 3회 세척하였다. 100 μl의 베네픽스® (100 ng/mL, 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12.5 ng/mL, 6.25 ng/mL, 3.125 ng/mL 및 1.5625 ng/mL) 및 상응하는 농도의 FIX-sFc를 각각의 ELISA 웰에 각각 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, ELISA 플레이트를 200 μl의 PBST (0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS)로 3회 세척하였다. 검출 항체 (토끼 인자 IX 폴리클로날 Ab, 압캠, (U.K.), Cat. Ab23335)를 1:1,000으로 PBST (0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS) 내에 희석하고, ELISA 플레이트에 첨가하였다. 인큐베이팅 후, ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. HRP 접합 항체 (퍼옥시다제-아피니퓨어 염소 항-토끼 Ab, 잭슨 이뮤노리서치, (USA), Cat.111-035-144) 및 TMB 퍼옥시다제 기질 (KPL, Cat.53-00-03)을 플레이트 내에 첨가하여 발색시켰다. 마지막으로, 100 μl의 1 N H2SO4를 사용하여 반응을 정지시켰다. 파장 450 nm 및 600 nm에서 희석된 혈청의 흡광도는 소프트맥스® 프로 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. FIX-sFc의 농도는 식 (X = [a/(Y-Y0)-1](1/b) x X0)에 의해 결정되었다. C 초기 값, AUC 값 및 소실기 반감기 (T1/ 2)는 PK 솔루션 2.0™ 소프트웨어를 사용하여 FIX-sFc의 농도에 의해 계산되었다.
단일 용량을 사용한 투여 후에 래트에서의 맙셀렉트 SuRe™ 및 베네픽스®로부터 정제된 FIX-sFc의 정맥 내 (I.V.) 약동학 프로파일을 도 7에 제시하고, 평균 약동학적 특징을 표 6에 제시한다. FIX-sFc 및 베네픽스®의 반감기는 각각 56.0±13.1 및 11.91±2.54 (hr)이었다. FIX-sFc 및 베네픽스®의 AUC는 각각 19080.3±2606.4 및 46594.40±3634.08 (ng-hr/mL)이었다. FIX-sFc 및 베네픽스®의 C 초기 값은 각각 4668.0±447.5 및 11790.98±4898.85 (ng/mL)이었다.
본 발명의 FIX-sFc의 반감기는 I.V. 투여된 래트에서 약 56시간이었고, 이것은 베네픽스®의 반감기(11.91±2.54시간)보다 5X 더 길다. 따라서, FIX-sFc는 혈우병 환자가 주사 빈도를 줄이고 환자의 삶의 질을 향상시키기 위해 오래 작용하는 약물이다. 약동학적 데이터는 본 발명의 FIX-sFc가 Fc 수용체에 결합됨으로써, C 초기 농도 및 AUC가 더 낮아지고 혈류 내로 서서히 다시 방출되어 그의 반감기가 길어지게 됨을 나타내었다.
실시예
10
FIX-
sFc의
생물학적 활성 검정
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 시험을 사용하여 FIX-sFc의 생물학적 활성을 측정하였다. 간단히 기재하면, 참조 약물 (베네픽스®, 와이어쓰 (Wyeth)) 및 FIX-sFc를 새로 준비하여 10, 5 및 2.5 μg/ml의 농도 (최종 부피 = 500 μL)로 인자 IX 결핍 혈장 (해마톨로직 테크놀로지스, 인크 (Haematologic Technologies, Inc))에 희석하였다. 샘플 (베네픽스® 또는 FIX-sFc)을 데이드(Dade)® 액틴(Actin)® FSL 시약 (지멘스 헬쓰케어 디아그노스틱스 프로덕츠 게엠베하 (Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH))과 같은 부피로 혼합하고, 37℃에서 3분 동안 인큐베이팅하였다. 마지막으로, CaCl2를 첨가하여 응고 반응을 정지시키고, 혈전의 형성을 관찰하였다. 응고 시간 및 비활성은 평행선 방법 (PLA 분석)에 의해 기록되고 계산되었다.
표 8에 제시된 바와 같이, 응고 시간은 베네픽스® 또는 FIX-sFc의 농도에 따라 달라졌다. 평균 APTT 결과는 각각 2.5, 5.0 및 10.0 μg/ml의 농도에서 FIX-sFc에 대해 30.1, 26.2 및 25.5초이었다. 표 8에 제시된 바와 같이, FIX-sFc는 베네픽스®와 비교하여 유사한 상대 효능 및 비활성을 보였다. FIX-sFc는 베네픽스®와 동등한 생물학적 활성을 유지하고, 이것은 단일 쇄 Fc가 융합 단백질에서 FIX의 기능을 방해하지 않는다는 것을 시사한다.
실시예
11
인터페론 알파 단일 쇄
Fc
융합 단백질 (
IFNα
-
sFc
)
1. 융합 단백질
본 실시예에서, 인터페론 알파 (IFNα)를 포함하는 융합 단백질을 제조한 후, 후속 실시예에서 사용하였다. IFNα는 IFNα 분자의 큰 패밀리의 대표적인 예이다.
구체적으로, 상기 논의된 화학식 1의 구조를 갖는 IFNα 단일 쇄 융합 단백질 (IFNα-sFc)을 제조하였다:
(B)-(힌지)-(CH2-CH3)
여기서
생물활성 분자 (B)는 인터페론 알파 (IFNα) 단백질 (서열식별번호: 69)이고;
힌지 영역 (힌지)은 돌연변이된 IgG1 힌지 (서열식별번호: 23)이고;
(CH2-CH3)은 IgG1의 CH2-CH3 (서열식별번호: 62)이다.
IFNα-sFc 융합 단백질의 전장 아미노산 서열은 서열식별번호: 70으로서 서열 목록에 제시된다.
2. 발현 벡터
IFNα-sFc는 DNA 발현 벡터를 사용하여 생산되었다. IFNα-sFc의 DNA 단편을 조립 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 방법에 의해 중첩 프라이머를 사용하여 조립하였다. 이어서, 조립된 IFNα-sFc 단편을 pZD 벡터 (pcDNA3.1Neo, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드, cat. no. V790-20 (dhfr 유전자 보유))의 PacI 및 EcoRV 부위에 라이게이팅하여 도 8에 제시된 바와 같은 pZD/IFNα-sFc를 수득한 후, 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 발현 벡터 구축물은 제오신-내성 유전자를 선택 마커로서 포함하였다.
실시예
12
IFNα
-
sFc를
생산하는 안정한 재조합 세포주의 확립
CHOdhfr - 세포를 트립신 처리하고, CP-T 완충제 (사이토 펄스 Cat. CP-T)에 3x106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 0.2 mL의 세포 현탁액 (6x105 세포)을 전기천공 (PA4000 펄스애질® 전기천공기, 사이토 펄스 사이언시스)에 의해 10 μg의 플라스미드 pZD/IFNα-sFc로 형질감염시켰다. 비-선택 배지에서 48시간 성장시킨 후, 고수율 클론 22-123-327-117-Re117을 얻기 위해 형질감염체를 IMDM, 10% 소 태아 혈청, 제오신 (인비트로겐 Cat. 1486406) 및 5 nM MTX (시그마 Cat. BCL5707V)를 함유하는 선택 완전 배지에서 인큐베이팅하였다. 배양 배지에 분비된 융합 단백질의 발현을 Q-ELISA에 의해 검출하고 정량하였다.
원래의 22-123-327-117-Re117 세포를 10% FBS, 제오신 및 0.1 μM MTX가 보충된 IMDM을 함유하는 10 cm 접시에서 배양하였다. 세포를 37℃ 가습 95% 공기/5% CO2 인큐베이터 (모델 3326, 포르마 사이언티픽)에서 유지하였다. 무혈청 배양 배지에서 세포를 적응시키기 위해, 배지를 IMDM으로부터 5% FBS, 제오신 및 0.1 μM MTX가 보충된 JRH 무혈청 배지로 교체하였다. 세포가 안정화되면, 세포를 트립신 처리에 의해 10 cm 접시에서 분리하고, 동일한 백분율의 FBS가 보충된 50 mL JRH 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 옮겼다. 융합도가 3-5일 내에 90%에 도달할 때, 세포를 보다 낮은 백분율의 FBS가 보충된 JRH 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 계대배양하였다. 세포를 스피너 플라스크에서 FBS 백분율을 10%로부터 0%로 단계적으로 감소시킴으로써 더 낮은 혈청 조건에 적응시켰다.
혈청 샘플에서 IFNα-sFc 융합 단백질의 농도를 사내 IFNα-sFc ELISA 키트에 의해 정량하였다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. 단일 쇄 Fc에 연결된 재조합 IFN 알파8을 포함하는 융합 단백질 (즉, IFNα-sFc)을 최종적으로 생산하기 위해 선택, 제한 희석 및 단계적 MTX 챌린지에 의해 고수율 클론을 성공적으로 수득하였다. 생성된 융합 단백질은 추가의 시험관 내 또는 생체 내 생물학적 활성 검정 및 약동학 연구를 위해 정제되었다.
실시예
13
IFNα
-
sFc의
크로마토그래피 정제
단백질 A 기반 수지 (맙셀렉트 SuRe™)를 사용하여 IFNα-sFc를 정제하였다. 정제 후, 상응하는 회수율을 정량적 ELISA에 의해 분석하고, 각각의 순도를 SDS-PAGE로 분석하였다. IFNα-sFc 융합 단백질에 대한 상세한 정제 공정은 아래에서 기재된다.
1. 맙셀렉트
SuRe
™ 정제
고수율 IFNα-sFc 생산 세포주의 배양 배지를 1 mL 수지에 대해 약 4.6 mg의 로딩 비율로 단백질 A 기반 맙셀렉트 SuRe™ 칼럼 (GE; Cat. no.: 11-0034-93)에 적용하였다. 2회 세척 단계 후에, 융합 단백질을 0.1 M 글리신 pH 3.0 용리 완충제로 용리시켰다. 주 피크는 용리 완충제에 의해 용리된다. 맙셀렉트 SuRe™ 용리액을 Q-ELISA에 의해 분석하여 양 및 회수율을 결정하였다.
2. 결과
IFNα-sFc는 다른 완충제 조건을 사용하여 맙셀렉트 SuRe™에 의해 정제하였다. 결과는 0.1 M 글리신 (pH 3.0) 용리 완충제가 IFNα-sFc를 물리화학적 특성을 추가로 결정하기 위해 고순도로 효율적으로 정제할 수 있음을 보여주었다. 정제된 IFNα-sFc 샘플의 용리액을 도 9에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE로 분석한 결과, 평가된 모든 완충제에서 정제된 IFNα-sFc가 주요 밴드로 제시되었다. 침전을 방지하기 위해 안정화 첨가제 (수크로스 또는 우레아)를 용리 완충제에 사용하였다. 우레아가 완충제에 첨가제로서 사용되었을 때, 약간의 저분자량 불순물이 나타났다. 수크로스 첨가제가 존재하는 글리신 용리 완충제 내의 IFNα-sFc의 순도는 >95%인 것으로 밝혀졌다.
실시예
14
IFNα
-
sFc에
대한 약동학 연구
바이오라스코 타이완 코., 엘티디.에서 8마리의 래트 (체중: 276-300 g)를 구입하였다. 모든 래트를 약동학 (PK) 연구를 시작하기 전에 4일 동안 격리하고 순응시켰다. 래트를 PK 연구를 위해 다음과 같이 4개의 시험 군으로 나누었다: (1) 페가시스® (PEG화 IFNα), (2) 본 개시내용의 IFNα-sFc, (3) Peg-인트론® (PEG화 IFNα), 및 (4) 로페론-A® (재조합 IFNα). 래트에게 페가시스®의 경우 18.6 μg/kg으로, IFNα-sFc의 경우 13.95 μg/kg으로, Peg-인트론®의 경우 9.7 μg/kg으로 및 로페론-A®의 경우 5.89 μg/kg으로 동등하게 전환된 310 pmol/kg을 투여하였다. 모든 제품은 포스페이트 완충 염수에 새로운 샘플 희석제인 0.2% 소 혈청 알부민 (애플리켐, CN: A0850,0250)으로 새로 준비하였다. 래트를 군으로 나누고, 퍼 염료로 표시하였다. 모든 주사는 피하 (S.C.) 경로를 위해 등쪽 목 부위를 통해 래트에게 수행되었다.
혈액 샘플을 주사 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120, 144, 192, 240, 288 및 336시간 후에 수집한 다음, 20분 동안 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 -70℃에서 보관하였다. 로페론-A®를 투여한 래트에 대해 주사 0.08, 0.25 및 8시간 후에 추가의 혈액 샘플을 수집하고 보관하였다.
혈청 샘플의 인터페론 농도를 ELISA 방법에 의해 정량하였다. 검정을 수행하기 전에, 혈청 희석 배수를 최적화하고, 플레이트를 표준물질, 대조군 및 검체에 대해 레이아웃하였다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. 혈청 내의 IFN 농도로부터 Cmax, Tmax, AUC 값 및 소실기 반감기 (T1/2)를 PK 솔루션즈 2.0™ 소프트웨어로 계산하였다.
단일 용량 투여 후의 상이한 처리군의 피하 (S.C.) 약동학 프로파일을 도 10에 제시하고, 그의 평균 약동학적 특성은 표 9에 제시한다. 페가시스®, IFNα-sFc, Peg-인트론® 및 로페론-A®의 반감기는 각각 23.2, 50.2, 20.8 및 0.73시간이었다. 페가시스®, IFNα-sFc, Peg-인트론® 및 로페론-A®의 AUC는 각각 64694.5, 60621.9, 5307.6 및 489.2 pM/h이었다. 페가시스®, IFNα-sFc, Peg-인트론® 및 로페론-A®의 Tmax는 각각 32.0, 32.0, 6.0 및 0.67시간이었다.
로페론-A®는 1세대 재조합 IFNα 제품이다. 페가시스® 및 Peg-인트론®은 둘 다 PEG (폴리에틸렌 글리콜)가 천연 IFNα에 커플링된 IFNα의 2세대 제품이다. PEG의 포함은 이전에 비-PEG화 형태에 비해 IFNα의 반감기를 현저히 연장하는 것으로 나타났다. PEG에 의한 반감기의 증가는 표 9 및 도 10에 보고된 약동학 데이터에 나타난 바와 같이, 본 실시예에서도 관찰되었다 (페가시스® 및 Peg-인트론®의 데이터와 로페론-A®의 데이터를 비교).
표 9 및 도 10은 또한 본 개시내용의 단일 쇄 Fc 융합 단백질에 존재할 때, 페가시스®, Peg-인트론® 및 로페론-A®에 비해 IFNα의 반감기가 훨씬 더 연장됨을 보여준다. 특히, IFNα-sFc의 반감기는 PEG화된 2개의 인터페론 (페가시스® 및 Peg-인트론®)보다 2배 초과로 더 길고, 재조합 IFNα (로페론-A®)보다 68배 초과로 더 길다.
실시예
15
IFNα
-
sFc의
생물학적 활성 검정
IFN의 항바이러스 활성은 세포 병변 효과 (CPE) 억제 검정에 의해 결정되었다. 간단히 기재하면, 96-웰 플레이트의 웰에 1.0 x 104 A549 세포를 씨딩하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포 성장이 융합 단층을 형성할 때, 세포를 다양한 농도 및 형태의 IFNα로 처리하였다. IFN의 5배 단계 희석액을 178 ng/mL의 농도로 출발하여 제조하였다. 웰에 첨가된 IFN의 최종 부피는 100 μl이었다. 24시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 6 x 104 PFU/mL의 역가에서 뮤린 뇌심근염 바이러스 (EMCV)로 감염시키고, 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포 병변 효과 (CPE)는 임의의 인터페론이 없는 바이러스 대조군 웰에서 관찰되었다. 20 μl의 MTS 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이팅하였다. 염색된 세포를 자동 플레이트 판독기에서 OD 490 nm에서 분광광도계로 분석하였다. 모든 검정은 3회 수행하였고, 총 평균을 계산하였다.
IFN의 각각의 농도에서 바이러스 CPE의 억제 백분율은 하기 식을 사용하여 계산되었다:
"억제 (%) = (OD 시험 웰 - OD 바이러스 대조군)/(OD 세포 대조군 - OD 바이러스 대조군)"
4-파라미터 로지스틱 곡선 및 50% 바이러스 복제 억제 용량 둘 다는 시그마 플롯 (Sigma Plot) 소프트웨어에 의해 계산되었다.
또한, IFNα-sFc (단일 쇄)의 항바이러스 활성을 IFNα-Fc (이량체)와 비교하고, 그 결과를 도 11 및 표 10에 제시한다. IFNα-sFc의 항바이러스 활성 (IC50 = 0.0061 nm)은 IFN-α-Fc (IC50 = 0.0313 nM)보다 5.1배 더 높았고, IFN-페가시스® (IC50 = 0.0894)보다 14.7배 더 높았다.
요약
실시예 14 및 15에서 수득된 결과는 본 개시내용의 IFNα 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNα-sFc)이 (1) 단백질 A 크로마토그래피를 통한 정제 수율 증가에 의한 생산 비용의 감소, (2) 항바이러스 활성의 증진, (3) 혈청 반감기의 연장, 및 이에 다른 투여 빈도의 감소, 및 (4) 신장 청소율 (renal clearance)의 감소를 포함하는, 다른 IFNα 제품에 비해 생물학적 특성 및 이점이 개선되었음을 입증한다. 전통적인 이량체화된 Fc 융합 단백질 (IFNα-Fc) 및 페가시스®의 반감기가 로페론-A®에 비해 연장되었지만, 그들의 생물학적 활성은 IFNα-sFc보다 낮았다. IFNα-Fc 및 페가시스®에서 관찰되는 보다 낮은 생물학적 활성은 적어도 부분적으로는 더 큰 융합 분자 (즉, IFNα-Fc 내의 Fc 이량체 및 페가시스® 내의 분지된 40 kDa PEG)와의 수용체 결합의 입체 방해에 의해 야기되는 것으로 보인다.
도 10-11 및 표 9-10에 제시된 결과는 본 개시내용의 단일 쇄 Fc 변형이 다른 형태의 IFNα와 비교하여 연장된 반감기 및 향상된 생물학적 활성을 갖는 IFNα를 생성한다는 것을 입증한다. 이러한 결과는 본 발명의 변형이 펩티드 및 단백질 기반 치료제를 함유하는 매우 강력하고 효율적인 제약 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예
16
인터페론 알파 수용체 1 (
IFNAR1
) 및 인터페론 알파 수용체 2 (
IFNAR2
)에 대한 IFNα-sFc (단일 쇄) 및 IFNα-Fc (이량체)의 각각의 결합 친화도의 비교
인터페론 융합 단백질의 결합 친화도는 동역학/친화도 검정에 의해 결정되었다.
간단히 기재하면, 5 μg/mL rhIFN 알파 수용체 2 (IFNAR2) (시노 바이오테크놀로지 (Sino biotechnology), CN.: 10359-H08H)를 고정 완충제 (10 mM 아세트산나트륨 완충제, pH 4.0) 내에서 제조하였다. rhIFNAR2 (RL = 800 RU)는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기기 (GE, 모델: 비아코어(Biacore) X100)에서 통상적인 아민 커플링을 통해 CM5 센서 칩 (GE, CN.: BR-1003-99)에 고정하였다. 12.5 내지 200 nM IFNα-sFc 또는 IFNα-Fc를 함유하는 샘플 용액을 이동 완충제 (0.005% 트윈 20을 함유하는 PBS, pH 7.4)로 2배 연속 희석에 의해 제조하였다. 이전 단계에서 제조된 이동 완충제로 2배 연속 희석하여 6.25 내지 100 nM IFNα-sFc 또는 IFNα-Fc 단일 주사 용액을 제조하였다. 이어서, 200 nM IFN-알파 수용체 1 (IFNAR1) (시노 바이오테크놀로지, CN.: 13222-H08H) 용액을 이전 단계에서 제조된 동일 부피의 IFN 단일 주사 용액과 혼합하여 IFN-IFNAR1 혼합물을 제조하였다. IFNAR1의 농도는 100 nM인 반면, IFNα-sFc 또는 IFNα-Fc의 농도는 6.25 nM 내지 100 nM이었다. IFNα-sFc 또는 IFNα-Fc의 평형 회합 상수 (Ka) 및 평형 해리 상수 (Kd) 값을 BIAevaluation 소프트웨어에 의해 분석하여 Kd 및 Ka에 의해 결합 상수 (KD) 값을 계산하였다.
도 12a-도 12b에 나타낸 바와 같이, IFNα-sFc--IFNAR1 및 IFNα-Fc--IFNAR1은 유사한 결합 프로파일을 가졌다. 특히, 표 11은 IFNα-sFc의 Ka가 1.4E+06 1/Ms이고 IFNα-Fc의 Ka는 3.3E+06 1/Ms로서, IFN의 결합 회합성이 상대적으로 유사함을 보여준다. 그러나, 해리 단계에서, IFNα-sFc--IFNAR1은 IFNα-Fc--IFNAR1보다 더 느린 해리 프로파일 (Kd)을 가졌다. 표 11에 나타낸 바와 같이, IFNAR1로부터 IFNα-sFc와 IFNα-Fc의 해리 (Kd)는 각각 5.6E-03 및 5.6E-02 1/s이었다. IFNAR에 대한 IFNα-sFc 및 IFNα-Fc의 상호작용 (KD)의 친화도는 관찰된 회합 (Ka) 및 해리 (Kd) 프로파일에 기초하여 각각 4.0E-09 및 1.7E-08 nM로 결정되었다. 따라서, IFNα-sFc의 친화도는 3원 복합체 형성을 위한 IFNα-Fc보다 4.25배 더 높았다.
본 실시예에서 관찰된 결합 친화도 결과는 IFNα-sFc가 IFNα-Fc와 비교하여 향상된 생물학적 활성을 갖고 이것은 Fc 이량체에 비해 단일 쇄 Fc에 대한 수용체 결합에서 입체 방해가 작기 때문일 가능성이 있다는 이전의 실시예에서 논의된 이론을 추가로 지지한다.
실시예
17
과립구-
콜로니
자극 인자 단일 쇄
Fc
융합 단백질 (
GCSF
-
sFc
)
1. 융합 단백질
본 실시예에서, 상기 논의된 화학식 1의 구조를 갖는 융합 단백질을 제조하였다:
(B)-(힌지)-(CH2-CH3)
여기서
생물활성 분자 (B)는 과립구-콜로니 자극 인자 (GCSF) 단백질 (서열식별번호: 71)이고;
힌지 영역 (힌지)은 돌연변이된 IgG1 힌지 (서열식별번호: 23)이고;
(CH2-CH3)은 IgG1의 CH2-CH3 (서열식별번호: 72)이다.
GCSF-sFc 융합 단백질의 전장 아미노산 서열은 서열식별번호: 72로서 서열 목록에 제시된다.
2. 발현 벡터
GCSF-sFc는 DNA 발현 벡터를 사용하여 생산되었다. 과립구-콜로니 자극 인자 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (GCSF-sFc)의 DNA 단편을 조립 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 방법에 의해 중첩 프라이머를 사용하여 조립하였다. 이어서, GCSF-sFc 단편을 pZD 벡터 (pcDNA3.1Neo, 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스바드), cat. no. V790-20 (dhfr 유전자 보유))의 PacI 및 EcoRV 부위에 라이게이팅하여 도 13에 제시된 바와 같은 pZD-GCSF-sFc를 수득한 후, 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 발현 벡터 구축물은 제오신-내성 유전자를 선택 마커로서 포함하였다.
실시예
18
GCSF
-
sFc를
생산하는 안정한 재조합 세포주의 확립
CHOdhfr - 세포를 트립신 처리하고, CP-T 완충제 (사이토 펄스 Cat. CP-T)에 3x106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 0.2 mL의 세포 현탁액 (6x105 세포)을 전기천공 (PA4000 펄스애질® 전기천공기, 사이토 펄스 사이언시스)에 의해 10 μg의 플라스미드 pZD-GCSF-sFc로 형질감염시켰다. 비-선택 배지에서 48시간 성장시킨 후, 고수율 클론 zG3-17-41을 얻기 위해 형질감염체를 IMDM, 10% 소 태아 혈청, 제오신 (인비트로겐 Cat. 1486406) 및 5 nM MTX (시그마 Cat. BCL5707V)를 함유하는 선택 완전 배지에서 인큐베이팅하였다. 배양 배지에 분비된 융합 단백질의 발현을 Q-ELISA에 의해 검출하고 정량하였다.
원래의 zG3-17-41 세포를 10% FBS, 제오신 및 0.1 μM MTX가 보충된 IMDM을 함유하는 10 cm 접시에서 배양하였다. 세포를 37℃ 가습 95% 공기/5% CO2 인큐베이터 (모델 3326, 포르마 사이언티픽)에서 유지하였다. 무혈청 배양 배지에서 세포를 적응시키기 위해, 배지를 IMDM으로부터 5% FBS, 제오신 및 0.1 μM MTX가 보충된 JRH 무혈청 배지로 교체하였다. 세포가 안정화되면, 세포를 트립신 처리에 의해 10 cm 접시에서 분리하고, 동일한 백분율의 FBS가 보충된 50 mL JRH 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 옮겼다. 세포를 스피너 플라스크에서 FBS 백분율을 10%로부터 0%로 단계적으로 감소시킴으로써 더 낮은 혈청 조건에 적응시켰다.
혈청 샘플에서 GCSF-sFc 융합 단백질의 농도를 GCSF-sFc ELISA 분석에 의해 정량하였다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. 단일 쇄 Fc에 연결된 재조합 GCSF를 포함하는 융합 단백질 (즉, GCSF-sFc)을 최종적으로 생산하기 위해 선택, 제한 희석 및 단계적 MTX 챌린지에 의해 고수율 클론을 성공적으로 수득하였다. 생성된 융합 단백질은 추가의 시험관 내 또는 생체 내 생물학적 활성 검정 및 약동학 연구를 위해 정제되었다.
실시예
19
GCSF
-
sFc의
크로마토그래피 정제
단백질 A 기반 수지 (맙셀렉트 SuRe™)를 사용하여 GCSF-sFc를 정제하였다. 정제 후, 상응하는 회수율을 정량적 ELISA에 의해 분석하고, 각각의 순도를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. GCSF-sFc 융합 단백질에 대한 상세한 정제 공정은 아래에서 기재된다.
맙셀렉트
SuRe
™ 정제
고수율 GCSF-sFc 생산 세포주의 배양 배지를 1 mL 수지에 대해 약 3.4 mg의 로딩 비율로 단백질 A 기반 맙셀렉트 SuRe™ 칼럼 (GE; Cat. No.: 11-0034-93)에 적용하였다. 2회 세척 단계 후에, 융합 단백질을 0.1 M 글리신 pH 3.0 용리 완충제로 용리시켰다. 용리된 주 피크는 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 분석하였다. 또한, 맙셀렉트 SuRe™ 용리액을 Q-ELISA에 의해 분석하여 양 및 회수율을 결정하였다. 또한, 정제된 GCSF-sFc 샘플의 용리액을 SDS-PAGE로 분석하였다. 도 14는 GCSF-sFc 융합 단백질이 SDS-PAGE에 의해 주요 밴드로 제시됨을 보여준다. 요약하면, GCSF-sFc는 맙셀렉트 SuRe™에 의해 효율적으로 포획될 수 있다.
실시예
20
GCSF
-
sFc에
대한 약동학 연구
바이오라스코 타이완 코., 엘티디.에서 9마리의 래트 (체중: 180-200 g)를 구입하였다. 모든 래트를 약동학 (PK) 연구를 시작하기 전에 4일 동안 격리하고 순응시켰다. 래트를 PK 연구를 위해 다음과 같이 3개의 시험 군으로 나누었다: (1) GCSF-sFc, (2) 재조합 GCSF인 레노그라스팀 (그라노사이트®), 및 (3) 재조합 인간 GCSF의 PEG화 형태인 Peg-필그라스팀 (뉴라스타®). 래트에게 GCSF-sFc의 경우 221.43 μg/Kg 및 레노그라스팀 및 Peg-필그라스팀의 경우 100 μg/Kg의 몰 동등량을 투여하였다. 모든 GCSF 제품은 포스페이트 완충 염수에 샘플 희석제인 0.2% 소 혈청 알부민 (애플리켐, CN: A0850,0250)으로 새로 준비하였다. 래트를 군으로 나누고, 퍼 염료로 표시하였다. 모든 주사는 피하 (S.C.) 경로를 위해 등쪽 목 부위를 통해 래트에게 수행되었다.
혈액 샘플을 주사 5분, 0.5, 1, 2, 3, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 및 168시간 후에 수집한 다음, 20분 동안 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 -70℃에서 보관하였다.
혈청 샘플의 GCSF 농도는 GCSF에 결합하고 이를 검출하기 위해 쌍형성된 항체 (알&디 시스템, CN: MAB214 및 알&디 시스템, CN: BAF214)를 사용하는 ELISA 방법에 의해 정량하였다. 검정을 수행하기 전에, 혈청 희석 배수를 최적화하고, 플레이트를 표준물질, 대조군 및 검체에 대해 레이아웃하였다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. 혈청 내의 GCSF 농도로부터 Cmax, Tmax, AUC 값 및 소실기 반감기 (T1/ 2)를 PK 솔루션즈 2.0™ 소프트웨어로 계산하였다.
단일 용량 투여 후의 래트에서의 각각의 GCSF의 피하 (S.C.) 약동학 프로파일을 도 15에 제시하고, 그의 평균 약동학적 특성은 표 12에 제시한다. GCSF-sFc, 레노그라스팀 및 Peg-필그라스팀의 반감기는 17.16, 4.1 및 12.0시간이었다. GCSF-sFc, 레노그라스팀 및 Peg-필그라스팀의 Cmax는 각각 906.9, 156.4 및 480.8 ng/mL이었다. GCSF-sFc, 레노그라스팀 및 Peg-필그라스팀의 Tmax는 각각 48, 0.5 및 10.3시간이었다. GCSF-sFc, 레노그라스팀 및 Peg-필그라스팀의 AUC는 각각 50624, 790-1292 및 23202 ±2921 ng-h/mL이었다.
레노그라스팀은 1세대 재조합 GCSF 제품이다. Peg-필그라스팀은 PEG (폴리에틸렌 글리콜)에 커플링된 GCSF의 2세대 제품이다. PEG의 포함은 1세대 제품 (레노그라스팀)에 비해 GCSF의 반감기를 연장하는 것으로 나타났다. PEG에 의한 GCSF 반감기의 증가는 표 12 및 도 15에 보고된 약동학 데이터에 나타난 바와 같이, 본 실시예에서도 관찰되었다 (레노그라스팀의 데이터와 Peg-필그라스팀의 데이터를 비교).
표 12 및 도 15는 또한 GCSF가 본 개시내용의 단일 쇄 Fc 융합 단백질에 존재할 때, 레노그라스팀 및 Peg-필그라스팀에 비해 GCSF의 반감기가 훨씬 더 연장됨을 보여준다. 특히, GCSF-sFc의 반감기는 PEG화된 GCSF (Peg-필그라스팀)보다 거의 1.5배 더 길고 재조합 GCSF (레노그라스팀)보다 4배 초과로 더 길다.
실시예
21
GCSF
-
sFc의
생물학적 활성 검정
호중구 감소성 마우스를 사용하여 천연 GCSF, 즉 레노그라스팀 (그라노사이트®)과 비교하여 GCSF 효능을 분석하였다. 본 연구에서, 6주령의 BALB/cByJNarl 수컷 마우스 30마리를 6개의 군 (군당 5마리의 마우스)으로 나누었다. 모든 마우스를 제0일에 CPA (시클로포스파미드 일수화물; 시그마, CN.: C7397) (100 mg/kg)로 처리하였다. 대조군으로서의 군 A에게 제1일에 0.9 % NaCl/0.1 % BSA 용액만을 투여하였다. 3개의 참조군은 레노그라스팀 (추가이 (Chugai), CN.: N3L212)을 각각 51.02, 116.07 및 12.75 μM/kg의 용량을 포함하는 단일 샷 (군 B1 및 B2) 또는 4회 샷 (군 B3)로 투여하였다. 2개의 시험군은 51.02 μM/kg (군 C1) 및 116.07 μM/kg (군 C2)의 용량을 함유하는 GCSF-sFc를 단일 샷으로 투여하였다. 단일 샷을 실시한 군 (군 A, B1, B2, C1, 및 C2)은 제1일에 주사하고, 4회 샷을 실시한 군 (군 B3)은 제1, 2, 3 및 4일에 주사하였다. 모든 샷은 피하 주사 경로를 통해 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 후 각각의 날에 수집하고, 연구가 끝날 때까지 혈액분석기 (HEMAVET 950 LV)에 의해 분석하였다. 참조를 위해 CPA 처리 3일 전 (제-3일)에 혈액 샘플을 채취하였다. 본 연구에서 사용된 실험 설계는 표 13에 요약되어 있다.
도 16은 CPA로 마우스를 전처리하면 호중구 감소가 발생함을, 즉 처리된 마우스의 혈액에서 호중구 수를 감소시킴을 보여준다 (모든 샘플에서 제-3일 및 제0일을 제1일과 비교). 그러나, 호중구 감소증은 일시적인 것으로 밝혀졌고, 호중구의 수준은 대조군에서 약 8일 후에 CPA 처리 이전의 수준으로 서서히 되돌아갔다 (군 A의 결과 참조). 제1일에 레노그라스팀의 중간 용량 51.02 μM/Kg (군 B1) 또는 고용량 116.07 μM/Kg (군 B2)의 단일 샷은 관찰 기간 동안 CPA 대조군에서 관찰된 수준을 초과하도록 호중구 수치를 증가시키는 데 임의의 평가가능한 효과를 보이지 않는다 (군 B1 및 군 B2를 군 A와 비교). CPA 처리 (군 B3) 후에 레노그라스팀의 다중 투여 (4회 샷)는 군 A, B1 및 B2에 비해 호중구 수준 증가에 대해 일부 효과를 보였다 (군 B3, 제3-5일 참조). 그러나, 호중구 수치가 정상 범위를 겨우 넘어서 상승하고 수준이 다중 투여 기간 후에 정상 수준으로 빠르게 감소하기 때문에, 관찰된 효과는 최소이고 단기간 지속되었다 (군 B3, 제5일 이하 참조).
이와 대조적으로, CPA 처리 후 중간 용량 (51.02 μM/Kg) 또는 고용량 (116.07μM/kg)의 GCSF-sFc의 단일 투여는 대조군 및 레노그라스팀으로 처리된 모든 군보다 호중구 수준을 유의하게 상승시켰다 (군 C1 및 C2와 군 A, B1, B2, B3을 비교).
따라서, 본 개시내용의 GCSF 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (GCSF-sFc)은 보다 긴 반감기를 갖고, 천연 및 PEG화 형태의 GCSF에 비해 호중구 감소 동물 질환 모델에서 호중구 분화 및 증식을 향상시킬 때 보다 강력하고 효율적이다.
실시예
22
인터페론 베타 단일 쇄
Fc
융합 단백질 (
IFNβ
-
sFc
)
1. 융합 단백질
본 실시예에서, 상기 논의된 화학식 1의 구조를 갖는 융합 단백질을 제조하였다:
(B)-(힌지)-(CH2-CH3)
여기서
생물활성 분자 (B)는 인터페론 베타 (IFNβ) 단백질 (서열식별번호: 73)이고;
힌지 영역 (힌지)은 돌연변이된 IgG1 힌지 (서열식별번호: 23)이고;
(CH2-CH3)은 IgG1의 CH2-CH3 (서열식별번호: 63)이다.
IFNβ-sFc 융합 단백질의 전장 아미노산 서열은 서열식별번호: 74로서 서열 목록에 제시된다.
2. 발현 벡터
IFNβ-sFc는 DNA 발현 벡터를 사용하여 생산되었다. IFNβ-sFc의 DNA 단편을 조립 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 방법에 의해 중첩 프라이머를 사용하여 조립하였다. 이어서, 조립된 IFNβ-sFc 단편을 pZD 벡터 (pcDNA3.1Neo, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드, cat. no. V790-20 (dhfr 유전자 보유))의 PacI 및 EcoRV 부위에 라이게이팅하여 도 17에 제시된 바와 같은 pZD/IFNb-sFc를 수득한 후, 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 발현 벡터 구축물은 제오신-내성 유전자를 선택 마커로서 포함하였다.
실시예
23
IFNβ
-
sFc를
생산하는 안정한 재조합 세포주의 확립
CHOdhfr - 세포를 트립신 처리하고, CP-T 완충제 (사이토 펄스 Cat. CP-T)에 3x106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 0.2 mL의 세포 현탁액 (6x105 세포)을 전기천공 (PA4000 펄스애질® 전기천공기, 사이토 펄스 사이언시스)에 의해 10 μg의 플라스미드 pZD-IFNβ-sFc로 형질감염시켰다. 비-선택 배지에서 48시간 성장시킨 후, 고수율 클론 zG3-17-41을 얻기 위해 형질감염체를 IMDM, 10% 소 태아 혈청, 제오신 (인비트로겐 Cat. 1486406) 및 5 nM MTX (시그마 Cat. BCL5707V)를 함유하는 선택 완전 배지에서 인큐베이팅하였다. 배양 배지에 분비된 융합 단백질의 발현을 Q-ELISA에 의해 검출하고 정량하였다.
원래의 Z-BsFc 세포를 10% FBS, 제오신 및 0.1 μM MTX가 보충된 IMDM을 함유하는 10 cm 접시에서 배양하였다. 세포를 37℃ 가습 95% 공기/5% CO2 인큐베이터 (모델 3326, 포르마 사이언티픽)에서 유지하였다. 무혈청 배양 배지에서 세포를 적응시키기 위해, 배지를 IMDM으로부터 5% FBS, 제오신 및 0.1 μM MTX가 보충된 JRH 무혈청 배지로 교체하였다. 세포가 안정화되면, 세포를 트립신 처리에 의해 10 cm 접시에서 분리하고, 동일한 백분율의 FBS가 보충된 50 mL JRH 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 옮겼다. 융합도가 3-5일 내에 90%에 도달할 때, 세포를 보다 낮은 백분율의 FBS가 보충된 JRH 무혈청 배지를 함유하는 스피너 플라스크로 계대배양하였다. 세포를 스피너 플라스크에서 FBS 백분율을 10%로부터 0%로 단계적으로 감소시킴으로써 더 낮은 혈청 조건에 적응시켰다.
혈청 샘플에서 IFNβ-sFc 융합 단백질의 농도를 사내 IFNβ-sFc ELISA 키트에 의해 정량하였다. 혈청 희석 배수를 최적화하고, 표준물질, 대조군 및 검체에 대한 플레이트 레이아웃을 결정한 후, 융합 단백질을 사용하여 공식적인 검정을 수행하였다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 (Pro) 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. 단일 쇄 Fc에 연결된 재조합 IFN 베타 (즉, IFNβ-sFc)를 포함하는 융합 단백질을 최종적으로 생산하기 위해, 선택, 제한 희석 및 단계적인 MTX 챌린지에 의해 고수율 클론을 성공적으로 수득하였다. 생성된 융합 단백질은 추가의 시험관 내 또는 생체 내 생물학적 활성 검정 및 약동학 연구를 위해 정제되었다.
실시예
24
IFNβ
-
sFc의
크로마토그래피 정제
단백질 A 기반 수지 (맙셀렉트 SuRe™)를 사용하여 IFNβ-sFc를 정제하였다. 정제 후, 상응하는 회수율을 정량적 ELISA에 의해 분석하고, 각각의 순도를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. IFNβ-sFc 융합 단백질에 대한 상세한 정제 공정은 아래에서 기재된다.
맙셀렉트
SuRe
™ 정제
고수율 IFNβ-sFc 생산 세포주의 배양 배지를 1 mL 수지에 대해 약 1.58 mg의 로딩 비율로 단백질 A 기반 맙셀렉트 SuRe™ 칼럼 (GE; Cat. no.: 11-0034-93)에 적용하였다. 2회 세척 단계 후에, 융합 단백질을 0.1 M 글리신 pH 3.0 용리 완충제로 용리시켰다. 맙셀렉트 SuRe™ 칼럼으로부터의 주 피크에 용리된 단백질을 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 관찰된 예리한 피크 및와 SDS-PAGE (데이터 미제시)에 의해 얻은 예리한 밴드를 기초로 하여 분석하여 상대적으로 순수한 것으로 밝혀졌다. 또한, 맙셀렉트 SuRe™ 용리액을 Q-ELISA에 의해 분석하여 표 14에 제시된 양 및 회수율을 결정하였다.
실시예
25
IFNβ
-
sFc에
대한 약동학 연구
바이오라스코 타이완 코., 엘티디.에서 8마리의 루이스 래트 (체중: 200-230 g)를 구입하였다. 모든 래트를 약동학 (PK) 연구를 시작하기 전에 4일 동안 격리하고 순응시켰다. 래트를 PK 연구를 위해 다음과 같이 2개의 시험 군으로 나누었다: (1) 천연 섬유모세포 유래 인간 IFNβ-1a (레비프®) 및 (2) IFNβ-sFc. 래트에게 레비프® 및 IFNβ-sFc를 37 μg/Kg의 용량으로 래트에게 투여하였다. 모든 제품은 포스페이트 완충 염수에 샘플 희석제인 0.2% 소 혈청 알부민 (애플리켐, CN: A0850,0250)으로 새로 준비하였다. 래트를 군으로 나누고, 퍼 염료로 표시하였다. 모든 주사는 피하 (S.C.) 경로를 위해 등쪽 목 부위를 통해 래트에게 수행되었다.
혈액 샘플을 주사 5분, 0.5, 1, 4, 7, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 및 168시간 후에 수집한 다음, 20분 동안 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 -70℃에서 보관하였다.
혈청 샘플 내의 인터페론 농도는 IFNβ에 대해 베리킨(VeriKine)™ 인간 IFN 베타 ELISA 키트 (PBL 어세이 사이언스 (PBL assay science), CN.: 41410)에 의해 정량되었다. 파장 450 nm 및 600 nm에서의 흡광도는 소프트맥스® 프로 5 소프트웨어에 의해 획득되었다. 혈청 내의 인터페론 농도로부터 Cmax, Tmax, AUC 값 및 소실기 반감기 (T1/2)를 PK 솔루션즈 2.0™ 소프트웨어로 계산하였다.
단일 용량 투여 후의 래트에서의 IFNβ의 피하 (S.C.) 약동학 프로파일을 도 18에 제시하고, 그의 평균 약동학적 특성은 표 15에 제시한다. 레비프® 및 IFNβ-sFc의 반감기는 각각 18.92-23.57 및 31.89-37.7시간이었다. 레비프® 및 IFNβ-sFc의 Cmax는 각각 3.2±0.71 및 6.55±0.78 ng/mL이었다. 레비프® 및 IFNβ-sFc의 Tmax는 각각 12±0 및 9.55±3.61시간이었다. 레비프® 및 IFNβ-sFc의 AUC는 각각 115±18.38 및 273±2.83 ng-hr/mL이었다.
본 발명의 IFNβ-sFc는 레비프® (천연 형태의 IFNβ)와 비교하여 도 18 및 표 15에 제시된 바와 같이 반감기 연장의 개선을 보였다.
실시예
26
IFNβ
-
sFc의
생물학적 활성 검정
IFNβ는 항염증성 시토카인이며, 다발성 경화증 (MS) 치료를 위한 주요 약물 중의 하나이다. MS는 중추 신경계의 가장 흔한 염증성 질환이다. 면역 세포는 혈액 뇌 장벽을 가로질러 미엘린을 공격하고, 이를 통해 MS 환자의 신경계에서 비효율적인 신호 전달을 유도한다. MS의 재발을 제어하기 위해서 IFNβ 약물을 1주일에 수회 주사하는 것이 필요하다. MS에 대한 IFNβ의 항염증 메커니즘은 미엘린 수초의 요소에 대한 T 세포 반응에서 Th1로부터의 Th2로의 사이토킨 밸런스의 변화를 포함하는 것으로 보고되었다. Th1 및 Th2 군에 더하여, 오스테오폰틴 (OPN)을 포함한 2개의 다른 중요한 전염증성 시토카인이 MS의 발병에 있어서의 CNS 염증에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. IFNβ는 PBMC 유래의 1차 T 세포에서 OPN의 생성을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 억제는 CD4+ T 세포 수준에서 일어난다.
본 연구에서, 오스테오폰틴 억제 검정으로 IFNβ-sFc의 생물학적 활성을 평가하였고, 그의 활성을 천연 IFNβ-1a (레비프®)와 비교하였다. 간단히 기재하면, 오스테오폰틴 억제 검정은 다음과 같이 수행되었다:
인간 PBMC를 전혈로부터 단리하였다. PBMC 자극을 위해, 96-웰 평저 조직 배양 플레이트를 웰당 1 μg/mL 농도의 항-CD3 항체 100 μl로 미리 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 각각의 웰을 200 μl RPMI 1640 (FBS 함유)로 세척하고, 5 x 104 세포를 씨딩하였다. 개개의 웰을 1 μg/mL의 항-CD28 항체, IFNβ-sFc (1.5 또는 10 ng/mL) 또는 레비프® (1.5 또는 10 ng/mL)로 처리하고, 플레이트를 48시간 동안 37℃에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 각각의 웰의 상청액을 수거하여 -70℃의 냉동고에 보관하였다. 인간 오스테오폰틴 (OPN)의 양은 ELISA (알&디 시스템즈, CN.: DOST00)에 의해 측정되었다.
각각의 샘플 내의 OPN 농도는 다음과 같이 계산하였다: x-축에 OPN을, y-축에 흡광도 (OD450-OD570)를 제시한 별개의 표준 곡선을 플로팅하고, 피트 선(fit line)을 4-파라미터 로지스틱 식을 사용하여 그렸다. 이어서, 문헌 [Chen M. et al. "Regulatory effects of IFN-β on production of osteopontin and IL-17 by CD4+ T Cells in MS" Eur . J. Immunol. 39, 2525-2536 (2009)]에 기재된 바와 같이, 다음 식을 사용하여 OPN 농도를 계산하였다: X = X0 x {[a/(Y-Y0)-1]^(1/b)}.
도 19에 제시된 바와 같이, 본 개시내용의 단일 쇄 Fc 융합 단백질 (IFNβ-sFc)은 1.5 ng/mL (73.4±0.8%) 및 10 ng/mL (79.5±3.6%)의 시험 제품으로 처리된 세포에서 OPN 생산을 유의하게 억제하였다. 참조 제품 (레비프®)으로 처리한 세포는 1.5 ng/mL (88.4±2.7%) 및 10 ng/mL (81.3±13.3%)에서 OPN의 유사한 억제를 보였다. 이러한 결과는 IFNβ-sFc가 천연 IFNβ의 생물학적 활성과 대등한 생물학적 활성을 갖기 때문에 단일 쇄 Fc의 포함은 융합 단백질의 IFNβ 부분이 그의 수용체에 효율적으로 결합하는 능력을 현저하게 방해하지 않는다는 것을 시사한다.
표 1
돌연변이된 힌지 영역의 예
X : Ser, Gly, Thr, Ala, Val, Leu, Ile, Met, 및/또는 결실
표 2
IgG1로부터
유래된
돌연변이된
힌지
영역의 아미노산 서열의 예
1 밑줄로 표시된 잔기는 야생형 IgG의 서열과 관련하여 돌연변이 부위를 나타낸다.
표 3
단백질 A 수지 (맙셀렉트
SuRe
™) 및
DEAE
수지 (
DEAE
FF) 크로마토그래피
칼럼에
의한 EPO-sFc의 정제
표 4
단백질 A 수지 (맙셀렉트
SuRe
™) 및
IX셀렉트
수지 크로마토그래피
칼럼에
의한 FIX-
sFc의
정제
표 5
재조합 EPO (
에프렉스
®) 및
DEAE
FF로부터 정제된 EPO-
sFc의
약동학적 특징
값은 평균 ± S.D. (CV)를 나타낸다.
* 에프렉스®에 비해, P<0.05
표 6
재조합 FIX (
베네픽스
®) 및 맙셀렉트
SuRe
™
로부터
정제된 FIX-
sFc의
약동학적 특징
값은 평균 ± S.D. (I.V.)를 나타낸다.
표 7
재조합 EPO (
에프렉스
®)와 EPO-
sFc
사이의 효능 비교
표 8
재조합 FIX (
베네픽스
®)와 FIX-
sFc
사이의 효능 비교
1 상대 효능은 재조합 FIX의 비활성 (즉, 200 IU/mg)과 비교한 시험 샘플의 비활성의 비이다.
표 9
피하 투여 후
래트에서의
인터페론의 약동학적 특징
표 10
피하 투여 후
래트에서의
인터페론의 항바이러스 활성
1 비율은 각각의 샘플 IC50과 IFNα-sFc의 IC50의 비교이다.
표 11
IFNα
-
sFc
(단량체) 및
IFNα
-
Fc
(
이량체
)의
IFNAR1에
대한 결합 친화도 특성
표 12
피하 투여 후
래트에서의
GCSF의
약동학적 특징
표 13
GCSF
-
sFc에
대한 생물학적 활성 검정을
위한
실험 설정
1 각각의 군은 5마리의 호중구 감소성 마우스이다.
2 모든 군을 제0일에 CPA (시클로포스파미드 일수화물)로 전처리하였다. 처리 약물의 투여는 단일 샷이 실시된 군에 대해서는 제1일에, 4회 샷이 실시된 군에 대해서는 제1, 2, 3 및 4일에 수행되었다.
표 14
ELISA에 의해 결정된, 단백질 A 수지로 정제된
IFNβ
-
sFc의
회수율
표 15
피하 투여 후
래트에서의
IFNβ의
약동학적 특징
SEQUENCE LISTING
<110> UBI Pharma Inc
WANG, Chang-Yi
<120> Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof
<130> 1007316.001WO2 (UBIP1001-WO)
<140> TBD
<141> 2016-06-10
<150> US 62/175,186
<151> 2015-06-12
<150> US 15/002,396
<151> 2016-01-20
<150> US 15/177,605
<151> 2016-06-09
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> wild type IgG1 hinge peptide sequence
<400> 1
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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<211> 15
<212> PRT
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<220>
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<220>
<221> SITE
<222> (14)..(14)
<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<400> 2
Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Lys Thr His Thr Xaa Pro Pro Xaa Pro
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<400> 3
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<212> PRT
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<220>
<221> SITE
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<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(12)
<223> Wild type IgG2 hinge peptide sequence
<400> 6
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
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<221> SITE
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<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<221> SITE
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<223> Artificial mutated IgG2 hinge peptide sequence
<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
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Glu Arg Lys Xaa Xaa Val Glu Xaa Pro Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<223> Artificial mutated IgG2 hinge peptide sequence
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<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
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Val Glu Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(17)
<223> Wild type IgG3 hinge peptide sequence
<400> 10
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(17)
<223> Artificial mutated IgG3 hinge peptide sequence
<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<220>
<221> SITE
<222> (16)..(16)
<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<400> 11
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Xaa Pro Arg Xaa
1 5 10 15
Pro
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<211> 15
<212> PRT
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<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
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<223> Artificial mutated IgG3 hinge peptide sequence
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<221> SITE
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<400> 12
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Xaa Pro Arg
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<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(12)
<223> Artificial mutated IgG3 hinge peptide sequence
<400> 13
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Wild type IgG3 hinge peptide sequence
<400> 14
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
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<210> 15
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
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Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Thr Pro Pro Pro Xaa Pro Arg Xaa Pro
1 5 10 15
<210> 16
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<223> Artificial mutated IgG3 hinge peptide sequence
<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (11)..(11)
<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<400> 16
Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Thr Pro Pro Pro Xaa Pro Arg
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
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<221> SITE
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<223> Artificial mutated IgG3 hinge peptide sequence
<220>
<221> SITE
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Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Thr Pro Pro Pro
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<212> PRT
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<223> Mutated IgG Hinge Region
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<221> SITE
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<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
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Asp Thr Pro Pro Pro Xaa Pro Arg Xaa Pro
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(12)
<223> Wild type IgG4 hinge peptide sequence
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(12)
<223> Artificial mutated IgG4 hinge peptide sequence
<220>
<221> SITE
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Glu Xaa Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Xaa Cys Pro
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<212> PRT
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<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(9)
<223> Artificial mutated IgG4 hinge peptide sequence
<220>
<221> SITE
<222> (2)..(2)
<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<400> 21
Glu Xaa Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> Artificial mutated IgG4 hinge peptide sequence
<220>
<221> SITE
<222> (8)..(8)
<223> S or G or T or A or V or L or I or M or deletion
<400> 22
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Xaa Cys Pro
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 23
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
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<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(13)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 24
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
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Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 26
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
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Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
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<212> PRT
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<221> SITE
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<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
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Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
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Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Pro Pro Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(14)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 30
Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 31
Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Gly Pro
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<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(13)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 32
Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
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Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 34
Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
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Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Gly Pro
1 5 10
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<211> 8
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(8)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
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Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro
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<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 38
Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
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<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 39
Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Ser Pro
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 40
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Gly Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 41
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(13)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 42
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro
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<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(13)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 43
Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro
1 5 10
<210> 44
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 44
Glu Pro Lys Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Thr Pro
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<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(13)
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Glu Pro Lys Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(14)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 46
Glu Pro Lys Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Pro
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<210> 47
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 47
Glu Pro Lys Ser Thr Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 48
Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Thr Pro
1 5 10
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(8)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 49
Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro
1 5
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(14)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 50
Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Thr Pro
1 5 10
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 51
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 52
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 53
Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Leu Pro Pro Met Pro
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 54
Glu Pro Lys Ser Val Asp Lys Thr His Thr Leu Pro Pro Ile Pro
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 55
Glu Pro Lys Ser Leu Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala Pro
1 5 10 15
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(13)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 56
Glu Pro Lys Ser Val Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro
1 5 10
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(13)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 57
Glu Pro Lys Ser Met Asp Lys Thr His Thr Val Pro Pro
1 5 10
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(13)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 58
Glu Pro Lys Ser Ile Asp Lys Thr His Thr Leu Pro Pro
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 59
Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Leu Pro
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated IgG Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> Artificial IgG1 hinge peptide sequence
<400> 60
Asp Lys Thr His Thr Val Pro Pro Leu Pro
1 5 10
<210> 61
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(193)
<223> Human EPO protein
<400> 61
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg
20 25 30
Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn
50 55 60
Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys
65 70 75 80
Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala
85 90 95
Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gly Ala Leu Leu Val Asn Ser
100 105 110
Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Ser Leu Thr Thr Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 62
<211> 461
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(461)
<223> Human Factor IX protein
<400> 62
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 63
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(216)
<223> Fc sequence of IgG1 (CH2-CH3 of human IgG1)
<400> 63
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215
<210> 64
<211> 419
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erythropoietin Single Chain Fc Fusion Protein (EPO-sFc)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(419)
<223> Erythropoietin single chain Fc Fusion Protein (EPO-sFc)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(193)
<223> Erythropoietin (EPO)
<220>
<221> SITE
<222> (194)..(203)
<223> Mutated Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (204)..(419)
<223> Single Chain Fc Region (sFc)
<400> 64
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg
20 25 30
Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn
50 55 60
Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys
65 70 75 80
Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala
85 90 95
Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gly Ala Leu Leu Val Asn Ser
100 105 110
Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Ser Leu Thr Thr Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu
195 200 205
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
210 215 220
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
225 230 235 240
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
245 250 255
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr
260 265 270
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
275 280 285
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
290 295 300
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
305 310 315 320
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
325 330 335
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
340 345 350
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
355 360 365
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
370 375 380
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
385 390 395 400
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
405 410 415
Ser Pro Gly
<210> 65
<211> 692
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Factor IX Single Chain Fc Fusion Protein (FIX-sFc)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(692)
<223> Factor IX single chain Fc Fusion Protein (FIX-sFc)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(461)
<223> Factor IX (FIX)
<220>
<221> SITE
<222> (462)..(476)
<223> Mutated Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (477)..(692)
<223> single chain Fc Region (sFc)
<400> 65
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Glu Pro Lys
450 455 460
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
465 470 475 480
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
485 490 495
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
500 505 510
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
515 520 525
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser
530 535 540
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
545 550 555 560
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
565 570 575
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
580 585 590
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
595 600 605
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
610 615 620
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
625 630 635 640
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
645 650 655
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
660 665 670
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
675 680 685
Leu Ser Pro Gly
690
<210> 66
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> IFNalpha8
<222> (1)..(189)
<400> 66
Met Ala Leu Thr Phe Tyr Leu Leu Val Ala Leu Val Val Leu Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Phe Ser Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
65 70 75 80
His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser
85 90 95
Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu
100 105 110
Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly
115 120 125
Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
130 135 140
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser
145 150 155 160
Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
165 170 175
Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu
180 185
<210> 67
<211> 420
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Interferon alpha single chain fusion protein (IFNa-sFc)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(189)
<223> Interferon alpha (IFNa)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(204)
<223> Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (205)..(420)
<223> single chain Fc region (sFc)
<400> 67
Met Ala Leu Thr Phe Tyr Leu Leu Val Ala Leu Val Val Leu Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Phe Ser Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
65 70 75 80
His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser
85 90 95
Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu
100 105 110
Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly
115 120 125
Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
130 135 140
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser
145 150 155 160
Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
165 170 175
Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu Glu Pro Lys
180 185 190
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
210 215 220
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
225 230 235 240
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
245 250 255
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser
260 265 270
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
275 280 285
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
290 295 300
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
305 310 315 320
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
325 330 335
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
340 345 350
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
355 360 365
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
370 375 380
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
385 390 395 400
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Gly
420
<210> 68
<211> 204
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(204)
<223> Granulocyte-Colony Stimulating Factor (GCSF)
<400> 68
Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln
1 5 10 15
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro
20 25 30
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
35 40 45
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
50 55 60
Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
65 70 75 80
Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser
85 90 95
Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
100 105 110
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu
115 120 125
Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala
130 135 140
Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu
145 150 155 160
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg
165 170 175
Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
195 200
<210> 69
<211> 435
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Granulocyte-Colony Stimulating Factor single chaing Fc Fusion
Protein (GCSF-sFc)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(204)
<223> Granulocyte-Colony Stimulating Factor (GCSF)
<220>
<221> SITE
<222> (205)..(219)
<223> Mutated Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (220)..(435)
<223> Single chain Fc (sFc)
<400> 69
Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln
1 5 10 15
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro
20 25 30
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
35 40 45
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
50 55 60
Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
65 70 75 80
Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser
85 90 95
Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
100 105 110
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu
115 120 125
Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala
130 135 140
Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu
145 150 155 160
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg
165 170 175
Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Glu Pro Lys Ser
195 200 205
Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu
210 215 220
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
225 230 235 240
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
245 250 255
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
260 265 270
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr
275 280 285
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
290 295 300
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
305 310 315 320
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
325 330 335
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
340 345 350
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
355 360 365
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
370 375 380
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
385 390 395 400
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
405 410 415
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
420 425 430
Ser Pro Gly
435
<210> 70
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(187)
<223> Interferon beta (IFNb)
<400> 70
Met Asn Asn Arg Trp Ile Leu His Ala Ala Phe Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180 185
<210> 71
<211> 419
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Interferon beta single chain Fc Fusion Protein (IFNb-sFc)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(187)
<223> Interferon beta (IFNb)
<220>
<221> SITE
<222> (188)..(202)
<223> Mutated Hinge Region
<220>
<221> SITE
<222> (203)..(419)
<223> Single chain Fc (sFc)
<400> 71
Met Asn Asn Arg Trp Ile Leu His Ala Ala Phe Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Glu Pro Lys Ser Ser
180 185 190
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
195 200 205
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
210 215 220
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
225 230 235 240
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
245 250 255
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
260 265 270
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
275 280 285
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
290 295 300
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
305 310 315 320
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
325 330 335
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
340 345 350
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
355 360 365
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
370 375 380
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
385 390 395 400
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
405 410 415
Pro Gly Lys
<210> 72
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region if IgG
<220>
<221> SITE
<222> (67)..(67)
<223> N or H
<400> 72
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215
Claims (15)
- IgG 분자의 Fc 단편 및 생물활성 분자를 포함하며, 여기서 Fc 단편은 단일 쇄 Fc (sFc)인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, Fc 단편이 힌지 영역을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제2항에 있어서, 힌지 영역이 돌연변이되고 디술피드 결합을 형성하지 않는 것인 융합 단백질.
- 제2항에 있어서, 힌지 영역이 서열식별번호: 1-60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제2항에 있어서, 힌지 영역이 서열식별번호: 23 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 생물활성 분자가 시토카인, 성장 인자, 호르몬 또는 그의 기능적 부분인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 생물활성 분자가 에리트로포이에틴, 인자 IX, IFNα, GCSF 및 IFNβ인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 생물활성 분자가 돌연변이된 힌지 영역을 통해 Fc 단편에 연결되는 것인 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열식별번호: 66, 68, 70, 72 및 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
- 제1항에 따른 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
- a) 생물활성 분자 및 힌지 영역을 포함하는 Fc 단편을 제공하는 단계;
b) 돌연변이된 Fc를 형성하기 위해 아미노산 치환 및/또는 결실에 의해 힌지 영역을 돌연변이시키는 단계; 및
c) 생물활성 분자 및 돌연변이된 Fc를 조합하는 단계
를 포함하는, 융합 단백질을 생산하는 방법. - 제11항에 있어서, 힌지 영역이 시스테인 잔기의 치환 및/또는 결실에 의해 돌연변이되는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 생물활성 분자가 힌지 영역을 통해 돌연변이된 Fc와 조합되는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 생물활성 분자가 시토카인, 성장 인자, 호르몬 또는 그의 기능적 부분인 방법.
- 제11항에 있어서, 생물활성 분자가 에리트로포이에틴, 인자 IX, IFNα, GCSF 및 IFNβ인 방법.
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