KR20200136424A - Cd47 결합제 - Google Patents

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KR20200136424A
KR20200136424A KR1020207029435A KR20207029435A KR20200136424A KR 20200136424 A KR20200136424 A KR 20200136424A KR 1020207029435 A KR1020207029435 A KR 1020207029435A KR 20207029435 A KR20207029435 A KR 20207029435A KR 20200136424 A KR20200136424 A KR 20200136424A
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seq
ser
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antigen
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KR1020207029435A
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윌리엄 제임스 조나단 핀레이
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울트라휴먼 투 리미티드
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Abstract

본 명세서에는 CD47에 특이적으로 결합하는 항체 분자 및 관련 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. 또한 본 명세서에는 상기 항체 분자의 의학적 용도가 제공된다.

Description

CD47 결합제
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 영국 특허 출원 제1813693.7호(출원일: 2018년 8월 22일) 및 영국 특허 출원 제1804860.3호(출원일: 2018년 3월 27일)의 이익을 주장하며, 이들 특허의 개시내용은 전문이 참조에 의해 원용된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
본 출원과 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷의 카피(파일명: ULTW_001_02WO_SeqList_ST25.txt, 기록일: 2019년 3월 26일, 파일 크기 145,923바이트).
기술분야
본 발명은 CD47(Cluster of　Differentiation 47, 인테그린 연관 단백질[integrin associated protein: IAP]로서도 공지됨)에 특이적으로 결합하는 항체 분자 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
CD47(인테그린 연관 단백질[IAP]로서도 공지됨)은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하고, 막 인테그린, 트롬보스폰딘(thrombospondin-1: TSP-1) 및 신호-조절 단백질 알파(signal-regulatory protein alpha: SIRPα)를 비롯한 몇몇 공지된 파트너에 결합하는 막관통 단백질이다. CD47은 세포의 아포토시스, 증식, 접착 및 이동을 비롯한 다양한 세포 과정과 연관되며, 중요하게는, 그것은 면역 및 혈관신생 반응에서 중요한 역할을 한다. CD47-SIRPα 신호전달은 대식세포 및 다른 골수 세포에 의한 식세포작용의 활성화를 저해하는 중요한 분자 상호작용이다. 이것은 종양 세포의 생존을 촉진시키고, 따라서 골수 계통-특이적 면역 관문(myeloid lineage-specific immune checkpoint)으로서 작용한다.
전임상 증거는, CD47-SIRPα 신호전달을 차단하는 것이 혈액 악성종양 및 고형 악성종양 둘 다의 다수의 실험 모델에서 대식세포의 식세포작용 활성을 향상시키고, 이종 이식편의 성장을 저해한다는 것을 시사한다. 대식세포 활성은 또한 염증-연관 조직 리모델링, 예컨대, 조직 섬유증 및 죽상경화판의 형성의 생물학에서 인식되는 인자이기 때문에, CD47-SIRPα 신호전달 축은 또한 비-암성 질환에서 상당한 치료적 가능성이 있다. 따라서, 항-CD47 mAb는 암 및 다른 설정에서 면역치료제로서 작용하고, 현재 확립된 요법의 효과를 증폭시킬 가능성을 갖는다.
현재 승인된 항체 요법 대부분은 면역화된 설치류로부터 유래된다. 이들 항체 중 대다수는 인간 v-유전자 프레임워크 서열 내에 뮤린 CDR을 "이식(grafting)"시킴으로써 "인간화"로서 공지된 방법을 겪는다(문헌[Nelson et al., 2010, Nat Rev Drug Discov 9: 767-774] 참고). 이러한 방법은 대개 부정확하고, 생성된 항체의 표적 결합 친화도의 감소로 이어진다. 본래 항체의 결합 친화도로 되돌아가게 하기 위해서, 뮤린 잔기가 일반적으로 이식된 v-도메인의 가변 도메인 프레임워크 내의 주요 위치에 도입된다("역-돌연변이(back-mutation)"이라고도 공지됨).
CDR 이식 및 역 돌연변이를 통해서 인간화된 항체는 완전 뮤린 v-도메인을 갖는 것과 비교할 때 임상에서 더 낮은 면역 반응 속도를 유도한다고 밝혀져 있지만, 이러한 기본적인 이식 방법을 사용하여 인간화된 항체는 이식된 CDR 루프에 여전히 보유된 잠재적인 물리적인 불안정성 및 면역원성 모티프로 인해서 상당한 임상 개발 위험을 여전히 갖는다. 작용 기전의 일부로서 면역 효과기 기능과 잠재적으로 관련된 항체, 예컨대, 항-CD47은 면역원성에 대해서 특히 위험한데, 그 이유는 이것이 CD47+ 표적 세포의 식세포작용을 촉진시켜, 표적 세포와 함께 항체의 항원 가공을 초래하기 때문이다. 환자에서 이들 항-약물 항체 반응은 임상적 사용 동안 약물 반감기, 역가(potency) 및 안전성을 감소시킬 수 있다. 단백질 면역원성의 동물 시험은 보통 인간에서의 면역 반응을 예측하지 못하기 때문에, 치료 용도를 위해서 조작된 항체는 정제된 단백질에서 예측된 인간 T-세포 에피토프 함량, 비-인간 생식세포계열 아미노산 함량 및 응집 가능성을 최소화시키는 것에 초점을 맞추고 있다.
따라서, 이상적인 인간화된 효능작용적 항-CD47 항체는 양호하게 특징규명된 인간 생식세포계열 서열의 프레임워크 및 CDR 둘 다에서 발견되는 것과, v-도메인에서 가능한 많은 동일한 잔기를 가질 것이다. 문헌[Townsend et al. (2015; PNAS 112: 15354-15359)]에는 래트, 토끼 및 마우스 항체로부터 유래된 CDR이 바람직한 인간 프레임워크에 그래프팅되고, 이어서 "증강 이진 치환(Augmented Binary Substitution)"이라고 지칭되는 인간 생식세포계열화(germ-lining) 접근법에 적용되는 항체를 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 이 접근법이 본래 항체 파라토프에서 기본적인 가소성을 입증하였지만, 상당히 정확한 항체-항원 공결정 구조 데이터의 부재 하에서, 임의의 주어진 항체의 CDR 루프에서 어느 개별 잔기가 인간 생식세포계열로 그리고 어떤 조합으로 전환될 수 있는지를 확실하게 예측하는 것은 여전히 가능하지 않다. 추가로, Townsend 등의 연구는 개발 위험 모티프의 제거가 이로울 수 있는 위치에서 인간 생식세포계열에서 발견되는 잔기를 넘어 돌연변이유발의 추가를 다루지 않았다. 이것은 이러한 방법을 본질적으로 비효율적으로 만드는 기술적 한계이며, 항체를 고 위험의 개발 어려움에 놓이게 한다. 또한, 현재 개별 v-도메인의 단백질 서열의 원위 위치 또는 심지어는 파트너 v-도메인 상의 어느 변형이 항원 결합 친화도 및 특이성을 유지하면서 위험 모티프의 제거를 용이하게 하는지를 정확하게 예측할 수 없다.
따라서 CDR 생식세포계열화 및 개발 품질 최적화는 복잡하고, 다원적인 문제인데, 그 이유는 이러한 예에서 하기를 비롯한 분자의 다양한 기능성 특성이 바람직하게는 유지되어야 하기 때문이다: 표적 결합 특이성, 인간 및 동물 시험 종(예를 들어, 크랩-섭취 마카크(crab-eating macaque), 즉, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)라고도 알려진 시노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey)) 둘 다로부터의 CD47에 대한 친화도, v-도메인 생물물리학적 안정성 및/또는 IgG 발현 수율. 항체 조작 연구는 주요 CDR 내의 심지어는 단일 잔기 위치의 돌연변이가 이들 목적하는 분자 특성 모두에 대해서 극적인 효과를 가질 수 있다는 것을 밝혀냈다.
국제 특허 공개 제WO2011143624A2호에는 "5F9G4"라고 지칭되는 길항작용 뮤린 항-CD47 IgG 분자, 및 5F9G4의 인간화된 형태(h5F9G4)의 제조 방법이 기재되어 있다. 이들 5F9G4의 인간화된 형태는 전통적인 인간화 기술을 사용하여, 즉, 카밧-정의된 뮤린 CDR을 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열 내에 이식시킴으로써 제조되었고, 여기서 인간 프레임워크 잔기 중 일부는 상응하게 위치된 5F9G4 뮤린 잔기에 잠재적으로 역 돌연변이된다. 상기에 언급된 이유로 인해서, 국제 특허 공개 제WO2011143624A2호에 기재된 5F9G4의 이러한 인간화된 형태는 이상적이지 않다.
본 발명은 다수의 항-CD47 항체 및 이의 의학적 용도를 제공한다.
본 발명의 일 양상에 따라서, 인간 CD47에 그리고 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47에 특이적으로 결합하는 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분이 제공되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, VH 영역은 IGHV5-51-기반 또는 IGHV1-3-기반 프레임워크를 포함한다. 일부 실시형태에서, VL 영역은 IGKV2-28-기반 프레임워크를 포함한다.
IGHV5-51 배경에서, 항-CD47 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 하기를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
하기 순서의 서열의 아미노산: G-Y-S-F-T-N 또는 N의 보존적 치환(예컨대, S)-Y-N 또는 N의 보존적 치환(예컨대, S)-M 또는 M의 보존적 치환(예컨대, I)-H 또는 임의의 아미노산(예컨대, G)을 갖는 HCDR1(서열번호 28);
하기 순서의 서열의 아미노산: M 또는 M의 보존적 치환(예를 들어, I)-G-T 또는 임의의 아미노산(예컨대, I)-I-Y-P-G-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, D)-D 또는 임의의 아미노산(예컨대, S)-D-T-S 또는 임의의 아미노산(예컨대, R)-Y-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, S, H)-Q 또는 임의의 아미노산(예컨대, P)-K 또는 임의의 아미노산(예컨대, S)-F-Q/K-G/D를 갖는 HCDR2(서열번호 29); 및
하기 순서의 서열의 아미노산: G 또는 임의의 아미노산(예컨대, Q)-G-Y 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W)-R-A 또는 임의의 아미노산(예컨대, I, T, V, W)-M 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, E, K, L, P, Q, R, S, T, V, W)-D-Y를 갖는 HCDR3(서열번호 30).
IGHV1-3 배경에서, 항-CD47 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 하기를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
하기 순서의 서열의 아미노산: G-Y-T-F-T-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, D)-Y-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, A)-M-H를 갖는 HCDR1(서열번호 31);
하기 순서의 서열의 아미노산: M-G-T-I-Y-P-G-N-D-D 또는 임의의 아미노산(예컨대, N)-T-S 또는 임의의 아미노산(예컨대, K)-Y-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, S)-Q-K-F-Q-G를 갖는 HCDR2(서열번호 32); 및
하기 순서의 서열의 아미노산: G 또는 임의의 아미노산(예컨대, Q)-G-Y 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W)-R-A 또는 임의의 아미노산(예컨대, I, T, V, W)-M 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, E, K, L, P, Q, R, S, T, V, W)-D-Y를 갖는 HCDR3(서열번호 30).
본 발명의 양상에서, 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 HCDR1은 서열 GYTFTNYNMH(서열번호 33; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 HCDR1)를 제외할 수 있고, 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 HCDR2는 서열 MGTIYPGNDDTSYNQKFKD(서열번호 34; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 HCDR2)를 제외할 수 있고/이거나 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 HCDR3은 서열 GGYRAMDY(서열번호 35; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 HCDR3)를 제외할 수 있다.
항체 분자 또는 항원-결합 부분은 하기를 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다:
하기 순서의 서열의 아미노산: R-S-S-Q-S-I 또는 I의 보존적 치환(예컨대, L)-V 또는 V의 보존적 치환(예컨대, L)-Y 또는 Y의 보존적 치환(예컨대, H)-S-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, G, S, K)-G 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, Y)-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, Q, Y)-T 또는 임의의 아미노산(예컨대, N)-Y-L-G 또는 임의의 아미노산(예컨대, D)을 갖는 LCDR1(서열번호 36);
하기 순서의 서열의 아미노산: K-V 또는 임의의 아미노산(예컨대, G)-S-N-R-F 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, S)-S를 갖는 LCDR2(서열번호 37); 및
하기 순서의 서열의 아미노산: F 또는 임의의 아미노산(예컨대, L, M)-Q-G 또는 임의의 아미노산(예컨대, A)-S 또는 임의의 아미노산(예컨대, T, L, M)-H 또는 임의의 아미노산(예컨대, Q, R)-V 또는 임의의 아미노산(예컨대, I, T)-P-Y-T 또는 임의의 아미노산(예컨대, I)을 갖는 LCDR3(서열번호 38).
본 발명의 양상에서, 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 LCDR1은 서열 RSSQSIVYSNGNTYLG(서열번호 39; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 LCDR1)를 제외할 수 있고/있거나 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 LCDR2는 서열 KVSNRFS(서열번호 40; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 LCDR2)를 제외할 수 있고/있거나 항체 분자 또는 항원 결합 부분의 LCDR3은 서열 FQGSHVPYT(서열번호 41)를 제외할 수 있다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
(a) HCDR1은 아미노산 서열 G-Y-X1-F-T-X2-Y-X3-X4-X5(식 중, X1은 S 또는 S의 보존적 치환이고, X2는 N 또는 N의 보존적 치환이며, X3은 N 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 M 또는 M의 보존적 치환이며, X5는 H 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 42)를 포함하고;
(b) HCDR2는 아미노산 서열 X1-X2-X3-I-Y-P-G-X4-X5-X6-T-X7-Y-X8-X9-X10-F-Q-G(식 중, X1은 M 또는 M의 보존적 치환이고, X2는 G 또는 G의 보존적 치환이며, X3은 T 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 N 또는 N의 보존적 치환이며, X5는 D 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 D 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 S 또는 임의의 다른 아미노산이고, X8은 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X9는 Q 또는 임의의 다른 아미노산이고, X10은 K 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 43)를 포함하며;
(c) HCDR3은 아미노산 서열 X1-G-X2-R-X3-X4-D-Y(식 중, X1은 G 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 Y 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 A 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 M 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 44)를 포함하고;
(d) LCDR1은 아미노산 서열 R-S-S-Q-S-X1-X2-X3-S-X4-X5-X6-X7-Y-L-X8(식 중, X1은 I 또는 I의 보존적 치환이고, X2는 V 또는 V의 보존적 치환이며, X3은 Y 또는 Y의 보존적 치환이고, X4는 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 G 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 T 또는 임의의 다른 아미노산이고, X8은 G 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 45)을 포함하며;
(e) LCDR2는 아미노산 서열 K-X1-S-N-R-X2-S(식 중, X1은 V 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 F 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 46)를 포함하고; 그리고
(f) LCDR3은 아미노산 서열 X1-Q-X2-X3-X4-X5-P-Y-X6(식 중, X1은 F 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 G 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 S 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 H 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 V 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 T 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 47)을 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
(a) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
(b) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
(c) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
(d) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
(e) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
(f) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
(g) VH 영역의 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGNSDTSYNPSFQG(서열번호 61)의 HCDR2 및 GGVRAMDY(서열번호 62)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQASQVPYT(서열번호 63)의 LCDR3을 포함하거나; 또는
(h) VH 영역의 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGDSDTRYNPKFQG(서열번호 58)의 HCDR2 및 GGYRAEDY(서열번호 59)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQGSHVPY(서열번호 60)의 LCDR3을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
VH 영역 아미노산 서열은,
(a) 서열번호 48 또는 서열번호 57의 HCDR1;
(b)서열번호 49 또는 서열번호 61 의 HCDR2; 및
(c) 서열번호 50 또는 서열번호 62의 HCDR3을 포함하고;
VL 영역 아미노산 서열은,
(a') 서열번호 51, 서열번호 55 또는 서열번호 56의 LCDR1;
(b') 서열번호 52의 LCDR2; 및
(c') 서열번호 53, 서열번호 54 또는 서열번호 63의 LCDR3을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
(a) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 2를 포함하거나;
(b) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 3을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함하거나;
(c) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5를 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 6을 포함하거나;
(d) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 8을 포함하거나;
(e) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9를 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 10을 포함하거나;
(f) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 12를 포함하거나;
(g) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 13을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함하거나; 또는
(h) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 15를 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 16을 포함한다.
또한 본 발명에 따라서 치료제에 연결된 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 면역접합체가 제공된다.
또 다른 양상에서 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
추가로 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다.
또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
추가 양상에서 항-CD47 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분의 생산 방법이 제공되며, 이 방법은 본 발명의 숙주 세포를 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분의 발현 및/또는 생산을 야기하는 조건 하에서 배양하는 단계, 및 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분을 숙주 세포 또는 배양물로부터 단리시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
추가로 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가 양상에서, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가로 본 명세서에는 의약으로서 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 본 명세서에 정의된 바와 같은 scFv 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다. 본 발명은 또한 암의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서 본 발명은 제2 치료제, 예를 들어, 항암제와 조합하여 별개로, 순차적으로 또는 동시에 사용하기 위한, 용도를 위한 항체 분자, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 면역접합체, 또는 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 치료 방법을 제공한다.
추가 양상에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 대상체에서 자가면역 질환 또는 염증 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
자가면역 질환 또는 염증 질환은 관절염, 천식, 다발성 경화증, 건선, 크론병(Crohn's disease), 염증성 장 질환, 루푸스, 그레이브스병(Grave's disease) 및 하시모토 갑상선염 및 강직성 척추염으로 이루어진 군으로부터의 모든 양상에서 선택될 수 있다.
또한 자가면역 질환 또는 염증 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
추가로 자가면역 질환 또는 염증 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명은 또한 대상체에서 심혈관계 질환 또는 섬유성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 심혈관계 질환 또는 섬유성 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
추가로 자가면역 질환, 염증 질환 또는 섬유성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
심혈관계 질환은 본 발명의 임의의 양상에서 예를 들어, 관상동맥 심질환 또는 죽상경화증일 수 있다.
섬유성 질환은 본 발명의 임의의 양상에서 예를 들어, 심근경색, 협심증, 골관절염, 폐섬유증, 낭포성 섬유증, 기관지염 또는 천식일 수 있다.
본 발명은 또한 인간 CD47 및 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47, 또는 이의 항원-결합 부분에 특이적으로 결합하는 항체 분자의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은,
(1) 비-인간 기원으로부터의 항-CD47 CDR을 인간 v-도메인 프레임워크 내에 이식하여 인간화된 항-CD47 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 단계;
(2) CDR 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 인간화된 항-CD47 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분의 클론의 파지 라이브러리를 생성시키는 단계;
(3) 인간 CD47 및 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47에 대한 결합에 대해서 파지 라이브러리를 스크리닝하는 단계;
(4) 인간 CD47 및 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47에 대한 결합 특이성을 갖는 스크리닝 단계 (3)으로부터 클론을 선택하는 단계; 및
(5) 단계 (4)로부터 선택된 클론으로부터 인간 CD47 및 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47, 또는 이의 항원-결합 부분에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 생산하는 단계를 포함한다.
방법은, 인간화를 향상시키고/시키거나 인간 T 세포 에피토프 함량을 최소화시키고/시키거나 단계 (5)에서 생산된 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분의 제조 특성을 개선시키기 위해서, 단계 (4)에서 선택된 클론의 CDR 내의 특정 위치에서의 추가 탐색적 돌연변이생성에 기초하여, 단계 (4)에서 선택된 클론을 기반으로 하는 추가 클론을 생산하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
도 1A 내지 도 1F. 인간 및 시노 CD47-Fc 단백질에 대한 h5F9G4 IgG1 및 hSIRPα-Fc 결합에 대한, 라이브러리-유래된 항-CD47 scFv의 HTRF-기반 경쟁 스크리닝. 클론은 각각의 라운드에서 바이오티닐화된 인간 및/또는 시노몰거스 원숭이 CD47-Fc 단백질 상에서의 개별 파지 선택 분지(separate phage selection branch)로부터 유래되었다. 2개의 분지에서의 다중 라운드의 선택 후, 라이브러리-유래된 클론(흑색원)을 인간 및 시노 CD47-Fc 둘 다에 대한 결합 및 h5F9G4 IgG1 및 hSIRPα-Fc의 에피토프 차단(신호 감소를 통해서 측정됨)에 대해서 스크리닝하였다. 라운드 2 결과(도 1A, 도 1B). 라운드 3 결과(도 1C, 도 1D). 라운드 4 결과(도 1E, 도 1F). 음성 대조군(비-CD47-결합) 및 양성 대조군 h5F9G4 scFv를 각각 회색의 십자가 있는 원 및 회색 경계가 있는 흑색 원으로 나타낸다. 또한, IGHV5-51/IGKV2-28 이식편 scFv를 또한 각각의 플레이트 상에 포함시켰다(회색 육각형).
도 2A 및 도 2B. 생식세포계열에 대한 돌연변이에 대한 CDR 잔기 관용의 분석. 269개의 고유한 scFv 클론의 ELISA-양성 집단의 CDR에서 뮤린 아미노산 보유 빈도의 플롯을 각각 VH(서열번호 64 내지 66)(도 1A) 및 VL(서열번호 67 내지 69)(도 2B) 도메인에 대해서 제시한다. HCDR3 내 이외의, 인간/뮤린 잔기 돌연변이생성에 대해서 표적화된 잔기 만을 플로팅한다. X-축 상의 괄호 안에 제시된 CDR 잔기는 이식을 위해서 사용된 인간 생식세포계열에서 발견된 것과 동일하였다(IGKV2-28 및 IGHV5-51). 괄호로 표시되지 않지만, 값이 0으로 설정된 HCDR2 내의 잔기는 이식 과정 동안 인간 생식세포계열로 돌연변이되었다. 두 플롯 모두에서 75%에서의 회색 파선은 인간 생식세포계열에 의한 뮤린 잔기 대체의 관용에 대한 컷-오프를 나타낸다.
도 3A 및 도 3B. 인간 및 시노 CD47-Fc 단백질에 대한 라이브러리-유래된 리드 IgG 결합에 대한 직접 적정 ELISA. 인간 IgG1널(null) 포맷의 키메라 항-CD47(m5F9G4) 및 라이브러리-유래된 클론을 인간(도 3A) 및 시노(도 3B) CD47-Fc 단백질에 대한 직접 결합 ELISA에서 적정하였다(㎍/㎖ 단위). m5F9G4 및 라이브러리-유래된 클론은 CD47의 두 오쏘로그에 대해서 결합 활성을 나타내었다.
도 4A 및 도 4B. 라이브러리-유래된 리드에 대한 ELISA-기반 CD47-Fc-SIRPα 경쟁 검정. 플레이트-결합된 인간 SIRPα에 대한 인간(도 4A) 및 시노(도 4B) CD47-Fc 단백질에 대한 ELISA 결합 신호를 IgG1널 포맷의 적정된 경쟁자, D-A6 scFv-Fc, 플러스 아이소타입 IgG1, IGHV5-51 이식편, h5F9G4 및 IgG1널 포맷의 m5F9G4의 존재 하에서 조사하였다.
도 5A 및 도 5B. 라이브러리-유래된 비드에 대한 HTRF-기반 용액상 고-감도, CD47 에피토프 경쟁 검정. 인간 또는 시노 CD47에 대한 h5F9G4 IgG에 대한 HTRF 결합 신호를 라이브러리-유래된 리드, 플러스 아이소타입 IgG1 및 비표지된 h5F9G4 및 m5F9G4를 비롯한 적정된 경쟁자 IgG의 존재 하에서 조사하였다. 모든 라이브러리-유래된 리드는 인간 CD47에 결합하는 h5F9G4의 농도-의존적 저해를 나타내었는데, 이는 더 낮은 결합 친화도로 공유된 에피토프가 유지됨을 시사한다(도 5A). D-A6 단백질(IgG 및 scFv-Fc) 둘 다는 인간 CD47에 결합하는 h5F9G4를 완전히 저해하는 능력을 나타내었고(도 5B), 동일한 v-도메인의 scFv-Fc 융합 형태는 IgG보다 더 높은 역가이다.
도 6A 내지 도 6H. 인간 및 시노 CD47-Fc 단백질에 대한 디자이너 리드 IgG 결합에 대한 직접 적정 ELISA. 인간 IgG1널 포맷의 키메라 항-CD47(m5F9G4) 및 디자이너 클론을 인간 및 시노 CD47-Fc 단백질에 대한 직접 결합 ELISA에서 적정하였다(㎍/㎖ 단위). m5F9G4 및 라이브러리-유래된 클론은 CD47의 두 오쏘로그에 대해서 결합 활성을 나타내었다: VH1.1 내지 VH1.3 패밀리 대 인간(도 6A) 및 시노(도 6B); VH1.4 내지 VH1.6 패밀리 대 인간(도 6C) 및 시노(도 6D); 인간에 대한 VH1.7, VH1.9 및 VH1.10 패밀리(도 6E) 및 인간(도 6G) 및 시노(도 6H)에 대한 시노(도 6F) 및 VH1.8 패밀리.
도 7A 및 도 7B. VH1.8 패밀리 디자이너 리더에 대한 ELISA-기반 CD47-Fc-SIRPα 경쟁 검정. 플레이트-결합된 인간 SIRPα에 대한 인간(도 7A) 및 시노(도 7B) CD47-Fc 단백질에 대한 ELISA 결합 신호를 IgG1널 포맷의 적정된 경쟁자, 플러스 m5F9G4 및 양성 대조군으로서 IgG1널 포맷의 h5F9G4의 존재 하에서 조사하였다.
도 8. 추가의 디자이너 리더에 대한 ELISA-기반 CD47-Fc-SIRPα 경쟁 검정. 플레이트-결합된 인간 SIRPα에 대한 인간 CD47-Fc에 대한 ELISA 결합 신호를 IgG1널 포맷의 적정된 경쟁자, 플러스 아이소타입 IgG1 및 IgG1널 포맷의 m5F9G4의 존재 하에서 조사하였다.
도 9A 내지 도 9D. 디자이너 비드에 대한 HTRF-기반 용액상 고-감도, CD47 에피토프 경쟁 검정. 인간 또는 시노 CD47에 대한 h5F9G4 IgG에 대한 HTRF 결합 신호를 라이브러리-유래된 리드, 플러스 비표지된 h5F9G4 및 대조군으로서의 m5F9G4를 비롯한 적정된 경쟁자 IgG의 존재 하에서 조사하였다. 모든 VH1.8-패밀리 디자이너 리드는 인간(도 9A) 및 시노(도 9B) CD47에 결합하는 h5F9G4의 강력한 농도-의존적인 저해를 나타내었다. 다른 선택된 디자이너 리드는 또한 감소된 감소된 역가로, 인간(도 9C) 및 시노(도 9D) CD47에 결합하는 h5F9G4의 농도-의존적인 저해를 나타내었다.
도 10. 디자이너 리드에 대한 HL60, 인간 및 시노 CD47+ CHO-K1 세포에 대한 유세포 분석법 결합. 항-CD47 대조군 m5F9G4 및 h5F9G4, 디자이너 리드 및 아이소타입 대조군(모든 IgG1널)을 야생형(WT, 즉, 비형질주입된) CHO-K1 세포, 인간 CD47-형질주입된 CHO-K1 세포, 시노 CD47-형질주입된 CHO-K1 세포 및 인간 AML 세포주 HL60에 대한 특이적 결합에 대해서 조사하였다. IgG를 24 내지 100,000ng/㎖의 범위의 농도에서 시험하였다. 아이소타입 대조군을 제외한 모든 CD47-특이적 항체의 경우, 인간 및 시노 세포주, 플러스 HL60 세포에 대해서 농도-의존적인 결합이 관찰되었다. 야생형 CHO-K1 세포에 대해서 배경을 초과하는 결합 신호가 관찰되지 않았다.
도 11A 내지 도 11C. 개발 위험 ELISA. 본 검정은, IgG1 형태의 디자이너 리드, h5F9G4 및 m5F9G4 항체가 음성 대조군 IgG1 우스테키누맙 유사체보다 음으로 하전된 생물분자 인슐린(도 11A), 이중-가닥 DNA(dsDNA)(도 11B) 및 단일-가닥 DNA(ssDNA)(도 11C)에 대해서 동일하거나 더 낮은 결합(VH1.12/VL8 제외)을 나타낸다는 것을 나타내었다. 보코시주맙(Bococizumab) 및 브리아키누맙(Briakinumab) 유사체에 대해서 관찰된 바와 같은, 이들 분자에 대한 강한 표적외 결합은 치료용 항체의 불량한 약동학의 고위험 지시자인 것이 밝혀져 있다.
도 12a 내지 도 12c. iTope TM 을 사용한 h5F9G4의 VH 및 VL 서열의 요약 분석. 완전 v-도메인 서열에 걸쳐 있는 펩타이드를 1개 아미노산 증분으로 9량체 펩타이드로서 시험하였다. 각각의 행은 MHC 클래스 II 결합(코어 9량체)에 대해서 점수 매겨진 9량체 펩타이드의 p1 고정 잔기의 위치를 나타낸다. 각각의 상자는 정렬된 9량체와 MHC 클래스 II 사이의 0.6 초과의 결합 점수를 나타낸다. 무차별 결합 펩타이드는 17 또는 그 초과의 대립유전자에 결합하는 것으로 식별된다. 잠재적으로 면역원성인 펩타이드를 함유하는 영역을 '무차별 고'(HAF) 및 '무차별 중간'(LAF) 칼럼으로 나타내고; 진회색 수직 막대는 HAF MHC 클래스 II 결합 펩타이드를 나타내고, 연회색 막대는 LAF MHC 클래스 II 결합 펩타이드를 나타낸다. 'TCED' 칼럼에서, T 세포 에피토프 데이터베이스로부터의 상당히 균질한 펩타이드를 나타내는 영역을 수직 회색 막대로 나타낸다. LCDR1(서열번호 70)(도 12a), HCDR1(서열번호 71)(도 12b) 및 HCDR3(서열번호 72)(도 12c)에서 발견된 주요 HAF 및 TCED+ 에피토프에 대해서 예시적인 분석을 나타낸다.
도 13a 및 도 13b. iTope TM 을 사용한 주요 리드의 VL 서열의 요약 분석. 완전 v-도메인 서열에 걸쳐 있는 펩타이드를 완전 v-도메인(예로서 본 명세서에 나타낸 VL1.1)에 걸쳐서 1개 아미노산 증분으로 9량체 펩타이드로서 시험하였다. 데이터를 도 13a 및 도 13b에 나타낸다. LCDR2(서열번호 73)(도 13a) 및 LCDR3(서열번호 74)(도 13b)에서 발견된 HAF 및 TCED+ 에피토프에 대해서 예시적인 분석을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c. 인간 대식세포 및 주카트 세포를 사용한 식세포작용 역가 검정. IgG4(S228P) 포맷의 클론 h5F9G4, VH1.8/VL1.1, VH1.8/VL1.6 및 VH1.8/VL1.6-DI를, 3명의 개별 공여자로부터 유래된 인간 단핵구-유래된 대식세포 및 CD47+ 표적 세포로서의 주카트 인간 암 세포를 사용하여, 식세포작용의 유세포 분석법 검정으로 이의 상대적인 역가에 대해서 조사하였다. 식세포작용을, 공여자 1(도 14a), 2(도 14b) 및 3(도 14c)에 대한 CD11b+ 집단으로부터의 백분율 CFSE+ 세포로서 측정하였다.
본 발명의 제1 양상에 따라서, 인간 CD47 및 또한 선택적으로 시노몰거스 원숭이 CD47, 또는 이의 항원-결합 부분에 특이적으로 결합하는 항체 분자가 제공되며, 여기서 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 하기를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
IGHV5-51 배경에서: 하기 순서의 서열의 아미노산: G-Y-S-F-T-N 또는 N의 보존적 치환(예컨대, S)-Y-N 또는 N의 보존적 치환(예컨대, S)-M 또는 M의 보존적 치환(예컨대, I)-H 또는 임의의 아미노산(예컨대, G)을 갖는 HCDR1(서열번호 28);
하기 순서의 서열의 아미노산: M 또는 M의 보존적 치환(예를 들어, I)-G-T 또는 임의의 아미노산(예컨대, I)-I-Y-P-G-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, D)-D 또는 임의의 아미노산(예컨대, S)-D-T-S 또는 임의의 아미노산(예컨대, R)-Y-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, S, H)-Q 또는 임의의 아미노산(예컨대, P)-K 또는 임의의 아미노산(예컨대, S)-F-Q-G를 갖는 HCDR2(서열번호 29); 및
하기 순서의 서열의 아미노산: G 또는 임의의 아미노산(예컨대, Q)-G-Y 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W)-R-A 또는 임의의 아미노산(예컨대, I, T, V, W)-M 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, E, K, L, P, Q, R, S, T, V, W)-D-Y를 갖는 HCDR3(서열번호 30).
일부 양상에서 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체 또는 항원-결합 부분은 서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하거나 이것으로 이루어진 CD47 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 양상에서 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체 또는 항원-결합 부분은 서열번호 24 또는 서열번호 25와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CD47 단백질에 특이적으로 결합한다.
IGHV1-3 배경에서; 하기 순서의 서열의 아미노산: G-Y-T-F-T-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, D)-Y-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, A)-M-H를 갖는 HCDR1(서열번호 31);
하기 순서의 서열의 아미노산: M-G-T-I-Y-P-G-N-D-D 또는 임의의 아미노산(예컨대, N)-T-S 또는 임의의 아미노산(예컨대, K)-Y-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, S)-Q-K-F-Q-G를 갖는 HCDR2(서열번호 32); 및
하기 순서의 서열의 아미노산: G 또는 임의의 아미노산(예컨대, Q)-G-Y 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W)-R-A 또는 임의의 아미노산(예컨대, I, T, V, W)-M 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, E, K, L, P, Q, R, S, T, V, W)-D-Y를 갖는 HCDR3(서열번호 30).
본 발명의 양상에서, 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 HCDR1은 서열 GYTFTNYNMH(서열번호 33; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 HCDR1)를 제외할 수 있고, 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 HCDR2는 서열 MGTIYPGNDDTSYNQKFKD(서열번호 34; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 HCDR1)를 제외할 수 있고/있거나 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 HCDR3은 서열 GGYRAMDY(서열번호 35; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 HCDR3)를 제외할 수 있다.
항체 분자 또는 항원-결합 부분은 하기를 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다:
하기 순서의 서열의 아미노산: R-S-S-Q-S-I 또는 I의 보존적 치환(예컨대, L)-V 또는 V의 보존적 치환(예컨대, L)-Y 또는 Y의 보존적 치환(예컨대, H)-S-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, G, S, K)-G 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, Y)-N 또는 임의의 아미노산(예컨대, Q, Y)-T 또는 임의의 아미노산(예컨대, N)-Y-L-G 또는 임의의 아미노산(예컨대, D)을 갖는 LCDR1(서열번호 36);
하기 순서의 서열의 아미노산: K-V 또는 임의의 아미노산(예컨대, G)-S-N-R-F 또는 임의의 아미노산(예컨대, A, S)-S를 갖는 LCDR2(서열번호 37); 및
하기 순서의 서열의 아미노산: F 또는 임의의 아미노산(예컨대, L, M)-Q-G 또는 임의의 아미노산(예컨대, A)-S 또는 임의의 아미노산(예컨대, T, L, M)-H 또는 임의의 아미노산(예컨대, Q, R)-V 또는 임의의 아미노산(예컨대, I, T)-P-Y-T 또는 임의의 아미노산(예컨대, I)을 갖는 LCDR3(서열번호 38).
본 발명의 양상에서, 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 LCDR1은 서열 RSSQSIVYSNGNTYLG(서열번호 39; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 LCDR1)를 제외할 수 있고/있거나 항체 분자 또는 항원-결합 부분의 LCDR2는 서열 KVSNRFS(서열번호 40; WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 5F9G4 뮤린/인간화된 항체 LCDR2)를 제외할 수 있고/있거나 항체 분자 또는 항원 결합 부분의 LCDR3은 서열 FQGSHVPYT(서열번호 41)를 제외할 수 있다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
(a) HCDR1은 아미노산 서열 G-Y-X1-F-T-X2-Y-X3-X4-X5(식 중, X1은 S 또는 S의 보존적 치환이고, X2는 N 또는 N의 보존적 치환(예를 들어, S)이며, X3은 N 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, S, A)이고, X4는 M 또는 M의 보존적 치환(예를 들어, I)이며, X5는 H 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, G)임)(서열번호 42)를 포함하고;
(b) HCDR2는 아미노산 서열 X1-X2-X3-I-Y-P-G-X4-X5-X6-T-X7-Y-X8-X9-X10-F-Q-G(식 중, X1은 M 또는 M의 보존적 치환(예를 들어, I)이고, X2는 G 또는 G의 보존적 치환이며, X3은 T 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, I)이고, X4는 N 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, D)이며, X5는 D 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, S)이고, X6은 D 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 S 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, R)이고, X8은 N 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, S)이며, X9는 Q 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, P)이고, X10은 K 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, S)임)(서열번호 75)를 포함하며;
(c) HCDR3은 아미노산 서열 X1-G-X2-R-X3-X4-D-Y(식 중, X1은 G 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, Q)이고, X2는 Y 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 또는 W)이며, X3은 A 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, I, T, V 또는 W)이고, X4는 M 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, A, E, K, L, P, Q, R, S, T, V 또는 W)임)(서열번호 44)를 포함하고;
(d) LCDR1은 아미노산 서열 R-S-S-Q-S-X1-X2-X3-S-X4-X5-X6-X7-Y-L-X8(식 중, X1은 I 또는 I의 보존적 치환(예를 들어, L)이고, X2는 V 또는 V의 보존적 치환(예를 들어, L)이며, X3은 Y 또는 Y의 보존적 치환(예를 들어, H)이고, X4는 N 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, G, S 또는 K)이며, X5는 G 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, A 또는 Y)이고, X6은 N 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, Q 또는 Y)이며, X7은 T 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, N)이며, X8은 G 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, D)임)(서열번호 45)을 포함하며;
(e) LCDR2는 아미노산 서열 K-X1-S-N-R-X2-S(식 중, X1은 V 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, G)이고, X2는 F 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, A 또는 S임)(서열번호 46)를 포함하고; 그리고
(f) LCDR3은 아미노산 서열 X1-Q-X2-X3-X4-X5-P-Y-X6(식 중, X1은 F 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, L 또는 M)이고, X2는 G 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, A)이며, X3은 S 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, T, L 또는 M)이고, X4는 H 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, Q 또는 R)이며, X5는 V 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, I 또는 T)이고, X6은 T 또는 임의의 다른 아미노산(예를 들어, I)임)(서열번호 47)을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 아미노-말단에서 카복실-말단 순서로, FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4를 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역 및 아미노-말단에서 카복실-말단 순서로, FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4를 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열번호 42이고, HCDR2는 서열번호 75이며, HCDR3은 서열번호 44이고, LCDR1은 서열번호 45이며, LCDR2는 서열번호 46이고, LCDR3은 서열번호 47이며, 여기서 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 아미노산 서열은 서열번호 141의 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 아미노산 서열이고(표 2 참고), 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 아미노산 서열은 서열번호 144의 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4 아미노산 서열이다(표 2 참고).
본 명세서에 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 처음으로 WO2011143624A2; US20130142786A1에 개시된 뮤린 항-CD47 항체 5F9G4로부터 유래된 CDR 서열을 사용하여 다수의 최적화된 항-CD47 항체 분자를 생성시키는 것을 성공시켰다. 본 발명의 실시형태에서, 이들 항체 분자는 (적절한 동물 시험 종에서 생체내 연구를 가능하게 하기 위해서) 인간 CD47뿐만 아니라 시노몰거스 원숭이 CD47 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖도록 선택되었다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 최적화된 항체 분자의 추가 선별은 개선된 가변 도메인 안정성, 더 높은 발현 수율 및/또는 감소된 면역원성을 제공하였다.
본 발명의 바람직한 최적화된 항-CD47 항체 분자는 상응하는 뮤린 CDR 또는 다른(예컨대, 프레임워크) 아미노산 위치에서 최대 수의 인간 생식세포계열 치환을 가질 필요는 없다. 하기의 실험 부분에서 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 "최대 인간화된" 항체 분자가 항-CD47 결합 특성 및/또는 다른 바람직한 특징의 관점에서 반드시 "최대 최적화"되는 것은 아님을 발견하였다.
본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분의 아미노산 서열에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 활성 및/또는 친화도를 향상시키거나 감소시킨 변이체뿐만 아니라 그들의 특성에 유의하게 영향을 미치지 않는 기능적으로 동등한 가변 영역 및 CDR을 포함하는 항체 분자 및 이의 상응하는 항원-결합 부분을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열을 돌연변이시켜 CD47에 대한 원하는 결합 친화도를 갖는 항체를 얻을 수 있다. 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입뿐만 아니라, 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드까지의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합을 포함하는 삽입이 예상된다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 분자 또는 에피토프 태그에 결합된 항체 분자를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환에서 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
본 발명의 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 글리코실화 및 비글리코실화 폴리펩타이드뿐만 아니라 다른 번역 후 변형을 갖는 폴리펩타이드, 예를 들어, 상이한 당과의 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 예를 들어, 글리코실화 부위를 형성 또는 제거하기 위해 하나 이상의 아미노산 잔기를 첨가, 제거 또는 대체함으로써 돌연변이되어 이러한 번역 후 변형을 변경할 수 있다.
본 발명의 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 예를 들어 아미노산 치환에 의해 변형되어 항체에서 잠재적 단백질 분해 부위를 제거할 수 있다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분에서, HCDR1은 아미노산 서열: G-Y-T/S-F-T-N/S/D-Y-N/S/A-M/I-H/G(서열번호 76)를 가질 수 있고; HCDR2는 아미노산 서열: M/I/V-G/A/S-T/I-I-Y-P-G-N/D-D/S-D/N-T-S/K/R-Y-N/S/H-Q/P/H-K/S-F-K/Q-D/G(서열번호 77)를 가질 수 있고; HCDR3은 아미노산 서열: G/Q-G-Y/A/C/D/E/F/G/H/I/K/L/M/N/Q/R/S/T/V/W-R-A/I/T/V/W-M/A/E/K/L/P/Q/R/S/T/V/W-D-Y(서열번호 78)를 가질 수 있다.
예를 들어, HCDR1은 아미노산 서열: G-Y-T/S-F-T-N/D-Y-N/A-M/I-H(서열번호 79)를 가질 수 있고; HCDR2는 아미노산 서열: M-G-T-I-Y-P-G-N/D-D/S-D/N-T-S/K/R-Y-N/S-Q/P/H-K/S-F-Q-G(서열번호 80)를 가질 수 있고; HCDR3은 아미노산 서열: G-G-Y/E/F/I/K//N/V-R-A-M/E/Q-D-Y(서열번호 81)를 가질 수 있다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분에서, LCDR1은 아미노산 서열: R-S-S-Q-S-L-V/L-Y/H-S-N/G/S/K-G/A/Y-N/Y-T/N-Y-L-G/D(서열번호 82)를 가질 수 있고; LCDR2는 아미노산 서열: K-G-S-N-R-F/A-S(서열번호 83)를 가질 수 있고; LCDR3은 아미노산 서열: F/M-Q-G/A-S-H/Q-V-P-Y-T/I(서열번호 84)를 가질 수 있다.
예를 들어, LCDR1은 아미노산 서열: R-S-S-Q-S-L-L-H-S-N/K-G/A/Y-N/Q/Y-T/N-Y-L-G(서열번호 85)를 가질 수 있고; LCDR2는 아미노산 서열: K-V/G-S-N-R-F/A/S-S(서열번호 86)를 가질 수 있고; LCDR3은 아미노산 서열: F/L/M-Q-G/A-S/T/L/M-H/Q/R-V/I/T-P-Y-T/I(서열번호 87)를 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시형태에서, 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.8/VL1.1]; 또는
(b) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.8/VL1.2]; 또는
(c) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.8/VL1.3]; 또는
(d) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.8/VL1.4]; 또는
(e) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.8/VL1.5]; 또는
(f) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.8/VL1.6]; 또는
(g) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.1/VL1.1]; 또는
(h) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.1/VL1.2]; 또는
(i) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.1/VL1.3]; 또는
(j) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.1/VL1.6]; 또는
(k) 아미노산 서열 GYTFTDYNMH(서열번호 88; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.5/VL1.1]; 또는
(l) 아미노산 서열 GYTFTNYNIH(서열번호 89; HCDR1), MGTIYPGNDDTSYSQKFQG(서열번호 90; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.7/VL1.1]; 또는
(m) 아미노산 서열 GYTFTNYNIH(서열번호 89; HCDR1), MGTIYPGNDDTSYSQKFQG(서열번호 90; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.7/VL1.2]; 또는
(n) 아미노산 서열 GYTFTNYNIH(서열번호 89; HCDR1), MGTIYPGNDDTSYSQKFQG(서열번호 90; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.7/VL1.3]; 또는
(o) 아미노산 서열 GYTFTNYNIH(서열번호 89; HCDR1), MGTIYPGNDDTSYSQKFQG(서열번호 90; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.7/VL1.5]; 또는
(p) 아미노산 서열 GYTFTNYNIH(서열번호 89; HCDR1), MGTIYPGNDDTSYSQKFQG(서열번호 90; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.7/VL1.6]; 또는
(q) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTSYSQKFQG(서열번호 90; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.6/VL1.1]; 또는
(r) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTSYSQKFQG(서열번호 90; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.6/VL1.2]; 또는
(s) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTSYSQKFQG(서열번호 90; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASHVPYT(서열번호 53; LCDR3), [클론 VH1.9/VL1.1]; 또는
(t) 아미노산 서열 GYTFTNYAMH(서열번호 48; HCDR1), MGTIYPGNDDTKYSQKFQG(서열번호 91; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQASQVPYT(서열번호 54; LCDR3), [클론 VH1.9/VL1.2]; 또는
(u) 아미노산 서열 GYSFTNYNIH(서열번호 57; HCDR1), MGTIYPGNSDTSYNPSFQG(서열번호 61; HCDR2), GGVRAMDY(서열번호 62; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), MQASQVPYT(서열번호 63; LCDR3), [클론 D6]; 또는
(v) 아미노산 서열 GYSFTNYNIH(서열번호 57; HCDR1), MGTIYPGNSDTSYNPKFQG(서열번호 92; HCDR2), GGKRAMDY(서열번호 93; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), MQASQVPYT(서열번호 63; LCDR3), [클론 F-E5]; 또는
(w) 아미노산 서열 GYSFTNYNIH(서열번호 57; HCDR1), MGTIYPGDSDTSYNPKFQG(서열번호 94; HCDR2), GGYRAQDY(서열번호 95; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), MQASHVPYT(서열번호 96; LCDR3), [클론 E-C5]; 또는
(x) 아미노산 서열 GYSFTNYNIH(서열번호 57; HCDR1), MGTIYPGDSDTSYNPKFQG(서열번호 94; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), MQGSHVPYT(서열번호 97; LCDR3), [클론 E-D6]; 또는
(y) 아미노산 서열 GYSFTNYNIH(서열번호 57; HCDR1), MGTIYPGDSDTRYNQKFQG(서열번호 98; HCDR2), GGIRAMDY(서열번호 99; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), FQGSHVPYI (서열번호 100; LCDR3), [클론 B-A6]; 또는
(z) 아미노산 서열 GYSFTNYNIH(서열번호 57; HCDR1), MGTIYPGNSDTRYNPKFQG(서열번호 101; HCDR2), GGFRAMDY(서열번호 50; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), MQGSHVPYT(서열번호 97; LCDR3), [클론 D-C12]; 또는
(zi) 아미노산 서열 GYSFTNYNIH(서열번호 57; HCDR1), MGTIYPGDSDTRYNPKFQG(서열번호 58; HCDR2), GGYRAEDY(서열번호 59; HCDR3), RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51; LCDR1), KGSNRFS(서열번호 52; LCDR2), MQGSHVPYT(서열번호 97; LCDR3), [클론 E-A1].
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
(a) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
(b) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
(c) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
(d) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
(e) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
(f) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
(g) VH 영역의 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGNSDTSYNPSFQG(서열번호 61)의 HCDR2 및 GGVRAMDY(서열번호 62)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQASQVPYT(서열번호 63)의 LCDR3을 포함하거나; 또는
(h) VH 영역의 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGDSDTRYNPKFQG(서열번호 58)의 HCDR2 및 GGYRAEDY(서열번호 59)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQGSHVPY(서열번호 60)의 LCDR3을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되, 여기서 VH 영역은 표 7의 VH 영역 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하고, VL 영역은 표 7의 VL 영역 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
(a) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 2를 포함하거나;
(b) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 3을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함하거나;
(c) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5를 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 6을 포함하거나;
(d) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 8을 포함하거나;
(e) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9를 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 10을 포함하거나;
(f) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 12를 포함하거나;
(g) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 13을 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함하거나; 또는
(h) VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 15를 포함하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 16을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
(a) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 2와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나;
(b) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 3과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나;
(c) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 6과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나;
(d) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 7과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 8과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나;
(e) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 10과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나;
(f) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 11과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나;
(g) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 13과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 14와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하거나;
(h) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 15와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하고, VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 16과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일하다.
일부 양상에서, 항-CD47 항체의 CDR 아미노산 서열은 언급된 서열 내의 CDR 아미노산 서열과 100% 동일한 반면, FR 아미노산 서열은 언급된 서열 내의 FR 아미노산 서열과 100% 미만 동일하다.
일부 양상에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 부분은 단리될 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 본 명세서에 개시된 CDR의 세트를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 CD47에 대한 결합에 대해서 교차-경쟁할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 단리된 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원-결합 부분은 본 명세서에 개시된 CDR의 세트를 포함하는 항체 또는 항원-결합 부분과 CD47에 대한 결합에 대해서 교차-경쟁하고; (a) 완전 생식세포계열 인간 프레임워크 아미노산 서열을 포함하고/하거나; (b) LCDR1에 NG' 고위험 탈아마이드화 부위를 포함하지 않고/않거나; (c) LCDR1에 'NT' 탈아마이드화 부위를 포함하지 않고/않거나; (d) HCDR1 및/또는 HCDR2에 높은 MHC 클래스 II 결합 친화도를 갖는 인간 생식세포계열 펩타이드 서열을 포함하고/하거나; (e) LCDR1에 인간 T 세포 에피토프 서열을 포함하지 않고/않거나; (f) VH 도메인의 HCDR1 또는 HCDR1/프레임워크 2 영역에 인간 T 세포 에피토프 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, HCDR2에 높은 MHC 클래스 II 결합 친화도를 갖는 인간 생식세포계열 펩타이드 서열은 FQGQVTISA(서열번호 102) 또는 FQGRVTITA(서열번호 103)이다.
용어 "교차-경쟁한다", "교차-경쟁", "교차-차단한다", "교차-차단된" 및 "교차-차단하는"은 본 명세서에서 표적 CD47(예를 들어, 인간 CD47)에 대한 본 발명의 항-CD47 항체의 알로스테릭(allosteric) 조절을 통해서 직접적으로 또는 간접적으로 결합을 방해하는 항체 또는 이의 부분의 능력을 의미하도록 상호 교환 가능하게 사용된다. 항체 또는 이의 부분이 표적에 대한 또 다른 것의 결합을 방해할 수 있는 정도 및 따라서 그것이 본 발명에 따라서 교차-차단 또는 교차-경쟁한다고 지칭될 수 있는지의 여부는 경쟁 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 결합 경쟁 검정은 균질 시간 분해 형광(Homogeneous Time Resolved Fluorescence: HTRF)이다. 특히 적합한 하나의 정량적 교차-경쟁 검정은 FACS- 또는 알파스크린-기반 접근법을 사용하여 표적에 대한 결합과 대해서, 표지된(예를 들어, His 태그된, 바이오티닐화된 또는 방사성 표지된) 항체 또는 이의 부분과 다른 항체 또는 이의 부분 간의 경쟁을 측정한다. 일반적으로, 교차-경쟁 항체 또는 이의 부분은, 예를 들어, 교차-경쟁 검정에서 표적에 결합하여, 검정 동안 그리고 제2 항체 또는 이의 부분의 존재 하에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩타이드의 기록된 변위(displacement)가 주어진 양에서 존재하는 잠재적 교차-차단 항체 또는 이의 단편에 의한 최대 이론적인 변위(예를 들어, 교차-차단될 필요가 있는 차가운(예를 들어, 비표지된) 항체 또는 이의 단편에 의한 변위)의 100% 이하(예를 들어, FACS 기반 경쟁 검정에서)인 것이다. 바람직하게는, 교차-경쟁 항체 또는 이의 부분은 10% 내지 100%, 또는 50% 내지 100%의 기록된 변위를 갖는다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 항원-결합 부분은 번역 후 변형(post-translational modification: PTM) 부위, 예를 들어 글리코실화 부위(N-결합 또는 O-결합), 탈아미노화 부위, 인산화 부위 또는 이성질체화/단편화 부위를 제거하는 하나 이상의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다.
350개 이상의 PTM 유형이 공지되어 있다. PTM의 주요 형태는 인산화, 글리코실화(N- 및 O-결합), 수모일화, 팔미토일화, 아세틸화, 황화, 미리스토일화, 프레닐화 및 메틸화(K 및 R 잔기의)를 포함한다. 특정 PTM에 대한 원인인 추정 아미노산 부위를 식별하는 통계적 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌[Zhou et al., 2016, Nature Protocols 1: 1318-1321)] 참고). 예를 들어, 치환, 결실 및/또는 삽입에 의한 이러한 부위의 제거 및 이어서 선택적으로 (a) 결합 활성 및/또는 (b) PTM의 손실에 대해 (실험적으로 그리고/또는 이론적으로) 시험하는 것이 고려된다.
예를 들어, 5F9G4 뮤린 LCDR1(본 명세서에 정의된 바와 같음, 즉, 아미노산 서열 RSSQSIVYSNGNTYLG(서열번호 39))은 잔기 10 및 11(NG)에서 추정 '고위험' 탈아마이드화 부위를 갖는 것으로 식별되었다. 예를 들어, 잔기 10의 (예컨대, G, S 또는 K로의) 치환에 의해서 본 발명의 LCDR1 내의 동등한 위치에서 이러한 부위를 제거하는 것이 예상된다(예를 들어, 표 3에서 다수의 클론에서와 같음). 예를 들어, 잔기 11의 (예컨대, A 또는 Y로의) 치환에 의해서 본 발명의 LCDR1 내의 동등한 위치에서 이러한 부위를 제거하는 것이 예상된다(예를 들어, VL1.4 v-도메인 서열을 함유하는 클론 및 표 3 및 표 4에서 발견되는 다수의 다른 클론에서와 같음).
추가 예에서, 5F9G4 뮤린 LCDR1(본 명세서에 정의된 바와 같음, 즉, 아미노산 서열 RSSQSIVYSNGNTYLG(서열번호 39))은 잔기 12 및 13(NT)에서 추정 '고위험' 탈아마이드화 부위를 갖는 것으로 식별되었다. 예를 들어, 잔기 12의 (예컨대, Q 또는 Y로의) 치환에 의해서 본 발명의 LCDR1 내의 동등한 위치에서 이러한 위험 부위를 제거하는 것이 예상된다(예를 들어, VL1.4 v-도메인 서열을 함유하는 클론 및 표 3 및 표 4에서 발견되는 다수의 다른 클론에서와 같음).
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 인간, 인간화 또는 키메라일 수 있다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 CDR이 삽입된 하나 이상의 인간 가변 도메인 프레임워크 스캐폴드를 포함할 수 있다. 예를 들어, VH 영역, VL 영역 또는 VH 및 VL 영역 둘 다는 하나 이상의 인간 프레임워크 영역 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 HCDR 서열이 삽입된 IGHV5-51 인간 생식세포계열 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열의 세트가 삽입된 IGHV5-51 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함할 수 있다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 HCDR 서열이 삽입된 IGHV1-3 인간 생식세포계열 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열의 세트가 삽입된 IGHV1-3 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함할 수 있다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 LCDR 서열이 삽입된 IGKV2-28 인간 생식세포계열 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열의 세트가 삽입된 IGKV2-28 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 HCDR 서열이 삽입된 IGHV5-51 인간 생식세포계열 스캐폴드 및 상응하는 LCDR 서열이 삽입된 IGKV2-28 인간 생식세포계열 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열의 세트가 삽입된 IGHV5-51 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 상응하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열의 세트가 삽입된 IGKV2-28 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열은 표 4의 클론 중 임의의 하나의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 6개 모두의 CDR 서열은 표 4에서와 동일한 클론으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열은 표 4의 제1 클론으로부터 유래되고, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열은 표 4의 제2 클론으로부터 유래된다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 HCDR 서열이 삽입된 IGHV1-3 인간 생식세포계열 스캐폴드 및 상응하는 LCDR 서열이 삽입된 IGKV2-28 인간 생식세포계열 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 상응하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열의 세트가 삽입된 IGHV1-3 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 상응하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열의 세트가 삽입된 IGKV2-28 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열은 표 4의 클론 중 임의의 하나의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 6개 모두의 CDR 서열은 표 4에서와 동일한 클론으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열은 표 4의 제1 클론으로부터 유래되고, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열은 표 4의 제2 클론으로부터 유래된다.
일부 양상에서, 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2이다. 추가 실시형태에서, 면역글로불린 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG1널, IgG4(S228P), IgA1 또는 IgA2이다. 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 면역학적으로 불활성인 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 야생형 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 불변 영역, 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A, G237A 및 P331S를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 야생형 인간 IgG2 불변 영역 또는 야생형 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 항-CD47 항체는 표 8의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 표 8의 Fc 영역 서열은 CH1 도메인에서 시작한다. 일부 양상에서, 항-CD47 항체는 인간 IgG4, 인간 IgG4(S228P), 인간 IgG2, 인간 IgG1, 인간 IgG1-3M 또는 인간 IgG1-4M의 Fc 영역의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG4(S228P) Fc 영역은 야생형 인간 IgG4 Fc 영역에 비해서 하기 치환: S228P를 포함한다. 예를 들어, 인간 IgG1-3M Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc 영역에 비해서 하기 치환: L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 반면, 인간 IgG1-4M Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc 영역에 비해서 하기 치환: L234A, L235A, G237A 및 P331S를 포함한다. 일부 양상에서, 면역글로불린 분자의 불변 영역에서 아미노산 잔기의 위치는 EU 명명법(Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94)에 따라서 넘버링된다. 일부 양상에서, 면역글로불린 불변 영역은 RDELT(서열번호 26) 모티프 또는 REEM(서열번호 27) 모티프(표 8)를 포함할 수 있다. REEM(서열번호 27) 알로타입은 RDELT(서열번호 26) 알로타입보다 더 작은 인간 집단에서 발견된다. 일부 양상에서, 항-CD47 항체는 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 항-CD47 항체는 표 4의 클론의 임의의 하나의 6개의 CDR 아미노산 서열 및 표 8의 Fc 영역 아미노산 서열의 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 항-CD47 항체는 표 8의 Fc 영역 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 및 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역인 면역글로불린 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역, 경쇄 가변(VL) 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하고,
(a) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(b) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(c) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(d) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(e) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(f) VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(g) VH 영역의 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGNSDTSYNPSFQG(서열번호 61)의 HCDR2 및 GGVRAMDY(서열번호 62)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQASQVPYT(서열번호 63)의 LCDR3을 포함하고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나; 또는
(h) VH 영역의 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGDSDTRYNPKFQG(서열번호 58)의 HCDR2 및 GGYRAEDY(서열번호 59)의 HCDR3을 포함하고; VL 영역 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQGSHVPY(서열번호 60)의 LCDR3을 포함하고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역, 경쇄 가변(VL) 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하고,
(a) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 1을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 2를 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG2 불변 영역; 야생형 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나;
(b) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 3을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG2 불변 영역; 야생형 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나;
(c) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 5를 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 6을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG2 불변 영역; 야생형 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나;
(d) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 7을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 8을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG2 불변 영역; 야생형 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나;
(e) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 9를 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 10을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG2 불변 영역; 야생형 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나;
(f) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 11을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG2 불변 영역; 야생형 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나;
(g) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG2 불변 영역; 야생형 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나; 또는
(h) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 15을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 16을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG2 불변 영역; 야생형 인간 IgG1 불변 영역 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다.
일부 양상에서, 본 명세서에는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 개시되며, 여기서 항체는 중쇄 가변(VH) 영역, 경쇄 가변(VL) 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하고,
(a) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 1을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 2를 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(b) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 3을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(c) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 5를 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 6을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(d) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 7을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 8을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(e) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 9를 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 10을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(f) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 11을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(g) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함하거나;
(h) VH 영역 아미노산 서열은 서열번호 15를 포함하거나 이것으로 이루어지고; VL 영역 아미노산 서열은 서열번호 16을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 중쇄 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 양상에서, 항-CD47 항체는 면역 효과기 널일 수 있다. 일부 양상에서, 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 면역 효과기 기능을 유도하지 않거나, 선택적으로 면역 효과기 기능을 억제한다. 일부 양상에서, 항-CD47은 인간 FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa 및 FcgRIIIb 수용체에 대해서 측정 가능한 결합이 결핍될 수 있지만, 인간 FcgRIIb 수용체에 대한 결합을 유지하고, 선택적으로 인간 FcRn 수용체에 대한 결합을 유지한다. FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa 및 FcgRIIIb는 활성화 수용체의 예이다. FcgRIIb는 저해성 수용체의 예이다. FcRn은 재순환 수용체의 예이다. 일부 양상에서, 인간 Fc 수용체에 대한 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 결합 친화도는 바이아코어® 분석으로 측정될 수 있다. 일부 양상에서, 균질 시간 분해 형광(HTRF)을 사용하여 인간 Fc 수용체에 대한 항-CD47 항체의 결합을 연구할 수 있다. HTRF의 일례에서, 인간 IgG1(야생형)을 Fc 감마 수용체의 완전 슈트(full suite)와 같이 표지하고, 이어서 조작된 Fc 단편을 갖는 항체를 적정 경쟁에서 사용한다. 일부 양상에서, CD47-양성 세포를 인간 백혈구 및 항-CD47 항체와 혼합할 수 있고, CDC, ADCC 및/또는 ADCP에 의한 세포 사멸을 측정할 수 있다. 일부 양상에서, 인간 IgG1-3M의 Fc 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD47 항체(표 8 참조)는 효과기 널이다. 일부 양상에서, 인간 IgG1-3M의 Fc 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD47 항체(표 8 참조)는 효과기 널이 아니다.
항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 Fab 단편, F(ab)2 단편, Fv 단편, scFv(단일쇄 Fv) 단편, 4량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 2가 항체), 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 단클론성 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 제1 항원 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체일 수 있고, 여기서 제1 항원은 CD47이고, 제2 항원은 CD47이 아니다. 항체 분자 및 이들의 작제 및 사용 방법은 예를 들어 문헌[Holliger & Hudson (2005, Nature Biotechnol. 23(9): 1126-1136)]에 기재되어 있다.
일부 양상에서, 본 발명은 IgG 포맷에서보다 단일-쇄 Fv(scFv) 포맷에서 CD47-SIRPα 상호작용을 보다 강력하게 중화시키는 중쇄 가변(VH) 영역 서열 및 경쇄 가변(VL) 영역 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 분자의 VH 영역은 IGHV5-51 프레임워크 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일-쇄 Fv(scFv)를 포함하며, (a) HCDR1은 G-Y- T-F-T-X1-Y-X2-X3-X4(식 중, X1은 N 또는 N의 보존적 치환이고, X2는 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 M 또는 M의 보존적 치환이고, X4는 H 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 104)를 포함하고; (b) HCDR2는 M-G-X1-I-Y-P-G-X2-X3-X4-T-X5-Y-X6-X7-X8-F-Q-G(식 중, X1은 T 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 N 또는 N의 보존적 치환이며, X3은 D 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 D 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 S 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 Q 또는 임의의 다른 아미노산이고, X8은 K 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 105)를 포함하고; (c) HCDR3은 X1-G-X2-R-X3-X4-D-Y(식 중, X1은 G 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 Y 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 A 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 M 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 44)를 포함하고; (d) LCDR1은 R-S-S-Q-S-X1-X2-X3-S-X4-X5-X6-X7-Y-L-X8(식 중, X1은 I 또는 I의 보존적 치환이고, X2는 V 또는 V의 보존적 치환이며, X3은 Y 또는 Y의 보존적 치환이고, X4는 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 G 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 T 또는 임의의 다른 아미노산이고, X8은 G 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 45)을 포함하며; (e) LCDR2는 K-X1-S-N-R-X2-S(식 중, X1은 V 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 F 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 46)를 포함하고; 그리고 (f) 상기 LCDR3은 X1-Q-X2-X3-X4-X5-P-Y-X6(식 중, X1은 F 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 G 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 S 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 H 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 V 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 T 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 47)을 포함하며, VH 영역은 내부에 상기 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열이 삽입된 IGHV5-51 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 scFv는 (a) GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGDSDTSYNPKFQG(서열번호 94)의 HCDR2 및 GGYRAEDY(서열번호 59)의 HCDR3을 포함하는 VH 아미노산 서열; (b) RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQGSHVPYT(서열번호 97)의 LCDR3을 포함하는 VH 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, scFv는 아미노-말단에서부터 카복실-말단 순서로 VH-VL 또는 VL-VH를 포함한다. 일부 양상에서, scFv는 VH 서열과 VL 서열 사이에 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, scFv는 면역글로불린 불변 영역 또는 면역글로불린 불변 영역의 일부를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 scFv를 포함하는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) CD47-결합 분자를 제공한다. 일부 경우에, 면역글로불린 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 임의의 하나를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 치료제에 연결된 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 면역접합체가 제공된다.
적합한 치료제의 예는 세포독소, 방사성동위원소, 화학치료제, 면역조절제, 혈관생성억제제(anti-angiogenic agent), 증식억제제(antiproliferative agent), 아포토시스촉진제(pro-apoptotic agent), 세포분열억제 효소(cytostatic enzyme), 세포용해 효소(cytolytic enzyme)(예를 들어 RNAses)를 포함한다. 추가로 치료제는 치료용 핵산, 예컨대, 면역조절제, 혈관생성억제제, 항-증식제 또는 아포토시스촉진제를 암호화하는 유전자를 포함한다. 이들 약물 설명어(drug descriptor)는 상호 배타적이지 않으므로, 치료제는 상기 용어 중 하나 이상을 사용하여 기재될 수 있다.
면역접합체에 사용하기에 적합한 치료제의 예는 탁산, 메이탄신, CC-1065 및 듀오카마이신, 칼리키아미신 및 다른 엔다이인(enediyne) 및 아우리스타틴을 포함한다. 다른 예는 항-폴레이트, 빈카 알칼로이드 및 안트라사이클린을 포함한다. 식물 독소, 다른 생물활성 단백질, 효소(즉, ADEPT), 방사성동위원소, 광감작제(photosensitizer)가 면역접합체에서도 사용될 수 있다. 또한, 리포솜 또는 중합체와 같은 세포독성제로서 2차 담체를 사용하여 접합체를 제조할 수 있고, 적합한 세포독소는 세포의 기능을 저해 또는 방지하고/하거나 세포를 파괴시키는 작용제를 포함한다. 대표적인 세포독소는 항생제, 튜불린 중합 저해제, DNA에 결합하여 이를 방해하는 알킬화제 및 단백질 합성 또는 단백질 키나제, 포스파타아제, 토포이소머라아제, 효소 및 사이클린과 같은 필수 세포 단백질의 기능을 방해하는 작용제를 포함한다.
대표적인 세포독소는 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 조루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 카루비신, 노갈라마이신, 메노가릴, 피라루비신, 발루비신, 사이타라빈, 젬시타빈, 트라이플루리딘, 안시타빈, 에노시타빈, 아자시티딘, 독시플루리딘, 펜토스타틴, 브록수딘(broxuhdine), 카페시타빈, 클라드리빈, 데시타빈, 플록수딘, 플루다라빈, 고우게로틴(gougerotin), 퓨로마이신, 테가푸르, 티아조푸린, 아드하마이신(adhamycin), 시스플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 다카바진, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미톡산트론, 블레오마이신, 메클로르에타민, 프레드니손, 프로카르바진, 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 에토포사이드, 탁솔, 탁솔 유사체, 플라틴, 예컨대, 시스-플라틴 및 카보-플라틴, 미토마이신, 티오테파, 탁산, 빈크리스틴, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 타목시펜, 이다루비신, 돌라스타틴/아우리스타틴, 헤미아스테린, 에스페라마이신 및 메이탄시노이드를 포함지만 이들로 제한되지 않는다.
적합한 면역조절제는 종양에 대한 호르몬 작용을 차단하는 항-호르몬 및 사이토카인 생산을 억제하거나, 자가-항원 발현을 하향-조절하거나 또는 MHC 항원을 차폐하는 면역억제제를 포함한다.
또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 핵산 분자는 (a) VH 영역 아미노산 서열; (b) VL 영역 아미노산 서열; 또는 (c) 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 VH 및 VL 영역 아미노산 서열 둘 다를 암호화할 수 있다. 일부 양상에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자는 단리될 수 있다.
추가로 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 재조합 숙주 세포일 수 있다.
추가 양상에서 항-CD47 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분의 생산 방법이 제공되며, 이 방법은 본 발명의 숙주 세포를 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분의 발현 및/또는 생산을 야기하는 조건 하에서 배양하는 단계, 및 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분을 숙주 세포 또는 배양물로부터 단리시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
추가로 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가 양상에서, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 이 방법은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 암은 위장관 간질성 암(Gastrointestinal Stromal cancer: GIST), 췌장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 결장직장암, 전립선암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계암, 말초신경계암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 충수암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종 또는 혈액조직암일 수 있다.
본 발명은 또한 암의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서 본 발명은 제2 치료제, 예를 들어, 항암제와 함께 조합하여 별개로, 순차적으로 또는 동시에 사용하기 위한, 용도를 위한 항체 분자, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 면역접합체, 또는 핵산 분자, 또는 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 치료 방법을 제공한다.
추가 양상에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 대상체에서 자가면역 질환 또는 염증 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 자가면역 질환 또는 염증 질환은 관절염, 천식, 다발성 경화증, 건선, 크론병, 염증성 장 질환, 루푸스, 그레이브스병 및 하시모토 갑상선염 또는 강직성 척추염일 수 있다.
또한 자가면역 질환 또는 염증 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
추가로 자가면역 질환 또는 염증 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명은 또한 대상체에서 심혈관계 질환 또는 섬유성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 심혈관계 질환 또는 섬유성 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
추가로 심혈관계 질환 또는 섬유성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역접합체, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
심혈관계 질환은 본 발명의 임의의 양상에서 예를 들어, 관상동맥 심질환 또는 죽상경화증일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 임의의 양상에서 섬유성 질환은 심근경색, 협심증, 골관절염, 폐섬유증, 천식, 낭포성 섬유증 또는 기관지염일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 2차 반응을 유발하지 않으며, 예를 들어, 항-CD47 항체 분자의 투여 촉진, 수명 및/또는 신체에서의 효능 증가 또는 용액에서의 용해도 증가를 허용하도록 하는 약제학적 조성물에 도입되는 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있다. 이들 약제학적으로 허용 가능한 비히클은 널리 공지되어 있으며, 항-CD47 항체 분자의 투여 방식의 기능으로서 당업자에 의해 조정될 것이다.
일부 실시형태에서, 항-CD47 항체 분자는 투여 전에 재구성을 위해 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 항체 분자는 멸균수에서 재구성될 수 있고, 개체에게 투여되기 전에 식염수와 혼합될 수 있다.
항-CD47 항체 분자는 일반적으로 약제학적 조성물의 형태로 투여될 것이며, 이것은 항체 분자 이외에 적어도 1종의 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물은 항-CD47 항체 분자 이외에 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하고, 항-CD47 항체 분자의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 좌우될 것이며, 이는 하기에 논의된 바와 같은 볼러스(bolus), 주입, 주사 또는 임의의 다른 적합한 경로일 수 있다.
비경구, 예를 들어 피하 또는 정맥 내 투여의 경우, 예를 들어, 주사에 의해, 항-CD47 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 무발열원(pyrogen-free)이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대, 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 젖산 링거 주사제를 사용하여 적합한 용액을 양호하게 제조할 수 있다. 완충제, 예컨대, 인산염, 시트레이트 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3'-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리바이닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 사용될 수 있다.
항-CD47 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 치료하고자 하는 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 항-CD47 항체 분자는 예방학적 또는 예방적 치료를 포함하여(예를 들어, 개체에서 발생하는 질환의 위험을 감소시키기 위해 개체에서 질환이 발병되기 전의 치료; 발병 지연; 또는 발병 후 중증도 감소), 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용될 수 있다. 치료 방법은 항-CD47 항체 분자를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
투여는 일반적으로 "치료적 유효량"으로, 이것은 환자에게 이점을 나타내기에 충분하다. 이러한 이점은 적어도 하나의 증상의 적어도 개선일 수 있다. 실제 투여되는 양 및 투여 속도 및 투여 시간 경과는 치료하고자 하는 대상체의 성질 및 중증도, 치료하고자 하는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 병태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료 전문가에게 공지된 다른 인자에 따라 좌우될 것이다. 치료 처방, 예를 들어, 투여량 등에 대한 결정 등은 일반의 및 기타 의료 전문가의 책임이며, 증상의 중증도 및/또는 치료하고자 하는 질환의 진행에 따라 달라질 수 있다. 적절한 용량의 항체 분자는 당업계에 널리 공지되어 있다(Ledermann J.A. et al., 1991, Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al., 1991, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). 투여될 의약의 유형에 적절하게 사용될 수 있는 특정 투여량이 본 명세서 또는 문헌[Physician's Desk Reference (2003)]에 제시될 수 있다. 치료적 유효량 또는 적합한 용량의 항체 분자는 동물 모델에서 시험관내 활성 및 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서 유효 투여량을 인간에 대해서 외삽하는 방법이 공지되어 있다. 정확한 용량은 항체가 예방 또는 치료를 위한 것인지, 치료하고자 하는 영역의 크기 및 위치, 항체의 정확한 성질(예를 들어, 전체 항체, 단편) 및 항체에 부착된 임의의 검출 가능한 표지 또는 다른 분자의 성질에 좌우될 것이다.
전형적인 항체 용량은 전신 적용의 경우 100㎍ 내지 1g이고, 국소 적용의 경우 1㎍ 내지 1㎎의 범위일 것이다. 초기의 더 높은 부하 용량(loading dose), 그 다음 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 전형적으로, 항체는 전체 항체, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 아이소타입일 수 있다. 이것은 성인 환자의 단일 치료를 위한 용량이며, 어린이 및 유아에 대해 비례적으로 조정될 수 있고, 분자량에 비례하여 다른 항체 형태에 대해서도 조정될 수 있다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 주 2회, 주 단위 또는 월 단위 간격으로 반복될 수 있다. 개체의 치료 스케줄은 항체 조성물의 약동학적 및 약력학적 특성, 투여 경로 및 치료하고자 하는 질환의 성질에 따라 달라질 수 있다.
치료는 주기적일 수 있고, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상일 수 있으며, 예를 들어 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 1개월에 1회 이상, 약 5주 이상 또는 약 6주 이상일 수 있다. 예를 들어, 치료는 2 내지 4주마다 또는 4 내지 8주마다 일 수 있다. 치료는 수술 전 및/또는 후에 제공될 수 있고/있거나 외과적 치료 또는 침습적 절차의 해부학적 부위에서 직접 투여되거나 적용될 수 있다. 적합한 제형 및 투여 경로는 상기에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD47 항체 분자는 피하 주사로 투여될 수 있다. 피하 주사는 예를 들어, 장기간 또는 단기간 예방/치료를 위해 자동 주입기를 사용하여 투여될 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 항-CD47 항체 분자의 치료 효과는 용량에 따라 혈청 중에서 수 배의 항체 반감기 동안 지속될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량의 항-CD47 항체 분자의 치료 효과는 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5 개월 이상 또는 6개월 이상 동안 개체에서 지속될 수 있다.
본 발명은 또한 인간 CD47 및 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47, 또는 이의 항원-결합 부분에 특이적으로 결합하는 항체 분자의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은,
(1) 비-인간 기원으로부터의 항-CD47 CDR을 인간 v-도메인 프레임워크 내에 이식하여 인간화된 항-CD47 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 단계;
(2) CDR 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 인간화된 항-CD47 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분의 클론의 파지 라이브러리를 생성시키는 단계;
(3) 인간 CD47 및 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47에 대한 결합에 대해서 파지 라이브러리를 선택하는 단계;
(4) 인간 CD47 및 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47에 대한 결합 특이성을 갖는 선택 단계 (3)으로부터 클론을 스크리닝하는 단계; 및
(5) 단계 (4)로부터 선택된 클론으로부터 인간 CD47 및 선택적으로 또한 시노몰거스 원숭이 CD47, 또는 이의 항원-결합 부분에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 생산하는 단계를 포함한다.
방법은, 인간화를 향상시키고/시키거나 인간 T 세포 에피토프 함량을 최소화시키고/시키거나 단계 (5)에서 생산된 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분의 제조 특성을 개선시키기 위해서, 단계 (4)에서 선택된 클론의 CDR 내의 특정 위치에서의 추가 탐색적 돌연변이생성에 기초하여, 단계 (4)에서 선택된 클론을 기반으로 하는 추가 클론을 생산하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 적용 가능한 선별(refinement)은 하기 실시예 1에 기재된 바와 같다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "CD47"은 CD47의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 IAP(인테그린 연관 단백질) 및 이의 변이체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, CD47은 인간, 래트, 마우스 및 닭을 비롯한 모든 포유동물 종의 네이티브 서열 CD47을 포함한다. 용어 "CD47"은 인간 CD47의 변이체, 아이소폼 및 종 동족체를 포함하도록 사용된다. 본 발명의 항체는 인간 이외의 종으로부터의 CD47, 특히 시노몰거스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)의 CD47과 교차- 반응할 수 있다. 인간 및 시노몰거스 CD47 아미노산 서열의 예는 표 9에 제공되어 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 인간 CD47에 대해 완전히 특이적일 수 있고, 비-인간 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 "항-CD47 길항제 항체"(교환 가능하게 "항-CD47 항체"로 지칭됨)의 맥락에서 사용된 "길항제"는 CD47에 결합하여, CD47 신호전달에 의해 매개되는 CD47 생물학적 활성 및/또는 하류 경로(들)를 저해할 수 있는 항체를 지칭한다. 항-CD47 길항제 항체는 수용체 결합 및/또는 CD47에 대한 세포 반응의 도출과 같은 CD47 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로를 포함하는, CD47 생물학적 활성을 (상당히 포함) 차단, 길항작용, 억제 또는 감소시킬 수 있는 항체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "항-CD47 길항제 항체"는 CD47 자체 및 CD47 생물학적 활성(골수 계통의 세포에 의한 식세포작용의 활성화를 향상시키는 능력을 포함하지만 이것에 제한되지 않음) 또는 활성 또는 생물학적 활성의 결과가 실질적으로 무의미하거나, 감소되거나 또는 임의의 유의미한 정도로 중화되는 모든 용어, 제목 및 기능적 상태 및 특징을 포함한다는 것이 명확하게 이해될 것이다.
CD47이 다른 수용체에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합활성으로 보다 용이하게 결합하고/하거나 더 긴 지속 시간으로 결합하는 경우, 항체는 CD47과 "특이적으로 결합", "특이적으로 상호작용", "우선적으로 결합", "결합" 또는 "상호작용"한다.
"항체 분자"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해, 표적, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 무손상 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라 임의의 항원 결합 단편(예를 들어, "항원-결합 부분") 또는 이의 단일 쇄, 항체를 포함하는 융합 단백질 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성, 예를 들어 scFv, 단일 도메인 항체(예를 들어, 샤크 및 카멜리드 항체), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디 v-NAR 및 비스-scFv를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 구성을 포함한다.
"항체 분자"는 임의의 클래스의 항체, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 서브-클래스)을 포함하며, 항체는 임의의 특정 클래스일 필요는 없다. 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스에 배정될 수 있다. 면역글로불린의 하기의 5가지 주요 클래스가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 몇몇은 서브 클래스(아이소타입), 예를 들어 lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 및 lgA2로 더 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 한다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 소단위 구조 및 3차원 구성이 널리 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체 분자의 "항원 결합 부분"이라는 용어는 CD47에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체 분자의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체 분자의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab; Fab'; F(ab')2; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 단일 도메인 항체(dAb) 단편 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
용어 "Fc 영역"을 사용하여 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의한다. "Fc 영역"은 네이티브 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226번 위치의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230에서부터 이의 카복실-말단으로 신장되는 것으로 정의된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카밧에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 CH2 및 CH3의 2개의 불변 도메인을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.
항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역(hypervariable region)으로도 공지된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어지며, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR에 측접하기 위한 FR을 선택하는 경우, 예를 들어, 항체를 인간화 또는 최적하는 경우, 동일한 표준 클래스 내에 CDR 서열을 함유하는 항체로부터의 FR이 바람직하다.
본 출원에 사용된 CDR 정의는 면역글로불린 레퍼토리 분석 및 항체와 항원의 단리 시에 그리고 공-결정에서의 항체의 구조적 분석의 조합에 기초하여, 현장에서 생성된 많은 이질적인, 종종 상충되는 구조에 사용된 도메인을 조합한다(문헌[Swindells et al., 2016, abYsis: Integrated Antibody Sequence and Structure-Management, Analysis, and Prediction. J Mol Biol. [PMID: 27561707; Epub 22 August 2016]]의 검토 참조). 본 명세서에 사용된 CDR 정의("통합된" 체계)는 이러한 모든 이전 통찰의 내용을 포함하고, 잠재적으로 표적-결합 상보성을 매개하는 전체 잔기 랜드스케이프를 샘플링하는 데 필요한 모든 적절한 루프 위치를 포함한다.
표 1은 동일한 CDR을 정의하기 위해서 널리 공지된 대안 시스템과 비교하여, 본 명세서에 정의된 바와 같은 5F9G4 뮤린 항-CD47 항체 CDR의 아미노산 서열("통합된" 체계)을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "보존적 치환"은 아미노산을 기능적 활성을 현저하게 해롭게 변화시키지 않는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. "보존적 치환"의 바람직한 예는 하나의 아미노산을 하기 BLOSUM 62 치환 매트릭스에서 값이 0 이상인 또 다른 아미노산으로 치환하는 것이다(문헌[Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89: 10915-10919] 참조):
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용어 "단클론성 항체"(monoclonal antibody: Mab)는 예를 들어, 임의의 진핵 생물, 원핵 생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭하고, 이것이 생산되는 방법이 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 단클론성 항체는 동종 또는 실질적으로 동종 집단으로 존재한다.
"인간화된" 항체 분자는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 서브서열)인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분의 형태를 지칭한다. 인간화된 항체는 수용자의 CDR 유래 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR 유래 잔기로 치환된 인간 면역글로불린(수용자 항체)일 수 있다.
"인간 항체 또는 완전 인간 항체"는 인간 항체 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스 또는 인간 세포로부터 유래된 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭한다.
용어 "키메라 항체"는, 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체 분자와 같은, 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열은 다른 종으로부터 유래된 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭하는 것으로 의도된다.
"항체-약물 접합체" 및 "면역접합체"는 CD47에 결합하고, 세포 독성, 세포분열억제제 및/또는 치료제에 접합된 항체 유도체를 포함하는 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭한다.
본 발명의 항체 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 당업계에 널리 공지된 기술, 예를 들어, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술의 조합 또는 당업계에 쉽게 공지된 다른 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
용어 "단리된 분자"(분자이든, 예를 들어, 폴리펩타이드이든, 폴리뉴클레오타이드이든 또는 항체이든)는 그 기원 또는 유도원으로 인해서 (1) 네이티브 상태에서 동반되는 자연 연관 성분과 회합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 존재하지 않거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해서 발현되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 자연적으로 기원하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 발현된 분자는 자연 연관된 성분으로부터 "단리"될 것이다. 분자는 또한 당업계에 널리 공지된 정제 기술을 사용하여 단리에 의해서 자연 연관 성분이 실질적으로 존재하지 않게 될 수 있다. 분자 순도 또는 균질성은 당업계에 널리 공지된 다수의 수단에 의해서 검정될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 샘플의 순도는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 겔의 염색을 사용하여 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 폴리펩타이드를 가시화함으로써 검정될 수 있다. 특정 목적을 위해서, HPLC 및 정제를 위해서 당업계에 널리 공지된 다른 수단을 사용함으로써 더 높은 분해능이 제공될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체 분자의 항원-결합 영역 중 하나 이상에서 항체 분자, 또는 이의 항원-결합 부분에 의해 인식되고 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 1차, 2차 또는 3차 단백질 구조의 한정된 영역으로 구성될 수 있으며, 항체의 항원 결합 영역, 또는 이의 항원-결합 부분에 의해 인식되는 표적의 2차 구조 단위 또는 구조 도메인의 조합을 포함한다. 에피토프는 마찬가지로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 한정된 화학적 활성 표면 군화로 구성될 수 있으며, 특정 3차원 구조적 특성뿐만 아니라 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "항원 에피토프"는 당업계에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어 통상적인 면역검정, 항체 경쟁적 결합 검정 또는 x-선 결정학 또는 관련 구조 결정 방법(예들 들어, NMR)에 의해 항체 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드의 일부로서 정의된다.
용어 "결합 친화도" 또는 "KD"는 특정 항원-항체 상호작용의 해리도를 지칭한다. KD는 "오프-레이트(off-rate)(koff)"라고도 하는 해리 상수와 결합 상수 또는 "온-레이트(on-rate)(kon)"의 비율이다. 따라서 KD는 koff/kon과 동일하고, 몰 농도(M)로 표현된다. KD가 작을수록 결합 친화력이 더 강하다는 것을 따른다. 따라서, 1μM의 KD는 1nM의 KD와 비교하여 약한 결합 친화도를 나타낸다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 한 가지 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하는 것이고, 일반적으로 바이아코어®시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용한다.
용어 "역가"는 생물학적 활성의 측정치이며, IC50, 즉, 본 명세서에 기재된 CD47 활성 검정에서 측정된 활성의 50%를 저해하기 위한, 항원 CD47에 대한 항체 또는 항체 약물 접합체의 유효 농도로서 지정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 어구 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 양(투여량 및 시간 기간 및 투여 수단)을 지칭한다. 유효량은 대상체에게 치료적 이점을 부여하는데 필요한 활성제의 적어도 최소량 이상이지만 독성량 미만이다.
본 발명의 항체 분자의 생물활성과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "저해한다" 또는 "중화시킨다"는 예를 들어, 항체 분자의 CD47에 대한 생물학적 활성 또는 결합 상호작용을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항, 금지, 방지, 억제, 둔화, 방해, 제거, 정지, 감소 또는 역전시키는 항체의 능력을 의미한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입물의 도입을 위한 벡터(들)에 대한 수용자였거나 수용자일 수 있는 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적인 돌연변이로 인해 본래의 모 세포와 (형태학 또는 게놈 DNA 보체에서) 완전히 동일할 필요는 없을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(들)로 생체내에서 형질주입된 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포에서 관심대상의 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 바람직하게는 발현할 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡 터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터 및 생산자 세포와 같은 특정 진핵 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 달리 지시되지 않는 한, 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태 또는 이러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 역전, 완화, 이의 진행 저해, 이의 진행 지연, 이의 발병 지연 또는 예방하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 달리 지시되지 않는 한, 상기에 정의된 바와 같은 치료 행동을 지칭한다. 용어 "치료하는"은 또한 대상체의 아주반트(adjuvant) 및 네오아주반트(neoadjuvant) 치료를 포함한다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 명세서의 "치료"에 대한 언급은 치유, 일시적 치료 및 예방학적 치료에 대한 언급을 포함한다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 명세서의 "치료"에 대한 언급은 또한 치유, 일시적 치료 및 예방학적 치료에 대한 언급을 포함한다.
본 명세서에서 "포함하는"이라는 언어로 실시형태가 기술된 경우, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 용어로 기재된 달리 유사한 실시형태도 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 양상 또는 실시형태가 마쿠쉬(Markush) 군 또는 다른 대안의 군화에 의해 설명되는 경우, 본 발명은 전체이지만 군의 각 구성원을 개별적으로 열거된 전체 군 및 주요 군의 모든 가능한 하위군뿐만 아니라 군 구성원 중 하나 이상이 없는 주요 군도 포함한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에서 임의의 군 구성원 중 하나 이상을 명시적으로 배제하는 것을 예상한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 충돌의 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전체에서, 용어 "포함하다" 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하지만 다른 정수 또는 정수 군을 배제하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형은 복수를 포함하고 복수형은 단수를 포함할 것이다. 용어 "예컨대" 또는 "예를 들어" 뒤에 나오는 모든 예(들)는 완전하거나 제한하려는 것이 아니다.
달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업자가 속한 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이다.
본 발명의 특별한 비제한적인 실시형태를 이제 첨부 도면을 참조하여 설명할 것이다.
실시예 1. 최적화된 항-CD47 치료용 항체의 생성
도입부
본 실시예에서, 본 발명자들은 길항작용적이고 최적화된 항-CD47 항체의 패널을 성공적으로 생성시켰다. 이들 항-CD47 항체는 양호하게 발현되고, 생물리학적으로 안정적이고, 가용성이 높으며, 바람직한 인간 생식세포계열 대한 최대화된 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
물질 및 방법
IgG 클로닝, 일시적인 발현, 정제
DNA 서열을 암호화하는 항체 v-도메인을 제한-결찰 클로닝을 통해서 별개의 플라스미드 벡터 내의 별개의 IgG 중쇄 및 경쇄 발현 카세트 내에 클로닝하였다. 항체를 2개의 인간 IgG1 포맷: IgG4(S228P) 및 IgG1널 - Fcg 수용체-유래된 효과기 기능을 최소화하는 더 낮은 힌지 돌연변이 L234A/L235A/G237A를 갖는 IgG1로 발현시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라서 엔도톡신-무함유 IgG 발현 플라스미드 제제를 일시적으로 형질주입시킨 후 HEK-293expi 또는 CHO 세포에서 IgG를 발현시켰다. IgG를 단일 단계 프로토콜을 사용하여 정제시켰다: 컨디셔닝된 배지를, PBS pH7.4로 사전 평형화된 1㎖ ProA 세파로스 칼럼 상에 로딩하였다(니트(neat)). 칼럼을 5 칼럼 부피의 PBS pH7.4로 세척하고, 그 다음 단백질을 100mM 글리신, pH 2.7로 용리시키고, 30kDa 컷오프 투석막을 사용하여 PBS pH 7.4 중에서 투석시켰다.
IgG 적정 결합 ELISA
Greiner Bio-One High bind ELISA 플레이트를 코팅하기 위해서, 표적 단백질을 탄산염 완충제 중에서 1㎍/㎖로 희석시키고, 4℃에서 밤새 웰당 100㎕로 첨가하였다. 코팅된 플레이트를 PBS pH 7.4로 3× 세척하고, 1시간 동안 RT에서 PBS 중의 1% BSA(380㎕/웰)로 차단시키고, 이어서 PBS-Tween 20(PBST)으로 3× 세척하였다. 이어서 CD47 항체(100㎕/웰; PBST 중에 희석됨)를 첨가하고, 이어서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션시켰다. 이어서 플레이트를 PBST로 3× 세척하고, 염소 항-인간 카파 쇄-HRP를 RT에서 1시간 동안 첨가하였다(100㎕/웰). 이어서 플레이트를 PBST로 3× 세척하고, PBS로 2회 세척한 후, 100㎕ TMB를 웰당 첨가하였다. 100㎕ 2M H2SO4/웰을 첨가함으로써 반응을 중단시키고, OD를 450㎚에서 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
항-CD47 항체를 ELISA에 의해서 다중반응성에 대해서 시험하였다. 정제된, 재조합, 표적 및 비표적 항원을 96-웰 Nunc maxisorp 플레이트에서 4℃에서 밤새 탄산염 완충제 중에서 웰당 100ng로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBS로 3× 세척하고, PBS 중에서 1% BSA로 차단시키고, 이어서 PBS-Tween20으로 3× 세척하였다. 이어서 1차 항체의 연속 희석물을 적용하고, 플레이트를 PBS-Tween20으로 3× 세척하고, 염소 항-인간 카파 쇄-HRP 1:4,000 2차 항체를 적용하였다. 이어서 웰을 PBS-Tween20으로 3× 및 PBS로 2× 세척하고, 100㎕의 TMB 퍼옥시다제 기질을 웰당 첨가하고, 100㎕ 2M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 중단시키고, 450㎚에서 흡광도를 판독하였다. 음으로 하전된 생물분자 표면 상에서의 ELISA를 통한 IgG 결합 분석을 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Mouquet et al., 2010, Nature 467: 591-595] 참고).
CD47 라이브러리 생성 및 선택
매스 올리고뉴클레오타이드(mass oligonucleotide) 합성 및 PCR에 의해 CD47 scFv 레퍼토리를 조립하였다. 이어서 증폭된 scFv 레퍼토리를 제한-결찰을 통해 파지미드 벡터 내로 클로닝시키고, 이.콜라이 TG-1 세포로 형질전환시키고, 파지 레퍼토리를 이전에 상세히 기술된 바와 같이 본질적으로 구제하였다(Finlay et al., 2011, Methods Mol Biol 681: 383-401).
스트렙타비딘 자성 마이크로비드를 CD47-Fc 단백질(인간 또는 시노)로 코팅하고, 비드를 PBS로 3회 세척하고, 5% 탈지유 단백질(MPBS)을 함유한 PBS pH 7.4에 재현탁시킴으로써 파지 선택을 수행하였다. 이들 비드를 라운드 1의 선택에서 200nM의 표적 단백질로 코팅하고, 그 다음 후속 라운드에서 100, 50 및 10nM로 코팅하였다
HTRF 결합 경쟁 검정
경쟁 HTRF 검정을 확립하여 이식되고 라이브러리-유래된 클론에 의해서 인간 및/또는 시노 CD47-Fc에 대한 h5F9G4 IgG 결합에 대해서 에피토프 경쟁을 조사하였다. 정제된 h5F9G4 IgG1을 제조사의 설명서에 따라서 표지 키트(시스바이오사(CisBio))를 사용하여 터븀으로 표지하였다. 최종 반응 혼합물은 상기에 기재된 바와 같이 제조된, 바이오티닐화된 인간 또는 시노 CD47-Fc, SA-XL665(시스바이오사), 터븀-표지된 모체 h5F9G4 및 관심대상의 경쟁자 scFv 또는 IgG를 1× 검정 완충제[50mM 인산나트륨, pH 7.5, 400mM 포타슘 플루오라이드 및 0.1% BSA(w/v)] 중의 20㎕의 총 반응 부피로 함유하였다. 연속해서 시약을 384-웰 저-부피 블랙 플레이트(Nunc)에 첨가하였다. 반응을 1시간 동안 실온에서 진행시키고, 그 다음 플레이트를 340㎚에서의 여기로 플레이트 판독기로 판독하고, 615㎚(h5F9G4-터븀으로부터의 입력 도너 형광을 측정) 및 665㎚(SAXL665로부터의 출력 억셉터 형광을 측정함)에서의 2개의 방출 판독물을 판독하였다. 판독을 665㎚/615㎚ 비로 표현하였다.
CD47-SIRPα 결합 경쟁 검정
경쟁 ELISA 검정을 확립하여 CD47과 SIRPα의 결합 상호작용을 차단하는 최적화된 리드의 능력을 조사하였다. Greiner Bio-One High bind ELISA 플레이트를 코팅하기 위해서, 탄산염 코팅 완충제 중의 10㎍/㎖의 인간 SIRPα-Fc를 4℃에서 밤새 웰당 100㎕로 첨가하였다. 코팅된 플레이트를 PBS pH7.4로 3× 세척하고, 1시간 동안 RT에서 PBS 중의 1% BSA(380㎕/웰)로 차단시키고, 이어서 PBS-Tween 20(PBST)으로 3× 세척하였다. 이어서 바이오티닐화된 인간, 마우스 또는 시노 CD47-Fc를 경쟁 scFv 또는 IgG의 첨가하거나 첨가하지 않고 60분 동안 실온에서, 웰당 100㎕로 PBS 중의 0.2㎍/㎖로 첨가하였다. 이어서 플레이트를 PBST로 3× 세척하고, 스트렙타비딘-HRP를 실온에서, 1시간 동안 첨가하였다(100㎕/웰). 이어서 플레이트를 PBST로 3× 세척하고, PBS로 2회 세척한 후, 100㎕ TMB를 웰당 첨가하였다. 100㎕ 2M H2SO4/웰을 첨가함으로써 반응을 중단시키고, OD를 450㎚에서 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
항체 v-도메인 T 세포 에피토프 함량: 인 실리코 분석
치료용 항체 및 단백질에서 T 세포 에피토프의 위치를 식별하는 것에 기초한 인 실리코 기술(압제나사(Abzena, Ltd.))을 항체 v-도메인에서의 잠재적 면역원성을 평가하기 위해 사용하였다. iTopeTM를 사용하여 인간 MHC 클래스 II에 대한 무차별 고친화도 결합을 갖는 펩타이드에 대한 주요 리드의 VL 및 VH 서열을 분석하였다. 무차별 고친화도 MHC 클래스 II 결합 펩타이드는 약물 단백질의 임상 면역원성에 대한 높은 위험 지표인 T 세포 에피토프의 존재와 상관 관계가 있는 것으로 생각된다. iTopeTM 소프트웨어는 34개의 인간 MHC 클래스 II 대립유전자의 개방-말단 결합 홈 내에서 펩타이드의 아미노산 측쇄와 특이적 결합 포켓(특정 포켓 위치; p1, p4, p6, p7 및 p9) 간의 선호되는 상호작용을 예측한다. 이들 대립유전자는 임의의 특정 민족 집단에서 가장 많이 발견된 것에 대한 가중치를 부여하지 않고, 전세계에서 발견된 가장 일반적인 HLA-DR 대립유전자를 나타낸다. 20개의 대립유전자는 '개방' p1 구성을 포함하고, 14개는 83번 위치의 글리신이 발린으로 치환되는 '폐쇄' 구성(closed configuration)을 포함한다. 주요 결합 잔기의 위치는 시험 단백질 서열에 걸쳐 있는 8개의 아미노산에 의해 중첩되는 9량체 펩타이드의 인 실리코 생성에 의해 달성된다. 이 과정은 MHC 클래스 II 분자에 결합하거나 결합하지 않는 펩타이드 사이에서 높은 정확도로 성공적으로 구별된다.
또한, 다른 단백질 서열의 시험관내 인간 T 세포 에피토프 매핑 분석에 의해 이전에 확인된 T 세포 에피토프에 대한 매칭을 위해서 TCEDTM(T Cell Epitope DatabaseTM) 검색을 사용하여 서열을 분석하였다. TCEDTM은 관련이 없는 단백질 및 항체 서열로부터 유래된 펩타이드의 대규모(10,000개 초과의 펩타이드) 데이터베이스에 대해 임의의 시험 서열을 검색하는 데 사용된다.
인간 대식세포를 사용한 식세포작용 역가 검정
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심분리에 의해서 백혈구로부터 단리시켰다. 그 다음 CD14 양성 PBMC를 CD14 마이크로비드를 사용하여 자성 세포 단리를 통해서 단리시켰다. 동시에, 주카트 세포를 녹색 CFSE(카복시-플루오레세인 다이아세테이트, 석신이미딜 에스터) 세포 트레이서 염료를 사용하여 표지하였다. 총 6.25×105개의 표지된 주카트 세포를 5% CO2를 함유하는 가습 분위기에서 37℃에서 1시간 동안 96웰 플레이트에서 UH2 항체의 존재 하에서 사전 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 2.5×105개의 CD14 양성 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 동일한 배양 조건 하에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
격렬한 피펫팅에 의해서 세포를 수거하고, 생존성 염료로 염색하고, 얼음 냉각된 4% 파라폼알데하이드를 사용하여 10분 동안 교정시켰다. 고정 후, 세포를 Fc 수용체 결합 저해제 단클론성 항체로 10분 동안 차단하고, 이어서 Alexa Fluor 647(AF647) 접합된 항-인간 CD11b 항체와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 4% 파라폼알데하이드 중에서 5분 동안 추가 시간 고정시켰다.
세포를 CFSE 및 AF647 형광 강도 데이터와 함께 측면 산란 및 전방 산란 특성을 기록하는 BD Fortessa 유세포 분석기 상에서 분석하였다. 적어도 1×104개의 AF647 양성 이벤트가 기록될 때까지 데이터를 캡처하였다. FlowJo 소프트웨어(버전 10.4.2)를 사용하여 데이터를 획득 후 분석하였다. 간략하면, 산란 특성(FSC-면적에 의한 SSC-면적)에 의해서 세포 부스러기를 게이팅하였다. SSC-높이에 의한 SSC-면적에 의해서, 이어서 FSC-높이에 의한 FSC-면적에 의해서 단일 세포를 게이팅하였다. 남아있는 단일 세포 집단으로부터, CFSE 및 CD11b 이중 양성 세포를 비히클 처리된 시험에서 CD11b 양성 세포의 집단에 기초하여 배치된 사분(quadrant) 게이트를 사용하여 게이팅하였다. CD11b 양성 집단으로부터의 CFSE 양성 세포의 백분율을 계산하고, 플로팅하였다.
결과 및 논의
바람직한 인간 생식세포계열 v-유전자 상의 CDR 이식
길항작용적 뮤린 항-CD47 IgG 5F9G4(5F9G4; WO2011143624A2 및 표 2 참조)를 먼저 CDR 이식을 사용하여 인간 생식세포계열 면역글로불린 v-도메인 프레임워크 서열 스캐폴드에 도입하였다. 최적의 약물-유사 특성을 갖는 최종 리드 치료용 IgG 화합물에 대한 본 발명자들의 조작 노력을 편향시키기 위해, 본 발명자들은 모체 항체의 CDR을 매우 양호하게 디스플레이되고, 파지 디스플레이에서 scFv 포맷으로 발현되고, 우수한 용해도 및 높은 물리적 안정성을 갖고, 발현된 인간 항체 레퍼토리에서 높은 빈도로 사용되는 것으로 공지된 "바람직한" 생식세포계열 스캐폴드 IGHV5-51 및 IGKV2-28에 이식시키기로 선택하였다. IGHV5-51이 또한 VH의 이식을 위한 바람직한 생식세포계열 프레임워크였는데, 그 이유는 그것이 m5F9G4 HCDR2와 높은 서열 및 구조적 모티프 상동성을 나타내었기 때문이다(도 2).
이러한 스캐폴드 및 이식된 CDR 정의는 표 2에 요약되어 있다. 키메라 항-CD47 항체 m5F9G4 및 인간화된 h5F9G4에 대한 중쇄 및 경쇄 서열을 또한 표 2에 제시한다. 이러한 CDR 이식 과정은 널리 공지되어 있지만, 주어진 인간 v-도메인 서열의 세트가 비-인간 CDR 이식에 적합한 수용체 프레임워크로서 작용할 것인지 예측하는 것은 여전히 문제가 있다. 부적합한 프레임워크의 사용은 표적 결합 기능의 손실, 단백질 안정성 문제 또는 심지어 최종 IgG의 발현 손상을 야기할 수 있다. 따라서, IGKV2-28/IGHV5-51 이식편을 CDR 돌연변이생성 및 개선된 클론의 선택을 위한 주형으로 채택하였다.
라이브러리 생성 및 스크리닝
CDR-이식된 IGKV2-28/IGHV5-51 v-도메인 서열을 VL-VH scFv 포맷으로 조합하고, 돌연변이생성 라이브러리 카세트를 매스 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조립에 의해 생성시켰다. 최종 scFv 라이브러리를 파지 디스플레이 벡터에 결찰시키고, 전기 천공법을 통해 이.콜라이 내에 형질전환시켜 6.0×108개의 독립적인 클론을 생성시켰다. 96개의 클론을 서열결정함으로써 라이브러리 구축 품질을 검증하였다. 이러한 서열결정 데이터는 각각의 분산 위치에서 뮤린 또는 인간 생식세포계열 잔기를 암호화하는 위치가 대략 50%의 빈도로 효과적으로 샘플링되었음을 나타내었다. 헬퍼 파지 M13을 사용하여 라이브러리를 구제하였고, 선택을 다중 개별 분지로 바이오티닐화된 인간 및 시노몰거스 원숭이 CD47-Fc 단백질 상에서 수행하였다.
사후-선택 스크리닝(도 1A 내지 도 1F에 제시된 바와 같음) 및 DNA 서열결정은, 프레임워크 서열이 완전 생식세포계열을 유지하면서, h5F9G4 IgG1과 에피토프 결합 경쟁을 보유하고, hSIRPα에 대한 hCD47의 결합을 차단하고, CDR 내에 상당히 증가된 인간 함량을 함유하는 269개의 고유한 인간 및 마우스 CD47-결합 scFv 클론의 존재를 나타내었다. 이들 269개의 클론 중에서, 생식세포계열화 돌연변이는 모두 CDR에서 관찰되었다(표 3). 리드 클론을 인간 CD47-Fc 및 h5F9G4 둘 다에 대한 CDR 생식세포계열화 대 HTRF 신호의 수준에 기초하여 순위 매겼다(도 1). 이어서 이러한 순위로부터의 상위 11개 클론의 v-도메인을 하기와 같이 추가 시험을 위해서 IgG 발현 벡터 내에 서브클로닝시켰다(표 4). 그러나, 예상치 못하게, CD47-SIRPα 및 CD47-h5F9G4 둘 다의 중화의 모든 분석에서, 라이브러리 유래된 클론 또는 IGKV2-28/IGHV5-51 이식편 scFv 중 어느 것도 IGKV2-28/IGHV1-3-이식된 h5F9G4 scFv와 동일한 역가를 달성하지 않았다(도 1A 내지 도 1F).
라이브러리 선택으로부터 직접 유래된 리드 클론의 경우 생식세포계열화 돌연변이가 모든 CDR에서 발견된 반면, 서열 분석은 추가 클론을 최대 인간화를 갖고, 최대 CD47 결합 친화도 및 길항성 역가를 보유하도록 설계할 수 있는 가능성을 남겼다. 따라서, 인간 및 마우스 단백질에 대해서 결합 신호를 갖는 269개의 서열-고유한 히트를 사용하여 이러한 기능적으로 특징규명된 집단의 CDR에서 뮤린 아미노산에 대한 보유 빈도를 분석하였다. 위치 아미노산 보유 빈도를 VH 및 VL 도메인에서 발견되는 백분율로서 표현하였다(도 2A, 도 2B). 75% 미만의 RF를 갖는 뮤린 잔기는 일련의 조합 설계에서 표적 결합 파라토프에 필수적이지 않을 수 있고 생식세포계열화에 개방될 가능성이 있는 위치로 간주되었다. 중요하게는, 상기에 요약된 scFv 스크리닝 데이터에서 관찰된 바와 같이, IGHV5-51-이식된 VH 도메인의 역가는 IGHV1-3 프레임워크에 대한 것보다 낮을 가능성이 있다고 간주되었다. 이것이 사실인지의 여부를 조사하기 위해서, 도 2A 및 도 2B에 요약된 파라토프 샘플링 정보를 사용하여 초기 라이브러리(VH 도메인 내의 IGHV5-51 프레임워크)로부터 유래된 상당히-인간화된 클론과의 비교를 위해서 IGKV2-28 및 IGHV1-3 프레임워크에서 디자이너 클론을 작제하였다.
다수의 조합으로, 75% 초과의 RF를 갖는 원칙적으로 이러한 뮤린 잔기를 함유하는 10개의 VH 디자인을 VH1.1 내지 VH1.10으로 지정하였다. scFv 서열의 고기능 집단에서 발견된 가장 인간화된 CDR과, LCDR1에서 추가-인간화 및 탈아마이드화 모티프-파괴 돌연변이를 조합한 6개의 VL 디자인(VL1.1 내지 VL1.6)을 또한 생성시켰다(표 4). 이들 LCDR1 인간화 및 안정화 돌연변이는 11, 12 및 13번 위치(잔기 GNT)를 샘플링하였는데, 이것은 가변 위치인 것으로 관찰되었지만(도 2A, 표 3), 이들 잠재적으로 최적의 서열(예를 들어, 디자이너 쇄 VL1.4에서 발견된 'ANT' 및 특히 'AYN' 모티프 및 표 4에 요약된 다른 것)이 표적 결합 특이성 및 CD47-SIRPα 상호작용을 차단하는 능력을 보유하면서 용인될 수 있다는 것을 명시적으로 입증하지는 않았다.
유전자 합성(상기에 요약된 11개의 라이브러리-유래된 클론, 양성 대조군 IGHV5-51 이식편, h5F9G4 및 m5F9G4, 및 음성 대조군 비-CD47-반응성 v-도메인과 함께)에 의해서 VH 및 VL 클론을 생성시키고, 이어서 인간 IgG1널로서의 생산을 위해서 발현 벡터 내에 클로닝시켰다. 기능성 최적화된 서열을 찾을 기회를 최대화하기 위해서, 디자이너 VH 및 VL 클론을 매트릭스화하여 VH 서열 및 VL 서열의 모든 가능한 조합을 조합하였다. 상기에 관찰된 IGHV5-51-기반 scFv의 관찰된 감소된 역가가 프레임워크 선택이 아니라 scFv 포맷팅으로 인한 것인지의 여부를 조사하기 위해서, 리드 클론 D6의 scFv를 IgG1 및 scFv-Fc 융합 포맷 둘 다로서 클로닝하였다. 모든 IgGs 및 D6 scFv-Fc 융합 단백질을 쉽게 발현시켰고, HEK-293 세포의 일시적인 형질주입으로부터 정제시켰다.
라이브러리-유래된 리드 IgG 특이성 및 역가 특성
이어서, 상기에 기재된 정제된 IgG를 직접 적정 ELISA 포맷으로 인간 및 시노 CD47-Fc에 대한 결합에 대해 시험하였다. 이러한 분석은, 모든 라이브러리 유래된 클론이 인간 CD47에 대한 결합 친화도를 보유하였지만, m5F9G4 IgG1의 결합을 완전히 재현한 것은 아니었음을 입증하였다(도 3A). 이러한 감소된 결합은 시노 CD47에 대해서 더 두드러졌는데, 클론 F-G3은 특히 약한 반응성을 나타내었다(도 3B).
직접 ELISA 결합 신호는 결합활성에 영향을 받고, 특이적 에피토프의 유지를 증명하지 않기 때문에, 모든 IgG를 CD47-SIRPα 결합 차단 검정(도 4) 및 CD47에 대한 5F9G4 결합의 용액상 HTRF 경쟁 검정(도 5)으로 조사하였다. CD47-SIRPα 결합 차단 검정에서, 모든 라이브러리-유래된 IgG는 인간(도 4A)에 결합하든 시노 CD47(도 4B)에 결합하든 간에, h5F9G4, m5F9G4 및 IGHV5-51 이식된 IgG에 비해서 상당히 감소된 역가를 나타내었다. 중요하게는, IGHV5-51-이식된 IgG는, SIRPα에 대한 인간 및 시노 CD47 둘 다의 결합을 완전히 차단하는 능력을 나타내었지만, h5F9G4에 비해서 역가가 명백히 감소하였다. 이는, 5F9G4 CDR을 IGHV5-51 프레임워크 상에 배치하는 이식 방법은 h5F9G4에 비해서 분자의 역가를 특별하게 감소시켰는데, 그 이유는 CDR 서열이 두 프레임워크 모두에서 유지되기 때문이다. 추가의 예상치 못한 발견으로, D6 scFv-Fc 융합 단백질은 두 오쏘로그에 대해서 IGHV5-51 이식편 IgG의 출발 CD47 차단 역가를 유지하였지만, D-A6 IgG는 두 오쏘로그를 완전히 차단할 수 없었다(도 4A, 도 4B).
일부 IGHV5-51-프레임워크 클론에 의한 CD47 차단 역가의 관찰된 손실이 '에피토프 이동' 현상에 의해 유도되지 않았는지를 확인하기 위해 HTRF 검정을 수행하였다. 이 검정은 CD47에 대한 h5F9G4의 결합에 대해서 경쟁하는 이들 클론의 능력을 조사하였다. 이들 분석은, 대부분의 모든 클론(예측된 F-G3)이 h5F9G4와 교차 경쟁할 수 있고, 대부분의 클론은 최고 농도에서 결합의 완전 저해를 나타내었다(도 5A). 그러나, 저해의 역가는 h5F9G4 자가-경쟁에 비해서 다시 감소되었다. 이러한 발견은, 공유된 에피토프는 유지되었지만, IGHV5-51 프레임워크 클론에서 결합 친화도는 감소되었음을 시사한다. 중요하게는, D6 IgG에 비해서 개선된 D6 scFv-Fc의 기능은 다시 D6 scFv-Fc가 IGHV5-51 이식편 IgG와 동등한 역가를 나타내지만, D-A6 IgG는 명백히 감소된 역가를 가짐을 입증하였다(도 5B).
D6 scFv-Fc 융합 역가 대 D6 IgG에 관한 발견은, scFv 디스플레이 및 스크리닝과 커플링된, CDR을 재이식시키는 방법이 scFv 포맷에서 우세하게 기능성이고, 이어서 IgG1로 재구성될 때 손상되는 클론을 예상치 못하게 선택하였음을 강하게 시사하였다. 이러한 관찰은, 이러한 클론을 이중특이적 항체 생성에서 특히 매력적으로 만드는데, 그 이유는 scFv 단편이 다중특이적 항체의 모듈식 빌딩 블록으로서 성공적으로 사용될 수 있기 때문이다. 그러나, 총괄하면, 이러한 발견은 또한 Townsend 등의 본래 방법이 h5F9G4의 개선된 버전을 생성시키는 데 실패하였다는 것을 입증한다.
디자이너 IgG 특이성 및 역가 특성
이어서, 상기에 기재된 정제된 디자이너 IgG를 직접 적정 ELISA 포맷으로 인간 및 시노 CD47-Fc에 대한 결합에 대해 시험하였다. 이러한 분석은, 다수의 클론이 인간 및 시노 CD47에 대한 결합 친화도를 보유하였지만, 결합 역가의 범위는 매우 이질적인데, 일부 클론은 결합 신호가 상당히 감소되었지만, IgG의 하위세트는 m5F9G4 IgG1의 결합을 완전히 재현한다(도 6A 내지 도 6H). VL1.1 내지 1.6 도메인과 조합하여 VH1.8 VH 도메인을 함유하는 클론의 패밀리는, m59G4의 완전 결합 역가의 가장 일관된 재현을 나타내었고, 이것은 도 6G 및 도 6H에 개별적으로 도시되어 있다.
직접 ELISA 결합 신호는 결합활성에 영향을 받고, 특이적 에피토프의 유지를 증명하지 않기 때문에, 모든 IgG를 CD47-SIRPα 결합 차단 검정(도 7, 도 8)으로 조사하였다. CD47-SIRPα 결합 차단 검정에서, 모든 VH1.8 패밀리 IgG는 높은 역가를 나타내었는데, 인간(도 7A)에 결합하든 시노 CD47(도 7B)에 결합하든, h5F9G4 및 m5F9G4에 비해서 VH1.8/VL1.4 이외의 모든 클론에 대해서 기능성 동등성을 갖는다. ELISA에서 양호하게 작용한 몇몇 다른 디자이너 클론은 또한 VH1.8 패밀리 클론보다 더 낮은 역가에도 불구하고, hCD47-SIRPα 결합을 차단하는 능력을 나타내었다(도 8).
고기능성 디자이너 클론에 의한 CD47 차단 역가의 관찰된 유지가 유지된 에피토프 특이성과 커플링되었는지를 보장하기 위해서, CD47에 결합하는 5F9G4의 용액상 HTRF 경쟁 분석을 수행하였다(도 9). 이 검정은 CD47에 대한 h5F9G4의 결합에 대해서 경쟁하는 주요 디자이너 클론의 능력을 조사하였다. 이들 분석은, 모든 VH1.8 패밀리 클론이 h5F9G4와 교차 경쟁할 수 있고, 다수의 클론이 인간(도 9A) 및 시노(도 9B) CD47에 대해서 동등한(표 5) 역가를 나타내었다는 것을 입증하였다. 그러나, VH1.8/VL1.4에 대한 저해 역가는 h5F9G4 자가-경쟁에 비해서 다시 감소하였다. 이러한 발견은, 공유된 에피토프는 유지되었지만, VL1.4 도메인-함유 클론의 경우결합 친화도가 감소되었음을 시사하였다. 추가의 HTRF 분석은, hCD47 차단을 나타낸 모든 비-VH1.8 패밀리 클론(도 8)이 또한 h5F9G4와 교차 경쟁할 수 있지만, 모든 클론은 인간(도 9C) 및 시노(도 9D) CD47에 대해서 감소된 역가(표 5)를 나타내었다는 것을 입증하였다. VH1.8 배경에서 CDR 잔기를 추가로 샘플링하기 위한 시도로, VL1.5 서열의 3개 추가의 디자이너 자손(VL1.7, VL1.8 및 VL1.9)과 함께 2개의 추가 디자인(VH1.11 및 VH1.12)을 생성시켰다. 이들 디자인을 매트릭스에서 공동 발현시켜 6개 추가의 IgG를 생성시키고, 이어서 CD47-SIRPα 차단 검정으로 조사하였다. 이러한 분석은, 10㎍/㎖에서 최소한의 차단(50% 미만)을 유지한 VH1.12/VL1.8을 제외한 클론 모두가 CD47을 길항시키는 데 있어서 모든 역가를 잃어버렸다는 것을 나타내었다. 이들 발견은, LCDR2의 6번 위치에서의 F>A의 돌연변이, 또는 LCDR3의 1번 위치에서의 돌연변이 F>M이 모두 CD47 길항작용의 완전한 제거로 이어졌다는 것을 나타내었다.
세포막에서 리드 IgG 결합 특이성의 유세포 분석
ELISA에 의해서 CD47에 대한 결합을 보유하는 것을 나타내는 항체를 유세포 분석법을 통해 세포 표면에서 농도 의존적인 결합에 대해 분석하였다. CHO-K1 세포에 인간 또는 시노 CD47 전장 cDNA를 안정적으로 형질주입시켰다. 이어서, 항-CD47 IgG 및 아이소타입 대조군 IgG1을 모두 IgG1널 포맷으로 100 내지 0.024㎍/㎖의 농도 범위에 걸쳐서 인간, 시노, 또는 야생형 대조군('wt', 즉, 비형질주입됨) CHO-K1에 대한 결합에 대해서 시험하였다(도 10). 아이소타입 대조군 이외의 모든 IgG는, 인간 및 시노 CD47+ 세포, 또한 인간 AML 세포주 HL60에 대해서 농도-의존적인 결합을 나타내었고, 각각의 경우에서 최대 MFI는 비형질주입된 CHO-K1에 대한 결합에 대한 관찰된 배경 신호보다 50배를 초과하게 더 높다. 항-CD47 항체는 아이소타입 대조군 IgG1과 필적하는, 비형질주입된 CHO-K1 세포에 대해서 측정 가능한 배경 결합을 나타내지 않았다(도 10).
'개발 가능성' ELISA 검정에서 리드 IgG 분석
치료 용도로 의도된 IgG의 여러 지표 생물학적 기질에 대한 결합은 불량한 생체이용률 및 짧은 생체내 반감기로 인해서 환자에서 불량한 성능에 대한 높은 위험의 지표라는 것이 당업계에 공지되어 있다. 3종의 이러한 생물학적 기질은 인슐린, dsDNA 및 ssDNA이다(Avery et al. Mabs; 10:2; 244-255; 2018). 따라서 이들 3종의 기질을 사용하여 ELISA 플레이트를 코팅하고, 최적화된 리드 항체의 IgG1널 버전의 결합을 조사하였다. 이러한 인간 IgG 기반 항체에 대한 결합 신호를 다중 반응성 및 불량한 성능을 갖는 것으로 밝혀진 '양성 대조군' 인간 IgG 항체와 비교하여 임상 시험 진행을 중단하였다(보코시주맙 및 브리아키누맙 인간 IgG1 유사체). 음성 대조군 인간 IgG1 항체의 경우, 브리아키누맙과 동일한 치료 표적과 반응하기 때문에 IgG1 우스테키누맙 유사체를 사용하였지만, 이것은 pK가 더 길고, 치료 제품으로 성공적으로 승인되었다. 도 11A, 도 11B 및 도 11C에 도시된 ELISA 분석에서, 양성 대조군 항체는 3종의 기질 모두에 대해 예상되는 강한 반응성을 나타낸 반면, 음성 대조군 우스테키누맙은 낮은 반응성을 나타내었다. 중요하게는, 시험된 모든 IgG1 리드 클론은 3종의 기질 모두에 대해 음성 대조군과 동일하거나 더 낮은 결합을 나타내었다. 이러한 발견은 최적화된 클론 VH1.8/VL1.1, VH1.8/VL1.2, VH1.8/VL1.3, VH1.8/VL1.4, VH1.8/VL1.5, VH1.8/VL1.6, VH1.7/VL1.4, VH1.6/VL1.9 및 VH1.12/VL1.8에서 매우 특이적인 표적-유래 결합의 유지를 강조한다.
항체 v-도메인 T 세포 에피토프 분석
치료용 항체 및 단백질에서 T 세포 에피토프의 위치를 식별하는 것에 기초한 인 실리코 기술(압제나사)을 h5F9G4 및 리드 v-도메인의 면역원성을 평가하기 위해 사용하였다. v-도메인 열의 분석은 중첩된 9량체 펩타이드(각각 최종 펩타이드가 8개의 잔기에 의해 중첩됨)를 사용하여 수행하였고, 이를 34개의 MHC 클래스 II 알로타입 각각에 대해 시험하였다. 각각의 9량체를 잠재적인 '적합성' 및 MHC 클래스 II 분자와의 상호작용에 기초하여 점수를 매겼다. 소프트웨어에 의해 계산된 펩타이드 점수는 0 내지 1이다. 높은 평균 결합 점수(iTopeTM 점수 기록 기능에서 0.55 초과)를 생성한 펩타이드를 강조하였고, MHC 클래스 II 결합 펩타이드의 50% 초과(즉, 34개의 대립 유전자 중 17개)가 높은 결합 친화도(0.6 초과의 점수)를 갖는 경우, 이러한 펩타이드는 CD4+ T 세포 에피토프를 함유할 위험이 높은 것으로 간주되는 '고친화도' MHC 클래스 II 결합 펩타이드로 정의되었다. 낮은 친화도 MHC 클래스 II 결합 펩타이드는 0.55 초과(그러나 대부분 0.6 초과가 아님)의 결합 점수로 상당한 수의 대립유전자(50% 초과)에 결합한다. TCEDTM를 사용하여 서열의 추가 분석을 수행하였다. 이 서열은 압제나사에서 수행된 이전의 시험관내 T 세포 에피토프 매핑 연구에서 T 세포 반응을 자극하는 관련되지 않은 단백질/항체로부터의 펩타이드(T 세포 에피토프) 사이의 임의의 높은 서열 상동성을 확인하기 위해 BLAST 검색에 의해 TCEDTM를 조사하는데 사용되었다.
펩타이드를 다음의 4개의 클래스로 분류하였다: 고친화도 외부물질('HAF' - 고 면역원성 위험), 저친화도 외부물질('LAF' - 더 낮은 면역원성 위험), TCED+(TCEDTM 데이터베이스에서 이미 식별된 에피토프), 및 생식세포계열 에피토프('GE' - 높은 MHC 클래스 II 결합 친화도를 갖는 인간 생식세포계열 펩타이드 서열). 생식세포계열 에피토프 9량체 펩타이드는 광범위한 생식세포계열 펩타이드를 사용한 이전 연구에서 검증된 바와 같이 T 세포 관용(즉, 이들 펩타이드는 숙주에서 "자가"로서 인식됨)으로 인해서 면역원성 가능성을 갖지 않을 것이다. 중요하게는, 이러한 생식세포계열 v-도메인 에피토프(인간 항체 불변 영역에서 유사한 서열에 의해 추가로 제공됨)는 또한 항원 제시 세포의 막에서 MHC 클래스 II 점유에 대해서 경쟁하여, T 세포 자극에 필요한 '활성 역치'를 달성하기에 충분한 외래 펩타이드 제시 위험을 감소시킨다. 따라서 높은 GE 함량은 항체 치료제의 임상 개발에서 유리한 품질이다. 반면에, TCED+ 펩타이드는 MHC 분자에 제시될 수 있고, 인간 t 세포를 활성화할 수 있는 실험적으로 입증된 펩타이드 에피토프의 특성을 갖기 때문에 임상에서 면역원성 위험이 매우 높다.
주요 리드 v-도메인은 h5F9G4와 비교할 때 펩타이드 에피토프 함량에서 상당한 이로운 변화를 나타냈다. 따라서, 본 명세서에서 수행된 v-도메인 조작 방법은 TCED+이고, h5F9G4의 중쇄 및 경쇄 v-도메인 둘 다에서 발견된 다중 HAF 및 LAF 에피토프를 제거하면서 항-CD47 역가를 유지하는 항체에 대해 성공적으로 선택되었다. 중요하게는, 리드 클론의 CDR에서 발견되는 생식세포계열화 돌연변이에 의해서 이들 외부 에피토프를 선택적으로 제거하였다. 예를 들어, h5F9G4의 LCDR-1에서 발견된 TCED+ 펩타이드 'IVYSNGNTY'(서열번호 106)(도 12a)(따라서 CDR 이식에 의해 인간화된 h5F9G4의 모든 형태)는 표 4의 모든 리드 클론에서 발견된 바와 같이 1 및 2번 위치에서 돌연변이 I>L 및 V>L에 의해서 대부분의 리드 클론에서 제거되었다. 이러한 발견은 LCDR1 단독의 생식세포계열화 및 비-생식세포계열화 돌연변이가 아스파라긴 탈아마이드화 위험 모티프뿐만 아니라 입증된 인간 T 세포 에피토프를 제거하는 데 충분함을 나타내었다.
유사하게, h5F9G4 서열로부터의 HCDR1/프레임워크 2 영역은 HAF 및 TCED+ 펩타이드 'YNMHWVRQA'(서열번호 107)를 암호화하였다(도 12b). 이 에피토프는 표 4에서 발견된 다수의 리드 서열, 예컨대, 서열 'YAMHWVRQA'(서열번호 108)를 함유하는 항체(예를 들어, VH1.1, VH1.6, VH1.8, VH1.9, VH1.11, VH1.12) 또는 'YNIHWVRQA'(서열번호 109)를 함유하는 항체(예를 들어, VH1.7)에서 제거되었다. 중요하게는, 2번 위치에서 N>A 및 3번 위치에서 M>I 돌연변이는 TCED+ 에피토프를 제거할 뿐만 아니라 이 에피토프를 GE 펩타이드로 전환시켰다. 또한, 표 4에 기재된 모든 리드의 HCDR2의 마지막 잔기의 생식세포계열화(표 2에 정의된 바와 같은 최종 c-말단 HCDR2 위치에서 돌연변이 D>G)가 또한 IGHV5-51('FQGQVTISA' 서열번호 102) 및 IGHV1-3('FQGRVTITA' 서열번호 103) 둘 다의 생식세포계열에서 발견되는 GE 펩타이드를 회복시켰다.
h5F9G4 VH 도메인의 HCDR3/프레임워크 4 서열에서, 추가의 TCED+ 펩타이드 'YRAMDYWGQ'(서열번호 110)가 식별되었다(도 12c). 이러한 에피토프는 표 4에서 발견된 다수의 리드 서열, 예컨대 서열 'YRAEDYWGQ'(서열번호 111)를 함유하는 항체(예를 들어, VH1.1, VH1.2, VH1.3, VH1.6, VH1.9)에서 제거되었다.
비판적으로, 도 2A 및 도 2B의 데이터에 따라 CD47-결합 클론에서 용인되지 않는 것으로 예측된 비-생식세포계열 및 생식세포계열 돌연변이를 탐색적 신규 치환으로서 몇몇 주요 리드에 포함시켰다. 예를 들어, h5F9G4의 LCDR-1에서, 경쇄 서열 VL1.3, VL 1.4, VL 1.5 및 VL 1.6(표 4)에서 발견되는 발달 위험 모티프-제거 돌연변이는 용인되지 않아야 한다(도 2B). 유사하게, VH1.8 서열 및 기타(표 4)에 기초한 클론의 HCDR1에서의 단일, 탈면역화, 비보존적 N>A 돌연변이는 도 2A의 데이터에서 용인되지 않을 것으로 강력하게 예측되었다. 이러한 발견은 이로운 돌연변이가 상황에 따라 v-유전자 프레임워크 의존적이며, 이러한 경우 선험적으로 또는 Townsend 등의 방법으로 완전히 예측될 수 없음을 나타낸다.
마지막으로, VL 서열 VL1.1 내지 1.9에서 2개의 나머지 HAF 펩티드가 발견되었다. 프레임워크2/LCDR2 영역에 걸쳐 있는 제1 HAF 펩타이드 'LIYKGSNRF'(서열번호 112)가 도 13a에 도시된 분석에서 식별되었다. 프레임워크3/LCDR3 영역에 걸쳐 있는 제2 HAF 펩타이드 'VGVYYCFQA'(서열번호 113)는 도 13a에 도시된 분석에서 식별되었다. 두 HAF 펩타이드 모두는 1번 위치의 잔기를 알라닌(각각 L>A 및 V>A)으로 돌연변이시킴으로써 완전히 제거될 수 있다. 이러한 치환을 샘플링하기 위해, VL 도메인에 두 알라닌 치환 모두를 함유하는 새로운 클론 'VH1.8/VL1.6-DI'를 작제하였다.
주요 리드의 역가 및 친화도 분석
클론 h5F9G4, VH1.8/VL1.1, VH1.8/VL1.6 및 VH1.8/VL1.6-DI를 쉽게 발현시키고, 인간 IgG4(S228P) 포맷으로 정제시켰다. 모든 클론의 경우, Fab 도메인을 또한 가용성 단량체로서 발현시키고, 결합 친화도 분석을 위해서 정제시켰다. 이어서, 이들 Fab를 정상 상태 친화도 분석을 사용하여 바이아코어에 의해서 인간 및 시노 CD47에 대한 결합에 대해서 조사하였다. 정상 상태는 모든 Fab의 온 및 오프 레이트가 신뢰할 수 있는 1:1 모델링에 대해서 너무 빠르기 때문에 결합 친화도 분석으로 사용하였다. 표 6에 제시된 바와 같이, 모든 4개의 클론은 매우 낮은 Chi2 값에 의해서 입증된 바와 같이, 정확하고, 양호하게 일치하는 데이터를 나타내었다. 모든 클론은 h5F9G4의 2배 이내로, 낮은 nM 범위로 결합 친화도를 가짐을 발견하였다.
보유된 역가의 최종 분석으로서, IgG4(S228P) 포맷의 클론 h5F9G4, VH1.8/VL1.1, VH1.8/VL1.6 및 VH1.8/VL1.6-DI를, 3명의 개별 공여자로부터 유래된 인간 단핵구-유래된 대식세포 및 CD47+ 표적 세포로서의 주카트 인간 암 세포를 사용하여, 식세포작용의 유세포 분석법 검정으로 이의 상대적인 역가에 대해서 조사하였다. 공여자 1(도 14a), 공여자 2(도 14b) 및 공여자 3(도 14c)으로부터의 세포에 대해서 분석된 모든 클론의 경우, 모든 클론은 완전 중첩 반응 곡선에 의해서 입증된 바와 같이, h5F9G4의 역가에 비해서 완전히 유지되거나 개선되었다.
본 발명은 바람직한 또는 예시적인 실시형태를 참조하여 설명되었지만, 당업자는 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변형 및 변화가 달성될 수 있고, 그러한 변형이 본 명세서에서 명확하게 고려됨을 인식할 것이다. 본 명세서에 개시되고 첨부된 청구범위에 제시된 특정 실시형태에 대한 어떠한 제한도 의도되지 않으며, 또한 추론되어서는 안 된다.
본 명세서에 개시되고 첨부된 청구범위에 제시된 특정 실시형태에 대한 어떠한 제한도 의도되지 않으며, 또한 추론되어서는 안 된다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적 및 논문을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 임의의 목적을 위해 전체적으로 참조에 의해서 명확하게 포함된다. 포함된 문헌 중 하나 이상 또는 문헌의 일부가 본 출원에서의 용어의 정의와 상반되는 용어를 정의하는 경우, 본 출원에 제시된 정의가 우선시된다. 그러나 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원에 대한 언급은, 그것이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 임의의 국가에서 공통적인 일반적인 지식의 부분을 형성한다는 인정 또는 제안의 임의의 형태로서 간주되어서는 안 된다.
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SEQUENCE LISTING <110> ULTRAHUMAN TWO LIMITED <120> CD47 BINDING AGENTS <130> WO/2019/185717 <140> PCT/EP2019/057723 <141> 2019-03-27 <150> GB 1813693.7 <151> 2018-08-22 <150> GB 1804860.3 <151> 2018-03-27 <160> 333 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1.8/VL1.6 heavy chain variable (VH) region <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1.8/VL1.6 light chain 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<222> (1)..(1) <223> Xaa can be Met or a conservative substitution of Met <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Thr or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Asp or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Ser or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Asn or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be Gln or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Lys or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be Gln or Lys <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa can be Gly or Asp <400> 29 Xaa Gly Xaa Ile Tyr Pro Gly Xaa Xaa Asp Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Phe Xaa Xaa <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 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<221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Asn or any amino acid <400> 32 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Gln Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9G4 murine/humanized antibody HCDR1 <400> 33 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Asn Met His 1 5 10 <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9G4 murine/humanized antibody HCDR2 <400> 34 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys 1 5 10 15 Phe Lys Asp <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9G4 murine/humanized antibody HCDR3 <400> 35 Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR1 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Ile or a conservative substitution of Ile <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be Val or a conservative substitution of Val <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Tyr or a conservative substitution of Tyr <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asn or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be Gly or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Asn or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be Thr or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Gly or any amino acid <400> 36 Arg Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Xaa 1 5 10 15 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Val or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Phe or any amino acid <400> 37 Lys Xaa Ser Asn Arg Xaa Ser 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Phe or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Gly or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be Ser or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be His or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Val or any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Thr or any amino acid <400> 38 Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Xaa 1 5 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9G4 murine/humanized antibody LCDR1 <400> 39 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly 1 5 10 15 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9G4 murine/humanized antibody LCDR2 <400> 40 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5F9G4 murine/humanized antibody LCDR3 <400> 41 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR1 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Ser or a conservative substitution of Ser <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Asn or a conservative substitution of Asn <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Met or a conservative substitution of Met <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be His or any other amino acid <400> 42 Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 43 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Met or a conservative substitution of Met <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Gly or a conservative substitution of Gly <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Thr or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn or a conservative substitution of Asn <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Asp or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asp or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Ser or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Asn or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be Gln or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Lys or any other amino acid <400> 43 Xaa Xaa Xaa Ile Tyr Pro Gly Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Gly or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Tyr or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Ala or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Met or any other amino acid <400> 44 Xaa Gly Xaa Arg Xaa Xaa Asp Tyr 1 5 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR1 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Ile or a conservative substitution of Ile <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be Val or a conservative substitution of Val <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Tyr or a conservative substitution of Tyr <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asn or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be Gly or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Asn or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be Thr or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Gly or any other amino acid <400> 45 Arg Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Xaa 1 5 10 15 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Val or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Phe or any other amino acid <400> 46 Lys Xaa Ser Asn Arg Xaa Ser 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Phe or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Gly or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be Ser or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be His or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Val or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Thr or any other amino acid <400> 47 Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Xaa 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR1 <400> 48 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 49 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 49 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Gln Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 50 Gly Gly Phe Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding 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misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Asn or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be Gln or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Lys or any other amino acid <400> 75 Xaa Xaa Xaa Ile Tyr Pro Gly Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR1 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Thr or Ser <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Asn, Ser or Asp <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn, Ser or Ala <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Met or Ile <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be His or Gly <400> 76 Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 77 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Met, Ile or Val <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Gly, Ala or Ser <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Thr or Ile <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn or Asp <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Asp or Ser <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asp or Asn <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Ser, Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Asn, Ser or His <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be Gln, Pro or His <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Lys or Ser <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be Lys or Gln <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa can be Asp or Gly <400> 77 Xaa Xaa Xaa Ile Tyr Pro Gly Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Phe Xaa Xaa <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Gly or Gln <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Tyr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Ala, Ile, Thr, Val or Trp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Met, Ala, Glu, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val or Trp <400> 78 Xaa Gly Xaa Arg Xaa Xaa Asp Tyr 1 5 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR1 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Thr or Ser <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Asn or Asp <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn or Ala <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Met or Ile <400> 79 Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Xaa Xaa His 1 5 10 <210> 80 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn or Asp <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Asp or Ser <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asp or Asn <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Ser, Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Asn or Ser <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be Gln, Pro or His <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Lys or Ser <400> 80 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Tyr, Glu, Phe, Ile, Lys, Asn or Val <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Met, Glu or Gln <400> 81 Gly Gly Xaa Arg Ala Xaa Asp Tyr 1 5 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR1 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be Val or Leu <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Tyr or His <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asn, Gly, Ser or Lys <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be Gly, Ala or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Asn or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be Thr or Asn <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Gly or Asp <400> 82 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Xaa 1 5 10 15 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Phe or Ala <400> 83 Lys Gly Ser Asn Arg Xaa Ser 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Phe or Met <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be His or Gln <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Thr or Ile <400> 84 Xaa Gln Xaa Ser Xaa Val Pro Tyr Xaa 1 5 <210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR1 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asn or Lys <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be Gly, Ala or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Asn, Gln or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be Thr or Asn <400> 85 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gly 1 5 10 15 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be Val or Gly <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Phe, Ala or Ser <400> 86 Lys Xaa Ser Asn Arg Xaa Ser 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Phe, Leu or Met <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be Ser, Thr, Leu or Met <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be His, Gln or Arg <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Val, Ile or Thr <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Thr or Ile <400> 87 Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Xaa 1 5 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR1 <400> 88 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His 1 5 10 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR1 <400> 89 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Asn Ile His 1 5 10 <210> 90 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 90 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Ser Gln Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 91 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 91 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Ser Gln Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 92 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 92 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Pro Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 93 Gly Gly Lys Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 94 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 94 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Pro Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 95 Gly Gly Tyr Arg Ala Gln Asp Tyr 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR3 <400> 96 Met Gln Ala Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR3 <400> 97 Met Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 98 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 98 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Gln Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 99 Gly Gly Ile Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR3 <400> 100 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Ile 1 5 <210> 101 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 101 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human germline peptide sequence with high MHC class II binding affinity in the HCDR2 <400> 102 Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human germline peptide sequence with high MHC class II binding affinity in the HCDR2 <400> 103 Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala 1 5 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR1 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Asn or a conservative substitution of Asn <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Met or a conservative substitution of Met <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be His or any other amino acid <400> 104 Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 105 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Thr or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Asn or a conservative substitution of Asn <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Asp or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asp or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Ser or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Asn or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be Gln or any other amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Lys or any other amino acid <400> 105 Met Gly Xaa Ile Tyr Pro Gly Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCED+ peptide <400> 106 Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HAF and TCED+ peptide <400> 107 Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCED+ peptide <400> 108 Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCED+ peptide <400> 109 Tyr Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCED+ peptide <400> 110 Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 1 5 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCED+ peptide <400> 111 Tyr Arg Ala Glu Asp Tyr Trp Gly Gln 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HAF peptide <400> 112 Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Phe 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HAF peptide <400> 113 Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 1 5 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 114 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Asn Met His 1 5 10 <210> 115 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 115 Asn Tyr Asn Met His 1 5 <210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 116 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 1 5 <210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Asn 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 118 Thr Asn Tyr Asn Met His 1 5 <210> 119 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 119 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys 1 5 10 15 Phe Lys Asp <210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 121 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121 Tyr Pro Gly Asn Asp Asp 1 5 <210> 122 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 122 Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr 1 5 <210> 123 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 123 Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp 1 5 10 15 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 124 Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 125 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 125 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 126 Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 127 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 128 Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 129 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp 1 5 <210> 130 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 130 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly 1 5 10 15 <210> 131 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 131 Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 132 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 132 Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 133 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 133 Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr 1 5 10 <210> 134 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 134 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 135 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 135 Ala Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 1 5 10 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 136 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 137 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus 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molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 299 Gly Gly His Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 300 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 300 Gly Gly Leu Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 301 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 301 Gly Gly Leu Arg Thr Met Asp Tyr 1 5 <210> 302 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 302 Gly Gly Met Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 303 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 303 Gly Gly Asn Arg Ala Lys Asp Tyr 1 5 <210> 304 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 304 Gly Gly Asn Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 305 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 305 Gly Gly Gln Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 306 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 306 Gly Gly Arg Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 307 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 307 Gly Gly Ser Arg Ala Lys Asp Tyr 1 5 <210> 308 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 308 Gly Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 309 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 309 Gly Gly Thr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 310 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 310 Gly Gly Val Arg Ala Thr Asp Tyr 1 5 <210> 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Gly Tyr Arg Ala Pro Asp Tyr 1 5 <210> 317 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 317 Gly Gly Tyr Arg Ala Arg Asp Tyr 1 5 <210> 318 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 318 Gly Gly Tyr Arg Ala Ser Asp Tyr 1 5 <210> 319 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 319 Gly Gly Tyr Arg Ala Thr Asp Tyr 1 5 <210> 320 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 320 Gly Gly Tyr Arg Ala Val Asp Tyr 1 5 <210> 321 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 321 Gly Gly Tyr Arg Ile Met Asp Tyr 1 5 <210> 322 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 322 Gly Gly Tyr Arg Thr Glu Asp Tyr 1 5 <210> 323 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 323 Gly Gly Tyr Arg Thr Met Asp Tyr 1 5 <210> 324 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 324 Gly Gly Tyr Arg Thr Thr Asp Tyr 1 5 <210> 325 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 325 Gly Gly Tyr Arg Val Met Asp Tyr 1 5 <210> 326 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 326 Gly Gly Tyr Arg Trp Met Asp Tyr 1 5 <210> 327 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 327 Gln Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 328 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR1 <400> 328 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gly 1 5 10 15 <210> 329 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR1 <400> 329 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Tyr Asn Thr Tyr Leu Gly 1 5 10 15 <210> 330 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion LCDR2 <400> 330 Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 331 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 331 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn His Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 332 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR2 <400> 332 Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys 1 5 10 15 Phe Gln Gly <210> 333 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD47 antibody molecule or antigen-binding portion HCDR3 <400> 333 Gly Gly Asn Arg Ala Glu Asp Tyr 1 5

Claims (43)

  1. 항-CD47 항체(anti-Cluster of Differentiation 47 antibody) 또는 이의 항원-결합 부분으로서,
    상기 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
    (a) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
    (b) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
    (c) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASHVPYT(서열번호 53)의 LCDR3을 포함하거나;
    (d) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNAYNYLG(서열번호 56)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
    (e) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNANTYLG(서열번호 55)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
    (f) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 GYTFTNYAMH(서열번호 48)의 HCDR1, MGTIYPGNDDTKYNQKFQG(서열번호 49)의 HCDR2 및 GGFRAMDY(서열번호 50)의 HCDR3을 포함하고; 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 FQASQVPYT(서열번호 54)의 LCDR3을 포함하거나;
    (g) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGNSDTSYNPSFQG(서열번호 61)의 HCDR2 및 GGVRAMDY(서열번호 62)의 HCDR3을 포함하고; 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQASQVPYT(서열번호 63)의 LCDR3을 포함하거나; 또는
    (h) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGDSDTRYNPKFQG(서열번호 58)의 HCDR2 및 GGYRAEDY(서열번호 59)의 HCDR3을 포함하고; 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQGSHVPY(서열번호 60)의 LCDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1을 포함하고, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2를 포함하거나;
    (b) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 3을 포함하고, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함하거나;
    (c) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5를 포함하고, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6을 포함하거나;
    (d) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7을 포함하고, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 8을 포함하거나;
    (e) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9를 포함하고, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10을 포함하거나;
    (f) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11을 포함하고, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 12를 포함하거나;
    (g) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 13을 포함하고, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함하거나; 또는
    (h) 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 15를 포함하고, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 16을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  3. 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서,
    상기 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
    (a) HCDR1은 아미노산 서열 G-Y-X1-F-T-X2-Y-X3-X4-X5(식 중, X1은 S 또는 S의 보존적 치환이고, X2는 N 또는 N의 보존적 치환이며, X3은 N 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 M 또는 M의 보존적 치환이며, X5는 H 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 42)를 포함하고;
    (b) HCDR2는 아미노산 서열 X1-X2-X3-I-Y-P-G-X4-X5-X6-T-X7-Y-X8-X9-X10-F-Q-G(식 중, X1은 M 또는 M의 보존적 치환이고, X2는 G 또는 G의 보존적 치환이며, X3은 T 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 N 또는 N의 보존적 치환이며, X5는 D 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 D 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 S 또는 임의의 다른 아미노산이고, X8은 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X9는 Q 또는 임의의 다른 아미노산이고, X10은 K 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 43)를 포함하며;
    (c) HCDR3은 아미노산 서열 X1-G-X2-R-X3-X4-D-Y(식 중, X1은 G 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 Y 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 A 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 M 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 44)를 포함하고;
    (d) LCDR1은 아미노산 서열 R-S-S-Q-S-X1-X2-X3-S-X4-X5-X6-X7-Y-L-X8(식 중, X1은 I 또는 I의 보존적 치환이고, X2는 V 또는 V의 보존적 치환이며, X3은 Y 또는 Y의 보존적 치환이고, X4는 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 G 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 T 또는 임의의 다른 아미노산이고, X8은 G 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 45)을 포함하며;
    (e) LCDR2는 아미노산 서열 K-X1-S-N-R-X2-S(식 중, X1은 V 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 F 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 46)를 포함하고; 그리고
    (f) LCDR3은 아미노산 서열 X1-Q-X2-X3-X4-X5-P-Y-X6(식 중, X1은 F 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 G 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 S 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 H 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 V 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 T 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 47)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서,
    상기 항체 또는 항원-결합 부분은 CD47에 대한 결합에 대해서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분과 교차-경쟁하고; 그리고
    (a) 완전 생식세포계열 인간 프레임워크 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (b) 상기 LCDR1 내에 'NG' 탈아마이드화(deamidation) 부위를 포함하지 않고/않거나;
    (c) 상기 LCDR1 내에 'NT' 탈아마이드화 부위를 포함하지 않고/않거나;
    (d) HCDR1 및/또는 HCDR2 내에 높은 MHC 클래스 II 결합 친화도를 갖는 인간 생식세포계열 펩타이드 서열을 포함하고/하거나;
    (e) 상기 LCDR1 내에 인간 T 세포 에피토프 서열을 포함하지 않고/않거나;
    (f) VH 도메인의 상기 HCDR1 또는 상기 HCDR1/프레임워크 2 영역 내에 인간 T 세포 에피토프 서열을 포함하지 않는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간, 인간화된 또는 키메라인, 항체 또는 항원-결합 부분.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역, 상기 VL 영역 또는 상기 VH 영역과 상기 VL 영역 둘 다는 하나 이상의 인간 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역, 상기 VL 영역 또는 상기 VH 영역과 상기 VL 영역 둘 다는 CDR이 삽입된 인간 가변 영역 프레임워크 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열이 삽입된 IGHV5-51 또는 IGHV1-3 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  9. 제1항, 제3항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL 영역은 상기 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열이 삽입된 IGKV2-28 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 면역글로불린 불변 영역을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY인, 항체 또는 항원-결합 부분.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2인, 항체 또는 항원-결합 부분.
  13. 제10항에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 면역학적으로 불활성(immunologically inert)인, 항체 또는 항원-결합 부분.
  14. 제10항에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 불변 영역, 아미노산 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역, 야생형 인간 IgG1 불변 영역, 아미노산 치환 L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역 또는 야생형 인간 IgG2 불변 영역인, 항체 또는 항원-결합 부분.
  15. 제10항에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 어느 하나를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv, 단일 도메인 항체(dAb), 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 또는 비스-scFv인, 항원-결합 부분.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성인, 항체 또는 항원-결합 부분.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 사량체 항체, 4가 항체 또는 다중특이적 항체인, 항체 또는 항원-결합 부분.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 제1 항원 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이되, 상기 제1 항원은 CD47이고, 상기 제2 항원은 CD47이 아닌, 항체 또는 항원-결합 부분.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 (a) 인간 CD47 또는 (b) 인간 CD47 및 시노몰거스(cynomolgus) CD47에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 항원-결합 부분.
  21. 단일-쇄 Fv(single-chain Fv: scFv)로서,
    중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되,
    (a) HCDR1은 G-Y-T-F-T-X1-Y-X2-X3-X4(식 중, X1은 N 또는 N의 보존적 치환이고, X2는 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 M 또는 M의 보존적 치환이고, X4는 H 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 104)를 포함하고;
    (b) HCDR2는 M-G-X1-I-Y-P-G-X2-X3-X4-T-X5-Y-X6-X7-X8-F-Q-G(식 중, X1은 T 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 N 또는 N의 보존적 치환이며, X3은 D 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 D 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 S 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 Q 또는 임의의 다른 아미노산이고, X8은 K 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 105)를 포함하고;
    (c) HCDR3은 X1-G-X2-R-X3-X4-D-Y(식 중, X1은 G 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 Y 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 A 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 M 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 44)를 포함하고;
    (d) LCDR1은 R-S-S-Q-S-X1-X2-X3-S-X4-X5-X6-X7-Y-L-X8(식 중, X1은 I 또는 I의 보존적 치환이고, X2는 V 또는 V의 보존적 치환이며, X3은 Y 또는 Y의 보존적 치환이고, X4는 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 G 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 N 또는 임의의 다른 아미노산이며, X7은 T 또는 임의의 다른 아미노산이고, X8은 G 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 45)을 포함하며;
    (e) LCDR2는 K-X1-S-N-R-X2-S(식 중, X1은 V 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 F 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 46)를 포함하고; 그리고
    (f) LCDR3은 X1-Q-X2-X3-X4-X5-P-Y-X6(식 중, X1은 F 또는 임의의 다른 아미노산이고, X2는 G 또는 임의의 다른 아미노산이며, X3은 S 또는 임의의 다른 아미노산이고, X4는 H 또는 임의의 다른 아미노산이며, X5는 V 또는 임의의 다른 아미노산이고, X6은 T 또는 임의의 다른 아미노산임)(서열번호 47)을 포함하며,
    상기 VH 영역은 상기 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열이 삽입된 IGHV5-51 인간 생식세포계열 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하는, scFv.
  22. 제21항에 있어서,
    (a) 상기 VH 아미노산 서열은 GYSFTNYNIH(서열번호 57)의 HCDR1, MGTIYPGDSDTSYNPKFQG(서열번호 94)의 HCDR2 및 GGYRAEDY(서열번호 59)의 HCDR3을 포함하고; 그리고
    (b) 상기 VH 아미노산 서열은 RSSQSLLHSNGNTYLG(서열번호 51)의 LCDR1, KGSNRFS(서열번호 52)의 LCDR2 및 MQGSHVPYT(서열번호 97)의 LCDR3을 포함하는, scFv.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역 또는 면역글로불린 불변 영역의 일부를 더 포함하는, scFv.
  24. 제23항에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역은 서열번호 17 내지 23 중 어느 하나를 포함하는, scFv.
  25. 치료제에 연결된 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 scFv를 포함하는, 면역접합체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 치료제는 세포독소, 방사성동위원소, 화학치료제, 면역조절제, 혈관생성억제제(anti-angiogenic agent), 증식억제제(antiproliferative agent), 아포토시스촉진제(pro-apoptotic agent), 세포분열억제 효소(cytostatic enzyme), 세포용해 효소(cytolytic enzyme), 치료용 핵산, 혈관생성억제제, 증식억제제 또는 아포토시스촉진제인, 면역접합체.
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분, 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 scFv 또는 제25항 또는 제26항의 면역접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  28. 핵산 분자로서,
    제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 scFv의
    (a) 상기 VH 영역의 아미노산 서열;
    (b) 상기 VL 영역의 아미노산 서열; 또는
    (c) 상기 VH 영역의 아미노산 서열과 상기 VL 영역의 아미노산 서열 둘다
    를 암호화하는, 핵산 분자.
  29. 제28항의 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  30. 제28항의 핵산 분자 또는 제29항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  31. 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 생산 방법으로서,
    제29항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를, 핵산 분자가 발현되는 조건 하에서 배양함으로써 상기 항체 또는 항원-결합 부분을 생산하는 단계; 및
    상기 숙주 세포 또는 배양물로부터 상기 항체 또는 항원-결합 부분을 단리시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  32. 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분, 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 scFv, 제25항 또는 제26항의 면역접합체 또는 제27항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 대상체에서 암, 자가면역 질환, 염증 질환, 심혈관계 질환 또는 섬유성 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분, 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 scFv, 제25항 또는 제26항의 면역접합체 또는 제27항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 암은 위장관 간질성 암(Gastrointestinal Stromal cancer: GIST), 췌장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 결장직장암, 전립선암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계암, 말초신경계암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 충수암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종 또는 혈액조직암인, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 상기 염증 질환은 관절염, 천식, 다발성 경화증, 건선, 크론병(Crohn's disease), 염증성 장 질환, 루푸스, 그레이브스병(Grave's disease), 하시모토 갑상선염 또는 강직성 척추염인, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 심혈관계 질환은 관상동맥 심질환 또는 죽상경화증인, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 섬유성 질환은 심근경색, 협심증, 골관절염, 폐섬유증, 낭포성 섬유증, 기관지염 또는 천식인, 방법.
  38. 암, 자가면역 질환, 염증 질환, 심혈관계 질환 또는 섬유성 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분, 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 scFv, 제25항 또는 제26항의 면역접합체 또는 제27항의 약제학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 암은 위장관 간질성 암(GIST), 췌장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 결장직장암, 전립선암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계암, 말초신경계암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 충수암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종 또는 혈액조직암인, 항체 또는 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 약제학적 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 상기 염증 질환은 관절염, 천식, 다발성 경화증, 건선, 크론병, 염증성 장 질환, 루푸스, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염 또는 강직성 척추염인, 항체 또는 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 약제학적 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 상기 심혈관계 질환은 관상동맥 심질환 또는 죽상경화증인, 항체 또는 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 약제학적 조성물.
  42. 제38항에 있어서, 상기 섬유성 질환은 심근경색, 협심증, 골관절염, 폐섬유증, 낭포성 섬유증, 기관지염 또는 천식인, 항체 또는 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 약제학적 조성물.
  43. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 부분, 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 scFv, 제25항 또는 제26항의 면역접합체 또는 제27항의 약제학적 조성물.
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