CN107835693B - 免疫球蛋白融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种融合蛋白。本发明融合蛋白包含免疫球蛋白G的Fc片段和生物活性分子，其中此Fc为单链Fc。通过突变、取代或删除此Fc的铰链的氨基酸，使此Fc的铰链无法形成双硫键。另外本发明更提供制备和使用本发明融合蛋白的方法。
Description
技术领域
本发明关于包含免疫球蛋白G的Fc片段和生物活性分子的治疗性融合蛋白，其中，此Fc片段为单链。
背景技术
免疫球蛋白包括四条多肽链，两条重链和两条轻链，其透过链间双硫键加以联结。每个轻链具有两个结构域，即一个轻链可变区结构域(VL)和一个轻链恒定区结构域(CL)；且每个重链具有两个区域，即一个重链可变区(VH)和一个重链恒定区(CH)。重链恒定区(CH)由以数字命名的多个重链恒定区结构域(例如CH1、CH2、CH3等)所组成(参见例如美国第6,086,875号专利(Blumberg R.S.等人)、美国第5,624,821号专利(Winter G.P.等人)以及美国第5,116,964号专利(Capon D.J.and Lasky L.A.))。根据其生物学性质、在生物体中的位置，以及处理不同抗原(即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)的能力，将免疫球蛋白分为不同的同型(isotypes)。取决于免疫球蛋白同型，重链恒定区(CH)可有三或四个CH结构域。同样地，在某些同型(IgA、IgD和IgG)中，重链包含可增加此分子弹性的铰链区(Janeway等人2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y.)。
在人类有四种IgG亚类(IgG1、2、3和4)，依据其在血清中的含量依序命名(以IgG1含量最多)。IgG同型，由两条轻链和两条重链所组成，其中每条重链包含三个重链恒定区结构域(CH1、CH2、CH3)。利用双硫键(—S—S—)将IgG的两条重链相互连接，且将每个重链连接一个轻链。IgG的抗原结合位点位于抗原结合区片段(Fab区)，其包含轻链可变区结构域(VL)和重链可变区结构域(VH)以及轻链恒定区结构域(CL)和重链恒定区结构域(CH1)。IgG的可结晶区域片段(Fc区)为含有CH2和CH3结构域的重链的一部分，其可结合位于某些细胞表面上的Fc受体(包含新生儿Fc受体(FcRn))。IgG的重链还具有位于CH1和CH2结构域间的铰链区(铰链)，其将Fab区与Fc区分隔开并透过双硫键将两重链连接在一起。铰链区的结构有助于四个IgG亚类中的每一者独特生物性质的展现。
IgG以小尺寸单体形式分泌，以使其易于充满组织。其为唯一的同型，具有可促进通过人体胎盘以提供子宫内胎儿保护的受体(新生儿Fc受体(FcRn))。在新生儿自身免疫系统发展前，通过胎盘吸收的IgG可提供新生儿体液免疫。
IgG新生儿Fc受体(FcRn)结合位点位于抗体的Fc区。FcRn通常是在人类胎盘和上皮细胞表达，并参与防止IgG降解的内吞救急途径(endocytic salvage pathway)。此救急途径是在酸性pH下由IgG对FcRn的高度pH依赖结合亲和力所调停。在酸性pH下IgG对FcRn的高度亲和力会导致在摄取进入酸性核内体后将内化IgG结合至FcRn(Goebl NA,等人,2008；Junghans RP,等人,1996)。虽然在内化后大多数可溶性蛋白质会被导向溶体，但内化的FcRn结合的IgG会返回到胞质膜，并从预设的降解途径中被有效地救出。一旦暴露于细胞外空间的中性pH值下，IgG可再从FcRn分离并返回循环中。因此，将抗体延长的血清半衰期特性保持在Fc片段。
这种救急途径提供一种机制，可用于发展相对于未修饰蛋白质药物于血液循环中具有延长半衰期的新一代蛋白质药物。具体地来说，未修饰的蛋白质药物具有短的循环半衰期，使得必需在延长的治疗期间中频繁给药。通过许多方法(包含聚乙二醇化(PEGylation)融合蛋白技术(美国食品和药物管理局；Osborn BL,等人,2002))致力于延长蛋白质药物半衰期；然而，这些努力的结果并不理想。
已知连接感兴趣蛋白质或其片段与IgG恒定区来产生融合蛋白。例如，感兴趣的蛋白“X”与IgG的“Fc”结构域连接以产生“Fc-X”或“X-Fc”融合蛋白(免疫融合蛋白(immunofusion))。相对于其它种类的融合蛋白，通常可以较大量制备与纯化免疫融合蛋白，其原因在于此融合蛋白的Fc部分被设计用于通过细胞有效的分泌。相较于含有非Fc的对应物(non-Fc-containing counterparts)，含有免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白具有增强的特征，包含增加的蛋白质稳定性和较长的血清半衰期(参见Capon等人1989,Nature337:525)，以及结合至Fc受体(例如新生儿Fc受体(FcRn)的能力(参见例如，美国第6,086,875号专利(Blumberg R.S.等人)；美国第6,485,726号专利(Blumberg R.S.等人)；美国第6,030,613号专利；世界专利第03/077834号申请案(Blumberg R.S.等人)；以及美国第2003-0235536A1号专利申请案(Blumberg R.S.等人))。下列专利文献描述额外的示例。
美国第5,116,964号专利(Capon D.J.and Lasky L.A.)公开包含淋巴细胞表面糖蛋白(LHR)和免疫球蛋白链的配体结合伴侣蛋白(ligand binding partner protein)，其中，配体结合伴侣蛋白和免疫球蛋白是通过氨基端的氨基或羧基端的羧基加以融合。
世界专利第94/04689号申请案(Pastan I.H.等人)公开使用免疫球蛋白的Fc以提供具有延长半衰期的毒素，其包含配体结合结构域(CD4受体)和假单胞菌属外毒素A。此IgGFc连接CD4受体和假单胞菌属外毒素A。
美国第6,797,493号专利(Sun L-H.等人)公开hG-CSF-L-vFc融合蛋白，其包含人类颗粒球群落刺激因子(hG-CSF)、具有约20个或更少氨基酸的具弹性的肽连接子(L)，以及人类IgG Fc变体。此Fc变体为无裂解性，并展现极小非欲求的Fc-介导副作用。
美国第8,557,232号专利(Gillies S.D.等人)公开用以表达可溶性且具生物活性的Fc-IFN-β融合蛋白及其变体(Fc-IFN-βsol)的方法和组合物。Fc-IFN-β融合蛋白包含连接免疫球蛋白Fc区的羧基端的IFN-β蛋白。
上述文献描述具有两个Fc链的融合蛋白，其被设计为具有紧邻的两个生物活性分子。这些传统的融合蛋白的生物活性分子与目标分子或细胞的交互作用通常受到抑制或空间上的阻碍。因此，需要发展融合蛋白，其包含连接IgG的经修饰的Fc区的生物活性分子，可增加生物活性分子的体内半衰期，而无抑制生物活性分子的生物活性。这种经修饰的融合蛋白可通过相关的亲和性纯化过程提供便于纯化的额外优点。
参考文献：
1.Blumberg R.S.等人,“Receptor specific transepithelialus transport oftherapeutics”US Patent Nos.6,030,613(2000),6,086,875(2000),and 6,485,726(2002)
2.Blumberg R.S.等人,“Central airway administration for systemicdelivery of therapeutics”WO 03/077834(2002)and US Patent Application 2003-0235536A1(2003)
3.Capon D.J.,等人,“Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy”Nature 337:525(1989)
4.Capon D.J.and Lasky L.A.,“Hybrid immunoglobulins”US Patent 5,116,964(1992)
5.Gillies S.D.等人,“Stabilization of Fc-interferon-beta fusionproteins”US Patent 8,557,232(2013)
6.Goebl N.A.,等人,“Neonatal Fc Receptor Mediates Internalization ofFc in Transfected Human Endothelial Cells”Mol.Biol.Cell,19(12):5490-5505(2008)
7.Janeway等人,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y(2001)
8.Junghans R.P.,等人,“The protection receptor for IgG catabolism isthe beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor”Proc Natl Acad Sci USA.93(11):5512-5516(1996)
9.Ober R.J.等人,Exocytosis of IgG as mediated by the receptor,FcRn:ananalysis at the single-molecule level.Proc Natl Acad Sci USA.101(30):11076-81(2004)
10.Ober R.J.等人,Visualizing the site and dynamics of IgG salvage bythe MHC class I-related receptor,FcRn.J Immunol.172(4):2021-9(2004)
11.Osborn B.L.等人,“Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of ahuman serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys.”JPharmacol Exp Ther.303(2):540-8(2002)
12.Pastan I.H.,等人,“Recombinant toxin with increased half-life”WO94/04689(1993)
13.Peters R.T.等人,Prolonged activity of factor IX as a monomeric Fcfusion protein.Blood.115(10):2057-64(2010)
14.Sun L-H.等人,“Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities”US Patent6,797,493(2004)
15.Winter G.P.等人,“Antibodies with altered effector functions”USPatent 5,624,821(1997)
16.Vaccaro C,等人,Engineering the Fc region of immunoglobulin G tomodulate in vivo antibody levels.Nat Biotechnol.23(10):1283-8(2005)
发明内容
本发明是涉及包含一部分免疫球蛋白(Ig)分子的新颖融合蛋白、其组合物，以及制备和使用本发明融合蛋白的方法。本发明融合蛋白在生物体中可延长生物活性分子的血清半衰期。
本发明的一个范畴是关于融合蛋白、杂合体(hybrid)、缀合物(conjugate)及其组合物。本发明融合蛋白通常包含(a)生物活性分子和(b)衍生自Ig分子(Ig片段)的重链恒定区(CH)的一部分。Ig片段可包含重链恒定区的任何部分，包含一或多个重链恒定区结构域、铰链区、Fc区和/或其组合。(a)生物活性分子和(b)融合蛋白的Ig片段，其衍生自如同本领域所公开每一片段的野生型序列。衍生的序列包含野生型序列，以及同系物、类似物、片段和野生型序列的其它变体。
在某些实施例中，融合蛋白的Ig片段包含单链的Fc(sFc或scFc)，单体，其无法形成二聚体。在一些实施例中，融合蛋白包含对应于免疫球蛋白铰链区的序列。在各种实施例中，铰链区包含防止融合蛋白与其它融合蛋白或其它免疫球蛋白分子形成双硫键的修饰。在一些实施例中，通过突变和/或删除一或多个Cys氨基酸以防止双硫键的形成，藉此修饰铰链区。在一些实施例中，生物活性分子是通过铰链区连接scFc。在具体实施例中，融合蛋白包含位于其氨基端的生物活性分子，其通过突变的铰链区连接scFc。在某些实施例中，本发明关于组合物，包含药学组合物，包含融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的另一个范畴是关于制备和使用融合蛋白及其组合物的方法。在一些实施例中，制备融合蛋白的方法包含：(i)提供生物活性分子、Fc片段和铰链区，(ii)修饰铰链区以防止其形成双硫键，以及(iii)通过突变的铰链区将生物活性分子连接Fc片段，以形成融合蛋白、杂合体、缀合物或其组合物。本发明还提供纯化融合蛋白的方法，包含(i)提供融合蛋白，以及(ii)通过基于蛋白质A或蛋白质G的层析媒介纯化融合蛋白。
以下实施例将参照附图详细描述本发明。
附图说明
图1A-1D为依据本发明各种实施例的单链融合蛋白的设计。图1A显示一融合蛋白，此融合蛋白包含位于氨基端的生物活性分子，生物活性分子共价连接铰链区和人类IgG的Fc片段(CH2和CH3结构域)。图1B显示一融合蛋白，此融合蛋白包含位于氨基端的生物活性分子，生物活性分子通过连接子共价连接铰链区和人类IgG的Fc片段(CH2和CH3结构域)。图1C显示一融合蛋白，此融合蛋白包含位于羧基端的生物活性分子，生物活性分子共价连接铰链区和人类IgG的Fc片段(CH2和CH3结构域)。图1D显示一融合蛋白，此融合蛋白包含位于羧基端的生物活性分子，生物活性分子通过连接子共价连接铰链区和人类IgG的Fc片段(CH2和CH3结构域)。
图2显示pZD/EPO-sFc质粒的图谱。依据本发明实施例，pZD/EPO-sFc质粒编码EPO-sFc融合蛋白。
图3显示pZD/FIX-sFC质粒的图谱。依据本发明实施例，pZD/FIX-sFc质粒编码Factor IX-sFc融合蛋白。
图4为通过本发明方法所产生红血球生成素单链Fc融合蛋白(EPO-sFc)利用库马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。泳道M为分子量标记(标记包含分子量为20、25、37、50、75、100、150和250kDa的重组蛋白质)。泳道1为细胞培养基内的EPO-sFc融合蛋白。泳道2为利用蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM Hitrap管柱)纯化的EPO-sFc融合蛋白的洗出液。泳道3为利用DEAE管柱纯化的EPO-sFc融合蛋白的洗出液。EPO-sFc(泳道1至3)的分子量介于50-70KDa，具有高含量的糖基化作用。
图5为通过本发明方法所产生Factor IX单链Fc融合蛋白(Factor IX-sFc)利用库马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。泳道M为分子量标记(标记包含分子量为50、75、100和150kDa的重组蛋白质)。泳道1为原始的重组人类Factor IX(贝赋
)。泳道2为利用蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM Hitrap管柱)纯化的Factor IX-sFc融合蛋白的洗出液。Factor IX-sFc(泳道2)的分子量介于100-110KDa，具有高含量的糖基化作用。
图6显示于大鼠以单一剂量皮下(S.C.)注射红血球生成素单链Fc融合蛋白(EPO-sFc)(实心圆形)和原始的重组人类EPO
(空心圆形)的药物动力学(PK)样态。以16.8μg/kg的单一剂量皮下注射EPO-sFc，EPO-sFc的半衰期为约22小时，其为
半衰期的三倍。
图7显示于大鼠以单一剂量静脉(I.V.)注射Factor IX单链Fc融合蛋白(FIX-sFc)(正方形)和原始的重组人类Factor IX(贝赋)(三角形)的药物动力学(PK)样态。对静脉注射而言，FIX-sFc的半衰期为约56小时，其为贝赋半衰期(T1/2＝11.91小时)的五倍。
图8显示pZD/IFNα-sFc的质粒图谱。依据本发明实施例，pZD/IFNα-sFc质粒编码IFNα-sFc融合蛋白。
图9为通过本发明方法所产生干扰素α单链Fc融合蛋白(IFNα-sFc)利用库马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。泳道M为分子量标记(标记包含分子量为20、25、37、50、75、100、150和250kDa的重组蛋白质)。泳道1和2分别为含有0.2至0.4M蔗糖的IFNα-sFc融合蛋白的洗出液。泳道3和4分别为含有1.0至2.0M尿素的IFNα-sFc融合蛋白的洗出液。
图10显示于大鼠以单一剂量皮下(S.C.)注射派罗欣
(圆形)、干扰素α单链Fc融合蛋白(IFNα-sFc)(矩形)、佩乐能
(正三角形)和罗荛愫
(倒三角形)的药物动力学(PK)样态。IFNα-sFc的半衰期为约50.2小时，其较其它干扰素产品的半衰期长。
图11为显示干扰素α单链Fc融合蛋白(IFNα-sFc)(圆形)、派罗欣(正三角形)和干扰素αFc融合蛋白(IFNα-Fc)(倒三角形)于大鼠的抗病毒活性图标。IFNα-sFc的抗病毒活性(IC50)为约0.0061nM，其远优于IFNα-Fc和派罗欣的抗病毒活性(IFNα-Fc的抗病毒活性(IC50)为约0.0313nM，派罗欣的抗病毒活性(IC50)为约0.0894nM)。
图12为IFNα-sFc与干扰素α受体1(IFNAR1)(图12A)和IFNα-Fc与IFNAR1(图12B)的结合样态(association profiles)。
图13为pZD-GCSF-sFc的质粒图谱。依据本发明实施例，pZD/GCSF-sFc质粒编码GCSF-sFc融合蛋白。
图14为通过本发明方法所产生GCSF单链Fc融合蛋白(GCSF-sFc)利用库马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。泳道M为分子量标记(标记包含分子量为20、25、37、50、75、100、150和250kDa的重组蛋白质)。泳道1为GCSF-sFc的洗出液。
图15为显示于大鼠以单一剂量皮下(S.C.)注射GCSF单链Fc融合蛋白(GCSF-sFc)(圆形)、来格司亭(Lenograstim)(格拉诺赛特
)(三角形)和培非格司亭(Peg-filgrastim)(纽拉斯塔
)(矩形)的药物动力学(PK)样态。GCSF-sFc的半衰期为约17.16小时，其较来格司亭和培非格司亭的半衰期长(来格司亭的半衰期为约4.1小时，培非格司亭的半衰期为约12.0小时)。
图16为显示以单一剂量(B1组和B2组)或四剂量(B3组)皮下(S.C.)注射来格司亭，以及以单一剂量皮下(S.C.)注射GCSF单链Fc融合蛋白(GCSF-sFc)(C1组和C2组)的生物活性。相较于来格司亭，GCSF-sFc具有较高的活性以增强小鼠中嗜中性白细胞的分化和增生。
图17为pZD-IFNβ-sFc的质粒图谱。依据本发明实施例，pZD-IFNβ-sFc质粒编码IFNβ-sFc融合蛋白。
图18为显示于大鼠以单一剂量皮下(S.C.)注射干扰素β单链Fc融合蛋白(IFNβ-sFc)(矩形)和利比
(菱形)的药物动力学(PK)样态。IFNβ-sFc的半衰期为约31.89-37.7小时，其较利比的半衰期长(利比的半衰期为约18.92-23.57小时)。
图19为显示通过IFNβ-sFc融合蛋白和利比的骨桥蛋白(osteopontin(OPN))抑制。IFNβ-sFc融合蛋白分别于1.5ng/mL和10ng/mL的浓度下展现73.4±0.8％和79.5±3.6％的显著抑制效果。IFNβ-sFc的生物活性与利比相当。
具体实施方式
本发明是涉及包含生物活性分子和一部分免疫球蛋白分子的新颖融合蛋白。本发明的各个范畴关于融合蛋白，其组合物，以及制备和使用本发明融合蛋白的方法。本发明融合蛋白对于在生物体中延长生物活性分子的血清半衰期是有用的。
以下提供详细描述以协助本领域技术人员实施本发明。那些所属领域中具有通常知识者可理解在此明确描述的实施例的修饰或变化，其未悖离本文中所包含的讯息的精神或范围者，乃由本发明所涵盖。文中所使用的术语仅用于描述特定实施例，并非用于缩限本发明。以下所使用的章节标题仅用于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的标的。
如同于说明书中已完整地公开及详述，在此提及的所有出版物、专利申请、专利、图示和其它参考文献通过引用在并入本文整体。
1.融合蛋白
本发明所述的“融合蛋白”或“融合多肽”是杂合蛋白质或多肽，其包含以通常不会在自然界中发现的方式连接在一起的至少两种蛋白质或多肽。
本发明的一个范畴涉及包含免疫球蛋白(Ig)Fc片段和生物活性分子的融合蛋白。相较于此前所描述未融合或合并进入融合蛋白(例如，含有两个Fc区的融合蛋白)的相同生物活性分子，合并进入本发明融合蛋白的生物活性分子具有改善的生物性质。例如，相较于其非融合的对应物，合并进入本发明融合蛋白的生物活性分子具有较长的血清半衰期。此外，本发明融合蛋白维持生物活性分子的完整生物活性，而无任何功能性的降低，其比起此前融合蛋白(因为两个Fc区造成空间上的阻碍而导致活性降低)有所改进。
相较于此前所描述未融合的生物活性分子和合并进入融合蛋白的生物活性分子，本发明融合蛋白对生物活性分子提供显著的生物学优点。
本发明融合蛋白可具有以下任何分子式(也表示于图1中)：
(B)-(铰链)-(CH2-CH3) (式1)
(CH3-CH2)-(铰链)-(B) (式2)
(B)-(L)m-(铰链)-(CH2-CH3)；或 (式3)
(CH3-CH2)-(铰链)-(L)m-(B) (式4)
其中
“B”为生物活性分子；
“铰链”为IgG分子的铰链区；
“CH2-CH3”为IgG重链的CH2和CH3恒定区结构域；
“L”为任选的连接子；以及
“m”可为任何整数或0。
以下进一步讨论融合蛋白的各个部分/片段。
a.Fc区和Fc片段
本发明融合蛋白包含来自免疫球蛋白(Ig)分子的Fc片段。
本发明所述的“Fc区”是指位于重链恒定区羧基端的免疫球蛋白的一部分。Fc区为免疫球蛋白的一部分，其可与细胞表面受体(Fc受体)和补体系统中的其它蛋白质交互作用，以协助活化免疫系统。在IgG、IgA和IgD同型中，Fc区包含两个重链结构域(CH2和CH3结构域)。在IgM和IgE同型中，Fc区包含三个重链恒定结构域(CH2至CH4结构域)。虽然Fc部分的范围可以变化，但是通常将人类IgG重链Fc部分定义为包含残基C226或P230至其羧基端，其中编码是依照EU索引。
在某些实施例中，融合蛋白包含CH2-CH3结构域，其为FcRn结合片段，可以再次回收进入循环中。具有这种结构域的融合蛋白证实此融合蛋白的体内半衰期的增加。
本发明所述的“Fc片段”是指融合蛋白的一部分，其对应于来自任何同型的免疫球蛋白分子的Fc区。在一些实施例中，Fc片段包含IgG的Fc区。在具体实施例中，Fc片段包含IgG1的Fc区的全长的范围。在一些实施例中，Fc片段是指免疫球蛋白分子的全长Fc区，在本领域中将其作为特征并加以描述。在其它实施例中，Fc片段包含全长Fc区的一部分或片段，例如重链结构域的一部分(例如CH2结构域、CH3结构域等)，和/或于Fc区常见的铰链区。例如，Fc片段可以包含整个或部份的CH2结构域和/或整个或部份的CH3结构域。在一些实施例中，Fc片段可包含全长Fc区或其部分的功能类似物。
本发明所述的“功能类似物”是指氨基酸序列或核酸序列的变体，其实质上保留了如同原始序列的相同的功能特性(结合辨识、结合亲和力等)。功能类似物的例子包含序列，其与原始序列相似，但包含在氨基酸位置的保留性取代；静电荷的变化；共价连接至另一官能基；或小规模的添加、插入、删除或保守性取代和/或其任意组合。Fc片段的功能性类似物可以本领域已知的任何方法合成产生。例如，可以利用定点突变，通过氨基酸的添加、删除和/或取代，通过修饰已知氨基酸序列，以产生功能性类似物。在一些实施例中，功能类似物具有与给定的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的氨基酸序列。通过标准比对算法(例如ClustalX)，当依照比对算法两序列为最佳比对时，测定出两个序列之间的百分比相似性。
可以由任何动物(例如，人、牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、天竺鼠)获得或衍生免疫球蛋白分子。此外，可以由任何同型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或一个同型中的亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)获得或衍生免疫球蛋白的Fc片段。在一些实施例中，Fc片段是由IgG获得或衍生，且在特定实施例中，Fc片段是由人类IgG(包含人源化IgG)获得或衍生。
可以利用本领域中任何已知的方法获得或产生Fc片段。例如，可从动物分离或纯化、重组表达，或合成产生此Fc片段。在一些实施例中，Fc片段是于核酸分子(例如，DNA或RNA)中编码，以及由细胞、生殖细胞系、cDNA基因库或噬菌体库分离。
Fc区和/或Fc片段可包含在一些免疫球蛋白同型(IgA、IgD和IgG)中的铰链区。在某些实施例中，通过突变铰链区以修饰Fc片段，藉此其不包含任何Cys，且无法形成双硫键。以下进一步讨论铰链区。
本发明融合蛋白的Fc片段优选地为单链Fc。本发明所述的“单链Fc”(即“sFc”)是指以此种方式(例如，利用化学修饰或突变添加、删除或取代氨基酸)修饰Fc片段，以防止其形成二聚体。
在某些实施例中，融合蛋白的Fc片段衍生自人类IgG1，其可包含野生型人类IgG1氨基酸序列或其变体。在一些实施例中，融合蛋白的Fc片段含有天然人类IgG1分子位于第297氨基酸位置作为N-糖基化位点的Asn氨基酸(基于IgG1的欧洲编码系统，如美国第7,501,494号专利所讨论)，其对应位于Fc片段(SEQ ID NO:63)的残基67。在其它实施例中，将Asn(N)残基突变为His(H)(SEQ ID NO:72)或Ala(A)(SEQ ID NO:73)以移除位于Fc片段的N-糖基化位点。含有位于N-糖基化位点的可变位置的Fc片段如序列表中SEQ ID NO:63、72、73所示。
在一些实施例中，Fc片段的CH3-CH2结构域具有对应野生型序列的氨基酸序列(公开于SEQ ID NO:63)。在某些实施例中，Fc片段的CH3-CH2结构域具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列，在此将Asn(N)突变为His(H)以移除N-糖基化位点。在某些实施例中，Fc片段的CH3-CH2结构域具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列，在此将Asn(N)突变为Ala(A)以移除N-糖基化位点。
b.铰链区
本发明融合蛋白可包含在一些免疫球蛋白同型(IgA、IgD和IgG)中可见的铰链区。铰链区将Fc区与Fab区分隔开，且可增加分子弹性，并通过双硫键连接两重链。对由完整Fc区所提供的功能而言，形成包含二CH2-CH3结构域的二聚体是需要的。位于野生型铰链区的Cys间的链间双硫键有助于将Fc分子的二链接合在一起，以产生功能单位。
在某些实施例中，铰链区是衍生自IgG，以IgG1为优选。铰链区可以是全长或修饰(截短)的铰链区。
在具体实施例中，铰链区包含防止融合蛋白与其它融合蛋白或免疫球蛋白分子形成双硫键的修饰。在具体实施例中，通过突变和/或删除一或多个Cys氨基酸修饰铰链区，以防止双硫键的形成。可删除全长铰链区的氨基端或羧基端以形成截短的铰链区。为了避免双硫键的形成，可以利用非Cys的氨基酸取代或删除位于铰链区的Cys。在具体实施例中，可以Ser、Gly、Ala、Thr、Leu、Ile、Met或Val取代铰链区的Cys。来自IgG1至IgG4的野生型和突变的铰链区的实施例包含如表1所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1至22)。在含有突变序列的二铰链区之间无法形成双硫键。修饰IgG1铰链区以提供不同的突变铰链区，其序列如表2所示(SEQ ID NO:23-60)。
c.连接子
融合蛋白可具有连接至Fc片段氨基端的生物活性分子。或者，融合蛋白可具有连接至Fc片段羧基端的生物活性分子。此连接为共价键，以肽键为优选。
在本发明中，可将一或多个生物活性分子直接连接至Fc片段的羧基端或氨基端。优选地，生物活性分子可直接连接至Fc片段的铰链。
此外，融合蛋白可任选地包含至少一个连接子。因此，生物活性分子可以间接地连接至Fc片段。连接子可插入于生物活性分子和Fc片段之间。连接子可连接至Fc片段的氨基端或Fc片段的羧基端。
在一实施例中，连接子包含氨基酸。连接子可包含1-5个氨基酸。
d.生物活性分子
本发明所述的“生物活性分子”是指蛋白质、糖蛋白，以及其组合。生物活性物质的例子包含抗血管生成因子、细胞激素、生长因子、激素、酵素、其受体，以及其片段。
生物活性细胞激素的例子包含，但不限于：白介素(IL)(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)；巨噬细胞发炎蛋白(例如，MIP1α、MIP1β)；巨噬细胞群落刺激因子；颗粒球巨噬细胞群落刺激因子；干扰素(IFNs)(例如，干扰素α、干扰素β、干扰素γ)；肿瘤坏死因子(例如，TNF-α、TNF-β)；淋巴因子抑制因子(lymphokine inhibitory factor)；血小板衍生生长因子；干细胞生长因子；肿瘤生长因子β；淋巴毒素；Fas；红血球生成素(EPO)；白血病抑制因子；抑瘤素M；睫状神经营养因子；泌乳素；CD40配体；CD27配体；以及CD30配体；包含颗粒球和/或巨噬细胞刺激因子(GM-CSF、G-CSF和CSF-1)的群落刺激因子和生长因子；以及血小板衍生、表皮、类胰岛素、转化以及纤维母细胞生长因子。生物活性细胞激素也包含受体和/或其片段。生物活性细胞激素也包含那些先前所述者(参见例如美国第6,086,875和6,485,726号专利)。
生长因子、蛋白激素，以及可能经由FcRn结合伴侣递送的其受体，包含，但不限于红血球生成素(EPO)、血管生成素、肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经生长因子、肿瘤生长因子α、血小板生成素、甲状腺刺激因子、甲状腺释放激素、神经滋养因子、上皮生长因子、血管内皮生长因子、睫状神经营养因子、LDL、体介素、胰岛素生长因子、类胰岛素生长因子I和II。生物活性生长因子也包含那些先前所述者(参见例如美国第6,086,875和6,485,726号专利)。
在某些实施例中，本发明预期的生物活性分子包含红血球生成素(EPO)、FactorIX(FIX)、干扰素(IFNs)，以及颗粒球群落刺激因子(G-CSF或GCSF)。
在一个实施例中，生物活性分子为红血球生成素(EPO)。红血球生成素为一种分子量约34,000Da的酸性糖蛋白，是涉及红血球前驱细胞成熟成为红血球的糖蛋白激素。其为调节循环中红血球细胞量所必需。自然存在的红血球生成素于胎儿期是由肝脏制造，于成人则是由肾脏制造，其于血液中循环，并刺激于骨髓中红血球细胞的生成。参见欧洲药典的红血球生成素浓缩液。在一个具体实施例中，EPO蛋白具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
在另一个实施例中，生物活性分子是Factor IX(FIX)。FIX为一种分子量约70,000Da的球状蛋白质，是一种参与凝血的维生素K依赖性蛋白质。其以酶原的形式合成，并在分泌进入血液前经过三种转译后修饰。在人类，肝脏是合成FIX的部位。此蛋白质参与凝血过程，并应用于B型血友病患者的治疗。目前的市面上唯一的FIX来源是人类血浆。参见欧洲药典的人类凝血因子IX。在一个具体实施例中，FIX蛋白具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在其它实施例中，生物活性分子是干扰素α(IFNα)或干扰素β(IFNβ)。干扰素(IFN)为糖蛋白(分子量为19-20KDa)，具有抗病毒、免疫调节和抗增生作用，并且根据其结构同源性和结合的特定受体分为三类(第I、II和III型)。第一型干扰素家族包含众多的IFNα变体、单一个干扰素β成员，以及鲜为人知的干扰素、、和。然而，所有第I型干扰素只结合干扰素α受体(IFNAR)。干扰素α由因应不同刺激的白细胞所制造，而干扰素β由白细胞以外的大多数细胞种类所产生。干扰素β与干扰素α具有30％的氨基酸同源性，但相较于干扰素α，干扰素β对IFNAR具有较高的结合亲和力。干扰素α和β于源自病毒的各种人类癌症与疾病的治疗中使用。在一个具体实施例中，干扰素α蛋白为具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的IFNα8。在一个具体实施例中，IFNβ蛋白具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在另一个实施例中，生物活性分子是颗粒球群落刺激因子(GCSF)。颗粒球群落刺激因子(GCSF)是一个具有174或177个氨基酸多肽单链的分子量为20kDa的糖蛋白。较短形式者相较于较长的同型异构物具有较高的活性和稳定性，且作为市售医药GCSF产品的基础。GCSF刺激嗜中性白细胞低下的前驱细胞的增生，以及其分化形成颗粒球，并且也活化成熟的嗜中性白细胞。GCSF最常应用在化疗引发的嗜中性白细胞低下的治疗。在一个具体实施例中，GCSF蛋白具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
2.组合物
在某些实施例中，本发明关于组合物，包含药学组合物，包含融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。
药学组合物可以通过混合融合蛋白与任选的药学上可接受的载体加以制备。药学上可接受的载体包含溶剂、分散介质、等张剂和类似物。载体的例子包含水、盐溶液或其它缓冲液(例如磷酸盐、柠檬酸盐缓冲液)、油、醇、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶)、碳水化合物(例如单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇或糊精)、凝胶、脂质、脂质体、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)、螯合剂(例如EDTA)、成盐反离子(例如钠)、非离子界面活性剂(例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG))，或其组合。
药学组合物可含有一种以上的活性化合物。例如，组合物可含有一或多种融合蛋白和/或一或多种额外的有益的化合物。活性成分可以任何方便和可实施的方式(例如，通过混合、溶解、悬浮、乳化、包覆、吸附等)与载体结合，并制成适合于注射、输液或类似物的剂型(例如粉末(包含冻干粉末)、悬浮液)。也可制成缓释制剂。
在某些实施例中，药学组合物包含供人类使用的融合蛋白。可于适当的pH值下，将药学组合物配制于合适的缓冲液中，合适的缓冲液包含，但不限于柠檬酸盐、磷酸盐、Tris、BIS-Tris等，药学组合物也可包含赋形剂(例如糖(50mM至500mM的蔗糖、海藻糖、甘露糖醇，或其混合物)、界面活性剂(例如，0.025％至0.5％的Tween 20或Tween 80)和/或其它试剂。可制备含有不同量融合蛋白的剂型。一般情况下，给予受试者的剂型包含介于约0.1mg/mL至约200mg/mL的融合蛋白。在某些实施例中，剂型可包含介于约0.5mg/mL至约50mg/mL的融合蛋白；介于约1.0mg/mL至约50mg/mL的融合蛋白；介于约1mg/mL至约25mg/mL的融合蛋白；或介于约10mg/mL至约25mg/mL的融合蛋白。在具体实施例中，剂型包含约1.0mg/mL、约5.0mg/mL、约10.0mg/mL，或约25.0mg/mL的融合蛋白。
3.方法
本发明的另一个范畴是关于制备和使用融合蛋白及其组合物的方法。
a.融合蛋白的制备
在一些实施例中，制备融合蛋白的方法包含(i)提供生物活性分子和包含铰链区的Fc片段，(ii)修饰铰链区以防止其形成双硫键，以及(iii)通过突变的铰链区将生物活性分子直接或间接地连接至scFc，以形成融合蛋白、杂合体、缀合物或其组合物。本发明还提供纯化融合蛋白的方法，包含(i)提供融合蛋白，以及(ii)通过基于蛋白质A或蛋白质G的层析媒介纯化融合蛋白。
或者可以通过公知的分子生物学技术表达融合蛋白。任何分子选殖技术的标准手册提供了详细的方法，通过重组DNA和RNA的表达以制造本发明融合蛋白。为了构建表达本发明融合蛋白的基因，将氨基酸序列反向转译为核酸序列，以针对表达基因的生物体较佳使用优化的密码子。接着，制备编码肽或蛋白质的基因，通常是通过合成编码融合蛋白和必需调控因子的重叠的寡核苷酸。组装合成的基因并将其插入所需的表达载体中。因此，本发明包含那些编码本发明融合蛋白的合成核酸序列，且核酸构建的特征在于在非编码序列的改变并不会改变其编码分子的生物活性。将合成的基因插入合适的选殖载体，获得重组体并描绘其特征。在对于所选表达系统和宿主合适的条件下表达融合蛋白。通过蛋白A或蛋白G的亲和性管柱(例如
或
)纯化融合蛋白。
可在哺乳动物细胞、低等真核生物或原核生物制备本发明融合蛋白。哺乳动物细胞的例子包含猴COS细胞、CHO细胞、人类肾脏293细胞、人类上皮A431细胞、人类Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、其它经转型的灵长类细胞株、正常二倍体细胞、衍生自原生组织、原生外植体(primary explants)、HeLa细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞的体外培养的细胞株。
本发明还提供了一种制备免疫球蛋白G的单链Fc(sFc)区域的方法，包含突变、取代或删除位于IgG的Fc铰链区的Cys。在一个实施例中，以Ser、Gly、Thr、Ala、Val、Leu、Ile或Met取代Cys。在另一个实施例中，删除Cys。在额外的实施例中，删除铰链的一个片段。
本发明更提供一种制备融合蛋白的方法，包含：(a)提供生物活性分子和包含铰链区的IgG Fc片段，(b)通过氨基酸取代和/或删除突变铰链区，以形成无双硫键的突变的Fc，以及(c)结合生物活性分子和突变的Fc。
b.融合蛋白的应用
可通过静脉、皮下、肌内，或通过任何粘膜表面(例如口服、舌下、颊内、鼻腔、直肠、阴道)，或通过肺部途径给予本发明融合蛋白。
本发明融合蛋白的剂量变化取决于受试者和特定的给药模式。根据本领域技术人员公知的一些因素，包含，但不限于融合蛋白种类、受试者的物种和受试者的体重，改变所需的剂量。剂量范围可为0.1至100,000μg/kg体重。可在整个24小时期间或通过持续输注给予单一剂量或多剂量的融合蛋白。可以连续地或以特定时间表施用融合蛋白。可由从动物模型获得的剂量-反应曲线推断有效剂量。
4.具体实施方案
本发明的具体实施方案包含，但不限于以下：
(1)一种融合蛋白，包含IgG分子的Fc片段，以及生物活性分子，其中Fc片段为单链Fc(sFc)。
(2)如(1)所述的融合蛋白，其中Fc片段包含铰链区。
(3)如(2)所述的融合蛋白，其中铰链区被突变且不会形成双硫键。
(4)如(2)所述的融合蛋白，其中铰链区包含选自由SEQ ID NO:1-60所组成群组中的氨基酸序列。
(5)如(2)所述的融合蛋白，其中铰链区包含SEQ ID NO:23或27的氨基酸序列。
(6)如(1)所述的融合蛋白，其中生物活性分子为细胞激素、生长因子、激素或其功能部分。
(7)如(1)所述的融合蛋白，其中生物活性分子为红血球生成素、Factor IX、IFNα、GCSF或IFNβ。
(8)如(1)所述的融合蛋白，其中生物活性分子通过突变的铰链区连接Fc片段。
(9)如(1)所述的融合蛋白，其中融合蛋白的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:64、65、67、69和71所组成的群组。
(10)一种药学组合物，包含如(1)至(9)中任一所述的融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。
(11)一种制备融合蛋白的方法，包含：
a)提供生物活性分子和包含铰链区的Fc片段，
b)通过氨基酸取代和/或删除突变铰链区，以形成突变的Fc，以及
c)结合生物活性分子和突变的Fc。
(12)如(11)所述的方法，其中铰链区通过取代和/或删除Cys残基被突变。
(13)如(11)所述的方法，其中生物活性分子通过铰链区与突变的Fc结合。
(14)如(11)所述的方法，其中生物活性分子为细胞激素、生长因子、激素或其功能部分。
(15)如(11)所述的方法，其中生物活性分子为红血球生成素、Factor IX、IFNα、GCSF或IFNβ。
本发明额外的具体实施例包含，但不限于以下实施例。
实施例
实施例1.红血球生成素单链FC融合蛋白(EPO-sFc)
1.融合蛋白
在本实施例中，制备的融合蛋白具有上述讨论的式1结构：
(B)-(铰链)-(CH2-CH3)
其中：
生物活性分子(B)为红血球生成素(EPO)蛋白(SEQ ID NO:61)；
铰链区(铰链)为突变的IgG1铰链(SEQ ID NO:27)；以及
(CH2-CH3)为IgG1的CH2-CH3(SEQ ID NO:72)。
EPO-sFc融合蛋白的全长氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:64所示。
2.表达载体
利用DNA表达载体制备EPO-sFc。通过装配聚合酶链反应(assembly polymerasechain reaction(PCR))方法，使用重叠引子，以构筑红血球生成素单链Fc融合蛋白(EPO-sFc)的DNA片段。之后，将EPO-sFc片段接合进入pZD载体(pcDNA3.1Neo，Invitrogen，Carlsbad，CA，货号V790-20，具有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因)的PacI和EcoRV切位，以获得如图2所示的pZD/EPO-sFc，再将其转形进入大肠杆菌(E.coli)中。表达载体构建包含作为筛选标志的吉欧霉素(zeocin)抗性基因。
实施例2.制造EPO-sFc的稳定型重组细胞株的建立
将CHOdhfr-细胞以胰蛋白酶处理，并且将其以3x106细胞/mL的浓度再悬浮于CP-T缓冲液(Cyto pluse Cat.CP-T)中。利用电穿孔(PA4000
electroporator，CytoPulse Sciences)方式，以10μg质粒pZD/EPO-sFc转染0.2mL细胞悬浮液(6x105细胞)。在非选择性培养基中生长48小时后，在含有IMDM、10％胎牛血清(FBS)、吉欧霉素(InvitrogenCat.1486406)和5nM MTX(Sigma Cat.BCL5707V)的选择性完全培养基中培养转染子(transfectants)，以获得高产选殖株zE93。利用Q-ELISA(
Epo ELISAkit)侦测并定量培养基中分泌性融合蛋白的表达。
在含有10％FBS、吉欧霉素和0.1μM MTX的IMDM培养基的10厘米培养皿中培养原始的zE93细胞。将细胞培养于37℃、湿度固定、空气成分含5％二氧化碳(95％air/5％CO2)的培养箱(Model 3326,Forma scientific)内。为了使细胞适应无血清的培养基，将培养基由IMDM改成JRH无血清培养基并补充5％FBS、吉欧霉素和0.1μM MTX。当细胞变得稳定时，以胰蛋白酶处理使细胞由10厘米培养皿分离，且之后将其转移至含有相同比例FBS的50mL JRH无血清培养基的搅拌式培养瓶中。当细胞于3-5天内达到90％满盘(confluency)时，将细胞传代进入含有较低比例FBS的JRH无血清培养基的搅拌式培养瓶内。通过逐步将FBS比例由10％减少至0％，使细胞适应较低血清的环境。
利用
Epo ELISA kit(R&D Systems Inc.,CN:DEP00)定量血清样品中EPO-sFc融合蛋白的浓度。在利用融合蛋白执行正式测试前，将血清稀释倍数优化，并对标准品、对照组和样品进行盘格设定(plate layout)。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。
通过筛选、限数稀释法和MTX浓度筛选，成功获得高产选殖株，以最终制造包含连接单链Fc的重组EPO的融合蛋白(即EPO-sFc)。纯化所得的融合蛋白以供进一步体外或体内生物活性测试和药物动力学研究。
实施例3.EPO-sFc的层析纯化
利用蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM)和DEAE树脂(DEAE FF阴离子交换管柱)纯化EPO-sFc。纯化之后，利用定量ELISA分析相对应的回收率，并利用SDS-PAGE分析各自的纯度。EPO-sFc的详细纯化步骤叙述如下。
1.MabSelect SuReTM纯化
将来自高产EPO-sFc细胞株的培养基加入基于蛋白质A的MabSelect SuReTM管柱(GE；货号：11-0034-93)中，加载比率是1mL树脂对应约4.8mg。在二个清洗步骤后，以pH 3.0洗脱缓冲溶液洗脱融合蛋白，且之后将洗出液中和至pH 8.8。利用Q-ELISA(
EPO ELISA kit)分析MabSelect SuReTM洗出液，以测定含量和回收率。回收率为65.8％，表示利用MabSelect SuReTM蛋白质A管柱可有效结合和纯化设计的EPO-sFc(表3)。
2.DEAE FF纯化
在加入DEAE FF 1mL Hitrap管柱前，将缓冲液交换至DEAE FF平衡缓冲液。之后，将由如实施例2所述高产细胞株制备的含有EPO-sFc的细胞培养基加入DEAE FF 1mLHitrap管柱中，加载比率是1mL树脂对应约5.92mg。在酸洗步骤后，利用含有130mM NaCl的40mM Tris缓冲液(pH 8.0)洗脱主峰。利用Q-ELISA
EPO ELISA kit)分析DEAE FF洗出液。总回收率为15.48％(表3)。
3.结果
表3分别描述关于利用MabSelect SuReTM和DEAE FF纯化的EPO-sFc融合蛋白的信息。表格显示MabSelect SuReTM可通过单一纯化步骤有效率地产生高纯度EPO-sFc。
图4显示，利用以上讨论的方法所产生的EPO-sFc融合蛋白通过SDS-PAGE可展现一条主要条带(泳道1、2和3)。EPO-sFc的分子量介于50-70KDa，具有高含量的糖基化作用，此结果显示于通过过碘酸希夫(Periodic Acid-Schiff(PAS))染色的一式双份的SDS-PAGE胶体上。
唾液酸为EPO-sFc的重要成份之一，可影响其于体内循环中的半衰期。EPO-sFc的分子量介于50-70KDa，具有高含量的糖基化作用。依照表3，分别通过包括MabSelect SuReTM和DEAE FF的不同层析方法可纯化EPO-sFc。MabSelect SuReTM可通过单一纯化步骤有效率地产生高纯度EPO-sFc。DEAE FF阴离子交换树脂可进一步提供完善的纯化方式，以移除可能影响EPO-sFc半衰期的EPO-sFc的低唾液酸同型异构物。
实施例4.EPO-sFc的药物动力学研究
由乐斯科生物科技股份有限公司购入十只大鼠(体重范围介于276-300g)。在药物动力学研究开始前，将所有大鼠隔离并使其适应环境四天。将大鼠分成三个试验组以供药物动力学研究：(1)利用DEAE纯化的EPO-sFc；(2)利用蛋白质A纯化的EPO-sFc；以及(3)原始的重组人类EPO
以16.8μg/kg的剂量对第(1)和(2)组大鼠给药，以3.5μg/kg的剂量对第(3)组大鼠给药。蛋白质是通过皮下(S.C.)给药。将大鼠分组并以皮毛染料标记。以新鲜的样品稀释液(0.25％牛血清白蛋白(AppliChem,CN:A0850,0250))将参考组蛋白质(
3.5μg/mL)和试验组融合蛋白EPO-sFc(DEAE树脂)和EPO-sFc(蛋白质A树脂)(浓度16.8μg/mL)配制于生理食盐水中，供注射之用。所有注射均经由大鼠背颈部的部位进行皮下注射。
在注射后0.5、1、2、5、8、12、24、48、72、96、120和144小时收集血液样品，然后以3,000rpm离心20分钟。将上清液贮存于-70℃。
利用
Epo ELISA kit(R&D Systems Inc.,CN:DEP00)定量血清样品中的EPO浓度。在执行试验前，将血清稀释倍数优化，并对标准品、对照组和样品进行盘格设定。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。通过PKSolutions 2.0TM软件由血清中EPO浓度计算Cmax、Tmax、AUC数值和消除相半衰期(T1/2)。
以DEAE FF纯化的EPO-sFc和
以单一剂量给予大鼠后的皮下(S.C.)注射药物动力学分析如图6所示，以及主要药物动力学特性如表5所示。EPO-sFc-DEAE的半衰期为22.3±0.38小时。相反地，
的半衰期只有6.182±0.675小时。EPO-sFc(DEAE)和
的AUCs分别为327.4±15.13和161.5±23.64ng-小时/mL。EPO-sFc(DEAE)和
的Tmax分别为18±0.00和9.33±2.31小时。
相对于原始EPO
产品，EPO-sFc的半衰期延长高达3倍。因此本发明EPO-sFc可使用于慢性肾脏病(CKD)或癌症病人，以减少注射频率并改进病人的生活质量。
实施例5.EPO-sFc的生物活性试验
将八只雌性BALB/c小鼠(8周龄)分成两组，以测定EPO的生物活性。一组给予参考组药物
另一组则给予本发明EPO-sFc融合蛋白(EPO-sFc)。购入参考组药物(
Johnson and Johnson)，并新鲜配制为浓度336μg/mL(等于40IU/mL)。依照实施例3新鲜配制0.336ng/mL的EPO-sFc融合蛋白(与40IU/mL的
相同摩尔数)。以0.5ml的
或EPO-sFc融合蛋白在第1天皮下注射每一只小鼠，然后在第4至9天、第11天和第13天进行采血。
网状血球数量是红血球生成素生物活性的优良指标，因为其代表最近的生成，并可测定网状血球数量和红血球生成素的效价(potency)。通过FACS测定网状血球数量。将1.0mL的PBS和5.0μL的全血加入聚苯乙烯试管作为未染色的样品。将1.0mL的噻唑橙(Thiazole Orange(BD Retic-CountTM,cn:349204))和5.0μL的全血加入聚苯乙烯试管作为染色的样品。将两试管于黑暗中在室温下反应30分钟，然后于反应后3.5小时内进行分析。将样品轻轻混合后立即进行分析。利用流式细胞仪(BD FACSCaliburTM)测定网状血球，并利用CellQuest ProTM软件进行分析。计算各样品中网状血球的百分比，以利用PK solutions2.0软件(Summit,Montrose,CO,USA)评估曲线下的功效面积(AUEC)和网状血球的最大百分比(RETmax)。
通过测定AUEC和RETmax，将网状血球数量用来比较参考组药物和EPO-sFc融合蛋白的活性(如表7所示)。
和EPO-sFc融合蛋白的0至13小时的AUEC分别为88.69和91.03ng·小时/ml。此外，
和EPO-sFc融合蛋白的RETmax分别为11.12％和10.48％。AUEC和RETmax结果显示，本实施例中EPO-sFc具有与
相当的生物活性，EPO-sFc融合蛋白的单链Fc部分并未显著地干扰EPO部分的功能。
实施例6.FACTORIX单链FC融合蛋白(FIX-sFc)
1.融合蛋白
在本实施例中，制备的融合蛋白具有上述讨论的式1结构：
(B)-(铰链)-(CH2-CH3)
其中：
生物活性分子(B)为Factor IX蛋白(FIX)(SEQ ID NO:62)；
铰链区(铰链)为突变的IgG1铰链(SEQ ID NO:23)；以及
(CH2-CH3)为IgG1的CH2-CH3(SEQ ID NO:63)。
FIX-sFc融合蛋白的全长氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:65所示。
2.表达载体
利用DNA表达载体制备FIX-sFc。通过装配聚合酶链反应方法，使用重叠引子，以构筑Factor IX的DNA片段。Factor IX单链Fc融合蛋白(FIX-sFc)的全长基因是由反应混合物放大，将其接合进入pZD载体(pcDNA3.1Neo，Invitrogen，Carlsbad，CA，货号V790-20，具有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因)的PacI和ApaI切位，以获得如图3所示的pZD/FIX-sFc，再将其转形进入大肠杆菌中。表达载体构建包含作为筛选标志的吉欧霉素抗性基因。
实施例7.制造FIX-sFc的稳定型重组细胞株的建立
CHOdhfr-细胞以胰蛋白酶处理，并且将其以3x106细胞/mL的浓度再悬浮于CP-T缓冲液(Cyto pluse Cat.CP-T)中。然后，为了表达rhFIX-sFc，利用电穿孔(PA4000
electroporator，Cyto Pulse Sciences)方式，以15μg质粒pZD/FIX-sFc转染0.2mL细胞悬浮液(6x105细胞)。在非选择性培养基中生长48小时后，在含有IMDM、10％胎牛血清(FBS)、遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen Cat.10131-027)和5nM MTX(SigmaCat.M-8407)的选择性完全培养基中培养转染子，以获得高产选殖株N18。当细胞于96孔盘中达到满盘时，利用Q-ELISA评估rhFIX-sFc量，并将具有高表达的选殖株转移至6孔盘中。在利用Q-ELISA测定含有FIX-sFc的培养基的浓度前，以每孔洞1x105细胞的浓度传代这些选殖株，并允许其生长7天。
以1:1000(1μg/mL)的比例将捕获抗体(小鼠Factor IX单株抗体，Bioporto，Denmark，Cat.HYB 133-09)配制于碳酸盐/碳酸氢盐被覆缓冲液(carbonate/bicarbonatecoating buffer)中供使用。将100μl稀释的捕获抗体加入ELISA微量盘的孔洞中，并于4℃隔夜培养。以1:1000的比例将侦测抗体(兔factor IX多株抗体，Abcam，(U.K.)，Cat.Ab23335)稀释于PBST(PBS含有0.05％Tween 20)中，并加入ELISA微量盘内。将HRP偶联抗体(过氧化酶标记山羊抗兔抗体(Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Rabbit Ab),Jackson ImmunoResearch,(USA),Cat.111-035-144)和TMB过氧化酶底物(KPL,Cat.53-00-03)用于呈色。最终，加入100μl的1N硫酸停止反应。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。利用公式(X＝[a/(Y-Y0)-1](1/b)x X0)测定FIX-sFc的浓度，并利用PK solution 2.0TM软件由FIX-sFc浓度计算起始浓度(C initial)数值、AUC数值和消除相半衰期(T1/2)。
在含有5％FBS、吉欧霉素和0.01μM MTX的IMDM培养基的10厘米培养皿中培养原始的N18选殖株。将细胞培养于37℃、湿度固定、空气成分含8％二氧化碳(92％air/8％CO2)的培养箱(Model 3326,Forma scientific)内。为了使细胞适应无血清的培养基，将培养基由IMDM改成
325PF CHO无血清培养基并补充2％FBS、吉欧霉素和0.02μM MTX。当细胞变得稳定时，以胰蛋白酶处理使细胞由10厘米培养皿分离，且之后将其转移至含有相同比例FBS的50mL
325PF CHO无血清培养基的搅拌式培养瓶中。当细胞于3-5天内达到90％满盘时，将细胞传代进入含有较低比例FBS的
325PF CHO无血清培养基的搅拌式培养瓶内。通过逐步将FBS比例由10％减少至0％，使细胞适应较低血清的环境。为了进一步提高rhFIX-sFc的产量和活性，利用pZD/FIX-sFc再转染选殖株。之后利用FACS分选来自高产选殖株N18-reZB的细胞，以在此分离高产细胞群并于
325PF CHO无血清培养基中生长。通过不同MTX条件测试来自选殖株N18-reZB的细胞，以筛选制造高产量rhFIX-sFc的细胞。
在一轮筛选后，进一步以Q-ELISA和MTX浓度筛选来筛选高产选殖株N18-reZB-sp4-sp5。接着，通过分选以pZD/FIX-sFc再转染无血清转植株，以及MTX浓度筛选和功能筛选，以产生高产选殖株。于此过程中获得N18-reZB-sp4-sp5。如以Q-ELISA所测得，在N18-reZB-sp4-sp5分批培养中的累积总量为约53.4μg/mL。
实施例8.FIX-sFc的层析纯化
利用蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM)和IXSelect树脂纯化FIX-sFc。纯化之后，利用定量ELISA分析相对应的回收率，并利用SDS-PAGE分析各自的纯度。FIX-sFc的详细纯化步骤叙述如下。
1.MabSelect SuReTM纯化
将FIX-sFc制造细胞株的培养基加入基于蛋白质A的MabSelect SuReTM管柱中，加载比率是1mL树脂对应约1.84mg。在二个清洗步骤后，以pH3.0缓冲溶液由管柱洗脱出融合蛋白。利用Q-ELISA分析MabSelect SuReTM洗出液，以测定含量和回收率。利用MabSelectSuReTM可有效地捕获FIX-sFc，且单一纯化步骤已经可产生高度纯化的制品(如图5泳道2所示)。
2.IXSelect纯化
将IXSelect亲和性树脂(GE；no.:17-5505-01)充填于1mL管柱中。将直接针对FIX的单株抗体与树脂耦合。加载pH值的范围为6.5-8.0。将FIX-sFc培养基加入IXSelect管柱中而无缓冲液交换。加载比率是1mL树脂对应约1.69mg。在清洗步骤以移除未结合物质后，利用含有2M MgCl2的20mM Tris缓冲液(pH 7.4)洗脱主峰。之后，利用Q-ELISA分析IXSelect洗出液。
3.结果
表4分别描述关于利用MabSelect SuReTM和IXSelect亲和性树脂纯化FIX-sFc融合蛋白的信息。表格显示MabSelect SuReTM和IXSelect可通过单一纯化步骤有效率地产生高纯度FIX-sFc。
图5显示，利用以上讨论的方法所产生的FIX-sFc融合蛋白通过SDS-PAGE可展现一条主要条带(泳道1和2)。Factor IX-sFc的分子量介于100-110KDa，具有高含量的糖基化作用，此结果显示于通过过碘酸希夫染色的一式双份的SDS-PAGE胶体上。MabSelect SuReTM和IXSelect的回收率分别为88.34％和20.05％(如表4所示)。如图5所示，以基于蛋白质A的MabSelect SuReTM管柱层析通过具有高产率和纯度的单一纯化步骤可有效率地纯化FIX-sFc，其原因在于设计融合蛋白FIX-sFc的sFc与蛋白质A/G良好的结合特性。
实施例9.FIX-sFc的药物动力学研究
由乐斯科生物科技股份有限公司购入八只SD大鼠(体重范围介于315-375g)。将大鼠随机分成二组进行药物动力学(PK)研究：(1)以重组FIX(贝赋)作为参考组药物；以及(2)本发明FIX-sFc。在第0天经由尾静脉以剂量1mg/kg对第(1)和(2)组大鼠投药。依据试验时程表，在注射后0、0.25、4、8、24、48、72、96和168小时收集大鼠的血液样品。将无凝结剂的血液样品置于室温至少30分钟，利用3,000rpm离心20分钟分离血清。将血清样品分装并贮存于-70℃直到分析使用。
利用碳酸盐/碳酸氢盐被覆缓冲液，以1:1000(1μg/mL)的比例配制稀释的捕获抗体(小鼠Factor IX单株抗体，Bioporto，Denmark，Cat.HYB 133-09)。将缓冲液胶囊(Sigma,Cat.#C-3041)溶解于100mL ddH2O中以产生0.05M缓冲液(pH 9.6)，使用0.2μm过滤器过滤，并储存于4℃。将100μl稀释的捕获抗体加入ELISA微量盘的孔洞中，并于4℃隔夜培养。利用200μl阻断液(PBS(pH 7.2)含有2.0％BSA)对微量盘进行阻断，并以200μl的PBS(PBS(pH7.2))清洗微量盘三次。分别将100μl的贝赋(浓度为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL和1.5625ng/mL)和对应浓度的FIX-sFc加入每个ELISA微量盘的孔洞中，并于37℃培养1小时。然后，以200μl的PBST(PBS含有0.05％Tween 20)清洗ELISA微量盘三次。以1:1000的比例将侦测抗体(兔factor IX多株抗体，Abcam，(U.K.)，Cat.Ab23335)稀释于PBST(PBS含有0.05％Tween 20)中，并加入ELISA微量盘内。在培养后，以PBST清洗ELISA微量盘三次。将HRP偶联抗体(过氧化酶标记山羊抗兔抗体(Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Rabbit Ab),Jackson ImmunoResearch,(USA),Cat.111-035-144)和TMB过氧化酶底物(KPL,Cat.53-00-03)加入微量盘以呈色。最后，使用100μl的1N硫酸停止反应。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的稀释血清的吸光值。利用公式(X＝[a/(Y-Y0)-1](1/b)x X0)测定FIX-sFc的浓度。利用PK solution 2.0TM软件经由FIX-sFc浓度计算起始浓度数值、AUC数值和消除相半衰期(T1/2)。
以MabSelect SuReTM纯化的FIX-sFc和贝赋以单一剂量给予大鼠后的静脉(I.V.)注射药物动力学分析如图7所示，以及主要药物动力学特性如表6所示。FIX-sFc和贝赋的半衰期分别为56.0±13.1和11.91±2.54小时。FIX-sFc和贝赋的AUCs分别为19080.3±2606.4和46594.40±3634.08ng-小时/mL。FIX-sFc和贝赋的起始浓度分别为4668.0±447.5和11790.98±4898.85ng/mL。
在利用静脉(I.V.)注射投药于大鼠体内时，本发明FIX-sFc的半衰期为约56小时，其为贝赋半衰期(11.91±2.54小时)的五倍。因此，FIX-sFc对血友病病人为长效药物，可减少注射频率并改进病人的生活质量。药物动力学数据指出，本发明FIX-sFc可能结合Fc受体，造成较低的起始浓度和AUC，并且缓慢释放回血流中，造成其较长的半衰期。
实施例10.FIX-sFc的生物活性试验
利用活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time(APTT))试验测定FIX-sFc的生物活性。简单地说，新鲜配制参考组药物(贝赋,Wyeth)和FIX-sFc，并将其以10、5和2.5μg/ml(最终体积500μL)的浓度稀释于FIX缺乏血浆(HaematologicTechnologies,Inc)中。然后，将样品(贝赋或FIX-sFc)与等体积的
FSL试剂(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH)混合，并于37℃培养3分钟。最后，加入CaCl2停止凝血反应，并观察血块形成。利用并行线测定法(parallel line method(PLA analysis))记录和计算凝血时间和比活性。
如表8所示，凝血时间是取决于贝赋或FIX-sFc的浓度。对浓度为2.5、5.0和10.0μg/ml的FIX-sFc的平均APTT结果分别为30.1、26.2和25.5秒。如表8所示，与贝赋相比较，FIX-sFc具有相似的相对效价(relative potency)和比活性。FIX-sFc维持与贝赋相等的生物活性，此显示单链Fc并不会干扰于融合蛋白中的FIX的功能。
实施例11.干扰素α单链FC融合蛋白(IFNα-sFc)
1.融合蛋白
在本实施例中，制备包含干扰素α(IFNα)的融合蛋白，用于之后的实施例中。IFNα是IFNα分子大家族的代表性示例。
具体来说，制备的IFNα单链融合蛋白(IFNα-sFc)具有上述讨论的式1结构：
(B)-(铰链)-(CH2-CH3)
其中：
生物活性分子(B)为干扰素α(IFNα)蛋白(SEQ ID NO:66)；
铰链区(铰链)为突变的IgG1铰链(SEQ ID NO:23)；以及
(CH2-CH3)为IgG1的CH2-CH3(SEQ ID NO:72)。
IFNα-sFc融合蛋白的全长氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:67所示。
2.表达载体
利用DNA表达载体制备IFNα-sFc。通过装配聚合酶链反应方法，使用重叠引子，以构筑IFNα-sFc的DNA片段。然后，将IFNα-sFc片段接合进入pZD载体(pcDNA3.1Neo，Invitrogen，Carlsbad，CA，货号V790-20，具有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因)的PacI和EcoRV切位，以获得如图8所示的pZD/IFNα-sFc，再将其转形进入大肠杆菌中。表达载体构建包含作为筛选标志的吉欧霉素抗性基因。
实施例12.制造IFNα-sFc的稳定型重组细胞株的建立
CHOdhfr-细胞以胰蛋白酶处理，并且将其以3x106细胞/mL的浓度再悬浮于CP-T缓冲液(Cyto pluse Cat.CP-T)中。利用电穿孔(PA4000
electroporator，CytoPulse Sciences)方式，以10μg质粒pZD/IFNα-sFc转染0.2mL细胞悬浮液(6x105细胞)。在非选择性培养基中生长48小时后，在含有IMDM、10％胎牛血清、吉欧霉素(InvitrogenCat.1486406)和5nM MTX(Sigma Cat.BCL5707V)的选择性完全培养基中培养转染子，以获得高产选殖株22-123-327-117-Re117。利用Q-ELISA侦测并定量培养基中分泌性融合蛋白的表达。
在含有10％FBS、吉欧霉素和0.1μM MTX的IMDM培养基的10厘米培养皿中培养原始的22-123-327-117-Re117细胞。将细胞培养于37℃、湿度固定、空气成分含5％二氧化碳(95％air/5％CO2)的培养箱(Model 3326,Forma scientific)内。为了使细胞适应无血清的培养基，将培养基由IMDM改成JRH无血清培养基并补充5％FBS、吉欧霉素和0.1μM MTX。当细胞变得稳定时，以胰蛋白酶处理使细胞由10厘米培养皿分离，且之后将其转移至含有相同比例FBS的50mL JRH无血清培养基的搅拌式培养瓶中。当细胞于3-5天内达到90％满盘时，将细胞传代进入含有较低比例FBS的JRH无血清培养基的搅拌式培养瓶内。通过逐步将FBS比例由10％减少至0％，使细胞适应较低血清的环境。
利用本公司内部生产的IFNα-sFc ELISA试剂盒定量血清样品中IFNα-sFc融合蛋白的浓度。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。通过筛选、限数稀释法和MTX浓度筛选，成功获得高产选殖株，以最终制造包含连接单链Fc的重组IFNα8的融合蛋白(即IFNα-sFc)。纯化所得的融合蛋白以供进一步体外或体内生物活性测试和药物动力学研究。
实施例13.IFNα-sFc的层析纯化
利用蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM)纯化IFNα-sFc。纯化之后，利用定量ELISA分析相对应的回收率，并利用SDS-PAGE分析各自的纯度。IFNα-sFc融合蛋白的详细纯化步骤叙述如下。
1.MabSelect SuReTM纯化
将来自高产IFNα-sFc细胞株的培养基加入基于蛋白质A的MabSelect SuReTM管柱(GE；货号：11-0034-93)中，加载比率是1mL树脂对应约4.6mg。在二个清洗步骤后，以0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱缓冲溶液洗脱融合蛋白。利用洗脱缓冲溶液洗脱出主峰。利用Q-ELISA分析MabSelect SuReTM洗出液，以测定含量和回收率。
2.结果
利用不同缓冲液条件以MabSelect SuReTM纯化IFNα-sFc。结果显示，0.1M Gly(pH3.0)洗脱缓冲溶液可有效率地纯化IFNα-sFc，其具有可供进一步物化特性测定的高纯度。如图9所示，利用SDS-PAGE分析纯化的IFNα-sFc样品的洗出液，显示于评估的所有缓冲液中，纯化的IFNα-sFc以一条主要条带的形式展现。利用稳定添加剂(蔗糖或尿素)于洗脱缓冲溶液中以预防沉淀。当利用尿素于缓冲液中作为添加剂时会出现一些低分子量的杂质。发现于具有蔗糖添加剂的甘氨酸洗脱缓冲溶液中的IFNα-sFc的纯度可>95％。
实施例14.IFNα-sFc的药物动力学研究
由乐斯科生物科技股份有限公司购入八只大鼠(体重范围介于276-300g)。在药物动力学(PK)研究开始前，将所有大鼠隔离并使其适应环境四天。将大鼠分成四个试验组以供药物动力学研究：(1)派罗欣(聚乙二醇化的IFNα)，(2)本发明IFNα-sFc，(3)佩乐能(聚乙二醇化的IFNα)，以及(4)罗荛愫(重组IFNα)。以310pmol/kg的剂量对大鼠给药，其换算相当于18.6μg/kg的派罗欣、13.95μg/kg的IFNα-sFc、9.7μg/kg的佩乐能和5.89μg/kg的罗荛愫。以新鲜的样品稀释液(PBS内含0.2％牛血清白蛋白(AppliChem,CN:A0850,0250))新鲜配制所有样品。将大鼠分组并以皮毛染料标记。所有注射均经由大鼠背颈部的部位进行皮下注射。
分别在注射后0.5、1、2、4、6、12、24、36、48、60、72、96、120、144、192、240、288和336小时收集血液样品，然后以3,000rpm离心20分钟。将上清液贮存于-70℃。对给予罗荛愫的大鼠于注射后0.08、0.25和8小时收集额外的血液样品并贮存。
利用ELISA方法定量血清样品中的干扰素浓度。在执行试验前，将血清稀释倍数优化，并对标准品、对照组和样品进行盘格设定。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。通过PK Solutions 2.0TM软件由血清中IFN浓度计算Cmax、Tmax、AUC数值和消除相半衰期(T1/2)。
以单一剂量投药后在不同处理组别的皮下(S.C.)注射药物动力学分析如图10所示，以及其主要药物动力学特性如表9所示。派罗欣、IFNα-sFc、佩乐能和罗荛愫的半衰期分别为23.2、50.2、20.8和0.73小时。派罗欣、IFNα-sFc、佩乐能和罗荛愫的AUCs分别为64694.5、60621.9、5307.6和489.2pM/小时。派罗欣、IFNα-sFc、佩乐能和罗荛愫的Tmax分别为32.0、32.0、6.0和0.67小时。
罗荛愫
是第一代重组IFNα产品。派罗欣和佩乐能是第二代IFNα产品，具有聚乙二醇(polyethylene glycol(PEG))结合至天然IFNα。已显示，相较于非聚乙二醇化的形式，加入聚乙二醇可显著地延长IFNα的半衰期。如于表9和图10的药物动力学数据显示，于此实施例也可观察到利用PEG可增加半衰期(将派罗欣和佩乐能的数据与罗荛愫的数据比较)。
表9和图10也显示，相较于派罗欣、佩乐能和罗荛愫，本发明单链Fc融合蛋白甚至更进一步延长IFNα的半衰期。具体来说，IFNα-sFc的半衰期比两个聚乙二醇化的干扰素(派罗欣和佩乐能)的半衰期长2倍以上，且比重组IFNα(罗荛愫)的半衰期长68倍以上。
实施例15.IFNα-sFc的生物活性试验
利用细胞病变效应(cytopathic effect(CPE))抑制试验测定干扰素的抗病毒活性。简单来说，将1.0x 104A549细胞种于96孔盘的孔洞中，并于含有5％二氧化碳的37℃培养箱培养24小时。当细胞生长至铺满单层时，以不同浓度及形式的IFNα处理细胞。从浓度为178ng/mL开始配制干扰素的五倍系列稀释。加入孔洞的干扰素的最终体积为100μl。在24小时后，移除培养基，且以效价为6x 104PFU/mL的鼠脑心肌炎病毒(murineencephalomyocarditis virus(EMCV))感染细胞并培养24小时。于无任何干扰素的病毒对照组的孔洞观察到细胞病变效应(CPE)。将20μl的MTS溶液加入每一个孔洞中，并将微量盘置于含有5％二氧化碳的37℃培养箱培养3小时。利用自动读盘仪于OD 490nm处的光谱分析染色的细胞。所有试验进行三重复并计算总平均。
利用以下公式计算于每一个干扰素浓度的病毒CPE的抑制作用百分比：
“抑制作用(％)＝(OD试验组孔洞–OD病毒对照组)/(OD细胞对照组-OD病毒对照组)”
利用Sigma Plot软件计算四参数罗吉斯曲线(four-parameter logistic curve)和50％病毒复制作用抑制剂量。
此外，对IFNα-sFc(单体)和IFNα-Fc(二聚体)的抗病毒活性进行比较，结果如图11和表10所示。IFN-α-sFc的抗病毒活性(IFN-α-sFc的IC50为0.0061nM)较IFN-α-Fc的抗病毒活性(IFN-α-Fc的IC50为0.0313nM)高出5.1倍，且较派罗欣的抗病毒活性(派罗欣的IC50为0.0894nM)高出14.7倍。
总结
由实施例14和15所获得的结果证实，相较于其它IFNα产品，本发明IFNα单链Fc融合蛋白(IFNα-sFc)具有改进的生物特性和优点，包括：(1)通过蛋白质A层析通过增加纯化产率减少生产成本，(2)抗病毒活性的提高，(3)较长的血清半衰期以减少给药频率，以及(4)肾脏清除率的减少。虽然，传统二聚体Fc融合蛋白(IFNα-Fc)和派罗欣的半衰期相较于罗荛愫是延长的，但是其生物活性低于IFNα-sFc。看起来IFNα-Fc和派罗欣的较低的生物活性至少部分可能是由大融合分子(即IFNα-Fc的Fc二聚体，以及派罗欣的分枝的40kDa PEG链)与受体结合的空间上阻碍所引起。
在图10-11和表9-10的结果证明，相较于其它形式的IFNα，本发明单链Fc修饰产生具有延长半衰期和增强生物活性的IFNα。此结果显示，本发明的修饰可用以制造含有基于肽和蛋白质治疗的高效价且有效的药学组合物。
实施例16.IFNα-sFc(单体)和IFNα-Fc(二聚体)对干扰素α受体1(IFNAR1)和干扰素α受体2(IFNAR2)个别结合亲和力的比较
利用动力学/亲和力试验测定干扰素融合蛋白的结合亲和力。
简单来说，将5μg/mL的rhIFNα受体2(IFNAR2)(Sino biotechnology,CN.:10359-H08H)配制于固定化缓冲液(10mM醋酸钠缓冲液(pH 4.0))中。通过常见氨基偶联(aminecoupling)方式将rhIFNAR2固定于CM5感应芯片(GE,CN.:BR-1003-99)上(芯片表面的偶联水平(RL)为800RU)，以表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance(SPR))传感器(GE,Model:Biacore X100)测定。以运行缓冲液(running buffer)(含有0.005％Tween 20的PBS(pH 7.4))通过二倍系列稀释制备含有12.5至200nM IFNα-sFc或IFNα-Fc的样品溶液。利用运行缓冲液对先前步骤制备的溶液进行二倍系列稀释，以制备6.25至100nM IFNα-sFc或IFNα-Fc的单一注入溶液(single injection solutions)。然后，将200nM干扰素α受体1(IFNAR1)(Sino biotechnology,CN.:13222-H08H)溶液与等体积的先前步骤制备的干扰素单一注入溶液混合，以制备干扰素-IFNAR1混合物。IFNAR1的浓度为100nM，而IFNα-sFc或IFNα-Fc的浓度范围介于6.25nM至100nM。利用BIAevaluation软件分析IFNα-sFc或IFNα-Fc的平衡结合常数(Ka)和平衡解离常数(Kd)数值，以通过Kd和Ka计算结合常数(KD)数值。
如图12A-12B所示，IFNα-sFc-IFNAR1和IFNα-Fc-IFNAR1具有相似的结合图形。具体来说，表11显示干扰素的结合相当相似，IFNα-sFc和IFNα-Fc的Ka数值分别为1.4E+06 1/Ms和3.3E+06 1/Ms。然而，在解离阶段，IFNα-sFc-IFNAR1较IFNα-Fc-IFNAR1具有较慢的解离图形(Kd)。如表11所示，IFNα-sFc和IFNα-Fc由IFNAR1解离的解离常数(Kd)分别为5.6E-03和5.6E-02 1/s。基于观察到的结合(Ka)和解离(Kd)样态，IFNα-sFc和IFNα-Fc对IFNAR的交互作用的亲和力(KD)分别为4.0E-09和1.7E-08nM。因此，IFNα-sFc的亲和力比用以形成三元复合物的IFNα-Fc高出4.25倍。
此实施例中所观察到的结合亲和力进一步支持先前实施例中所讨论到的理论，相较于IFNα-Fc，IFNα-sFc的生物活性较强，原因可能源自于单链Fc相较于Fc二聚体在受体结合上具有较少的空间阻碍。
实施例17.颗粒球群落刺激因子单链FC融合蛋白(GCSF-sFc)
1.融合蛋白
在本实施例中，制备的融合蛋白具有上述讨论的式1结构：
(B)-(铰链)-(CH2-CH3)
其中：
生物活性分子(B)为颗粒球群落刺激因子(GCSF)蛋白(SEQ ID NO:68)；
铰链区(铰链)为突变的IgG1铰链(SEQ ID NO:23)；以及
(CH2-CH3)为IgG1的CH2-CH3(SEQ ID NO:72)。
GCSF-sFc融合蛋白的全长氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:69所示。
2.表达载体
利用DNA表达载体制备GCSF-sFc。通过装配聚合酶链反应方法，使用重叠引子，以构筑颗粒球群落刺激因子单链Fc融合蛋白(GCSF-sFc)的DNA片段。之后，将GCSF-sFc片段接合进入pZD载体(pcDNA3.1Neo，Invitrogen，Carlsbad，CA，货号V790-20，具有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因)的PacI和EcoRV切位，以获得如图13所示的pZD-GCSF-sFc，再将其转形进入大肠杆菌中。表达载体构建包含作为筛选标志的吉欧霉素抗性基因。
实施例18.制造GCSF-sFc的稳定型重组细胞株的建立
将CHOdhfr-细胞以胰蛋白酶处理，并且将其以3x106细胞/mL的浓度再悬浮于CP-T缓冲液(Cyto pluse Cat.CP-T)中。利用电穿孔(PA4000
electroporator，CytoPulse Sciences)方式，以10μg质粒pZD-GCSF-sFc转染0.2mL细胞悬浮液(6x105细胞)。在非选择性培养基中生长48小时后，在含有IMDM、10％胎牛血清、吉欧霉素(InvitrogenCat.1486406)和5nM MTX(Sigma Cat.BCL5707V)的选择性完全培养基中培养转染子，以获得高产选殖株zG3-17-41。利用Q-ELISA侦测并定量培养基中分泌性融合蛋白的表达。
在含有10％FBS、吉欧霉素和0.1μM MTX的IMDM培养基的10厘米培养皿中培养原始的zG3-17-41细胞。将细胞培养于37℃、湿度固定、空气成分含5％二氧化碳(95％air/5％CO2)的培养箱(Model 3326,Forma scientific)内。为了使细胞适应无血清的培养基，将培养基由IMDM改成JRH无血清培养基并补充5％FBS、吉欧霉素和0.1μM MTX。当细胞变得稳定时，以胰蛋白酶处理使细胞由10厘米培养皿分离，且之后将其转移至含有相同比例FBS的50mL JRH无血清培养基的搅拌式培养瓶中。通过逐步将FBS比例由10％减少至0％，使细胞适应较低血清的环境。
利用GCSF-sFc ELISA分析定量血清样品中的GCSF-sFc融合蛋白的浓度。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。通过筛选、限数稀释法和MTX浓度筛选，成功获得高产选殖株，以最终制造包含连接单链Fc的重组GCSF的融合蛋白(即GCSF-sFc)。纯化所得的融合蛋白以供进一步体外或体内生物活性测试和药物动力学研究。
实施例19.GCSF-sFc的层析纯化
利用蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM)纯化GCSF-sFc。纯化之后，利用定量ELISA分析相对应的回收率，并利用SDS-PAGE分析各自的纯度。GCSF-sFc的详细纯化步骤叙述如下。
MabSelect SuReTM纯化
将来自高产GCSF-sFc细胞株的培养基加入基于蛋白质A的MabSelect SuReTM管柱(GE；货号：11-0034-93)中，加载比率是1mL树脂对应约3.4mg。在二个清洗步骤后，以0.1MGly(pH3.0)洗脱缓冲溶液洗脱融合蛋白。利用逆相高效能液相层析仪(RP-HPLC)洗脱并分析主峰。也利用Q-ELISA分析MabSelect SuReTM洗出液，以测定含量和回收率。也利用SDS-PAGE分析纯化的GCSF-sFc样品的洗出液。图14显示，GCSF-sFc融合蛋白通过SDS-PAGE可展现一条主要条带。概括来说，通过MabSelect SuReTM可有效率地捕获GCSF-sFc。
实施例20.GCSF-sFc的药物动力学研究
由乐斯科生物科技股份有限公司购入九只大鼠(体重范围介于180-200g)。在药物动力学(PK)研究开始前，将所有大鼠隔离并使其适应环境四天。将大鼠分成三个试验组以供药物动力学研究：(1)GCSF-sFc，(2)来格司亭(格拉诺赛特)，为重组GCSF，以及(3)培非格司亭(纽拉斯塔)，为重组人类GCSF的聚乙二醇化形式。以221.43μg/Kg的GCSF-sFc和摩尔当量为100μg/Kg的来格司亭和培非格司亭的剂量对大鼠给药。以样品稀释液(PBS内含0.2％牛血清白蛋白(AppliChem,CN:A0850,0250))新鲜配制所有GCSF样品。将大鼠分组并以皮毛染料标记。所有注射均经由大鼠背颈部的部位进行皮下注射。
分别在注射后5分钟和0.5、1、2、3、8、12、24、36、48、72、96、120、144与168小时收集血液样品，然后以3,000rpm离心20分钟。将上清液贮存于-70℃。
利用成对的抗体(R&D System,CN:MAB214和R&D System,CN:BAF214)去结合和侦测GCSF，以定量血清样品中的GCSF浓度。在执行试验前，将血清稀释倍数优化，并对标准品、对照组和样品进行盘格设定。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。通过PK Solutions 2.0TM软件由血清中GCSF浓度计算Cmax、Tmax、AUC数值和消除相半衰期(T1/2)。
以单一剂量投药后于大鼠的个别GCSFs的皮下(S.C.)注射药物动力学分析如图15所示，以及其主要药物动力学特性如表12所示。GCSF-sFc、来格司亭和培非格司亭的半衰期分别为17.16、4.1和12.0小时。GCSF-sFc、来格司亭和培非格司亭的Cmax分别为906.9、156.4和480.8ng/mL。GCSF-sFc、来格司亭和培非格司亭的Tmax分别为48、0.5和10.3小时。GCSF-sFc、来格司亭和培非格司亭的AUC分别为50624、790-1292和23202±2921ng-小时/mL。
来格司亭是第一代重组GCSF产品。培非格司亭是GCSF结合PEG(聚乙二醇)的第二代产品。相较于第一代产品(来格司亭)，加入聚乙二醇可延长GCSF的半衰期。如于表12和图15的药物动力学数据显示，于此实施例中也可观察到利用PEG可增加GCSF半衰期(将来格司亭的数据与培非格司亭的数据比较)。
表12和图15也显示，相较于来格司亭和培非格司亭，当GCSF存在于本发明单链Fc融合蛋白中时，甚至更进一步延长GCSF的半衰期。具体来说，GCSF-sFc的半衰期几乎为聚乙二醇化GCSF(培非格司亭)的半衰期的1.5倍，且为重组GCSF(来格司亭)的半衰期的4倍以上。
实施例21.GCSF-sFc的生物活性试验
利用嗜中性白细胞低下的小鼠分析相较于天然GCSF(即来格司亭(格拉诺赛特))的GCSFs效价。在本实施例中，将30只6周龄雄性BALB/cByJNarl小鼠分成六组(即每组5只)。在第0天以环磷酰胺单水合物(Cyclophosphamide monohydrate(CPA)；Sigma,CN.:C7397)(100mg/kg)处理所有小鼠。作为对照组的A组在第1天只接受0.9％氯化钠/0.1％牛血清白蛋白溶液。三个参考组包含接受来格司亭(Chugai,CN.:N3L212)单次注射的B1和B2组，和接受来格司亭四次注射的B3组，三者接受的剂量分别为51.02、116.07和12.75μM/kg。两个试验组分别接受剂量为51.02μM/kg(C1组)和116.07μM/kg(C2组)的GCSF-sFc的单次注射。接受单次注射的组别(A、B1、B2、C1和C2组)于第1天注射，且接受四次注射的组别(B3组)在第1、2、3和4天注射。所有注射是通过皮下注射的途径给药。直到研究结束为止，于投药后的每一天收集血液样品并利用血液分析仪(HEMAVET 950LV)进行分析。也采取CPA处理之前3天(第-3天)的血液样品供参考。将本研究中使用的试验设计概述于表13内。
图16显示以CPA对小鼠进行预处理引起嗜中性白细胞低下，即于经处理小鼠的血液中的嗜中性白细胞数量减少(将所有样品的第-3天和第0天与第1天比较)。然而，发现嗜中性白细胞低下为暂时的现象，且在对照组嗜中性白细胞数量于约8天后缓慢地恢复至以CPA处理之前的水平(参见A组结果)。在观察期间中，以中剂量51.02μM/Kg(B1组)或高剂量116.07μM/Kg(B2组)来格司亭在第一天单次注射者，其于嗜中性白细胞数量增加上并未具有任何高过于在CPA对照组所观察到结果的明显效果(将B1和B2组与A组比较)。相较于A、B1和B2组，在CPA处理后以来格司亭多次投药(四次注射)(B3组)于嗜中性白细胞数量增加上具有一些效果(参见B3组第3-5天)。然而，所观察到的效果极细微且短暂，因为嗜中性白细胞数量上升仅略高于正常范围，且此程度于多次给药期间之后迅速减少至正常水平(参见B3组第5天以及其后)。
相反地，在CPA处理后给予中剂量(51.02μM/Kg)或高剂量(116.07μM/kg)GCSF-sFc的单次给药，可有效地提高嗜中性白细胞数量，其显著地高于对照组和以来格司亭处理的所有组别(将C1和C2组与A、B1、B2和B3组比较)。
因此，相较于天然和聚乙二醇化形式的GCSF，本发明GCSF单链Fc融合蛋白(GCSF-sFc)具有较长的半衰期，且其于嗜中性白细胞低下的动物疾病模型中在增强嗜中性白细胞的分化和增生上较有效力与效率。
实施例22.干扰素β单链FC融合蛋白(IFNβ-sFc)
1.融合蛋白
在本实施例中，制备的融合蛋白具有上述讨论的式1结构：
(B)-(铰链)-(CH2-CH3)
其中：
生物活性分子(B)为干扰素β(IFNβ)蛋白(SEQ ID NO:70)；
铰链区(铰链)为突变的IgG1铰链(SEQ ID NO:23)；以及
(CH2-CH3)为IgG1的CH2-CH3(SEQ ID NO:73)。
IFNβ-sFc的全长氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:71所示。
2.表达载体
利用DNA表达载体制备IFNβ-sFc。通过装配聚合酶链反应方法，使用重叠引子，以构筑IFNβ-sFc的DNA片段。之后，将IFNβ-sFc片段接合进入pZD载体(pcDNA3.1Neo，Invitrogen，Carlsbad，CA，货号V790-20，具有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因)的PacI和EcoRV切位，以获得如图17所示的pZD/IFNβ-sFc，再将其转形进入大肠杆菌中。表达载体构建包含作为筛选标志的吉欧霉素抗性基因。
实施例23.制造IFNβ-sFc的稳定型重组细胞株的建立
CHOdhfr-细胞以胰蛋白酶处理，并且将其以3x106细胞/mL的浓度再悬浮于CP-T缓冲液(Cyto pluse Cat.CP-T)中。利用电穿孔(PA4000
electroporator，CytoPulse Sciences)方式，以10μg质粒pZD-IFNβ-sFc转染0.2mL细胞悬浮液(6x105细胞)。在非选择性培养基中生长48小时后，在含有IMDM、10％胎牛血清、吉欧霉素(InvitrogenCat.1486406)和5nM MTX(Sigma Cat.BCL5707V)的选择性完全培养基中培养转染子，以获得高产选殖株Z-BsFc。利用Q-ELISA侦测并定量培养基中分泌性融合蛋白的表达。
在含有10％FBS、吉欧霉素和0.1μM MTX的IMDM培养基的10厘米培养皿中培养原始的Z-BsFc细胞。将细胞培养于37℃、湿度固定、空气成分含5％二氧化碳(95％air/5％CO2)的培养箱(Model 3326,Forma scientific)内。为了使细胞适应无血清的培养基，将培养基由IMDM改成JRH无血清培养基并补充5％FBS、吉欧霉素和0.1μM MTX。当细胞变得稳定时，以胰蛋白酶处理使细胞由10厘米培养皿分离，且之后将其转移至含有相同比例FBS的50mLJRH无血清培养基的搅拌式培养瓶中。当细胞于3-5天内达到90％满盘时，将细胞传代进入含有较低比例FBS的JRH无血清培养基的搅拌式培养瓶内。通过逐步将FBS比例由10％减少至0％，使细胞适应较低血清的环境。
利用本公司内部生产的IFNβ-sFc ELISA试剂盒定量血清样品中的IFNβ-sFc融合蛋白的浓度。在利用融合蛋白执行正式测试前，将血清稀释倍数优化，并对标准品、对照组和样品进行盘格设定。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。通过筛选、限数稀释法和MTX浓度筛选，成功获得高产选殖株，以最终制造包含连接单链Fc的重组IFNβ的融合蛋白(即IFNβ-sFc)。纯化所得的融合蛋白以进一步供体外或体内生物活性测试和药物动力学研究。
实施例24.IFNβ-sFc的层析纯化
利用蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM)纯化IFNβ-sFc。纯化之后，利用定量ELISA分析相对应的回收率，并利用SDS-PAGE分析各自的纯度。IFNβ-sFc的详细纯化步骤叙述如下。
MabSelect SuReTM纯化
将来自高产IFNβ-sFc细胞株的培养基加入基于蛋白质A的MabSelect SuReTM管柱(GE；货号：11-0034-93)中，加载比率是1mL树脂对应约1.58mg。在二个清洗步骤后，以0.1MGly(pH3.0)洗脱缓冲溶液洗脱融合蛋白。分析由MabSelect SuReTM管柱的主峰洗脱的蛋白质，基于在逆相高效能液相层析仪(RP-HPLC)所观察到的明显的图峰和由SDS-PAGE所获得的明显的条带，显示此蛋白质具有相当的纯度(数据未显示)。如表14所示，也利用Q-ELISA分析MabSelect SuReTM洗出液，以测定含量和回收率。
实施例25.IFNβ-sFc的药物动力学研究
由乐斯科生物科技股份有限公司购入八只Lewis大鼠(体重范围介于200-230g)。在药物动力学(PK)研究开始前，将所有大鼠隔离并使其适应环境四天。将大鼠分成两个试验组以供药物动力学研究：(1)由天然纤维母细胞衍生的人类IFNβ-1a(利比)和(2)IFNβ-sFc。以37μg/Kg的剂量对大鼠给予利比和IFNβ-sFc。以新鲜的样品稀释液(PBS内含0.2％牛血清白蛋白(AppliChem,CN:A0850,0250))新鲜配制所有样品。将大鼠分组并以皮毛染料标记。所有注射均经由大鼠背颈部的部位进行皮下注射。
分别在注射后5分钟和0.5、1、4、7、12、24、36、48、72、96、120、144和168小时收集血液样品，然后以3,000rpm离心20分钟。将上清液贮存于-70℃。
利用针对IFNβ的VeriKineTM人类干扰素βELISA试剂盒(PBL assay science,CN.:41410)定量血清样品中的干扰素浓度。利用
Pro 5软件获得波长450nm和600nm处的吸光值。通过PK Solutions 2.0TM软件由血清中干扰素浓度计算Cmax、Tmax、AUC数值和消除相半衰期(T1/2)。
以单一剂量投药后于大鼠的IFNβ的皮下(S.C.)注射药物动力学分析如图18所示，以及主要药物动力学特性如表15所示。利比和IFNβ-sFc的半衰期分别为18.92-23.57和31.89-37.7小时。利比和IFNβ-sFc的Cmax分别为3.2±0.71和6.55±0.78ng/mL。利比和IFNβ-sFc的Tmax分别为12±0和9.55±3.61小时。利比和IFNβ-sFc的AUCs分别为115±18.38和273±2.83ng-小时/mL。
如图18和表15所示，当与利比(天然形式的IFNβ)的半衰期相比较时，本发明IFNβ-sFc展现较佳的半衰期延长。
实施例26.IFNβ-sFc的生物活性试验
IFNβ是一种抗发炎的细胞激素，并作为治疗多发性硬化症(multiple sclerosis(MS))的主要药物之一。MS是中枢神经系统最常见的炎症疾病。免疫细胞穿过血脑屏障并攻击髓鞘，导致MS病人神经系统的讯息的无效传递。每周多次注射IFNβ药物对控制MS的复发是必需的。已报导MS的IFNβ的抗发炎机制涉及于针对髓鞘成份的T细胞反应中由Th1至Th2的细胞激素平衡的偏离。除Th1和Th2细胞群以外，发现另外两个重要的促发炎细胞激素，包括骨桥蛋白(osteopontin(OPN))，在MS致病机转中于CNS发炎反应中扮演重要角色。已显示IFNβ在衍生自PBMC的初级T细胞中可抑制OPN的生成，且此抑制发生在CD4+T细胞层次。
在本研究中，在骨桥蛋白抑制试验中评估IFNβ-sFc的生物活性，并将其生物活性与自然的IFNβ-1a(利比)相比较。简单来说，骨桥蛋白抑制试验依照以下说明进行：
由全血分离出人类PBMCs。为刺激PBMC，于每一孔洞以100μl的浓度为1μg/mL的抗CD3抗体预涂覆96孔平底组织培养盘，并将其于4℃隔夜培养。将每一孔洞以200μl RPMI1640(含有FBS)清洗，并种下5×104细胞。以1μg/mL抗CD28抗体、IFNβ-sFc(1.5或10ng/mL)或利比(1.5或10ng/mL)处理各个孔洞，并将培养盘置于37℃、空气成分含5％二氧化碳、湿度固定的培养箱内培养48小时。在培养后，由每一孔洞收集上清液并贮存于-70℃冰箱中。利用ELISA(R&D systems,CN.:DOST00)测定人类骨桥蛋白(OPN)含量。
依照以下方式计算于每一样品中的OPN浓度：以OPN为x轴，以吸光值(OD450-OD570)为y轴，绘制个别的标准曲线，并利用四参数罗吉斯方程式拟合曲线。如Chen M.等人发表的文献”Regulatory effects of IFN-βon production of osteopontin and IL-17by CD4+T Cells in MS”Eur.J.Immunol.39,2525-2536(2009)所述，利用以下方程式：X＝X0×{[a/(Y-Y0)-1]^(1/b)}计算OPN浓度。
如图19所示，于以1.5ng/mL(73.4±0.8％)和10ng/mL(79.5±3.6％)的试验样品处理的细胞中，本发明单链Fc融合蛋白(IFNβ-sFc)可显著地抑制OPN的生成。以参考组药物(利比)处理细胞证实于浓度1.5ng/mL(88.4±2.7％)和10ng/mL(81.3±13.3％)对OPN具有相似的抑制。此结果显示，加入单链Fc并未显著地阻碍融合蛋白的IFNβ部分有效率地结合其受体的能力，原因在于IFNβ-sFc具有与天然IFNβ相当的生物活性。
所有说明书中所公开的发明技术特点可以任意方式组合。说明书中公开的每一技术特点可以提供相同、等同或相似目的的其它方式替换。因此，除非另有特别说明，文中所有公开的特点均只是等同或相似特点的一般系列的实例。
由上述可知，本领域技术人员能轻易地了解本发明的必要特征，在不脱离其精神与范围下能就本发明做许多改变与调整以应用于不同用途与条件。
表1、突变铰链区的示例
X：Ser、Gly、Thr、Ala、Val、Leu、Ile、Met或被删除
表2、衍生自IgG1的突变铰链区的氨基酸序列示例
1画底线的残基表示与野生型IgG序列相关的突变位点。
表3、通过蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM)和DEAE树脂(DEAE FF)层析管柱的EPO-sFc纯化
表4、通过蛋白质A树脂(MabSelect SuReTM)和IXSelect树脂层析管柱的FIX-sFc纯化
表5、重组EPO
和由DEAE FF纯化的EPO-sFc的药物动力学特性
数值表示平均值±标准差(变异系数)。
*和
相比，P<0.05
表6、重组FIX(贝赋)和由MabSelect SuReTM纯化的FIX-sFc的药物动力学特性
数值表示平均值±标准差(变异系数)
表7、重组EPO
和EPO-sFc间的效价比较
表8、重组FIX(贝赋)和FIX-sFc间的效价比较
1相对效价是试验样品比活性相对于重组FIX比活性(即200IU/mg)的比值。
表9、在皮下注射后干扰素在大鼠中的药物动力学特性
表10、在皮下注射后干扰素在大鼠中的抗病毒活性
1比值为各样品IC50与IFNα-sFc的IC50的比较。
表11、IFNα-sFc(单体)和IFNα-Fc(二聚体)对IFNAR1的结合亲和力特性
表12、在皮下注射后GCSFs在大鼠中的药物动力学特性
表13、对于GCSF-sFc的生物活性试验的实验计划
1每一组别包含5只嗜中性白细胞低下的小鼠
2所有组别于第0天预处理CPA。对接受单次注射的组别于第1天给予治疗药物，且对接受四次注射的组别于第1、2、3和4天给予治疗药物。
表14、利用蛋白质A树脂纯化的IFNβ-sFc的回收率(利用ELISA测定)
表15、在皮下注射后IFNβ在大鼠中的药物动力学特性
| 利比(自然的IFNβ) | IFNβ-sFc | |
| T<sub>1/2</sub>(小时) | 18.92-23.57 | 31.89-37.70 |
| T<sub>max</sub>(小时) | 12.00±0 | 9.55±3.61 |
| C<sub>max</sub>(ng/mL) | 3.20±0.71 | 6.55±0.78 |
| AUC(ng-小时/mL) | 115±18.38 | 273±2.83 |
| 清除率(mL/小时/kg) | 326±53.74 | 136±1.41 |
Claims (3)
1.一种融合蛋白，包含免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc片段，以及生物活性分子，其中该Fc片段包含铰链区，该铰链区被突变且不会形成双硫键，该Fc片段为单链Fc(sFc)，通过该单链Fc，该融合蛋白无法形成二聚体结构，其中该生物活性分子通过突变的铰链区连接该Fc片段，其中该融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:64、65、67、69和71。
2.一种药学组合物，包含如权利要求1所述的融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。
3.一种制备如权利要求1所述的融合蛋白的方法，包含：
a)提供生物活性分子和包含铰链区的Fc片段，其中该生物活性分子为红血球生成素、FactorIX、IFNα、GCSF或IFNβ，
b)通过取代和/或删除半胱氨酸残基突变该铰链区，以形成突变的Fc，该突变的Fc为单链Fc(sFc)，以及
c)结合该生物活性分子和该突变的Fc，其中该生物活性分子通过该铰链区与该突变的Fc结合。
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