JP2003516934A - ヒト骨髄前駆細胞阻害性因子−１（ｍｐｉｆ−１）を用いる、細胞、組織および器官の損傷を処置または予防する方法 - Google Patents

ヒト骨髄前駆細胞阻害性因子−１（ｍｐｉｆ−１）を用いる、細胞、組織および器官の損傷を処置または予防する方法

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JP2003516934A JP2001529738A JP2001529738A JP2003516934A JP 2003516934 A JP2003516934 A JP 2003516934A JP 2001529738 A JP2001529738 A JP 2001529738A JP 2001529738 A JP2001529738 A JP 2001529738A JP 2003516934 A JP2003516934 A JP 2003516934A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト骨髄前駆細胞阻害性因子−１（ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ−１）（ＭＰＩＦ−１）ポリペプチド（以前には、ＭＩＰ−３およびケモカインβ８（ＣＫβ８またはｃｋｂ−８）と呼ばれていた）をコードする単離された核酸分子、ならびにＭＰＩＦ−１ポリペプチド自体を用いる、治療用組成物を開示しており、そしてその方法を開示している。また、本明細書には、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞および組換え方法も同様に記載している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、ヒト骨髄前駆細胞阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）ポリぺプチド（以
前は、ＭＩＰ−３およびケモカインβ８（ＣＫβ８またはｃｋｂ−８）と呼ばれ
た）、ならびにＭＰＩＦ−１をコードする単離されたポリヌクレオチドを使用す
る新規な方法に関する。ＭＰＩＦ−１を産生するためのベクター、宿主細胞、お
よび組換え法も提供される。
【０００２】 （関連技術） ケモカイン（インタークリン（ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅ）サイトカインとも呼ば
れる）は、構造的および機能的に関連するサイトカインのサブファミリーである
。これらの分子は、サイズが８〜１４ｋｄである。一般に、ケモカインは、アミ
ノ酸レベルで２０％〜７５％の相同性を示し、そして２つのジスルフィド結合を
形成する４つの保存されたシステイン残基によって特徴づけられる。第一の２つ
のシステイン残基の配置に基づいて、ケモカインは、２つのサブファミリー（α
およびβ）に分類されている。αサブファミリーにおいて、最初の２つのシステ
インは、１つのアミノ酸によって分離され、従って「Ｃ−Ｘ−Ｃ」サブファミリ
ーといわれる。βサブファミリーにおいて、２つのシステインは、隣接する位置
にあり、そしてそれゆえ−Ｃ−Ｃ−サブファミリーといわれる。これまでのとこ
ろ、このファミリーの少なくとも８つの異なるメンバーは、ヒトにおいて同定さ
れている。
【０００３】 インタークリンサイトカインは、広範な種々の機能を示す。証明的特徴は、異
なる細胞型（単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および線維芽細胞を含む）
の走化性移動を誘発するその能力である。多くのケモカインは、炎症誘発性活性
を有し、そして炎症性反応の間の多数の段階に関与する。これらの活性には、ヒ
スタミン放出、リソソーム酵素およびロイコトリエン放出の刺激、標的免疫細胞
の内皮細胞への接着の増大、補体タンパク質の結合の増大、顆粒球接着分子およ
び補体レセプターの誘導された発現、ならびに呼吸バーストが含まれる。それら
の炎症への関与に加えて、特定のケモカインが他の活性を示すことが示されてい
る。例えば、マクロファージ炎症性タンパク質Ｉ（ＭＩＰ−１）は、造血幹細胞
増殖を抑制し得、血小板因子−４（ＰＦ−４）は、内皮細胞増殖、ケラチノサイ
トのインターロイキン−８（ＩＬ−８）によって促進される増殖の強力なインヒ
ビターであり、そしてＧＲＯは、黒色腫細胞の自己分泌増殖因子である。
【０００４】 多様な生物学的活性を考慮して、ケモカインが多くの生理学的状態および疾患
状態（リンパ球輸送、創傷治癒、造血調節、ならびにアレルギー、喘息、および
関節炎のような免疫学的疾患を含む）に関係していることは驚くことではない。
造血系統調節因子の一例は、ＭＩＰ−１である。ＭＩＰ−１は、元々、マクロフ
ァージから産生されるエンドトキシン誘導炎症誘発性サイトカインとして同定さ
れた。引き続く研究は、ＭＩＰ−１が２つの異なるが、関連するタンパク質ＭＩ
Ｐ−１αおよびＭＩＰ−１βから構成されることを示した。ＭＩＰ−１αおよび
ＭＩＰ−１βの両方が、マクロファージ、単球、およびＴリンパ球の化学誘引物
質である。興味深いことに、多分化能幹細胞インヒビター（ＳＣＩ）の生化学的
精製および引き続く配列分析により、ＳＣＩがＭＩＰ−１βと同一であることが
明らかになった。さらに、ＭＩＰ−１βは、造血幹細胞増殖を抑制するＭＩＰ−
１αの能力を相殺し得ることが示されている。この知見は、ＭＩＰ−１の一次的
な生理学的役割が、骨髄における造血を調節することであり、そして提案された
炎症性機能が二次的なものであるという仮説を導く。ＭＩＰ−１αの幹細胞イン
ヒビターとしての作用の態様は、細胞サイクルをＧ2Ｓ静止期でブロックするそ
の能力に関連する。さらに、ＭＩＰ−１αの阻害効果は、未成熟の前駆細胞に限
定されるようであり、そして実際に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（
ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で、後期前駆細胞に対して刺激性である。
【０００５】 マウスＭＩＰ−１は、リポポリサッカライド刺激ＲＡＷ ２６４．７（マウス
マクロファージ腫瘍細胞株）由来の主要な分泌タンパク質である。これは、精製
されており、そして２つの関連するタンパク質ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β
からなることが見出されている。
【０００６】 いくつかのグループが、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのヒトホモログであ
るようであるものをクローニングしている。全ての場合において、ｃＤＮＡは、
活性化されたＴ細胞ＲＮＡに対して調製されたライブラリーから単離された。
【０００７】 ＭＩＰ−１タンパク質は、初期の創傷炎症細胞において検出され得、そして創
傷線維芽細胞からＩＬ−１およびＩＬ−６の産生を誘導することが示されている
。さらに、精製された天然のＭＩＰ−１（ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１α、およびＭ
ＩＰ−１βポリぺプチドを含む）は、マウスの足蹠に皮下に、またはウサギの脳
脊髄液に大槽内にのいずれかで注入された場合に、急性の炎症を引き起こす（Ｗ
ｏｌｐｅおよびＣｅｒａｍｉ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ３：２５６５−７３ （１
９８９））。ＭＩＰ−１のこれらの炎症誘発性特性（これらは、直接または間接
であり得る）に加えて、ＭＩＰ−１は、滅菌創傷チャンバーを使用した実験マウ
スモデルにおける創傷治癒の初期の炎症段階の間に回収されている（Ｆａｈｅｙ
ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ２：９２ （１９９０））。例えば、Ｃｈｉｒｏｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって出願されたＰＣＴ出願Ｕ．Ｓ．９２／０５１９
８は、酵母において哺乳動物マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）を産生
するテンプレートとして活性であるＤＮＡ分子を開示する。
【０００８】 マウスＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βは、異なるが、密接に関連するサイト
カインである。２つのタンパク質の部分精製された混合物は、好中球機能に影響
を及ぼし、そして局所的な炎症および発熱を引き起こす。ＭＩＰ−１αは、酵母
細胞において発現され、そして均質にまで精製されている。構造分析により、Ｍ
ＩＰ−１αが、血小板因子４（ＰＦ−４）およびインターロイキン８（ＩＬ−８
）（これらに対し、限定された配列相同性を有する）に非常に類似する二次およ
び三次構造を有することが確認された。ＭＩＰ−１αは、インビボで活性であり
、マウス幹細胞を、トリチウム化チミジンによる引き続くインビトロ殺傷から保
護することが実証されている。ＭＩＰ−１αはまた、顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子に応答して、より拘束された前駆顆粒球マクロファージコロニー形
成細胞の増殖を増強することが示された（Ｃｌｅｍｅｎｓ， Ｊ．Ｍ．ら、Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅ ４：７６−８２ （１９９２））。
【０００９】 本発明のポリぺプチド、ＭＰＩＦ−１（時折、ＭＩＰ−３およびＣｋβ−８と
も呼ばれる）は、アミノ酸配列相同性に基づいて、βケモカインファミリーの新
たなメンバーである。
【００１０】 （発明の要旨） 本発明の１つの局面に従って、全長または成熟ＭＰＩＦ−１ポリぺプチド、お
よび生物学的に活性な、診断的または治療的に有用なフラグメント、アナログ、
およびそれらの誘導体を使用する、細胞、組織および器官に対する損傷を予防ま
たは処置する新規方法が、提供される。
【００１１】 別の局面において、本発明は、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドをコードする単離さ
れたポリヌクレオチドを使用する処置または予防の方法を提供する。本発明のＭ
ＰＩＦ−１は、好ましくは、動物起源であり、そしてより好ましくはヒト起源で
ある。
【００１２】 本発明はまた、ＭＰＩＦ−１ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ）およびこのようなポリぺプチドをコードする単離された核酸
分子（ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む）、ならびに生物学的
に活性で、そして診断的にまたは治療的に有用なフラグメント、アナログ、およ
びその誘導体を提供する。
【００１３】 ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド。本発明はまた、図１に示されるアミノ酸配列
（配列番号２）または細菌宿主中でＡＴＣＣ受託番号７５６７６として１９９４
年２月９日に寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を
有するＭＰＩＦ−１ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を提供する。寄託されたＭＰＩＦ−１クローンを配列決定することに
よって決定されたヌクレオチド配列（図１に示される（配列番号１））は、１２
０アミノ酸残基のポリぺプチドをコードするオープンリーディングフレームおよ
び約２１アミノ酸残基のリーダー配列を含み、そして成熟タンパク質の推定分子
量は、非グリコシル化形態において１１ｋＤａ、そしてグリコシル化形態におい
て約１１〜１４ｋＤａ（グリコシル化の程度に依存する）である。成熟ＭＰＩＦ
−１タンパク質のアミノ酸配列を、図１に示す（配列番号２）。
【００１４】 従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：（１）（
ａ）図１の全アミノ酸配列（配列番号２）を有するＭＰＩＦ−１ポリぺプチドを
コードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１の全アミノ酸配列（配列番号２）（し
かし、Ｎ末端メチオニン残基を除く）を有するＭＰＩＦ−１ポリぺプチドをコー
ドするヌクレオチド配列；（ｃ）図１（配列番号２）の２２〜１２０位のアミノ
酸配列を有する成熟ＭＰＩＦ−１ポリぺプチドをコードするヌクレオチド配列；
（１）（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号７５６７６に含まれるｃＤＮＡクローンによって
コードされる全アミノ酸配列を有するＭＰＩＦ−１ポリぺプチドをコードするヌ
クレオチド配列；（１）（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号７５６７６に含まれるｃＤＮＡ
クローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＭＰＩＦ−１ポリぺプ
チドをコードするヌクレオチド配列；および上記（１）（ｆ）（１）−（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに
相補的なヌクレオチド配列。
【００１５】 ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド改変体。本発明はさらに、図１（配列番号２）
の推定アミノ酸配列を有するポリぺプチドの、または寄託されたクローンのｃＤ
ＮＡによってコードされるポリぺプチドのフラグメント、アナログ、および誘導
体をコードする、本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌ
クレオチドの改変体は、ポリぺプチドの天然に存在する対立遺伝子改変体か、ま
たはポリぺプチドの天然に存在しない改変体であり得る。
【００１６】 相同なＭＰＩＦ−１ポリぺプチド。本発明のさらなる実施態様には、上記の（
ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のヌクレオチド配列のいず
れかに少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下で、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）ま
たは（ｆ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単
離された核酸分子が含まれる。ハイブリダイズするこれらのポリヌクレオチドは
、Ａ残基のみ、またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチドには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイ
ズしない。
【００１７】 核酸プローブ。本発明のなお別の局面に従って、ＭＰＩＦ−１核酸配列に特異
的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子を含むか、あるいはこれらの核
酸分子からなる、核酸プローブもまた提供される。
【００１８】 組換えベクター、宿主細胞および発現。本発明はまた、本発明の単離された核
酸分子を含む組換えベクター、および組換えベクターを有する宿主細胞、ならび
にこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術による
ＭＰＩＦ−１ポリぺプチドまたはペプチドの産生のためにこれらを使用する方法
に関する。
【００１９】 ＭＰＩＦ−１ポリぺプチド。本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ
酸配列を有する単離されたＭＰＩＦ−１ポリぺプチドをさらに提供する：（Ｉ）
（ａ）図１（配列番号２）に示されるリーダー配列を含む全１２０アミノ酸配列
を有するＭＰＩＦ−１ポリぺプチドのアミノ酸配列；（ｂ）図１（配列番号２）
に示されるリーダー配列を含む全１２０アミノ酸配列（しかし、Ｎ末端メチオニ
ン残基を除く）を有するＭＰＩＦ−１ポリぺプチドのアミノ酸配列；（ｃ）図１
（配列番号２）の２２〜１２０位のアミノ酸配列を有する成熟ＭＰＩＦ−１ポリ
ぺプチド（リーダーを含まない）のアミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号７５
６７６に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる全アミノ酸配列（リー
ダーを含む）を有するＭＰＩＦ−１ポリぺプチドのアミノ酸配列；および（ｅ）
ＡＴＣＣ受託番号７５６７６に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる
アミノ酸配列を有する成熟ＭＰＩＦ−１ポリぺプチドのアミノ酸配列。
【００２０】 相同なＭＰＩＦ−１ポリぺプチド。本発明のポリぺプチドはまた、上記の（ａ
）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に記載の少なくとも９５％の同一性を
有するアミノ酸配列を有する相同なポリぺプチド、ならびに上記の配列に少なく
とも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一なアミノ酸配列を有
するポリぺプチドを含む。
【００２１】 ＭＰＩＦ−１エピトープ保有ポリぺプチドおよびコードするポリヌクレオチド
。本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（
ｄ）または（ｅ）に記載のＭＰＩＦ−１ポリぺプチドのエピトープ保有部分のア
ミノ酸配列を有するペプチドまたはポリぺプチドに関する。本発明のＭＰＩＦ−
１ポリぺプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポ
リぺプチドは、少なくとも６または７、好ましくは少なくとも９、およびより好
ましくは少なくとも約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸を有するこのようなポリぺ
プチドの部分を含むが、上記の本発明のポリぺプチドの全アミノ酸配列をまでお
よびそれを含むエピトープ保有ポリぺプチドは、本発明に包含される。
【００２２】 本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）
または（ｅ）のアミノ酸配列をコードするＭＰＩＦ−１ポリぺプチドのエピトー
プ保有部分のアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのポ
リヌクレオチドからなる、単離された核酸分子に関する。
【００２３】 ＭＰＩＦ−１抗体。本発明のなおさらなる局面に従って、このようなポリぺプ
チドに対する抗体が提供される。別の実施態様において、本発明は、上記の（ａ
）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）のアミノ酸配列を有するＭＰＩＦ−
１ポリぺプチド特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００２４】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を有するＭＰＩＦ−１
ポリぺプチド特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。このよう
な抗体は、以下に記載されるように診断的または治療的に有用である。
【００２５】 ＭＰＩＦ−１アンタゴニストおよび方法。本発明のなお別の局面に従って、こ
のようなポリぺプチドのアンタゴニストまたはインヒビターが提供される。これ
らは、例えば、動脈硬化症、自己免疫疾患、ならびに慢性炎症性および感性性疾
患、ヒスタミン媒介性アレルギー性反応、過好酸性症候群、ケイ肺炎、肉芽種性
疾患、肺の炎症性疾患、ＩＬ−１およびＴＮＦの阻害、再生不良性貧血、ならび
に脊髄形成異常症候群の処置におけるこのようなポリぺプチドの作用を阻害する
ために使用され得る。あるいは、このようなポリぺプチドは、ＩＬ−１およびＴ
ＮＦ−αの産生を阻害して、再生不良性貧血、脊髄形成異常症候群、喘息、およ
び関節炎を処置するために使用され得る。
【００２６】 診断アッセイ。本発明のなお別の局面において、ポリぺプチドの過少発現およ
び過剰発現に関連する疾患を検出するため、およびこのようなポリぺプチドをコ
ードする核酸配列における変異を検出するための診断アッセイが提供される。
【００２７】 本発明のなお別の局面に従って、このようなポリぺプチド、またはこのような
ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡの合成、お
よびＤＮＡベクターの製造に関するインビトロの目的で研究試薬として利用する
ためのプロセスが、ヒト疾患の処置のための治療薬および診断を開発する目的で
提供される。
【００２８】 本発明はまた、ＭＰＩＦ−１ポリぺプチドによって誘導される細胞性応答を増
幅または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング法であって、ＭＰＩ
Ｆ−１ポリぺプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞応答を
アッセイする工程、および細胞応答を標準的な細胞応答と比較する工程を包含す
る方法を提供する。ここで、標準は候補化合物の非存在下で接触がなされた場合
にアッセイされる；これにより、標準に対して増大した細胞応答が、その化合物
がアゴニストであること、そして標準に対して減少した細胞応答が、その化合物
がアンタゴニストであることを示す。
【００２９】 多くの疾患について、有意に高いかまたは低いレベルのＭＰＩＦ−１遺伝子発
現が、このような障害を有する個体から採取した特定の組織または体液（例えば
、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において、「標準」ＭＰＩＦ−１遺伝子
発現レベル（すなわち、障害を有さない個体からの組織または体液におけるＭＰ
ＩＦ−１発現レベル）に比較して、検出されると考えられる。従って、本発明は
、以下の工程を包含する疾患の診断の間に有用な診断方法を提供する：（ａ）個
体の細胞または体液中でのＭＰＩＦ−１遺伝子発現レベルをアッセイする工程；
（ｂ）ＭＰＩＦ−１遺伝子発現レベルを、標準のＭＰＩＦ−１遺伝子発現レベル
と比較し、それにより、標準の発現レベルに比較したアッセイされたＭＰＩＦ−
１遺伝子発現レベルの増大または減少が疾患の指標である、工程。このような障
害には、白血病、慢性炎症、自己免疫疾患、固形腫瘍が含まれる。
【００３０】 薬学的組成物。本発明はまた、別の局面において、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオ
チド、プローブ、ベクター、宿主細胞、ポリぺプチド、フラグメント、改変体、
誘導体、エピトープ保有部分、抗体、アンタゴニストまたはアゴニストのうちの
少なくとも１つを含む薬学的組成物を提供する。
【００３１】 治療方法。本発明のなおさらなる局面に従って、治療目的のために（例えば、
化学療法の間に化学治療剤から骨髄幹細胞を保護するため、白血病細胞を除去す
るため、免疫応答を刺激するため、造血およびリンパ球輸送を調節するため、乾
癬、固形腫瘍の処置、耐性および急性および慢性の感染に対する宿主防御を増強
するため、ならびに創傷治癒を刺激するために）このようなポリぺプチドまたは
このようなポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロー
ブが提供される。
【００３２】 本発明のさらなる局面は、体内における増大したレベルのＭＰＩＦ−１活性を
必要とする個体を処置するための方法であって、このような個体に治療有効量の
本発明の単離されたＭＰＩＦ−１ポリぺプチド、またはそのアゴニストをそれぞ
れ含む組成物を投与する工程を包含する、方法に関する。
【００３３】 本発明のなおさらなる局面は、体内のＭＰＩＦ−１活性のレベルの減少を必要
とする個体を処置するための方法に関する。この方法は、このような個体に、治
療有効量のＭＰＩＦ−１アンタゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する
。 本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明らか
である。
【００３４】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明は、ヒト骨髄前駆体阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）ポリペプチド（以前
にＭＩＰ−３およびケモカインβ８（ＣＫβ８またはｃｋｂ−８）と称した）よ
うな、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子、またはポリ
ペプチド自身を利用する、診断的または治療的組成物および方法を提供し、そし
てこれらを産生するためのベクター、宿主、および組換えもしくは合成方法を提
供する。
【００３５】 （ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド） 本発明の局面に従って、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する全長
または成熟ＭＰＩＦ−１ポリペプチドならびに１９９４年２月９日にＡＴＣＣ寄
託第７５６７６号として寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟
ＭＰＩＦ−１ポリペプチドをコードする単離された核酸配列（ポリヌクレオチド
）が提供される。アメリカンタイプカルチャーコレクションの住所は、Ｐａｔｅ
ｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅ
ｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９である
。寄託クローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ）に含まれる。
【００３６】 本明細書中において言及される寄託（単数または複数）は、特許手順の目的の
ための微生物の寄託の国際認定に関するブタベスト条約の条件下に維持される。
これらの寄託は、当業者に対して単に簡便になるように提供され、そして寄託が
３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１２下で必要とされることを承認するものではない。
寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによってコ
ードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中において参考として援用
され、そして本明細書中の配列の説明との任意のコンフリクトの事象において制
限する。ライセンスが、寄託された物質を作製、使用、または販売するために必
要とされ得、そしてそのようなライセンスは本明細書によって容認されない。
【００３７】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、サイトカインまたは
ケモカインファミリー内に存在する炎症後スーパージーン「インタークライン」
に構造的に関連する。ＭＰＩＦ−１は、ＭＩＰ−１ホモログであり、そしてＭＩ
Ｐ−１βに対してよりもＭＩＰ−１αに対してより相同である。ＭＩＰＦ−１を
コードするポリヌクレオチドは、大動脈内皮ｃＤＮＡライブラリーに由来し、そ
して１２０アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレ
ームを含み、それは多くのケモカインに対して顕著な相同性を示す。最大の適合
は、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質１αに対してであり、３６％同一性お
よび６６％類似性を示す（図２）。
【００３８】 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡ（このＤＮＡは、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む）の形態であり得る。ＤＮＡは
二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コー
ド（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は
、図１または２０Ａに示すコード配列（それぞれ、配列番号１または６）または
寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が
、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１または２０Ａ（配列番号１ま
たは６）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする
異なるコード配列であり得る。
【００３９】 図１の成熟ポリペプチド（配列番号２）または寄託したｃＤＮＡによりコード
される成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：
成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、ならびに
リーダーまたは分泌配列、もしくはプロタンパク質配列のような付加的コード配
列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じて付加的コード配列）お
よび非コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列
の５’および／または３’非コード配列）。
【００４０】 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的コード配列、およ
び／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００４１】 本発明はまた、配列番号１または６に開示されるポリヌクレオチド配列、その
相補鎖および／または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列の改変体に関
する。
【００４２】 「改変体」とは、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なる
が、その必須の特性は保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
一般に、改変体は、全体で非常に類似し、そして多くの領域においては、このＭ
ＰＩＦ−１ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【００４３】 他に示されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ３７３など）を用いて決
定され、そして本明細書中において決定されるＤＮＡ分子によってコードされる
ポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定したＤＮＡ配列の翻
訳によって予測された。従って、この自動化アプローチによって決定される任意
のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中において決定
された任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤差を含み得る。自動化によって決
定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド
配列に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも
約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、他のアプローチ
（当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む）によってより正確に
決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較して、決
定されたヌクレオチド配列中の単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻
訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配
列によってコードされる予測されるアミノ酸配列は、配列決定されたＤＮＡ分子
によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり、そのような挿入ま
たは欠失の点で始まる。
【００４４】 他に示されない限り、本明細書中に示される各「ヌクレオチド配列」は、デオ
キシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと省略される）の配列として示さ
れる。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によっ
て、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの
配列、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては、リボヌクレオチド
（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）の対応する配列が意図され、ここで、特定されたデオ
キシリボヌクレオチド配列中の各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、
リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）によって置換される。例えば、デオキシリボヌ
クレオチドの略語を用いて示されるように、配列番号１または６の配列を有する
ＲＮＡ分子との言及は、配列番号１または６の各デオキシリボヌクレオチドＡ、
Ｇ、またはＣが、対応するリボヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣによって置換され
、そして各デオキシリボヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵによって置換され
た配列を有するＲＮＡ分子を示すことが意図される。
【００４５】 本明細書中に提供される情報を用いて、図１のヌクレオチド配列などの、ＭＰ
ＩＦ−１ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニング
およびスクリーニング手順（開始物質としてｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクロー
ニングするための手順など）を用いて得られ得る。
【００４６】 本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチ
ドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に
存在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体で
あり得る。
【００４７】 本発明はまた、図１（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド、また
は寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含
する。この変異体は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたクロ
ーンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体または
アナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変
異体および付加または挿入変異体を含む。
【００４８】 本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号２）に
示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在する対立遺
伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子
変異体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌク
レオチド配列の代わりの形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を
実質的に変化させない。
【００４９】 本発明はまた、ポリヌクレオチドを含み、ここで、成熟ポリペプチドについて
のコード配列は、同一のリーディングフレームにおいて、宿主細胞由来のポリペ
プチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に
融合され得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、
そして宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有し、ポリペプチドの成熟形
態を形成し得る。これらのポリヌクレオチドはまた、付加的Ｎ末端アミノ酸残基
を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有す
る成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そしてタンパク質の不活性な形態
である。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。
【００５０】 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、あるいはプ
ロ配列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両
方を有するタンパク質をコードし得る。
【００５１】 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列
は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供
する、ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。
あるいは、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）
が使用される場合は、血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフ
ルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Ｗｉｌｓｏｎ
，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７（１９８４））。
【００５２】 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関するＤＮＡのセグメン
トを意味し；それは、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）、
ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間に介在性配列（イントロン）を
含む。
【００５３】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（ｍＲＮＡなど）、また
はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるまたは
合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または
一本鎖であり得る。一般鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としてもまた公知の
コード鎖であり得るか、またはそれはアンチセンス鎖としてもまた言及される非
コード鎖であり得る。
【００５４】 用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合
は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動
物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離
されていないが、天然の系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離
されている同一のポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは、単離さ
れている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、そして／
またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であ
り得、そしてそのようなベクターもしくは組成物が、その天然の環境の一部では
ないように、なお単離され得る。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子
のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離された核酸
分子は、さらに合成的に生成されたような分子を含む。しかし、ライブラリー（
例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであり、
そしてこのライブラリーの他のクローンから単離されていない（例えば、クロー
ンおよびライブラリーの他のメンバーを含む均質な溶液の形態で）クローンに含
まれるまたは染色体調製物（例えば、染色体スプレッド）上に含まれる核酸、あ
るいはゲノムＤＮＡの調製物（例えば、１つ以上の制限酵素でインタクトな、剪
断された、および／または切断された）中の他の核酸から単離されていない調製
物に存在する核酸は、本発明の目的のためには、「単離され」ていない。
【００５５】 本発明の単離した核酸分子は、ＭＰＩＦ−１ ｃＤＮＡについてのオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むか、あるいはそれからなるＤＮＡ分子；成
熟Ｍ−ＣＩＦタンパク質、成熟ＭＰＩＦ−１タンパク質についてのコード配列を
含むか、あるいはそれからなるＤＮＡ分子；および上記の配列とは実質的に異な
るが、遺伝子コードの縮重に起因してなおＭＰＩＦ−１ポリペプチドをコードす
る配列を含むＤＮＡ分子を含む。当然のことながら、遺伝子コードは、当該分野
において周知である。従って、上記の縮重した変異体を生成することは、当業者
にとって日常的である。
【００５６】 本発明はさらに、配列間に少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細
書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に
、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる場合、用語「スト
リンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも９５
％、そして好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じるこ
とを意味する。好ましい実施形態において、本明細書中上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）のｃＤＮＡ、も
しくは寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ
生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００５７】 あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズ
する少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましくは少なくと
も５０塩基を有し得、そして本発明のポリヌクレオチドは、それに対して上記の
ように同一性を有し、そして本明細書中上記のようにポリペプチドに対して同一
性を有し、そして活性を保持してもしなくてもよい。例えば、そのようなポリヌ
クレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドについてのプローブとして（例え
ば、ポリヌクレオチドの回収のため、または診断用プローブとして、またはＰＣ
Ｒプライマーとして）使用され得る。
【００５８】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で上記の本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズす
るポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれからなる単離された核酸分子を提供
する（例えば、ＡＴＣＣ受託番号７５６７６（ＭＰＩＦ−１）に含まれるｃＤＮ
Ａクローン）。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０
％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナ
トリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液
、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡから
なる溶液中で４２℃にて一晩インキュベーションし、続いて約６５℃において０
．１×ＳＳＣでそのフィルターを洗浄することが意図される。
【００５９】 ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参
照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ま
しくは少なくとも約２０ｎｔ、なおさらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そ
してさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオ
チド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。意図されるものはまた、
参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好
ましくは少なくとも約２０ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２５ｎｔ、
なおさらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３
０〜７０（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、および
／または７０（当然ながら、本明細書中に列挙されるものに加えてフラグメント
長もまた有用である））ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチドである。こ
れらは、上で、そしてより詳細には以下で考察されるような診断用プローブおよ
びプライマーとして有用である。
【００６０】 当然のことながら、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡクロ
ーン）のより大きな部分（例えば、５０〜７５０ｎｔ長部分）、または参照ポリ
ヌクレオチドの全長にさえハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、本発明
によるプローブとして有用であり、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ま
たは配列番号１もしくは６（ＭＰＩＦ−１）に示されるようなヌクレオチド配列
のすべてではないにしろほとんどに対応するポリヌクレオチドも同様である。例
えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部とは、参照ポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列由来の２０以上の連続したヌクレオチドが意図され
る。示されるように、そのような部分は、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション
技術によるプローブとして、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的
配列の増幅のためのプライマーとしてのいずれかで診断的に有用である（例えば
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（
１９８９）に記載される、その全体の開示は、本明細書により本明細書中におい
て参考として援用される）。
【００６１】 ＭＰＩＦ−１ ｃＤＮＡクローンは寄託され、そして決定されたヌクレオチド
配列が提供されているため、ＭＰＩＦ−１ ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドを生成することは、当業者にとって日常的である。例え
ば、ＭＰＩＦ−１ ｃＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断または超音
波処理による剪断は、ＭＰＩＦ−１ ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズする
ポリヌクレオチドである種々のサイズのＤＮＡ部分を生成するために容易に使用
され得る。
【００６２】 あるいは、本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、公知の技術に従
って合成的に生成され得る。当然のことながら、ポリＡ配列（ｃＤＮＡの３’末
端ポリ（Ａ）トラクトなど）にのみ、またはＴ（またはＵ）残基の相補的な伸長
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイ
ズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、そ
のようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）伸長を含む任意の核酸分子またはその
相補体（例えば、実際に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズする
からである。
【００６３】 示されるように、ＭＰＩＦ−１ ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子
は、以下を含むが、これらに限定されない：それ自体によって成熟ポリペプチド
のアミノ酸配列をコードする核酸分子；成熟ポリペプチドについてのコード配列
およびさらなる配列（リーダーをコードする配列など）または分泌配列（プレタ
ンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列など）；
成熟ポリペプチドのコード配列（先述のさらなるコード配列を有するまたは有さ
ない）であり、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングおよびポリ
アデニル化シグナル（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を含む
）において役割を担う転写非翻訳配列のようなイントロン、および非コード５’
および３’配列を含むが、これらに限定されない、さらなる非コード配列を共に
有するコード配列；さらなるアミノ酸（例えば、さらなる機能性を提供するアミ
ノ酸）をコードするさらなるコード配列。従って、ポリペプチドをコードする配
列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドを
コードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態
において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例
えば、ｐＱＥベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）において提供されるタグ
）であり、その多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ８２１−８２４ （１９８
９）において記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便
な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由
来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、これはＷｉ
ｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７： ７６７ （１９８４）によって記載されている
。以下に議論されるように、他のこのような融合タンパク質は、ＭＰＩＦ−１ポ
リペプチド、またはＮ末端もしくはＣ末端でＦｃに融合されるフラグメントを含
む。
【００６４】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の変異体に関し、これは、ＭＰＩＦ−１
ポリペプチドの一部、アナログ、または誘導体をコードする。変異体は、天然の
対立遺伝子変異のように天然に存在し得る。「対立遺伝子変異」によって、生物
の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換形態の１つが意図
される。Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｌｅｗｉｎ， Ｂ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）。天然に存在しない
変異体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００６５】 そのような変異体は、ヌクレオチド置換、欠失、または付加によって生成され
るものを含む。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る
。変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方において変換され得る
。コード領域における変換は、保存性もしくは非保存性のアミノ酸置換、欠失、
または付加を生じ得る。これらのうちで特に好ましいものは、サイレントな置換
、付加、および欠失であり、それらは、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドまたはその一
部の特性および活性を変化しない。また、この点において特に好ましいものは、
保存性置換である。最も高度に好ましいものは、本明細書中に記載のような、成
熟タンパク質をコードする核酸分子、または寄託されたｃＤＮＡクローンによっ
てコードされる成熟アミノ酸配列である。
【００６６】 （ＭＰＩＦ−１相同ポリヌクレオチド） 本発明はさらに、配列番号２のポリペプチドならびにそのフラグメント（この
フラグメントは、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチ
ドに少なくとも３０塩基、そして好ましくは少なくとも５０塩基を有する）をコ
ードするポリヌクレオチドに少なくとも９５％同一性を有するポリヌクレオチド
に関する。
【００６７】 本発明のさらなる実施形態は、以下に少なくとも８０％、８５％、９０％、９
２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれからなる単離された核酸分子を
含む：（ａ）予想されるリーダー配列を含む、配列番号２のアミノ酸配列を有す
るＭＰＩＦ−１ポリペプチドまたはフラグメントをコードするヌクレオチド配列
；（ｂ）予想されるリーダー配列を含むが、Ｎ末端メチオニン残基を含まない、
配列番号２のアミノ酸配列を有するＭＰＩＦ−１ポリペプチドまたはフラグメン
トをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）成熟ＭＰＩＦ−１ポリペプチド（リー
ダーを除いた全長ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）寄託さ
れたｃＤＮＡクローンによってコードされるリーダーを含む完全なアミノ酸配列
を有する全長ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）寄託されたｃ
ＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、
もしくは（ｅ）中の任意のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列。
【００６８】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも例
えば９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポ
リヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１
００ヌクレオチド当たり５までの点変異を含み得ることを除き、ポリヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列が参照配列に同一であることが意図される。換言すれば、
参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチドを得るために、参照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失され、
別のヌクレオチドと置換され得るか、または参照配列中の全ヌクレオチドの５％
までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。これらの参照配列の変異
は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置、またはこれらの末端位
置間のいずれかの場所に生じ得、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、または
参照配列内の１つ以上の連続した群のいずれかに分散して生じる。
【００６９】 実際の問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１に示されるヌクレ
オチド配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に、少なく
とも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、もし
くは９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｈａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ
８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７
５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）の
ような公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的に決定され得る。Ｂｅｓｔ
ｆｉｔは、２つの配列間の相同性の最も良いセグメントを見出すためのＳｍｉｔ
ｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａ
ｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２： ４８２−４８９ （１９８１）の局所的相同性アル
ゴリズムを使用する。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用
いて、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に９５％同一であるか否かを
決定する場合、当然のことながら、同一性％が参照ヌクレオチド配列の全長にわ
たって計算され、そして参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性で
のギャップが許容されるようにパラメータを設定する。
【００７０】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象
配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列とも呼ばれる）を決
定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ． Ｂｉｏ
ｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤ
Ｂコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い
合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、Ｕ
からＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、
同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ
配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒ
ｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ
Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐ
ｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏ
ｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方
）である。
【００７１】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’の短縮を考慮しないからである。５’末端または３’末端で短
縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは
、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５
’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正され
る。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果に
よって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて上
記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引か
れ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、
本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるよう
に、問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’の塩基の
外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で計算され
る。
【００７２】 例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失が、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’の末端の塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、対象配列の５’または
３’に問い合わせと一致／整列しない塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって計算される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００７３】 好ましくは、上記のプログラムが、使用され、本発明のポリヌクレオチド（参
照配列）および第２の配列を整列し、そして手動で計算される。同一性パーセン
トは、２つの配列間で同一な個々のヌクレオチドの数を参考配列におけるヌクレ
オチド残基の総数で割り、１００％を掛ける。例えば、第２の配列に対する配列
番号１の１〜３６０ヌクレオチドの同一パーセントを決定するために、ヌクレオ
チドミスマッチの数（すなわち、点変異：挿入、欠失および置換）が計数され、
そして３６０（参考配列におけるヌクレオチドの数）から差し引かれて、同一性
ヌクレオチドの数を得る。生じた数は、３６０で割られ、次いで１００％で掛け
られる。ミスマッチ（すなわち、点変異：個々のヌクレオチドの挿入、欠失およ
び置換）が配列番号１の１〜５、１８、２０１〜２１０、３００、３０２、３１
８〜３２８、３３０、３３６、３４１および３４９〜３５２位にある場合、同一
性パーセントは、９０％である（５＋１＋１０＋１＋１＋１１＋１＋１＋１＋３
＝３６ ３６０−３６＝３２４ ３２４／３６０＝０．９ ０．９×１００＝９
０％）。ポリペプチドの同一性パーセントは、類似の様式で計算される。
【００７４】 当業者が認識するように、上記の配列決定の誤差の可能性、ならびに異なる公
知のタンパク質におけるリーダーについての切断部位の可変性に起因して、寄託
されたｃＤＮＡによってコードされる成熟ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、約９９
アミノ酸を含むが７５〜１２０アミノ酸の範囲のいずれかの場所であり得；そし
てこのタンパク質の実際のリーダー配列は約２１アミノ酸であるが、約１５〜約
３５アミノ酸の範囲のいずれかの場所であり得る。
【００７５】 ＭＰＩＦ−１変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における
変化を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を
生成するが、コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を
含むポリヌクレオチド変異体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな
置換によって生成されるヌクレオチド変異体が、好ましい。さらに、任意の組合
せにおいて５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付
加される変異体もまた、好ましい。ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド変異体は、種
々の理由（例えば、特定の宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮ
Ａにおけるコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに
変化させる））のために、生成され得る。
【００７６】 天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つを
いう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発
技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【００７７】 （核酸プローブ） そのような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイ
ブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのため、そして例えば、ノーザンブ
ロット分析によってヒト組織におけるＭＰＩＦ−１遺伝子の発現を検出するため
のプローブとして有用である。本発明はさらに、本明細書中に記載の単離された
核酸分子のフラグメントに関する。寄託されたＭＰＩＦ−１ ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列、または図１もしくは２０Ａ（配列番号１もしくは６）に示されるヌ
クレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、少なくと
も約１５ｎｔ長、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ長、さらにより好
ましくは少なくとも約３０ｎｔ長、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４
０ｎｔ長のフラグメントが意図され、これは本明細書中で議論されるように診断
用プローブおよびプライマーとして有用である。当然のことながら、寄託された
ＭＰＩＦ−１ ｃＤＮＡのすべてではないにしろほとんどのヌクレオチド配列、
または図１または２０Ａ（配列番号１または６）において示されるようなヌクレ
オチド配列に対応するフラグメントと同様に、より長い５０〜５００ｎｔ長のフ
ラグメントもまた本発明によって有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長の
フラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１も
しくは２０Ａ（配列番号１もしくは６）において示されるようなヌクレオチド配
列由来の２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。遺伝子は寄
託されており、そして図１もしくは２０Ａ（配列番号１もしくは６）において示
されるようなヌクレオチド配列が提供されるため、そのようなＤＮＡフラグメン
トを生成することは当業者に日常的である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切
断、または超音波処理による剪断は、種々のサイズのフラグメントを生成するた
めに容易に使用され得る。あるいは、そのようなフラグメントは、合成的に生成
され得る。
【００７８】 本願は、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、配列番号２または７のｍ
〜ｎとして下に開示されるＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードする）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一である、核酸分子に関し、これは、その核酸が
ＭＰＩＦ−１機能的活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらない
。これは、特定の核酸分子がＭＰＩＦ−１機能的活性を有するポリペプチドをコ
ードしない場合でさえ、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしてその核酸を使用する方法を、当業者
はなお知っているからである。ＭＰＩＦ−１機能的活性を有するポリペプチドを
コードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、（１）ｃＤＮＡライ
ブラリーにおいてＭＰＩＦ−１遺伝子またはその対立遺伝子改変体もしくはスプ
ライス改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐ
ｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるよう
な、ＭＰＩＦ−１遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、中期染色体スプ
レッドに対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；な
らびに特定の組織におけるＭＰＩＦ−１ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザン
ブロット分析が、挙げられる。
【００７９】 しかし、本明細書中に開示される核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核酸分子が好まし
い。これらは、事実、ＭＰＩＦ−１機能的活性を有するポリペプチドをコードす
る。「ＭＰＩＦ−１機能的活性を有するポリペプチド」によって、例えば特定の
免疫アッセイおよび／または生物学的アッセイにおいて測定されるように、本発
明のＭＰＩＦ−１ポリペプチド（例えば、完全（全長）ＭＰＩＦ−１、成熟ＭＰ
ＩＦ−１および可溶性ＭＰＩＦ−１（例えば、ＭＰＩＦ−１の細胞外ドメインに
含まれる配列を有する））の機能的活性と類似する活性（しかし、同一である必
要はない）を示すポリペプチドが意図される。例えば、ＭＰＩＦ−１機能的活性
は、ＭＰＩＦ−１リガンドを結合するＭＰＩＦ−１ポリペプチドの能力を決定す
ることによって日常的に測定され得る。ＭＰＩＦ−１機能的活性はまた、ポリペ
プチドを発現する細胞を誘導するポリペプチド（細胞表面上に存在しないまたは
発現されるコグネイトリガンドなど）の能力を決定することによって測定され得
る。
【００８０】 本発明の全長遺伝子のフラグメントを、ｃＤＮＡライブラリーについてのハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用して、全長ｃＤＮＡを単離し得、そして
その遺伝子に対する高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他のｃＤ
ＮＡを単離し得る。好ましくは、この型のプローブは、少なくとも３０塩基を有
し、そして例えば５０以上の塩基を含み得る。プローブをまた使用して、全長転
写物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節領域、プロモーター領域、エク
ソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローンを同定し得る
。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための公知の
ＤＮＡ配列を用いることによって遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する
。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを
用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡをスクリーニングし、プ
ローブがライブラリーのどのメンバーにハイブリダイズするかを決定する。
【００８１】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメントに
関する。本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、以下である
核酸配列を有する短いポリヌクレオチドをいう：寄託されたクローンに含まれる
か、もしくは寄託されたクローン中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
をコードする核酸配列の一部であるか；配列番号１または６もしくはそれらの相
補鎖に示される核酸配列の一部であるか、または配列番号２のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の一部である。本発明のヌクレオチドフラグメン
トは、好ましくは、少なくとも約１５ｎｔ長、そしてより好ましくは少なくとも
約２０ｎｔ長、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ長、そしてなおより
好ましくは少なくとも約４０ｎｔ長、少なくとも約５０ｎｔ長、少なくとも約７
５ｎｔ長、または少なくとも約１５０ｎｔ長である。「少なくとも約２０ｎｔ長
」のフラグメントは、例えば寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列または
配列番号１もしくは６に示されるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続する塩
基を含むことが意図される。この文脈において「約（おおよそ）」は、いずれか
の末端もしくは両方の末端において、特に記載された値（これより数個（５、４
、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値）を含む。こ
れらのヌクレオチドフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プロ
ーブおよびプライマーとして含むが、それらに限定されない使用を有する。当然
のことながら、より大きなフラグメント（例えば、５０、１５０、５００、６０
０、２０００ヌクレオチド）もまた、好ましい。
【００８２】 さらに、本発明は、残基５０〜５９９、１００〜５９９、２００〜５９９、３
００〜５９９、４００〜５９９、５００〜５９９、６００〜１８００、５０〜５
００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００、５
０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００、５０〜３００
、１００〜３００、２００〜３００、５０〜２００、１００〜２００、および５
０〜１００由来の配列番号１または６の少なくとも約２５ヌクレオチド、少なく
とも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌ
クレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌク
レオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少
なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、または少なくと
も約１００ヌクレオチドの任意の一部を含むか、あるいはそれからなるポリヌク
レオチドを含む。
【００８３】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
おおよそ以下のヌクレオチド数から配列番号１または６の末端の配列、またはそ
れらの相補鎖、または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡを含むか、あるい
はそれからなるフラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜
１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、
３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０または５５
１。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲、およびい
ずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、ま
たは１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さい範囲を含む。好ましくは、
これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。よ
り好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明細書中で議論されるようにプ
ローブまたはプライマーとして使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件またはより低いストリンジェンシー条件下でこれらの核酸分子に
ハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌク
レオチドによりコードされるポリペプチドも同様に含まれる。本発明において、
「ポリヌクレオチドフラグメント」は、配列番号２に含まれるか、または寄託さ
れたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の一部であ
るアミノ酸をいう。
【００８４】 （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質発現） 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクター
を含む遺伝学的に操作された宿主細胞、および組換え技術によるＭＰＩＦ−１、
ポリペプチドまたはフラグメントの生成に関する。本発明はさらに、細菌系にお
けるタンパク質生成に有用な新規な発現ベクターに関する。これらの新規なベク
ターは、ｐＨＥ４シリーズのベクター、そして特にｐＨＥ４−５ベクターによっ
て例示される（図３１および３６Ａ〜Ｅ）。
【００８５】 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖につ
いての選択可能マーカーを含むベクターに結合され得る。以下で詳細に議論され
るように、一般にプラスミドベクターは、沈殿物（リン酸カルシウム沈殿物など
）において、または荷電脂質との複合体において、宿主細胞中に導入される。ベ
クターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用い
てインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞中に形質導入され得る。
【００８６】 目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシス作用制御領域を含むベク
ターは、本発明の実施における使用について好ましい。シス作用制御領域は、オ
ペレーターおよびエンハンサー配列を含む。本明細書中で使用される場合、用語
「オペレーター」は、通常ＤＮＡから構成される、隣接ヌクレオチド配列の転写
を制御するヌクレオチド配列をいう。オペレーター配列は、一般に細菌染色体由
来である。
【００８７】 本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、高等真核生物による
転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大され得る。エン
ハンサーはシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約３００ｂｐであり、こ
れは所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増大させるように作用
する。エンハンサーの例として、複製起点のｂｐ１００〜２７０の後期側に位置
するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハン
サー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン
ハンサーが挙げられる。
【００８８】 適切なトランス作用因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによ
って供給され得るか、または宿主中への導入に際してベクター自体によって供給
され得る。
【００８９】 この点における特定の好ましい実施形態において、ベクターは特異的な発現を
提供し、それは誘導性および／または細胞型特異的であリ得る。そのようなベク
ターの中で特に好ましいものは、操作が容易な環境要因（例えば、温度および栄
養添加物）によって誘導されるものである。また、実施例３０において記載され
るｐＨＥ４−５ベクターは、ＭＰＩＦ−１の発現について好ましい。
【００９０】 本発明において有用なさらなる発現ベクターは、染色体由来のベクター、エピ
ソーム由来のベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド
、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例
えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）、およびそれ
らの組み合わせ由来のベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））を含
む。
【００９１】 適切な核酸配列は、種々の手順によってベクター中に挿入され得る。一般に、
核酸配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中に、当該分野で公知の手順に
よって挿入される。そのような手順および他のものは、当業者の範囲内であると
考えられる。
【００９２】 核酸挿入物は、適切なプロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、
Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびｔａｃプロモー
ター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイ
ルスＬＴＲのプロモーター、ならびに原核生物細胞もしくは真核細胞またはそれ
らのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター
）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公
知である。本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、ヌクレオチ
ド配列、または最小でＲＮＡポリメラーゼ作用についての結合部位もしくは開始
部位を提供するヌクレオチド配列の群をいう。発現構築物はさらに、転写開始、
終結のための部位、および転写される領域において翻訳のためのリボソーム結合
部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは
始めの翻訳開始、および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に配置された
終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。ベクターはまた、発現を
増強するための適切な配列を含み得る。
【００９３】 本明細書中で使用される場合、句「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド
配列が、配列の機能を変換し得るように別のヌクレオチド配列に結合される連結
をいう。例えば、プロモーター／オペレーターに作動可能に連結されたタンパク
質コード配列は、これらの配列の影響または制御下でタンパク質コード配列の発
現を行う。２つのヌクレオチド配列（例えば、タンパク質コード配列およびコー
ド配列の５’末端に連結されたプロモーター領域配列）は、プロモーター機能の
誘導がタンパク質コード配列ｍＲＮＡの転写を生じる場合、そして２つのヌクレ
オチド配列間の連結の性質が（１）フレームシフト変異の導入を生じることも、
（２）発現調節配列がｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を指向するのを妨げるこ
ともしない場合、作動可能に連結されているといわれる。従って、プロモーター
領域は、プロモーターがヌクレオチド配列の転写をもたらし得る場合、ヌクレオ
チド配列に作動可能に連結される。
【００９４】 本明細書中で使用される場合、句「クローニングベクター」は、プラスミドも
しくはファージ核酸、または宿主細胞において自律的に複製し得、そして１つも
しくは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる他の核酸配列
をいい、この部位で、そのような核酸配列はベクターの必須の生物学的機能の欠
失なしに決定可能な様式で切断され得、この部位中で核酸がその複製およびクロ
ーニングを生じるようにスプライシングされ得る。クローニングベクターはさら
に、クローニングベクターを用いて形質転換された細胞の同定における使用に適
切なマーカーを含み得る。例えば、マーカーは、エリスロマイシンおよびカナマ
イシン耐性である。用語「ビヒクル」は、時に「ベクター」のために使用される
。
【００９５】 本明細書中で使用される場合、句「発現ベクター」は、宿主中での発現ベクタ
ーの形質転換後、発現ベクター中にクローン化される構造遺伝子を発現し得るク
ローニングベクターに類似のベクターをいう。発現ベクターにおいて、クローン
化された構造遺伝子（目的の任意のコード配列）は、そのような遺伝子が特定の
宿主において発現されるのを可能にする特定の配列の制御下に置かれる（すなわ
ち、それに作動可能に連結される）。例えば、ｐＨＥ４−５において、構造遺伝
子は、Ｔ５ファージプロモーター配列および２つのｌａｃオペレーター配列に作
動可能に連結される。発現制御配列は変化し、そしてさらに特定の転写エレメン
ト（例えば、転写配列）および／または翻訳エレメント（例えば、開始および終
結部位）を含み得る。
【００９６】 先に示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能
マーカーを含む。そのようなマーカーは、真核細胞培養については、ジヒドロ葉
酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、そしてＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌に
おける培養については、テトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン
耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例としては以下を含むが、これらに限
定されない：細菌細胞（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例え
ば酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅまたはＰ
ｈｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８）））；昆虫細
胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細
胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫細胞
）；ならびに植物細胞。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、
当該分野において公知である。
【００９７】 本発明の実施における発現ベクターの使用に加えて、本発明はさらに、目的の
タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーター
およびプロモーターエレメントを含む新規な発現ベクターを含む。そのようなベ
クターの１つの例は、ｐＨＥ４−５（配列番号３７）であり、これは以下および
実施例１４の両方において詳細に記載される。ｐＨＥ４−５ベクターは、アメリ
カンタイプカルチャーコレクション、特許寄託（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０
−２２０９）に１９９７年９月３０日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号２０
９３１１を与えられた。
【００９８】 図３１および３６において要約されるように、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番
号３７）の成分は以下を含む：（１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子、（２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、（３）Ｔ５ファージ
プロモーター配列、（４）２つのｌａｃオペレーター配列、）５）ＭＰＩＦ−１
Δ２３をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）、（６）Ｓｈｉｎｅ−Ｄ
ｅｌｇａｒｎｏ配列、（７）ラクトースオペロン抑制遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複
製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ）由来である。プロモーター配列およびオペレーター配列を合成的に作製し
た。核酸配列の合成生成は当該分野において周知である。ＣＬＯＮＴＥＣＨ ９
５／９６ Ｃａｔａｌｏｇ， ２１５−２１６頁、ＣＬＯＮＴＥＣＨ， １０２
０ Ｅａｓｔ Ｃｉｒｃｌｅ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ ９４３０３。
【００９９】 上述のように、ｐＨＥ４−５ベクターは、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む。ｌａｃＩ
ｑは、ｌａｃＩ遺伝子の対立遺伝子であり、ｌａｃオペレーターの強固な調節を
付与する。Ａｍａｎｎ，Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１〜３１５（１９８８）
；Ｓｔａｒｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ５１：２５５〜２６７（１９８７）。ｌａｃＩ
ｑ遺伝子は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、そして下流（すなわち、３’）
配列の転写を阻止する、リプレッサータンパク質をコードする。しかし、ｌａｃ
Ｉｑ遺伝子産物は、ラクトースかまたは特定のラクトースアナログ（例えば、イ
ソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））のいずれかの存在下
で、ｌａｃオペレーターから分離する。従って、ＭＰＩＦ−１Δ２３は、ｐＨＥ
４−５ベクターを含む非誘導宿主細胞において、感知可能な量で産生されない。
しかし、ＩＰＴＧのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、ＭＰＩ
Ｆ−１Δ２３コード配列の発現を生じる。
【０１００】 ｐＨＥ４−５ベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号３８）は
、Ｔ５ファージプロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列を含む。１つ
のオペレーターは、転写開始部位の５’側に配置され、そしてもう他方は、同部
位の３’側に位置する。これらのオペレーターは、ｌａｃＩｑ遺伝子産物と組合
せて存在する場合、ｌａｃオペロンインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ）の非存
在下での、下流配列の強固な抑制を与える。このｌａｃオペレーターから下流に
位置する作動可能に連結された配列の発現は、ｌａｃオペロンインデューサー（
例えば、ＩＰＴＧ）の添加により誘導され得る。ｌａｃＩｑタンパク質へのｌａ
ｃインデューサーの結合は、ｌａｃオペレーター配列からのそれらの解放、およ
び作動可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のｌａｃオペロ
ン調節は、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．、ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳ
ＴＲＹ ＷＩＴＨ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳ、第４版（１
９９７）、８０２〜８０７頁に概説される。
【０１０１】 ｐＨＥ４シリーズのベクターは、ＭＰＩＦ−１Δ２３コード配列を除くｐＨＥ
４−５ベクターの全ての構成要素を含む。ｐＨＥ４ベクターの特徴は、最適化さ
れた合成Ｔ５ファージプロモーター、ｌａｃオペレーター、およびシャイン−ダ
ルガーノ配列を含む。さらに、これらの配列はまた、最適に間隔を空けられ、そ
の結果、挿入された遺伝子の発現は強固に調節され得、そして高レベルの発現が
誘導に際して生じる。
【０１０２】 本発明のタンパク質の生成における使用に適切な公知の細菌性プロモーターの
中には、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７
プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λ ＰＲおよびＰＬプロモーター、ならび
にｔｒｐプロモーターを含む。適切な真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期プ
ロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プ
ロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイル
ス（ＲＳＶ））、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタ
ロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられる。
【０１０３】 ｐＨＥ４−５ベクターはまた、ＡＵＧ開始コドンの５’側にシャイン−ダルガ
ーノ配列を含む。シャイン−ダルガーノ配列は、一般に、ＡＵＧ開始コドンから
約１０ヌクレオチド上流（すなわち、５’）に位置する短い配列である。これら
の配列は、本質的には、原核生物リボソームを、ＡＵＧ開始コドンに向ける。
【０１０４】 従って、本発明はまた、細菌における本発明のタンパク質の産生に有用な発現
ベクターに関する。本発明のこの局面は、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号３７
）（ＡＴＣＣ受託番号２０９３１）およびその改変体によって例示される。
【０１０５】 細菌における、本発明のタンパク質の発現における使用に好ましいさらなるベ
クターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＤ
１０、ｐＢＳベクター、ｐＤ１０、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４
６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ
２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が
挙げられる。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡ
Ｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）
；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａから入手可能）がある。
【０１０６】 他の適切なベクターは、当業者に容易に明白であり、そしてｐＢＲ３２２（Ａ
ＴＣＣ ３７０１７）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、およびＧＥＭ１（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を含む。これらのｐ
ＢＲ３２２「バックボーン」切片は、適切なプロモーターおよび発現されるべき
構造配列と組み合わせられる。適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細
胞密度までの増殖後、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度変化
または化学的誘導）によって誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【０１０７】 さらなる実施形態では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。
宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細
胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例え
ば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチ
オン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感
染、または他の方法により達成され得る。そのような方法は、多くの標準的な実
験マニュアルにおいて記載される（例えば、Ｄａｖｉｓら， ＢＡＳＩＣ ＭＥ
ＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，（１９８６））。
【０１０８】 組換え構築物は、周知の技術（例えば、感染、形質導入、トランスフェクショ
ン、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーショ
ン、および形質転換）を用いて宿主細胞中に導入され得る。ベクターは、例えば
、ファージ、プラスミド、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターで
あり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠失であり
得る。後者の場合において、ウイルス増殖は、一般に宿主細胞を相補する際にの
み起こる。
【０１０９】 宿主細胞は、本発明のベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベ
クターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトラン
スフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファー
ジなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質
転換体の選択、またはＭＰＩＦ−１および遺伝子の増幅に適切なように改変され
た従来の栄養培地において培養され得る。培地条件（例えば、温度、ｐＨなど）
は、発現のために選択された宿主細胞に関して以前に使用された条件であり、当
業者に明白である。
【０１１０】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため
に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ビヒクル、特にベクターまたはプラスミドのいずれか１
つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体核酸配列、非染色体核酸配列、
および合成核酸配列を含む（例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミド；フ
ァージ核酸；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージ核酸の組み合わせに由
来するベクター、ウイルス核酸（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウ
イルス、αウイルス、および仮性狂犬病））。しかし、宿主において複製可能で
、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。
【０１１１】 上記のように、本明細書中上記のような適切な核酸配列ならびに適切なプロモ
ーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿
主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。
【０１１２】 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、
Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａおよびＳｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ
黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の
範囲内であると考えられる。
【０１１３】 さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む
組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターま
たはウイルスベクター）を含み、このベクターの中に、本発明の配列が正方向ま
たは逆方向に挿入されている。この実施形態の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを含む）
を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販される。以下のベクターが例として提供される。細菌性：ｐＱＥ
７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇ
ｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ
、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０
、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ
、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＳＶＫ３、ｐＢ
ＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、他の任意のプラス
ミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である
限り、使用され得る。
【０１１４】 宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する
ために、従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは
、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。
【０１１５】 成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で、適切な
プロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、そのようなタンパ
ク質を産生するために、本発明の核酸構築物に由来するＲＮＡを使用して用いら
れ得る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベク
ターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）（この開示は、本明細書中に参
考として援用される）に記載される。
【０１１６】 一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能と
する選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示す
る高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特
に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、
酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに
由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、および好まし
くは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を指示し得る
リーダー配列と適切な相内で組立てられる。随意に、異種配列は、所望の特徴を
与えるＮ末端同定ペプチド（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略
化された精製）を含む融合タンパク質をコードし得る。
【０１１７】 細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造核
酸配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターで作動可能な読み取り相で挿入することにより構築される。ベクター
は、ベクターの維持を確実にし、そして所望により宿主内での増幅を提供するた
めに１つ以上の表現型選択マーカー、および複製起点を含有する。形質転換のた
めに適切な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。
【０１１８】 細胞は、代表的には遠心分離により回収され、物理的手段または化学的手段に
より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【０１１９】 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音
波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ
り破砕され得、そのような方法は、当業者に周知である。
【０１２０】 種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ ２３：１７５（
１９８１）に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のベ
クターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ
、およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切
なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そして任意の必要なリボソーム結合
部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプタ
ー部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列をも含む。ＳＶ４０ウイルス
スプライスおよびポリアデニル化部位に由来する核酸配列は、必要な非転写遺伝
エレメントを提供するために使用され得る。
【０１２１】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチドおよび好ましくは、その分泌された形態は、以下か
ら回収され得る：天然の精製産物（体液、組織および細胞を含み、直接単離され
るかまたは培養される）；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核
生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳
動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順にお
いて用いられる宿主に依存して、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、グリコシル化さ
れていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、ＭＰＩＦ
−１ポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改
変された開始メチオニン残基を含み得る。従って、翻訳開始コドンによってコー
ドされているＮ末端メチオニンは、一般的に、すべての真核生物細胞において翻
訳後に任意のタンパク質から高い効率で除去されることが当該分野において周知
である。大部分の原核生物においても、大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニ
ンはまた、効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では、この原核生物の
除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存し
て、非効率的である。
【０１２２】 本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加え
て、本発明はまた、内因性遺伝物質（例えば、ＭＰＩＦ−１コード配列）を欠失
もしくは置換するように、ならびに／または本発明のＭＰＩＦ−１ポリヌクレオ
チドに作動可能に結合され、そして内因性ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドを活性
化し、変更し、および／もしくは増幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオ
チド配列）を含むように操作されている初代の、二代目の、および不死化された
、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の宿主細胞を含む。例えば、当該分野で
公知の技術を使用して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエ
ンハンサー）ならびに内因性ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド配列を相同組換えを
介して作動可能に結合し得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された、米
国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された、国際公開
番号ＷＯ９６／２９４１１；１９９４年８月４日に公開された、国際公開番号Ｗ
Ｏ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら
、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと（これらの
開示の各々は、これら全体が参考として援用される））。
【０１２３】 （ＭＰＩＦ−１ポリペプチド） 本発明はさらに、単離したＭＰＩＦ−１ポリペプチドに関連し、それは、寄託
されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、または図１のアミノ酸配列
（配列番号２）、あるいは上記ポリペプチドの部分を含むかあるいはこれからな
るペプチドまたはポリペプチドを有する。用語「ペプチド」および「オリゴペプ
チド」は、（一般に認識されているように）同義とみなされ、そして各々の用語
は、文脈がペプチド結合により結合した少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すこ
とが必要である場合に、交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、１
０個より多いアミノ酸残基を含む鎖について、本明細書中で使用される。本明細
書中の全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、アミノ末端
からカルボキシ末端の方向に左から右に書かれる。本発明はさらに、本発明のポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれ
らから構成されるか、あるいはこれらからなるタンパク質を提供する。
【０１２４】 本発明はまた、配列番号２に開示され、そして／または寄託されたクローンに
よってコードされるポリペプチドの改変体を包含する。
【０１２５】 「改変体」とは、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドまたはＭＰＩＦ−１ポリペプ
チドとは異なるが、その必須の特性は保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドを言及する。一般的に、改変体は全体的に酷似しており、そして多くの領
域においてＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドまたはＭＰＩＦ−１ポリペプチドと同
一である。
【０１２６】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ＭＰＩＦ−１機能的
活性を示すポリペプチドをコードする。ＭＰＩＦ−１「機能的活性」を示すポリ
ペプチドとは、全長（完全）ＭＰＩＦ−１タンパク質と関連した１つ以上の公知
の機能的活性を示し得るポリペプチドを意味する。これらの機能的活性としては
、以下が、挙げられるが、これらに限定されない：生物学的活性、抗原性、抗Ｍ
ＰＩＦ−１抗体と結合する能力（または、結合のためにＭＰＩＦ−１ポリペプチ
ドと競合する能力）、免疫原性（ＭＰＩＦ−１ポリペプチドと結合する抗体を産
生する能力）、本発明のＭＰＩＦ−１ポリペプチドと多量体を形成する能力、な
らびにＭＰＩＦ−１ポリペプチドがレセプターまたはリガンドと結合する能力。
【０１２７】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体
、およびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
【０１２８】 例えば、抗ＭＰＩＦ−１抗体への結合についてＭＰＩＦ−１の全長ポリペプチ
ドに結合するか、またはそれと競合する能力についてアッセイする、１つの実施
形態では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このような
アッセイとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ
）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応
、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素ま
たは放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセ
イ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫
蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのよう
な技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定され
ない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによ
って検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二
次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態
では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の
検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【０１２９】 別の実施形態では、ＭＰＩＦ−１レセプターまたはリガンドが同定されるか、
あるいは本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体が多量体化
する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグ
ラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニテ
ィーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る
。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．５９：９４−１２３を参照のこと。別の実施形態では、その基質へのＭＰＩ
Ｆ−１結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【０１３０】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例を参照のこと）およびそう
でなければ当該分野において公知のアッセイは、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドおよ
びそのフラグメント、改変誘導体およびアナログがＭＰＩＦ−１関連生物活性を
（インビトロまたはインビボのいずれかで）誘発する能力を測定するために慣用
的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
【０１３１】 本発明のＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち
、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。
従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のＭＰＩＦ−１ポリペプ
チド、それらの調製およびそれらを含む組成物（好ましくは、薬学的組成物）に
関する。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマ
ー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態において、本発明のマ
ルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテト
ラマーである。
【０１３２】 本発明によって包含されるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得
る。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーとは、本発明のＭＰＩＦ−１ポ
リペプチド（本明細書中に記載されるＭＰＩＦ−１のフラグメント、改変体およ
び融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーのことをいう。これらのホモマ
ーは、同一または異なるポリペプチド配列を有するＭＰＩＦ−１ポリペプチドを
含み得る。特定の実施形態において、本発明のホモマーは、同一のポリペプチド
配列を有するＭＰＩＦタンパク質のみを含むマルチマーである。別の特定の実施
形態において、本発明のホモマーは、異なるポリペプチド配列を有するＭＰＩＦ
タンパク質を含むマルチマーである。特定の実施形態において、本発明のマルチ
マーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるポリペプチド配列を有するＭ
ＰＩＦタンパク質を含む）またはホモトリマー（例えば、同一または異なるポリ
ペプチド配列を有するＭＰＩＦタンパク質を含む）である。さらなる実施形態に
おいて、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくと
もホモトリマー、または少なくともホモテトラマーである。
【０１３３】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＭＰＩＦタンパ
ク質に加えて異種タンパク質（すなわち、ＭＰＩＦ遺伝子によってコードされる
ポリペプチド配列に対応しないポリペプチド配列のみを含むタンパク質）を含む
マルチマーをいう。特定の実施形態において、本発明のマルチマーは、ヘテロダ
イマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態にお
いて、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくとも
ホモトリマー、または少なくともホモテトラマーである。
【０１３４】 本発明のマルチマーは、疎水結合、親水結合、イオン結合および／もしくは共
有結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態において、本発明のマルチマー（例えば
、ホモダイマーまたはホモトリマー）は、本発明のタンパク質が溶液中で互いに
接触する場合に形成される。別の実施形態において、本発明のへテロマルチマー
（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のタンパク
質が、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質に
おける異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に形成される
。他の実施形態において、本発明のマルチマーは、本発明のＭＰＩＦタンパク質
との、および／または本発明のＭＰＩＦタンパク質間での共有結合によって形成
される。このような共有結合は、ポリペプチド配列（配列番号２に記載されるポ
リペプチド配列およびＡＴＣＣ寄託番号７５６７６に含まれるｃＤＮＡクローン
によってコードされるポリペプチド）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み
得る。１つの例において、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在
する）ポリペプチドにおいて相互作用するタンパク質のポリペプチド配列内に位
置するシステイン残基間での架橋である。別の例において、この共有結合は、化
学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、Ｍ
ＰＩＦ融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミ
ノ酸残基を含み得る。１つの例において、共有結合は、本発明の融合タンパク質
に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照
のこと）。特定の例において、この共有結合は、（本明細書中に記載されるよう
な）本発明のＭＰＩＦ−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。
【０１３５】 別の実施形態において、本発明のＭＰＩＦポリペプチドおよびそのエピトープ
保有フラグメントは、異種抗原（例えば、ポリペプチド、炭水化物、リン脂質、
または核酸）と融合される。
【０１３６】 特定の実施形態において、異種抗原は、免疫原である。より特定の実施形態に
おいて、異種抗原は、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質またはそのフラグメントで
ある。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によ
って包含される。
【０１３７】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質は、当該分野
で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋さ
れ得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５
，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分野
で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるタン
パク質のポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の１つ以上の分子間架
橋を形成し得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国
特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のタンパク質は、
タンパク質のポリペプチド配列のＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオ
チンの付加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１つ
以上のこれらの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために適用
され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発
明のマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質成分を含むリポソームを
生成するために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１３８】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子工学技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態において、本発明のマルチマー中に含まれるタン
パク質は、本明細書中に記載されるかまたはさもなくば当該分野で公知の融合タ
ンパク質技術を用いて組換え的に産生される（例えば、米国特許第５，４７８，
９２５号を参照のこと、これは、本明細書中でその全体が参考として援用される
）。特定の実施形態において、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオ
チドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカー
ポリペプチドをコードする配列に連結し、次いで、もともとのＣ末端からＮ末端
（リーダー配列を欠く）へと逆方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成
ポリヌクレオチドに、さらに連結することによって生成される（例えば、米国特
許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書中でその全体が参考
として援用される）。別の実施形態において、本明細書中に記載されるかまたは
さもなくば当該分野で公知の組換え技術が適用されて、膜貫通ドメインを含む本
発明の組換えポリペプチドを生成し、そしてこれは、膜再構成技術によってリポ
ソームに取り込まれ得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこ
と、これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０１３９】 さらに、本発明のタンパク質は、当該分野で公知の技術（例えば、Ｃｒｅｉｇ
ｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ
．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１
１（１９８４））を用いて化学的に合成され得る。例えば，本発明のＭＰＩＦポ
リペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置の使用
によって合成され得る。さらに、所望であれば，非古典的アミノ酸または化学ア
ミノ酸アナログは、ＭＰＩＦポリペプチド配列中への置換または付加として導入
され得る。非古典的アミノ酸は、以下を含むがこれらに限定されない：標準アミ
ノ酸のＤ−アイソマー、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミ
ノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇＡｂｕ、ｅＡｈｘ、６−アミノヘキサン酸
、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルチニン、ノルロ
イシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシト
ルリン、システイック酸（ｃｙｓｔｅｉｃ ａｃｉｄ）、ｔ−ブチルグリシン、
ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニ
ン、フルオロ−アミノ酸、設計されたアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸、
Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、および一般なアミノ酸アナロ
グ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１４０】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して産生さ
れ得、この技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：オリゴ
ヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異
的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：
４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗ
ｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変
異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏ
ｎｄｏｎ Ｓｅｒ．Ａ ３１７：４１５（１９８６）を参照のこと）。
【０１４１】 本発明は、翻訳の間または翻訳の後に差示的に改変される（例えば、グリコシ
ル化，アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘
導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞性リガンドに対する連
結など）ＭＰＩＦポリペプチドを含む。多くの任意の化学的改変が、以下を含む
がこれらに限定されない公知の技術によって行なわれ得る：臭化シアン、トリプ
シン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的
化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン存在下におけ
る代謝的合成；など。
【０１４２】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後改変は、例えば、Ｎ結合型糖鎖または
Ｏ結合型糖鎖（Ｎ末端およびＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格に対する化
学的部分の付着、Ｎ連結糖鎖またはＯ連結糖鎖の化学的改変、および原核宿主細
胞の発現の結果としてＮ末端メチオニン残基の付加または欠失を含む。ポリペプ
チドはまた、タンパク質の検出および単離を可能にする、酵素的、蛍光的、同位
体的または親和性標識のような検出可能な標識を用いて改変され得る。
【０１４３】 本発明によってまた与えられるのは、化学的に改変されたＭＰＩＦの誘導体で
あり、これは、ポリペプチドの可溶性、安定性および循環時間の増加または免疫
原性の減少のようなさらなる利点を与え得る（米国特許第４，１７９，３３７号
を参照のこと）。誘導体化のための化学的成分は、例えば、ポリエチレングリコ
ール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどのような、水溶性ポリ
マーから選択され得る。ポリペプチドは、分子中のランダムな部位、または分子
中の予め決定された部位を改変され得、そして１、２、３以上の付加した化学的
成分を含み得る。
【０１４４】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、ポ
リエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、
２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６
０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５
００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，００
０、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００
、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、
１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２
０，０００ 、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５
０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５
，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または
１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０１４５】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有していてもよい。分
枝ポリエチレングリコールは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，６４
３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）
；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−
６４６（１９９９）（これらの各々の開示は、本明細書中において参考として援
用される）。
【０１４６】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。
【０１４７】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基の
いずれかへの結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレング
リコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸
残基、またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学系を用いて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リ
ジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン）またはタ
ンパク質の１つより多くの型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組み合わせ）にポリエ
チレングリコールを結合し得る。
【０１４８】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質を具体的に所望し得る。ポリエチレングリ
コールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（またはペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応
の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末
端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化
部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化
物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は
、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（
リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され
得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端での
タンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１４９】 上記のように、本発明のタンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、か
なり多数の手段によって、達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、
直接的または介在性リンカーによってのいずれかによってタンパク質に接続され
得る。タンパク質にポリエチレングリコールを接続させるためのリンカーレス（
ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）システムは、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔ
ｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）
；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１
８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０
５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載される。こ
れらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０１５０】 介在性リンカーを伴わずに、ポリエチレングリコールを直接、タンパク質のア
ミノ酸残基に接続させるための一つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ
）されたＭＰＥＧを利用する。トレシル化されたＭＰＥＧは、塩化トレシル（Ｃ
ｌＳＯ2ＣＨ2ＣＦ3）を使用するモノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエ
チレングリコール（ＭＰＥＧ）の改変によって生成される。トレシル化されたＭ
ＰＥＧを用いるタンパク質の反応の際に、ポリエチレングリコールが、直接タン
パク質のアミン基と接続される。従って、本発明は、２，２，２−トリフルオロ
エタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレン
グリコール分子と本発明のタンパク質を反応させることによって産生されるタン
パク質ポリエチレングリコール結合体を含む。
【０１５１】 ポリエチレングリコールはまた、多数の異なる介在性リンカーを使用して、タ
ンパク質と接続され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この全体
の開示は、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質とポリエチレン
グリコールを連結するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−ポリエ
チレングリコール結合体（ここで、ポリエチレングリコールは、リンカーによっ
てタンパク質と接続される）はまた、化合物（例えば、ＭＰＥＧ−スクシンイミ
ジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥ
Ｇ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニ
トロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧスクシネート誘導体）とタ
ンパク質との反応によって、産生され得る。多数のさらなるポリエチレングリコ
ール誘導体およびポリエチレングリコールをタンパク質に接続するための反応化
学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載され、その全体の開示は、本明細書中に参考
として援用される。本明細書中で設定された反応化学を使用して産生されるペグ
化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１５２】 本発明の各タンパク質に接続されるポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）はまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０、以上のポリエチレングリコール分子と連結され得る。同様に、タンパク質分
子当たりの置換の平均程度は、例えば、１−３、２−４、３−５、４−６、５−
７、６−８、７−９、８−１０、９−１１、１０−１２、１１−１３、１２−１
４、１３−１５、１４−１６、１５−１７、１６−１８、１７−１９、または１
８−２０のポリエチレングリコール部分の範囲内である。置換の程度を決定する
ための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において議
論される。
【０１５３】 「ＭＰＩＦ−１活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイに
おいて測定されるように、本発明のＭＰＩＦ−１タンパク質（全長タンパク質ま
たは好ましくは成熟タンパク質）の活性に類似するが必ずしも同一ではない活性
を提示するポリペプチドを意図する。ＭＰＩＦ−１タンパク質活性は、実施例９
、１０ならびに図５に記載されるアッセイによって測定され得る。例えば、ＭＰ
ＩＦ−１タンパク質活性は、以下の実施例９に開示されるインビトロ骨髄保護（
ｍｙｅｌｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）アッセイを使用して測定された。
【０１５４】 手短には，細胞の系統枯渇集合（Ｌｉｎ-細胞）をマウスの骨髄から単離し、
ＭＰＩＦ−１を有するか、または有さない状態の複数のサイトカインの存在下で
インキュベートした。４８時間後、５−Ｆｕおよびインキュベーションを受けた
各培養の１組は、次いでさらに２４時間継続され、その時点で当業者に公知の任
意の適切なクローン原生アッセイによって残存低増殖能力コロニー形成細胞（Ｌ
ＰＰ−ＣＦＣ）の数が決定される。大部分の割合（例えば、３０〜５０％以上、
例えば、４０％以上）のＬＰＰ−ＣＦＣが、ＭＰＩＦ−１の存在下で５−Ｆｕに
誘発された細胞傷毒性から保護された。それに対して、無関係なタンパク質の存
在下、ＭＰＩＦ−１が存在しない状態では、ＬＰＰ−ＣＦＣに対する保護がほと
んど（＜５％）観察されなかった。このようなアッセイにおいて、高増殖性能力
コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）は、ＭＰＩＦ−１の存在下において、５−
Ｆｕ誘発細胞毒性から保護したが、いくつかの場合においては、そうではなかっ
た。ＬＰＰ−ＣＦＣが保護されない場合、ＨＰＰ−ＣＦＣは、一般的に保護され
ない。
【０１５５】 ＭＰＩＦ−１タンパク質活性はまた、実施例１６〜１８に開示される致死量以
下および致死量モデルによって、そして実施例１９に開示される細胞保護（ｃｙ
ｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）方法によって測定され得る。
【０１５６】 従って「ＭＰＩＦ−１タンパク質活性を有するポリペプチド」は、上記アッセ
イにおいて、ＭＰＩＦ−１活性を示すポリペプチドを含む。活性の程度がＭＰＩ
Ｆ−１タンパク質と同一である必要はないが、好ましくは、「ＭＰＩＦ−１タン
パク質活性を有するポリペプチド」は、ＭＰＩＦ−１タンパク質と比較して実質
的に類似した活性を示す（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ＭＰＩＦ−１タ
ンパク質と比較して、より大きな活性または約２０分の１以上、好ましくは、約
１０分の１以上の活性を示す）。
【０１５７】 本発明は、さらに、図１の推定アミノ酸配列（配列番号２）を有するか、また
は寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、ならびにこのような
ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体によってコードされるアミ
ノ酸配列を有するＭＰＩＦ−１ポリペプチドに関する。
【０１５８】 用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプ
チド（配列番号２）または寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ドを参照する場合、そのようなポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を本
質的に保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、プロタンパク質
部分の切断によって活性され、活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパ
ク質を含む。
【０１５９】 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合
成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【０１６０】 図１（配列番号２）のまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされたポリペプ
チドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残
基が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存された
アミノ酸残基）と置換され、およびこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝コ
ードによってコードされたものであるかまたはそうでないもの、または（ｉｉ）
１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチ
ドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、
ポリエチレングリコール）と融合されたもの、またはさらなるアミノ酸（例えば
、リーダーまたは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製のために使用される配
列またはプロタンパク質配列）が成熟ポリペプチドと融合されたものであり得る
。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書における教示
から当業者の範囲内であると判断される。
【０１６１】 任意のＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用さ
れ得る。例えば、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、第２のタンパク質に融合される
場合、抗原性タグとして使用され得る。ＭＰＩＦ−１ポリペプチドに対して惹起
される抗体は、ＭＰＩＦ−１に結合することによって、この第２のタンパク質を
間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は、細胞の位置
を輸送シグナルに基づいて標的とするので、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、他の
タンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【０１６２】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチドに融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列
のみならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である
必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０１６３】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、好ましく
は、均質に精製される。
【０１６４】 本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に、成熟ポリペプチ
ド）、ならびに配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも９５％類似性（な
おより好ましくは、少なくとも９５％同一）を有するポリペプチドを含み、また
、このようなポリペプチドの部分を含み、そして少なくとも２５アミノ酸、少な
くとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少な
くとも４５アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸、少なくとも５５
アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも６５アミノ酸、少なくとも７０
アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも８５
アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも９５アミノ酸、少なくとも１０
０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。
【０１６５】 タンパク質（ポリペプチド）フラグメントは、「独立の（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎ
ｄｉｎｇ）」であり得るか、またはフラグメントが形成する一部分もしくは領域
、最も好ましくは、１つの連続した領域のより大きなポリぺプチド内に含まれ得
る。本発明のポリぺプチドフラグメントの代表的な例は、例えば、おおよそのア
ミノ酸番号１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１
０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、または１６１からコード領域
末端までのフラグメントを含むかあるいはこれらからなる。さらに、ポリぺプチ
ドフラグメントは、長さが約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０
、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸であり得る
。この状況において、「約」は、いずれかの末端もしくは両方の末端で、具体的
に列挙される範囲または値、いくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のアミ
ノ酸だけ、より大きなまたはより小さな範囲または値を含む。
【０１６６】 タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以
上の生物学的機能の欠失の改変を生じたとしても、他の機能的活性（例えば、生
物学的活性、多量化する能力、ＭＰＩＦ−１リガンドに結合する能力）はなお保
持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体
を誘導および／または結合する、短縮されたＭＰＩＦ−１ムテインの能力は、一
般に、完全また成熟したポリペプチドの大多数より少ない残基が、Ｎ末端から除
去される場合に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠損する特定の
ポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記
載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な
方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有する
ＭＰＩＦ−１ムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し
得るようである。実際に、６つと同じくらい少ないＭＰＩＦ−１アミノ酸残基か
ら構成されるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【０１６７】 従って、ポリペプチドフラグメントは、分泌ＭＰＩＦ−１タンパク質ならびに
成熟形態を含む。さらに好ましいポリペプチドフラグメントは、アミノ末端もし
くはカルボキシ末端、またはその両方から、連続した欠失残基を有する分泌ＭＰ
ＩＦ−１タンパク質または成熟形態を含む。例えば、任意の数のアミノ酸（１〜
６０の範囲）は、分泌ＭＰＩＦ−１ポリペプチドまたは成熟形態のいずれかのア
ミノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０の範囲）が
、分泌ＭＰＩＦ−１タンパク質または成熟形態のいずれかのカルボキシ末端から
欠失され得る。さらに、上記アミノ末端の欠失およびカルボキシ末端の欠失の任
意の組み合わせが好ましい。同様に、これらのポリペプチドフラグメントをコー
ドスルポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０１６８】 当該分野で知られるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプ
チドの配列と比較することにより決定される。
【０１６９】 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡ（Ａ
ＴＣＣ ７５６７６）の核酸配列または図１〜２０Ａに示された核酸配列（配列
番号１または６）に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一である配列を有する大量の核酸分子が、「ＭＰＩＦ−１タンパク質
活性を有する」ポリペプチドをコードすると即時に認識する。実際、これらのヌ
クレオチド配列の縮重改変体は全て同じポリペプチドをコードしているので、こ
れは、上記の比較アッセイを行わなくても当業者に明らかである。縮重改変体で
ないこのような核酸分子については、妥当な数もＭＰＩＦ−１タンパク質活性を
有するポリペプチドをコードしていることがさらに当該分野で認識される。これ
は、以下にさらに記載されるように、当業者が、タンパク質機能に顕著に影響す
る可能性が低いかまたは影響しないようであるアミノ酸置換（例えば、ある脂肪
族アミノ酸と別の脂肪族アミノ酸との置換）を十分に理解しているからである。
【０１７０】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば配列番号２に対して、
または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配
列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュー
タープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対
象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列としても参照される）を
決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏ
ｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤ
Ｂコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い
合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方と
もアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同
一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパ
ラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔ
ｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄ
ｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒ
ｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝
５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚ
ｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１７１】 対象配列が、−末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列の−末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。−末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列の−末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列の−末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ
末端およびＣ末端残基の外側に位置する。
【０１７２】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列の−末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１７３】 好ましくは、上記のプログラムは、本発明のポリペプチドおよび第２の配列を
整列させるために使用され、そして％同一性は、手動で算出される。％同一性は
、参照配列中のアミノ酸の総数で除算され、１００を乗算された、２つの配列間
で同一である個々のアミノ酸の数である。例えば、第２の配列に対する配列番号
２のアミノ酸１〜１００の％同一性を決定するために、アミノ酸ミスマッチの数
（すなわち、点変異：挿入、欠失および置換）が計数され、そして１００（参照
配列中のアミノ酸の数）から減算されて、同一なアミノ酸の数を得る。得られた
数を１００で除算し、次いで１００％を乗算する。配列番号２の１位、５位、２
１〜２３位、４１位および９６〜１００位においてミスマッチ（すなわち、この
アミノ酸の点変異：挿入、欠失および置換）が存在する場合、％同一性は、９０
％である（１＋１＋３＋１＋４＝１０。１００−１０＝９０。９０／１００＝０
．９。０．９×１００＝９０％）。
【０１７４】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は
、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら，「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇ
ｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４７．１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは変
化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーが
あることを指摘する。
【０１７５】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。
【０１７６】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の各残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（
１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され得る
。
【０１７７】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。
【０１７８】 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により対応
する全長ポリペプチドを生成するために使用され得る；従って、このフラグメン
トは、全長ポリペプチドを生成ために中間体として使用され得る。本発明のポリ
ヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。
【０１７９】 小胞体の管腔へ、細胞膜周辺腔へ、および細胞外環境への翻訳されたタンパク
質の分泌について、適切な分泌シグナルは、発現されたポリペプチドへ導入され
得る。このシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であるか、またはこれらは
、異種シグナルであり得る。
【０１８０】 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能性領域もまた含み得る。例えば、
さらなるアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域は、精製の間、または連続した操
作および保存の間に、宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、
ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、精製を容易にするためにペプチド
部分がポリペプチドに付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調
製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善
するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加
は、当該分野で公知であり、そして慣用的な技術である。好ましい融合タンパク
質は、水溶性タンパク質に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば
、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願第２０４５８６９号）は、別
のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種
々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦ
ｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改
善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。一方、い
くつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され
、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失し得ることが望ましい。こ
れは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用に対して障害となると判明する
場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）
である。薬物探索において、例えば、ｈＩＬ５−レセプターのようなヒトタンパ
ク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニン
グアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，ら、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２
−５８（１９９５）；およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎ，ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２７０巻，第１６号
：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。
【０１８１】 本発明のＭＰＩＦ−１タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール
沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロ
ースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチ
ンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され
、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰ
ＬＣ」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは以下を含む：天然
の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例
えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含
む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において用いられ
る宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよいし
、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドは
また、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変された開始メチオ
ニン残基を含み得る。
【０１８２】 （ＭＰＩＦ−１ポリペプチド改変体）ＭＰＩＦ−１ポリペプチドのいくつかの
アミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能に有意な影響を及ぼさずに改変し
得ることが、当該分野において認識される。配列におけるそのような相違が考慮
される場合、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存在することを覚えて
おくべきである。一般的に、類似の機能を果す残基が使用される限り、三次構造
を形成する残基を置換することは可能である。他の例において、タンパク質の非
重要な領域で変化が生じる場合、残基の型は、完全に重要でないかもしれない。
【０１８３】 従って、本発明はさらに、実質的にＭＰＩＦ−１欠失変異体活性を示す本発明
のＭＰＩＦ−１ポリぺプチドのバリエーションまたは以下に議論さえるタンパク
質部分のようなＭＰＩＦ−１タンパク質を含む。そのような変異体は、欠失、挿
入、反転、反復、および型置換（例えば、ある親水性残基の別のものへの置換（
しかし、概して、強い親水性から強い疎水性への置換でない））を含む。低荷電
アミノ酸または、そのような「中性」アミノ酸の置換は一般的に活性に対してほ
とんど影響を与えない。
【０１８４】 代表的に、以下のものが、保存的置換とみなされる；脂肪族アミノ酸Ａｌａ，
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間のあるものから別のものへの置換：ヒドロキシル
残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残
基ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、なら
びに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間の置換。
【０１８５】 荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸または中性アミノ酸での置換もまた、さら
に特に興味深い。これは、改善された特徴（例えば、より少ない凝集）を有する
タンパク質を生じ得る。凝集の防止は、非常に望ましい。タンパク質の凝集は、
凝集物が免疫原性であり得るため、活性を低下させるだけでなく、薬学的処方物
を調製する場合にもまた問題ともなり得る。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．
Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら
、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、
Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９３））。
【０１８６】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターに対するリガンドの結合の選択性
を変化させ得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２
６８（１９９３）は２つの公知のタイプのＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮ
Ｆ−αの選択的な結合を生じる特定の変異を記載する。
【０１８７】 上記で詳細に示したように、表現型的にサイレント（すなわち、機能的に有意
に有害な影響を有するようでない）であるようなアミノ酸変化に関連したさらな
るガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ
Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｔｏｌｅｒａｎｃ
ｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（表１を参照のこと）に見出され
得る。
【０１８８】 示されるように、変化は、好ましくは、マイナーな性質のものであり、例えば
タンパク質のフォールディングまたは活性に有意に影響を与えない保存的アミノ
酸置換である（表１を参照のこと）。
【０１８９】
【表１】 当然、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、上記に記載したものを含む多く
の因子に依存する。一般的に言うと、目的に応じて任意の所定のＭＰＩＦ−１ポ
リペプチドに対する置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、
５、または３より多くない。特定のＭＰＩＦ−１アミノ酸置換が以下に記載され
る。
【０１９０】 本発明のさらなる局面は、アミノ酸の置換を含む。特に関心のあることは、タ
ンパク質のホールディングに有意に影響しない保存的アミノ酸置換である。当業
者に公知の保存的アミノ酸置換の例は、上記の表１に示される。
【０１９１】 さらに特に関心のあることはまた、荷電アミノ酸の別の荷電アミノ酸または中
性アミノ酸との置換である。これは改善された特性（例えば凝集が少ない）を有
するタンパク質を生じ得る。凝集の妨害は、非常に望ましい。タンパク質の凝集
は、活性の減少を生じ得るだけでなく、薬学的処方物を調製する際にそれらが免
疫原性であるため問題である（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）、Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔ
ｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）、Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １
０：３１７−３７７（１９９３））。
【０１９２】 ＭＰＩＦ−１タンパク質は、天然の変異または人為的な１もしくはいくつかの
アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。図１（配列番号２）に示されるアミ
ノ酸配列のいくつかの好ましい変異体は、以下に記載される。（指定による（例
えば、Ａｌａ（２１）Ｍｅｔは、図１（配列番号２）の２１位におけるＡｌａが
Ｍｅｔにより置換されることが意図される。））
【０１９３】
【化１】 例えば、ＭＰＩＦ−１のアミノ酸レベルにおける部位指向性変化は、保存的ア
ミノ酸と有する特定のアミノ酸を置換することにより作製され得る。好ましい保
存的変異としては、以下が含まれる：Ｍｌ（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶ
で置換される）；Ｋ２（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｖ３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｓ４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｖ５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ａ６
（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｓ９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１
１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｍ１２（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｌ１３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｖ１４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される
）；Ｔ１５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ１６（Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇｌ８（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｓ１９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ２
０（Ｎで置換される）；Ａ２１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｒ２２（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｖ２３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、またはＭで置換される）；Ｔ２４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｋ２５（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｄ２６（Ｅで置換される）；
Ａ２７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ２８（Ｄで置換
される）；Ｔ２９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ３０
（Ｄで置換される）；Ｆ３１（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｍ３２（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｍ３３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
またはＶで置換される）；Ｓ３４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｋ３５（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｌ３６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ３８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｅ３９（Ｄで置換される）；Ｎ４０（Ｑで置換される）；Ｖ４２（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ４３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ４４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｄ４５（Ｅで置換される）；Ｒ４６（Ｈ、またはＫで置換され
る）；Ｆ４７（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｈ４８（Ｋ、またはＲで置換され
る）；Ａ４９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ５０（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ５１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ５２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｄ５３（Ｅで置換される）；１５６（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換される）；Ｓ５７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｙ５８（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｔ５９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ６１（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｓ６２（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｉ６３（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ６６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｌ６７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｌ６８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ６９（Ｄで置換
される）；Ｓ７０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｙ７１
（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｆ７２（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｅ７３
（Ｄで置換される）；Ｔ７４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｎ７５（Ｑで置換される）；Ｓ７６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｅ７７（Ｄで置換される）；Ｓ７９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換される）；Ｋ８０（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｇ８２（Ａ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ８３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭで置換される）；Ｉ８４（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｆ８５（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｌ８６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ８７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｋ８８（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｋ８９（Ｈ、またはＲ
で置換される）；Ｇ９０（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｒ９１（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｒ９２（Ｈ、またはＫで置換される）；
Ｆ９３（Ｗ、またはＹで置換される）；Ａ９５（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｎ９６（Ｑで置換される）；Ｓ９８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｄ９９（Ｅで置換される）；Ｋ１００（Ｈ、ま
たはＲで置換される）；Ｑ１０１（Ｎで置換される）；Ｖ１０２（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｑ１０３（Ｎで置換される）；Ｖ１０４
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｍ１０６（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｒ１０７（Ｈ、またはＫで置換される）
；Ｍ１０８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｌ１０９（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ１１０（Ｈ、またはＲで置
換される）；Ｌ１１１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｄ
１１２（Ｅで置換される）；Ｔ１１３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｒ１１４（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｉ１１５（Ａ、Ｇ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋｌ１６（Ｈ、またはＲで置換される）
；Ｔ１１７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ１１８（Ｈ
、またはＫで置換される）；Ｋｌ１９（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｎ１２０
（Ｑで置換される）。
【０１９４】 得られる構築物は、本明細書の全体にわたって記載される活性または機能、お
よび当該分野で公知の活性または機能について慣用的にスクリーニングされ得る
。好ましくは、得られる構築物は、増加および／または減少したＭＰＩＦ−１の
活性または機能を有するが、残存するＭＰＩＦ−１の活性または機能は維持され
る。より好ましくは、得られる構築物は、１つより多く増加および／または減少
したＭＰＩＦ−１の活性または機能を有するが、残存するＭＰＩＦ−１の活性ま
たは機能は維持される。
【０１９５】 保存的なアミノ酸置換に加えて、ＭＰＩＦ−１の改変体は、（ｉ）１つ以上の
非保存的なアミノ酸残基での置換（ここで、置換されるアミノ酸残基は、遺伝コ
ードによってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくて
もよい）、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、ま
たは（ｉｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可
溶性を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポ
リぺプチドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧＦｃ融合
領域ペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列
）とのポリぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書
中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１９６】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むＭＰＩＦ−１ポリぺプチド改変体は、改善された特性（
例えば、より少ない凝集性）を有するポリペプチドを生成し得る。薬学的処方物
の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増
加の両方をもたらす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ１０：３０７−３
７７（１９９３））。
【０１９７】 例えば、ＭＰＩＦ−１の好ましい非保存的な置換として、以下が挙げられる：
Ｍｌ（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｋ２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｖ３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｓ４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｌ
１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｍ１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｌ１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｖ１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｔ１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ａ１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｌ１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｇ１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２１（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ２２
（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｖ２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｔ２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｋ２５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ａ２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｅ２８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ３０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ
３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｍ３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｍ３３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３６（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３７（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ま
たはＣで置換される）；Ｌ３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｅ３９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｐ４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｖ４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ４５（Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｒ４６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ４８（Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ａ４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｔ５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｓ５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ａ５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｄ５３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで
置換される）；Ｃ５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｉ５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ５７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ５８（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｔ５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｐ６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｒ６１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ６２
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；１
６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｐ６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｃ６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｓ６６
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ
６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｌ６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｅ６９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ７２（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｅ７３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｓ７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｅ７７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ７８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｓ７９
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ
８０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｐ８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｇ８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ８３（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；１８４（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ８５
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｌ８６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｔ８７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｋ８８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ８９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｇ９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｒ９１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ９２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｃ９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ａ９５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ
９７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｓ９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ９９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１００（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｑ１０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｖ１０４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｃ１０５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｍ１０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１０７（Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｍ１０８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｌ１０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｋ１１０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ１１２（Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｔ１１３（Ｄ、Ｂ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｒ１１４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、５、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ１１５（Ｄ、Ｂ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１１６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｔ１１７（Ｄ、Ｂ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；ＲＩ１８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；ＫＩ１９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ．またはＣで置換される）；Ｎ１２０（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌで置換される）。
【０１９８】 得られる構築物は、本明細書の全体にわたって記載された、および当該分野に
おいて公知の活性または機能を慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、
得られる構築物は、残存しているＭＰＩＦ−１活性またはＭＰＩＦ−１機能が維
持される一方、増加および／または減少されたＭＰＩＦ−１活性またはＭＰＩＦ
−１機能を有する。より好ましくは、得られる構築物は、１つより多く増加およ
び／または減少したＭＰＩＦ−１の活性または機能を有するが、残存するＭＰＩ
Ｆ−１の活性または機能は維持される。
【０１９９】 さらに、１つより多くのアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９
および１０）を、上記されたような代わりのアミノ酸（保存されたアミノ酸か、
または保存されていないアミノ酸のどちらか）で置換し得る。置換されたアミノ
酸は、ＭＰＩＦ−１タンパク質の全長形態、成熟形態、またはプロタンパク質形
態ならびに以下に列挙された一般式ｍ−ｎを有するＮ末端欠失変異体およびＣ末
端欠失変異体内に存在し得る。
【０２００】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
個のアミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０個のアミノ酸置換を超
えず、なおより好ましくは、３０個のアミノ酸置換を超えず、そしてなおさらに
より好ましくは、２０個のアミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有するＭＰＩ
Ｆ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。当然、好まし
さの増大する順番に、ポリペプチドが、少なくとも１個のアミノ酸置換を含むが
、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を超えな
いＭＰＩＦ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することは
非常に好ましい。特定の実施形態において、図１のアミノ酸配列またはそのフラ
グメント（例えば、本明細書に記載の成熟形態および／または他のフラグメント
）における付加、置換、および／または欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２
５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が
好ましい。
【０２０１】 上記のように、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、配列番号２、配列番号７のアミ
ノ酸配列または１以上のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を除く寄託されたｃＤ
ＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる
。また上記のように、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、配列番号２、配列番号７ま
たは寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるポリペプチドに対して、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一であり得る。１つの実施形態では、このようなポリペプチド改変
体はまた、ＭＰＩＦ−１またはそれらの少なくとも１つの領域と同じかまたは実
質的に同じ構造を有する。例えば、この構造は、ＮＭＲにより決定されるような
溶液構造であり得る（実施例３７を参照のこと）。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０２０２】 例えば、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、１つまたはいくつかのアミノ酸変化（
置換、欠失または付加）を含み得るが、特定の残基または位置における変化は含
まない。置換、欠失または付加が除かれ得る位置は、以下のような４つのＣｙｓ
残基保存残基を含む：配列番号２のＣｙｓ−５４（実施例３７におけるＣｙｓ−
１１）、Ｃｙｓ−５５（実施例３７におけるＣｙｓ−１２）、Ｃｙｓ−７８（実
施例３７におけるＣｙｓ−３５）、およびＣｙｓ−９４（実施例３７におけるＣ
ｙｓ−５１）。保存された残基はまた、以下のにおける２つのＣｙｓ残基を含む
：配列番号２のＣｙｓ−６５（実施例３７におけるＣｙｓ−２２）およびＣｙｓ
−１０５（実施例３７におけるＣｙｓ−６２）。これらの位置のいずれか１つま
たは組み合わせは、置換、欠失または付加から除かれ得る。好ましくは、ＭＰＩ
Ｆ−１改変体は、ＭＰＩＦ−１の６つの各Ｃｙｓ残基を除いて、置換、欠失また
は付加を含む。
【０２０３】 変更されることから除かれる得るさらなる残基としては、以下の保存的に置換
された残基が挙げられる：配列番号２のＩｌｅ−５６（実施例３７におけるＩｌ
ｅ−１３）、Ｔｙｒ−５８（実施例３７におけるＴｙｒ１５）、Ａｒｇ−６１（
実施例３７におけるＡｒｇ−１８）およびＩｌｅ−６３（実施例３７におけるＩ
ｌｅ−２０）。これらの位置のいずれか１つまたは組み合わせは、置換、欠失ま
たは付加されているものから除かれ得る。好ましくは、改変体は、これらの残基
を除く、置換、欠失または付加されることから除かれ得る。あるいは、このよう
な保存的に置換されたさらなる残基は、保存的置換により変更され得る。
【０２０４】 変更されることから除かれ得るさらなる残基としては、例えば、以下の保存的
に置換された残基が挙げられる：配列番号２のＩｌｅ−５６（実施例３７におけ
るＩｌｅ−１３）、Ｔｙｒ−５８（実施例３７におけるＴｙｒ１５）、Ａｒｇ−
６１（実施例３７におけるＡｒｇ−１８）、Ｔｈｒ−７４（実施例３７における
Ｔｈｒ−３１）およびＴｈｒ−８７（実施例３７におけるＴｈｒ−４４）。これ
らの位置のいずれか１つまたは組み合わせは、置換、欠失または付加されている
ことから除かれ得る。好ましくは、改変体は、これらの各残基を除く、置換、欠
失または付加されることから除かれ得る。あるいは、このような保存的に置換さ
れたさらなる残基は、保存的置換により変更され得る。
【０２０５】 変更されることから除かれ得るさらなる残基としては、例えば、以下の保存的
に置換された残基が挙げられる：配列番号２のＩｌｅ−５６（実施例３７におけ
るＩｌｅ−１３）、Ｔｙｒ−５８（実施例３７におけるＴｙｒ１５）、Ａｒｇ−
６１（実施例３７におけるＡｒｇ−１８）、Ｉｌｅ−６３（実施例３７における
Ｉｌｅ−２０）、Ｔｈｒ−７４（実施例３７におけるＴｈｒ３１）およびＴｈｒ
−８７（実施例３７におけるＴｈｒ−４４）。これらの位置のいずれか１つまた
は組み合わせは、置換、欠失または付加されているものから除かれ得る。好まし
くは、改変体は、これらの各残基を除いて、置換、欠失または付加を含む。ある
いは、このような保存的に置換されたさらなる残基は、保存的置換により変更さ
れ得る。
【０２０６】 保存的に置換された残基としてはまた、例えば、以下の保存的に置換された残
基が挙げられる：配列番号２のＩｌｅ−６３（実施例３７におけるＩｌｅ−２０
），Ｌｅｕ−６８（実施例３７におけるＬｅｕ−２５）、Ｔｙｒ−７１（実施例
３７におけるＴｙｒ−２８）、Ｐｈｅ−７２（実施例３７におけるＰｈｅ−２９
）、Ｖａｌ−８３（実施例３７におけるＶａｌ−４０）、Ｉｌｅ−８４（実施例
３７におけるＩｌｅ−４１）、Ｐｈｅ−８５（実施例３７におけるＰｈｅ−４２
）、Ｐｈｅ−９３（実施例３７におけるＰｈｅ−５０）、Ａｌａ−９５（実施例
３７におけるＡｌａ−５２）、Ｖａｌ−１０２（実施例３７におけるＶａｌ−５
９）、Ｍｅｔ−１０６（実施例３７におけるＭｅｔ−６３）およびＬｅｕ−１０
９（実施例３７におけるＬｅｕ−６６）。これらの位置のいずれか１つまたは組
み合わせは、置換、欠失または付加されることから除かれ得る。好ましくは、Ｍ
ＰＩＦ−１改変体は、これらの残基を除いて、置換、欠失または付加を含む。あ
るいは、このような保存的に置換されたさらなる残基は、保存的置換により変更
され得る。
【０２０７】 保存的に置換されたさらなる残基としては、例えば、以下が挙げられる：配列
番号２のＩｌｅ−５６（実施例３７におけるＩｌｅ−１３）、Ａｒｇ−６１（実
施例３７におけるＡｒｇ−１８）、Ｔｙｒ−５８（実施例３７におけるＴｙｒ−
１５）、Ｔｈｒ−７４（実施例３７におけるＴｈｒ−３１）およびＧｌｙ−８２
（実施例３７におけるＧｌｙ−３９）。これらの位置のいずれか１つまたは組み
合わせは、置換、欠失または付加されることから除かれ得る。好ましくは、ＭＰ
ＩＦ−１改変体は、これらの残基を除いて、置換、欠失または付加を含む。ある
いは、このような保存的に置換されたさらなる残基は、保存的置換により変更さ
れ得る。
【０２０８】 なおさらなる保存的に置換された残基としてはまた、例えば、以下が挙げられ
る：配列番号２のＰｒｏ−６４（実施例３７におけるＰｒｏ２１）およびＰｒｏ
−９７（実施例３７におけるＰｒｏ−５４）。これらの位置のいずれか１つまた
は組み合わせは、置換、欠失または付加されることから除かれ得る。好ましくは
、ＭＰＩＦ−１改変体は、これらの残基を除いて、置換、欠失または付加を含む
。あるいは、このような保存的に置換されたさらなる残基は、保存的置換により
変更され得る。
【０２０９】 なおさらなる保存的に置換された残基としては、例えば、以下の保存的に置換
された残基が挙げられる：配列番号２のＧｌｎ−１０１（実施例３７におけるＧ
ｌｎ−５８）。この残基は、置換、欠失または付加されていることから除かれ得
る。好ましくは、この残基は、保存的に置換される。より好ましくは、この残基
は、バルキーな側鎖を欠くアミノ酸で置換される。従って、この残基は、好まし
くは、例えば、Ｔｒｐ以外のアミノ酸で置換される。
【０２１０】 なおさらなる保存的に置換された残基としては、例えば、以下の保存的に置換
された残基が挙げられる：配列番号２のＡｒｇ−６１（実施例３７におけるＡｒ
ｇ１８）、Ｌｙｓ−８８（実施例３７におけるＬｙｓ−４５）およびＡｒｇ−９
１（実施例３７におけるＡｒｇ−４８）。これらの位置のいずれか１つまたは組
み合わせは、置換、欠失または付加されることから除かれ得る。好ましくは、Ｍ
ＰＩＦ−１改変体は、これらの残基を除いて、置換、欠失または付加を含む。あ
るいは、このような保存的に置換されたさらなる残基は、保存的置換により変更
され得る。
【０２１１】 なおさらなる保存的に置換された残基としてはまた、例えば、以下の保存的に
置換された残基が挙げられる：配列番号２のＬｙｓ−８９（実施例３７における
Ｌｙｓ４６）、Ｌｙｓ−１００（実施例３７におけるＬｙｓ−５７）、Ａｒｇ−
１０７（実施例３７におけるＡｒｇ−６４）およびＬｙｓ−１１０（実施例３７
におけるＬｙｓ−６７）。これらの位置のいずれか１つまたは組み合わせは、置
換、欠失または付加されているものから除かれ得る。好ましくは、ＭＰＩＦ−１
改変体は、置換、欠失または付加されることから除かれ得る。好ましくは、改変
体は、これらの残基を除く、置換、欠失または付加されることから除かれ得る。
あるいは、このような保存的に置換されたさらなる残基は、保存的置換により変
更され得る。
【０２１２】 上記のさらに好ましい実施形態に加えて、保存された残基および保存的に置換
された残基の好ましい組み合わせとしては、配列番号２のＴｈｒ−７４（実施例
３７におけるＴｈｒ−３１）、Ｇｌｙ−８２（実施例３７におけるＧｌｙ−３９
）、Ｔｙｒ−５８（実施例３７におけるＴｙｒ−１５）、Ｃｙｓ−５４（実施例
３７におけるＣｙｓ−１１）、Ｃｙｓ−５５（実施例３７におけるＣｙｓ−１２
）およびＣｙｓ−９４（実施例３７におけるＣｙｓ−５１）が挙げられる。好ま
しくは、ＭＰＩＦ−１改変体は、置換、欠失または付加されることから除かれ得
る。好ましくは、改変体は、これらの残基を除く、置換、欠失または付加される
ことから除かれ得る。あるいは、このような保存的に置換されたさらなる残基は
、保存的置換により変更され得る。
【０２１３】 好ましくは、ＭＰＩＦ−１改変体は、上記保存的に置換された残基の少なくと
も１つまたは全てを除くアミノ酸変化を含む。あるいは、上記の保存的に置換さ
れた残基の少なくとも１つまたは全ては、保存的置換により変更され得る。
【０２１４】 好ましくは、ＭＰＩＦ−１改変体は、上記保存された残基の少なくとも１つま
たは全て（すなわち、１以上のＣｙｓ残基）および保存的に置換された残基の少
なくとも１つまたは全て（すなわち、残りの上記残基の１以上）を除くアミノ酸
変更を含む。あるいは、保存的に置換された残基の少なくとも１つまたは全ては
、保存的置換により変更され得る、 （ＭＰＩＦ−１スプライス改変体）さらに、ＭＰＩＦ−１の改変体が、同定さ
れ、そして特徴付けられた。これらのアナログのいくつかは、アミノ末端短縮を
含む。さらに、明らかに選択的スプライス部位から生じるＭＰＩＦ−１アナログ
が、同定され、そして特徴付けられてきた（図２０（配列番号７））。実施例１
１は、これらのＭＰＩＦ−１アナログの生物学的活性を開示する。これらのアナ
ログの配列は、図１９（配列番号３、４および５、ならびに配列番号２中のアミ
ノ酸残基４６〜１２０、４５〜１２０、４８〜１２０、４９〜１２０、３９〜１
２０、および４４〜１２０）に示される 別の局面において、本発明は、ＭＰＩＦ−１の１３７アミノ酸スプライス改変
体におけるアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号７に示された保存的アミノ酸
置換としては、以下が挙げられる：Ｍ１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで
置換される）；Ｋ２（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｖ３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｓ４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｖ５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ａ６（
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｓ９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１１
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｍ１２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｌ１３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換される）；Ｖ１４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）
；Ｔ１５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ１６（Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｇ１８（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｓ１９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ２０
（Ｎで置換される）；Ａ２１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｒ２２（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｖ２３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
またはＭで置換される）；Ｔ２４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｋ２５（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｄ２６（Ｅで置換される）；Ａ
２７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ２８（Ｄで置換さ
れる）；Ｔ２９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ３０（
Ｄで置換される）；Ｆ３１（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｍ３２（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｍ３３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ま
たはＶで置換される）；Ｓ３４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｋ３５（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｌ３６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｌ３８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｅ３９（Ｄで置換される）；Ｎ４０（Ｑで置換される）；Ｖ４２（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ４３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ４４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｄ４５（Ｅで置換される）；Ｍ４６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
またはＶで置換される）；Ｌ４７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｗ４８（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｒ４９（Ｈ、またはＫで置換さ
れる）；Ｒ５０（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｋ５１（Ｈ、またはＲで置換さ
れる）；Ｉ５２（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ５３（
Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ５５（Ｎで置換される）
；Ｍ５６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｔ５７（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ５８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｓ５９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｈ６０（Ｋ、またはＲで置換される）；Ａ６１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ６２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｇ６３（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ
６４（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｈ６５（Ｋ、またはＲで置換される）；Ａ
６６（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ６７（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ６８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ａ６９（Ｇ、１、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｄ７０（Ｅで置換される）；Ｉ７３（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｓ７４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｙ７５（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｔ７６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｒ７８（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｓ７９（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｉ８０（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換される）；Ｓ８３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｌ８４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ８５（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ８６（Ｄで置換される）
；Ｓ８７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｙ８８（Ｆ、ま
たはＷで置換される）；Ｆ８９（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｅ９０（Ｄで置
換される）；Ｔ９１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｎ９
２（Ｑで置換される）；Ｓ９３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｅ９４（Ｄで置換される）；Ｓ９６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｋ９７（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｇ９９（Ａ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ１００（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ま
たはＭで置換される）；Ｉ１０１（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｆ１０２（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｌ１０３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ１０４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、または
Ｖで置換される）；Ｋ１０５（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｋ１０６（Ｈ、ま
たはＲで置換される）；Ｇ１０７（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｒ１０８（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｒ１０９（Ｈ、またはＫで置
換される）；Ｆ１１０（Ｗ、またはＹで置換される）；Ａ１１２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｎ１１３（Ｑで置換される）；Ｓ１１５
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｄ１１６（Ｅで置換され
る）；Ｋ１１７（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｑ１１８（Ｎで置換される）；
Ｖ１１９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｑ１２０（Ｎで
置換される）；Ｖ１２１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；
Ｍ１２３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｒ１２４（Ｈ、
またはＫで置換される）；Ｍ１２５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換
される）；Ｌ１２６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ１
２７（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｌ１２８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｄ１２９（Ｅで置換される）；Ｔ１３０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ１３１（Ｈ、またはＫで置換される）；
Ｉ１３２（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ１３３（Ｈ、
またはＲで置換される）；Ｔ１３４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｒ１３５（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｋ１３６（Ｈ、またはＲで
置換される）；および／またはＮ１３７（Ｑで置換される）。
【０２１５】 例えば、配列番号７に示された１３７アミノ酸スプライス改変体における非保
存的な置換としては、以下が挙げられる：Ｍｌ（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ３（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ４（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ５（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ６
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ
７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｌ８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｓ９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｃ１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｌ１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１６（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１７（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ１８（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｑ２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ２２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２３（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２５（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｄ２６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ２８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｔ２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｅ３０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ３２（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ３３（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３
４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｋ３５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｌ３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｌ３８（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ３９（
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｎ４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換さ
れる）；Ｖ４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｌ４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｌ４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｄ４５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ４８（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｒ４９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ５０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ５１（Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；１５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｇ５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｐ５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｑ５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｍ５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｔ５７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｌ５８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｓ５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｈ６０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ６１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ６４（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｈ６５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ７０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｃ７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｃ７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；１７
３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｓ７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｙ７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ７７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｒ７８（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｓ７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；１８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｐ８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｃ８２（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰ
で置換される）；Ｓ８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｌ８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｌ８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ８６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ８７（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ８８（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｆ８９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ９０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ９１（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ９
２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｓ９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ９４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ９５（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰ
で置換される）；Ｓ９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｋ９７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される
）；Ｇ９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｖ１００（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｉ１０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｆ１０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１０４（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１０５（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｋ１０６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ１０７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１０８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ
１０９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｆ１１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ１１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置
換される）；Ａ１１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｎ１１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換
される）；Ｓ１１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｄ１１６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１１７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｑ１１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１２
１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｃ１２２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｍ１２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１２４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ１２
５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｌ１２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｋ１２７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１２８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ１２９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１
３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｒ１３１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；１１３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１３３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１３４（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１３
５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｋ１３６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；および／またはＮ１３７（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）。
【０２１６】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチドの特徴を改善するかまたは変更するために、タンパ
ク質操作が使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術が、新規のタンパク
質を作製するために使用され得る。ムテインおよび欠失または融合タンパク質は
、例えば、活性の増強または安定性の改善を示し得る。さらに、これらは高収率
で精製され得、そして、少なくとも特定の精製および貯蔵条件下で、優れた可溶
性を示し得る。以下に示されるのは、構築され得る変異のさらなる例である。
【０２１７】 ＭＰＩＦ−１アミノ末端およびカルボキシ末端欠失：インターフェロンγは、
このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後
、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ ２６８（４）：２９８４−２９８８（１９９３）は、３、８、または２
７アミノ末端アミノ酸残基が不足する場合でさえ、ヘアピン結合活性を有する改
変されたＫＧＦタンパク質を報告する。多数の他の例が、当業者に公知である。
【０２１８】 特に、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−１２０によって
記載され得、ここで、ｍは２〜１１５の整数であって、ｍは配列番号２に同定さ
れるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに詳細には、本発明は、配列番号２に
示された以下の残基のアミノ酸配列を含むか、または代替的にはそれらからなる
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：Ｋ−２〜Ｎ−１２０；
Ｖ−３〜Ｎ−１２０；Ｓ−４〜Ｎ−１２０；Ｖ−５〜Ｎ−１２０；Ａ−６〜Ｎ−
１２０；Ａ−７〜Ｎ−１２０；Ｌ−８〜Ｎ−１２０；Ｓ−９〜Ｎ−１２０；Ｃ−
１０〜Ｎ−１２０；Ｌ−１１〜Ｎ−１２０；Ｍ−１２〜Ｎ−１２０；Ｌ−１３〜
Ｎ−１２０；Ｖ−１４〜Ｎ−１２０；Ｔ−１５〜Ｎ−１２０；Ａ−１６〜Ｎ−１
２０；Ｌ−１７〜Ｎ−１２０；Ｇ−１８〜Ｎ−１２０；Ｓ−１９〜Ｎ−１２０；
Ｑ−２０〜Ｎ−１２０；Ａ−２１〜Ｎ−１２０；Ｒ−２２〜Ｎ−１２０；Ｖ−２
３〜Ｎ−１２０；Ｔ−２４〜Ｎ−１２０；Ｋ−２５〜Ｎ−１２０；Ｄ−２６〜Ｎ
−１２０；Ａ−２７〜Ｎ−１２０；Ｅ−２８〜Ｎ−１２０；Ｔ−２９〜Ｎ−１２
０；Ｅ−３０〜Ｎ−１２０；Ｆ−３１〜Ｎ−１２０；Ｍ−３２〜Ｎ−１２０；Ｍ
−３３〜Ｎ−１２０；Ｓ−３４〜Ｎ−１２０；Ｋ−３５〜Ｎ−１２０；Ｌ−３６
〜Ｎ−１２０；Ｐ−３７〜Ｎ−１２０；Ｌ−３８〜Ｎ−１２０；Ｅ−３９〜Ｎ−
１２０；Ｎ−４０〜Ｎ−１２０；Ｐ−４１〜Ｎ−１２０；Ｖ−４２〜Ｎ−１２０
；Ｌ−４３〜Ｎ−１２０；Ｌ−４４〜Ｎ−１２０；Ｄ−４５〜Ｎ−１２０；Ｒ−
４６〜Ｎ−１２０；Ｆ−４７〜Ｎ−１２０；Ｈ−４８〜Ｎ−１２０；Ａ−４９〜
Ｎ−１２０；Ｔ−５０〜Ｎ−１２０；Ｓ−５１〜Ｎ−１２０；Ａ−５２〜Ｎ−１
２０；Ｄ−５３〜Ｎ−１２０；Ｃ−５４〜Ｎ−１２０；Ｃ−５５〜Ｎ−１２０；
Ｉ−５６〜Ｎ−１２０；Ｓ−５７〜Ｎ−１２０；Ｙ−５８〜Ｎ−１２０；Ｔ−５
９〜Ｎ−１２０；Ｐ−６０〜Ｎ−１２０；Ｒ−６１〜Ｎ−１２０；Ｓ−６２〜Ｎ
−１２０；Ｉ−６３〜Ｎ−１２０；Ｐ−６４〜Ｎ−１２０；Ｃ−６５〜Ｎ−１２
０；Ｓ−６６〜Ｎ−１２０；Ｌ−６７〜Ｎ−１２０；Ｌ−６８〜Ｎ−１２０；Ｅ
−６９〜Ｎ−１２０；Ｓ−７０〜Ｎ−１２０；Ｙ−７１〜Ｎ−１２０；Ｆ−７２
〜Ｎ−１２０；Ｅ−７３〜Ｎ−１２０；Ｔ−７４〜Ｎ−１２０；Ｎ−７５〜Ｎ−
１２０；Ｓ−７６〜Ｎ−１２０；Ｅ−７７〜Ｎ−１２０；Ｃ−７８〜Ｎ−１２０
；Ｓ−７９〜Ｎ−１２０；Ｋ−８０〜Ｎ−１２０；Ｐ−８１〜Ｎ−１２０；Ｇ−
８２〜Ｎ−１２０；Ｖ−８３〜Ｎ−１２０；Ｉ−８４〜Ｎ−１２０；Ｆ−８５〜
Ｎ−１２０；Ｌ−８６〜Ｎ−１２０；Ｔ−８７〜Ｎ−１２０；Ｋ−８８〜Ｎ−１
２０；Ｋ−８９〜Ｎ−１２０；Ｇ−９０〜Ｎ−１２０；Ｒ−９１〜Ｎ−１２０；
Ｒ−９２〜Ｎ−１２０；Ｆ−９３〜Ｎ−１２０；Ｃ−９４〜Ｎ−１２０；Ａ−９
５〜Ｎ−１２０；Ｎ−９６〜Ｎ−１２０；Ｐ−９７〜Ｎ−１２０；Ｓ−９８〜Ｎ
−１２０；Ｄ−９９〜Ｎ−１２０；Ｋ−１００〜Ｎ−１２０；Ｑ−１０１〜Ｎ−
１２０；Ｖ−１０２〜Ｎ−１２０；Ｑ−１０３〜Ｎ−１２０；Ｖ−１０４〜Ｎ−
１２０；Ｃ−１０５〜Ｎ−１２０；Ｍ−１０６〜Ｎ−１２０；Ｒ−１０７〜Ｎ−
１２０；Ｍ−１０８〜Ｎ−１２０；Ｌ−１０９〜Ｎ−１２０；Ｋ−１１０〜Ｎ−
１２０；Ｌ−ｌｌｌ〜Ｎ−１２０；Ｄ−１１２〜Ｎ−１２０；Ｔ−１１３〜Ｎ−
１２０；Ｒ−１１４〜Ｎ−１２０；Ｉ−１１５〜Ｎ−１２０。これらのポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって含まれる。
【０２１９】 また上記のように、タンパク質のＣ末端由来の１つ以上のアミノ酸の欠失が、
タンパク質の１つ以上の生物学的機能を喪失の改変を生じる場合でさえ、他の生
物学的機能（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、ＭＰＩＦ−１レセプタ
ーを結合する能力）が、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全形態ま
たは成熟形態を認識する抗体を誘導するそして／または結合する短縮されたＭＰ
ＩＦ−１ムテインの能力は、完全または成熟ポリペプチドの大部分未満の残基が
Ｃ末端から除去される場合、一般的に保持される。完全ポリペプチドのＣ末端残
基を欠失する特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否か
は、本明細書中に記載の慣例的な方法および他の当該分野で公知の方法によって
、容易に決定され得る。大多数のＣ末端アミノ酸残基が欠失したＭＰＩＦ−１ム
テインは、いくらかの生物学的または免疫学的活性を保持し得る。実際、たった
６つのＭＰＩＦアミノ酸残基から構成されるペプチドが、しばしば、免疫応答を
誘起し得る。
【０２２０】 従って、本発明は、一般式１−ｎ（ここで、ｎは６〜１１９の整数であり、配
列番号２に同定されるアミノ酸残基の位置に対応する）によって記載されるよう
に、図１（配列番号２）に示されるＭＰＩＦ−１ポリペプチドのアミノ酸配列の
カルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドをさらに提供する。
より詳細には、本発明は、配列番号２に示される以下の残基のアミノ酸配列を含
むかまたは代替的にはそれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを提供する：Ａ−２７〜Ｋ−１１９；Ａ−２７〜Ｒ−１１８；Ａ−２７〜Ｔ−
１１７；Ａ−２７〜Ｋ−１１６；Ａ−２７〜Ｉ−１１５；Ａ−２７〜Ｒ−１１４
；Ａ−２７〜Ｔ−１１３；Ａ−２７〜Ｄ−１１２；Ａ−２７〜Ｌ−１１１；Ａ−
２７〜Ｋ−１１０；Ａ−２７〜Ｌ−１０９；Ａ−２７〜Ｍ−１０８；Ａ−２７〜
Ｒ−１０７；Ａ−２７〜Ｍ−１０６；Ａ−２７〜Ｃ−１０５；Ａ−２７〜Ｖ−１
０４；Ａ−２７〜Ｑ−１０３；Ａ−２７〜Ｖ−１０２；Ａ−２７〜Ｑ−１０１；
Ａ−２７〜Ｋ−１００；Ａ−２７〜Ｄ−９９；Ａ−２７〜Ｓ−９８；Ａ−２７〜
Ｐ−９７；Ａ−２７〜Ｎ−９６；Ａ−２７〜Ａ−９５；Ａ−２７〜Ｃ−９４；Ａ
−２７〜Ｆ−９３；Ａ−２７〜Ｒ−９２；Ａ−２７〜Ｒ−９１；Ａ−２７〜Ｇ−
９０；Ａ−２７〜Ｋ−８９；Ａ−２７〜Ｋ−８８；Ａ−２７〜Ｔ−８７；Ａ−２
７〜Ｌ−８６；Ａ−２７〜Ｆ−８５；Ａ−２７〜Ｉ−８４；Ａ−２７〜Ｖ−８３
；Ａ−２７〜Ｇ−８２；Ａ−２７〜Ｐ−８１；Ａ−２７〜Ｋ−８０；Ａ−２７〜
Ｓ−７９；Ａ−２７〜Ｃ−７８；Ａ−２７〜Ｅ−７７；Ａ−２７〜Ｓ−７６；Ａ
−２７〜Ｎ−７５；Ａ−２７〜Ｔ−７４；Ａ−２７〜Ｅ−７３；Ａ−２７〜Ｆ−
７２；Ａ−２７〜Ｙ−７１；Ａ−２７〜Ｓ−７０；Ａ−２７〜Ｅ−６９；Ａ−２
７〜Ｌ−６８；Ａ−２７〜Ｌ−６７；Ａ−２７〜Ｓ−６６；Ａ−２７〜Ｃ−６５
；Ａ−２７〜Ｐ−６４；Ａ−２７〜Ｉ−６３；Ａ−２７〜Ｓ−６２；Ａ−２７〜
Ｒ−６１；Ａ−２７〜Ｐ−６０；Ａ−２７〜Ｔ−５９；Ａ−２７〜Ｙ−５８；Ａ
−２７〜Ｓ−５７；Ａ−２７〜Ｉ−５６；Ａ−２７〜Ｃ−５５；Ａ−２７〜Ｃ−
５４；Ａ−２７〜Ｄ−５３；Ａ−２７〜Ａ−５２；Ａ−２７〜Ｓ−５１；Ａ−２
７〜Ｔ−５０；Ａ−２７〜Ａ−４９；Ａ−２７〜Ｈ−４８；Ａ−２７〜Ｆ−４７
；Ａ−２７〜Ｒ−４６；Ａ−２７〜Ｄ−４５；Ａ−２７〜Ｌ−４４；Ａ−２７〜
Ｌ−４３；Ａ−２７〜Ｖ−４２；Ａ−２７〜Ｐ−４１；Ａ−２７〜Ｎ−４０；Ａ
−２７〜Ｅ−３９；Ａ−２７〜Ｌ−３８；Ａ−２７〜Ｐ−３７；Ａ−２７〜Ｌ−
３６；Ａ−２７〜Ｋ−３５；Ａ−２７〜Ｓ−３４；Ａ−２７〜Ｍ−３３；Ａ−２
７〜Ｍ−３２；Ａ−２７〜Ｆ−３１；Ａ−２７〜Ｅ−３０；Ａ−２７〜Ｔ−２９
；Ａ−２７〜Ｅ−２８；Ｍ−１〜Ｄ−２６；Ｍ−１〜Ｋ−２５；Ｍ−１〜Ｔ−２
４；Ｍ−１〜Ｖ−２３；Ｍ−１〜Ｒ−２２；Ｍ−１〜Ａ−２１；Ｍ−１〜Ｑ−２
０；Ｍ−１〜Ｓ−１９；Ｍ−１〜Ｇ−１８；Ｍ−ｌ〜Ｌ−１７；Ｍ−１〜Ａ−１
６；Ｍ−１〜Ｔ−１５；Ｍ−１〜Ｖ−１４；Ｍ−１〜Ｌ−１３；Ｍ−１〜Ｍ−１
２；Ｍ−１〜Ｌ−ｌｌ；Ｍ−１〜Ｃ−１０；Ｍ−１〜Ｓ−９；Ｍ−１〜Ｌ−８；
Ｍ−１〜Ａ−７。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、
本発明によって含まれる。
【０２２１】 さらに、シグナル配列は、これらのＣ末端構築物に加えられ得る。例えば、配
列番号２のアミノ酸１〜２６、配列番号２のアミノ酸２〜２６、配列番号２のア
ミノ酸３〜２６、配列番号２のアミノ酸４〜２６、配列番号２のアミノ酸５〜２
６、配列番号２のアミノ酸６〜２６、配列番号２のアミノ酸７〜２６、配列番号
２のアミノ酸８〜２６、配列番号２のアミノ酸９〜２６、配列番号２のアミノ酸
１０〜２６、配列番号２のアミノ酸１１〜２６、配列番号２のアミノ酸１２〜２
６、配列番号２のアミノ酸１３〜２６、配列番号２のアミノ酸１４〜２６、配列
番号２のアミノ酸１５〜２６、配列番号２のアミノ酸１６〜２６、配列番号２の
アミノ酸１７〜２６、配列番号２のアミノ酸１８〜２６、配列番号２のアミノ酸
１９〜２６、配列番号２のアミノ酸２０〜２６、配列番号２のアミノ酸２１〜２
６、配列番号２のアミノ酸２２〜２６、配列番号２のアミノ酸２３〜２６、配列
番号２のアミノ酸２４〜２６、配列番号２のアミノ酸２５〜２６、配列番号２の
アミノ酸２６は、上記に列挙された各Ｃ末端構築物のＮ末端に付加され得る。
【０２２２】 さらに、上記に列挙されたＮ末端またはＣ末端欠失のいずれかが、Ｎ末端およ
びＣ末端欠失ＭＰＩＦ−１ポリペプチドを産生するために組み合わせられ得る。
本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方から１つ以上のアミノ
酸が欠失したポリペプチドを提供し、これは、配列番号２の残基ｍ−ｎを有する
ように一般的に記載され得、ここで、ｎおよびｍは上記のように整数である。こ
れらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって含ま
れる。
【０２２３】 さらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、以下の残基のアミノ酸配列を
含むか、または代替的にはそれらからなる：Ｍ−１〜Ｔ−１５；Ｋ−２〜Ａ−１
６；Ｖ−３〜Ｌ−１７；Ｓ−４〜Ｇ−１８；Ｖ−５〜Ｓ−１９；Ａ−６〜Ｑ−２
０；Ａ−７〜Ａ−２１；Ｌ−８〜Ｒ−２２；Ｓ−９〜Ｖ−２３；Ｃ−１０〜Ｔ−
２４；Ｌ−１１〜Ｋ−２５；Ｍ−１２〜Ｄ−２６；Ｌ−１３〜Ａ−２７；Ｖ−１
４〜Ｅ−２８；Ｔ−１５〜Ｔ−２９；Ａ−１６〜Ｅ−３０；Ｌ−１７〜Ｆ−３１
；Ｇ−１８〜Ｍ−３２；Ｓ−１９〜Ｍ−３３；Ｑ−２０〜Ｓ−３４；Ａ−２１〜
Ｋ−３５；Ｒ−２２〜Ｌ−３６；Ｖ−２３〜Ｐ−３７；Ｔ−２４〜Ｌ−３８；Ｋ
−２５〜Ｅ−３９；Ｄ−２６〜Ｎ−４０；Ａ−２７〜Ｐ−４１；Ｅ−２８〜Ｖ−
４２；Ｔ−２９〜Ｌ−４３；Ｅ−３０〜Ｌ−４４；Ｆ−３１〜Ｄ−４５；Ｍ−３
２〜Ｒ−４６；Ｍ−３３〜Ｆ−４７；Ｓ−３４〜Ｈ−４８；Ｋ−３５〜Ａ−４９
；Ｌ−３６〜Ｔ−５０；Ｐ−３７〜Ｓ−５１；Ｌ−３８〜Ａ−５２；Ｅ−３９〜
Ｄ−５３；Ｎ−４０〜Ｃ−５４；Ｐ−４１〜Ｃ−５５；Ｖ−４２〜Ｉ−５６；Ｌ
−４３〜Ｓ−５７；Ｌ−４４〜Ｙ−５８；Ｄ−４５〜Ｔ−５９；Ｒ−４６〜Ｐ−
６０；Ｆ−４７〜Ｒ−６１；Ｈ−４８〜Ｓ−６２；Ａ−４９〜Ｉ−６３；Ｔ−５
０〜Ｐ−６４；Ｓ−５１〜Ｃ−６５；Ａ−５２〜Ｓ−６６；Ｄ−５３〜Ｌ−６７
；Ｃ−５４〜Ｌ−６８；Ｃ−５５〜Ｅ−６９；Ｉ−５６〜Ｓ−７０；Ｓ−５７〜
Ｙ−７１；Ｙ−５８〜Ｆ−７２；Ｔ−５９〜Ｅ−７３；Ｐ−６０〜Ｔ−７４；Ｒ
−６１〜Ｎ−７５；Ｓ−６２〜Ｓ−７６；Ｉ−６３〜Ｅ−７７；Ｐ−６４〜Ｃ−
７８；Ｃ−６５〜Ｓ−７９；Ｓ−６６〜Ｋ−８０；Ｌ−６７〜Ｐ−８１；Ｌ−６
８〜Ｇ−８２；Ｅ−６９〜Ｖ−８３；Ｓ−７０〜Ｉ−８４；Ｙ−７１〜Ｆ−８５
；Ｆ−７２〜Ｌ−８６；Ｅ−７３〜Ｔ−８７；Ｔ−７４〜Ｋ−８８；Ｎ−７５〜
Ｋ−８９；Ｓ−７６〜Ｇ−９０；Ｅ−７７〜Ｒ−９１；Ｃ−７８〜Ｒ−９２；Ｓ
−７９〜Ｆ−９３；Ｋ−８０〜Ｃ−９４；Ｐ−８１〜Ａ−９５；Ｇ−８２〜Ｎ−
９６；Ｖ−８３〜Ｐ−９７；Ｉ−８４〜Ｓ−９８；Ｆ−８５〜Ｄ−９９；Ｌ−８
６〜Ｋ−１００；Ｔ−８７〜Ｑ−１０１；Ｋ−８８〜Ｖ−１０２；Ｋ−８９〜Ｑ
−１０３；Ｇ−９０〜Ｖ−１０４；Ｒ−９１〜Ｃ−１０５；Ｒ−９２〜Ｍ−１０
６；Ｆ−９３〜Ｒ−１０７；Ｃ−９４〜Ｍ−１０８；Ａ−９５〜Ｌ−１０９；Ｎ
−９６〜Ｋ−１１０；Ｐ−９７〜Ｌ−１１１；Ｓ−９８〜Ｄ−１１２；Ｄ−９９
〜Ｔ−１１３；Ｋ−１００〜Ｒ−１１４；Ｑ−１０１〜Ｉ−１１５；Ｖ−１０２
〜Ｋ−１１６；Ｑ−１０３〜Ｔ−１１７；Ｖ−１０４〜Ｒ−１１８；Ｃ−１０５
〜Ｋ−１１９；Ｍ−１０６〜Ｎ−１２０。これらのポリペプチドフラグメントは
、本発明のＭＰＩＦ−１ポリペプチドの生物学的活性を保持し得、そして、以下
にさらに記載されるように、抗体を産生するために有用であり得る。これらのポ
リペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって
含まれる。
【０２２４】 ＡＴＣＣ受託番号第７５６７６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコード
される完全ＭＰＩＦ−１アミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列もまた含まれる（ここで、この部分は、ＡＴＣＣ受託番号第７
５６７６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列
のアミノ末端から１〜約１１０アミノ酸の任意の整数のアミノ酸残基、または、
ＡＴＣＣ受託番号第７５６７６号に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードさ
れる完全アミノ酸配列のカルボキシ末端から１〜約１１０アミノ酸から任意の整
数のアミノ酸残基、あるいは、上記アミノ末端およびカルボキシ末端欠失の任意
の組み合わせを除外する）。上記欠失変異体ポリペプチド形態の全てをコードす
るポリヌクレオチドもまた提供される。
【０２２５】 本出願はまた、本明細書中に開示されるＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド配列ｍ
−ｎに少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一で
あるポリペプチドを含むタンパク質に関する。好ましい実施形態において、この
出願は、本明細書中に示される特定のＭＰＩＦ−１ Ｎ末端およびＣ末端欠失の
アミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質に関する。こ
れらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって含まれ
る。
【０２２６】 図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列の特に好ましいＭＰＩＦ−１ポリ
ペプチドは、以下に示される：
【０２２７】
【化２】 従って、１つの局面において、ＭＰＩＦ−１のＮ末端欠失変異体が、本発明に
よって提供される。このような変異体は、図１（配列番号２）の少なくとも最初
の２２Ｎ末端アミノ酸残基の欠失（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）−−Ａｒ
ｇ（２２）の欠失）を有するが、最初の６０Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない
欠失を有する図１（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含むかまたは代替的にそ
れらからなるものを含む。あるいは、欠失は、図１（配列番号２）の少なくとも
最初の２２Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、最初の５３Ｎ末端アミノ酸残基より多
くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番号２）の少なくとも最初の３３Ｎ末
端アミノ酸残基を含むが、最初の５３Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない。ある
いは、欠失は、図１（配列番号２）の少なくとも最初の３７Ｎ末端アミノ酸残基
（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）−−Ｐｒｏ（３７）の欠失）を含むが、最
初の５３Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番
号２）の少なくとも最初の４８Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、最初の５３Ｎ末端
アミノ酸残基より多くはない。
【０２２８】 上記のＭＰＩＦ−１のＮ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、上記
の範囲の全ての組み合わせに関する。例えば、図１（配列番号２）の少なくとも
最初の２２Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の４８Ｎ末端アミノ酸残基より多く
ない欠失；図１（配列番号２）の少なくとも最初の３７Ｎ末端アミノ酸残基を含
むが最初の４８Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号２）の少
なくとも最初の２２Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の３７Ｎ末端アミノ酸残基
より多くない欠失；図１（配列番号２）の少なくとも最初の２２Ｎ末端アミノ酸
残基を含むが最初の３３Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号
２）の少なくとも最初の３３Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の３７Ｎ末端アミ
ノ酸残基より多くない欠失；および図１（配列番号２）の少なくとも最初の３３
Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の４８Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失。
【０２２９】 別の局面では、ＭＰＩＦ−１のＣ末端欠失変異体が本発明によって提供される
。好ましくは、このＭＰＩＦ−１のＣ末端欠失変異体のＮ末端アミノ酸残基は、
図１（配列番号２）のアミノ酸残基１（Ｍｅｔ）または２２（Ａｒｇ）である。
このような変異体は、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（Ａｓｎ（１２０）
）であるが最後の５２Ｃ末端アミノ酸残基（例えば、図１（配列番号２）のアミ
ノ酸残基Ｇｌｕ（６９）−Ａｓｎ（１２０）の欠失）より多くない欠失を有する
図１（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含むかまたは代替的にそれらからなる
ものを含む。あるいは、欠失は、図１（配列番号２）の少なくとも最後の１０ま
たは１５Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の５２Ｃ末端アミノ酸残基より多く
はない。あるいは、欠失は、図１（配列番号２）の少なくとも最後の２０Ｃ末端
アミノ酸残基を含むが、最後の５２Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あるい
は、欠失は、図１（配列番号２）の少なくとも最後の３０Ｃ末端アミノ酸残基を
含むが、最後の５２Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図
１（配列番号２）の少なくとも最後の３６Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の
５２Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番号２
）の少なくとも最後の４１Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の５２Ｃ末端アミ
ノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番号２）の少なくとも
最後の４５Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の５２Ｃ末端アミノ酸残基より多
くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番号２）の少なくとも最後の４８Ｃ末
端アミノ酸残基を含むが、最後の５２Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。
【０２３０】 上記のＭＰＩＦ−１のＣ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、上記
の範囲の全ての組み合わせに関する。例えば、図１（配列番号２）の少なくとも
最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後の４８Ｃ末端アミノ酸残基より多くない
欠失；図１（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後
の４５Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号２）の少なくとも
最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後の４１Ｃ末端アミノ酸残基より多くない
欠失；図１（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後
の３６Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号２）の少なくとも
最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後の１０Ｃ末端アミノ酸残基より多くない
欠失；図１（配列番号２）の少なくとも最後の１０Ｃ末端アミノ酸残基を含むが
最後の２０Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号２）の少なく
とも最後の１０Ｃ末端アミノ酸残基を含むが最後の３０Ｃ末端アミノ酸残基より
多くない欠失；図１（配列番号２）の少なくとも最後の１０Ｃ末端アミノ酸残基
を含むが最後の３６Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号２）
の少なくとも最後の２０Ｃ末端アミノ酸残基を含むが最後の３０Ｃ末端アミノ酸
残基より多くない欠失；など、など、など．．． さらに別の局面では、本発明によって含まれるのは、Ｎ末端およびＣ末端残基
の両方からアミノ酸が欠失したＭＰＩＦ−１欠失変異体である。このような変異
体は、上述したＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせを
含む。このような変異体は、図１（配列番号２）の少なくとも最初の２２Ｎ末端
アミノ酸残基の欠失であるが、最初の５２Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない欠
失を有し、かつ少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後の５２Ｃ末端
アミノ酸残基より多くない欠失を有する図１（配列番号２）に示すアミノ酸配列
を含むかまたは代替的にそれらからなるものを含む。あるいは、欠失は、図１（
配列番号２）の少なくとも最初の３３、３７、または４８Ｎ末端アミノ酸である
が最初の５２Ｎ末端アミノ酸より多くなく、そして図１（配列番号２）の少なく
とも最後の１０、２０、３０、３６、４１、４５、または４８Ｃ末端アミノ酸残
基であって、最後の５２Ｃ末端アミノ酸より多くない欠失を含み得る。上記範囲
の全ての組み合わせがさらに含まれる。
【０２３１】 本発明の特に好ましいフラグメントは、ＭＰＩＦ−１の構造的または機能的性
質によって特徴付けられるフラグメントである。このようなフラグメントとして
は、完全（すなわち、全長）ＭＰＩＦ−１（配列番号２）のα−へリックスおよ
びα−へリックス形成領域（「α領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領
域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（ターン領域）、コイルおよび
コイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域
、β両親媒性領域、表面形成領域、および高抗原性指標領域を含むアミノ酸残基
を含む（すなわち、ジャメソン−ウルフプログラムのデフォルトパラメーターを
使用して同定されるように、１．５以上の抗原性指標を有する４つ以上の近接し
たアミノ酸を含む）。特定の好ましい領域は、図１４に示されるような領域であ
り、そして、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列の分析によって同定さ
れた上述の形態の領域を含むがこれに限定されない。これらのコンピュータープ
ログラムをのデフォルトパラメーターを使用して推定される、このような好まし
い領域としては、以下が挙げられる；ガルニエ−ロブソン（Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒ
ｏｂｓｏｎ）推定α領域、ガルニエ−ロブソン推定β領域、ガルニエ−ロブソン
推定ターン領域、およびガルニエ−ロブソン推定コイル領域；チョウ−ファスマ
ン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）推定α領域、チョウ−ファスマン推定β領域、チ
ョウ−ファスマン推定ターン領域およびチョウ−ファスマン推定コイル領域；ケ
イト−ドオリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）推定親水性領域およびケイ
ト−ドオリトル推定疎水性領域；アイセンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）α領域
両親媒性猟領域およびアイセンバーグβ両親媒性領域；エミニ（Ｅｍｉｎｉ）表
面形成領域；およびジャメソン−ウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）高抗原性
指標領域。保存されたドメイン内に含まれる配列番号２のポリペプチドフラグメ
ントは、本発明によって意図される（図１および図３参照のこと）。これらのド
メインをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、本発明に含まれる。
【０２３２】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＭＰＩＦ−１の機
能的性質をコードする。この点に関する本発明の好ましい実施形態は、ＭＰＩＦ
−１のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「α領域」）、β−シー
トおよびβ−シート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（タ
ーン領域）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎
水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、およ
び高抗原性指標領域を含むフラグメントを含む。
【０２３３】 さらなる好ましい領域は、実施例３７に示される領域である。
【０２３４】 上記のように図１４に開示されているＭＰＩＦ−１の構造的または機能的性質
を示すデータは、デフォルトパラメーター上に設定されるＤＮＡ*ＳＴＡＲの種
々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して作成される。好ましい実施形態に
おいて、図１４に示されるデータは、抗原性について高度の可能性を示すＭＰＩ
Ｆ−１の領域を決定するために使用される。高い抗原性の領域は、免疫応答の開
始のプロセスにおいて抗原認識が生じ得る環境におけるペプチドの表面上で曝露
されるようなペプチドの領域を示す値を選択することによって示されるデータか
ら決定される。
【０２３５】 図１４に示される上述の好ましい領域は、図１に示されるアミノ酸配列の分析
によって同定される上述の形態の領域を含むがこれに限定されない。図１４に示
されるように、このように好ましい領域としては、ガルニエ−ロブソン（Ｇａｒ
ｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ）α領域、ガルニエ−ロブソンβ領域、ガルニエ−ロブ
ソンターン領域、およびガルニエ−ロブソンコイル領域、チョウ−ファスマン（
Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）α領域、チョウ−ファスマンβ領域およびチョウ−フ
ァスマンコイル領域、ケイト−ドオリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）親
水性領域およびケイト−ドオリトル疎水性領域、アイセンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂ
ｅｒｇ）α領域両親媒性猟領域およびアイセンバーグβ両親媒性領域、カープラ
ス−シュルツ（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ）可撓性領域、エミニ（Ｅｍｉｎ
ｉ）表面形成領域、およびジャメソン−ウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）高
抗原性指標領域を含む。
【０２３６】 この点について、高度に好ましいフラグメントは、いくつかの構造的特徴（例
えば、上記または以下に示されるいくつかの特徴）を組み合わせるＭＰＩＦ−１
の領域を含むフラグメントである。
【０２３７】 １つの実施形態において、ＭＰＩＦ−１改変体および／またはフラグメントは
、ＭＰＩＦ−１と同一の構造または実質上同一の構造を有し得るかまたは少なく
ともそのひとつの領域（例えば、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）によって決定され
る溶液構造（実施例３７を参照のこと））または他の技術によって決定されるよ
うな構造）を有し得る。従って、ＭＰＩＦ−１改変体および／またはフラグメン
トは、配列番号２もしくは配列番号７の配列または寄託されたｃＤＮＡクローン
によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有
し得るが、ＭＰＩＦ−１と同一もしくは実質的に同一の構造またはその少なくと
も１つの領域を有する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも
また、本発明によって含まれる。
【０２３８】 ＭＰＩＦ−１改変体および／またはフラグメントは、ＭＰＩＦ−１の少なくと
も１つの領域と同一または実質的に同一の構造を有し得る。ＭＰＩＦ−１の領域
は、Ｎ末端ループ、３10ループ、第１のβ鎖、第１のＩＩＩ型ターン、第２のβ
鎖、Ｉ型ターン、第３のβ鎖、第２のＩＩＩ型ターン、および実施例３７に記載
されるαへリックス（すなわち、配列番号２のアミノ酸５６〜６３（実施例３７
において１３〜２０と番号付けされる）、６４〜６７（実施例３７における２１
〜２４）、７０〜７４（実施例３７における２７〜３１）、７５〜８１（実施例
３６における３２〜３８）、８２〜８７（実施例３７における３９〜４４）、８
８〜９０（実施例３６における４５〜４７）、９１〜９５（実施例３７における
４８〜５２）、９６〜９８（実施例３７における５３〜５５）、および９９〜１
０９（実施例３７における５６〜６６））を含む。ＭＰＩＦ−１領域はまた、配
列番号２のアミノ酸４４〜１２０（実施例３７における１〜７７）、４４〜５３
（実施例３７における１〜１０）、５４〜１０９（実施例３７における１１〜６
６）、５４〜１０５（実施例３７における１１〜６２）、５６〜１０９（実施例
３７における１３〜６６）、１０６〜１２０（実施例３７における６３〜７７）
、１１０〜１２０（実施例３７における６７〜７７）、図１４に示される領域、
本明細書中に記載されるかまたはアミノ酸配列分析によって推定される他の領域
を含む。ＭＰＩＦ−１ポリペプチド改変体および／またはフラグメントは、これ
らのＭＰＩＦ−１領域と同一もしくは実質的に同一の構造またはその組み合わせ
を有し得る。
【０２３９】 １つ以上のＭＰＩＦ−１領域の同一もしくは実質的に同一の構造を有するＭＰ
ＩＦ−１改変体および／またはフラグメントについて、構造はお互いに近接し得
る。１つの実施形態において、この構造はお互いに近接していない（すなわち、
これらは１つ以上のアミノ酸残基で分離されている）。好ましくは、この構造は
、ＭＰＩＦ−１の構造と整列される。好ましくは、この構造は、ＭＰＩＦ−１の
構造上に重ね合わされる。好ましい実施形態において、この構造は、ＭＰＩＦ−
１における対応する構造とお互いに関連する同一構造（すなわち、同一の４次構
造）を有する。
【０２４０】 例えば、ＭＰＩＦ−１改変体および／またはフラグメントは、Ｎ末端ループ、
第１のβ鎖、第２のβ鎖、第３のβ鎖、およびＭＰＩＦ−１のαへリックスと同
一または実質的に同一の構造を有し得る。従って、好ましい組み合わせにおいて
、ＭＰＩＦ−１改変体および／またはフラグメントは、配列番号２のアミノ酸５
６〜６３（実施例３７における１３〜２０）、７０〜７４（実施例３７における
２７〜３１）、８２〜８７（実施例３７における３９〜４４）、９１〜９５（実
施例３７における４８〜５２）、および９９〜１０９（実施例３７における５６
〜６６））と同一または実質的に同一の構造を有する。
【０２４１】 別の例として、ＭＰＩＦ−１改変体および／またはフラグメントは、Ｎ末端ル
ープ、３10ループ、第１のβ鎖、第１のＩＩＩ型ターン、第２のβ鎖、Ｉ型ター
ン、第３のβ鎖、第２のＩＩＩ型ターン、およびＭＰＩＦ−１のαへリックスと
同一または実質的に同一の構造を有する。従って、ＭＰＩＦ−１改変体および／
またはフラグメントは、配列番号２のアミノ酸５６〜６３（実施例３７において
１３〜２０と番号付けされる）、６４〜６７（実施例３７における２１〜２４）
、７０〜７４（実施例３７における２７〜３１）、７５〜８１（実施例３６にお
ける３２〜３８）、８２〜８７（実施例３７における３９〜４４）、８８〜９０
（実施例３６における４５〜４７）、９１〜９５（実施例３７における４８〜５
２）、９６〜９８（実施例３７における５３〜５５）、および９９〜１０９（実
施例３７における５６〜６６））と同一または実質的に同一の構造を含む。
【０２４２】 好ましい実施形態において、ＭＰＩＦ−１改変体および／またはフラグメント
は、配列番号２のアミノ酸５６〜１０９（実施例３７における１３〜６６）と同
一または実質的に同一の構造を有する。
【０２４３】 別の実施形態において、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドは、ＭＰＩＦ−１の１
つ以上の領域のアミノ酸配列を含むみ得るかまたはそれらからなり得る。２つ以
上の領域のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなるポリペプチドについて、
この領域はお互いに近接し得る。１つの実施形態において、この領域は、お互い
に近接していない（すなわち、これらは１つ以上のアミノ酸残基によって分離さ
れている）。好ましくは、アミノ酸配列は、ＭＰＩＦ−１の対応する領域のアミ
ノ酸配列と整列され、その結果、ＭＰＩＦ−１においてそれらを分離する同数の
アミノ酸残基によって分離される。
【０２４４】 なお別の実施形態において、ＭＰＩＦ−１改変体および／またはフラグメント
は、上記の領域の１つ以上におけるアミノ酸変化（置換、欠失、および挿入）を
含み得るが、１つ以上の他の領域において全く変化を含まない。これらのポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって含まれる。
【０２４５】 他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なＭＰＩＦ−１フ
ラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは類似の活性を示すフラグメ
ントであるが、必ずしもＭＰＩＦ−１ポリペプチドの活性と同一ではない。この
フラグメントの生物学的活性は、改善した所望の活性または減少した所望でない
活性を含み得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、
本発明によって含まれる。
【０２４６】 しかし、多数のポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に入手可
能であり、配列データベースを介してアクセス可能である。これらの配列のいく
つかは、配列番号１または６に関連し、そして、本発明の概念より先に公に入手
可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連ポリヌクレオチドは、
特定には、本発明の範囲から除外される。全ての関連した配列を列挙することは
わずらわしい。従って、好ましくは、本発明から除外されるのは、ａ−ｂの一般
式によって記載されるヌクレオチド配列を含むか、または代替的にはこれらから
なる１つ以上のポリヌクレオチドであり、ここで、ａは配列番号１の１〜３４９
の間の任意の整数であり、ｂは１５〜３６３の任意の整数であり、ａおよびｂの
両方は配列番号１に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そして、ｂは、
ａ＋１４より大きいかまたは同じである。
【０２４７】 ＭＰＩＦ−１の１３７アミノ酸スプライス改変体のアミノ末端およびカルボキ
シ末端欠失：上記に示されるように、本発明は、ヒトＭＰＩＦ−１改変体をさら
に提供する。ｃＤＮＡ配列および１３７アミノ酸配列を図２０Ａに示す（それぞ
れ配列番号６および７）。真核生物発現系を使用して、本発明は、このＭＰＩＦ
−１スプライス改変体の３つのＮ末端欠失変異体を発見した。これらは、Ｈｉｓ
（６０）−Ａｓｎ（１３７）；Ｍｅｔ（４６）−Ａｓｎ（１３７）；およびＰｒ
ｏ（５４）−Ａｓｎ（１３７）を含む。従って、さらなる局面において、ＭＰＩ
Ｆ−１スプライス改変体Ｎ末端欠失変異体は、本発明によって提供される。この
ような変異体は、図２０Ａ（配列番号７）に示される、少なくとも最初の４５Ｎ
末端アミノ酸残基を欠失するが、図２０Ａ（配列番号７）の最初の５９Ｎ末端ア
ミノ酸残基を超えない欠失を有するアミノ酸配列を含むか、または代替的にはそ
れらからなる配列を含む。あるいは、この欠失は、図２０Ａ（配列番号７）の少
なくとも最初の５３Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、最初の５９Ｎ末端アミノ酸残
基を超えない。あるいは、この欠失は、図２０Ａ（配列番号７）の少なくとも最
初の４５のＮ末端アミノ酸残基を含むが、最初の５３のＮ末端アミノ酸残基を超
えない。
【０２４８】 配列番号７に示されるような本発明の１３７アミノ酸スプライシングバリアン
トのさらなるＮ末端欠失は、配列番号７の以下の残基のアミノ酸配列を含むか、
あるいはこのようなアミノ酸配列から構成されるポリペプチドを含む：
【０２４９】
【化３】 同様に、配列番号７に示されるような本発明の１３７アミノ酸のスプライシン
グバリアントポリペプチドのさらなるＣ末端欠失は、配列番号７の以下の残基の
アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０２５０】
【化４】 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ま
しくは実質的に精製される。ＭＰＩＦ−１ポリペプチドの組換え的に生成された
バージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０
（１９８８））により記載される１工程方法によって、実質的に精製され得る。
【０２５１】 本発明のポリペプチドは、リーダーを含む寄託されたｃＤＮＡによりコードさ
れるポリペプチド（すなわち全長タンパク質）、寄託されたｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドからリーダーを除くポリペプチド（すなわち、成熟タンパ
ク質）、リーダーを含む図１のポリペプチド（配列番号２）、リーダーを含むが
、Ｎ末端メチオニン残基を除く図１のポリペプチド（配列番号２）、リーダーを
除く図１のポリペプチド（配列番号２）、ならびに上記のポリペプチドに少なく
とも８０％、８５％、９０％、９２％または９５％類似性であり、そしてなおよ
り好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％類似性を有する
ポリペプチドを含む。本発明のさらなるポリペプチドは、図１のポリペプチド（
配列番号２）に対して、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であり、なおよ
り好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリ
ペプチドを含み、そしてまた少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少
なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。
【０２５２】 ２つのポリペプチドについて「％類似性」とは、２つのポリペプチドをＢｅｓ
ｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍ
ａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）および類似性決定のためのデフォルト設定
を用いて２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって生じた類似
性スコアを意図する。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８
２−４８９， １９８１）の局所相同性演算を用いて２つの配列間の最良の類似
性セグメントを見出す。
【０２５３】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９５％
「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペプチドのア
ミノ酸配列は、このポリペプチド配列が、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドの参照アミ
ノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５アミノ酸までの変化を含み得ることを除い
て参照配列と同一であることを意図する。言い換えれば、参照アミノ酸配列に少
なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参
照配列中５％までのアミノ酸残基が別のアミノ酸と欠失もしくは置換され得るか
、または参照配列中の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が参照配列に挿
入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカル
ボキシ末端位置またはそれらの末端位置間の任意の位置で、参照配列中の残基間
で個別にまたは参照配列内で１つ以上の連続する群でのいずれかで分散して生じ
得る。
【０２５４】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号２）
、に示すアミノ酸配列または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされたア
ミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であ
るか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログ
ラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａ
ｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ ５３７１１）を用いて従来的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任
意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、例えば、本発明に従う参
照配列に９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、
同一性パーセントが、参照アミノ酸配列の全長にわたって算定され、かつ参照配
列中のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性のギャップを可能にするように設
定される。
【０２５５】 本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは当業者に周知の方法を
用いる分子篩ゲル濾過カラムの分子量マーカーとして用いられ得る。
【０２５６】 以下に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドは、ポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体を惹起させるために用いられ得る。これは、以下に記
載するようにＭＰＩＦ−１タンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて、
またはＭＰＩＦ−１タンパク質機能を増強または阻害し得るアゴニストおよびア
ンタゴニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、酵母ツー
ハイブリッドシステムにおいて、ＭＰＩＦ−１タンパク質結合タンパク質を「捕
獲」するために用いられ得る。このタンパク質もまた、本発明に従う候補アゴニ
ストおよびアンタゴニストである。酵母ツーハイブリッドシステムは、Ｆｉｅｌ
ｄｓおよびＳｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９）に
記載される。
【０２５７】 （ＭＰＩＦ−１エピトープ保有ポリペプチド）別の局面では、本発明は、本発
明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含む（かまたはそれからなる）ペプチ
ドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発
明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピト
ープ」は、全タンパク質が免疫原である場合抗体応答を惹起するタンパク質の部
分として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上で少数の遺伝子座
に制限されると考えられている。他方で、抗体が結合し得るタンパク質分子の領
域は、「抗原性エピトープ」として定義される。一般に、タンパク質の免疫原性
エピトープの数は、抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら
、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３９９８−
４００２（１９８３）を参照のこと。
【０２５８】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと、こ
れは、米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載される）。
【０２５９】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に惹起し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．および
Ｌｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８
３）を参照のこと。
【０２６０】 タンパク質反応性血清を惹起し得るペプチドは、タンパク質の一次配列におい
て頻繁に示され、単純な化学法則のセットにより特徴づけられ得、そしてインタ
クトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミ
ノ酸もしくはカルボキシ末端のいずれにも限定されない。極度に疎水性のペプチ
ドおよび６残基以下のペプチドは、模倣されたタンパク質に結合する抗体の誘導
に一般に有効ではない；より長いペプチド（特に、プロリン残基を含むペプチド
）が通常有効である。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、上述、６６１。例えば、これらの
指針に従って設計した２０のペプチドのうち１８（インフルエンザウイルス血液
凝集素ＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％を網羅する８〜３９残基を含む）は
、ＨＡ１タンパク質またはインタクトなウイルスと反応する抗体を誘導した；そ
してＭｕＬＶポリメラーゼ由来の１２／１２のペプチドおよび狂犬病糖タンパク
質由来の１８／１８のペプチドは、それぞれのタンパク質を沈降した抗体を誘導
した。
【０２６１】 従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するために有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫したドナー
由来の脾臓細胞の融合により得られた高い割合のハイブリドーマは、一般に、ネ
イティブタンパク質と反応性の抗体を分泌する。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（上述）
６６３。抗原性エピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドにより惹起された抗
体は、模倣されたタンパク質を検出するために有用であり、そして異なるペプチ
ドに対する抗体は、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域
の運命を追跡するために用いられ得る。ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣
されたタンパク質についての種々の定性または定量アッセイで、例えば、競合ア
ッセイで用いられ得る。なぜなら、これは、短いペプチド（例えば、約９アミノ
酸）でさえ、免疫沈降アッセイにおいて結合し、そしてより大きなペプチドと置
換し得ることが示されてためである。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７
：７６７−７７８ （１９８４）、７７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗
体はまた、例えば、当該分野で周知の方法を用いる吸着クロマトグラフィーによ
る、模倣されたタンパク質の精製のために有用である。
【０２６２】 上記の指針に従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび
ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましく
は、少なくとも７、より好ましくは、少なくとも９、そして最も好ましくは約１
５〜約３０アミノ酸の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配
列のより大きな部分を含むか、あるいはそれからなるペプチドまたはポリペプチ
ド（約３０〜約５０アミノ酸、または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列ま
でのおよびこれを含む任意の長さを含む）もまた、本発明のエピトープ保有ペプ
チドまたはポリペプチドとみなし、そしてまた、模倣されたタンパク質と反応す
る抗体を誘導するために有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのア
ミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解度を提供するように選択される（
すなわち、配列は、比較的親水性の残基を含み、そして高度に疎水性の配列は、
好ましく避けられる）；そしてプロリン残基を含む配列は、特に好ましい。
【０２６３】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なくと
も５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも
９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、およ
び最も好ましくは約１５と３０との間のアミノ酸配列を含む。少なくとも１０、
１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、
７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基長の免疫原性または
抗原性エピトープを含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドが好ましい。
【０２６４】 ＭＰＩＦ−１特異的抗体を生成するために用いられ得る抗原性ポリペプチドま
たはペプチドの非限定的な例は、以下を含む：配列番号２における約２１〜約３
０のアミノ酸残基を含むか、これからなるポリペプチド；配列番号２における約
３１〜約４４のアミノ酸残基を含むか、これからなるポリペプチド；配列番号２
における約４９〜約５５のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけ
る約５９〜約６７のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約７
２〜約８３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約８６〜約
１０３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約１１０〜約１
２０のアミノ酸残基を含むポリペプチド。上記に示したように、本発明者らは、
上記ポリペプチドフラグメントがＭＰＩＦ−１の抗原性領域であることを決定し
た。
【０２６５】 Ｍ−ＰＩＦ特異的抗体を生成するために用いられ得るさらなる抗原性ポリペプ
チドまたはペプチドは、上記のＮ末端欠失およびＣ末端欠失を含む。
【０２６６】 本発明はまた、ＭＰＩＦ−１の１３７アミノ酸スプライシングバリアント（配
列番号７）のエピトープフラグメントを提供する。より詳細には、本発明は、配
列番号７の以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する：
【０２６７】
【化５】 本発明のエピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドは、本発明の核酸分子を
用いて、ペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の従来の手段（組換
え手段を含む）によって産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配
列は、組換え産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を生成するための免
疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エ
ピトープ保有ペプチドはまた、公知の化学合成方法を用いて合成され得る。例え
ば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で多数のペプチド（例えば、調製され特徴
づけられた（ＥＬＩＳＡタイプ結合研究により）ＨＡ１ポリペプチドのセグメン
トの単一のアミノ酸改変体を表す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプ
チド）を合成する簡便な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｒ．Ａ．（１
９８５）Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌ
ｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ
ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ
ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５。この「同時多重ペプチド合成
（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ （ＳＭＰＳ）」プロセスは、米国特許第４，６３１，２１１号（Ｈｏ
ｇｈｔｏｎら（１９８６））にさらに記載されている。この手順において、種々
のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別個の溶媒透過性パケットに含有
され、固相法に関与する多くの同一の反復工程の至適な使用を可能にする。競合
マニュアル手順は、５００〜１０００またはそれ以上の合成を同時に行うことを
可能にする。Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、上述、５１３４。
【０２６８】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、ＭＰＩＦ−１タンパク質のエピトープ
保有部分をコードする核酸分子を含む。
【０２６９】 詳細には、本発明のＭＰＩＦ−１のこのような核酸フラグメントは、以下をコ
ードする核酸分子を含む：配列番号２における約２１〜約３０のアミノ酸残基を
含むか、あるいはこれからなるポリペプチド；配列番号２における約３１〜約４
４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約４９〜約５５のア
ミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約５９〜約６７のアミノ酸
残基を含むポリペプチド；配列番号２における約７２〜約８３のアミノ酸残基を
含むポリペプチド；配列番号２における約８６〜約１０３のアミノ酸残基を含む
ポリペプチド；配列番号２における約１１０〜約１２０のアミノ酸残基を含むポ
リペプチド、またはその中の任意の範囲または値（を含むポリペプチド）。
【０２７０】 本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントがＭＰＩＦ−１タンパク質の抗
原性領域であることを決定した。ＭＰＩＦ−１タンパク質の他のこのようなエピ
トープ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記載される。
【０２７１】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために用いられる。これには、インビボ免疫、インビトロ免疫、およ
びファージディスプレイ法が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｓｕ
ｔｃｌｉｆｆｅら、上述；Ｗｉｌｓｏｎら、上述；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ
．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照
のこと。インビボ免疫を用いる場合、動物は、遊離ペプチドで免疫され得る；し
かし、抗ペプチド抗体価は、ペプチドの巨大分子キャリア（例えば、キーホール
リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）への結合により追
加免疫投与され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、リンカー（例
えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクインイミドエステル（Ｍ
ＢＳ））を用いてキャリアに結合され得る。一方、他のペプチドは、グルタルア
ルデヒドのようなより一般的な連結剤を用いてキャリアに連結され得る。動物（
例えば、ウサギ、ラット、およびマウス）は、遊離ペプチドまたはキャリア結合
ペプチドのいずれかで、例えば、約１００ｇのペプチドまたはキャリアタンパク
質とフロイントアジュバントとを含む乳剤の腹腔内および／または皮内注射によ
って免疫される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊
離ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイによって、検出され得る抗ペプチド抗体
の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免
疫動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当該分野で周知の方法
に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による、抗
ペプチド抗体の選択によって増大され得る。
【０２７２】 本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、全タンパク質が免疫原
である場合抗体応答を惹起するタンパク質のそれらの部分）は、当該分野で公知
の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、上述は、酵素結合免疫吸
着アッセイにおいて反応するのに十分な純度の数百のペプチドの固体支持体上に
おける迅速な同時合成のための方法を開示している。合成されたペプチドと抗体
との相互作用は、次いで、支持体からそれらを除去することなく容易に検出され
る。このようにして、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチ
ドは、当業者によって日常的に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスの外被タ
ンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、Ｇｅｙｓｅｎらによって位置
決めされ、タンパク質の全２１３アミノ酸配列を網羅する全ての２０８の可能な
ヘキサペプチドの重複セットの合成によって７アミノ酸が解明された。次いで、
全ての２０アミノ酸が順にエピトープ内のすべての位置で置換されたペプチドの
完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応について特異性を与える特定
のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチド
アナログが、本方法によって日常的に作製され得る。米国特許第４，７０８，７
８１号（Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７））は、所望のタンパク質の免疫原性エピトー
プを保有するペプチドを同定する本方法をさらに記載する。
【０２７３】 なおさらに、米国特許第５，１９４，３９２号（Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０））
は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエピトープの幾
何学的に等価なモノマー（すなわち、「ミモトープ」）（アミノ酸または他の化
合物）の配列を検出または決定する一般的方法を記載している。より一般には、
米国特許第４，４３３，０９２号（Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９））は、目的の特定
のレセプターのリガンド結合部位に相補的なリガンドの幾何学的に等価なモノマ
ーの配列を検出または決定する一般的方法を記載している。同様に、米国特許第
５，４８０，９７１号（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６）Ｐｅｒａｌ
ｋｙｌｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）は、直鎖状Ｃ1
−Ｃ7アルキル過アルキル化オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセッ
トおよびライブラリー、そして目的のアクセプター分子に優先的に結合する過ア
ルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセッ
トおよびライブラリーを用いる方法を開示している。従って、本発明のエピトー
プ保有ペプチドの非ペプチドアナログは、これらの方法によって日常的に作製さ
れ得る。
【０２７４】 「ポリペプチドおよびペプチド」について本節で引用した各文書の完全な開示
が、本明細書中に参考として援用されている。
【０２７５】 当業者は、本発明のＭＰＩＦ−１ポリペプチドおよび上記のそれらのエピトー
プ保有フラグメントが、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み
合わされて、キメラポリペプチドを生じ得ることを理解する。これらの融合タン
パク質は、精製を容易にし、そしてインビボで増大された半減期を示す。これは
、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免
疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタン
パク質（ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３
３１：８４−８６ （１９８８））について示されている。ＩｇＧ部のためにジ
スルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、モノマーＭＰＩＦ
−１タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子を結合し、
中和するのにより効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ ２７０：３９５８−３９６４ （１９９５））。
【０２７６】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含むかあるいはこれからなる本発明のポリペプチ
ドは、異種のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチド
は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたは
それらの部分（ＣＨ1、ＣＨ2、ＣＨ3、またはそれらの任意の組み合わせおよび
それらの部分（ドメイン全体およびその部分を含む））と融合され得、キメラポ
リペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そして
インビボでの半減期を増大させ得る。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチ
ドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の
定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている。例
えば、ＥＰＡ ０，３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，
３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。ＩｇＧ部分に起因するジスルフ
ィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたは
それらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果
的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコ
ードする核酸はまた、エピトープタグとして目的の遺伝子と組換えられ、発現さ
れたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。
【０２７７】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを利用して、配列番号２に対応するポリペプチドの活性を調
節し得、このような方法を使用することにより、これらのポリペプチドのアゴニ
ストおよびアンタゴニストを効果的に生成し得る。一般には、米国特許第５，６
０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第
５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅ
ｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（
１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ
Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）
：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によ
ってその全体において参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態に
おいて、配列番号１または６に対応するポリヌクレオチドおよび対応するポリペ
プチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリ
ングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、本発明の配列番号１または
６のポリヌクレオチドに対応する所望の分子に２つ以上のＤＮＡセグメントをア
センブルすることを含む。別の実施形態において、配列番号１または６に対応す
るポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法に
よる、ランダム変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態に
おいて、配列番号１または６に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドの１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメント
など、またはそれによりコードされるポリペプチドは、１つ以上の異種分子の、
１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと
組み換えられ得る。
【０２７８】 （ポリペプチド精製および単離）ＭＰＩＦ−１は、硫酸アンモニウムまたはエ
タノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性
クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレク
チンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養物から回収および
精製される。タンパク質再折り畳み工程は、必要に応じて、成熟タンパク質の配
置を完全にすることにおいて用いられ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）は、最終精製工程のために用いられ得る。
【０２７９】 本発明のポリペプチドは、天然に精製された生成物または化学合成手順の産物
であり得るか、あるいは原核生物宿主もしくは真核生物宿主から（例えば、培養
物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞による）組換え技術に
よって産生され得る。組換え産生手順で使用される宿主に依存して、本発明のポ
リペプチドは哺乳動物もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコシル化され得る
か、または非グリコシル化され得る。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチ
オニンアミノ酸残基を含み得る。
【０２８０】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術（例えば、Ｃｒｅｉ
ｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，
Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１
１１（１９８４））を用いて化学的に合成され得る。例えば，ＭＰＩＦ−１ポリ
ペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置の使用に
よって合成され得る。さらに、所望であれば，非古典的アミノ酸または化学アミ
ノ酸アナログは、ＭＰＩＦ−１ポリペプチド配列中への置換または付加として導
入され得る。非古典的アミノ酸は、以下を含むがこれらに限定されない：標準ア
ミノ酸のＤ−アイソマー、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−ア
ミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇＡｂｕ、ｅＡｈｘ、６−アミノヘキサン
酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルチニン、ノル
ロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシ
トルリン、システイック酸（ｃｙｓｔｅｉｃ ａｃｉｄ）、ｔ−ブチルグリシン
、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラ
ニン、フルオロ−アミノ酸、設計されたアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸
、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、）、および一般なアミノ酸ア
ナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０２８１】 本発明は、翻訳の間または翻訳の後に差示的に改変される（例えば、グリコシ
ル化，アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘
導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞性リガンドに対する連
結などによって）ＭＰＩＦ−１ポリペプチドを含む。多くの任意の化学的改変が
、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって行なわれ得る：臭化シ
アン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4
による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン
存在下における代謝的合成；など。
【０２８２】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後改変は、例えば、Ｎ結合型糖鎖または
Ｏ結合型糖鎖（Ｎ末端およびＣ末端のプロセシング）、アミノ酸バックボーンに
対する化学的部分の付着、Ｎ連結糖鎖またはＯ連結糖鎖の化学的改変、および原
核宿主細胞の発現の結果としてＮ末端メチオニン残基の付加または欠失を含む。
ポリペプチドはまた、タンパク質の検出および単離を可能にする、酵素的、蛍光
的、同位体的または親和性標識のような検出可能な標識を用いて改変され得る。
【０２８３】 本発明によってまた与えられるのは、化学的に改変された本発明のポリペプチ
ドの誘導体であり、これは、ポリペプチドの可溶性、安定性および循環時間の増
加または免疫原性の減少のようなさらなる利点を与え得る（米国特許第４，１７
９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学的成分は、例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどのような
、水溶性ポリマーから選択され得る。ポリペプチドは、分子中のランダムな部位
、または分子中の予め決定された部位を改変され得、そして１、２、３以上の付
加した化学的成分を含み得る。
【０２８４】 ポリマーは任意の分子量であり得、そして分岐されてもまたは分岐されなくて
もよい。ポリエチレングリコールについて、好ましい分子量は、取り扱いおよび
製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａ（用語「約」は、ポリエチ
レングリコールの調製において、いくつかの分子は規定された分子量よりもより
多く、いくつかは少ないことを示す）との間である。他のサイズも使用され得、
これは、望ましい治療的プロフィールに依存する（例えば、所望の徐放性の期間
、生物学的活性に対する効果（もしあれば）、取り扱いの容易さ、抗原性の程度
または抗原性の欠如、およびポリエチレングリコールの治療的タンパク質または
アナログに対する他の既知の効果）。
【０２８５】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（ＧＣＳＦにＰＥ
Ｇを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８１０
３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔ
ｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコールは
、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってアミノ酸
残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分
子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジ
ン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基を有す
るアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端
アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレングリコ
ール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のために好ま
しいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。
【０２８６】 Ｎ末端で化学改変されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する割合、行われるべきペグ化反応
の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末
端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化
部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化
物質の精製によってであり得る。Ｎ末端改変で化学改変された選択的タンパク質
は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基
（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成さ
れ得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端で
のタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０２８７】 （抗体）本発明での使用のためのＭＰＩＦ−１タンパク質特異的抗体は、イン
タクトなＭＰＩＦ−１タンパク質、またはその抗原性ポリペプチドフラグメント
に対して惹起され得、これはアルブミンのようなキャリアタンパク質とともに、
またはそれが十分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合はキャリアをともな
わずに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提示され得る。
【０２８８】 本明細書中で使用される用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」
（Ｍａｂ）は、 ＭＰＩＦ−１タンパク質に特異的に結合し得るインタクトな分
子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメント
）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントは、インタ
クトな抗体のＦｃフラグメントを欠いており、循環からより迅速に排除され、そ
してインタクトな抗体のより少ない非特異的組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、
Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ． ２４：３１６−３２５ （１９８３））。従って、こ
れらのフラグメントが好ましい。
【０２８９】 ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそれらのア
ナログ、またはそれらを発現する細胞が、それらに対する抗体を産生するための
免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、およ
びヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの
産生を含む。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン
トの産生に使用され得る。
【０２９０】 本発明はまた、配列番号２または７に示されるポリペプチド配列のエピトープ
を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドフラグメント、あるいは寄託され
たクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列に関する
。これらのエピトープをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１また
は６に記載の配列など）がまた、これらのエピトープをコードするポリヌクレオ
チドの相補鎖のヌクレオチド配列と同様に、本発明に包含される。ストリンジェ
ントな条件または低ストリンジェンシー条件下でこの相補鎖にハイブリダイズす
るポリヌクレオチドもまた包含される。
【０２９１】 本発明において、「エピトープ」は、動物、特にヒトの抗原性活性または免疫
原性活性を有するポリペプチドフラグメントをいう。本発明の好ましい実施形態
は、エピトープを含むかあるいはこれからなるポリペプチドフラグメント、なら
びにこのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに関する。抗体が結合し得
るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。対照的に
、「免疫原性エピトープ」は、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義
される。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。
【０２９２】 抗原性エピトープは、例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクロ
ーナル抗体を含む）の惹起に有用である（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ
３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｈｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０２９３】 同様に、免疫原性エピトープは、例えば、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌ
ｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性
エピトープとしては、分泌タンパク質が挙げられる。免疫原性エピトープは、キ
ャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまた
はマウス）に対して提示され得るか、または、その免疫原性エピトープが十分に
長い場合では（少なくとも約２５アミノ酸）、キャリアなしで提示され得る。し
かし、８〜１０個程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、変性さ
れたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合し得る抗体を惹起する
のに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッティングにおいて）
。
【０２９４】 さらに、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する
抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ＩｇＧ
（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ1および
ＩｇＡ2を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＹを含む。本明細書中で
使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）とは、抗体全体、すなわち、単鎖抗体全体
、およびその抗原結合フラグメントを含む、ことを意図する。最も好ましくは、
この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ
、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、
ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれ
かを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、
鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源であり得る。好ましくは、この抗体は
、ヒト、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、
またはニワトリである。
【０２９５】 単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ1ドメイン、Ｃ
Ｈ2ドメインおよびＣＨ3ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ1ドメイ
ン、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインとの任意の組み合わせもまた本発明に含
まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、モノクロ
ーナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒトモノク
ローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体をさらに含む。本発明はさらに、本
発明の抗体に抗イディオタイプである抗体を含む。
【０２９６】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種の組成物（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方に特
異的であり得る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ ９２／０８８０２；
ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号、
同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８
１号、同第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０２９７】 本発明の抗体は、この抗体が認識または特異的に結合する、本発明のポリペプ
チドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトー
プまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連
続するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、ま
たは表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトー
プまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、
本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチ
ドの排除を可能にする抗体を含む。
【０２９８】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合しない抗体もま
た、本発明に含まれる。さらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合するだけの
抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、それらの結合親和性について
記載または特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ未満、
１０-6Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、５×１０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ
未満、５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、
５×１０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、５×１０-12Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、５×
１０-13Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×１０-14Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、５×１０ -15 Ｍ未満または１０-15Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する親和性が挙げられ
る。
【０２９９】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、そして標的化する
当該分野で公知の方法を含むがこれらに限定されない用途を有する。これらは、
インビトロおよびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、
この抗体は、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的
におよび定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば
、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される
）を参照のこと。
【０３００】 本発明の抗体は、単独または他の化合物との組み合わせのいずれかで使用され
得る。この抗体はさらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的
に融合され得るか、またはポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合（共有
結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセ
イにおける標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬剤、または毒素の
ようなエフェクター分子へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ
公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米
国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこ
と。
【０３０１】 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の適切な方法により調製され得
る。例えば、本発明のポリペプチドまたはそれらの抗原性フラグメントは、ポリ
クロナール抗体を含む血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。用語
「モノクロナール抗体」は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定
されない（ｎｏｔａ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）。用語「モノクロナール抗体」は
、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに
由来する抗体を言及し、そしてそれを産生する方法には言及されない。モノクロ
ナール抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、およびファージディスプレイ
技術の使用を含む当該分野において公知の広範な種々の技術を用いて調製され得
る。
【０３０２】 ハイブリドーマ技術は、当該分野において公知の技術およびＨａｒｌｏｗら、
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．第２版、
１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３６８１（Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（これらの参照文献は、参考としてそれら全
体を援用する）において教示される技術を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フ
ラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）またはペプシン
（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するため）などの酵素を用いて、タンパク
質分解性切断により生成され得る。
【０３０３】 あるいは、本発明の抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイ技術の
適用によって、または当該分野において公知の方法を用いる合成化学によって産
生され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野において公知の種々のファージ
ディスプレイ技術を用いて調製され得る。ファージディスプレイ方法においては
、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有する
ファージ粒子の表面にディスプレイされる。所望の結合特性を有するファージは
、抗原（典型的には固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原）を用い
て直接的に選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライ
ブラリー（例えば、ヒトまたはマウスの）から選択される。これらの方法に使用
されるファージは代表的に、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパ
ク質のいずれかと組換え的に融合される、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定
化Ｆｖ抗体ドメインを有する、ｆｄおよびＭ１３を含む、繊維状ファージである
。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例と
しては、以下に開示されるものが挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋ
ｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９
５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）
；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１
９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８
０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；
ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならび
に米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０
３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５
，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、
同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２
５号、同第５，６５８，７２７号および同第５，７３３，７４３号（これらの参
考文献は、参考としてそれら全体が援用される）。
【０３０４】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、そのファージ由来の抗体
コード領域は、単離され得、そして全体の抗体（ヒト抗体、または任意の他の所
望の抗原結合フラグメントを含む）を産生するために用いられ得、そして任意の
所望の宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む）にお
いて発現された。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント
を組換え的に（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ）産生するための技術はまた、当該
分野において公知である方法（例えば、ＷＯ９２／２２３２４：Ｍｕｌｌｉｎａ
ｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）
；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅ
ｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（上記
参考文献は、その全体が参考として援用される）において開示された方法）を用
いて利用され得る。
【０３０５】 一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を産生するために使用され得る技術の例は、米国特許
第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｕｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）
；Ｓｈｕ，Ｌら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳ
ｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記
載される技術を含む。ヒトにおける抗体のインビボの使用およびインビトロの検
出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト
抗体を使用することは、好ましくあり得る。キメラ抗体を産生するための方法は
、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２
１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１２５：１９１−２０２（１９８９）；および米国特許第５，８０７，７１５号
を参照のこと。抗体は、種々の技術（ＣＤＲ移植片化（ＥＰ ０ ２３９ ４０
０；ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；および同第５
，５８５，０８９号）、化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面形成（ｒ
ｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ ０ ５９２ １０６；ＥＰ ０ ５１９ ５９
６；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２
８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒ
ｏｇｕｓｋａ．ら、ＰＮＡＳ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖の
シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，
３３２号）を含む）を使用してヒト化され得る。ヒト抗体は、当該分野において
公知である種々の方法（上に記載されるファージディスプレー方法を含む）によ
って作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１
号、同第５，５４５，８０６号および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ
９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／
１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１
０７４１（上記参考文献は、その全体が参考として援用される）をもまた参照の
こと。
【０３０６】 さらに、本発明のポリペプチドに組換え的に融合または化学的に結合体化（共
有結合および非共有結合の両方を含む）された抗体が、本発明に含まれる。この
抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に対して特異的であり得る。例えば、
その抗体は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、特定の細胞表面レ
セプターに特異的な抗体に、本発明のポリペプチドを融合または結合体化するこ
とによって、特定の細胞型に本発明のポリペプチドに標的化するために用いられ
得る。本発明のポリペプチドに融合または結合した抗体は、当該分野において公
知である方法を用いたインビトロの免疫アッセイおよび精製方法において用いら
れ得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出、およびＷＯ ９３／２１２３２、ＥＰ
０ ４３９ ０９５、Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９
：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１；Ｇｉｌｌｉｅｓら
、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）（上記の参考文献は、その
全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３０７】 本発明は、可変領域とは異なる抗体ドメインに融合または結合した本発明のポ
リペプチドを含む組成物をさらに含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体
のＦｃ領域またはそれらの部分に、融合または結合し得る。本発明のポリペプチ
ドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ1ドメイン、ＣＨ2ドメインおよびＣ
Ｈ3ドメイン、または全ドメインまたはそれらの部分の任意の組合せを含み得る
。本発明のこのポリペプチドは、インビボにおけるポリペプチドの半減期を増加
するため、または当該分野で公知の方法を用いたイムノアッセイにおける使用の
ために、上記抗体部分に融合または結合され得る。このポリペプチドはまた、多
量体を形成するために上記抗体部分に融合または結合され得る。例えば、本発明
のポリペプチドに融合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分間でジスルフィド結合を介して
二量体を形成し得る。さらに高い多量体形態はＩｇＡおよびＩｇＭの部分にポリ
ペプチドを融合することにより作成され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分
に融合または結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米
国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，
０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，１
１２，９４６号：ＥＰ ０ ３０７ ４３４，ＥＰ ０ ３６７ １６６；ＷＯ
９６／０４３８８，ＷＯ ９１／０６５７０，Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、ＰＮＡ
Ｓ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、ＰＮＡＳ
８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記参考文献は、その全体が参
考として援用される）を参照のこと。
【０３０８】 本発明は、さらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト
として作用する抗体に関連する。例えば、本発明は、レセプター／リガンド相互
作用を、部分的にまたは全体的にのどちらかで、本発明のポリペプチドで中断す
る抗体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれ
る。リガンドの結合を妨げないが、レセプターの活性化を妨げるレセプター特異
的抗体が含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナリング）は、本明細書
中に記載されるか、そうでなければ当該分野において公知である技術により決定
され得る。リガンド結合およびレセプターの活性化の両方を妨げるレセプター特
異的抗体もまた、含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてレセプターに対
するリガンドの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、これにより
、レセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合するのを妨げない
抗体が含まれる。さらに、レセプターを活性化する抗体が含まれる。これらの抗
体は、リガンド調節レセプター活性化により影響される、全てのまたは全て以下
のどちらかの生物学的活性に対するアゴニストとして、作用し得る。この抗体は
、本明細書中に開示される特異的活性を含む生物学的活性に対するアゴニストま
たはアンタゴニストとして、特定され得る。この上記抗体アゴニストは当該分野
において公知である方法を用いて作成され得る。例えば、ＷＯ ９６／４０２８
１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：
１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（
１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら
、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐ
ｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−
１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３
３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２
（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒ
ｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記参考文献は、その
全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３０９】 上に議論されるように、本発明のポリペプチドに対する抗体は、次いで、当業
者に周知である技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣」する抗イディオ
タイプ抗体を生成するために、利用され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆
Ｂｏｎａ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）および
Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８
（１９９１）を参照のこと）。例えば、リガンドに結合し、そしてポリペプチド
の多量体化および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競合
的に阻害する抗体は、ポリペプチドの多量体化および／または結合ドメインを「
模倣」する抗イディオタイプを生成するために用いられ得、そして結果として、
ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、それらを中和する。このよ
うな中和抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメ
ントは、ポリペプチドリガンドを中和するための治療療法において使用され得る
。例えば、このような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドに結合す
るため、および／またはそのリガンド／レセプターに結合し、そしてそれにより
、その生物学的活性をブロックするために使用され得る。
【０３１０】 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成された抗体、またはそのイ
ンビボのレセプターが、動物へのポリペプチドの直接の注射によって、または動
物（好ましくは、ヒト以外）へのポリペプチドの投与によって得られ得る。次い
で、このように得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。この様式では、
ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえ、すべての天然のポリ
ペプチドに結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗
体は、このポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用
され得る。
【０３１１】 モノクローナル抗体の調製のために、持続的な細胞株培養によって産生される
抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例として、ハイブリドーマ技術（Ｋ
ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５
−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら
、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびヒトモノ
クローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９
８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げら
れる。
【０３１２】 単鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第４、９４６、７７８号）
が、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するために適合
され得る。
【０３１３】 本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、ＭＰＩＦ
−１タンパク質、またはその抗原性フラグメントを発現する細胞が、ポリクロー
ナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい
方法において、ＭＰＩＦ−１タンパク質の調製物は、それが天然の混入物を実質
的に含まないように調製されそして精製される。次いで、このような調製物が、
より大きな特異的活性のポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入され
る。
【０３１４】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのＭＰＩＦ−１タンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクロー
ナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４
９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１
（１９７６）； Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（
１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ
．Ｙ．（１９８１）５６３−６８１頁）を使用して調製され得る。一般に、この
ような手順は、ＭＰＩＦ−１タンパク質抗原で、またはより好ましくは、ＭＰＩ
Ｆ−１タンパク質発現細胞で動物（好ましくは、マウス）を免疫することを含む
。適切な細胞は、抗ＭＰＩＦ−１タンパク質抗体に結合するそれらの能力によっ
て認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地中で培養され得
る；しかし、１０％のウシ胎児血清（約５６℃で不活化した）を補充し、そして
約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約
１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ培地
中で細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞が抽出され、そ
して適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄腫細胞株が、本発明に
従って使用され得る；しかし、親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）（アメリカンタイプ
カルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄより入手可能
）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培
地中で選択的に維持され、次いで、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ
ｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））に記載されるような限界希釈によ
ってクローン化される。次いで、このような選択によって得られたハイブリドー
マ細胞は、ＭＰＩＦ−１タンパク質抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを
同定するためにアッセイされる。
【０３１５】 あるいは、ＭＰＩＦ−１タンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イデ
ィオタイプ抗体の使用によって二工程手順で産生され得る。このような方法は、
抗体がそれ自体抗原であるという事実、および従って二次抗体に結合する抗体を
得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、ＭＰＩＦ−１
タンパク質特異的抗体が、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用さ
れる。次いで、このような動物の脾細胞がハイブリドーマ細胞を産生するために
使用され、そしてハイブリドーマ細胞が、ＭＰＩＦ−１タンパク質特異的抗体に
結合するそれらの能力がＭＰＩＦ−１タンパク質抗原によってブロックされ得る
抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗
体は、ＭＰＩＦ−１タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み
、そしてさらなるＭＰＩＦ−１タンパク質特異的抗体の形成を誘導するように動
物を免疫するために使用され得る。
【０３１６】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2、ならびに本発明の抗体の他のフラグメントが本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが明らかである。このよう
なフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため
）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを産生するため）のような酵素
を使用する、タンパク質分解的切断によって産生される。あるいは、ＭＰＩＦ−
１タンパク質結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用によって、または合
成化学によって産生され得る。
【０３１７】 「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。こ
のような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由
来する遺伝的構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法
は、当該分野で公知である。概説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４
：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４、８１６、５６７号；
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７
３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら
、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４
３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９
８５）を参照のこと。
【０３１８】 本発明のＭＰＩＦ−１タンパク質特異的抗体のためのさらなる適切な標識が、
以下に示される。適切な酵素標識の例として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブド
ウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデ
ヒドロゲナーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオース
ホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ア
スパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレ
アーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０３１９】 適切な放射性同位元素標識の例として、3Ｈ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、 35 Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃ
ｕ、217Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄなどが挙げられる。111Ｉｎ
は、インビボの画像解析が使用される場合、それが肝臓による125Ｉまたは131Ｉ
標識したモノクローナル抗体の脱ハロゲン化の問題を回避するので、好ましい同
位元素である。さらに、この放射性ヌクレオチドは、画像解析のためのより好ま
しいガンマ放出エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ
．Ｍｅｄ．１０：２９６−３０１（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ
．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７（１９８７））。
【０３２０】 適切な非放射性同位元素標識の例として、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｔｒ
、および56Ｆｅが挙げられる。
【０３２１】 適切な蛍光標識の例として、152Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシ
アネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、
アロフィコシアニン標識、ｏ−フタアルデヒド標識、およびフルオレスアミン標
識が挙げられる。
【０３２２】 適切な毒素標識の例として、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が挙
げられる。
【０３２３】 化学発光標識の例として、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アク
リジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸
エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識
が挙げられる。
【０３２４】 核磁気共鳴対比剤の例として、Ｇｄ、Ｍｎ、および鉄のような重金属核が挙げ
られる。
【０３２５】 抗体に対する上記の標識の結合のための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら、
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１（１９７６）、およびＳｃｈｕ
ｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１−４０（１９７７）によって
提供される。後者に記載されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、過
ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スク
シンイミドエステル法であり、これらの方法の全て本明細書中で参考として援用
される。
【０３２６】 染色体アッセイ。本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配
列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置
とハイブリダイズし得る。さらに、染色体における特定の部位を同定することへ
の必要性が現在存在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マー
キング試薬は現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用可能ではない。
本発明に従う染色体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連し
た遺伝子と相関づけることにおいて重要な第一段階である。
【０３２７】 この点における特定の好ましい実施形態において、本明細書中で開示されるｃ
ＤＮＡは、ＭＰＩＦ−１タンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするた
めに用いられる。これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およびラ
イブラリーを用いて達成され得る。この目的のための周知の技術を用いて、イン
サイチュ染色体マッピングのためにゲノムＤＮＡが用られる。典型的には、染色
体マッピングのための慣用的手順に従って、良好なインサイチュハイブリダイゼ
ーションシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために、いくつかの試行錯
誤が必要とされ得る。
【０３２８】 手短には、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５
ｂｐ）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子の３’非翻
訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおいて１より多いエキソ
ンにまたがらず、従って、増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択
する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイ
ブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。このプライマーに対応す
るヒト遺伝子を含有するこれらのハイブリッドのみが増幅フラグメントを産生す
る。
【０３２９】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定のＤＮＡを特定の染色体に対応
させるための迅速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
本発明を使用し、準局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色
体由来のフラグメントのパネルまたは同類の手法における大きいゲノムクローン
のプールで達成され得る。その染色体にマッピングするために同様に用いられ得
る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識
フローソート（ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスク
リーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブ
リダイゼーションによる前選択を含む。
【０３３０】 中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するｃＤＮＡクローンの蛍光イン
サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、一工程で、正確な染色
体位置を提供し得る。この技術は、少なくとも５０または６０ｂｐを有するｃＤ
ＮＡからのプローブと共に用いられ得る。（この技術の概説については、Ｖｅｒ
ｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａ
ｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８８）を参照のこと）。
【０３３１】 一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例
えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ
ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃ
ｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に見出
される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係
が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）によって同定される。
【０３３２】 次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差
異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において
認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原
因因子である可能性が高い。
【０３３３】 物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度であれば、疾患
と関連する染色体領域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在
的な原因遺伝子の１つであり得る（これは、１メガベースマッピング解像度およ
び２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。
【０３３４】 罹患個体と非罹患個体との比較は、一般的に、まず染色体における構造的変化
（例えば、欠失または転座）を探すことを含み、これは、染色体スプレッドによ
り可視であるか、またはそのｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能であ
る。究極的には、いくつかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定は、変異の存在
を確認し、そして変異を多型性と区別するために必要とされる。
【０３３５】 本発明はさらに、アンチセンス技術の使用によるインビボにおけるＭＰＩＦ−
１の阻害に関する。アンチセンス技術は、三重鎖形成またはアンチセンスＤＮＡ
もしくはＲＮＡ（両方の方法は、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結
合に基づいている）を介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。例えば
、ポリヌクレオチド配列（これは、本発明のポリペプチドをコードする）の５’
コード部分は、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する
遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重鎖−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それによってＭＰＩＦ−１の転
写および産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボ
においてｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＭＰＩＦ−１タン
パク質への翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃ
ｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１
９８８））。 あるいは、上記のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが
インビボにおいて発現されて、ＭＰＩＦ−１の産生を上記の方法で阻害し得るよ
うに、当該分野における手順によって細胞に送達され得る。
【０３３６】 従って、ＭＰＩＦ−１に対するアンチセンス構築物は、ＭＰＩＦ−１誘導性ま
たは増強性のいずれかである障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、自己免疫
疾患（例えば、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病）ならびに慢性炎症
性および感染性疾患、ヒスタミン媒介性アレルギー反応、慢性関節リウマチ、珪
肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症およびその他の肺の慢性炎症性疾患、
特発性好酸球増多症候群、内毒素性ショック、ヒスタミン媒介性アレルギー反応
、プロスタグランジン非依存性発熱、ならびに再生不良性貧血およびその他の骨
髄不全の症例）を処置するために使用され得る。
【０３３７】 アンタゴニスト、アゴニスト、および方法．本発明はさらに、化合物をスクリ
ーニングして、本発明のケモカインポリペプチドに対するアゴニストおよびアン
タゴニストを同定するための方法を提供する。アゴニストは、ポリペプチドの類
似の生物学的機能を有するか、またはポリペプチドの機能を増強する化合物であ
り、一方アンタゴニストは、そのような機能をブロックする。走化性は、細胞（
これは、本発明のポリペプチドのいずれかによって化学誘引される）を、細胞が
入るために十分な直径（約５μｍ）の孔を有するフィルターの頂部に置くことに
よってアッセイされ得る。潜在的なアゴニストの溶液を上方区画中の適切なコン
トロール培地を含むチャンバーの底部に入れ、従って、アゴニストの濃度勾配は
、経時的に多孔性膜中にまたは多孔性膜を通って移動する細胞を計数することに
よって測定される。
【０３３８】 アンタゴニストについてアッセイする場合、本発明のケモカインポリペプチド
は、底部チャンバーに入れられ、そして細胞の走化性が防止されるかどうかを決
定するために、潜在的なアンタゴニストが添加される。
【０３３９】 あるいは、ポリペプチドのレセプターを発現している哺乳動物細胞または膜調
製物は、化合物の存在下で、標識されたケモカインポリペプチド（例えば、放射
能）とともにインキュベートされる。次いで、化合物がこの相互作用をブロック
する能力が測定され得る。この様式でアゴニストをアッセイする場合、ケモカイ
ンは存在せず、そしてアゴニスト自体がレセプターと相互作用する能力が測定さ
れ得る。
【０３４０】 潜在的なＭＰＩＦ−１アンタゴニストの例としては、ポリペプチドに結合する
抗体、またはいくつかの場合において、オリゴヌクレオチドが挙げられる。潜在
的なアンタゴニストの別の例は、ポリペプチドのネガティブドミナント変異体（
ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍｕｔａｎｔ）である。ネガティブドミ
ナント変異体は、野生型ポリペプチドのレセプターに結合するが、生物学的活性
を保持していないポリペプチドである。
【０３４１】 アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンス構築物はまた、潜在的な
アンタゴニストである。アンチセンス技術は、三重鎖形成またはアンチセンスＤ
ＮＡもしくはＲＮＡ（両方の方法は、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへ
の結合に基づいている）を介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。例
えば、ポリヌクレオチド配列（これは、本発明の成熟ポリペプチドをコードする
）の５’コード部分は、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に
関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重鎖−Ｌｅｅら、Ｎｕ
ｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それによってケモカ
インポリペプチドの転写および産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分
子のポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，
ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡがインビボにおいて発現されて、ケモカインポリペプチドの産生を阻
害し得るように細胞に送達され得る。 別の潜在的なケモカインアンタゴニストは、生物学的機能は喪失しているが、
なおポリペプチドのレセプターを認識しそしてそれに結合し、それによってレセ
プターを有効にブロックする、天然にまたは合成的に改変されたポリペプチドの
アナログであるポリペプチドのペプチド誘導体である。ペプチド誘導体の例とし
ては、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、それらに限定されない
。
【０３４２】 アンタゴニストは、ＭＰＩＦ−１誘導性または増強性のいずれかである障害（
例えば、自己免疫疾患ならびに慢性炎症性および感染性疾患）を処置するために
用いられ得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症およびインスリン依存
性糖尿病が挙げられる。
【０３４３】 アンタゴニストはまた、単核食細胞のリクルートメント（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅ
ｎｔ）および活性化を防止することによって、珪肺症、サルコイドーシス、特発
性肺線維症を含む感染性疾患を処置するために用いられ得る。それらはまた、好
酸球の産生および移動を防止することによって、特発性好酸球増多症候群を処置
するために用いられ得る。内毒素性ショックはまた、マクロファージの移動およ
び本発明のケモカインポリペプチドのそれらの産生を防止することによって、ア
ンタゴニストによって処置され得る。
【０３４４】 アンタゴニストはまた、動脈壁における単球浸潤を妨げることによってアロテ
ーム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。
【０３４５】 アンタゴニストはまた、ケモカイン誘導性肥満細胞および好塩基球脱顆粒なら
びにヒスタミンの放出を阻害することによって、ヒスタミン媒介性アレルギー反
応および免疫学的障害（遅延相アレルギー反応、慢性蕁麻疹、およびアトピー性
皮膚炎）を処置するために使用され得る。アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹
のようなＩｇＥ媒介性アレルギー反応もまた処置され得る。
【０３４６】 アンタゴニストはまた、創傷領域への単球の誘引を妨げることによって、慢性
および急性の炎症を処置するために使用され得る。それらはまた、正常な肺性マ
クロファージ集団を調節するために使用され得る。なぜなら、慢性および急性の
炎症肺性疾患は、肺における単核食細胞の隔絶と関係するからである。
【０３４７】 アンタゴニストはまた、患者の関節における骨膜体液への単球の誘引を妨げる
ことによって慢性関節リウマチを処置するために使用され得る。単球流入および
活性化は、退行性および炎症性関節症の両方の病原に有意な役割を果たす。
【０３４８】 アンタゴニストは、主としてＩＬ−１およびＴＮＦに起因する有害なカスケー
ドを妨害するのに使用され得、これは、他の炎症性サイトカインの生合成を妨げ
る。この方法において、アンタゴニストは、炎症を妨げるために使用され得る。
アンタゴニストはまた、ケモカインによって誘導されるプロスタグランジン非依
存性発熱を阻害するために使用され得る。
【０３４９】 アンタゴニストはまた、骨髄の不全（例えば、再生不良性貧血および脊髄形成
異常症候群）の症例を処置するために使用され得る。
【０３５０】 アンタゴニストはまた、肺における好酸球蓄積を妨げることによって、喘息お
よびアレルギーを処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、喘息肺
の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を処置するために使用され得る。
【０３５１】 アゴニスト。ＭＰＩＦ−１アゴニストは、本明細書中に記載されるような任意
の１つ以上のこれらのポリペプチドに類似した活性を有する任意の小分子を含む
。例えば、ＭＰＩＦ−１アゴニストは、ＭＰＩＦ−１活性を増強するために使用
され得る。例えば、化学療法または骨髄移植を受けた患者におけるＭＰＩＦ−１
誘導性骨髄保護を増強するために。
【０３５２】 疾患診断および予後。下記に考察されるような、所定の疾患または障害は、対
応する「標準的」哺乳動物（すなわち、疾患または障害を有さない同じ種の哺乳
動物）と比較した場合、ＭＰＩＦ−１タンパク質およびＭＰＩＦ−１タンパク質
をコードするｍＲＮＡの増大したレベルと関連し得る。さらに、増大したレベル
のＭＰＩＦ−１タンパク質が、疾患または障害を有さない哺乳動物に由来する血
清と比較した場合に、疾患または障害を有する同じ種の哺乳動物由来所定の体液
（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）において検出され得る。従って、本発
明は、診断方法を提供する。これは、哺乳動物の細胞または体液中のＭＰＩＦ−
１タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイすること、およびその
遺伝子発現レベルと標準ＭＰＩＦ−１遺伝子発現レベルとを比較することを含み
、それによって、標準を上回る遺伝子発現レベルにおける増大が、特定の疾患ま
たは障害の指示物となる。
【０３５３】 疾患または障害の診断が、通常の方法に従ってすでに行われた場合、本発明は
、予後指示物として有用であり、それによって増大したＭＰＩＦ−１遺伝子発現
を示す患者は、より低いレベルで遺伝子を発現する患者と比較してより悪い臨床
結果を経験する。
【０３５４】 「ＭＰＩＦ−１タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」
によって、直接的に（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベル
を決定するか、または見積もることによって）または相対的に（例えば、第２の
生物学的サンプル中のＭＰＩＦ−１タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比
較することによって）のいずれかで、第１の生物学的サンプル中のＭＰＩＦ−１
タンパク質のレベルあるいはＭＰＩＦ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡのレ
ベルを定性的または定量的に測定するか、もしくは見積もることが意図される。
【０３５５】 好ましくは、第１の生物学的サンプル中のＭＰＩＦ−１タンパク質レベルまた
はｍＲＮＡレベルが、測定されるか、または見積もられ、そして標準ＭＰＩＦ−
１タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較される。この標準は、疾患また
は障害を有さない個体から得られた第２の生物学的サンプルからとられる。当該
分野で理解されるように、一旦標準ＭＰＩＦ−１タンパク質レベルまたはｍＲＮ
Ａレベルが知られると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
【０３５６】 「生物学的サンプル」によって、ＭＰＩＦ−１タンパク質またはｍＲＮＡを含
む個体、細胞株、組織培養物、または他の供給源から得られた任意の生物学的サ
ンプルが意図される。生物学的サンプルは、分泌された成熟ＭＰＩＦ−１タンパ
ク質を含む哺乳動物体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および骨髄液）、およ
び卵巣、前立腺、心臓、胎盤、膵臓、腹水、筋肉、皮膚、腺、腎臓、肝臓、脾臓
、肺、骨、骨髄、眼球、末梢神経、中枢神経、乳房および臍の組織を含む。哺乳
動物から組織バイオプシーおよび体液を得るための方法は、当該分野で周知であ
る。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織バイオプシーが好ましい供給
源である。
【０３５７】 本発明は、哺乳動物における疾患を検出するために有用である。詳細には、本
発明は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における種々の免疫系関連障害の診断ま
たは処置に有用である間、有用である。このような障害は、腫瘍、ガン、および
免疫細胞機能の任意の不調節（自己免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制
、敗血症、創傷治癒、急性および慢性感染、細胞媒介免疫、体液免疫、炎症腸疾
患、骨髄抑制などが挙げられるがこれらに限定されない）を含む。好ましい哺乳
動物は、サル、尾なしザル、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒト
を含む。特に好ましいのはヒトである。
【０３５８】 総細胞ＲＮＡは、任意の適切な技術（例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよび
Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７
）に記載される単一工程グアニジン−チオシアネート−フェノール−クロロホル
ム法）を用いて生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ＭＰＩＦ−１タン
パク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を用いてアッセイさ
れる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ
−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を
含む。
【０３５９】 ノーザンブロット分析は、Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０３−３１２
（１９９０）に記載されるように行われ得る。手短には、総ＲＮＡは、上記の
ように生物学的サンプルから調製される。ノーザンブロットのために、ＲＮＡは
、適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナト
リウム緩衝液）において変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニ
トロセルロースフィルター上に移される。ＲＮＡがＵＶリンカーによってフィル
ターに連結された後、フィルターは、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハート溶液、
変性サケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中でプレハイ
ブリダイズされる。任意の適切な方法（例えば、32ＰマルチプライムＤＮＡ標識
システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って標識された、ＭＰＩＦ−１タンパク質
ｃＤＮＡは、プローブとして使用される。一晩のハイブリダイゼーションの後、
フィルターは、洗浄され、そしてｘ線フィルムに曝される。本発明に従ってプロ
ーブとして使用するためのｃＤＮＡは、上記のセクションに記載され、そして好
ましくは少なくとも１５ｂｐ長である。
【０３６０】 Ｓ１マッピングは、Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ ４９：３５７−３６７（１９
８７）に記載されるように行われ得る。Ｓ１マッピングにおいて使用するための
プローブＤＮＡを調製するために、上記ｃＤＮＡのセンス鎖は、標識アンチセン
スＤＮＡを合成するためにテンプレートとして使用される。次いで、アンチセン
スＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化されて、所望の長さの
さらなるＤＮＡプローブが作製される。このようなアンチセンスプローブは、標
的ｍＲＮＡ（すなわち、ＭＰＩＦ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡ）に対応
する保護されたバンドを可視化するために有用である。ノーザンブロット分析は
上記のように行われ得る。
【０３６１】 好ましくは、ＭＰＩＦ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、Ｍａ
ｋｉｎｏら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５−３０１（１９９０）に記載され
るＲＴ−ＰＣＲ法を用いてアッセイされる。この方法によって、ポリアクリルア
ミドゲルバンドにおける「アンプリコン」の放射能は、標識ｍＲＮＡの初期濃度
に正比例する。手短には、この方法は、生物学的サンプルから単離された総ＲＮ
ＡをＲＴプライマーおよび適切な緩衝液を含有する反応混合物中に添加すること
を含む。プライマーアニーリングのためのインキュベーションの後、混合物は、
ＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビターおよび逆転写酵素を補
充され得る。ＲＮＡの逆転写を達成するためのインキュベーションの後、次いで
、ＲＴ産物を、標識プライマーを用いるＰＣＲに供する。あるいは、プライマー
を標識しないで、ＰＣＲ反応混合物に標識ｄＮＴＰが含まれ得る。ＰＣＲ増幅は
、従来技術に従ってＤＮＡサーマルサイクラーにおいて行われ得る。増幅を達成
するための適切な回数の後、ＰＣＲ反応混合物は、ポリアクリルアミドゲル上に
電気泳動される。ゲルを乾燥させた後、適切なバンド（ＭＰＩＦ−１タンパク質
をコードするｍＲＮＡに対応する）の放射能が、イメージングアナライザーを用
いて定量される。ＲＴおよびＰＣＲ反応成分ならびに条件、試薬およびゲル濃度
、ならびに標識方法は、当該分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＲ法における改変は
、当業者に明らかである。
【０３６２】 逆転写された標的ｍＲＮＡを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーの任意の
セットが使用され得、そして上記のセクションに記載されるように設計され得る
。
【０３６３】 生物学的サンプル中のＭＰＩＦ−１タンパク質レベルをアッセイすることは、
任意の当該分野で公知の方法を用いて起こり得る。生物学的サンプル中のＭＰＩ
Ｆ−１タンパク質レベルをアッセイするために好ましいのは、抗体ベース技術で
ある。例えば、組織におけるＭＰＩＦ−１タンパク質発現は、古典的な免疫組織
学的方法で研究され得る。これらにおいて、特異的認識は、一次抗体（ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵
素、または他の結合した二次抗体を利用し得る。結果として、病理学的調査のた
めの組織切片の免疫組織学的染色が得られる。組織は、例えば、ウエスタンブロ
ットまたはドット／スロットアッセイ用のＭＰＩＦ−１タンパク質の遊離のため
に、例えば、尿素および中性界面活性剤を用いて抽出され得る（Ｊａｌｋａｎｅ
ｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０
９６（１９８７））。この技術において、これは、カチオン性固相の使用に基づ
き、ＭＰＩＦ−１タンパク質の定量は、標準として単離されたＭＰＩＦ−１タン
パク質を用いて達成され得る。この技術はまた、体液に適用され得る。これらの
サンプルを用いて、ＭＰＩＦ−１タンパク質のモル濃度は、異なる体液（例えば
、血清、血漿、尿、髄液など）についてのＭＰＩＦ−１タンパク質含量の標準値
を設定することを補助する。次いで、ＭＰＩＦ−１タンパク質量の正常な出現は
、健常な個体からの値を用いて設定され得る。これは、試験被験体から得られる
ものと比較され得る。
【０３６４】 ＭＰＩＦ−１遺伝子発現を検出するための有用な他の抗体ベース法は、免疫ア
ッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ））を含む。例えば、ＭＰＩＦ−１タンパク質特異的モノクロ
ーナル抗体は、ＭＰＩＦ−１タンパク質を検出および定量するための免疫吸着剤
および酵素標識プローブの両方として使用され得る。サンプル中に存在するＭＰ
ＩＦ−１タンパク質の量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを用いて標準
調製物中に存在する量と比較して計算され得る。別のＥＬＩＳＡアッセイにおい
て、２つの個々の特異的なモノクローナル抗体が、体液中のＭＰＩＦ−１タンパ
ク質を検出するために使用され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体は免疫
吸着剤として、そして他方の抗体は酵素標識プローブとして使用される。
【０３６５】 上記の技術は、本質的に「１工程」または「２工程」アッセイとして行われ得
る。「１工程」アッセイは、ＭＰＩＦ−１タンパク質と固定化抗体とを接触させ
る工程および、洗浄せずに、その混合物と標識抗体とを接触させる工程を含む。
「２工程」アッセイは、混合物と標識抗体とを接触させる前に洗浄する工程を含
む。他の従来の方法もまた、適切に使用され得る。通常、支持体上のアッセイ系
の１つの成分を固定化することが望ましく、それによって、系の他の成分が、そ
の成分との接触にもたらされ、そしてサンプルから容易に除去される。
【０３６６】 適切な酵素標識は、例えば、オキシダーゼ群由来のものを含み、これらは、基
質と反応することによって過酸化水素の産生を触媒する。グルコースオキシダー
ゼは、それが良好な安定を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手可
能であるので特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体／基質反
応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得
る。酵素の他に、他の適切な標識としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素（12 5 Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム
（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99mＴｃ））、および蛍光標識（例えば、蛍
光およびローダミン、およびビオチン）を含む。
【０３６７】 本発明のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドは、科学研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関するイン
ビトロ目的、ならびにヒト疾患の処置のための治療薬および診断薬を開発するた
めの目的のための研究試薬として使用され得る。例えば、ＭＰＩＦ−１は、それ
らの分化を一時的に妨げることによって、未成熟な造血前駆細胞（例えば、顆粒
球、マクロファージまたは単球）の拡大に使用され得る。これらの骨髄細胞は、
インビトロで培養され得る。
【０３６８】 全長ＭＰＩＦ−１遺伝子のフラグメントは、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリ
ダイゼーションプローブとして使用され得、全長の遺伝子が単離され、そしてそ
の遺伝子に対して高配列類似性または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子が
単離される。しかし、好ましくは、プローブは少なくとも３０塩基を有し、そし
て例えば、５０以上の塩基を含み得る。プローブはまた、全長転写物およびゲノ
ムクローンまたは完全な遺伝子（レギュレーターおよびプロモーター領域、エキ
ソン、およびイントロンを含む）を含むクローンに対応するｃＤＮＡクローンを
同定するために使用され得る。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成するための既知のＤＮＡ配列を用いることによって、遺伝子のコード
領域を単離する工程を含む。本発明の遺伝子に配列相補的な配列を有する標識オ
リゴヌクレオチドは、プローブがライブラリーのどのメンバーにハイブリダイズ
するかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブ
ラリーをスクリーニングするために使用される。
【０３６９】 本発明はまた、核酸配列中の変異の存在に関連する疾患または疾患への感受性
を検出するための診断アッセイの一部としてのＭＰＩＦ−１遺伝子の使用に関連
する。このような疾患は、ケモカインポリペプチドの過小発現に関連する。
【０３７０】 ＭＰＩＦ−１遺伝子において変異を保有する個体は、種々の技術によってＤＮ
Ａレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞から（例えば、血液
、尿、唾液、組織生検および剖検物質由来）得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出
のために直接的に使用され得るか、または分析の前にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６（１９８６））を用いることによって酵素
的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた、同じ目的で使用され得る。例
として、ＭＰＩＦ−１をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、ＭＰＩ
Ｆ−１および変異体を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠損お
よび挿入は、正常な遺伝子型との比較において増幅産物のサイズにおける変化に
よって検出され得る。点変異は、放射標識ＭＰＩＦ−１ ＲＮＡあるいは、放射
標識ＭＰＩＦ−１アンチセンスＤＮＡ配列に増幅ＤＮＡをハイブリダイズさせる
工程によって同定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅＡ消化または融
点の差異によって、ミスマッチした二重鎖から区別され得る。
【０３７１】 ＤＮＡ配列差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を有するかまたは有さないゲル
におけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によって達成
され得る。小さな配列欠損および挿入は、高解像度ゲル電気泳動によって可視化
され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメントの移
動度がそれらの特異的な融点または部分的な融点に従って異なる位置でゲルにお
いて遅延する変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別され得る（例えば、Ｍｙｅｒｓ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５）を参照のこと）。
【０３７２】 特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護）または化学切断法によって示され得る（例えば、Ｃｏｔｔ
ｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１（１９８５））。
【０３７３】 従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保
護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フ
ラグメント長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの
ような方法によって達成され得る。
【０３７４】 より慣習的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、イン
サイチュ分析によって検出され得る。
【０３７５】 本発明はまた、種々の組織におけるＭＰＩＦ−１のタンパク質の変化したレベ
ルを検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織サ
ンプルと比較したタンパク質の過剰発現が、疾患（例えば、腫瘍）の存在または
疾患（例えば、腫瘍）に対する感受性を検出し得る。宿主に由来するサンプル中
のＭＰＩＦ−１タンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当
業者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタ
ンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイを含む。
ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２），６章（１９９１））は、最初に、Ｍ
ＰＩＦ−１抗原に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を調製する
工程を含む。さらに、レセプター抗体はモノクローナル抗体に対して調製される
。レセプター抗体に、検出可能な試薬（例えば、放射能、蛍光または、この例で
は、西洋ワサビベルオキシダーゼ酵素）が付着される。サンプルは、宿主から取
り出され、そしてサンプル中のタンパク質に結合する固相支持体（例えば、ポリ
スチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意
の遊離タンパク質結合部位は、ＢＳＡのような非特異的タンパク質とインキュベ
ートすることによって覆われる。次に、モノクローナル抗体は、ポリスチレンデ
ィッシュに付着した任意のＭＰＩＦ−１タンパク質にモノクローナル抗体が付着
する時間の間、ディッシュ中でインキュベートされる。全ての非結合モノクロー
ナル抗体を緩衝液で洗い落とす。ここで、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結し
たレセプター抗体は、ディッシュ中に置かれ、ＭＰＩＦ−１に結合した任意のモ
ノクローナル抗体に対するレセプター抗体の結合を生じる。次いで、非付着レセ
プター抗体は洗い落とされる。次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュに
添加され、そして所定の期間に発生した呈色の量は、標準曲線と比較した場合、
患者サンプルの所定の容量中に存在するＭＰＩＦ−１タンパク質の量の尺度であ
る。
【０３７６】 競合アッセイは、ＭＰＩＦ−１に特異的である抗体が固相支持体および標識さ
れたＭＰＩＦ−１に付着され、そして宿主由来のサンプルが固相支持体を通過さ
れ、そして（例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーによって）検出
された標識の量は、サンプル中のタンパク質の量に相関し得る。
【０３７７】 「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイに類似する。「サンドイッ
チ」アッセイにおいて、ＭＰＩＦ−１が、固相支持体を通過され、そして固相支
持体に付着された抗体に結合する。次いで、第２の抗体はＭＰＩＦ−１に結合さ
れる。次いで、標識されかつ第２の抗体に対して特異的である、第３の抗体は、
固相支持体を通過され、そして第２の抗体に結合し、次いで量が定量され得る。
【０３７８】 本発明は、ケモカインポリペプチドのレセプターの同定のための方法を提供す
る。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の種々の方法（例えば、リ
ガンドパニングおよびＦＡＣＳ分取）によって同定され得る（Ｃｏｌｉｇａｎら
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．１（２）、５章、
（１９９１））。好ましくは、発現クローニングが使用され、ここでポリアデニ
ル化ＲＮＡがポリペプチドに応答性である細胞から調製され、そしてこのＲＮＡ
から作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そしてＣＯＳ細胞
、またはポリペプチドに対して応答性でない他の細胞をトランスフェクトするた
めに使用される。ガラススライド上で増殖するトランスフェクト細胞は、標識ポ
リペプチドに曝される。ポリペプチドは、種々の手段（ヨウ素化または部位特異
的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む）によって標識され得る。固定化
およびインキュベーションの後、これらのスライドは、オートラジオグラフ分析
に供される。ポジティブプールが同定され、そしてサブプールが調製され、そし
て反復性サブプーリングおよび再スクリーニングプロセスを用いて再トランスフ
ェクトされ、最終的に推定レセプターをコードする単一クローンが産生される。
【０３７９】 レセプター同定のための代替的アプローチとして、標識ポリペプチドは、細胞
膜またはレセプター分子を発現する抽出調製物と光親和性結合され得る。架橋物
質は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィルムに曝される。ポリペ
プチドのレセプターを含有する標識複合体が、切り出され、ペプチドフラグメン
トに分解され、そしてタンパク質微量配列決定に供され得る。微量配列決定から
得られるアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するために
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための変性オリゴヌクレオチドプロ
ーブの組を設計するために使用される。
【０３８０】 （治療薬）本発明のポリペプチドは、種々の免疫調節機能および炎症機能にお
いて使用され得、そしてまた多数の疾患状態において使用され得る。ＭＰＩＦ−
１は、ケモカインファミリーであり、それゆえそれらは、白血球（例えば、単球
、好中球、Ｔリンパ球、好酸球、好塩基球など）についての化学誘引物質である
。
【０３８１】 ノーザンブロット分析により、ＭＰＩＦ−１が造血性起源の組織に優先的に発
現されることが示される。
【０３８２】 （ＭＰＩＦ−１治療／診断適用）ＭＰＩＦ−１は、免疫応答および炎症の調節
において重要な役割を果たすことが示される。図１３において、リポポリサッカ
ライドが、ヒト単球からＭＰＩＦ−１の発現を誘導することが示される。従って
、エンドトキシンの存在に応答して、ＭＰＩＦ−１は、単球から発現され、それ
ゆえ、ＭＰＩＦ−１の投与は、宿主の免疫応答を調節するために使用され得る。
ＭＰＩＦ−１は、抗炎症剤として使用され得る。
【０３８３】 図４に示されるように、ＴＨＰ−１細胞（Ａ）およびＰＢＭＣ（Ｂ）における
ＭＰＩＦ−１の化学誘引活性が有意である。ＭＰＩＦ−１はまた、ＴＨＰ−１細
胞において有意なカルシウム動員を誘導し（図５）、これは、ＭＰＩＦ−１が単
球に対して生物学的効果を有することを示す。さらに、ＭＰＩＦ−１は、用量依
存性化学向性を生じ、カルシウム動員はヒト単球において応答する。
【０３８４】 さらに、本発明のポリペプチドは、抗腫瘍治療において有用であり得る。なぜ
なら、腫瘍に注射されたケモカイン発現細胞が、例えば、カポジ肉腫の処置にお
いて、腫瘍の退行を引き起こしたからである。ＭＰＩＦ−１は、細胞がＴＮＦ−
αを分泌することを誘導し得る。ＴＮＦ−αは、腫瘍退行のための公知の因子で
ある。この場合、このタンパク質は、腫瘍退行を誘導するために使用され得る。
ＭＰＩＦ−１はまた、ヒト単球が他の腫瘍およびガンを阻害する因子（例えば、
ＩＬ−６、ＩＬ−１およびＧ−ＣＳＦ）を分泌することを誘導し得る。さらに、
ＭＰＩＦ−１は、それらの化学向性活性を介して宿主防御（殺腫瘍性）細胞（例
えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージ）の浸潤および活性化を刺激し、
そしてまた、この様式で固形腫瘍を処置するのに使用され得る。
【０３８５】 （骨髄防御） ポリペプチドはまた、造血細胞の増殖および分化を阻害するために使用され得
、それゆえ、化学療法の間に化学療法薬剤から骨髄幹細胞を保護するために使用
され得る。図６および７は、ＭＰＩＦ−１が、低増殖能力コロニー形成細胞（Ｌ
ＰＰ−ＣＦＣ）によってコロニー形成を阻害することを示す。図８は、Ｍ−ＣＩ
ＦがＭ−ＣＳＦ刺激性コロニー形成を特異的に阻害し、一方、ＭＰＩＦ−１が阻
害しないことを示す。ＭＰＩＦ−１が骨髄細胞の増殖および／または分化を有意
に阻害するので、この抗増殖性効果は、化学療法薬剤のより高用量の投与を可能
にし得、それゆえ、より効果的な化学療法処置を可能にし得る。
【０３８６】 方向付けられた前駆細胞（例えば、顆粒球、およびマクロファージ／単球細胞
）の亜集団に対するＭ−ＣＩＦおよびＭＰＩＦ−１ポリペプチドの阻害効果は、
白血病細胞の増殖を阻害するために治療的に使用され得る。
【０３８７】 さらに、本発明者らは、ＭＰＩＦ−１およびその改変体（例えば、ＭＰＩＦ−
１Δ２３）が、ヒト骨髄および顆粒球前駆体のインビトロ増殖および分化を阻害
することを見出した。同様に、動物研究は、ＭＰＩＦ−１Δ２３が、例えば、イ
ンビトロおよびインビボの両方で低増殖能力コロニー形成細胞（ＬＰＰ−ＣＦＣ
）ならびに顆粒球／単球関連前駆体の発生を特異的に阻害することを示した。こ
れらの知見は、ＭＰＩＦ−１が化学保護薬剤としての治療適用を有する。これは
、初期骨髄前駆体を一般に使用される化学治療薬物の細胞傷害性効果から保護し
得る。
【０３８８】 ＭＰＩＦ−１およびその改変体が骨髄前駆体細胞を選択的に阻害する能力を有
するため、ＭＰＩＦ−１は、骨髄増殖性障害（例えば、本質的な血小板増多症（
ＥＴ）、赤血球増加症（ＰＶ）、または突発性骨髄異形成（ＡＭＭ））を処置す
るために使用され得る。これは、臨床的に密接に関連する。各障害は、単一の造
血幹細胞の獲得された変異から生じる。これは、その幹細胞の子孫に増殖利点を
与える。これらの障害の病態生理学は、異なる細胞型の過剰生産が存在する点に
おいて異なる。ＰＶにおいて、赤血球、顆粒球、および巨核球の過剰生産が存在
する。ＥＴにおいて、定義によって、血小板ならびに白血球の過剰生産が存在す
る。ＡＭＭはまた、骨髄線維症に加えて血小板増多症または白血球増多症を示す
。
【０３８９】 ＰＶ患者の安定化は、瀉血による赤血球の除去によって取り組まれ得る。しか
し、ＥＴ患者における上昇した血小板レベルについての匹敵する治療は存在しな
い。いくつかの骨髄抑制性治療は、血小板増多症の危険性を低下するために研究
されている。放射性リン、ヒドロキシ尿素、アルキル化剤（ブスルファンおよび
クロランブシル）、インターフェロン、またはアナグレリド（ａｎａｇｒｅｌｉ
ｄｅ）での処置は、全ての示された有意な副作用を有する。詳細には、アナグレ
リドを除く各骨髄抑制性治療での急性白血病の増大した危険性が存在する。アナ
グレリドは有望な治療と見なされる。しかし、アナグレリドに対する有害な反応
が心配され、そしてその慢性の毒性能力は確立されていない。インターフェロン
は、高価であり、副作用を有し、そして非経口投与の不便さから、現在、二次系
統（ｓｅｃｏｎｄ−ｌｉｎｅ）治療である。これらの知見は、これらの疾患にお
ける治療の実質的な必要性が依然として存在することを示す。
【０３９０】 ＭＰＩＦ−１Δ２３で前処理し次いで５−ＦＵで処理したマウスでのインビボ
研究において、血小板前駆細胞増殖の阻害が示される。
【０３９１】 本発明は、さらに他の骨髄抑制性治療および薬剤と組み合わせた、ＭＰＩＦ−
１、およびその改変体の使用を含む。
【０３９２】 図９、１０および１１において、利用された細胞系統の関連細胞を取り出し、
そして得られた細胞の集団をＭ−ＣＩＦまたはＭＰＩＦ−１と接触させた。Ｍ−
ＣＩＦは、細胞のＭａｃ−１ポジティブ集団における、ほぼ５０％の減少を生じ
た。これは、図８の結果と一致する。これは、Ｍ−ＣＩＦがＭ−ＣＳＦ応答性コ
ロニー形成細胞の阻害を誘導することを示す。図１１に示されるように、ＭＰＩ
Ｆ−１は、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦに応答してコロニーを形成
する関連前駆細胞の能力を阻害する。さらに、図１２に示されるように、ＭＰＩ
Ｆ−１の用量応答は、コロニー形成を阻害することが示される。この阻害は、こ
れらの因子によって媒介される分化シグナルの特異的ブロックまたは前駆細胞に
対する細胞傷害効果に起因し得る。さらに、実施例９および１０は、ＭＰＩＦ−
１が、化学治療薬剤の細胞傷害性に対するインビトロおよびインビボの骨髄保護
活性を有することを示す。従って、ＭＰＩＦ−１は、化学療法を受ける患者につ
いての骨髄保護物として有用であり得る。
【０３９３】 上記のように、化学療法および放射線治療から生じる１つの主要な合併症は、
非病原性細胞型の破壊である。本発明は、個体における骨髄細胞増殖を抑制する
ことによる、放射線および化学治療薬剤からの骨髄保護のための方法を提供する
。これらの方法は、骨髄抑制量のＭＰＩＦ−１を単独、またはマクロファージ炎
症タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症タンパク質−２α（
ＭＲＰ−２α）、血小板因子４（ＰＦ４）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）
、マクロファージ化学向性および活性化因子（ＭＣＡＦ）、およびマクロファー
ジ炎症タンパク質関連タンパク質−２（ＭＲＰ−２）からなる群から選択される
１以上のケモカインとともにのいずれかで、放射線処置または化学治療療法の一
部として個体に投与される工程を含む。従って、本発明の骨髄抑制性組成物は、
骨髄保護性効果を提供し、そして骨髄細胞に対して有害な効果を有する治療と組
み合わせて有用である。そういうわけで、本発明の骨髄抑制性組成物は、骨髄細
胞を低周期状態に置き、それによって、例えば、放射線治療または細胞周期活性
化薬剤（例えば、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、５−ＦｕおよびＡｒ
ａ−Ｃ）を用いる化学療法によって引き起こされる細胞損傷に対する保護を提供
する。一旦、化学治療薬物が個体の系を解消した場合、ＭＰＩＦ−１によって保
護される前駆体細胞の迅速な増幅および分化を、例えば、骨髄刺激剤（例えば、
インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＧＭ−
ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ
））を用いて刺激することが望ましい。
【０３９４】 化学治療薬剤の存在下でインビボ骨髄保護を付与するＭＰＩＦ−１の能力は、
実施例１３に示される。実施例１３は、化学治療薬剤の投与の前の個体へのＭＰ
ＩＦ−１の投与が複数周期の５−Ｆｕ処置の後でさえ、血液中の血小板の回復を
加速することを示す。実施例１３に示される実験はまた、複数同期の５−Ｆｕ処
置の間のＭＰＩＦ−１処置が顆粒球のより早い回復を生じることを示す。さらに
、実施例１３の結果はまた、ＭＰＩＦ−１およびＧ−ＣＳＦが、同時投与された
場合、相加的な効果を発揮することを示唆する。
【０３９５】 示されるように、本発明者らは、ＭＰＩＦ−１、およびその変異体が、骨髄由
来の低増殖能コロニー形成細胞（ＬＰＰ−ＣＦＣ）の強力なインビトロ抑制を示
すことを見出した。ＬＰＰ−ＣＦＣは、顆粒球系統および単球系統になる二分化
性造血前駆細胞である。ＭＰＩＦ−１はまた、顆粒球および単球コロニー形成細
胞に由来するヒトＣＤ３４+幹細胞によるコロニー形成を可逆的に阻害する。本
発明者らのインビトロ化学的保護実験は、薬物である５−フルオロウラシル（５
−Ｆｕ）、シトシンアラビノシド、およびＴａｘｏｌ（登録商標）の細胞傷害性
効果から、ＭＰＩＦ−１Δ２３によるこれらの造血前駆細胞の保護を示した。
【０３９６】 インビボ化学療法モデルにおけるＭＰＩＦ−１変異体（Δ２３）の使用は、そ
れが骨髄前駆細胞ならびに好中球および血小板の末梢細胞集団の両方のより迅速
な回復を生じることを示した。さらに、実施例１０および１５に示されるように
、ＭＰＩＦ−１の投与は、５−Ｆｕで処置された実験動物において、好中球減少
症および血小板減少症からの促進された回復を生じる。従って、ＭＰＩＦ−１お
よびその変異体は、化学療法剤に関連した骨髄形成不全、顆粒球減少症、および
血小板減少症の期間を短縮し、それによってそのような薬剤の処置を受けた患者
における感染の可能性を減少する。
【０３９７】 従って、本発明は、骨髄前駆細胞の保護のための方法、および分裂する細胞を
優先的に殺傷する治療（例えば、放射線治療または細胞周期活性薬物での処置）
を受けている個体へのＭＰＩＦ−１の投与を含む血小板および顆粒球の回復を加
速することに関する。ＭＰＩＦ−１は充分量で投与されて、分裂する細胞を優先
的に殺傷する処置および薬剤に対するインビボ骨髄保護を提供する。「ＭＰＩＦ
−１が投与される」は、ＭＰＩＦ−１、ＭＰＩＦ−１のアナログ、またはそれら
の組み合わせが、治療的有効量で投与されることを意味する。ＭＰＩＦ−１の投
与の態様は、以下に詳細に考察される。
【０３９８】 ＭＰＩＦ−１は、分裂する細胞を優先的に殺傷する治療の前、後、または最中
に投与され得る。好ましい実施態様において、ＭＰＩＦ−１は、放射線治療また
は細胞周期活性薬物投与の前に投与され、ＭＰＩＦ−１が骨髄細胞の増殖を抑制
することを可能にするに充分な時間がある。本発明によってさらに意図されるこ
とは、分裂中の細胞を優先的に殺傷する治療の複数ラウンドの間の骨髄細胞を保
護するためのＭＰＩＦ−１の使用である。このような場合、ＭＰＩＦ−１は、治
療レジメンまたは処置レジメンにおいて異なる時間点で単一用量または複数用量
のいずれかで投与され得る。
【０３９９】 上記に示されるように、ＭＰＩＦ−１は、単独または１つ以上の骨髄刺激因子
と組合わせて使用され得る。骨髄刺激因子は、現在、放射線治療または細胞周期
活性薬物での処置を受ける個人において、それらの欠乏の後、骨髄細胞の増殖を
刺激するために当該分野で使用されている。例えば、Ｋａｎｎａｎ，Ｖ．ら、Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．３７：１００５−
１０１０（１９９７）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏ
ｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １９：５２９−５３７（１９９７）；Ｖａｄｈａｎ
−Ｒａｊ，Ｓ．ら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１２６：６７３−６８１（
１９９７）；Ｈａｒｋｅｒ，Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８９：１５５−１６５（１９
９７）；Ｂａｓｓｅｒ，Ｒ，ら、Ｌａｎｃｅｔ ３４８：１２７９−１２８１（
１９９６）；Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８８：３３６３−３３７
０（１９９６）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８７：３６１５−３６２
４（１９９６）を参照のこと。ＭＰＩＦ−１は、例えば分裂する細胞を殺傷する
処置の前に投与され得、そして１つ以上の骨髄刺激因子はそのような治療過程の
後または最中に投与される。このような場合、ＭＰＩＦ−１は、治療および骨髄
刺激因子（単数または複数）の投与から骨髄細胞を保護し、次いで保護された骨
髄細胞集団の拡大をもたらす。
【０４００】 骨髄刺激因子は、代表的には、治療的に有効量の化学療法薬剤での処置を受け
る患者に投与される。用量処方物および投与の態様は、処置される個体、刺激さ
れる細胞の状態、化学療法レジメンの処置の段階、および使用される骨髄刺激因
子（単数または複数）を含む多数の要因で変化し得る。例えば、ＧＭ−ＣＳＦお
よびＧ−ＣＳＦは、それぞれ約１μｇ／キログラム体重および５〜１０μｇ／キ
ログラム体重の用量で治療的に有効であり、そして皮下注射により毎日の投与さ
れ得る。例えば、Ｋａｎｎａｎ，Ｖ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．３７：１００５−１０１０（１９９７）；Ｅｎｇｅｌ
ｈａｒｄｔ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １９：
５２９−５３７（１９９７）；Ｓｎｉｅｃｉｎｓｋｉ，Ｉ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８
９：１５２１−１５２８（１９９７）を参照のこと。ＩＬ−１１は、１００μｇ
／キログラム体重までの用量範囲で毎日の皮下注射によって投与され得る。Ｇｏ
ｒｄｏｎ，Ｍ．ら，前出。しかし、１０μｇ／キログラム体重未満のＩＬ−１１
の用量が、化学療法で誘導される血小板減少症を減少することに有効であると考
えられている。Ｔｐｏは、０．３〜２．５μｇ／キログラム体重の用量範囲で静
脈内注射によって投与され得る。例えば、Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ，Ｓ．ら．，Ａ
ｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２６：６７３−６８１（１９９７）；Ｈａｒｋ
ｅｒ，Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８９：１５５−１６５（１９９７）を参照のこと。
当業者が理解するように、最適な用量処方物および投与の態様は、上記の要因を
含む多数の要因によって変化する。さらなる骨髄刺激因子についての用量処方物
および投与の態様は、当該分野で公知である。
【０４０１】 分裂する細胞を優先的に殺傷する治療を含む処置プロトコールの一部としての
骨髄刺激因子の投与のタイミングはまた、用量処方物および投与の態様について
の上記の要因とともに変化し得る。放射線治療または細胞周期活性薬物を含む処
置プロトコールの一部として骨髄刺激因子の個体への投与を開示する多数の報告
が公開されている。例えば、Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ，Ｓ．ら、前出は、化学療法
剤投与の３週前に、Ｔｐｏの単一の静脈内投薬の使用を報告する。Ｐａｐａｄｉ
ｍｉｔｒｏｕ，Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ ７９：２３９１−２３９５（１９９７）
およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：２４１
４−２４１９（１９９７）は、数週間の経過にわたって化学療法剤の投与を含む
化学療法処置法を報告する。これらの場合のそれぞれにおいて、Ｇ−ＣＳＦの用
量は、化学療法剤での処置の最初の日後および最終日の前の複数の時間点で投与
される。ＩＬ−１１およびＧＭ−ＣＳＦの両方の類似の使用法が、Ｇｏｒｄｏｎ
，Ｍ．ら、前出、およびＭｉｃｈａｅｌ，Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ
ｏｌ．２０：２５９−２６２（１９９７）に報告されている。しかし、骨髄刺激
因子の投与の最適のタイミングが、使用される特定の骨髄刺激因子、およびそれ
らが投与される条件とともに変化することを、当業者は認識している。
【０４０２】 従って、分裂する細胞を優先的に殺傷する治療が骨髄細胞に対して有する細胞
傷害作用を軽減するという骨髄刺激因子の投与は、当該分野で公知である。骨髄
刺激因子は、静脈内注射および皮下注射を含むいくつかの経路によって投与され
得る。投与される骨髄刺激因子の濃度は、多数の要因と共に広範に変化するが、
一般的に、０．１〜１００μｇ／キログラム体重の間の範囲であり、そして化学
療法処置レジメンもしくは放射線処置レジメンにおいて、種々の時間点で単回用
量または複数用量で投与され得る。しかし、骨髄刺激因子は、一般的に、化学療
法剤の投与もしくは放射線処置の前または後で投与される。当業者が理解するよ
うに、骨髄刺激因子が使用される条件は、特定の骨髄刺激因子および処置レジメ
ンの両方で変化する。
【０４０３】 当業者に明らかなように、ＭＰＩＦ−１は、一般的に造血性増殖因子の有効性
を増強するために、上記のように使用され得る。このような造血性増殖因子とし
ては、赤血球の産生を刺激するエリスロポエチン、およびより初期の幹細胞を刺
激し、それによって全ての血液細胞型の数を増加する多系列増殖因子であるＩＬ
−３が挙げられる。他には、幹細胞因子；ＧＭ−ＣＳＦ；ならびにＧ−ＣＳＦと
エリスロポエチンとのハイブリッド分子；ＩＬ−３とＳＣＦとのハイブリッド分
子；ならびにＧＭ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦとのハイブリッド分子が挙げられる。
【０４０４】 本発明の骨髄抑制性薬学的組成物もまた、骨髄細胞の過剰増殖状態を引き起こ
す白血病の処置に有用である。従って、本発明は、骨髄抑制量のＭＰＩＦ−１を
単独か、またはＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２α、ＰＦ４、ＩＬ−８、ＭＣＡＦ、お
よびＭＲＰ−２からなる群より選択される１つ以上のケモカインとともにかのい
ずれかで白血病患者に投与する工程を包含する、白血病を処置する方法をさらに
提供する。
【０４０５】 「骨髄細胞増殖を抑制すること」は、骨髄細胞の細胞増殖を減少すること、お
よび／または緩序な細胞周期（ｓｌｏｗ−ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にある
骨髄細胞の割合を増加することが意図される。上記のように、「個体」は、哺乳
動物、好ましくはヒトが意図される。本発明の骨髄抑制性組成物のアセトニトリ
ル（ＡＣＮ）とのプレインキュベーションは、骨髄前駆細胞の抑制に対するこれ
らのケモカインの比活性を有意に増強する。従って、好ましくは、投与の前に、
本発明の骨髄抑制性組成物は、Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ Ｈ．Ｅ．，ら、Ａｎｎ−Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．７１（５）：２３５−４６（１９９５）およびＰＣＴ公開ＷＯ９
４／１３３２１（これらの全体の開示が本明細書中に参考として援用される）に
記載のように、ＡＣＮで前処理される。
【０４０６】 本発明の骨髄抑制性組成物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン、
メチルメラミン、アルキルスルホン酸塩、ニトロ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｏｕｒｅ
ａ）、およびトリアジン（ｔｒｉａｚｅｎｅ）のようなアルキル化剤；葉酸アナ
ログ、ピリミジンアナログ（特に、フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシ
ド）のような代謝拮抗剤、ならびにプリンアナログ；ビンカアルカロイド、エピ
ポドフィロトキシン、抗生物質、酵素および生物学的応答変更因子のような天然
産物；ならびにプラチナ配位複合体、アントラセンジオン、ヒドロキシ尿素のよ
うな置換された尿素、メチルヒドラジン誘導体、および副腎コルチコイド抑止剤
のような雑多な産物を含む種々の化学治療剤を組み合わせて使用され得る。
【０４０７】 化学療法剤は、公知の技術に従って、既知の濃度で投与され得る。本発明の骨
髄抑制性組成物は、化学療法剤と同時に投与され得るか、または化学療法剤が投
与される前または後のいずれかで別々に投与され得る。
【０４０８】 ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２β、およびＧＲＯ−αのような特定のケモカインは
、本発明の骨髄抑制性組成物に影響する骨髄抑制を阻害（少なくとも部分的にブ
ロック）する。従って、さらなる実施態様において、本発明は、ＭＩＰ−１β、
ＭＩＰ−２β、およびＧＲＯ−αからなる群より選択される有効量の骨髄抑制阻
害性インヒビターを、以前に骨髄抑制剤ＭＰＩＦ−１を単独または１つ以上のＭ
ＩＰ−１α、ＭＩＰ−２α、ＰＦ４、ＩＬ−８、ＭＣＡＦ、およびＭＲＰ−２と
ともにのいずれかに曝された哺乳動物へ投与する工程を包含する、骨髄抑制を阻
害するための方法を提供する。
【０４０９】 （細胞傷害性剤によって誘導される損傷からの防御） 本発明のポリペプチドはまた、細胞、組織および器官に対する細胞傷害性剤誘
導性損傷／傷害を減少または阻止するために使用され得る。
【０４１０】 正常組織に対する損傷は、細胞傷害性剤に対する暴露の結果として生じる。細
胞傷害性剤は、放射線および化学療法剤を含む。放射線は、不測の、環境の、職
業上の、診断的な、および治療的な放射線の暴露であり得る。正常組織損傷はま
た、放射線療法、化学療法、ならびに放射線療法と化学療法との組み合わせのよ
うな癌処置の一般的な副作用である。正常組織に対するこの損傷は、一般的に正
常組織「効果」、組織「毒性」、「病的状態」、「合併症」および組織「反応」
（急性、亜急性または遅い）としていわれる。
【０４１１】 従って、本発明は、放射線、放射線療法、化学療法、および他の細胞傷害性剤
によって引き起こされる正常組織損傷を処置および防止するための組成物および
方法を提供する。
【０４１２】 正常組織毒性、特に急性毒性（すなわち、処置の数日または数週間内に生じる
）は、痛みを生じ、そしてさらに、感染のような合併症を導く。さらに、急性毒
性は、癌治療剤の用量を制限し、従って、効果的癌処置を危うくする。さらに、
初期毒性効果が無症状である場合（すなわち、病的状態を起こさない、および用
量制限性ではない）でさえ、これらは、遅い（慢性としても公知）効果を導き得
る（すなわち、処置の数ヵ月後または数年後に生じる）。遅い効果は、例えば、
不妊症、壊死および繊維症の遅い開始、ならびにマイトジェン誘導性癌を含む。
【０４１３】 本発明は、急性、亜急性、および遅い正常組織毒性を処置および阻止する組成
物および方法を提供する。
【０４１４】 いくつかの経路は、正常細胞および組織に対する細胞傷害性誘導性（例えば、
放射線誘導性および化学療法誘導性）損傷に関する。損傷は、直接的または間接
的であり得る。直接的損傷は、細胞成分に対する細胞傷害性剤の作用から生じ、
そして染色体における一本鎖崩壊および二重鎖崩壊を含み、遊離ラジカルおよび
反応性酸素種から細胞膜および他の細胞成分を損傷する。間接的損傷は、細胞傷
害性剤の最初の作用より下流の事象から生じる。このような下流の事象は、壊死
細胞または組織、脈管傷害、正常免疫応答および炎症性応答によって遊離ラジカ
ルの放出を含む。
【０４１５】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも１つの上記の直
接的経路および間接的経路を調節することによって、細胞、組織および器官に対
する細胞傷害性剤誘導性損傷を処置および阻止する。
【０４１６】 損傷は、（幹細胞モデルとして公知の）潜在的な分裂細胞の除去；低酸素およ
び他の効果を生じる脈管傷害；ＪｕｎおよびＥＧＲ１のような最初期遺伝子の誘
導、インターロイキンおよびＴＮＦのようなプロ炎症性サイトカインの誘導、Ｔ
ＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＢＤＧＦのような炎症性サイトカインの誘導、ならびに二次
的サイトカインカスケードの誘導を含む正常宿主修復応答；炎症性応答の効果；
炎症性細胞、間質性機能細胞および繊維芽細胞のような多様な細胞型の間の相互
作用によって引き起こされ得る 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも１つの上記の損
傷の原因を調節する。
【０４１７】 線維症は、１つ以上の方法において誘導され得る：照射された組織に存在する
単球およびマクロファージは、プロ炎症性サイトカインを賛成するために誘導さ
れ、従って、炎症性応答におけるさらなるマクロファージを漸増する；上皮細胞
および間質細胞の最初の欠失は、炎症を誘導する；照射は、ＡＰ−１の誘導を通
じて繊維性サイトカインの発現を誘導する。
【０４１８】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、線維症を導く経路の少なく
とも１つ以上を調節する。
【０４１９】 細胞は、以下のいくつかの方法で放射線および他の細胞傷害性剤に応答する：
ＪＮＫ経路を活性化して、アポトーシス性体の形成によって印付けられるアポト
ーシスを導く膜スフィンゴミエリンからのセラミド形成；他の経路によって誘導
されるアポトーシス；小核（ＭＮ）の形成によって印付けられる有糸分裂関連死
；および細胞は代謝的に活性だが分裂し得ない細胞毒誘導性の老化。
【０４２０】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、放射線および他の細胞傷害
性剤に対する上記の細胞性応答の少なくとも１つを調節する。
【０４２１】 正常組織毒性を調節する、本発明のポリペプチドのような因子は、化学的改変
因子、毒性保護剤、保護因子、細胞保護因子および救出因子としていわれる。こ
れらの因子は、癌治療の副作用を減少または阻止するために、そして放射線暴露
からの組織損傷を阻止または処置するために有用である。
【０４２２】 本明細書中で記載される場合、用語細胞傷害性剤は、化学療法剤（抗腫瘍剤と
しても公知）および不測の放射線、職業上の放射線、環境的放射線、治療的放射
線のような放射線（例えば、分画された放射線療法、分画されていない放射線療
法および過分画された放射線療法、ならびに放射線および化学療法の組み合わせ
を含む）をいう。放射線の型はまた、電離（γ）放射線、粒子放射線、低エネル
ギー移動（ＬＥＴ）、高エネルギー移動（ＨＥＴ）、紫外放射線、赤外放射線、
可視光、および感光性放射線を含む。細胞傷害性剤は、好ましくは新生物細胞を
殺すかまたは迅速な増殖細胞の細胞周期を破壊する因子を含み、そして新生物細
胞の増殖を阻止または減少するために治療的に使用される因子を含む。化学療法
剤はまた、抗腫瘍薬物として公知であり、そして当該分野において周知である。
本明細書中で使用される場合、化学療法は、単一の化学療法剤または因子の組み
合わせでの処置を含む。処置の必要な被験体において、化学療法は、外科的処置
もしくは放射線療法、または他の抗新生物処置療法（ｍｏｄａｌｉｔｙ）と組み
合わされ得る。
【０４２３】 放射線はまた、Ｘ線またはガンマ線のような高エネルギー放射線である電離放
射線を含み、高直線エネルギー移動照射、低直線エネルギー移動照射、α線、β
線、中性子線、加速電子線、および紫外線の様式でイオン対を産生するように相
互作用する。放射線はまた、光子および分裂周波中性子を含む。
【０４２４】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される放
射線および化学療法のような細胞傷害性剤の効果から正常細胞および組織を保護
する。
【０４２５】 例示的な化学療法剤は、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン（ｅｐ
ｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、アントアサイクリン、抗生物質、アクチ
ノマイシンＤ、プリカマイシン、プロマイシン、グラミシジンＤ、パクリタキセ
ル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、
コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎ
ｅ）、およびアムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）（または「ｍＡＭＳＡ」）で
ある。ビンカアルカロイド種は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ
Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃｓ（第７版）（１９８５）１２７７−１２８０頁に記載される。ビンカ
アルカロイドの例は、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビンデシンである
。エピポドフィロトキシン種は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ
Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃｓ（第７版）（１９８５）１２８０−１２８１頁に記載される。エピポ
ドフィロトキシンの例は、エトポシド、エトポシドオルソキノン、およびテニポ
シドである。アントラサイクリン抗生物質種は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉ
ｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第７版）（１９８５）１２８３−１２８５頁に記載
される。アントラサイクリン抗生物質の例は、ダウノルビシン、ドキソルビシン
、ミトキサントラオン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒａｏｎｅ）、およびビスアントレン
（ｂｉｓａｎｔｈｒｅｎｅ）である。アクチノマイシンＤ（ダクチノマイシンと
も呼ばれる）は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第
７版）（１９８５）１２８１−１２８３頁に記載される。プリカマイシン（ｐｌ
ｉｃａｍｙｃｉｎ）（ミトラマイシンとも呼ばれる）は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎ
ｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ
ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第７版）（１９８５）１２８７−１２８８
頁に記載される。さらなる化学療法剤としては、以下が挙げられる：シスプラチ
ン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂ
ｂ）、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎｇ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ
Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ミトマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標
）、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、アルトレットアミン（ａｌ
ｔｒｅｔａｍｉｎｅ）（Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ
）（Ｃｙｔｏｘａｎｇ，Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ロムス
チン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ）（ＣｅｅＮＵ（登録商標）、Ｂｒｉｓ
ｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）
（ＢＣＮＵ）（ＢｉＣＮＵ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕ
ｉｂｂ）。
【０４２６】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドと組合わせて投与され得るさら
なる治療剤はまた、アクラチノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ａ、ア
クラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、アクロニン（ａｃｒｏｎｉｎｅ）、
アクロニシン（ａｃｒｏｎｙｃｉｎｅ）、アドリアマイシン、アルデスロイキン
（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）（インターロイキン２）、アルトレットアミン（ａ
ｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）（ヘキサミエチルメラミン）、アミノグルテチミド、ア
ミノグルテチミド（サイトアドレン（ｃｙｔａｄｒｅｎ））、アミノイミダゾー
ル、カルボキサミド、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）（ｍ−ＡＭＳＡ；ア
ムシジン（ａｍｓｉｄｉｎｅ））、アナストラゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ
）（アラミデックス（ａｒｉｍｉｄｅｚ））、アンチタビン（ａｎｃｉｔａｂｉ
ｎｅ）、アントラシリン（ａｎｔｈｒａｃｙｌｉｎｅ）、アントラマイシン（ａ
ｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、アスパラギナーゼ（エルスパー（ｅｌｓ
ｐａｒ））、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｄｉｎｅ）、アザシチジン（ラダカマ
イシン（ｌａｄａｋａｍｙｃｉｎ））、アザグアニン、アザセリン、アザウリジ
ン、１，１’，１’’−ホスフィノチオイリジネトリス（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔ
ｈｉｏｙｌｉｄｙｎｅｔｒｉｓ）アジリジン、アジリノ（２’，３’：３，４）
ピロロ（１，２−ａ）インドール−４，７−ジオン、ＢＣＧ（セラシス（ｔｈｅ
ｒａｃｙｓ））、ＢＣＮＵ、ＢＣＮＵクロロエチルニトロ尿素、ベンザミド、４
−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）ベンゼン酪酸、ビカルタミド（ｂｉｃａ
ｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビスクロロエチルニトロ尿素、ブレオマイシン、ブレオマ
イシン（ブレノザン（ｂｌｅｎｏｚａｎｅ））、ブレオマイシン、ブロモデオキ
シウリジン、ブロクスウリジン（ｂｒｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ブサルファン（ｂ
ｕｓｕｌｆａｎ）（マイレラン（ｍｙｌｅｒａｎ））、カルバミン酸エチルエス
テル、カルボプラチン、カルボプラチン（パラプラチン（ｐａｒａｐｌａｔｉｎ
））、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、カルムスチン（ＤＣＮＵ）、ク
ロロマイシンＡ３、ｃｉｓ−レチノイン酸、シスプラチン（ｃｉｓ−ｄｄｐｌ；
プラチノール（ｐｌａｔｉｎｏｌ））、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）
（２−クロロデオキシアデノシン；２ｃｄａ；ロイスタチン）、コフォルマイシ
ン（ｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）、シクロロイシン、シクロホスファミド、無水シク
ロホスファミド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シタラビン（
ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シタラビン、シタラビン塩酸（ｃｙｔｏｓａｒ−ｕ）
、２−デオキシ−２−（（（メチルニトロソアミノ（ｍｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓ
ｏａｍｉｎｏ））カルボニル）アミノ）−Ｄ−グルコース、ダカルボジン（ｄａ
ｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン（コスメゲン（ｃｏｓｍｅｇｅｎ））
、ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸（セルビジン（ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）
）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、デカルバジン（ＤＴＩＣ−ｄｏ
ｍｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、デキサメサゾン、ジアンヒ
ドロガラクチトール、ジアゾオキソノルロイシン、ジエチルスチルベストール（
ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ
（タキソテーレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ）））、ドキソルビシン塩酸（アドリアマイ
シン）、ドキソルビシンデヒドロクロリド、エフロルニチン（ｅｆｌｏｒｎｉｔ
ｈｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、エストラムスチ
ンリン酸ナトリウム（ｅｍｃｙｔ）、エチオジズ油（ｅｔｈｉｏｄｉｚｅｄ ｏ
ｉｌ）、エソグルシド（ｅｔｈｏｇｌｕｃｉｄ）、エチルカルバメート、エチル
メタンスルフォネート、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ＶＰ １６−２１
３）、フェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏ
ｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｕｄｒ）、フロクスウリジン（ｆｌ
ｕｄａｒａ）、フロクスウリジン（５−ＦＵ）、フルオキシメステロン（ｆｌｕ
ｏｘｙｍｅｓｔｅｒｏｎｅ）（ハロテスチン（ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ））、フル
タミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、フルタミド（ｅｕｌｅｘｉｎ）、フロクスウリ
ジン（ｆｌｕｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ニトロガリウム（グラニト（ｇｒａｎｉｔｅ
））、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ゲムザー（ｇｅｍｚａｒ））、
ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、（２−デオキシ−２−（３−メチル−３
−ニトロソウレイド（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅｉｄｏ））−Ｄ−グルコピラノース
）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ（ゾラデックス（ｚｏｌａｄｅｘ）））、
ヘキセストロール（ｈｅｘｅｓｔｒｏｌ）、ヒドロキシウレア（ヒドラ（ｈｙｄ
ｒａ））、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ（イダマイシン（ｉｄａｍｙｃ
ｉｎ）））、イホスファゲムシタビン（ｉｆｏｓｆａｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）
、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ（イフレックス（ｉｆｌｅｘ）））、
イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）ウィズメスナ（ｗｉｔｈｍｅｓｎａ）
（ＭＡＩＤ））、インターフェロン、インターフェロンα、インターフェロンα
−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ３、インターロイ
キン−２、イオベングアン（ｉｏｂｅｎｇｕａｎｅ）、イオベングアン イオベ
ングアン、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（カンプトサー（ｃａｍｐｔｏ
ｓａｒ）））、イソトレチノイン（ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ（アクトン（ａｃ
ｃｕｔａｎｅ）））、ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、４−（ビ
ス（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリンジアゾア
セテート、レンチノン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）、ロイコボリン、ロイプラリド（ｌ
ｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）ａｃｅｔａｔｅ（ＬＨＲＨ−アナログ）、レバミゾール（
エルガミゾール（ｅｒｇａｍｉｓｏｌ））、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ（
ＣＣＮＵ；ｃｅｅ−ＮＵ））、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、
マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、メクロレサミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔ
ｈａｍｉｎｅ）、メクロレサミン塩酸（ナイトロジェンマスタード）、メドロキ
シ（ｍｅｄｒｏｘｙ）プロゲルテロン酢酸（プロベラ（ｐｒｏｖｅｒａ）、デプ
プロベラ（ｄｅｐｏ ｐｒｏｖｅｒａ））、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏ
ｌ）酢酸（メナス（ｍｅｎａｃｅ））、メゲステロール酢酸、メルファラン（ｍ
ｅｌｐｈａｌａｎ）（アルケラン（ａｌｋｅｒａｎ））、メノラリル（ｍｅｎｏ
ｇａｒｉｌ）、メルカプトプリン、メルカプトプリン（プリネトール（ｐｕｒｉ
ｎｅｔｈｏｌ））、無水メルカプトプリン、ＭＥＳＮＡ、ｍｅｓｎａ（ｍｅｓｎ
ｅ））、メタンスルホン酸、エチルエステル、メトトレキサート（ｍｔｘ；メト
トレキサート））、メチル−ｃｃｎｕ、ミノシン（ｍｉｍｏｓｉｎｅ）、ミソニ
ダゾール（ｍｉｓｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、ミサラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃ
ｉｎ）、ミトアントロン（ｍｉｔｏａｎｔｒｏｎｅ）、ミトブロニトール（ｍｉ
ｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトラク
トール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ミトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ（ムタマ
イシン（ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）））、ミトマイシンＣ、ミトタン（ｍｉｔｏｔａ
ｎｅ（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ；リゾドレン（ｌｙｓｏｄｒｅｎ）））、ミトキサント
ロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトキサントロン塩酸（ノバントロン（ｎ
ｏｖａｎｔｒｏｎｅ））、モピダモル（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ビス（
２−クロロエチル）テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキザホスホリン−２−
アミン−２−オキシド、（Ｎ−（１−メチルエチル）−４−（（２−メチルヒド
ラジノ（ｈｙｄｒａｚｉｎｏ））メチル）ベンザミド、Ｎ−メチル−ビス（２−
クロロエチル）アミン、ニカルジピン、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ（ニ
ランドロン（ｎｉｌａｎｄｒｏｎ））、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ニ
トラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）、ナイトロジェンマスタード、ノコダゾー
ル、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅ
ｏｔｉｄｅ（サンドスタチン（ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ））、パクリタキセル（
ｔａｘｏｎ）、パクリタキセル、パクタマイシン（ｐａｃｔａｍｙｃｉｎ）、ペ
ガスパーガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ（ＰＥＧｘ−１））、ペントスタチ
ン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）（２’−デオキシコフォルマイシン（ｃｏｆｏｒ
ｍｙｃｉｎ））、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ペプチセミオ（ｐ
ｅｐｔｉｃｈｅｍｉｏ）、フォトフォレシス（ｐｈｏｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、
ピカマイシン（ｐｉｃａｍｙｃｉｎ（ミスラシン（ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）））、
ピチバニル（ｐｉｃｉｂａｎｉｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、
ピリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ポドフィロックス（ｐｏｄｏｆｉｌ
ｏｘ）、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ポルフィロ
マイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プレドニゾン、プロカルバジン、プロ
カルバジン塩酸（マツラン（ｍａｔｕｌａｎｅ））、プロスピジウム（ｐｒｏｓ
ｐｉｄｉｕｍ）、ピューロマイシン、ピューロマイシンアミノヌクレオシド、Ｐ
ＵＶＡ（プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）＋紫外ａ）、ピラン（ｐｙｒａｎ）コ
ポリマー、ラパマイシン、ｓ−アザシチジン、２，４，６−トリス（１−アジリ
ジニル）−ｓ−トリアジン、セムルスチン（ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ショードマ
イシン（ｓｈｏｗｄｏｍｙｃｉｎ）、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、スト
レプトゾシン（ザノサー（ｚａｎｏｓａｒ））、スラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）、
クエン酸タモキシフェン（ノルバデックス（ｎｏｌｖａｄｅｘ））、タキサン（
ｔａｘｏｎ）、テガフール（ｔｅｇａｆｕｒ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉ
ｄｅ）（ＶＭ−２６；ブモン（ｖｕｍｏｎ））、テヌアゾニック（ｔｅｎｕａｚ
ｏｎｉｃ）酸、ＴＥＰＡ、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、チオ
−テーパ（ｔｈｉｏ−ｔｅｐａ）、チオグアニン、チオテーパ（ｔｈｉｏｔｅｐ
ａ（チオプレックス（ｔｈｉｏｐｌｅｘ））、チロロン（ｔｉｌｏｒｏｎｅ）、
トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ（ベサ
ノイド（ｖｅｓａｎｏｉｄ））、トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、
トリコデルミン（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉｎ）、トリエチレングリコールジグリ
シジルエーテル、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチ
レンチオホスホラミド、トリメトレキサート（ニュートレキシン（ｎｅｕｔｒｅ
ｘｉｎ））、トリス（１−アジリジニル）ホスフィンオキシド、トリス（１−ア
ジリジニル）ホスフィンスルフィド、トリス（アジリジニル）−ｐ−ベンゾキノ
ン、トリス（１−アジリジニル）ホスフィンスルフィド、ウラシルマスタード、
ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、ビダラビンホスフェート、ビンブラスチ
ン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチンスルフェート（ベルバン（ｖｅ
ｌｂａｎ））、ビンブラスチンスルフェート（オンコビン（ｏｎｃｏｖｉｎ））
、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ
）、ビノレルビン酒石酸塩（ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ））、（ｌ）−ミ
ノシン（ｍｉｍｏｓｉｎｅ），１−（２−クロロエチル）−３−（４−メチルシ
クロヘキシル）−ｌ−ニトロ尿素、（８Ｓ−ｃｉｓ）−１０−（（３−アミノ−
２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リゾ（ｌｙｘｏ）−ヘキソピラノシル）オ
キシ）７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−
（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオン（ｎａｐ
ｈｔｈａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）、１３１−メタイオドベンジルグアニジン（Ｉ−
１３１ ＭＩＢＧ）、５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼニル）−１Ｈ−イ
ミダゾール−４−カルボキサミド、（５−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）
−２，４（ｌＨ，３Ｈ）−ピリミジンジオン、２，４，６−トリス（１−アジリ
ジニル）−ｓ−チアジン、２，３，５−トリス（１−アジリジニル）−２，５−
シクロヘキサジエン−１，４−ジオン、２−クロロ−Ｎ−（２−クロロエチル）
−Ｎ−メチルエタナミン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）テトラヒドロ−２
Ｈ−１，３，２−オキサザホスホリン（ホスフォリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎ）
）−２−アミン−２−オキシド）、３−デアザウリジン、３−イオドベンジルグ
アニジン、５，１２−ナフタセネジオン、５−アザシチジン、５−フルオロウラ
シル、（１ａＳ，８Ｓ，８ａＲ，８ｂＳ）−６−アミノ−８−（（（アミノカル
ボニル）オキシ）メチル）−１，ｌａ，２，８，８ａ，８ｂ−ヘキサヒドロ−８
ａ−メトキシ−５−メチルアジリノ（２’，３’：３，４）ピロロ（ｐｙｒｒｏ
ｌｏ）（１，２−ａ）インドール−４，７−ジオン、６−アザウリジン、６−メ
ルカプトプリン、８−アザグアニン、およびこれらの組合わせ。
【０４２７】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドと組合わせて投与され得る好ま
しい治療剤および組み合わせは、ドキソルビシンおよびドキセタキセル（Ｄｏｚ
ｅｔａｚｅｌ）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ（登録商標））、パクリタキ
セル、カルボプラチンおよびタキソール、タキソール、シスプラチンと放射線、
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−ＦＵと放射線、トキソテーレ（Ｔｏｘ
ｏｔｅｒｅ（登録商標））、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、Ａｒａ
Ｃ、エトポシド、ビンクリスチン、およびビンブラスチンを含む。
【０４２８】 例示的化学療法剤はまた、ドキセタキセル（Ｔｏｘｏｔｅｒｅ（登録商標））
およびトポテカン（登録商標）を含む。さらなる化学療法剤および他の細胞傷害
性剤は、以下の「薬学的組成物」に記載されるものを含む。
【０４２９】 さらなる化学療法剤および他の細胞傷害性剤は、以下の「エピトープおよび抗
体」ならびに本明細書中の他の部位に記載されるもの、ならびに当該分野におい
て周知である他のものを含む。
【０４３０】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、放射線損傷について予防的
におよび／または治療的に使用され得る。
【０４３１】 低い、中程度の、または高い用量の放射線に対する、細胞、組織および器官の
防護のために予防的または治療的に投与される本発明のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドは、放射線暴露に起因する損傷から、人または動物の個体および集
団を防護する。このような損傷としては、胃腸管系障害、体重減少、放射線病、
放射線熱傷、内分泌障害、甲状腺腫、目の疾患（例えば、ドライアイ症候群）、
炎症性疾患、心理学的障害、呼吸器系障害、尿生殖器系障害、循環系障害、なら
びに白血病および甲状腺がんのような癌、そして当該分野において周知の他の障
害が挙げられる。放射線暴露に起因する損傷は、細胞および組織に対する損傷を
含む。例えば、上記の損傷、細胞性ＤＮＡに対する損傷、細胞性画分における破
壊（ＤＮＡ画分の破壊によるような）、細胞死、癌誘導（治療誘導性二次的腫瘍
誘導および他の癌誘導を含む）。
【０４３２】 核兵器の増加および核実験の範囲は、世界のいくつかの領域において増加して
いる。さらに、原子力発電（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｗｅｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎ）の使用および工業の発達（例えば、核燃料処理および核兵器の除去）は、放
射線暴露の危険性を増加してきた。例えば、過去５０年の間に、４つの主要な放
射能事故（Ｋｉｓｔｙｍ（ＵＳＳＲ）およびＷｉｎｄ−Ｓｃａｌｅ（Ｅｎｇｌａ
ｎｄ）（１９５７年）、Ｔｈｒｅｅ Ｍｉｌｅ Ｉｓｌａｎｄ（ＵＳＡ）（１９
７９年）ならびにＣｈｅｒｎｏｂｙｌ（ＵＳＳＲ）（１９８６年））が報告され
た。これらの放射線の放出は。種々のレベルの放射能への広範な暴露を生じた。
Ｃｈｅｒｎｏｂｙｌにおける原子力発電所（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｌａｎｔ）での
事故に起因して、その領域内外の居住者および動物（例えば、家庭内動物）は、
深刻な影響を被った。
【０４３３】 １９５０年代初期において、システアミンおよび関連アミノアルキルチオール
が放射線に対して生物体を保護し得ることが見出された。特に、それらの物質が
マウスのＸ線への暴露の前に与えられた場合、これらの物質は、Ｘ線放射線の致
死的影響を減少した。この調査は、よりよい放射線保護剤を発見するために進行
中である。例えば、アミフォスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）および他のアミノ
アルキルジヒドロゲンホスホロチオエート（米国特許第３，８９２，８２４号）
は、特に、軍事的紛争の間に遭遇され得るＸ線または核放射線に対して使用され
る保護剤として本来発見された。最も保障される薬剤は、アミフォスチン（ＷＲ
２７２１（Ｓ−２（３−アミノプロピルアミノ）−エチル−ホスホロチオール酸
））であり、これは、体内でアミノアルキルチオールに分解して、この効果は、
システアミンの効果と同様である。しかし、ＷＲ２７２１の使用は、臨床的耐性
が乏しいことにより制限されてきた（Ｃａｉｒｎｉｅ，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒ
ｅｓ．９４：２２１（１９８３）；Ｔｕｒｒｉｓｉら、Ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃ
ｔｅｒｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ，ＮｙｇａａｒｄおよびＳ
ｉｍｉｃ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，６８１−６９
４頁（１９８３）；Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎ
ｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．８：５６１（１９８２））。
【０４３４】 本発明は、放射線誘発性損傷を保護するための方法を提供し、この方法は、放
射線投与の前および／または同時および／または後で受け入れ可能であり、そし
て、ヒトのような哺乳動物における使用を可能にするように、比較的低い非毒素
濃度で有効であり、そして以下に記載されるように、複数の投与ならびに単回の
投与を可能にする。
【０４３５】 上記のように、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、放射線また
は他の細胞障害性薬剤に起因する損傷から、細胞、組織および器官を保護、回復
および処置し、そして放射線のような細胞障害性因子に暴露された個体の生存率
を増加する。暴露の前、間および／または後に投与された本発明のポリペプチド
およびポリヌクレオチドは、放射線によって引き起こされる損傷の重篤度を排除
または軽減する。
【０４３６】 結果として、放射線暴露は、例えば、偶発的暴露、意図的暴露、内部的暴露、
外部的暴露、職業的暴露、環境的暴露、ラドン、核汚染であり得、そして例えば
、核爆発、原発事故または太陽フレアによって放出される放射線を含む。このよ
うな暴露は、例えば、原子力産業の労働者において、軍人において、一般人にお
いて、救急隊員において、核爆発および原発事故の生存者において、医療分野の
労働者において、患者において、および宇宙飛行士において生じる。本発明のポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、放射線の他の供給源（例えば、救急
隊員、一般人または軍人、あるいは宇宙飛行士が遭遇し得るような放射線）に対
する処置または保護を提供する際に有用であり得る。
【０４３７】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、放射線暴露に起因
する損傷を、予防的および／または治療的に、予防、軽減または処置するために
投与され得る。
【０４３８】 本発明は、放射線に起因する損傷から、個体を保護または処置するための方法
を提供し、この方法は、この個体に有効量の本発明のポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドを投与する工程を包含する。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドは、放射線に起因する損傷に対する保護剤であり、そして放射線暴露の前
、間、および／または同時に投与され得る。上記または以下で記載されるように
、保護剤（例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）は、処置の
予防的方法および治療的方法において有用である。
【０４３９】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、放射線に暴露されたようで
ある個体（例えば、原子力産業の労働者、軍人、宇宙飛行士、放射線を含む診断
方法および治療方法に従事している医療分野の労働者、または診断または処置の
目的のために放射線に曝されるべきである患者）の予防的処置および治療的処置
のために有用である。本明細書中の別の箇所に記載されるように、本発明のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、癌の放射線治療における補助剤として
有用であり、ここで、このポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、癌組織を放
射線治療によって破壊しつつ、正常な組織を選択的に保護する。
【０４４０】 従って、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、放射線への暴露の
危険のある個体に、予防的または治療的に投与され得る。予防的使用は、可能性
のある放射線損傷を予防または軽減し、そして治療的使用は、現存の損傷を処置
または軽減し、そしてさらなる損傷を、遅らせるか、軽減するかまたは予防する
。
【０４４１】 有効量は、所望の効果を達成するのに十分な本発明のポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドの量として理解されるべきである。このような効果は、予防的効果
または治療的効果、あるいはその両方であり得る。有効量は、当該分野で周知で
あるかまたは以下で記載されるように、個体が暴露される放射線のタイプおよび
量を含む様々な因子、ならびに投与レジメンなどに依存する。例えば、投薬量は
、以下で本明細書全体にわたって記載されるような投薬量である。
【０４４２】 本発明のポリペプチドは、化学治療剤および放射線を用いる処置の間に胃腸管
を保護することが示された（実施例１６〜１８を参照のこと）。さらに、本発明
のポリペプチドは、照射の後に投与された場合、胃腸管の放射線誘導性損傷を軽
減することが示された（実施例１６〜１８を参照のこと）。
【０４４３】 従って、本発明のポリペプチドは、上皮を保護するために用いられ得る。「上
皮」とは、血管および他の小さな管腔の内層を含む、身体の内面および外面の皮
膜をいう。これは、少量の接着物質で連結された細胞からなる。上皮は、層の数
、表在細胞の深さおよび形状に基づいてタイプ分けされる。上皮細胞としては、
前角膜、バレット上皮、円柱上皮、線毛上皮、円柱上皮、角膜上皮、肘上皮、半
規管上皮、エナメル上皮、偽上皮、胚上皮、歯肉上皮、腺上皮、糸球上皮、重層
上皮、水晶体上皮、間葉上皮、嗅上皮、単層扁平上皮、色素性上皮、保護上皮、
多列上皮、錐体上皮、気道上皮、杆状体上皮、精上皮、精上皮、単層上皮、扁平
上皮、重層上皮、被膜上皮、歯肉溝上皮、豹紋状上皮、移行上皮、ならびに目、
下、腺、口腔粘膜、十二指腸、回腸、空腸、盲腸、鼻孔、食道、結腸、乳腺、お
よび男性生殖器系および女性生殖器系の上皮細胞が挙げられる。
【０４４４】 「腺」とは、通常の代謝の必要性と関係のない物質を分泌または排出すること
を専門にする細胞の凝集物をいう。上皮細胞を含み得る腺の例には以下が挙げら
れる：吸収腺、副腺、腺房腺、胃酸分泌腺、副耳下腺、副腎腺、パイアー斑、ア
ルバラン腺、肛門腺、胞状腺、尿道球腺、大動脈腺、前舌腺、アポクリン腺、乳
輪腺、動脈腺、尾骨小体腺、披裂腺、アセリ腺、アヴィセナ腺、アトリビリアリ
ー（ａｔｒｉｂｉｌｉａｒｙ）腺、腋窩リンパ腺、バルトリン腺、ボアン腺、バ
ウムガルテン腺、胆管粘膜の腺、ブランダン腺、血管腺、ブールハーフェ腺、ボ
ネー腺、ボーマン腺、上腕リンパ節、気管支腺、ブルーフ腺、ブルンナー腺、頬
腺、球海綿体筋腺、噴門腺、頸動脈腺、腹腔リンパ腺、耳道腺、子宮頸腺、脈絡
膜腺、チャッチョ腺、結膜の睫毛腺、肛門周囲腺、クロケー腺、コベルリ腺、尾
骨小体腺、コイル状腺、複合腺、凝塊腺、結膜腺、カウパー腺、皮膚腺、細胞腺
、内分泌腺、十二指腸腺、デュヴェルネー腺、エブナー腺、エクリン汗腺、エグ
リ腺、内分泌腺、上皮内腺、食道腺、排出腺、外分泌腺、管の胞状腺、底腺、胃
腺、胃大網腺、ゲイ腺、生殖器腺、歯肉腺、グレー腺、球状腺、糸球体腺、口蓋
舌腺、ゲラン腺、喉頭腺、ハラー腺、ハルダー腺、ハヴァース腺、ヘドニック腺
、血リンパ腺、血液リンパ腺、造血腺、血リンパ腺、ヘンレ腺、肝腺、異質分泌
、冬眠腺、ホロクリン腺、および内分泌腺。
【０４４５】 腺のさらなる例としては以下が挙げられる：頸動脈間腺、中間腺、肩甲間腺、
間質腺、腸腺、上皮内腺、舌の筋肉内腺、頸腺、クラウゼ腺、口の口唇腺、涙腺
、副涙腺、乳腺、大腸の腺、大汗腺、喉頭腺、胃および舌のレンズ状腺、リーベ
ルキューン腺、舌腺、前舌腺、リトル腺、ルシュカ腺、リンパ腺、錐体外路リン
パ腺、臼歯腺、乳腺、副乳腺、下顎腺、マンツ腺、メーリス腺、マイボーム腺、
メロクリン腺、腸間膜リンパ腺、結腸間膜腺、混合腺、臼歯腺、モル腺、単形腺
、モントゴメリー腺、モルガニー腺、口の腺、滑膜腺、粘液分泌腺、粘液腺、舌
粘液腺、耳管の粘液腺、十二指腸の粘液腺、エウスターキオ管の粘液腺、多細胞
腺、子宮筋層腺、ナボット腺、ナーボト腺、鼻腺、頸の腺、包皮の臭腺、脂腺、
嗅腺、胃酸分泌腺、パッキオーニ腺、口蓋腺、膵脾リンパ節、小帯傍腺、上皮小
体、尿道腺、耳下腺、副耳下腺、胸部リンパ節、ペプシン分泌腺、汗腺、ペール
腺、咽頭腺、フィリップ腺、松果体、および下垂体。
【０４４６】 腺の他の例としては以下が挙げられる：ポワリエ腺、多層腺、尾腺、妊娠腺、
副甲状腺、包皮腺、前立腺、思春期腺（ｐｕｂｅｒｔｙ ｇｌａｎｄ）、幽門腺
、ブドウ房状腺、舌後腺、臼歯後腺、リビヌス腺、ローゼンミュラー腺、単胞状
腺、唾液腺、腹部唾液腺、耳下腺、内唾液腺、サンドストレーム腺、シュラー腺
、皮脂腺、結膜の皮脂腺、前哨リンパ腺、混合腺、漿液腺、セール腺、ジンモン
ツ腺、スキーン腺、単純腺、小腸の腺、大腸の孤立リンパ腺、脾臓腺、シュテー
ル腺、ブドウ房腺、耳介下腺、舌下腺、顎下腺、汗腺、副腎、副副腎、シュザー
ヌ腺、汗腺、滑液腺、瞼板腺、タイレ腺、胸腺、甲状腺、副耳下腺、舌の腺、気
管腺、トラコーマ腺、細葉性管状腺、胸部腺、タイソン腺、単細胞腺、尿道腺、
女性尿道の尿道腺、尾腺、子宮内膜腺、卵形嚢腺、腟腺、血リンパ腺、前庭腺（
大前庭腺および小前庭腺）、フィルヒョー腺、卵黄腺、大前庭腺、ヴァルダイア
ー腺、ヴェーバー腺、ヴォルフリング腺、ツァイス腺、およびツッカーカンドル
腺。
【０４４７】 腺のさらなる例としては以下が挙げられる：蛋白腺、パイアー腺、耳管腺、腋
窩汗腺、尿道球腺、食道の噴門腺、エウスターキオ管の腺、胞状腺、ガレアーテ
ィ腺、頬腺、ハルダー腺、鼠径腺、腎間体、クノル腺、ルシュカ腺、マルピーギ
腺、骨髄リンパ節、下垂体腺、顎下腺、メリー腺、ヌーン腺、瞼板腺、気管周腺
、松果体、精嚢腺、顎下腺、汗腺、副甲状腺、テルソン腺、ティーデマン腺、管
状胞状腺、トラコーマ腺、大前庭腺、ヴァスマン腺、ヴェプファー腺、およびウ
ルフ腺。
【０４４８】 従って、ＭＰＩＦ−１は、任意のこれらの細胞またはこれらの腺内の細胞を保
護するために用いられ得る。
【０４４９】 ＭＰＩＦ−１は、筋肉細胞（例えば、心筋細胞、骨格筋細胞および平滑筋細胞
）；上皮細胞（例えば、内皮細胞を含む扁平上皮細胞、立方上皮上皮細胞および
円柱上皮細胞）；神経組織細胞（例えば、ニューロンおよび神経膠）における細
胞障害性因子誘導性損傷を保護または軽減するために使用され得る。ＭＰＩＦ−
１はまた、筋肉組織、神経組織、上皮組織、内皮組織および結合組織の細胞障害
性因子誘導性損傷を保護または軽減するために使用され得る。
【０４５０】 さらに、ＭＰＩＦ−１は、分裂している細胞、分裂していない細胞、末端分化
細胞、多能性幹細胞、前駆細胞および非前駆幹細胞の細胞障害性因子誘導性損傷
を保護または軽減するために使用され得る。
【０４５１】 従って、ＭＰＩＦ−１は、神経系細胞（例えば、皮質ニューロン、内部ニュー
ロン、中心エフェクターニューロン、末梢エフェクターニューロンおよび双極ニ
ューロンを含むニューロン；ならびにシュヴァン細胞、稀突起神経膠細胞、星状
細胞、小グリアおよび上衣を含む神経膠）の損傷を処置するために使用され得る
。
【０４５２】 さらに、以下の内分泌および内分泌関連細胞はまた、ＭＰＩＦ−１を使用して
細胞障害性因子から処置または保護され得る：下垂体（上皮細胞、下垂体細胞、
神経膠、無顆粒性色素嫌性細胞、無顆粒性色素親和細胞（好酸性および好塩基性
細胞）を含む）；副腎細胞（エピネフリン分泌細胞、非エピネフリン分泌細胞、
骨髄細胞、頸部細胞（球状帯、束状帯および網状帯の細胞）を含む）；甲状腺細
胞（上皮細胞（主および傍濾胞細胞）を含む）；上皮小体細胞（上皮細胞（主細
胞および好酸性細胞）を含む）；膵臓細胞（ランゲルハンス細胞の細胞（α、β
、およびδ細胞）を含む）；松果体細胞（実質細胞および神経膠細胞を含む）；
胸腺細胞（傍濾胞細胞を含む）；精巣の細胞（精細管細胞、間質細胞（ライディ
ヒ細胞）、精原細胞、精母細胞（一次および二次）、精子細胞、精子、セルトー
リ細胞および筋様細胞を含む）；卵巣の細胞（卵子、卵原細胞、卵母細胞、顆粒
膜細胞、胃膜細胞（内部および外部）、胚上皮細胞および小胞細胞（始原細胞、
小嚢細胞、成熟細胞および退縮細胞）を含む）。
【０４５３】 ＭＰＩＦ−１は、筋肉細胞（例えば、筋原線維、錘内線維および錘外線維）の
細胞障害性因子誘導性損傷を処置するために使用され得る。ＭＰＩＦ−１は、骨
格系細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞、およびそれらの前駆細胞）の細胞障害性
薬物誘導性損傷を処置するために使用され得る。
【０４５４】 以下の循環器系細胞はまた、ＭＰＩＦ−１を使用して細胞障害性因子から処置
または保護され得る：心臓細胞（心筋細胞）；血液およびリンパの細胞（エリト
ロポイエチン感受性幹細胞、赤血球、白血球（例えば、好酸球、好塩基および球
好中球（顆粒細胞）、およびリンパ球および単球（無顆粒細胞）を含む）、血小
板、組織マクロファージ（組織球）、器官特異的食細胞 （例えば、クップファ
ー細胞、肺胞マクロファージ、および小グリア細胞）、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球
（例えば、細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびサプレッサＴ細胞）、巨
大赤芽球、単芽球、骨髄芽球、リンパ芽球、前赤芽球、巨核芽球、前単球、前骨
髄球、前リンパ球、早期正赤芽球、巨核球、中間正赤芽球、後骨髄球（例えば、
幼若後骨髄球、分葉球後骨髄球、および多形核顆粒球）、後期正赤芽球、網状赤
血球、および骨髄細胞。
【０４５５】 呼吸器系細胞（例えば、毛細管内皮細胞および肺胞細胞）はまた、細胞障害性
因子誘導性損傷を軽減または予防するためにＭＰＩＦ−１で処置され得る。泌尿
器系細胞（例えば、ネフロン、毛細管内皮細胞、顆粒細胞、細管内皮細胞、およ
び有足突起）もまた、処置または保護され得る。以下のような消化器系細胞もま
たＭＰＩＦ−１を使用して処置または保護され得る：単純円柱上皮細胞、粘膜細
胞、腺房細胞、壁細胞、主細胞、酵素原細胞、消化細胞、腸クロム親和細胞、杯
細胞、銀親和細胞およびＧ細胞。感覚細胞（例えば、聴覚系細胞（毛細胞））；
嗅覚系細胞（嗅覚受容器細胞、および円柱上皮細胞を含む）；平衡／前庭器細胞
（毛細胞および支持細胞を含む）；視覚系細胞（色素細胞、上皮細胞、光受容体
ニューロン（杆体および円錐体）、神経節細胞、アマクリン細胞、両極細胞およ
び水平細胞を含む）は、細胞障害性損傷を予防または軽減するためにＭＰＩＦ−
１で処置され得る。
【０４５６】 さらに、間葉細胞、間質細胞、毛細胞／卵胞細胞、脂質（脂肪）細胞、単純上
皮組織の細胞（鱗状上皮、立方上皮、円柱上皮、線毛円柱上皮、および多列線毛
円柱上皮）、重層上皮組織の細胞（重層扁平上皮（角化および非角化）、重層立
方上皮、および移行上皮）、杯細胞、腸間膜の内皮細胞、小腸の内皮細胞、大腸
の内皮細胞、毛細血管の上皮細胞、微小血管の上皮細胞、動脈の上皮細胞、小動
脈の上皮細胞、静脈の上皮細胞、細静脈の上皮細胞など、および膀胱の上皮細胞
は、細胞障害性損傷を軽減または予防するためにＭＰＩＦ−１で処置され得る。
【０４５７】 ＭＰＩＦ−１はまた、結合組織（例えば、真皮を含む緩い結合（輪紋状）組織
、密な線維状結合組織、弾性結合組織、細網状結合組織、および脂肪結合組織）
の細胞における細胞障害性損傷を保護および処置する。ＭＰＩＦ−１でまた保護
されそしてこれで処置可能な結合組織の細胞としては、軟骨細胞、脂肪細胞、骨
膜細胞、骨内膜細胞、ぞうげ芽細胞、骨芽細胞および骨細胞が挙げられる。
【０４５８】 ＭＰＩＦ−１はまた、上皮細胞、肝細胞、ケラチノサイトおよび基底ケラチノ
サイト、筋肉細胞、中枢神経系および末梢神経系の細胞、前立腺細胞、および肺
細胞を保護する。
【０４５９】 ＭＰＩＦ−１はまた、肺、乳房、膵臓、胃、小腸および大腸の上皮細胞を保護
する。ＭＰＩＦ−１は、皮膚、肺、肝臓および胃腸管内に含まれる、上皮細胞（
例えば、セボサイト（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝細胞、ＩＩ型肺胞細胞、ム
チン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびにそれらの前駆体）を保護し得る
。
【０４６０】 ＭＰＩＦ−１は肝細胞を保護し、従って、ＭＰＩＦ−１は、急性または慢性の
肝炎、ならびに癌治療（例えば、化学治療および／または放射線治療）、および
環境的被爆または偶発的被爆によって引き起こされる劇症または亜劇症（ｓｕｂ
ｆｕｌｍｉｎａｎｔ）肝不全を、予防的または治療的に予防または軽減するため
に使用され得る。
【０４６１】 ＭＰＩＦ−１はまた、放射線または化学治療のような細胞障害性因子での処置
から生じる腸毒性の副作用を軽減するために使用され得る。ＭＰＩＦ−１は、小
腸粘膜に対する細胞保護効果を有する。ＭＰＩＦ−１はまた、粘膜炎を予防的ま
たは治療的に予防または減弱し、そして化学治療および他の細胞障害性因子によ
ってから生じる粘膜炎（例えば、口腔、食道、腸、結腸、直腸および肛門の潰瘍
）を軽減するために使用され得る。
【０４６２】 炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）は、それぞれ、小腸
または大腸の粘膜表面の破壊を生じる疾患である。従って、ＭＰＩＦ−１は、粘
膜表面の再生を促進し、より迅速な治癒を助け、そして炎症性腸疾患の進行を防
ぐために使用され得る。ＭＰＩＦ−１処置は、胃腸管全体の粘液の産生に対して
有意な効果を有することが期待され、そして細胞障害性因子から腸粘膜を保護す
るために使用され得る。従って、本発明はまた、粘膜の疾患または病理学的現象
（潰瘍性大腸炎、クローン病、および粘膜が損傷される他の疾患を含む）を予防
または処置するための方法を提供し、この方法は、有効量のＭＰＩＦ−１を投与
する工程を包含する。本発明は、同様に、口腔粘膜炎（咽頭および下咽頭におけ
る粘膜損傷に関連する嚥下痛を含む）、食道粘膜炎、胃粘膜炎、腸粘膜炎、結腸
粘膜炎、および直腸粘膜炎を予防または処置するための方法を提供する。
【０４６３】 さらに、ＭＰＩＦ−１は、様々な因子に起因する肺の損傷を予防および軽減す
るために使用され得る。ＭＰＩＦ−１は、肺胞および細気管支上皮の損傷を予防
おまたは処置し得る。例えば、吸入損傷（すなわち、煙の吸入から生じる）およ
び放射線損傷（これらは、細気管支上皮および肺胞の壊死を引き起こす）は、Ｍ
ＰＩＦ−１で効果的に処置され得る。また、ＭＰＩＦ−１は、ＩＩ型肺胞細胞を
保護するために使用され得る。
【０４６４】 ＭＰＩＦ−１は、放射線治療および抗悪性腫瘍薬を用いる全身処置または局所
処置に関連する、真皮および表皮、目組織、歯組織、口腔の損傷、および合併症
を処置または予防する際に臨床的に有用であり得る。ＭＰＩＦ−１はまた、皮膚
損失を処置するために使用され得る。
【０４６５】 ＭＰＩＦ−１はまた、放射線、化学治療または他の細胞障害性処置から生じる
腸毒性の副作用を軽減するために使用され得る。ＭＰＩＦ−１は、小腸粘膜に対
して細胞保護効果を有する。ＭＰＩＦ−１はまた、粘膜炎を予防的または治療的
に予防または快復させるため、および化学治療、放射線および他の細胞障害性因
子から生じる粘膜炎（例えば、口腔潰瘍、食道潰瘍、腸潰瘍、結腸潰瘍、直腸潰
瘍および肛門潰瘍）を処置するために使用され得る。従って、本発明はまた、粘
膜の疾患または病理学的現象（潰瘍性大腸炎、クローン病、および粘膜が損傷し
ている他の疾患を含む）を予防または処置するための方法を提供し、この方法は
有効量のＭＰＩＦ−１を投与する工程を包含する。本発明は同様に、この損傷を
生じる因子または方法と無関係の口腔粘膜炎（咽頭および下咽頭における粘膜損
傷に関連する嚥下痛を含む）、食道粘膜炎、胃粘膜炎、腸粘膜炎、結腸粘膜炎、
および直腸粘膜炎を予防または処置するための方法、を提供する。
【０４６６】 さらに、ＭＰＩＦ−１は、化学物質に起因する疱疹およびやけど；化学治療薬
による処置に起因する卵巣の損傷、例えば、放射線または化学治療誘導性膀胱炎
、および高用量化学治療薬誘導性腸損傷を処置および／または予防するために使
用され得る。
【０４６７】 ＭＰＩＦ−１は、化学治療因子、放射線または他の細胞障害性因子によって引
き起こされる腎毒性を予防または軽減するために使用され得る。
【０４６８】 本発明はまた、個体を、放射線、化学治療または細胞毒性因子による処置の影
響から保護するための方法を提供し、この方法は、有効量のＭＰＩＦ−１を投与
する工程を包含する。本発明はさらに、放射線、化学治療因子、または他の細胞
障害性因子への暴露から生じる組織損傷を軽減または予防するための方法を提供
し、この方法は、有効量のＭＰＩＦ−１を投与する工程を包含する。個体は、治
療目的を含む多数の目的（例えば、過剰増殖障害の処置のため）のため、放射性
同位体の環境中への偶発的な放出の結果として、または侵襲性または非侵襲性の
医療診断手順（例えば、Ｘ線）の間に放射線に暴露され得る。さらに、かなりの
数の個体は、職場および自宅で放射性ラドンに暴露される。長期の連続した環境
的暴露は、平均寿命の減少の推定を算出するために使用されてきた。Ｊｏｈｎｓ
ｏｎ，Ｗ．およびＫｅａｒｆｏｔｔ，Ｋ．，Ｈｅａｌｔｈ Ｐｈｙｓ．７３：３
１２〜３１９（１９９７）。実施例１７〜１８に記載されるように、本発明のタ
ンパク質は、放射線に暴露された動物の生存を増加する。従って、ＭＰＩＦ−１
は、放射線誘導性損傷に罹患した個体の生存率を増加し、致死量以下の用量の放
射線から個体を保護し、そして過剰増殖性障害のような苦痛の処置における放射
線の治療量を増加するために使用され得る。
【０４６９】 ＭＰＩＦ−１はまた、通常耐性ではない放射線、化学治療薬または他の細胞障
害性因子の投薬に対して個体を保護するために使用され得る。このように使用さ
れるか、そうでなければ本明細書中で記載されるように使用される場合、ＭＰＩ
Ｆ−１は、放射線治療／暴露、化学治療、または他の細胞障害性因子を用いる処
置／暴露の前、後および／または間に投与され得る。高投薬量の放射線および化
学治療薬は、過剰増殖性障害のような進行段階の苦痛を有する個体を処置する場
合に特に有用である。
【０４７０】 別の局面において、本発明は、例えば、放射線誘導性口腔損傷および胃腸管損
傷、粘膜炎、腸線維症、直腸炎、放射線誘導性肺線維症、放射線誘導性肺炎、放
射線誘導性胸膜退縮症、放射線誘導性造血症候群、および放射線誘導性骨髄毒性
のような状態を予防または処置するための方法を提供し、この方法は、有効量の
ＭＰＩＦ−１を個体に投与する工程を包含する。
【０４７１】 従って、本発明のＭＰＩＦポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、放射線治
療、化学治療および標的放射線治療（例えば、悪性疾患、転移および関連の障害
（例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血
病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、お
よび赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球（顆粒球）白
血病、および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫症（
例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレー
ムマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、および充実性腫瘍、例えば、限定されないが
、肉腫症および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原
性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫
、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、胃癌、膵臓癌、乳
癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭
状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌
、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、頸部癌、精巣癌、肺癌、小細
胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上
衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色
腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）の放射免疫治療）の間、正常な細胞の
損傷（骨髄前駆体の損傷を含む）を阻害するために使用される。このような障害
はまた以下を含み得る：転移性骨髄甲状腺癌、未分化星状細胞腫、グリア芽種、
濾胞性リンパ腫、結腸癌、心臓腫瘍、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、粘液腫、筋腫
、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌
、前立腺癌、カポージ肉腫、および卵巣癌。本発明のポリペプチド、ポリペプチ
ドフラグメントおよび改変体、アゴニスト、およびアンタゴニスト、ならびに他
の抗体を使用して処置され得るさらなる障害が当該分野で周知であり、そしてま
た本明細書中に開示される。
【０４７２】 ＭＰＩＦ−１は、単独でか、または放射線または他の因子に対して保護を与え
る１つ以上のさらなる薬剤と共に使用され得る。多数のサイトカイン（例えば、
ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２）は、このような保護を与えることが
示されている。例えば、Ｎｅｔａ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１１
７７（１９９１）を参照のこと。さらに、ＩＬ−１１は、合わせた放射線および
化学治療の後、小腸粘膜細胞（Ｄｕ，Ｘ．Ｘ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８３：３３（１
９９４））および放射線誘導性胸部損傷（Ｒｅｄｌｉｃｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎ．１５７：１７０５〜１７１０（１９９６））を保護することが示され
た。いくつかの成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子および形質転換増殖因子
β−３）は、放射線暴露に対する保護を与えることが示されている。Ｄｉｎｇ，
Ｉ．ら、Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３６：３３７〜３４０（１９９７）；Ｐｏｔｔ
ｅｎ，Ｃ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７５：１４５４〜１４５９（１９９７
）。
【０４７３】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドと共に投与され得るさらなる放
射線保護薬としては以下が挙げられる：カルシウムアンタゴニスト（ＷＯ ９３
／０２６７０）、ポリエチレングリコール（米国特許第４、６７６、９７９号）
、ポリビニルピロリドン（米国特許第４、６７６、９７９号）、ポリエチレング
リコールモノメチルエーテル（米国特許第４、６７６、９７９号）、メトキシポ
リエチレングリコールのアミドおよびアミンおよび塩、ならびにキレート剤（例
えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、およびＥＧＴＡ（ＷＯ ９８／４７８５８））、マ
ンガンおよび他のメタロチオネイン誘発物質（米国特許第 ５、００８、１１９
）、ＷＲ−２７２１（米国特許第５、４２４、４７１号）、ＷＲ−１０６５、他
のホスホロチオエート（米国特許第５、８６９、３３８号）、ポリアミドチオー
ル（米国特許第５、２１７、９６４号）、ＳＣＦ／ＩＬ３／ＧＭ−ＣＳＦの組み
合わせ、または単一の治療レジメン（米国特許第５、６２０、６８５号）、βカ
ロチンおよびＤｕｎａｌｉｅｌｌａ藻類調製物（米国特許第５、９４８、８２３
号）、アルカロイドの亜リン酸誘導体（米国特許第５、９８１、５１２号）、チ
マリン（ｔｈｙｍａｌｉｎ）およびＬ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（米国特許第５、７
７０、５７６号）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、腫瘍壊死因子、幹細胞因
子およびＩＬ１２（Ｎｅｔａ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５ （Ｓｕｐｐｌ ２
）：２０７−１０（１９９７））、銅キレート（Ｓｏｒｅｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１０：１９１−２０４（１９９５））
、Ｄ因子／成長ホルモン／ＩＬ−１／腫瘍壊死因子の組み合わせ、または単一の
治療レジメン（米国特許第５、８４３、４２２号）、Ａｃｔｉｈａｅｍｙｌ（Ｃ
ＡＳ ＲＮ Ｎｏ．３７２３９−２８−４）、Ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ（ＷＲ ２
７２１）、２−アミノ−エタンチオールリン酸二水素一ナトリウム塩（エステル
）（シスタフォス（ｃｙｓｔａｐｈｏｓ）、ホスホシステアミン）、３−（ビス
（２−クロロエチル）カルバメート）エストラジオール（エストラムスチン）、
２−アミノ−エタンチオール（システアミン）、２、２’−ジチオビス（エチル
アミン）（シスタミン）、Ｓ−２−アミノエチルチオウロニウムブロミドヒドロ
ブロミド（ＡＥＴ）、銅キレート（例えば、Ｃｕ（ＩＩ）２（３，５−ジイソプ
ロピルサリチレート）４（Ｃｕ（ＩＩ）２（３，５，−ＤＩＰＳ）４）、Ｆｅ、
ＭｎおよびＺｎの必須金属元素キレート（Ｓｏｒｅｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１０：１９１−２０４（１９９５））、２−
（アルキルチオ）ピラジン、アルカロイドのリン酸誘導体（オーストリア特許第
３７７ ９８８号および同第３５４ ６４４号；米国特許第５、９８１、５１２
号）など、ならびにそれらの組み合わせ。
【０４７４】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、制吐薬（例えば、２−
（エチルチオ）−１０−（３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル−１
０Ｈ−フェノチアジン（エチルチオペラジン）、１−（ｐ−クロロ−α−フェニ
ルベンジル）−４−（ｍ−メチルベンジル）−ピペラジン（メクロジン、メクリ
ジン）など、およびそれらの組み合わせ）と共に投与され得る。本発明のポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドはまた、本明細書で開示されるか、または当該分
野で公知の他の治療薬およびそれらの組み合わせと共に投与され得る。
【０４７５】 出血性膀胱炎は、特定の疾患状態、ならびに薬物、ウイルスおよび毒素への暴
露に関連する症状である。これは膀胱の内皮管壁の拡散性出血として現れる。公
知の処置は、膀胱内、全身および非薬理学的治療を含む（Ｗｅｓｔ，Ｎ．Ｊ．，
Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ １７：６９６〜７０６（１９９７））。臨床
的に使用されるいくつかの細胞障害性因子は、膀胱の正常な上皮細胞の増殖の阻
害を生じ、致命的な潰瘍および上皮内層の破壊に至る副作用を有する。例えば、
シクロホスファミドは、肝臓において、混合機能ミクロソームオキシダーゼ系に
よって活性アルキル化代謝物に主に生体内変化される細胞障害性因子である。こ
れらの代謝物は、感受性の迅速に増殖している悪性細胞の増殖を妨げる。この作
用の機構は、腫瘍細胞ＤＮＡの架橋にかかわると考えられている（ｐｈｙｓｉｃ
ｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９７）。
【０４７６】 シクロホスファミドは、いくらかの患者において出血性膀胱炎、ある場合、胎
児において重篤であり得る合併症を引き起こす、細胞障害性因子の１例である。
膀胱の線維症はまた、膀胱炎をともなってか、またはともなわずに発達し得る。
この損傷は、尿によって排出されるシクロホスファミド代謝産物によって引き起
こされると考えられる。シクロホスファミドによって引き起こされる血尿は、通
常、７日間存在するが、持続し得る。いくつかの場合において、医療的処置また
は外科的処置が必要とされる。重篤な出血性膀胱炎の場合、結果として、シクロ
ホスファミド治療の中断となる。さらに、膀胱悪性疾患は、一般に、シクロホス
ファミド処置の２年以内に発生し、そして先に出血性膀胱炎を患った患者におい
て発生する（Ｃｙｔｏｘａｎ ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔを参照のこと）。
シクロホスファミドは、前立腺および男性の生殖系で毒素効果を有する。シクロ
ホスファミド処置は、結果として、生殖不能の展開となり、そしてある程度の精
巣萎縮症となる。
【０４７７】 当業者は、ＭＰＩＦ−１活性の増加したレベルの必要な個体を処置するための
ＭＰＩＦ−１ポリペプチドの有効量（骨髄抑制性薬剤または骨髄抑制性インヒビ
ターを伴ってか、または伴わずに骨髄抑制に有効なＭＰＩＦ−１ポリペプチドの
量を含む）が、ＭＰＩＦ−１の投与が必要とされる各状態のために経験的に決定
され得ることを理解する。ＭＰＩＦ−１活性を有するポリペプチドは、１以上の
薬学的に受容可能な賦形剤と組合せた薬学的組成物で投与され得る。
【０４７８】 ＭＰＩＦ−１をまた使用して、白血病および異常に増殖した細胞（例えば、腫
瘍細胞）を誘導アポトーシスによって処置し得る。ＭＰＩＦ−１は、造血前駆細
胞の集団においてアポトーシスを誘導する。
【０４７９】 ＭＰＩＦ−１は、未成熟造血前駆細胞（例えば、顆粒球、マクロファージまた
は単球）の肥大のために、それらの分化を一時的に防止することによって使用さ
れ得る。これらの骨髄細胞は、インビトロで培養され得る。従って、ＭＰＩＦ−
１はまた、骨髄移植および／または遺伝子治療の目的のためにインビトロで造血
幹細胞のモジュレーターとして有用であり得る。幹細胞は希少であり、そして遺
伝子を遺伝子治療のために導入するために最も有用であるので、ＭＰＩＦを使用
して、幹細胞の富化集団を単離し得る。幹細胞は、細胞毒（例えば、５−Ｆｕ）
の存在下で細胞を培養することによって富化され得、これによって分化細胞を迅
速に殺し、幹細胞はＭＰＩＦ−１によって保護される。これらの幹細胞は、骨髄
移植患者に戻され得るか、次いで、遺伝子治療のために所望される遺伝子の形質
移入のために使用され得る。さらに、ＭＰＩＦ−１は、個体に注射され得、この
結果、個体の骨髄から末梢の血液への幹細胞の放出に導く。これらの幹細胞は、
自己の骨髄移植の目的または遺伝子治療の操作のために単離され得る。患者が化
学療法または放射線治療を終えた後に、単離された幹細胞を患者に戻し得る。
【０４８０】 さらに、ＭＰＩＦ−１は、Ｔ−リンパ球およびマクロファージにおいて効果を
有するので、ＭＰＩＦ−１は、ウイルス、細菌または他の生体異物を取りこむた
めの細胞（ＡＰＣ）を提示する抗原の能力を増強し得、これらを処理し、そして
免疫応答に応答可能な白血球にこれらを提示する。ＭＰＩＦ−１はまた、Ｔ−白
血球およびＢ−白血球とＡＰＣとの相互作用を調節し得る。ＭＰＩＦ−１は、生
存するため、増殖するため、分化するため、さらなるサイトカインを分泌するた
め、または媒介物を溶解するために応答細胞を配向するか、またはアポトーシス
または細胞死の他の機構を誘導することによって応答細胞を選択的に除去する、
抗原提示の間に同時刺激シグナルを提供し得る。ＡＰＣはＨＩＶのＣＤ４＋Ｔ−
白血球への移動を容易にすることが示されているので、ＭＰＩＦ−１はまた、こ
の能力に影響を与え得、そしてＡＰＣを介して媒介された他のウイルスまたはＨ
ＩＶによって、白血球の感染を予防し得る。これはまた、ＨＩＶ、ＥＢＶ、また
は他のこのようなウイルスによる、ＡＰＣ、Ｔ−白血球または他の細胞型の初期
感染のために適切である。
【０４８１】 さらに、ＭＩＰ−１αレセプターは、ヒト単球およびＴ−白血球へのＨＩＶの
侵入を容易にする補助因子として有用である最近の実証は、ＭＰＩＦ−１および
その改変体が細胞へのＨＩＶ侵入の工程と相互作用し得る目的の能力を上げる（
実施例１１）。従って、ＭＰＩＦ−１は、ＭＩＰ−１αレセプターによって侵入
と容易となる、ウイルスおよびレトロウイルスのための抗ウイルス性剤として有
用であり得る。
【０４８２】 ＭＰＩＦ−１は、細菌およびウイルス感染ならびに他の異物と戦うＴ−白血病
の内因性活性を刺激することによって免疫増強因子として作用し得る。このよう
な活性は、外来抗原（例えば、対立遺伝子の感染および新生物形成に対する免疫
応答）に有用であるか、または固形腫瘍と白血病の両方を含む増殖を開始する。
【０４８３】 これらの理由のために、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける種々の
免疫系関連障害の診断または処置のために有用である。このような障害としては
、腫瘍、癌、および以下を含むこれらに限定されない免疫細胞機能の任意の調節
不全が挙げられる：自己免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、敗血症、
創傷治癒、急性感染および慢性感染、細胞媒介免疫、体液性免疫、炎症性腸疾患
、骨髄抑制など。
【０４８４】 従って、ＭＰＩＦ−１を使用して、創傷領域への標的免疫細胞の浸潤を制御す
ることによって、創傷治癒を容易にし得る。類似の様式において、本発明のポリ
ペプチドは、慢性感染（例えば、殺菌性白血球の誘引および活性化を介する、ミ
コバクテリア感染）に対する宿主防御を増強し得る。
【０４８５】 本発明のポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドは、科学的研究に関連するインビトロ目的、ＤＮＡの合成およびＤＮＡ
ベクターの製造、ならびにヒト疾患の処置のための治療剤および診断剤の開発の
目的のための研究試薬として使用され得る。例えば、ＭＰＩＦ−１は、それらの
分化を一時的に阻害することによる、未成熟の造血前駆細胞（例えば、顆粒球、
マクロファージまたは単球）の拡張のために使用され得る。これらの骨髄細胞は
、インビトロで培養され得る。
【０４８６】 これらのポリペプチドの別の使用は、例えば、自己免疫疾患およびリンパ性白
血病におけるＩＬ−２の生合成の阻害を介するＴ細胞増殖の阻害である。
【０４８７】 ＭＰＩＦ−１はまた、乾癬（ケラチノサイトの過剰増殖）における有用性を有
する表皮ケラチノサイト増殖を阻害するために有用であり得る。なぜなら、皮膚
のランゲルハンス細胞は、ＭＩＰ−１αを産生することが見出されているからで
ある。
【０４８８】 ＭＰＩＦ−１を使用して、壊死組織片クリーニング炎症性細胞および結合性組
織促進炎症性細胞の漸増を介しそして過剰なＴＧＦβ媒介線維症のその制御によ
っての両方で、創傷治癒の間の瘢痕を防止し得、さらに、このポリペプチドは、
発作、血小板増加症、肺動脈塞栓および骨髄増殖性障害を処置するために使用さ
れ得る。なぜなら、ＭＰＩＦ−１は、脈管透過性を増加するからである。
【０４８９】 （薬学的組成物） 本発明のＭＰＩＦ−１ポリペプチド薬学的組成物は、このような個体における
ＭＰＩＦ−１活性を増加するために有効な、有効量の本発明の単離されたＭＰＩ
Ｆ−１ポリペプチド、特に成熟形態のＭＰＩＦ−１を含有する。このような組成
物は処方され得、そして個々の患者の臨床状態（特に、ＭＰＩＦ−１ポリペプチ
ドの単独での処置における副作用）、ＭＰＩＦ−１ポリペプチド組成物の送達部
位、投与の方法、投与の計画、および他の開業医に公知の要因を考慮に入れて、
良好な医療の実施（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）と一致する
様式において投薬され得る。従って、本明細書の目的のための有効量のＭＰＩＦ
−１ポリペプチドは、このような考慮によって決定される。
【０４９０】 本発明のポリペプチド、アンタゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キ
ャリアとあわせて使用され得る。このような組成物は、治療的に有効量のタンパ
ク質、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャ
リアには、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない
。この処方物は、投与の形態に適すべきである。「薬学的に受容可能なキャリア
」とは、非毒性固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、ま
たは任意の型の処方補助剤を意味する。本明細書で使用される場合、用語「非経
口（的）」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ
）、皮下、および関節内の注射および注入を包含する、投与様式をいう。
【０４９１】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチドもまた、徐放性システムによって適切に投与される
。徐放性組成物の適切な例は、成型製品（例えば、フィルムまたはマイクロカプ
セル）の形態における半透過性のポリマーマトリクスを含む。徐放性マトリクス
は、ポリラクチド（米国特許第３、７７３、９１９号、ＥＰ５８、４８１号）、
Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍ
ａｎ、Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））
、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、および
Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、
エチレン酢酸ビニル（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３
−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３、９８８）を含む。徐放性ＭＰＩＦ−１ポリペプ
チド組成物はまた、リポソームに捕捉されたＭＰＩＦ−１ポリペプチドを含む。
ＭＰＩＦ−１ポリペプチドを含むリポソームは、それ自体が公知の方法によって
調製される：ＤＥ３、２１８、１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗ
ａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０
−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２、３２２；ＥＰ３６、６７６；ＥＰ８８、０
４６；ＥＰ１４３、９４９；ＥＰ１４２、６４１；日本国特許出願８３−１１８
００８；米国特許第４、４８５、０４５号、および同第４、５４４、５４５号；
およびＥＰ１０２、３２４を参照のこと。通常、リポソームは、小さな（約２０
０〜８００Å）単層型であり、ここで脂質含量は、約３０モル％コレステロール
より多く、選択された部分は、最適なＭＰＩＦ−１ポリペプチド治療について調
整される。
【０４９２】 非経口投与について、１つの実施形態において、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは
、一般には、所望の程度の純度で、単位投薬量の注入可能な形態（溶液、懸濁液
または乳濁液）で、このポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリア（すなわ
ち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、
そして処方物の他の成分と適合性であるもの）と混合することによって処方され
る。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤およびポリペプチドに有害であ
ることが公知である他の化合物を含まない。
【０４９３】 一般に、処方物は、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドを、液体キャリアまたは細かく
粉砕した固体キャリアまたは両方と、均一にかつしっかりと接触させることによ
って調製される。次いで、必要である場合、産物は、所望の処方物へと成型され
る。好ましくは、このキャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくは、レ
シピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は
、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液を含む。非水性ビヒ
クル（例えば、不揮発油およびオレイン酸エチル）ならびにリポソームもまた、
本明細書において有用である。
【０４９４】 キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物
を適切に含む。このような材料は、使用された投薬量および濃度においてレシピ
エントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、およ
び他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化
剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまた
はトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイ
ムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ
酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；
単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マ
ンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖
アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、
ナトリウム）；および／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベー
ト、ポロキサマー、またはＰＥＧ）を含む。
【０４９５】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、代表的に、このようなビヒクル中で約０．１ｍ
ｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で
、ｐＨ約３〜８で処方される。上記の特定の賦形剤、キャリア、または安定化剤
の使用は、ＭＰＩＦ−１ポリペプチド塩の形成をもたらすことが理解される。
【０４９６】 ＭＰＩＦ−１および／またはその改変体は、骨髄保護材として、ヒトにおける
過剰増殖障害の処置のための化学治療レジメンの一部として投与され、静脈内投
与のための適切な投与量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１０μｇ／ｋｇ体重であ
る。さらに、ＭＰＩＦ−１は、０．１、１．０、１０および１００μｇ／ｋｇ体
重の用量で静脈内投与され得る。動物研究のデータの推定により、ヒトにおける
骨髄保護のために適切なＭＰＩＦ−１の投薬量は、０．０１６μｇ／ｋｇ体重で
あることが示された。
【０４９７】 ＭＰＩＦ−１および／またはその改変体は、それが、細胞、組織および器官に
対する細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃ）損傷のための処置として投与される場合、細
胞毒性薬剤への暴露後ヒトに投与され得る。細胞、組織および器官に対する細胞
毒性損傷に対する予防薬として使用される場合、ＭＰＩＦ−１および／またはそ
の改変体は、暴露前に投与され得るか、あるいは細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃ）薬
剤への暴露の前と後の両方に投与され得る。
【０４９８】 さらに、ＭＰＩＦ−１、および／またはその改変体は、特定の数の日の間（例
えば、３日）毎日１回投与され得る。さらに、化学療法措置において使用される
場合、ＭＰＩＦ−１は、化学療法剤の投与の前にヒトに投与され得る。例えば、
ＭＰＩＦ−１は、２日前（化学療法剤の投与の１日前、および投与される日）に
投与され得る。
【０４９９】 ＭＰＩＦ−１、および／またはその改変体が、骨髄増殖疾患の処置のためにヒ
トに投与される場合、投与される用量は、ＭＰＩＦ−１が骨髄保護剤として使用
される場合と同じであり得る。骨髄増殖疾患の処置のためにヒトに投与される場
合、ＭＰＩＦ−１は、皮下に投与され得る。
【０５００】 治療的投与のために使用されるべきＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、無菌でなけ
ればならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通して濾
過することによって容易に達成される。治療的ＭＰＩＦ−１ポリペプチド組成物
は、一般的に、滅菌アクセスポート（例えば、皮下注射針によって貫通可能なス
トッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアル）を有する容器に配置される。
【０５０１】 ＭＰＩＦ−１ポリペプチドは、通常、単位または多用量容器（例えば、密封ア
ンプルまたはバイアル）において水性溶液としてかまたは再構築のための凍結乾
燥処方物として保存される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌバイアルが、
５ｍｌの滅菌濾過１％（ｗ／ｖ）水性ＭＰＩＦ−１ポリペプチド溶液で満たされ
、そして得られる混合物が凍結乾燥される。注入溶液は、静菌性注射用水を用い
て凍結乾燥ＭＰＩＦ−１ポリペプチドを再構築することによって調製される。
【０５０２】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされる１つ以上
の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器と関連して
、薬品もしくは生物学的生成物の製造、使用、または販売を規制する政府機関に
よって定められた形態にある通知が存在し得、その通知は、ヒト投与のために製
造、使用または販売する当局による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプ
チドは、他の治療的化合物とともに用いられ得る。
【０５０３】 本発明はまた、有効用の治療薬（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の被験体への投与
によって、疾患または傷害（例えば、本明細書中に開示される任意の１以上の疾
患または傷害）の処置および／または予防の方法を提供する。治療薬によるとは
、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合わせて、ポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド（フラグメントおよび改変体を含む）、その
アゴニストまたはアンタゴニスト、ならびに／もしくはそれらへの抗体を意味す
る。
【０５０４】 ＭＰＩＦ−１は、個々の患者の臨床状態（特にＭＰＩＦ−１単独での処置の副
作用）送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入
れて、よい医療とあわせた形態で処方および投薬される。従って、本明細書の目
的のための「有効量」は、このような考慮によって決定される。
【０５０５】 一般的な提案として、非経口投与される用量あたりの全薬学的有効量のＭＰＩ
Ｆ−１は、患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内であ
るが、上記のように、これは治療的判断の主題である。さらにより好ましくは、
この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、ヒトに対して最も好ま
しくは、ホルモンについて約０．０１と１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続的
に与えられる場合、ＭＰＩＦ−１は、代表的に、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０
μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜４回の注射によるかまたは連続
的皮下注入（例えば、ミニポンプを用いて）によるかのいずれかで投与される。
静脈バッグ溶液もまた用いられ得る。生じる応答について変化および処置後の間
隔を観察するために必要な処置の長さは、所望の効果に依存して変化するようで
ある。
【０５０６】 ＭＰＩＦ−１は、経口的にか、直腸へか、非経口的にか、槽内（ｉｎｔｒａｃ
ｉｓｔｅｍａｌｌｙ）へか、膣内へか、腹腔内へか、局所的（粉末、軟膏、ゲル
、ドロップ、または経皮パッチによって）か、頬側へか、または経口もしくは鼻
スプレーとして投与され得る。
【０５０７】 「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非中毒性の固体、半固体または液状充
填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意の型の処方補助物を意味する。用語「
非経口的」とは本明細書中において使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、
胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０５０８】 ＭＰＩＦ−１はまた、徐放系によって適切に投与される。徐放性ＭＰＩＦ−１
の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌ
ｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、ドロップ、または経皮パッ
チによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「
薬学的に受容可能なキャリア」とは、非中毒性の固体、半固体または液状充填剤
、希釈剤、カプセル化材料または任意の型の処方補助物を意味する。用語「非経
口的」とは本明細書中において使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨
内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０５０９】 ＭＰＩＦ−１はまた、徐放系によって適切に投与される。徐放性ＭＰＩＦ−１
の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、造形品の形態である半浸透性ポリ
マーマトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル））、適切な疎水
性物質（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹
脂、および乏しい可溶性誘導体（例えば、難溶性塩）を含む。
【０５１０】 徐放性マトリックスは、ポリラクチド（米国特許番号第３，７７３，９１９号
、ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートの
コポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６
（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１
）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）、またはポリ−
Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）を含む。
【０５１１】 徐放性ＭＰＩＦ−１はまた、リポソームに捕捉されたＭＰＩＦ−１を含む（一
般には、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９
０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏ
ｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅ
ｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）。Ｍ
ＰＩＦ−１含有リポソームは、それ自体既知の方法によって調製される：ＤＥ３
，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８
０）；ＥＰ ５２，３２２；ＥＰ ３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６：ＥＰ
１４３，９４９；ＥＰ １４２，６４１；日本特許出願８３−１１８００８；米
国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；および、ＥＰ
１０２，３２４。一般的に、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％コレステ
ロールより多い、小さな（約２００〜８００オングストローム）単ラメラ型であ
り、選択される割合は、最適な治療について調整される。
【０５１２】 なおさらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、ポンプによって送達される
（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０５１３】 他の制御放出（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）系は、Ｌａｎｇｅｒ
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説にお
いて議論される。
【０５１４】 非経口投与のために、１つの実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、通常、所望
の純度で、単位用量の注射用の形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に
受容可能なキャリア（すなわち、利用される用量および濃度でレシピエントに非
中毒性であり、そして処方物のほかの成分と適合し得るキャリア）と共に、ＭＰ
ＩＦ−１を混合することによって処方される。例えば、処方物は、好ましくは、
酸化剤およびＭＰＩＦ−１に対して有毒であると知られる他の化合物を含まない
。
【０５１５】 通常、処方物は、ＭＰＩＦ−１を液体のキャリアまたは細かく分けられた固体
のキャリアあるいはその両方と均一および密接に接触させることによって調整さ
れる。従って、必要ならば、この産物は、所望の剤形に形作られる。好ましくは
、キャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくは、レシピエントの血液と
等張な溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水
、リンガー溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。非水溶液ビヒクル（例
えば、不揮発油およびオレイン酸エチル）はまた、リポソームと同様に、本明細
書中で有用である。
【０５１６】 キャリアは、少量の添加物（例えば、等張性および化学的安定性を増強する物
質）を適切に含む。このような物質は、利用される用量および濃度でレシピエン
トに非中毒性であり、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢
酸および他の有機またはそれらの塩）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）
；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたは
トリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゲラチンまたは免疫グ
ロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例
えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン）；単糖類、
二糖類および他の炭水化物（例えば、セルロースまたはその誘導物、グルコース
、マントースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；
糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば
、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソル
ベート、ポロキシマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはＰＥＧ）を含む。
【０５１７】 ＭＰＩＦ−１は、典型的に、ｐＨ約３〜８において、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１
００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、このようなビヒク
ル内で処方される。前述のレシピエント、キャリア、または安定剤の特定の使用
がポリペプチド塩の形態を生じることが理解される。
【０５１８】 治療的投与のために使用される任意の薬剤は、無菌でなければならない。無菌
性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通じて濾過することによって
容易に達成される。ＭＰＩＦ−１は、一般的に、滅菌アクセスポート（例えば、
皮下注射によって貫通可能なストッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアル
）を有する容器に配置される。
【０５１９】 ＭＰＩＦ−１は、通常、単位または多用量容器（例えば、密封アンプルまたは
バイアル）において水溶性としてかまたは再構築のための凍結乾燥処方物として
保存される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌバイアルが、５ｍｌの滅菌濾
過１％（ｗ／ｖ）ＭＰＩＦ−１溶液で満たされ、そして得られる混合物が凍結乾
燥される。注入溶液は、静菌性注射用水を用いて凍結乾燥ＭＰＩＦ−１を再構築
することによって調製される。
【０５２０】 本発明は、ＭＰＩＦ−１の１つ以上の成分で見たされる１つ以上の容器を含む
薬学的なパックまたはキットを提供する。このような容器と関連して、薬品もし
くは生物学的生成物の製造、使用または、販売を規制する政府機関によって定め
られた形態にある通知が存在し得、その通知は、ヒト投与のための製造、使用ま
たは販売する当局による認可を反映する、さらに、ＭＰＩＦ−１は、他の治療的
化合物と共に用いられ得る。
【０５２１】 ＭＰＩＦ−１を単独でまたは他の補助剤と組み合わせて投与し得る。ＭＰＩＦ
−１と共に投与され得る補助剤は、ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコー
ル酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、Ｑ
Ｓ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、およびＭＰＬを含み得るが
、これに限定されない。特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１をミョウバンと
組み合わせて投与する。別の特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１をＱＳ−２
１と組み合わせて投与する。ＭＰＩＦ−１と共に投与され得るさらなる補助剤は
、モノホスホリル液体免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−１８、
ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびビロゾームの（ｖｉｒｏ
ｓｏｍａｌ）アジュバント技術を含むが、これらに限定されない。ＭＰＩＦ−１
と共に投与され得るワクチンは、ＭＭＲ（はしか、おたふくかぜ、風疹）、ポリ
オ、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ菌、
百日咳、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日
本脳炎、白色髄炎、狂犬病、腸チフス、発熱、および百日咳に対する防御へ指向
されるワクチンを含むがこれらに限定されない。同時に（例えば、混合剤として
）、別々であるが同時もしくは並行して；または経時的にのいずれかの配合物を
投与し得る。これは、組み合わせた薬剤を治療混合剤として共に投与する提示、
また組み合わせ剤を別々であるが、同時に（例えば、別々の静脈内ラインを個々
の同じ静脈ラインへ通すように）投与する手順を含む。さらに、「組み合わせて
の」投与は、化合物の１つの別々の投与または、所与の第１の、続いて第２の薬
剤の投与を含む。
【０５２２】 ＭＰＩＦ−１は、単独または他の治療剤と組合せて投与され得る。ＭＰＩＦ−
１と組み合わせて投与され得る治療剤としては、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ー、細胞障害剤、化学療法剤、放射線、放射線滅菌、標的放射線療法、抗生物質
、抗ウイルス薬剤、ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤、従来
の免疫治療剤、放射免疫検出剤、サイトカイン、および／または増殖因子が挙げ
られるが、これらに限定されない。同時に（例えば、混合剤として）、別々であ
るが同時もしくは並行して、；または経時的にのいずれかで組み合わせ剤を投与
し得る。これは、組み合わせ剤を治療混合剤として共に投与する提示、およびま
た組み合わせ剤を別々であるが、同時に（例えば、別々の静脈内ラインを個々の
同じ静脈ラインへ通すように）投与する手順を含む。さらに、「組み合わせの」
投与は、化合物の１つの別々の投与または、所与の第１の、続いて第２の薬剤の
投与を含む。
【０５２３】 １つの実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、ＴＮＦファミリーの他のメンバー
と組み合わせて投与される。ＭＰＩＦ−１とともに投与され得るＴＮＦ、ＴＮＦ
関連分子またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、それらに限定され
ない：ＴＮＦ−αの可溶性形態、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βと
してもまた公知）、ＬＴ−β（複合体ヘテロトリマーＬＴ−α２−βにおいて見
出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−
１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際出願公開番号ＷＯ９６／１
４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際出願公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカ
イン−α（国際出願公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際出願公開番
号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧおよびニュートロカイン−α（国際出願公開
番号ＷＯ９８／１８９２１、ならびにＯＸ４０、および神経増殖因子（ＮＧＦ）
および可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、
ＴＲ２（国際出願公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際出願公開番号
ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際出願公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、
ＴＲ５（国際出願公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際出願公開番号
ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際出願公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、
ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際出願公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国
際出願公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際出願公開番号ＷＯ９
８／０６８４２）およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、ＣＤ７０
、およびＣＤ１５３。
【０５２４】 特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１を、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシ
ド逆転写阻害剤、非ヌクレオシド逆転写阻害剤、および／またはプロテアーゼ阻
害剤と組み合わせて投与する。ＭＰＩＦ−１と組み合わせて投与され得るヌクレ
オシド逆転写阻害剤は、ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥ
ＸTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂ
ｉｎｅ／ｄｄＣ）／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴTM（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ
）／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）／３ＴＣ
）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）を含むが、限定され
ない。ＭＰＩＦ−１組み合わされて投与し得る非ヌクレオシド逆転写阻害剤は、
ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎ））、ＲＥＳＣＲＩＰＴ
ＯＲTM（デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ））、およびＳＵＳＴＩＶＡTM （エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ））を含むが、これらに限定されない。
ＭＰＩＦ−１と組み合わせて投与され得るタンパク質阻害剤は、ＣＲＩＸＩＶＡ
ＮTM（インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル（
ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖ
ｉｒ）、およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）
）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗レトロウイル
ス剤、ヌクレオシド逆転写阻害剤、非ヌクレオシド逆転写阻害剤、および／また
はプロテアーゼ阻害剤は、ＭＰＩＦ−１と任意に組み合わせて、使用され、ＡＩ
ＤＳを処置し得、ならびに／またはＨＩＶ感染を処置、および／もしくは防止し
得る。
【０５２５】 他の実施形態において、ＭＰＩＦ−１を抗日和見性感染剤と組み合わせて投与
し得る。ＭＰＩＦ−１と組み合わせて投与され得る抗日和見性剤は、ＴＲＩＭＥ
ＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、Ｐ
ＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、Ｒ
ＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM、Ｒ
ＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣ
ＩＮTM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯＶＩ
ＲTM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯＣＯ
ＮＡＺＯＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹＲＩ
ＭＥＴＨＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フィル
グラスティム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サーグラモスティム（
ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ／ＧＭ−ＣＳＦ）を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬ
ＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM 、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTMと任意に組み合わせて使用され、Ｐｎ
ｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置し、または予防
し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ TM 、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／またはＥＴＨ
ＡＭＢＵＴＯＬTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ菌複合感染を予防的に処置し、または予防し得る。別の特
定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴ
ＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、と任意に組
み合わせて使用され、日和見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ感染を予防的に処置し、または予防し得る。別の特定の実施形態におい
て、ＭＰＩＦ−１は、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、およ
び／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性サイ
トメガロウイルス感染を予防的に処置し、または予防し得る。別の特定の実施形
態において、ＭＰＩＦ−１は、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺ
ＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMと任意に組み合わせて使
用され、日和見性真菌感染を予防的に処置し、または予防し得る。別の特定の実
施形態において、ＭＰＩＦ−１は、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、および／またはＦＡ
ＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性単純ヘルペスウ
イルス型Ｉ感染および／または単純ヘルペスウイルス型ＩＩ感染を予防的に処置
し、または予防し得る。別の特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、ＰＹＲ
ＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMと任意に組み合
わせて使用され、日和見性Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に
処置し、または予防し得る。別の特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、Ｌ
ＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮTMと任意に組み合わせて
使用され、日和見性細菌感染を予防的に処置し、または予防し得る。
【０５２６】 さらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−１を抗ウイルス剤と組み合わせて投与
する。ＭＰＩＦ−１と共に投与され得る抗ウイルス剤は、アシクロビル、リバビ
リン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）を含むが
、これらに限定されない。
【０５２７】 さらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−１を抗生物質剤と組み合わせて投与す
る。ＭＰＩＦ−１と共に投与され得る抗生物質剤は、アモキシリン、β−ラクタ
マーゼ、アミノ酸糖体、β−ラクタム（糖ペプチド）、クリンダマイシン、クロ
ラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリトロマイシン
、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン
類、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラ
サイクリン、トリペトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およ
びバンコマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０５２８】 ＭＰＩＦ−１と組み合わせて投与され得る、従来の非特定の免疫抑制剤は、ス
テロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド、メ
チルプレドニゾロン、プレドニゾロン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−
デオキシスパーグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、およびＴ細胞に
応答する機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤を含むが、これらに
限定されない。
【０５２９】 特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１を免疫抑制薬製剤と組み合わせて投与
する。ＭＰＩＦ−１と共に投与され得るさらなる免疫抑制薬製剤は、ＯＲＴＨＯ
ＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／ＳＡＮ
ＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥＬＬ
ＣＥＰＴTM（マイコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）、アザチオプ
リン、グルコルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、お
よびＲＡＰＡＭＵＮＥTM（シロリマス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））を含むが、これ
らに限定されない。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄移
植の拒絶を妨ぐために使用され得る。
【０５３０】 さらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、単独でかまたは１以上の静脈内
免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。ＭＰＩＦ−１と組み合わせて
投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶＥＥ
ＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTMおよ
びＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態
において、ＭＰＩＦ−１は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫
グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０５３１】 さらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、単独でかまたは抗炎症剤と組み
合わせて投与される。ＭＰＩＦ−１とともに投与され得る抗炎症剤としては、グ
ルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導
体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリール
プロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チアジ
ンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン
、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）
、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、
エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オ
キサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、ピフ
オキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、これ
らに限定されない。
【０５３２】 別の実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、化学療法剤と組み合わせて投与され
る。ＭＰＩＦ−１とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導体（
例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマ
イシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば、フ
ルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキセート、フロクスウリジン、インターフ
ェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、メ
ルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルムスチ
ン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファ
ミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシン
、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例
えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニ
ルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストス
テロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン、お
よびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン
（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロ
レタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類および
組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（例え
ば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトタン、
硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げられるが
、これらに限定されない。
【０５３３】 特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミド
、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投与
されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態にお
いて、ＭＰＩＦ−１は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さらな
る実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰと共に
、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共に投与
される。
【０５３４】 さらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−は、サイトカインと組み合わせて投与
される。ＭＰＩＦ−１とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ−２、
ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２
、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ
−αが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、インター
ロイキンとともに投与され得るＭＰＩＦ−１としては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β
、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、
ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、Ｉ
Ｌ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およ
びＩＬ−２１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３５】 さらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、脈管形成タンパク質と組み合わ
せて投与される。ＭＰＩＦ−１と共に投与され得る脈管形成タンパク質としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：欧州特許番号ＥＰ−３９９８１
６に開示されるような神経膠腫由来の増殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ
−６８２１１０に開示されるような血小板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧
州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤ
ＧＦ−Ｂ）；国際特許出願番号ＷＯ９２／０６１９４に開示されるような血小板
増殖因子（ＰｌＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ４；
２５９−２６８（１９９３）に開示されるような血小板増殖因子−２（ＰｌＧＦ
−２）；国際特許出願番号ＷＯ９０／１３６４９に開示されるような血管内皮増
殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４７７に開示されるような血管
内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際特許出願番号ＷＯ９６／３９５１５に
開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；血管内皮増殖因子−
Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；；国際特許出願番号ＷＯ９６／２６７３６に開示されるよ
うな血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）Ｂ−１８６；国際特許
出願番号ＷＯ９８／０２５４３に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）；国際特許出願番号ＷＯ９８／０７８３２に開示されるような血管内
皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；および独国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に
開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）。上記の参考文献は、
本明細書中で参考として援用される。
【０５３６】 さらなる好ましい実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、造血増殖因子と組み合
わせて投与される。ＭＰＩＦ−１と共に投与され得る造血増殖因子は、ＬＥＵＫ
ＩＮＥTM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩＬＧ
ＲＡＳＴＩＭTM）を含むが、これらに限定されない。
【０５３７】 さらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、線維芽細胞増殖因子と組み合わ
せて投与される。ＭＰＩＦ−１とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子として
は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−
６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧ
Ｆ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが、
これらに限定されない。
【０５３８】 さらなる実施形態において、ＭＰＩＦ−１は、他の治療または予防レジメン（
例えば、照射治療）と組み合わせて投与される。
【０５３９】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニストはまた、抗脈管形成因子と共に投与され得
る。抗脈管形成因子の代表例としては、以下が挙げられる：抗非侵襲性因子、レ
チノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナー
ゼ−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プ
ラスミノゲン活性化因子インヒビター−１、プラスミノゲン活性化因子インヒビ
ター−２、ならびに種々の形態のより軽い「ｄ族（ｄ ｇｒｏｕｐ）」の遷移金
属。
【０５４０】 より軽い「ｄ族」の遷移金属としては、例えば、バナジウム、モリブデン、タ
ングステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げれられる。このような遷移
金属種は、遷移金属複合体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な複合体とし
ては、オキソ遷移金属複合体が挙げられる。
【０５４１】 バナジウム複合体の代表例としては、オキソバナジウム複合体（例えば、バナ
ジン酸塩およびバナジル複合体）が挙げられる。適切なバナジン酸複合体として
は、メタバナジン酸複合体およびオルトバナジン酸複合体（例えば、メタバナジ
ン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウム、およびオルトバナジン酸ナトリ
ウム）が挙げられる。適切なバナジル複合体としては、例えば、バナジルアセチ
ルアセトネートおよび硫酸バナジル水和物（例えば、硫酸バナジル一水和物また
は三水和物）を含む硫酸バナジルが挙げられる。
【０５４２】 タングステンおよびモリブデン複合体の代表例としてはまた、オキソ複合体が
挙げられる。適切なオキソタングステン複合体としては、タングステン酸塩およ
び酸化タングステン複合体が挙げられる。適切なタングステン酸塩複合体として
は、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸
ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切な酸化タングステ
ンとしては、酸化タングステン（ＩＶ）および酸化タングステン（ＶＩ）が挙げ
られる。適切なオキソモリブデン複合体としては、モリブデン酸塩、酸化モリブ
デンおよびモリブデニル複合体が挙げられる。適切なモリブデン酸複合体として
は、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよ
びその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。
適切な酸化モリブデンとしては、酸化モリブデン（ＶＩ）、酸化モリブデン（Ｖ
Ｉ）、およびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデニル複合体としては、
例えば、モリブデンアセチルアセトネートが挙げられる。他の適切はタングステ
ンおよびモリブデン複合体としては、例えば、グリセロール、酒石酸および糖か
ら誘導されたヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０５４３】 幅広い種々の他の抗脈管形成因子はまた、本発明の文脈内で使用され得る。代
表例としては、血小板因子４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（女王カニ
蓋（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ ｓｈｅｌｌｓ） から調製される）（Ｍｕｒａｔａ
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２−２６、１９９１）；硫酸化多糖ペプチ
ドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、エストロゲンおよびク
エン酸タモキシフェンのようなステロイドの存在によって増強され得る）；スタ
ウロスポリン；マトリクス代謝のモジュレーター（例えば、プロリンアナログ、
シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−ヒドロキシプロリン、チアプロリン
、α，α−ジピリジル、アミノプロピオニトリルフマラート；４−プロピル−５
−（４−ピリジニル）−２−（３−Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキセート；ミ
トキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；２−マクログロブリン血清；Ｃ
ｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１
−１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．２８６：４７５−４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデ
カスルフェート；エポネミシン（Ｅｐｏｎｅｍｙｃｉｎ）；カンプトセシン；フ
マギリン（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５−５５７、１９９０
）；金チオリンゴ酸ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆ
ｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０−１４４６、１９８７）；抗
コラゲナーゼ血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６２（４）：１６５９−１６６４、１９８７）；ビサントリーネ（Ｂｉ
ｓａｎｔｒｅｎｅ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロ
アントロン酸二ナトリウムすなわち「ＣＣＡ］；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎ
ｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２−３１６，１９９２）；サリドマイド；Ａ
ｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシナミノルイミダ
ゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメタロプロ
テイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）が挙げられる。
【０５４４】 （投与の様態）個体におけるＭＰＩＦ−１の活性の標準または正常レベルにお
ける減少によって生じる状態が、ＭＰＩＦ−１タンパク質の投与によって処置さ
れ得ることが理解される。従って、本発明はさらに、ＭＰＩＦ−１活性の増加し
たレベルを必要とする個体を処置する方法を提供し、この方法は、そのような個
体に、有効量の本発明の単離されたＭＰＩＦ−１ポリペプチド（詳細には、その
ような個体においてＭＰＩＦ−１活性レベルを増加するに有効なＭＰＩＦ−１の
成熟形態）を含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０５４５】 被験体に投与されるＭＰＩＦ−１の量および投薬措置は、投与の様態、処置さ
れる状態の性質、および処方する医者の判断のような多数の要因に依存する。薬
学的組成物は、特定の適応症の処置および／または予防に有効な量で投与される
。一般的に、ポリペプチドは、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与され
、そしてほとんどの場合、それらは１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ体重を超えない
量で投与され、そして好ましくは用量は、投与の経路、徴候、などを考慮して毎
日約１０μｇ／ｋｇ体重からである。
【０５４６】 一般的な提案として、非経口投与される用量あたりの全薬学的有効量のＭＰＩ
Ｆ−１ポリペプチドは、より好ましくは患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０
ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内であるが、上記のように、これは治療的判断の主題であ
る。さらにより好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日で
あり、ヒトに対して最も好ましくは、約０．０１と１ｍｇ／ｋｇ／日との間であ
る。連続的に与えられる場合、ＭＰＩＦ−１、Ｍ−ＣＩＦ、またはＭＩＰ−４ポ
リペプチドは、典型的に、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用
量速度で、１日あたり１〜４回の注射によるかまたは連続的皮下注入（例えば、
ミニポンプを用いて）によるかのいずれかで投与される。静脈バッグ溶液もまた
用いられ得る。生じる応答について変化および処置後の間隔を観察するために必
要な処置の長さは、所望の効果に依存して変化するようである。
【０５４７】 本発明のＭＰＩＦ−１を含む薬学的組成物は、経口的にか、直腸へか、非経口
的にか、嚢内へか、膣内へか、腹腔内へか、局所的（粉末、軟膏、ドロップ、ま
たは経皮パッチによって）か、頬側へか、または経口もしくは鼻スプレーとして
投与され得る。
【０５４８】 （遺伝子治療） ケモカインポリペプチド、およびポリペプチドであるアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、本発明に従って、インビボでこのようなポリペプチドを発現するこ
とによって用いられ得る（これは、しばしば「遺伝子治療」といわれる）。
【０５４９】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作され得、次いで操作された細胞
と共に、ポリペプチドで処置されるべき患者へ提供される。このような方法は当
該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮ
Ａを含むレトロウイルス粒子の使用によって当該分野で公知の手順によって操作
され得る。
【０５５０】 同様に、細胞は、例えば当該分野で公知の手順によってインビボでポリペプチ
ドを発現するためにインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明
のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を産生するための
産生細胞は、インビボでの細胞の操作、およびインビボでのポリペプチドの発現
のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投
与するこれらおよび他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかである。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた
後インビボで細胞を操作するために使用され得るレトロウイルス以外（例えば、
アデノウイルス）であり得る。
【０５５１】 レトロウイルスに由来し得るレトロウイルスプラスミドベクターは、モロニー
マウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウ
ス肉腫ウイルス、およびハーベイ肉腫ウイルスを含むが、それらに限定されない
。
【０５５２】 好ましい実施態様において、レトロウイルス発現ベクターｐＭＶ−７は、モロ
ニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）によって隣接され、単純ヘルペ
スウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの調節下で選択可
能な薬物耐性遺伝子ｎｅｏを含む。唯一のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位
は、コード配列の導入を容易にする（Ｋｉｒｓｃｈｕｍｅｉｅｒ， Ｐ．Ｔ．ら
， ＤＮＡ ７：２１９−２５（１９９８））。
【０５５３】 １つ以上の適切なプロモーターを含むベクターは、レトロウイルスＬＴＲ；Ｓ
Ｖ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら， Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
， 第７巻， 第９号：９８０−９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒ
ストン、ｐｏｌＩＩＩ、およびβアクチンプロモーターを含むが、それらに限定
されない真核生物細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター）を含むが、
それらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教
示から当業者に明らかである。
【０５５４】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、ウイルスチミジンキナーゼプ
ロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウ
イルスＬＴＲ、βアクチンプロモーター、およびポリペプチドをコードする遺伝
子を制御する天然のプロモーターを含むが、それらに限定されない適切なプロモ
ーターの制御下にある。
【０５５５】 レトロウイルスプラスミドベクターは、産生体細胞株を形成するために、パッ
ケージング細胞株の形質導入に使用される。トランスフェクトされ得るパッケー
ジング細胞の例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、およびＧＰ＋ａｌｍ２が挙
げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手段
によってパッケージング細胞へ形質導入され得る。このような手段としては、エ
レクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０５５６】 産生体細胞株は、このポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロ
ウイルスベクター粒子を生成する。次いで、このようなレトロウイルスベクター
粒子は、真核生物細胞を形質導入するために、インビトロまたはインビボのいず
れかで使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードす
る核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、線維芽細胞および内
皮細胞を含むが、これらに限定されない。
【０５５７】 本発明の別の局面は、傷害、疾患および状態を処置するための遺伝子療法であ
る。遺伝子療法は、本発明のＭＰＩＦ−１ポリペプチドの発現を達成するための
核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への
導入に関する。この方法は、プロモーターに作動可能に連結したＭＰＩＦ−１ポ
リペプチドおよび標的組織によってポリペプチドを発現するために必要な任意の
他の遺伝子要素をコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子
治療および送達技術は、当該分野において公知である（例えば、ＷＯ９０／１１
０９２（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０５５８】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでＭＰＩＦ−１ポリヌクレオ
チドに作動可能に連結するプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）によって操作され得、次いで、この操作された細胞は、このポリペプチ
ドによって処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野にお
いて周知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎ
ｉ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１
９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３
：４６０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄ
ｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（
１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４
：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６））を参照のこ
と（これらは、本明細書中で参考として援用される）。１つの実施形態において
、操作された細胞は、動脈細胞である。動脈細胞は、動脈、動脈の周りの組織へ
の直接注射によってか、またはカテーテル注入によって、患者へ再導入され得る
。
【０５５９】 以下により詳細に論じられるように、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド構築物は
、動物の細胞へ注射物を送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚
、肺、および肝臓など）の間隙空間への注射）によって送達され得る。ＭＰＩＦ
−１ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な脂質または水性キャリアで
送達され得る。
【０５６０】 １つの実施形態において、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレ
オチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡ
とは、細胞への侵入を補助、促進または容易にするために働く任意の送達ビヒク
ルのない配列をいい、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチンまたは沈殿剤などを含む。しかし、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドはま
た、当業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物およびリポフェ
クチン処方物などで送達され得る。このような方法は、例えば、米国特許第５，
５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号
（これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０５６１】 遺伝子療法において使用されるＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドベクター構築物
は、好ましくは、宿主細胞に組み込まれず、また複製を可能とする配列を含まな
い構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｓＳＧ；Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１および
ｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らか
である。
【０５６２】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド
配列の発現を駆動するために使用され得る。適切なプロモーターとしては、アデ
ノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；ま
たは異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター
）；気道レンチシウム（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイル
ス（ＲＳＶ）プロモーター；誘発性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター
、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロ
モーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミ
ジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ
ー）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホル
モンプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、ＭＰＩＦ−１のための天
然のプロモーターであり得る。
【０５６３】 遺伝子治療技術と異なって、標的細胞に裸の核酸配列を導入することの１つの
主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成という一時的な性質である。
研究は、複製されないＤＮＡ配列は、６ヶ月までの間、所望のポリペプチドの産
生を提供するために、細胞へ導入され得ることを示した。
【０５６４】 ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド構築物は、動物の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、
肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、
胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織を含む）の間
隙空間へと送達され得る。組織の間隙空間は、器官組織の細網線維、血管または
室の壁の弾性繊維、繊維組織のコラーゲン繊維の間の、細胞間流動性ムコ多糖類
マンドレルトリクス、あるいは筋肉細胞をシースで覆う結合組織内または骨の空
隙にある同様なマトリクスを含む。これは、同様に、循環の血漿およびリンパ性
チャネルのリンパ流によって占められる空隙である。筋肉組織の間隙空間への送
達は、以下に記載される理由のために好ましい。これらは、好都合なことに、こ
れらの細胞を含む組織への注射によって送達され得る。これらは、好ましくは、
分化した非分裂性細胞に送達されそして持続的に発現するが、送達および発現は
、未分化のまたは完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮
膚の繊維芽細胞）において達成され得る。インビボ筋肉細胞は、特に、ポリヌク
レオチドを取り込みそして発現するそれらの能力において適している。
【０５６５】 裸の核酸配列注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量
は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましく
は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識
するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。核酸配列の適切
かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態
および投与経路に依存し得る。
【０５６６】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。し
かし、他の非経口経路（例えば、特に肺もしくは気管支組織、咽喉、または鼻の
粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入）もまた用いられ得る。さらに、
裸のＭＰＩＦ−１ＤＮＡ構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いら
れるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０５６７】 裸のポリヌクレオチドは、当該分野において公知の任意の方法（送達部位に直
接針で注入、静脈内注射、局所的投与、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝
子ガン」が挙げられるがこれらに限定されない）によって、送達される。これら
の送達方法は、当該分野において公知である。
【０５６８】 この構築物もまた、送達ビヒクル（例えば、ウイルス配列、ウイルス粒子、リ
ポソーム処方物、リポフェクチン、沈降薬剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ａ
ｇｅｎｔ）など）を用いて送達され得る。このような送達の方法が、当該分野に
おいて公知である。
【０５６９】 特定の実施形態において、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド構築物は、リポソー
ム調製物中に複合体化される。本発明における用途のためのリポソーム調製物と
しては、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）、および中
性の調製物が挙げられる。しかし、カチオン性リポソームが特に好ましい。なぜ
なら、堅固な荷電複合体が、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間
に形成され得るからである。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、以下の
細胞内送達を媒介することが示されている：プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１
６（１９８７）；これは、本明細書中で参考として援用される）；ｍＲＮＡ（Ｍ
ａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７
７−６０８１（１９８９）；これは、本明細書中で参考として援用される）；お
よび精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０
１８９−１０１９２（１９９０）；これは、本明細書中で参考として援用される
）。
【０５７０】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［（２，３−ジオ
レイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そしてＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉ
ｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．から商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）のもと
で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６（１９８７）もまた参照のこと；これは、
本明細書中で参考として援用される）。他の市販されているリポソームとしては
、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）
およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０５７１】 他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に利用
可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイル
オキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明に
ついては、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２（これは、本明細書中で参考と
して援用される）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は、文献において
説明されている。例えば、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（これは、本明細書中で参考と
して援用される）を参照のこと。類似の方法が、他のカチオン性脂質物質からリ
ポソームを調製するために使用され得る。
【０５７２】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用して容易に調製され得る
。このような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール
、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯ
ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイル
ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はま
た、適切な比率でＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発物質と混合され得る。これら
の物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０５７３】 例えば、商業的に利用可能な、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイ
ルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、コレステロールの添加を伴
ってかまたは伴わずに、従来リポソームを作製するために種々の組み合わせで使
用され得る。従って、例えば、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞は、窒素ガス流の下で各
々５０ｍｇのＤＯＰＧおよびＤＯＰＣを乾燥させることによって超音波処理バイ
アル内へ調製され得る。サンプルを、減圧ポンプの下に一晩置き、そして翌日に
脱イオン水で水和する。次いで、サンプルを、インバート型カップ（ｉｎｖｅｒ
ｔｅｄ ｃｕｐ）（浴槽型）探針を備えたＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅ
ｌ ３５０超音波処理器を、浴槽を１５ＥＣにて循環させながら最大設定で用い
て、蓋をしたバイアル中で２時間超音波処理する。あるいは、負に荷電した小胞
は、多重膜小胞を生成するために超音波処理なしで調製され得るか、または不連
続の大きさの単一膜小胞を生成するために核孔（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）膜を通
して押し出すことによって調製され得る。他の方法は当業者に公知であり、そし
て利用可能である。
【０５７４】 このリポソームは、多重膜の小胞（ＭＬＶ）、小さな単一膜小胞（ＳＵＶ）、
または大きな単一膜の小胞（ＬＵＶ）を含み得る。ＳＵＶが好ましい。種々のリ
ポソーム−核酸複合体は、当該分野で周知の方法を使用して調製される。例えば
、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１０１：５１２−５２７（１９８３）（これは、本明細書中で参考として援用さ
れる）を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラス管壁上にリン脂
質の薄膜を沈着させ、引き続いてカプセル化されるべき物質の溶液と水和させる
ことによって調製され得る。ＳＵＶは、均質な単一膜リポソームの集団を生成す
るためにＭＬＶの超音波処理を延長することによって調製される。捕捉されるべ
き物質を、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで超音波処理する。カ
チオン性脂質を含有するリポソームを使用する場合、乾燥脂質膜を適切な溶液（
例えば、滅菌水または等張緩衝溶液（例えば、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＮａＣｌ）
）中に再懸濁し、超音波処理し、次いで予め形成されたリポソームをＤＮＡと直
接混合する。リポソームおよびＤＮＡは、正に荷電したリポソームのカチオン性
ＤＮＡへの結合に起因して、非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小さな
核酸フラグメントを用いる用途が見出される。ＬＵＶは、当該分野において周知
の多くの方法によって調製される。一般に使用される方法としては、Ｃａ2+−Ｅ
ＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９４：４８３（１９７５）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌ
ｌ １７：７７（１９７９）；エーテル注射（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎ
ｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９
（１９７６）；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．７６：８３６（１９７７）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８（１９７９））；界面活性剤透析（
Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５（１９７９））；および逆相エバポ
レーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１
０４３１（１９８０）；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏ
ｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５（１
９７８）；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６
６（１９８２））（これらは、本明細書中で参考として援用される）が挙げられ
る。
【０５７５】 一般的に、ＤＮＡ対リポソームの比率は約１０：１〜約１：１０である。好ま
しくはこの比率は約５：１〜約１：５である。より好ましくは、この比率は約３
：１〜約１：３である。さらにより好ましくは、この比率は約１：１である。
【０５７６】 米国特許第５，６７６，９５４号（これは、本明細書中で参考として援用され
る）は、カチオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウス中へ
の注射を報告する。米国特許第４，８９７，３５５号；同第４，９４６，７８７
号；同第５，０４９，３８６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，５８９，
４６６号；同第５，６９３，６２２号；同第５，５８０，８５９号；同第５，７
０３，０５５号、および国際公開番号ＷＯ９４／９４６９（これらは、本明細書
中で参考として援用される）は、細胞および哺乳動物中にＤＮＡをトランスフェ
クトする際の使用のためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，
４６６号；同第５，６９３，６２２号；同第５，５８０，８５９号；同第５，７
０３，０５５号および国際公開番号第ＷＯ９４／９４６９（これらは、本明細書
中で参考として援用される）は、哺乳動物へＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を送
達するための方法を提供する。
【０５７７】 特定の実施形態において、細胞は、エキソビボまたはインビボで、ＭＰＩＦ−
１をコードする配列を含むＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を用いて操作さ
れる。レトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス
；脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血
病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、骨髄増殖性
肉腫ウイルス（Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉ
ｒｕｓ）、および乳癌ウイルス。
【０５７８】 レトロウイルスプラスミドベクターが使用されて、プロデューサー細胞株を形
成するためにパッケージング細胞株を形質導入する。トランスフェクトされ得る
パッケージング細胞の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない；
Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４（１９９
０）（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されるよ
うな、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ
、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅ
ｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株。ベクターは、当該分野において公知の任意
の手段を通してパッケージング細胞を形質導入し得る。このような手段としては
以下が挙げられるが、これらに限定されない：エレクトロポレーション、リポソ
ームの使用、およびＣａＰＯ4沈降。１つの代替法において、レトロウイルスプ
ラスミドベクターは、リポソーム内にカプセル化され得るか、または脂質とカッ
プリングされ得、次いで宿主に投与され得る。
【０５７９】 プロデューサー細胞株は、ＭＰＩＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む
感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このようなレトロウイ
ルスベクター粒子が使用されて、インビトロまたはインビボのいずれかで真核生
物細胞を形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞は、ＭＰＩＦ−１を発現
する。
【０５８０】 特定の他の実施形態において、細胞は、アデノウイルスベクター中に含まれた
ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで操作され
る。アデノウイルスは、ＭＰＩＦ−１をコードし、そしてそれを発現するように
操作され得、同時に、正常な溶菌性ウイルス生活環において複製するその能力に
関して不活化される。アデノウイルスの発現は、ウイルスＤＮＡを宿主細胞染色
体中に組みこむことなく達成され、それによって挿入性変異誘発に関する懸念を
軽減させる。さらに、アデノウイルスは、優れて安全なプロフィールを伴って長
い間、生腸ワクチンとして使用されてきた（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら、Ａ
ｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３−２３８（１９７４））。
最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入は、コトンラットの肺へのα１抗ト
リプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓ
ｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９
１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２））
。さらに、ヒト癌における原因因子としてアデノウイルスを確立しようと試みる
広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：６６０６（１９７９））。
【０５８１】 本発明において有用な適切なアデノウイルスベクターは、例えば、Ｋｏｚａｒ
ｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．３
：４９９−５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４
３−１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．
Ｔｈｅｒ．４：７５９−７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅ
ｎｅｔ．７：３６２−３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３
６５：６９１−６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４号（
これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載される。例えば、アデノ
ウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞において増殖され
得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そしてＥ１ａおよび
Ｅ１ｂ（これらは、このベクターから欠失された遺伝子の産物を提供することに
よって、欠損アデノウイルスを補完する）を構成的に発現する。Ａｄ２に加えて
、他の種々のアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた
、本発明において有用である。
【０５８２】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損である。
複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスお
よび／またはパッケージング細胞株の補助を必要とする。得られるウイルスは細
胞に感染し得、そしてプロモーターに作動可能に連結されている目的のポリヌク
レオチドを発現し得るが、大部分の細胞で複製することができない。複製欠損ア
デノウイルスは、１つ以上の以下の遺伝子の全てまたは一部分を欠失し得る：Ｅ
１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａ、またはＬ１〜Ｌ５。
【０５８３】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用してエキ
ソビボまたはインビボで細胞が操作される。ＡＡＶは、感染性粒子を生成するた
めにヘルパーウイルスを必要とする天然に存在する欠損ウイルスである（Ｍｕｚ
ｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。これはまた、非分裂細胞にそのＤＮ
Ａを組み込み得る少数のウイルスのうちの１つである。ＡＡＶの３００程度の少
ない塩基対を含むベクターが、パッケージングされて組み込まれ得るが、外因性
ＤＮＡのための空間は、約４．５ｋｂに制限される。このようなＡＡＶを生成し
、そして使用する方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１３
９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第５
，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号、
ならびに同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０５８４】 例えば、本発明における使用のために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、
キャプシド化、および宿主細胞組み込みに必要な配列の全てを含む。ＭＰＩＦ−
１ポリヌクレオチド構築物は、標準的なクローニング方法（例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９
）に見出される方法）を使用してＡＡＶベクターに挿入される。次いで、組換え
ＡＡＶベクターは、任意の標準的技術（リポフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、リン酸カルシウム沈澱などを含む）を用いて、ヘルパーウイルスに感染さ
れるパッケージング細胞にトランスフェクトされる。適切なヘルパーウイルスと
しては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、または
ヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェクトさ
れ、そして感染されると、それらは、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド構築物を含
む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、これらのウイルス粒子を使用
して、エキソビボまたはインビボのいずれかで真核生物細胞を形質導入する。形
質導入された細胞は、そのゲノムに組み込まれたＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド
構築物を含み、そしてＭＰＩＦ−１を発現する。
【０５８５】 遺伝子治療の別の方法は、相同組換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７
０号（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１（１９
９６年９月２６日公開）；国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年８月
４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと）を介して異種制御
領域および内因性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＭＰＩＦ−１をコードする）
を作動可能に連結することを含む。この方法は、標的細胞に存在するが、この細
胞において通常は発現されないか、または所望されるよりも低いレベルで発現さ
れる遺伝子の活性化を含む。
【０５８６】 プロモーターに隣接する標的化配列とともにプロモーターを含むポリヌクレオ
チド構築物は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて作製される。適切なプロ
モーターは、本明細書中に記載される。標的化配列は、プロモーター−標的化配
列と内因性配列との相同組換えを可能にするために内因性配列に十分相同である
。標的化配列は、所望の内因性ポリヌクレオチド配列であるＭＰＩＦ−１の５’
末端に十分近いので、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に
作動可能に連結する。
【０５８７】 プロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを用いて増幅され得る。好ましくは
、増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端において異なる制限酵素
部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモー
ターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端
は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプロ
モーターおよび標的化配列は、消化され、そしてともに連結される。
【０５８８】 プロモーター−標的化配列の構築物は、裸のポリヌクレオチドとして、または
上記により詳述されたトランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイ
ルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、沈殿剤など）とと
もにのいずれかで、細胞に送達される。Ｐプロモーター−標的化配列は、任意の
方法により送達され得、この方法としては、直接針注射、静脈内注射、局所的投
与、カテーテル注入、粒子加速器などが挙げられ得る。この方法は、以下にさら
に詳述される。
【０５８９】 プロモーター標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。構築物と内因性
配列との間の相同組換えが生じ、その結果、内因性ＭＰＩＦ−１配列は、プロモ
ーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内因性ＭＰＩＦ−
１配列の発現を駆動する。
【０５９０】 ＭＰＩＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質をコード
する他のポリヌクレオチドとともに投与され得る。脈管形成タンパク質の例とし
ては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、
ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよびβ、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板
由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロ
ニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロ
ニー刺激因子、ならびに一酸化窒素シンターゼが挙げられるが、これらに限定さ
れない。
【０５９１】 好ましくは、ＭＰＩＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分
泌を容易にする分泌シグナル配列を含む。代表的には、このシグナル配列は、発
現されるべきポリヌクレオチドのコード領域に、このコード領域の５’末端の近
くに、またはその５’末端に配置される。このシグナル配列は、目的のポリヌク
レオチドに対して同種でも異種でもよく、そしてトランスフェクトされるべき細
胞に対して同種でも異種でもよい。さらにシグナル配列は、当該分野で公知の方
法を用いて化学的に合成され得る。
【０５９２】 上記の任意のポリヌクレオチド構築物の投与の任意の形態は、この形態が治療
的効果を提供するに十分な量で１つ以上の分子の発現を生じる限り、使用され得
る。これには、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、微粒子注射器（ｂｉｏ
ｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、
ゲルフォームスポンジデポー、他の市販のデポー物質、浸透圧ポンプ（例えば、
Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐剤固体（錠剤または丸剤）薬学的処方物、
および手術中の傾瀉適用または局所的適用が挙げられる。例えば、リン酸カルシ
ウム沈澱した裸のプラスミドをラット肝臓およびラット脾臓へ、またはタンパク
質コーティングしたプラスミドを門脈へ直接注射することにより、ラット肝臓で
の外来遺伝子の遺伝子発現が生じた（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３
：３７５（１９８９））。
【０５９３】 局所的投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達
ビヒクルと複合体化された本発明の組換え分子は、動脈の領域へ直接注射される
か、またはその領域内に局所的に投与される。動脈の領域内に組成物を局所的投
与することは、動脈内の数センチメートルおよび好ましくは数ミリメートルで組
成物を注射することをいう。
【０５９４】 局所的投与の別の方法は、外科的創傷にまたはその周辺に、本発明のポリヌク
レオチド構築物を接触させることである。例えば、患者は、手術を受け得、そし
てこのポリヌクレオチド構築物が、創傷内部の組織の表面にコーティングされ得
るか、またはこの構築物が創傷内部の組織の領域に注射され得る。
【０５９５】 全身投与において有用な治療的組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクル
に複合体化された、本発明の組換え分子を含む。全身的投与での使用のために適
切な送達ビヒクルは、特定の部位にこのビヒクルを標的化するためのリガンドを
含むリポソームを含む。
【０５９６】 全身的投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口送達およ
び経皮（局所的）送達が挙げられる。静脈内注射は、当該分野で標準的な方法を
用いて行われ得る。エアロゾル送達もまた、当該分野で標準的な方法を用いて行
われ得る（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７−１１２８１（１９９２）（これは、本明細
書中に参考として援用される）を参照のこと）。経口送達は、動物の腸中の消化
酵素による分解に抵抗し得るキャリアに、本発明のポリヌクレオチド構築物を複
合体化することにより行われ得る。このようなキャリアの例としては、プラスチ
ック性のカプセル剤または錠剤（例えば、当該分野で公知のもの）が挙げられる
。局所的送達は、皮膚内へ透過し得る親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と、本発
明のポリヌクレオチド構築物とを混合することにより行われ得る。
【０５９７】 送達されるべき物質の有効量を決定することは、多くの因子に依存し得、これ
らの因子としては、例えば、その物質の化学的構造および生物学的活性、動物の
年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重篤度、ならびに投与
経路が挙げられる。処置の頻度は、多くの因子（例えば、１用量あたりで投与さ
れるポリヌクレオチド構築物の量、ならびに被験体の健康状態および病歴）に依
存する。用量の正確な量、回数および投薬のタイミングは、主治医または獣医師
により決定される。
【０５９８】 本発明の治療組成物は、任意の動物、好ましくは、哺乳動物およびトリに投与
され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウ
サギ、ヒツジ、ウマおよびブタ（ヒトが特に好ましい）が挙げられる。
【０５９９】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施態様において、本発明によるアンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：Ｘに含まれる配列に対応する核酸またはその相補鎖および／あるいは寄託さ
れたクローンに含まれるヌクレオチド配列である。１つの実施態様において、ア
ンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、別の実施態様において、アン
チセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．、５６：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡまた
はＲＮＡを通してか、もしくは３重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し得
る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：
５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａ
ｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に記載さ
れる。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５
１：１３００（１９９１）において議論される。これらの方法は、相補的なＤＮ
ＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０６００】 例えば、非リンパ球性白血病細胞株であるＨＬ−６０および他の細胞株の増殖
を阻害するためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用
は、以前に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら
（１９８９））。これらの実験は、このオリゴヌクレオチドとともに細胞をイン
キュベートすることによりインビトロで行われた。インビボでの使用のための同
様の手順は、ＷＯ９１／１５５８０に記載されている。簡潔には、所定のアンチ
センスＲＮＡについての１対のポリヌクレオチドを以下のように生成する：オー
プンリーディングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端部位上の
ＥｃｏＲ１部位および３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、この対
のオリゴヌクレオチドを９０℃で１分間加熱し、次いで、２×連結緩衝液（２０
ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭ ＡＴＰ）中でアニールし、次いで
、レトロウイルスベクターＰＭＶ７（ＷＯ９１／１５５８０）のＥｃｏＲ１／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位に連結する。
【０６０１】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。
【０６０２】 １つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、外来の配列からの転
写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写され、
本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、本発
明のアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、それが
転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを保持し得
るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野において
標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞
において複製および発現のために使用される、プラスミド、ウイルスまたは当該
分野で公知の他のものであり得る。本発明のポリペプチドをコードする配列また
はそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する
当該分野で公知の任意のプロモーターによってであり得る。そのようなプロモー
ターは、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０
初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ
、２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復
に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９
７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８：１４４１−１４４５（１
９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが含まれるが、これらに限定さ
れない。
【０６０３】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも目的の遺伝子のＲＮＡ転写の一部に
相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることが好ましいが、必要では
ない。本明細書中でいわれる「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列は、Ｒ
ＮＡとハイブリダイズし得るに十分相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列
を意味し；従って、本発明の二本鎖アンチセンス核酸の場合において、二重鎖Ｄ
ＮＡの単一の鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイ
ブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依
存し、一般的に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、より多くの塩基ミスマ
ッチをともない、本発明のＲＮＡ配列は、安定な二重鎖（または三重鎖の場合も
あり得る）を含みかつなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点
を決定するために標準的な手順を使用することによりミスマッチの寛容の程度を
確認し得る。
【０６０４】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまで、およびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害
の際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補
的な配列は、なおｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果を示さなかった。一般的に
、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３−３３５（１９９４）を
参照のこと。従って、本発明のポリヌクレオチド配列の５’−または３’−の非
翻訳領域、非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍ
ＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。ｍＲＮＡの５
’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含
むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従って使用され
得る。ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするよ
うに設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレ
オチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわた
るオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは
、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５
ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０６０５】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはキメラ混合物、
あるいはその誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であり得る
。このオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で
改変され、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改良し得る。このオリ
ゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボにおいて宿
主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を促進する
因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４：６４８−６５２（１９８７）
；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照
のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（
１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘引切断
剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖｅｇｅ ａ
ｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８−
９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏ
ｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）を
含み得る。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、
ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘引切断
剤など）に結合体化され得る。
【０６０６】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０６０７】 この アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定さ
れない群から選択される少なくとも１つの改変糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０６０８】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含
むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変リン酸骨格を
含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート
、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキル
ホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそのアナログ。
【０６０９】 さらに別の実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−
アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補
的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反
対に、その鎖は互いに平行である（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチド
は、２−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲ
ＮＡ−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３
２７−３３０（１９８７））。
【０６１０】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用）により合成され得る。例として
、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））により合成され得、メチ
ルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された孔隙のガラス（ｐｏｒｅ ｇ
ｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用によ
り調製され得る。
【０６１１】 ＭＰＩＦ−１コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用さ
れ得るが、転写される非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好
ましい。
【０６１２】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを
使用して、本発明のポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡを破壊し得るが、ハン
マーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍ
ＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡ
を切断する。たった１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列を有
することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生
成は当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）において十分に記載される。
配列表に開示された各ヌクレオチド配列内に多くの潜在的なハンマーヘッドリボ
ザイム切断部位が存在する。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位が本
発明のポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように；
すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小に
するように、操作される。
【０６１３】 このアンチセンスアプローチにおける場合、本発明のリボザイムは、改変され
たオリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から
構成され得、そしてインビボにおいて本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞
に送達されるべきである。このリボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ
をコードするアンチセンスの導入のための上記と同じ様式において細胞中に導入
され得る。送達の好ましい方法は、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ
ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩプロモーター）の制御下で、リボザイ
ムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含み、その結果トランスフェ
クトした細胞が内因性メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量の
リボザイムを生成する。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるの
で、より低い細胞内濃度が効率のために必要とされる。
【０６１４】 アンタゴニスト化合物／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組
織に対する本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈおよびｐｒｏｌｉｆ
ｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍の新脈管形成を刺激し、そ
れにより異常な細胞増殖および増殖を（例えば、腫瘍形成または増殖において）
遅延または予防し得る。
【０６１５】 このアンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を予防し得
、そして嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術後
の上皮レンズ細胞の増殖を予防し得る。本発明のポリペプチドのマイトジェン活
性の予防はまた、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求され得る。
【０６１６】 このアンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾
患を処置し得る。
【０６１７】 従って、本発明は、以下を含むがこれらに限定されない、障害または疾患を処
置する方法を提供する：患者に（ａ）本発明のポリヌクレオチドに対するアンチ
センス分子および／または（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに対するリボザイム
を投与することによって本発明のポリヌクレオチドの過剰発現に関連する、本願
中に列挙された障害または疾患。
【０６１８】 （エピトープおよび抗体） 本発明は、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、ま
たはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるポリヌクレオチド配列によって、もしくは配
列番号Ｘの配列の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコード
されるポリペプチド配列のエピトープ、または上記で規定されたようなストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより低いストリンジェンシー
のハイブリダイゼーション条件下でＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるポリヌクレオ
チド配列によってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むか、あるい
はそれらからなるポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチド
配列（例えば、配列番号Ｘで開示された配列）のエピトープをコードするポリヌ
クレオチド配列、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補
鎖のポリヌクレオチド配列、および上記で定義されたストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼー
ション条件下で相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０６１９】 用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ま
しくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または
免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、
本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用さ
れる場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下
記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘
発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３
）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場
合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセ
イによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得
るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外
するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免
疫原性である必要はない。
【０６２０】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに
、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０６２１】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少
なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２
、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なく
とも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸配列を含
み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を含む
。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチド
は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５
、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基
の長さである。さらなる非排他的に好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で
開示される抗原性エピトープおよびその一部を含む。抗原性エピトープは、有用
である（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含
む）を惹起するため）。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される
抗原性エピトープ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任
意の組合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子
として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７
７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−
６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０６２２】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら
，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３
４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、
本明細書で開示される免疫原性エピトープおよび２、３、４、５以上のこれらの
免疫原性エピトープの任意の組合せを含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含
むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系
（例えば、ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を誘発するために提示され得
るし、またはこのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）
、そのポリペプチドはキャリアなしで提示され得る。しかし、８〜１０個程度の
少なさのアミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中
の直鎖状エピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されて
いる（例えば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【０６２３】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およ
びＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２３４７−２３５４（１
９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用
いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチ
ドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペ
プチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ
ＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプ
チドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリア
に結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチ
ドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペ
プチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答
を刺激することが公知である他のアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内注射
および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブースター注射
が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で
、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを
用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗
ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法
に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）に
より上昇し得る。
【０６２４】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープフラグメントまたは抗原性エピトープフラグメントを含む本発明のポリペプ
チドは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチド
は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたは
それらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ、お
よびこれらの部分）と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。このよう
な融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボにおける半減期を増加
し得る。このことは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺
乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなる
キメラタンパク質について示された。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕ
ｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと
。上皮の関門を横切っての免疫系への抗原の増強された送達は、ＦｃＲｎ結合パ
ートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまたはＦｃフラグメント（例えば、ＰＣ
Ｔ公開 ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ ９９／０４８１３を参照のこと）に
結合体化した抗原（例えば、インスリン）について実証されている。ジスルフィ
ド架橋二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、そのＩｇＧ部分ジスル
フィド結合に起因して、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よ
りも、他の分子の結合および中和において効果的であることが見出された。例え
ば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：３９５８−
３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた
、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（
ｆｌａｇ ｔａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチ
ドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載
された系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の迅速な精製
を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝
子は、遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からな
るアミノ末端タグと翻訳で融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中に
サブクローンされる。このタグは、融合タンパク質についてのマトリックス結合
ドメインとして働く。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は
、Ｎｉ２＋ニトリロ三酢酸アガロースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ
化したタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０６２５】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号Ｘに対応するポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメント
をアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチ
ドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の
実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ
以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション
、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０６２６】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の配列
番号２の、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、もしくは改変体、および
／またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（
ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ
フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産
生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗
体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグ
メントを含むが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「
抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部
分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本
発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ
、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、
ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1およびＩｇＡ2）または任意のサ
ブクラスであり得る。
【０６２７】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ1ドメイン、Ｃ
Ｈ2ドメインおよびＣＨ3ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ1ドメイ
ン、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗原結
合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物
を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス
（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、シップウサギ（ｓｈ
ｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリであ
る。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミ
ノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは１
つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内因性
免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、そして
例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に
おいて記載のような）を含む。
【０６２８】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種のエ
ピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方に特異
的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９２／０
８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７
４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５
，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０６２９】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように特定化され得る。本発明の任意のエピトープま
たはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発
明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチドの
排除を可能にする抗体を含む。
【０６３０】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、
本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク質
の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに対
応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９５
％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５
％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の
方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリ
ペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において
、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原性ま
たは免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性および
／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明
のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発
明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得
る。好ましい結合親和性としては、５×１０-2Ｍ未満、１０-2Ｍ未満、５×１０ -3 Ｍ未満、１０-3Ｍ未満、５×１０-4Ｍ未満、１０-4Ｍ未満、５×１０-5Ｍ未満
、１０-5Ｍ未満、５×１０-6Ｍ未満、１０-6Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１０-7 Ｍ未満、５×１０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、
５×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、５×１０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、５×
１０-12Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、５×１０-13Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×１０ -14 Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、５×１０-15Ｍ未満または１０-15Ｍ未満の解離定数
すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
【０６３１】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
【０６３２】 本発明はまた、モノクローナル抗体の、本発明のポリペプチド（好ましくは配
列番号２のポリペプチド）に対する結合を競合的に阻害する抗体を提供する。競
合的阻害は、例えば、本明細書中に記載される競合的結合アッセイを使用して当
該分野で公知の任意の方法により決定され得る。好ましい実施形態において、こ
の抗体は、本発明のモノクローナル抗体の、配列番号２ポリペプチドへの結合を
、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％
、または少なくとも５０％競合的に阻害する。
【０６３３】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検
出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在
下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、少
なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提
供される。
【０６３４】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
い抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し、そしてレセプタ
ーへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それにより
レセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合することを妨げない
抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの
抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、レセプター
の二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性
の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性化し得る。この抗体
は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生物
学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定
化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得
る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７
号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；
Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９
９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７
９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９
−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３
１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（
Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａ
ｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌ
ｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１
（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２
（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１
１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４
−２０（１９９６）（これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用さ
れる）を参照のこと。
【０６３５】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。
【０６３６】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の組成
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチド
または他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得
る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およ
び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子
へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９
５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９
９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０６３７】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を生じるのを妨げな
いような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含む
。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル
化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ
）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）に
よる誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質へ
の連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、
特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを
含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘導
体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０６３８】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与され得、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。種々のアジュバント
が、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そしてフ
ロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍ
ｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（
ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホー
ルリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット
−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような
強力に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなア
ジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０６３９】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（上記の参考文献は、その全体
が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「
モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術により生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクロ
ーナル抗体が生成される方法ではない。
【０６４０】 ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体に対して産生およびスクリーニングす
る方法は、慣用的であり、そして当該分野において周知であり、実施例において
詳細に議論される（実施例２２および３０）。非限定な例において、マウスを、
本発明のポリペプチドまたはこのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫化
し得る。一旦、免疫応答が検出される（例えば、抗原に対して特異的な抗体がマ
ウス血清中に検出される）と、マウスの脾臓を回収し、そして脾細胞を単離する
。次いで、脾細胞は、周知の技術によって、任意の適切なミエローマ細胞（例え
ば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）へ融合される。ハイブ
リドーマを、限定希釈により選択およびクローン化する。次いで、ハイブリドー
マクローンを本発明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌する細胞について、
当該分野に公知の方法によってアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含む腹
水を、ポジティブなハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫化することに
より、産生し得る。
【０６４１】 従って、本発明は、モノクローナル抗体、および本発明の抗体を分泌するハイ
ブリドーマ細胞を培養する工程を含む方法によって産生される抗体を、産生する
方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、ミエローマ細胞を
有する本発明の抗原を用いて免疫化されたマウスから単離された脾細胞を融合す
ることにより、次いで、本発明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌するハイ
ブリドーマクローンについて、その融合から生じるハイブリドーマをスクリーニ
ングすることにより、産生される。
【０６４２】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により産生し得
る。例えば、本発明のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントは
、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’
）２フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、免疫グロブリン分
子のタンパク質分解性切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）2フラグメント
は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ1ドメインを含む。
【０６４３】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野に公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的な抗体
ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子
の表面上に提示される。特定の実施形態において、このようなファージを、レパ
ートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、
ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用し得
る。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原を用い
て、（例えば、標識化抗原、あるいは固体表面または固体ビーズへ結合または捕
捉された抗原を使用して）選択または同定し得る。これらの方法において使用さ
れるファージは、代表的に、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺
伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたは
ジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現された
ｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージ
である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法
の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８６（１９９５
）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５
２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９〜１８（１９
９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５
７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開 ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４
；ＰＣＴ公開 ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１
０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２
；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，
２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同
第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７
号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，
６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７
３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらのそれぞれは、その全
体が参考として援用される）。
【０６４４】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体
をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体、または任意の他の所望の抗原
結合フラグメントを作製するために単離および使用され得、そして例えば、以下
に詳細に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細
菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’お
よびＦ（ａｂ’）2フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該
分野で公知の方法を用いて使用され得る。この方法は、例えば、以下に開示され
る方法である：ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａ
ｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（上記の参考文献は
、その全体が参考として援用される）。
【０６４５】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビト
ロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体または
ヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体は、この抗体の異なる部分が異
なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域
およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生す
るための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；および米国特許第５，８
０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号
を参照のこと（これらは、本明細書中でその全体が参照として援用される）。ヒ
ト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫
グロブリン分子由来の１つ以上のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合
する、非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域
におけるフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換さ
れ、抗原結合を改変（好ましくは、改善）する。これらのフレームワーク置換は
、当該分野で周知の方法により同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワ
ーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリン
グ、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配
列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒ
ｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）（これらは本
明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。抗体は、例えば
、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グ
ラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開
ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，
１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎ
ｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２
，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔ
ｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０
５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３
（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉ
ｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０６４６】 完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置に対して特に望ましい。ヒト抗体は
、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得、これらの方法としては、ヒ
ト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプ
レイ方法が挙げられる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６
，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３
、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ
９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、その全体が
参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０６４７】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。この改変された胚性幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞
に微量注入して、キメラマウスを産生する。次に、このキメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部
）を用いて通常の様式で免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、従
来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ
得る。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間のトランスジェニック
マウスの再編成によってかくまわれ（ｈａｒｂｏｒｅｄ）、そしてその後、クラ
ススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によ
って、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の
産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏ
ｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５
−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産
生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコール
の詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２
／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０
５９８ ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号
；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０
１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８
５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を
参照のこと（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。さら
に、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａ
ｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を
用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０６４８】 選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉｄ
ｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選
択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープ
を認識する完全ヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂ
ｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０６４９】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために
順々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）；ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照
のこと）。例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ）および／または本発明のポリペプチドのリガンドに対する
結合を競合的に阻害する抗体を用いて、このポリペプチドのマルチマー化および
／または結合ドメインを「模倣し」、そして結果として、ポリペプチドおよび／
またはそのリガンドに結合し、そして中和する抗イディオタイプを生成し得る。
このような中和抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフ
ラグメントは、治療レジメンにおいて使用されて、ポリペプチドリガンドを中和
し得る。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペ
プチドを結合し得るか、そして／またはそのリガンド／レセプターを結合し得、
それによって、その生物学的活性をブロックし得る。
【０６５０】 用語「本発明のポリペプチドのリガンドに対する結合」としては、本発明のリ
ガンドポリペプチドのレセプターへの結合；本発明のレセプターポリペプチドの
リガンドへの結合；本発明の抗体の抗原またはエピトープへの結合；本発明の抗
原またはエピトープの抗体への結合；本発明の抗体の抗イディオタイプ抗体への
結合；本発明の抗イディオタイプ抗体のリガンドへの結合；本発明の抗イディオ
タイプ抗体のレセプターへの結合；本発明の抗イディオタイプ抗体のリガンド、
レセプターもしくは抗体への結合などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０６５１】 別の例として、本発明のポリペプチドまたはそのリガンドに結合して競合的に
活性化する抗体を使用して、ポリペプチド結合ドメインおよび／または活性化ド
メインを模倣して、結果としてこのポリペプチドおよび／またはそのリガンドを
活性化する抗イディオタイプ抗体を作製し得る。このような抗イディオタイプこ
のような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントの活性化を治療レジメンにおい
て使用して、ポリペプチドリガンドを活性化し得る。例えば、このような抗イデ
ィオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドに結合し、それによりその生
物学的活性を活性化するか、ならびに／または本発明のポリペプチドのリガンド
および／もしくはレセプターに結合しそれによりその生物学的活性を活性化する
。
【０６５２】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むかあるいはこれらからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明
はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いスト
リンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上記のような）、抗
体（好ましくは、本発明のポリペプチドへ特異的に結合する抗体）をコードする
ポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドに結合する抗体をコードするポリヌクレオチド、に対してハイブリダイズする
ポリヌクレオチドを含む。
【０６５３】 当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得
、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば
、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレ
オチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例え
ば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９
４）に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部
分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチド
のアニーリングおよび連結、ならびに次いでＰＣＲによるこの連結されたオリゴ
ヌクレオチドの増幅を含む。
【０６５４】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、
化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブ
ラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体
の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブ
ラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））を、例
えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定す
るために、その配列をコードする抗体のの３’末端および５’末端にハイブリダ
イズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、またはその特定の遺
伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによっ
て得られ得る。ＰＣＲによって作製された増幅された核酸は、次いで、当該分野
で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニング
され得る。
【０６５５】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製
し得る。
【０６５６】 特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列
は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定するために、当該分野で周知の方法
、例えば、他の重鎖および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列を比較して、配
列超可変性領域を決定する方法、によって、調べられ得る。慣用的組換えＤＮＡ
技術を使用して、一つ以上のＣＤＲが、フレームワーク領域内、例えば、上記の
ように、非ヒト抗体をヒト化させるためにヒトフレームワーク領域内に挿入され
得る。このフレームワーク領域は、天然に存在するか、または共通するフレーム
ワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（ヒ
トフレームワーク領域の一覧については、例えばＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ． ２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましく
は、フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せによって生成するポリヌクレオチ
ドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは
、上で考察したように、一つ以上のアミノ酸の置換は、フレームワーク領域内で
起こり、そして好ましくは、このアミノ酸置換は、その抗原への抗体の結合を改
善する。さらに、このような方法は、アミノ酸置換させるため、または鎖内ジス
ルフィド結合に参加している一つ以上の可変領域システイン残基を欠失させて、
一つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠けた抗体分子を生成させるために、使用さ
れ得る。ポリヌクレオチドに対する他の改変は、本発明によって企図されそして
当該分野の技術範囲内である。
【０６５７】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、スプライシングすることによる、「
キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３
１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：
４５２−４５４（１９８５））の産生のために開発された技術が、使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物の種に由来する分子（
例えばマウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有
する分子）であり、例えばヒト化抗体である。
【０６５８】 あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６
，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９９８）；
Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８
７９−５８８３（１９９８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４
４−５４（１９８９））は、一本鎖抗体を産生するために適合され得る。一本鎖
抗体は、アミノ酸架橋を介して、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結
し、一本鎖ポリペプチドを生じることによって形成される。Ｅ．ｃｏｌｉにおけ
る機能的Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９９８））。
【０６５９】 （抗体産生の方法） 本発明の抗体は、抗体の合成について当該技術分野で公知の方法によって、特
に化学合成によって、または好ましくは組換え発現技術によって、産生され得る
。
【０６６０】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、または本発明の一本鎖抗体）の組換え発現は
、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。
本発明の、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの部分（好ま
しくは重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチド
が一旦得られれば、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術
を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。従って、ヌクレオチド配列
をコードする抗体を含むポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製する
ための方法は、本明細書中に記載される。当業者に周知の方法は、抗体コード配
列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するた
めに使用され得る。これらの方法は、例えば，インビトロ組換えＤＮＡ技術、合
成技術、およびインビボ遺伝子組換えを含む。従って、本発明は、本発明の抗体
分子をコードするヌクレオチド配列、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはプロ
モーターに作動可能に連結された、重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、を含む複
製可能ベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコー
ドするヌクレオチド配列を含み（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ８６／０５８
０７号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２
２，４６４号を参照のこと。）、そして、この抗体の可変領域は、重鎖または軽
鎖の全体の発現のためにこのようなベクター内にクローニングされ得る。
【０６６１】 発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入され、次いでトランスフ
ェクト細胞は、従来の技術によって本発明の抗体を産生するために培養される。
従って、本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその重
鎖もしくは軽鎖、または異種のプロモーターに作動可能に連結された、本発明の
一本鎖抗体を含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態
では、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、下記の詳細のように、免
疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞において共発現され得る。
【０６６２】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベク
ター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用い
て形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のよう
な微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換され
た酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコード
する配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感
染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイ
クウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞
系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、
Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム
に由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳
動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモー
ター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保
有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞
）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そして
より好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組
換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由
来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされ
た、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗
体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０
１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（
１９９０））。
【０６６３】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク
質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクタ
ーには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列が
ｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）
で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現
ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８
３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ
＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１
９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるため
に使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶
解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および
結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る
。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を
含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、Ｇ
ＳＴ部分から放出され得る。
【０６６４】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０６６５】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ
ー、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０６６６】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。
【０６６７】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プ
ロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、
など）、および選択マーカーであるが機能的でないかまたはインタクトなウイル
ス起源のマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮＡの
導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、次い
で、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選
択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に組み
込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクローニングし得、
細胞株に拡大され得ることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞
株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、直
接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価
において、特に有用であり得る。
【０６６８】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚ
ｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０
２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗ
ｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、こ
れらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ
使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使
用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（
Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８
に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−
５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９
１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉ
ｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１
９９３）；Ｍａｙ、１９９３年、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１
５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓ
ａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術
の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用
され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋ
ｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、
ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇ
ａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これらは
その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０６６９】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。
【０６７０】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードし、そして発現可能である。このような状況において、過剰の
毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））
。重鎖および軽鎖についてのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得
る。
【０６７１】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
て、精製を容易にし得る。
【０６７２】 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に組換えにより融合されるか、または化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによっ
て、特定の細胞型に対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が
使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、イン
ビトロイムノアッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において
使用され得る。例えば、Ｈｏｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ
９３／２１２３２号；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１
号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆ
ｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参
照のこと（これらは、その全体が参考として援用される）。
【０６７３】 （結合体およびキレート） 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメイン
に融合または結合された、本発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、
本発明のポリぺプチドは、抗体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合さ
れ得る。この抗体の本発明のポリぺプチドに融合された部分は、定常領域、ヒン
ジ領域、ＣＨ1ドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメイン、またはそのド
メイン全体もしくは部分の任意の組合せを含み得る。このポリぺプチドはまた、
上記の抗体の部分に融合または結合されて、多量体を形成し得る。例えば、本発
明のポリぺプチドに融合されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結
合を通して二量体を形成し得る。より高次の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇ
ＡおよびＩｇＭの部分に融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺ
プチドを抗体部分に融合または結合させるための方法は、当該分野において公知
である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号
；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８
５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１
６６；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９６／０４３８８号；同第ＷＯ９１／０６５７０
号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２
）（前記の参考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０６７４】 上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配
列番号２の改変体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半
減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイ
において使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに、
配列番号２に対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合体化し
て、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最
初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常
領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４
，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９
８８））。ジスルフィド結合二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融
合または結合体化される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質
またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合してそして中和する
において、さらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タン
パク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改
良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２ ２６２）。あるい
は、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を
欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ
部分と融合された（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎ
ｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０６７５】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供
する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タ
ンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ
３７：７６７（１９８４））、および「フラッグ（ｆｌａｇ）」タグを含むが
、これに限定されない。
【０６７６】 上記に示したように、少なくとも１つのＭＰＩＦ−１エピトープに特異的に結
合する抗体が含まれ、そして本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特
異的に結合する抗体はまた除外され得る。従って、抗体は、ＭＰＩＦ−１に特異
的であっても、またはＭＰＩＦ−１以外のポリペプチドおよびエピトープに特異
的であってもよい。
【０６７７】 本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所与の処置レジメン
（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進
行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物
質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種
々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々
の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イ
オン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）
に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する
媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカー）を介して、連結または結合体化さ
れ得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のために抗体に結合体化され
得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適
切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切
な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジ
ン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フ
ルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリ
アジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙
げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例とし
ては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、
適切な放射性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎまたは99Ｔｃが挙げら
れる。
【０６７８】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
、細胞傷害性、細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放
射性金属イオン（例えば、α−エミッタ−（例えば213Ｂｉ））に結合体化され
得る。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。
例としては、パクリタキソール（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、
グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テ
ニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒ
チン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄ
ｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミ
トラマイシン、アクチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココル
チコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、および
ピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療
剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−
チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化
剤（例えば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオテパ（
ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）
およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈ
ａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マ
イトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シ
スプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマ
イシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前
はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイ
シン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば
ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０６７９】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス体外毒素、またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例
えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長
因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス薬（
例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ ９７／３３８
９９号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ ９７／３４９１１号を
参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ ９９
／２３１０５号を参照のこと）、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アン
ジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリ
ンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（
「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファー
ジコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−Ｃ
ＳＦ」）、または他の増殖因子）、が挙げられ得る。
【０６８０】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原のイ
ムノアッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガ
ラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビ
ニルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０６８１】 さらに、ＭＰＩＦポリペプチド、その改変体、フラグメント、アゴニスト、お
よびアンタゴニストは、診断剤または治療剤（例えば、上記および本明細書中の
もの、または当該分野において周知の他のもの）に結合体化され得る。ＭＰＩＦ
結合体は、本明細書中に記載され、そして当該分野において周知の診断目的また
は治療目的のために使用され得る。
【０６８２】 例えば、ＭＰＩＦは、ラジオアイソトープに結合体化され得、そして診断また
は治療のために使用され得る。
【０６８３】 このような治療部分を抗体に結合体化する技術は、周知である、例えば、Ａｒ
ｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄ
ｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第二版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、ｐｐ．６２
３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、
「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎ
ｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐ
ｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎ
ｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂ
ａｌｄｗｉｎら（編）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−
５８（１９８２）を参照のこと。
【０６８４】 本発明の抗体、タンパク質（ポリペプチドを含む）および低分子は、標的化分
子および前標的化（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）分子として使用され得る。本発
明のこのような分子は、当業者に周知の方法（標的化放射性免疫療法のための抗
体および抗体のファージライブラリーの放射性標識キレート化が挙げられるが、
これに限定されない）によって、放射性標識され得る。例えば、ＤｅＮａｒｄｏ
ら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５（１０Ｓ）：３２１３ｓ−３２１８ｓ
（１９９９）；Ｑｕａｄｒｉら，Ｑ．Ｊ Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２：２５０−２
６１（１９９８）（これらの各々の内容が、それらの全体において参考として援
用される）を参照のこと。
【０６８５】 キレート化のために、異なる化学結合が、抗体と放射性標識キレートとの間に
挿入され得る。標的抗原と反応性の放射性標識モノクローナル抗体は、インビボ
において、細胞傷害性または診断用の同位体を悪性細胞に選択的に送達し得る。
前標的化分子の構築は、抗体遺伝子の多様性および柔軟性（ｍａｌｌｅａｂｉｌ
ｉｔｙ）を使用して、提供され得る。標的抗原と反応性である単鎖抗体フラグメ
ント（すなわち、ｓｃＦｖ）の多様なアレイは、ヒト未処理ファージ抗体ライブ
ラリーからの選択によって獲得され得る。ｓｃＦｖはまた、その後の操作（例え
ば、アフィニティー成熟、および特異性の改変）を容易にするファージライブラ
リーの構築のために、ハイブリドーマから直接的にクローン化され得る。特定の
抗原標的に対してこれらの供給源から選択されたｓｃＦｖ親和性は、広範なスペ
クトルの結合特性を示した。選択されたｓｃＦｖからの抗体重鎖（Ｖ（Ｈ））お
よび軽鎖（Ｖ（Ｌ））遺伝子は、カセットとして、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄ
ｙ）分子中にクローン化され得る。本願はさらに、以下において、毒素または細
胞傷害性プロドラッグに会合した本発明のポリペプチドの投与による、細胞の特
異的破壊のための方法を考察する。
【０６８６】 あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌ、米国特許第４，６７６，９８０号（これは、
その全体において、本明細書中で参考として援用される）に記載のように、二次
抗体に結合体化されて、抗体ヘテロ結合体を形成し得る。
【０６８７】 単独、あるいは細胞傷害性因子（単数または複数）および／またはサイトカイ
ン（単数または複数）と組み合わせて投与される抗体（これは、それに結合体化
された治療的部分を伴っても伴わなくともよい）が、治療剤として使用され得る
。
【０６８８】 放射性標識された抗体、タンパク質および低分子は、細胞傷害性因子であり、
そして放射性免疫療法のような標的化放射線療法、または放射性免疫診断および
放射性画像化のような放射性免疫検出において、使用され得る。正常な組織、細
胞および器官を防御または処置するために、ＭＰＩＦ−１は、放射性標識された
抗体、タンパク質または低分子の投与の前、投与の間、または投与後に投与され
得る。
【０６８９】 上記に示したように、ＭＰＩＦ−１の少なくとも１つのエピトープを特異的に
結合する抗体が含まれ、そして本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに
特異的に結合する抗体はまた、除外され得る。従って、抗体は、ＭＰＩＦ−１に
対して特異的であり得るか、またはＭＰＩＦ−１以外のポリペプチドおよびエピ
トープに対して特異的であり得る。１つの実施形態では、放射性標識抗体、タン
パク質または低分子が、癌または別の疾患に対する放射性免疫療法の間に、ＭＰ
ＩＦポリペプチドと組み合わせて投与される。ＭＰＩＦポリペプチドは、放射性
免疫療法剤の投与投与の前、投与の間、または投与後に投与される場合に、損傷
から正常な細胞（例えば、骨髄前駆体）および他の正常な細胞、組織、および器
官を防御および／または処置する。
【０６９０】 別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、以下と組み合わせて投与され
る：Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体；ＲｉｔｕｘａｎTM）
，Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ（90Ｙと結合体化された、抗ＣＤ
２０モノクローナル抗体；ＺｅｖａｌｉｎTM），Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ（131
Ｉと結合体化；ＢｅｘｘａｒTM），Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ＲｉｔｕｘａｎTM），
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎTM），ＯｖａＲｅｘ ＭｏＡｂ（
卵巣癌におけるＣＡ１２５に対するモノクローナル抗体），Ｄｅｎｉｌｅｕｋｉ
ｎ ｄｉｆｉｔｏｘ（ジフテリア毒素結合体；Ｏｎｔａｋ（登録商標）），ＡＡ
９８（正常な組織ではなく微小血管系に結合するモノクローナルＡｂ（Ｘｉｙｕ
ｎら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５（補遺）：要旨８２（１９９９））
，Ａｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ（抗汎腺癌抗原（ａｎｔｉ−ｐａｎａｄｅｎｏｃａｒ
ｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ）），抗ＣＥＡ抗体（131Ｉと結合体化（Ｂｅｈ
ｒら，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５ｔｈ Ａｎｎｕａ
ｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｔｌａｎｔａ；要旨１０２５（１９９９）），抗ＴＡＧ
７２糖タンパク質抗体，抗ＰＭＳＡ抗体，抗ＨＬＡ−ＤＲ１０β抗体，抗ＶＥＧ
Ｆ抗体，抗ＣＸＣＲ４抗体，ＣＨ２２５（キメラ化抗ＥＧＦｒ抗体（Ｍｅｎｄｅ
ｌｓｏｈｎら，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５ｔｈ Ａ
ｎｎ．Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｔｌａｎｔａ；要旨１５０２（１９９９）），ＣＰ−
３５８，７７４（Ｋａｒｐら，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ．３５ｔｈ
Ａｎｎ．Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ；要旨１４９９（１９９９）
）およびＺＤ １８３９（Ｋａｒｐら，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ．
３５ｔｈ Ａｎｎ．Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ；要旨１５００（１
９９９））（両方とも、ＥＧＦｒの低分子インヒビター），ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８
（90Ｙに結合する分子と結合体化された、抗ＣＤ２０抗体（Ｗｉｔｚｉｇら，「
Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８ ｒａｄｉｏｉ
ｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌａｐｓ
ｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ＣＤ２０−ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂ−ｃｅｌ
ｌ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ」，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ
ｏｌ．１９９９（印刷中）；Ｂａｓｔｉｏｎら，Ｂｌｏｏｄ．１９９５ ；８６
：３２５７−３２６２．），131Ｉ−ＭＮ−１４ Ｆ（ａｂ）2抗癌胎児抗原モノ
クローナル抗体（Ｊｕｗｅｉｄら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０００年１月；４
１（１）：９３−１０３；Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０００年１月；４１（１）
：１０４−６における論評），67Ｃｕ−２ＩＴ−ＢＡＴ−Ｌｙｍ−１（Ｌｙｍ−
１は、悪性リンパ球を優先的に標的化するマウスモノクローナル抗体である；キ
レート剤は、１，４，７，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ
’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（これは、67Ｃｕを結合する）（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ
ｌら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ １９９９年１２月；４０（１２）：２０１４−２
０）），レニウム−１８８−標識化抗ＮＣＡ抗原抗体ＢＷ ２５０／１８３（抗
顆粒球；トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（Ｓｅｉｔ
ｚら，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ １９９９年１０月；２６（１０）：１２
６５−７３）），ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８（90Ｙ ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕ
ｘｅｔａｎ；ＭＸ−ＤＴＰＡ（ｔｉｕｘｅｔａｎ）を共有結合するマウスＩｇＧ 1 κ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体，これは、放射性同位元素イットリウム−９
０をキレートする（Ｗｉｔｚｉｇ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９９年１２
月；１７（１２）：３７９３−８０３）），213Ｂｉ−ＨｕＭ１９５（抗ＣＤ３
３（Ｓｇｏｕｒｏｓら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ １９９９年１１月；４０（１１
）：１９３５−４６）），67銅−２−イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａ
ｎｅ）−６−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル］−ＴＥＴＡ−Ｌｙｍ−１
（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９年１０月
；５（１０補遺）：３３３０ｓ−３３３６ｓ）），90Ｙ−ＢＣ−４（テネイシン
を認識するマウスＭＡｂ；安定な90Ｙ標識化ＭＡｂ結合体は、ジエチレントリア
ミンペンタ酢酸（ＩＴＣ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）のキレーターｐ−イソチオシアナー
トベンジル誘導体を用いて調製され得る（Ｒｉｖａら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ １９９９年１０月；５（１０補遺）：３２７５ｓ−３２８０ｓ））， 131 Ｉ−標識化ｃＧ２５０キメラモノクローナル抗体Ｇ２５０（ｃＧ２５０）（
Ｓｔｅｆｆｅｎｓら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９年１０月；５
（１０補遺）：３２６８ｓ−３２７４ｓ）），二重特異性抗癌胎児抗原／抗ジエ
チレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）抗体、および131Ｉ Ｄｉ−ＤＴＰＡ
ハプテン（Ｖｕｉｌｌｅｚら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９年１
０月；５（１０補遺）：３２５９ｓ−３２６７ｓ））。そして、放射性免疫療法
についてのさらなる標的としては、ＨＬＡ−ＤＲ，ＣＤ １９，およびＣＤ２２
が挙げられる。
【０６９１】 放射性免疫療法の間の本発明の組成物による正常組織の防御を分析するための
方法は、当該分野において周知である。これには、８９−ストロンチウムの注入
を使用する骨髄損傷を研究するためのインビボモデル（これは、骨を探索し、そ
のようにして、骨髄構成成分を照射する）が挙げられる。以下の概説文献もまた
、抗体、放射線療法、および免疫放射線療法の使用に関する指針を提供する：「
Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ
ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．１９９９；３８補遺１
３：７５−８３；「Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈ
ｅｒａｐｙ」Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．２０００年２月；２６（１）
：３−１０；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ
ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ」Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９９年１２月；２６
（６）：６８３−９０；「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：ｆｉｒｓｔ ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｍａ」Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９９年
１０月；２６（５補遺１４）：６６−７３；「Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」Ｓ
ｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９年１０月；２６（５補遺１４）：５８−６５；
「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ
ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ
」Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９年１０月；５（１０補遺）：３２
１９ｓ−３２２３ｓ；”Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒａｄ
ｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｔｕｍｏｒｓ」Ｈｅ
ｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．１９９９年８月；１３
（４）：８１１−２３；および、「Ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ」Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．１９９
９年１月；１８（３）：２１９−２４。 別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例えば、
異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグに会合した、ＭＰＩＦポ
リペプチドまたは抗ＭＰＩＦ抗体を含む組成物）を、標的細胞（例えば、ＭＰＩ
Ｆを発現する、Ｂ細胞もしくはＴ細胞、単球、マクロファージ、および好中球の
ような）に送達する方法を提供する。本発明のＭＰＩＦポリペプチドまたは抗Ｍ
ＰＩＦ抗体は、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン性相互作用、および／
または共有結合的相互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、また
はプロドラッグと会合され得る。
【０６９２】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（例えば、ＭＰＩＦポリペプチドまたは抗ＭＰＩＦ抗体）
を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方法を
提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達
するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、
アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組
み込み得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を
、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０６９３】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに会合
した本発明のポリペプチド（例えば、ＭＰＩＦポリペプチドまたは抗ＭＰＩＦ抗
体）を投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のた
めの方法を提供する。
【０６９４】 例えば、放射性同位元素に結合体化されたＭＰＩＦが投与されて、白血病細胞
を破壊し得、従って、白血病を処置する。
【０６９５】 特定の実施形態では、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合し
たＭＰＩＦポリペプチドを投与することによって、Ｔ細胞系列またはＢ細胞系列
の細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞に関連した白血病またはリンパ腫）を特異
的に破壊するための方法を提供する。
【０６９６】 別の特定の実施形態では、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会
合した抗ＭＰＩＦ抗体を投与することによって、単球系列の細胞（例えば、単球
性白血病またはリンパ腫）を特異的に破壊するための方法を提供する。
【０６９７】 別の実施形態では、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合した
本発明のポリペプチド（例えば、ＭＰＩＦポリペプチドまたは抗ＭＰＩＦ抗体）
を投与することによって、細胞を特異的に破壊する（例えば、炎症の細胞性メデ
ィエイタの破壊）ための方法を提供する。炎症の細胞性メディエイタとしては、
例えば、Ｔ細胞、単球、樹状細胞、星状細胞、腎臓の血管間膜細胞、マクロファ
ージ、好中球および移植片拒絶（急性または慢性）に関与する細胞が挙げられる
。
【０６９８】 別の実施形態では、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合した非ＭＰＩＦ
分子を、ＭＰＩＦ−１と組み合わせて投与する。その結果、ＭＰＩＦ−１は、正
常な細胞、組織または器官の損傷を予防もしくは処置するか、または、骨髄前駆
細胞を保護する。
【０６９９】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（
ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、他の細胞傷害性
（ｃｙｔｏｘｉｃ）因子または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしく
は細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する
化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のま
たは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗
体（またはその補体固定含有部分））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ
、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ
、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇ
ｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ
）およびコレラ毒素。「毒素」はまた、細胞傷害性因子、細胞増殖抑制因子もし
くは細胞殺傷性因子、治療薬または放射性金属イオン（例えば、α−エミッター
（例えば、213Ｂｉなど））もしくは他の放射性同位体（例えば、103Ｐｄ、133
Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85Ｓｒ、32Ｐ、35Ｓ、90Ｙ、153Ｓｍ、 153 Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓｅ、113Ｓｎ、90イットリウム、117ス
ズ、186レニウム、166ホルミウム、および188レニウム）；発光標識（例えば、
ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、
ならびにビオチンを含む。
【０７００】 当該分野において公知の技術が、本発明の抗体を標識化するために適用され得
る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，
７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同
第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５
号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，
６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第
５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書中に参考と
してその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定されない。細胞毒または
細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリ
タキソール（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭
化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏ
ｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシ
ン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ
ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アク
チノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイ
ン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、
ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質
（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタ
ラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロ
レタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、
クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（
ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブス
ルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、な
らびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アン
トラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキ
ソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン
）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａ
ｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよ
びビンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０７０１】 「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞
傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って
使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化
剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シ
トシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセ
トアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０２】 本発明のさらに好ましい実施形態としては、以下に続く適用におけるＭＰＩＦ
ポリペプチド、ＭＰＩＦポリヌクレオチド、およびそれらの機能的アゴニストの
使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０３】 特定の実施形態では、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複数）もし
くはポリヌクレオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト（単数ま
たは複数）もしくはアンタゴニスト（単数または複数）（例えば、抗ＭＰＩＦ抗
体）を投与して、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、白血病、組織球性白血
病（ｈｙｓｔｉｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、単球性白血病（例えば、急
性単球性白血病）、白血病性細網症、シリング型単球性白血病（Ｓｈｉｌｌｉｎ
ｇ Ｔｙｐｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、および／または単球
および／または単球性の細胞および／または組織由来の他の白血病を、処置、予
防、検出、および／または診断する。
【０７０４】 従って、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複数）もしくはポリヌク
レオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト（単数または複数）も
しくはアンタゴニスト（単数または複数）（例えば、抗ＭＰＩＦ抗体）を投与し
て、以下のような白血病を処置、予防、検出および／または診断する：急性リン
パ芽球性（リンパ球性）白血病（ＡＬＬ）（これは、未分化Ｂ細胞形態、一般的
なＢ細胞形態、前Ｂ細胞形態（ｐｒｅ−Ｂ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍ）、およびＢ細
胞形態を含み得る）；急性骨髄性（骨髄性または骨髄球性）白血病（ＡＭＬ）（
これは、未分化骨髄芽球性形態、分化した骨髄芽球性形態、前骨髄球形態（ＡＰ
Ｌ）、骨髄単芽球性（ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｂｌａｓｔｉｃ）形態、単芽球性形態
、赤白血病性形態、および巨核芽球性形態を含み得る）；慢性リンパ性（リンパ
）白血病（ＣＬＬ）（これは、Ｂ細胞形態、Ｔ細胞形態、前リンパ性形態、セザ
リー症候群（皮膚Ｔ細胞リンパ腫の白血病相（ｐｈａｓｅ）、ヘアリーセル形態
、およびリンパ腫白血病（すなわち、悪性リンパ腫の進行した段階で見られる白
血病変化）を含み得る）；および慢性骨髄球性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、骨
髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）または顆粒球性）白血病（ＣＭＬ）など。ここ
で、新生物性クローンは、赤血球、巨核球、単球、Ｔ細胞、またはＢ細胞である
。
【０７０５】 別の特定の実施形態では、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複数）
もしくはポリヌクレオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト（単
数または複数）もしくはアンタゴニスト（単数または複数）を投与して、例えば
、結核で見られるような、単球性類白血病反応を処置、予防、診断、および／ま
たは改善する。
【０７０６】 別の特定の実施形態では、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複数）
もしくはポリヌクレオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト（単
数または複数）もしくはアンタゴニスト（単数または複数）を投与して単球増加
症（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単球減少症（ｍｏｎｏ
ｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ）、単球減少症（ｍｏｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉ
ａ）、および／または単球増加症（ｍｏｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）を処置、予防、診
断、および／または改善する。
【０７０７】 別の特定の実施形態では、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複数）
もしくはポリヌクレオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト（単
数または複数）もしくはアンタゴニスト（単数または複数）を投与して対宿主性
移植片病または移植拒絶を処置、予防、診断、および／または改善する。
【０７０８】 別の特定の実施形態では、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複数）
もしくはポリヌクレオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト（単
数または複数）もしくはアンタゴニスト（単数または複数）を投与して貧血を処
置、予防、診断、および／または改善する。
【０７０９】 別の特定の実施形態では、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複数）
もしくはポリヌクレオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト（単
数または複数）もしくはアンタゴニスト（単数または複数）を投与して、Ｂ細胞
悪性疾患（例えば、ＡＬＬ）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ急
性白血病、プラスマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、およびＥＢＶ
−癌化疾患（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）を処置、予防、診断、
および／または改善する。
【０７１０】 別の特定の実施形態では、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複数）
もしくはポリヌクレオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト（単
数または複数）もしくはアンタゴニスト（単数または複数）を使用して、線維組
織形成および線維組織形成に関連した状態（例えば、肺線維症、嚢胞性線維症（
膵嚢胞性線維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵線維嚢胞症、ムコビシ
ドーシス、および粘液過剰症のような線維組織形成を含む）、心内膜心筋線維症
、特発性腹膜後線維症、軟膜線維症、縦隔線維症、結節性表皮下線維組織増殖症
、中心静脈周囲線維化、筋周囲線維化、パイプ軸線維症、置換性線維形成、外膜
下線維症、およびシンマーズ陶製パイプ柄状線維症など。しかし、これらに限定
されない）を処置、予防、および／または診断する。
【０７１１】 非常に好ましい実施形態では、本発明のＭＰＩＦポリペプチド（単数または複
数）もしくはポリヌクレオチド（単数または複数）、またはそれらのアゴニスト
（単数または複数）もしくはアンタゴニスト（単数または複数）を使用して、特
に化学療法または放射線療法に付随するような、粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）
を処置、予防、および／または診断する。
【０７１２】 本発明のＭＰＩＦポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはそれ
らのアゴニストおよび／またはアンタゴニストをまた使用して、器官拒絶もしく
は対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）および／またはそれに付随する状態を処置、予
防、および／または診断し得る。器官拒絶は、免疫応答を通した、移植組織の宿
主免疫細胞破壊によって生じる。同様に、免疫応答はまた、ＧＶＨＤにも関与す
るが、この場合には、外来の移植された免疫細胞が、宿主組織を破壊する。免疫
応答、特にＴ細胞、単球または他の炎症のメディエイタの増殖、分化、または走
化性を阻害する、本発明のＭＰＩＦポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、お
よび／またはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの投与は、器官
拒絶またはＧＶＨＤを予防するにおいて有効な治療であり得る。さらに、マウス
において、ＭＰＩＦ−１を結合するＣＣＲ１レセプターの欠失は、同種移植片の
生存延長を生じさせることが示された（Ｇａｏら，「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＣＲ１ ｓｕｐｐｒｅｓ
ｓｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ
ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ」，Ｊ Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００年１月；１０５（１）：３５−４４）。従って、例え
ば、ＭＰＩＦ−１アンタゴニストを介して、そのＣＣＲ１レセプターとのＭＰＩ
Ｆ−１または他のＣＣＲ１リガンドの相互作用をブロックすることは、急性およ
び慢性の移植片拒絶を予防するために有用である。
【０７１３】 同様に、本発明のＭＰＩＦポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／
またはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストをまた使用して、炎症
を調節し得る。例えば、本発明のＭＰＩＦポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド、および／またはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、炎症
応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子を使用して、
炎症状態、慢性および急性の状態（慢性前立腺症、肉芽腫性前立腺症、およびマ
ラコプラキア、感染に付随する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、また
は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））、虚血−再灌流障害、エンドトキシン致
死性（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）、関節炎、補体媒介性超急性
拒絶（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｙｐｅｒａｃｕｔｅ ｒｅ
ｊｅｃｔｉｏｎ）、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン誘導性肺損傷、炎症
性腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）
の過剰産生の結果）を含む）の両方を処置、予防、および／または診断する。
【０７１４】 特定の実施形態では、本発明の抗ＭＰＩＦ抗体を使用して、炎症を処置、予防
、調節、検出、および／または診断する。
【０７１５】 特定の実施形態では、本発明の抗ＭＰＩＦ抗体を使用して、炎症性障害を処置
、予防、調節、検出、および／または診断する。
【０７１６】 好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）
，ＣＤ４０Ｌの可溶性形態（例えば、ＡＶＲＥＮＤTM），ＣＤ４０Ｌの生物学的
に活性なフラグメント、改変体または誘導体，抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、アゴ
ニスト性またはアンタゴニスト性の抗体），および／または抗ＣＤ４０抗体（例
えば、アゴニスト性またはアンタゴニスト性の抗体）と組み合わせて投与される
。
【０７１７】 当該分野で認識されるように、抗体を参照して上記および本明細書中に記載さ
れた結合体およびキレートは等しく、ＭＰＩＦポリペプチドの結合体およびキレ
ートに当てはまる。
【０７１８】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体
は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本
発明の遺伝子の翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には
、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示的に発現される細
胞マーカーとして有用であり得る。特定のエピトープ、またはエピトープの組み
合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを発現する細胞集団
のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団を
スクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用され得、そしてそ
の技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マト
リクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パンニング」、ならび
にフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭ
ｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）
が挙げられる。
【０７１９】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可
能にする。
【０７２０】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の
任意の方法により、免疫特異的結合についてアッセイされ得る。用いられ得るイ
ムノアッセイとしては、いくつかのものについてだけ名称を挙げると、ウエスタ
ンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）
、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈
降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量ア
ッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイのような技術を用い
る競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されな
い。このようなアッセイは慣用的であり、そして当該分野において周知である（
例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，
１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的なイムノアッセイが、以下に簡潔に記載され
る（が、これらは限定を目的とすることが意図されない）。
【０７２１】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプ
ロテアーゼのインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナ
ジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％
Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、目的
の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でイ
ンキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／またはプロテ
インＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でイ
ンキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およびＳＤＳ／
サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体の、特定の
抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により、アッセイ
され得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そしてバックグラ
ウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファロースビー
ズを用いて細胞溶解物を予め清澄化する工程）に関して、精通している。免疫沈
降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，
１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０７２２】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に転写する工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱
脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中
で希釈された一次抗体（目的の抗体）と、その膜を接触させ／プロービングし／
インキュベートする工程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング
緩衝液中で希釈された酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼ）あるいは放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）
に結合した二次抗体（一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）と、その膜を
接触させ／プロービングし／インキュベートする工程、洗浄緩衝液中でその膜を
洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含する。当業者は、
検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウンドノイズを減少
させるように改変され得るパラメータに関して、精通している。ウエスタンブロ
ットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編
，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０７２３】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能
な化合物に結合した二次抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され得
る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーテ
ィングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コーテ
ィングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る（すなわち、
サンドイッチＥＬＩＳＡ）。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように
改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリ
エーションに関して精通している。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については
、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０７２４】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、漸増量の
非標識抗原の存在下での、標識抗原（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）と目的の抗体と
のインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む。特定の抗
原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプ
ロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はまた、ラジオ
イムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の非標識の第
二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）に結合した目的の
抗体とともにインキュベートされる。
【０７２５】 （治療剤−抗体） 本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、
１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好まし
くは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工
程を包含する。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載
されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに
本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナロ
グおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸が挙げ
られるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異
常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記
載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されな
い）を処置、阻害または予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの
異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／
または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を
含むが、これに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、また
は本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る
。
【０７２６】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法をまとめると、身体内で局所的にま
たは全身的に、あるいは抗体の直接的細胞傷害性（例えば、補体による媒介（Ｃ
ＤＣ）、またはエフェクター細胞による媒介（ＡＤＣＣ））により、本発明のポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプロー
チのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教示を
与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリングの目
的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法を理解する。
【０７２７】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０７２８】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０７２９】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメ
ント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメン
ト、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性
としては、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、
１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、
１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ
、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１
０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０- 15 Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０７３０】 （抗体遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０７３１】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０７３２】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０７３３】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それにより抗体をコードする核酸
の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９
）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）
）。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいは
この核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはその
フラグメントを含む。
【０７３４】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０７３５】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の
多数の方法などのいずれかにより（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの
一部として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例え
ば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国
特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、
裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺
伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質もし
くは細胞表面のレセプターでコーティングするか、または薬剤をトランスフェク
トすることにより、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプ
セル化により、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結
合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリ
ガンドとそれを結合させて投与することなどにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこ
と）（レセプターを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする
。さらに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすること
により、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；
同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２
０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相
同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅ
ｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ
３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０７３６】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にす
る。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏ
ｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、造血性幹細胞を化
学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を幹細胞に送達するため
の、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療に
おけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である。
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
【０７３７】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利
点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ
ｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９
９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示す。
Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４
）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクター
の使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９
９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実
施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０７３８】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用について提案
されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２
０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０７３９】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を含む。通常、移入の方
法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子
を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。それら
の細胞は次いで、患者に送達される。
【０７４０】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない
：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染
、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒
介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入につい
ては、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒお
よびＢｅｈｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３
）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９
９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８
５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機
能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞
への安定した移入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可
能であり、そして好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現
可能である。
【０７４１】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。
【０７４２】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種
々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨
髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０７４３】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０７４４】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与さ
れる。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビト
ロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および／または
前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、Ｐ
ＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，
Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ
．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏ
ｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９
８６）を参照のこと）。
【０７４５】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域
に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は
、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能である
。
【０７４６】 （治療活性または予防活性の実証） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の治療有用性または予防有用性を実証す
るためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する
化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物
または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび
細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得
る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するために
用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げ
られ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして化
合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに
対するそのような化合物の効果が観察される。
【０７４７】 （治療的／予防的な投与および組成物−抗体） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、
ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限
定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましく
はヒトである。
【０７４８】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方物および投
与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方物および投与経路は、本明細書
中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０７４９】 種々の送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中でのカプセル化、この
化合物の発現が可能な組み換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例え
ば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（
１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての
核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻
腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物ま
たは組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射に
より、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および鞘内注射を包
含する；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０７５０】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料である）によ
り達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、
タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない
。
【０７５１】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０７５２】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された放出系にお
いて送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
系は、治療標的、即ち、脳に近接して配置され得、それにより、全身用量の一部
のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０７５３】 他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０７５４】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、特定の実施形態におい
て、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてこ
のベクターが細胞内になるようにこのベクターを投与することにより（例えば、
レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照
のこと）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺
伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしく
は細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることによ
り、または核に進入することが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させ
てこのベクターを投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照の
こと）などにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビ
ボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のた
めに相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０７５５】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用のために、連邦規制当局もしくは州政府により承認されたか、または米国
薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語
「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤
、またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアは、水および油（石油起源
、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、
鉱油、ごま油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的組
成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、
ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶
液に対して、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、
デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦
粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセ
ロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥した脱脂乳、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望される場合
、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物
は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物など
の形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのような
キャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマン
ニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナト
リウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的なキャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供す
る。処方物は、投与の様式に適するべきである。
【０７５６】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単位投薬形態と一緒に混
合されてのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（
ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような気密容器中の乾燥した凍結粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０７５７】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩の
ようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩のような
カチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０７５８】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、抑制および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイを使用して、必
要に応じて、最適な投薬量の範囲を同定するのを補助し得る。処方物において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである
。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線か
ら外挿され得る。
【０７５９】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体のより低い投薬量および頻度のより少ない投与は、
しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変
（例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）など）による抗体の取り込みおよび
組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０７６０】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０７６１】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診
断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出に
ついて提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を
使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする
工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較
する工程であって、これによってその標準的な発現レベルと比較されるアッセイ
されたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す、
工程を包含する。
【０７６２】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程であって、これに
よって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝
子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す、工程を包含する。癌に関
して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生
についての素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出する
ための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家が予防手段
を使用すること、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発
生またはさらなる進行を予防する。
【０７６３】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ
）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）
、およびテクネチウム（99Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノール）；ならび
に蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが
挙げられる。
【０７６４】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現される被験体
内の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および
結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投
与後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；なら
びにｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程であって、その結果、このバ
ックグラウンドレベルを超える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペ
プチドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す、工程
を包含する。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標
準的な値と、検出された標識化分子の量とを比較する工程を包含する種々の方法
により決定され得る。
【０７６５】 被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体
部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍ
Ｔｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗
体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。
インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒ
ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉ
ｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓ
ｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０７６６】 用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して
、標識分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして非結合性の標識分子がバッ
クグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与後の時間間隔は、６
〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態におい
ては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０７６７】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、疾患または障
害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の
診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。
【０７６８】 標識分子の存在は、当該分野において公知のインビボ走査の方法を用いて、患
者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存する。当業者
は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法に
おいて用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされないが、コンピュ
ーター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）
のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられる。
【０７６９】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線反応性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光反応性の走査機器を用いて患者において検出される。
別の実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射
出断層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）において検出される。さらに別の実
施形態においては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（Ｍ
ＲＩ）を用いて患者から検出される。
【０７７０】 （抗体および他のキット） 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器に入った本発明の抗体（好ましくは精製
された抗体）を含む。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体に対して特異的に免疫反応性のエピトープを含む、実質的に単
離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに含む。別の特定の実施形態におい
ては、本発明のキットは、抗体の目的のポリペプチドとの結合を検出するための
手段（例えば、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物
または発光化合物）と結合し得る抗体、または検出可能な基質と結合し得る第一
の抗体を認識する第二の抗体）を含む。
【０７７１】 別の特定の本発明の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を含み得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体に対して特異的に免疫反応性のエ
ピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含み得る。さらに、こ
のようなキットは、この抗体の抗原への結合を検出するための手段（例えば、フ
ローサイトメトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのよ
うな蛍光化合物と結合し得る抗体）を含む。特定の実施形態においては、このキ
ットは、組み換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポ
リペプチド抗原を含み得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体
に付着され得る。
【０７７２】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を含み得る。この実施形態においては、抗体のポリペプチド
抗原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。
【０７７３】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫活性な、実質的に単
離された抗体、およびポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗体との結合
を検出する手段を含む。１つの実施形態においては、抗体は、固体支持体に付着
される。特定の実施形態においては、その抗体は、モノクロナール抗体であり得
る。このキットの検出手段は、第二の標識モノクロナール抗体を含み得る。ある
いは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競合抗原を含み得る。
【０７７４】 １つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面
結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ
、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合す
る抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試
薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗
体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が
決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または
比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をイン
キュベートすることにより検出される酵素である。
【０７７５】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着さ
せるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に
、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な
基（例えば、活性なカルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）と
のタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的
には、遊離アミノ基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンで
コートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０７７６】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組み換え抗原を有する支持体、
および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒ
ト抗体を含む。
【０７７７】 以下の実施例の理解を容易にするために、特定の頻繁に存在する方法および／
または用語が記載される。
【０７７８】 「プラスミド」は、先行する小文字のｐ、ならびに／または続く大文字および
／もしくは数字によって示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販される
か非限定的な基準に基づいて公に入手可能か、または公開された手順に従って入
手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、これらに記
載されるプラスミドと等価なプラスミドが、当該分野で公知であり、そして当業
者に明らかである。
【０７７９】 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ内の特定の配列でのみ作用する制限酵素でのＤＮ
Ａの触媒的切断をいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素が市販され、そ
してそれらの反応条件、補因子、および他の必要物は、当業者に公知のように使
用された。分析目的には、代表的に、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメ
ントが、約２０μｇの緩衝液溶液中の約２単位の酵素とともに使用される。プラ
スミド構築物からＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的には、５〜５
０μｇのＤＮＡが、より大きな容量中で２０〜２５０単位の酵素で消化される。
特定の制限酵素についての適切な緩衝液および基質量は、製造者によって特定さ
れている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、供
給者の使用説明書に従って変化し得る。消化後、反応物を直接ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動し、所望のフラグメントを単離する。
【０７８０】 切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７（１９８０）に記載の８％ポリアクリル
アミドゲルを用いて実施される。
【０７８１】 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成され得る一本鎖ポリデオキシヌクレ
オチドまたは２つの相補的ポリデオキシヌクレオチドのいずれかをいう。このよ
うな合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下
でＡＴＰとともにリン酸を付加することなくして別のオリゴヌクレオチドに連結
されない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントと
連結する。
【０７８２】 「連結」は、２本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、前出、１４６頁）。他に提供されない限
り、連結は、既知の緩衝液および連結されるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モ
ル量の０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を有
する条件を用いて達成され得る。
【０７８３】 他に記述されない限り、形質転換は、Ｇｒａｈａｍ，ＦおよびＶａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ，Ａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に
記載のように実施された。
【０７８４】 ここで本発明を一般的に記載したが、本発明の例示のために提供され、そして
本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって同じこ
とがより容易に理解される。
【０７８５】 （実施例１） （ＭＰＩＦ−１の細菌発現および精製） ＭＰＩＦ−１、ＡＴＣＣ＃７５６７６をコードするＤＮＡ配列をまず、５’に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、およびプロセス後のＭＰＩＦ−
１タンパク質（これからシグナルペプチド配列を除去したもの）、ならびにＭＰ
ＩＦ−１遺伝子の３’側のベクター配列を用いて増幅する。Ｂａｍ ＨＩおよび
Ｘｂａ Ｉに対応する追加的なヌクレオチドを５’側配列および３’側配列にそ
れぞれ追加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’−ＴＣＡＧＧ
ＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ−３’（配列番号８）を有してお
り、この配列は、Ｂａｍ ＨＩ制限酵素部位の後に、プロセスされたタンパク質
コドンの推定末端アミノ酸から始まるＭＰＩＦ−１コード配列の１８個のヌクレ
オチドを含む。３’側配列５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧ
ＣＣＡＧＴ−３’（配列番号９）は、Ｘｂａ Ｉ部位に対する相補配列を含んで
いる。
【０７８６】 制限酵素部位は細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．Ｃｈａ
ｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質
耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−調節可能プロモータ
ーオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグお
よび制限酵素部位をコードする。次いでｐＱＥ−９をＢａｍ ＨＩおよびＸｂａ
Ｉで消化する。増幅した配列をｐＱＥ−９に連結し、ヒスチジンタグおよびＲ
ＢＳをコードする配列をインフレームで挿入する。次いで連結混合物を用いて、
Ｑｉａｇｅｎから入手可能であるＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を形質転換す
る。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、ｌａｃＩリプレッサーを発現し且つカナマイシン耐性
（Ｋａｎr）を付与する、プラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含んでいる。
形質転換体をＬＢプレート上で増殖できる能力によって同定し、アンピシリン／
カナマイシン耐性のコロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、Ａｍｐ（
１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補ったＬＢ培地中
における液体培養中で、一晩（Ｏ／Ｎ）の制限分析によって確認する。（Ｏ／Ｎ
）培養物を用いて、大培養物を１：１００から１：２５０の比で接種する。細胞
を、０．４から０．６の間の吸光度６００（Ｏ．Ｄ．600）まで増殖させる。次
いで、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド」）を添加する。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活
性化することによって誘導し、Ｐ／Ｏを鮮明にする（ｃｌｅａｒ）ことにより遺
伝子発現を増大する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで細胞を遠心分
離で収穫する。細胞ペレットを、カオトロピズム（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤で
ある６ＭグアニジンＨＣｌに可溶化する。清澄の後、６−Ｈｉｓタグを含有する
タンパク質の緊密な結合を可能にする条件下におけるニッケル−キレートカラム
のクロマトグラフィーにより、この溶液から、可溶化されたＭＰＩＦ−１を精製
する。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：
１７７−１８４（１９８４）。ＭＰＩＦ−１（９５％純度）を６ＭグアニジンＨ
Ｃｌ ｐＨ５．０中においてカラムから溶出させ、再生のために、３Ｍグアニジ
ンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元）および
２ｍＭグルタチオン（酸化）に調節する。この溶液中での１２時間のインキュベ
ーション後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透析する。
【０７８７】 あるいは、以下の非タグ化プライマーを用いて、遺伝子をプラスミドｐＱＥ７
０にクローニングした。
【０７８８】
【化６】 （Ｅ．ｃｏｌｉに対して最適化されたＭＰＩＦ−１の構築） Ｅ．ｃｏｌｉ発現系におけるＭＰＩＦ−１の発現レベルを増大するため、よく
用いられるＥ．ｃｏｌｉコドンに対して遺伝子のコドンを最適化した。ＭＰＩＦ
−１の最適化領域の合成のため、４個の一連のオリゴヌクレオチド、ｍｐｉｆ−
ｌオリゴ番号１〜４（後述）を作成した。これらの重複するオリゴを、以下の条
件での７回のＰＣＲ反応において用いた：
【０７８９】
【化７】 ７回の合成の後、この領域に対する５’プライマー（ＡＣＡ ＴＧＣ ＡＴＧ Ｃ ＧＵ ＧＵＵ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＣＵ ＧＡＡ ＡＣＣ ＧＡＡ
ＵＵＣ ＡＵＧ ＡＵＧ ＵＣＣ（配列番号１２）（ＧＣ ＡＴＧ Ｃ：は下
線表示））およびこの領域全体に対する３’プライマー（ＧＣＣ ＣＡＡ ＧＣ
Ｔ ＴＴＣ ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＴＧＡ ＴＡＣ ＧＧ
Ｇ（配列番号１３））を、６個のオリゴヌクレオチドの最初の反応からの１マイ
クロリットルを含むＰＣＲ反応物に加えた。この生成物を以下の条件を用いて３
０回増幅した：
【０７９０】
【化８】 この最後の反応で生成された生成物を、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによっ
て制限し、同様にＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断されたｐＱＥ７０
にクローニングした。これらのクローンを発現させ、上述の変異がない、より優
れた発現レベルを有することを見いだした。
【０７９１】 ｍｐｉｆオリゴ番号１：
【０７９２】
【化９】 （配列番号１４）。
【０７９３】 ｍｐｉｆ−１オリゴ番号２：
【０７９４】
【化１０】 （配列番号１５）。
【０７９５】 ｍｐｉｆ−１オリゴ番号３：
【０７９６】
【化１１】 （配列番号１６）。
【０７９７】 ｍｐｉｆ−１オリゴ番号４：
【０７９８】
【化１２】 （配列番号１７）。
【０７９９】 （ＭＰＩＦ−１欠失変異体の構築） 上述のＥ．ｃｏｌｉ最適化ＭＰＩＦ−１構築物を用いて、ＭＰＩＦ−１遺伝子
の５’末端から欠失変異体を構築した。５’欠失物を構築するために用いたプラ
イマーは後述する。Ｅ．ｃｏｌｉ最適化ＭＰＩＦ−１構築物について上述したの
と同様にＰＣＲ増幅を行った。Ｄｅｌｔａ１７−Ａ ｑｅ６、Ｄｅｌｔａ２３、
Ｄｅｌｔａ２８についての生成物を、５’部位に対してはＮｃｏＩで制限し、３
’部位に対してはＨｉｎｄＩＩＩで制限し、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによ
って消化されたプラスミドｐＱＥ６０にクローニングした。その他の全ての生成
物は、５’部位に対してはＳｐｈＩで制限し、３’部位に対してはＨｉｎｄＩＩ
Ｉで制限し、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたプラスミドｐＱ
Ｅ７０にクローニングした。
【０８００】 用いた５’プライマーは以下の通りである： Ｄｅｌｔａ １７−Ａ ｑｅ６ （ｐＱＥ６０）
【０８０１】
【化１３】 （配列番号１８）。
【０８０２】 この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
【０８０３】
【化１４】 （配列番号１９）。
【０８０４】 Ｄｅｌｔａ １６−Ａ ｑｅ７ （ｐＱＥ７０）
【０８０５】
【化１５】 （配列番号２０）。
【０８０６】 この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
【０８０７】
【化１６】 (配列番号２１）。
【０８０８】 Ｄｅｌｔａ ２３ （ｐＱＥ６０）
【０８０９】
【化１７】 （配列番号２２） この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
【０８１０】
【化１８】 （配列番号２３）。
【０８１１】 Ｄｅｌｔａ ２４ （ｐＱＥ７０）
【０８１２】
【化１９】 (配列番号２４）。
【０８１３】 この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
【０８１４】
【化２０】 （配列番号４）。
【０８１５】 Ｄｅｌｔａ ２８ （ｐＱＥ６０）
【０８１６】
【化２１】 （配列番号２５）。
【０８１７】 この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
【０８１８】
【化２２】 （配列番号２６）。
【０８１９】 Ｓ７０ から Ａ変異体（７０位のＳｅｒをＡｌａに変異した）（ｐＱＥ７０
） アンチセンス ｔｔｃ ｇａａ ｇｔａ ｇｇｃ ｔｔｃ ｃａｇ ｃａｇ（配
列番号２７） センス ｃｔｇ ｃｔｇ ｇａａ ｇｃｃ ｔａｃ ｔｔｃ ｇａａ（配列番号
２８）。
【０８２０】 ５’ＳｐｈＩフル
【０８２１】
【化２３】 （配列番号２９）。
【０８２２】 この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
【０８２３】
【化２４】 （配列番号３０）。
【０８２４】 全ての構築物に用いた３’プライマー： ３’Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
【０８２５】
【化２５】 （配列番号３１）。
【０８２６】 Ｅ．ｃｏｌｉ発現のための「成熟」ＭＰＩＦ−１（図１９における変異体−１
）
【０８２７】
【化２６】 （配列番号３）。
【０８２８】 （実施例２） 哺乳類細胞中のＭＰＩＦ−１遺伝子配列の一過性発現に用いられるベクターの
ほとんどは、ＳＶ４０複製起点を有するべきである。これにより、ウイルスＤＮ
Ａ合成の開始に必要なＴ抗原を発現する細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）中で複写数
の多いベクターの複製が可能となる。この目的のためには他のいかなる哺乳類細
胞株でも利用し得る。
【０８２９】 典型的な哺乳類発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモータ
要素、タンパク質コード配列、および転写物の転写の終了およびポリアデニル化
に必要なシグナルを含む。さらに含まれる要素としては、エンハンサー、Ｋｏｚ
ａｋ配列、およびＲＮＡスライシングのためにドナー部位とアクセプター部位と
に挟まれた介在配列がある。ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、レト
ロウイルス、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長末端反復（ＬＴＲ）
、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターにより、効率性の
高い転写が実現され得る。しかし、細胞性シグナルもまた用いられ得る（例えば
、ヒトアクチンプロモーター）。本発明を実行する場合に使用される適切な発現
ベクターは、例えば、ｓＰＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓ
ａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶ ｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ
２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７
１０９）のようなベクターが含まれる。使用され得る哺乳類宿主細胞としては、
ヒトＨｅＬａ、２８３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｒｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３お
よびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １、Ｃｏｓ ７およびＣＶ１、アフリカミドリザル
細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター
卵巣細胞が挙げられる。
【０８３０】 あるいは、遺伝子は、染色体に組込まれたその遺伝子を含む安定細胞株中で発
現され得る。ｄｈｆｔ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択
可能マーカーとの同時トランスフェクションにより、トランスフェクトされた細
胞の同定および単離が可能となる。
【０８３１】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、多量のコード化タンパク質を発現する
ように増幅され得る。目的の遺伝子の数百個または数千個もの複写を有する細胞
株を発現するためには、ＤＨＦＲ（ジヒドロフォレート還元酵素）が有用なマー
カーである。別の有用な選択マーカーとしては、酵素グルタミンシンターゼ（Ｇ
Ｓ）がある（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（
１９９１）：Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：
１６９−１７５（１９９２））。このようなマーカーを用いて、選択培地内で哺
乳類細胞を成長させ、最も高い耐性を有する細胞が選択される。これらの細胞株
は、染色体に組込まれた増幅遺伝子を含む。タンパク質の産生にはチャイニーズ
ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が用いられることが多い。
【０８３２】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力プロモーター
（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（Ｍａｒｃｈ、１９８５））、およびＣＭＶ
エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５
３０（１９８５））を含む。マルチクローニング部位は、例えば、制限酵素切断
部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８と共に、目的の遺伝子のクローニ
ングを容易にする。ベクターはさらに、３’イントロン、ラットプレプロインス
リン遺伝子のポリアデニル化および末端シグナルを含む。
【０８３３】 （Ａ．ＣＯＳ細胞中の組換えＭＰＩＦ−１の発現） プラスミドＣＭＶ−ＭＰＩＦ−１ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製起点、２
）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ＣＭＶプロモータ
ー、続いてポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部位
を含むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロゲン）に由来する。ＭＰＩＦ
−１前駆体全体およびその３’末端にインフレームで融合されるＨＡタグをコー
ドするＤＮＡフラグメントが、ベクターのポリリンカー領域にクローン化される
。従って、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下で行われる。ＨＡ
タグは、上述のようにインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトー
プに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９９１））
。ＨＡタグのターゲットタンパク質への侵入により、ＨＡエピトープを認識する
抗体による組換えタンパク質の検出が容易となる。
【０８３４】 プラスミドの構築ストラテジーについて以下に述べる。
【０８３５】 ＭＰＩＦ−１をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７６は、以下の２つ
のプライマーを用いてクローンされるオリジナルＥＳＴ上のＰＣＲによって構築
される。すなわち、５’プライマー、５’−ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧ
ＴＣＴＣＣＧＴＧＧＣＴ−３’（配列番号３２）、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびこ
れに続く開始コドンから始まる１８個のヌクレオチドのＭＰＩＦ−１コード配列
を含む。および３’配列、５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣ
ＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＴ
ＣＣ−３’（配列番号３３）、ＸｂａＩ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、およ
びＭＰＩＦ−１コード配列の最後の２０個のヌクレオチド（停止コドンは含まな
い）の相補配列を含む。従って、ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＰＩＦ
−１コード配列、これに続くインフレームで融合されるＨＡタグ、ＨＡタグの次
の翻訳終了停止コドン、およびＸｂａＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメ
ントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制
限酵素により消化され連結される。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔ
ｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３
７から入手可能）に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地プレ
ートで培養して、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から
単離し、制限分析によって正しいフラグメントが存在するかどうかを調べる。組
換えＭＰＩＦ−１の発現では、ＣＯＳ細胞がＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））によって発
現ベクターによりトランスフェクトされる。ＭＰＩＦ−１−ＨＡタンパク質の発
現は、放射標識および免疫沈降法（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８））によっ
て検出される。細胞を、トランスフェクションの２日後35Ｓ−システインにより
８時間標識化する。次に培養培地を回収して、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝
液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．１％のＳＤＳ、１％のＮＰ
−４０、０．５％のＤＯＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）（Ｗｉｌｓｏｎ
，Ｉら、上記、３７：７６７（１９８４））により溶解させる。細胞溶解物およ
び培養培地の両方が、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体により沈降する。沈降
したタンパク質を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析する。
【０８３６】 （Ｂ．ＣＨＯ細胞中のクローニングおよび発現） ＭＰＩＦ−１タンパク質の発現にはベクターｐＣ１が用いられる。プラスミド
ｐＣ１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ登録番号３７１４６）の誘
導体である。両方のプラスミドが、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でマウス
ＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドによりトランスフェクトされる、ジ
ヒドロフォレート活性の無いチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞が
、化学療法剤メトトレキサートが補充された選択培地（アルファマイナスＭＥＭ
、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を成長させることによって選
択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞中のＤＨＦＲ遺伝子
の増幅については十分に記述されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌ
ｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．
、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０：Ｈａｍｌ
ｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３：Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙ
ｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻：６
４−６８参照）。高濃度のＭＴＸ中で成長させた細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅
の結果としてターゲット酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬剤への耐性
を生じさせる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子にリンクされる場合は、第２の遺
伝子は通常は共増幅されて過剰発現する。最先端技術では、１，０００個を超え
る数の遺伝子複写を有する細胞株が生成される。続いて、メトトレキサートを除
去すると、細胞株は染色体に組込まれた増幅遺伝子を含む。
【０８３７】 プラスミドｐＣ１は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復（ＬＴＲ）の強力プロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｒｃｈ １９８５：４３８
−４４７０）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の直接初期遺伝子の
エンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１
：５２１−５３０、１９８５）を含む。プロモーターの下流側は、続いて、遺伝
子の統合を可能にする単一制限酵素開裂部位ＢａｍＨＩであり、この後、３’イ
ントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位が続く。
発現には他の効率性の高いプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーター
、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、または他のレトロウイルス、例えばＨ
ＩＶおよびＨＴＬＶＩからの長末端反復が用いられ得る。ｍＲＮＡのポリアデニ
ル化には、例えばヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子からの他のシグナルも
同様に用いられ得る。
【０８３８】 染色体に組込まれた目的の遺伝子を有する安定細胞株はまた、ｇｐｔ、Ｇ４１
８またはハイグロマイシンのような選択マーカーと同時トランスフェクトされる
と選択され得る。最初に１つより多い選択マーカーを、例えばＧ４１８にメトト
レキサートをプラスして用いると有利である。
【０８３９】 プラスミドｐＣ１は、制限酵素ＢａｍＨＩにより消化され、次に当該分野では
既知の手順によって、子牛腸ホスフェートを用いて脱ホスホリル化する。次にベ
クターを１％アガロースゲルから単離する。
【０８４０】 ＭＰＩＦ−１、ＡＴＣＣ番号７５６７６をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子の
５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増
幅される。
【０８４１】 ５’プライマーは、配列：
【０８４２】
【化２７】 （配列番号３４）を有し、これは、下線のＢａｍＨＩ制限酵素部位および図１の
ＭＰＩＦ−１タンパク質をコードする配列（配列番号１）の一部を含む。後述す
るように、発現ベクターに挿入されると、ヒトＭＰＩＦ−１をコードする増幅フ
ラグメントの５’末端は効率的なシグナルペプチドを提供する。Ｋｏｚａｋ，
Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）に記載され
ているように、真核生物細胞内での翻訳開始のための効率的なシグナルは、構築
物のベクター部内に適切に位置している。
【０８４３】 ３’プライマーは配列：
【０８４４】
【化２８】 （配列番号３５）を有し、これは、Ａｓｐ７１８制限部位、および、停止コドン
を含む、図１に示されているＭＰＩＦ−１コード配列（配列番号１）に相補的な
ヌクレオチド部分を含む。
【０８４５】 増幅フラグメントは、上述のように１％アガロースゲルから単離され、次にエ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８により消化され、そして１％ア
ガロースゲル上で再び精製される。
【０８４６】 次に、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化されたベクターはＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼにより連結される。次にＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞は形質転換さ
れ、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて正しい方位で挿入されたプラスミドｐＣ１を含
むバクテリアが同定される。挿入された遺伝子の配列は、ＤＮＡ配列化によって
確認される。
【０８４７】 （ＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクション） トランスフェクションのために活性ＤＨＦＲ酵素の無いチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞が用いられる。５μｇの発現プラスミドＣｌをリポフェクト法（Ｆｅ
ｌｇｎｅｒら、上記）を用いて０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏにより同時
トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは支配的な選択マーカー、
Ｇ４１８を含む抗生物質群への耐性を与える酵素をコードするＴｎ５からの遺伝
子ｎｅｏを含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８により補充されるアルファマ
イナスＭＥＭ内に播種する。２日後、細胞をハイブリドーマクローニングプレー
ト（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でトリプシン処理および播種し、１０〜
１４日間培養する。この期間後、単一クローンをトリプシン処理し、次に様々な
濃度のメトトレキサート（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４０
０ｎＭ）を用いて６ウェルのペトリ皿内に播種する。次に最も高い濃度のメトト
レキサートで成長するクローンを、もっと高い濃度のメトトレキサート（５００
ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）を含む新しい６ウェルプレートに移す。クロー
ンが１００μＭの濃度で成長するまで、同じ手順を繰り返す。
【０８４８】 所望の遺伝子産物が発現したかどうかを、ウェスタンブロット分析およびＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０８４９】 （実施例３） （ヒト組織中のＭＰＩＦ−１の発現パターン） ヒト組織中のＭＰＩＦ−１の発現レベルを調べるためにノーザンブロット分析
を実行した。全細胞ＲＮＡサンプルをＲＮＡｚｏｌTMＢシステム（Ｂｉｏｔｅｘ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、６０２３ Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｏｐ Ｅ
ａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ ７７０３３）により単離した。特定された各ヒ
ト組織から単離された全ＲＮＡの約１０μｇを、１％アガロースゲルで分離して
、ナイロンフィルター（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔ
ｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））上にブロットした。５０ｎｇのＤＮＡフラ
グメントを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って標識
反応を行った。標識されたＤＮＡをＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラム（５ Ｐｒｉ
ｍｅ−３ Ｐｒｉｍｅ、Ｉｎｃ．、５６０３ Ａｒａｐａｈｏｅ Ｒｏａｄ、Ｂ
ｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ ８０３０３）で精製した。次にフィルターを、０．５Ｍの
ＮａＰＯ4、ｐＨ７．４および７％のＳＤＳ中に１，０００，０００ｃｐｍ／ｍ
ｌの放射性同位元素標識された全長ＭＰＩＦ−１遺伝子により、６５℃で一夜ハ
イブリダイズする。０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで室温で２度および６０
℃で二度洗浄した後、フィルターを増感スクリーンを用いて−７０℃で一夜曝露
した。
【０８５０】 （実施例４） （バキュロウィルス発現系を用いたケモカインＭＰＩＦ−１の発現および精製
） ＳＦ９細胞を、ＭＰＩＦ−１ ｃＤＮＡを発現するように設計された組換えバ
キュロウィルスによって感染させた。細胞をＭＯＩ２で感染させ、２８℃にて７
２〜９６時間培養した。感染培養物由来の細胞残滓を、低速遠心分離により除去
した。最終濃度が２０μｇ／ｍｌ Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、１μｇ／ｍｌ ロ
イペプチン、１μｇ／ｍｌ Ｅ−６４および１ｍＭ ＥＤＴＡになるように、上
清にプロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
に上清のみ２０〜３０μｌをロードすることにより、上清中におけるＭＰＩＦ−
１のレベルをモニターした。ＭＰＩＦ−１は、数ｍｇ／リットルの発現レベルに
対応して９Ｋｄ可視バンドとして検出された。３段階精製手順によりＭＰＩＦ−
１をさらに精製した：ヘパリン結合性アフィニティクロマトグラフィー。バキュ
ロウィルス培養物の上清を、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ ｐ
Ｈ６を含有する緩衝液の１／３容量と混合し、０．２２μｍ膜を介して濾過した
。次に、サンプルをヘパリン結合カラム（ＨＥｌ ｐｏｒｏｓ ２０、Ｂｉ−Ｐ
ｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）にかけた。ｐＨ６の５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ中５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で、
ＭＰＩＦ−１を約３００ｍＭ ＮａＣｌにて溶出した；カチオン交換クロマトグ
ラフィー。ヘパリンクロマトグラフィーから得られたＭＰＩＦ−１に富む画分を
、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ ｐＨ６を含有する緩衝液を用い
て５倍に希釈した。次に、得られた混合物をカチオン交換カラム（Ｓ／Ｍ ｐｏ
ｒｏｓ ２０、Ｂｉｏ−Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に
かけた。ｐＨ６の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ中２５〜３００ｍ
Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で、ＭＰＩＦ−１を２５０ｍＭ ＮａＣｌにて溶出した
；サイズ排除クロマトグラフィー。カチオン交換クロマトグラフィーに続いて、
ＭＰＩＦ−１をサイズ排除カラム（ＨＷ５０、ＴＯＳＯ ＨＡＡＳ、１．４×４
５ｃｍ）にかけることによりさらに精製した。ＭＰＩＦ−１は、タンパク質のダ
イマー形態に対応し、１３．７Ｋｄ標準分子量（ＲＮａｓｅＡ）に近い位置で分
画した。
【０８５１】 上述の３段階精製の後、得られたＭＰＩＦ−１は、ＳＤＡ−ＰＡＧＥゲル（図
３）のクマシーブルー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色から、９０％より
純粋であることが判定された。
【０８５２】 また、精製されたＭＰＩＦ−１をエンドトキシン／ＬＰＳ汚染について試験し
た。ＬＰＳ含量は、ＬＡＬアッセイ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に基づき０
．１ｎｇ／ｍｌ未満であった。
【０８５３】 （実施例５） （新しく単離された骨髄細胞のＭ−ＣＳＦおよびＳＣＦ−刺激性コロニー形成
に対する、バキュロウィルス発現Ｍ−ＣＩＦおよびＭＰＩＦ−１の効果） マウス骨髄細胞の低密度集合を、処置された組織培養皿中で、３７℃にて１時
間インキュベートすることにより、単球、マクロファージおよびその他のプラス
チック表面に付着する細胞を除去した。次に、細胞の非付着集団を、図８に示す
因子の存在下あるいは不在下で、増殖培地を含む寒天にプレートした（１０，０
００細胞／皿）。培養物を３７℃にて１０日間インキュベートし（８８％Ｎ2、
５％ＣＯ2、および７％Ｏ2）、反転顕微鏡下においてコロニーのスコアを付けた
。データは、コロニーの平均数として表しており、３連で行われたアッセイから
得られたものである。
【０８５４】 （実施例６） （骨髄細胞のｌｉｎ-集団のＩＬ−３およびＳＣＦ刺激増殖および分化に対す
るＭＰＩＦ−１およびＭ−ＣＩＦの効果） 初期の造血前駆体を富化したマウスの骨髄細胞の集団を、陰性選択手順を用い
て得た。ここで、系統の大多数の方向付けられた細胞は、モノクローナルの抗体
（抗ｃｄｌｌｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲおよびＧｒ−１抗原）のパネルお
よび磁気ビーズを用いて除去された。得られた細胞（系統枯渇細胞）の集合は、
ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）を
補充した増殖培地において、指定されたケモカイン（５０ｎｇ／ｍｌ）が存在す
る、または存在しない状態でプレートした（５×１０4細胞／ｍｌ）。加湿イン
キュベータ（５％のＣＯ2、７％のＯ2、および８８％のＮ2の環境）において、
３７℃で７日間インキュベートした後、細胞は収集されＨＰＰ−ＣＦＣについて
、そして未成熟の前駆体についてアッセイされた。さらに、細胞を、特定の分化
抗原の発現に対してＦＡＣＳｃａｎによって分析した。コロニーデータは、コロ
ニーの平均数（＋／−ＳＤ）として表現され、細胞の各集団に対して６つのシャ
ーレにおいて実施したアッセイから得た（図９）。
【０８５５】 （実施例７） （ＭＰＩＦ−１はＩＬ−３，Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦに応答してコロニ
ー形成を阻害する） マウスの骨髄細胞を、大腿骨および脛骨の両方から流し、フィコール密度勾配
およびプラスチック接着によって除去された単球上で分離された。得られた細胞
の集合は、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ−Ｃ
ＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＧ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＭＥ
Ｍベースの培地で一晩インキュベートされた。これらの細胞は、ＩＬ−３（５ｎ
ｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）の存
在下で、５０ｎｇ／ｍｌで用いるか、または用いない状態で、寒天ベースのコロ
ニー形成アッセイにおいて１つのシャーレにつき１０００細胞ずつプレートした
。データは、特定の因子のみで形成されるコロニーの数の割合として、コロニー
形成の際に与えられる。２つの実験が、各実験に対する標準偏差を示すエラーバ
ーと共に複数シャーレの平均として示されたデータとして示される（図１１）。
【０８５６】 （実施例８） （遺伝子治療を介する発現） 線維芽細胞を皮膚生検によって被検体から得る。得られた組織を組織培養培地
に置き、そして小片に分離される。組織の小片を、組織培養フラスコの湿った表
面上に置く。各フラスコには約１０片を置く。フラスコと、逆さまにし、密閉そ
して室温で一晩放置する。室温での２４時間後、フラスコを逆さにし、そして組
織の塊がフラスコの底に固定されている状態で新鮮な培地（例えば、１０％のＦ
ＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するＨａｍのＦ１２培地）を
加える。次いで、これを、約１週間３７℃でインキュベートする。この時、新鮮
な培地を加え、数日おきに取り替える。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の単
層が出現する。単層を、トリプシン処理し、大きなフラスコにスケールアップす
る。
【０８５７】 モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｈ
ｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ ７：２１９−２５（１９８８））を、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて、仔ウシの腸管ホスファターゼによ
って処置される。線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビー
ズを用いて精製する。
【０８５８】 本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、５’および３’末端配列にそ
れぞれ対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅される。５’プライマーはＥｃｏ
ＲＩ部位を含み、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。同量のモロニ
ーマウス肉腫ウイルスの線状骨格およびＥｃｏＲＩならびにＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントがＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で加えられる。得られた混合物は、２つ
の断片の連結に対して適切な条件下で維持される。連結混合物は細菌ＨＢ１０１
の形質転換に用いられる。次いで、これらは、ベクターが対象の遺伝子を適切に
挿入されたことを確認する目的で寒天を含むカナマイシンのプレートにする。
【０８５９】 両種向性なｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍｌ２のパッケージング細胞を組織培養
中で、１０％の仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを
有するＤｕｌｂｅｃｃｏｌのＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（
ＤＭＥＭ）中でコンフルエントな密度まで増殖させる。次いで、遺伝子を有する
ＭＳＶベクターを培地に加え、パッケージング細胞をベクターによって形質転換
する。パッケージング細胞は、遺伝子を含む感染性のウイルス粒子を生成する（
よって、パッケージング細胞はプロデューサー細胞と呼ばれる）。
【０８６０】 新鮮な培地を形成転換プロデューサー細胞に加え、続いて、培地をコンフルエ
ントなプロデューサー細胞の１０ｃｍのプレートから採集する。感染性ウイルス
粒子を含む使用済み培地を、ミリポアフィルターを通して剥離し、剥離したプロ
デューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して線維芽細胞を感染させる。
培地を、線維芽細胞のサブコンフルエントプレートから除去し、プロデューサー
細胞からの培地で迅速に置換する。この培地を除去し、新鮮な培地で置換する。
ウイルスのカ価が高い場合、実質的に全ての線維芽線維が感染され、選択の必要
はない。カ価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓなどの選択可能なマーカー
を有するレトロウイルスのベクターを用いる必要がある。
【０８６１】 次いで、操作された加工線維芽細胞を、単独、またはｃｙｔｏｄｅｘ３のマイ
クロキャリアビーズ上でコンフルーエンスまで増殖した後、のいずれかで宿主に
注入する。よって、線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。
【０８６２】 （実施例９） （インビトロ骨髄保護） 上記に示したように、ＭＰＩＦ−１は、低増殖性能力コロニー形成細胞（Ｌｏ
ｗ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒ
ｍｉｎｇ Ｃｅｌｌ（ＬＰＰ−ＣＦＣ））の強力なインヒビターである。低増殖
性能力コロニー形成細胞は、顆粒球および単球系統を生じる骨髄前駆体である。
ＭＰＩＦ−１が細胞周期作用性化学療法薬物の細胞傷毒性からＬＰＰ−ＣＦＣの
保護を提供することを実証するために、細胞の系統枯渇集合（Ｌｉｎ−細胞）を
マウスの骨髄から単離し、ＭＰＩＦ−１を有するか、または有さない状態の複数
のサイトカインの存在下でインキュベートした。４８時間後、５−Ｆｕおよびイ
ンキュベーションを受けた各培養の１組は、次いでさらに２４時間継続され、そ
の時点でクローン原生アッセイによって残存ＬＰＰ−ＣＦＣの数が決定された。
図２１Ａに示すように、ＬＰＰ−ＣＦＣの約４０％までがＭＰＩＦ−１の存在下
で５−Ｆｕに誘発された細胞傷毒性から保護された。それに対して、ＭＰＩＦ−
１が存在しない状態、または無関係なタンパク質が存在するでは、ＬＰＰ−ＣＦ
Ｃに対する保護がほとんど（＜５％）観察されなかった。高増殖性能力コロニー
形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）は、同一の培養条件下ではＭＰＩＦ−１によって保
護されず、ＭＰＩＦ−１の保護効果の特異性を実証した。
【０８６３】 ５−Ｆｕの代わりに、化学治療薬剤Ａｒａ−Ｃを用いて同様の実験を実施した
。図１５Ｂに示すように、野生型ＭＰＩＦ−１および変異体ＭＰＩＦ−１（すな
わち、変異体−１、この変異体の説明は以下の実施例１１を参照）の両方からＬ
ＰＰ−ＣＦＣの劇的な保護が得られた。よって、ＭＰＩＦ−１は、５−Ｆｕおよ
びＡｒａ−Ｃの両方の化学治療薬物によって誘発された細胞傷毒性からＬＰＰ−
ＣＦＣを保護することができる。
【０８６４】 （実施例１０） （インビボ骨髄保護） インビボ骨髄保護の結果は、化学治療薬剤の作用の期間中にＭＰＩＦ−１によ
って骨髄中の臨界細胞種が保護され得る場合に、化学療法を受ける癌患者に観察
される重篤な副作用である細胞傷毒性薬物によって惹起された骨髄毒性が改善さ
れ得ることを示唆する。インビボ骨髄保護を実証するために、２種類の実験をマ
ウスで実施した。１つの実験では、１群のマウス（グループ４）を１．０ｍｇ／
ＫｇのＭＰＩＦ−１によって２４時間周期で３日間毎日注射（Ｉ．Ｐ．）し、３
日目にこれらのマウスに１５０ｍｇ／Ｋｇの５−Ｆｕを注射（Ｉ．Ｐ．）した。
生理食塩水のみ（グループ１）、ＭＰＩＦ−１のみ（グループ２）または５−Ｆ
ｕのみ（グループ３）を注射した動物がコントロールの役割を果たした。次いで
、各グループからの４つの動物が、５−Ｆｕ投与の後に３、６、および１０日目
に屠殺され、末梢血における白血球（ＷＢＣ）の計数を決定した。図１６に示す
ように、ＭＰＩＦ−１のみの注射ではＷＢＣ計数に影響がほとんどない。予測さ
れたように、５−Ｆｕ処置は、５−Ｆｕ後の６日目における循環するＷＢＣ計数
に劇的な減少を得られた。顕著に、５−Ｆｕ投与前にＭＰＩＦ−１で処置された
動物は、５−Ｆｕのみで処置された動物に比べて血液中において約２倍高いＷＢ
Ｃカウントを示した。よって、５−Ｆｕの前のＭＰＩＦ−１でマウスを処置する
ことによって、好中球減少から促進的な回復が得られる。
【０８６５】 骨髄中の造血幹細胞および多能性前駆体細胞は化学治療に続いて全ての造血性
系統を回復するよう機能する。正常な個人において、これらの細胞は低い頻度で
分裂し、よって、化学治療薬剤の一回の投与量が節約される。しかし、これらの
細胞は、第１の投与量後３日以内に薬剤の第２の投与量が投与された場合には殺
傷される。なぜなら、脊髄中の重要な前駆体細胞種はこの期間中に迅速に分裂す
るからである。
【０８６６】 ＭＰＩＦ−１が骨髄においてこのような細胞種を保護できることを実証するた
めに、以下の実験を行った。この実験は、以下のように処置された３グループの
マウス（各グループにつき６匹）を用いて行われた。グループ１には、１、２お
よび３日目に生理食塩水を注射し、グループ２には、０および３日目に５−Ｆｕ
で注射し、グループ３には、０および３日目に５−Ｆｕを、および１、２および
３日目にＭＰＩＦ−１を注射する（図１７を参照のこと）。骨髄が６および９日
目に採集され、当業者に周知のクローン原性のアッセイを用いてＨＰＰ−ＣＦＣ
およびＬＰＰ−ＣＦＣの頻度を決定した。結果は、５−Ｆｕの第２の投与量の前
にＭＰＩＦ−１を投与する事は、５−Ｆｕのみで処置された動物と比較して９日
目までにＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの頻度の回復が迅速に得られるこ
とを実証した（図１８を参照のこと）。
【０８６７】 （実施例１１） （ＭＰＩＦ−１変異体での研究） Ｎ末端から切断される多くのＭＰＩＦ−１改変体が同定され、そして特徴づけ
られている。Ｅｄｍａｎ分解によって決定されるようなこれらの改変体のアミノ
末端配列を図１９に示す。例えば、変異体−２，−３，−７および−８は、ＭＰ
ＩＦ−１の成熟形態の精製中に自然に生じた。そして、この調製物は調製物Ｋ０
８７１と呼ぶ。同様に、変異体−２，−３，−４および−５は、精製されたＭＰ
ＩＦ−１の調製物の別のバッチに発見された（調製物ＨＧ００３００−Ｂ７）。
これらの改変体を互いから精製することは不可能であるので、調製物Ｋ０８７１
およびＨＧ００３００−Ｂ７は以下の実験においてそのままの状態で用いられた
。Ｎ末端メチオニン以外はアミノ末端配列に関して変異体３と同一の変異体６は
、インビトロ変異原性によって発生された。Ｎ末端メチオニン以外は野生型と同
一の変異体１も変異誘発によって発生された。さらに、ＭＰＩＦ−１のオルタナ
ティブスプライシングされた形態（変異体−９）が発見された（図１９を参照の
こと）。この変異体−９のｃＤＮＡクローンは、１３７アミノ酸のタンパク質を
コードする（図２０Ａ）。変異体−９のアミノ酸配列をＭＰＩＦ−１の配列と比
較すると、ＭＰＩＦ−１配列における残留物４５および４６の間の１８アミノ酸
の挿入、ならびにＭＰＩＦ−１のアルギニン４６の減少が明らかになる（図２０
Ｂ）。以下は、これらのＭＰＩＦ−１変異体タンパク質の生物学的活性を要約す
る。
【０８６８】 （細胞内のカルシウム動員） 前述の実施例において、ＭＰＩＦ−１タンパク質は単球においてカルシウムを
動員することを示す。野生型および変異体ＭＰＩＦ−１タンパク質は、ヒトのＭ
ＩＰ−１αをポジティブコントロールとして用いるヒトの単球内における細胞内
カルシウムの動員の能力について検査された。以下のように実験が行われた。ヒ
トの単球は、洗浄によって隔離され，１ｍＭのＣａＣｌ2、２ｍＭのＭｇＳＯ4、
５ｍＭのグルコース、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含む１ｍｌの
ＨＢＳＳおよび２．５ｍＭのＩｎｄｏ−１／アセトキシメチルエステル中で３０
分間３７℃で１×１０6の細胞をインキュベートすることによってＩｎｄｏ−１
／アセトキシメチルエステルを負荷する。次いで、細胞はＨＢＳＳによって洗浄
され、５×１０5ｃｅｌｌ／ｍｌで同一の緩衝液において再懸濁され、指示され
たタンパク質の様々な濃度で３７℃で刺激される。細胞内カルシウム（（Ｃａ++ ）ｉ）の変化に応答して誘導された蛍光シグナルは、３００ｎｍにおけるＩｎｄ
ｏ−１の励起および４０５ｎｍおよび４８５ｎｍにおける放出をモニターするこ
とによってＨａｔｃｈｉＦ−２０００の蛍光分光光度計上で測定される。結果を
図２１に示す。
【０８６９】 結果は、調製物Ｋ０８７１、ＨＧ００３００−Ｂ７、および変異体−９が、野
生型よりも１０倍多い活性である一方、変異体−６は野生型から識別不能であり
、変異体−１は野生型よりも２倍多い活性であることを実証する（図２１参照）
。ＭＩＰ−αおよびＭＰＩＦ−１が一次アミノ酸配列に対して４５％同一である
ので、これらが同一のレセプターで相互作用するかどうかを決定することが興味
の対象となった。この可能性を探索するために、ＭＩＰ−１αに誘発されたカル
シウム動員を脱感作させるＭＰＩＦ−１の能力について研究した。図２２Ａおよ
び図２２ＢはＭＩＰ−１αおよびＭＰＩＦ−１の野生型タンパク質が単球におい
てカルシウムを動員する能力を互いに脱感作し得るが、ＭＣＰ−４（別のβケモ
カイン）はし得ないことを示す。
【０８７０】 同様の実験において、調製物Ｋ０８７１およびＨＧ００３００−Ｂ７および変
異体−１，−６および−９は、ＭＩＰ−１αに誘発されるカルシウム動員をブロ
ックすることができた。この実験は、以下のように行われた。１００ｎｇ／ｍｌ
の指定されたタンパク質に対するヒトの単球のカルシウム動員の応答が、図２１
に開示された実験に対して指定されたように測定された。脱感作の研究に対して
、単球はまず１つの因子に曝され、第１の処置への応答がベースラインに戻った
時、同一の細胞に第２の因子が加えられた。第２の因子に対しては（−）サイン
によって何の応答も示されず、（＋）サインによって第１の因子に対して刺激性
の応答が示された（図２３を参照のこと）。
【０８７１】 このように、ＭＰＩＦ−１およびその変異改変体は、ＭＩＰ−１αの細胞表面
レセプターの成分と相互作用するかまたはこの成分を共有するようである。ＭＩ
Ｐ−１αレセプターが、ＨＩＶがヒトの単球およびＴリンパ球へ入ることを容易
にする際に補助因子として役立つことという最近の実証は、ＭＰＩＦ−１または
その改変体が、ＨＩＶが細胞への侵入するプロセスを妨害し得るという興味ある
可能性を提示する。
【０８７２】 （走化性） ヒト末梢血単核性細胞（ＰＢＭＣ）画分（主に、リンパ球および単球から構成
される）の走化性を、９６ウェル神経プローブ走化性チャンバ中のＭＰＩＦ−１
およびその改変体の種々の濃度に対する応答において、測定した。実験は、以下
のように行った：細胞を、０．１％ＢＳＡを伴うＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ／ＢＳＡ）
中で３回洗浄し、そして標識するために２×１０6／ｍｌで再懸濁した。カルセ
インＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を、最終濃度１ｍＭに加え、そ
して細胞は、３７℃で３０分間インキュベートした。このインキュベートに続い
て、細胞を、ＨＢＳＳ／ＢＳＡ中で３回洗浄した。次に標識細胞は、８×１０6
／ｍｌとなるよう再懸濁し、そしてこの懸濁液２５ｍｌ（２×１０5 細胞）が９
６ウェル走化性プレートのそれぞれの上部チャンバへ分け入れられた。走化性試
薬を、それぞれのウェルの底部チャンバに、種々の濃度で分配した。上部および
底部チャンバは、ポリカーボネートフィルター（孔の大きさ ３〜５ｍｍ；ＰＶ
Ｐなし；ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ、Ｉｎｃ．）によって分けられている。細胞は、
４５〜９０分間移動させ、そして次に、移動した細胞（フィルターの底面表面に
付着した細胞および底部チャンバ中の細胞の両方）の数が、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ
１１ 蛍光プレート読み取り機（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）を使用して定量された。数値は、ピーク活性が、括弧内に示されたバックグ
ラウンドより上の相対誘導倍数（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉ
ｏｎ）で観察された濃度を表す。
【０８７３】 図２４で示される結果は、調製物Ｋ０８７１およびＨＧ００３００−Ｂ７が野
生型よりさらに強力な走化性の誘導物質であり、一方、変異体−１および−６が
野生型と区別がつかないことを実証する。
【０８７４】 （ＬＰＰ−ＣＦＣによるコロニー形成への影響。）ＬＰＰ−ＣＦＣによるコロ
ニー形成へのＭＰＩＦ−１改変体の影響を決定するために、制限された数のマウ
ス骨髄細胞を、種々の濃度のＭＰＩＦ−１改変体を有するまたは有さない、複数
種のサイトカインを補充した軟らかい寒天含有培地にプレートした。実験を、以
下のように行った：低密度集団のマウス骨髄細胞を、示されたＭＰＩＦ−１改変
体を種々の濃度で有するまたは有さない寒天含有培地に、以下のマウス組換えサ
イトカイン、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−
１α（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下でプレート
（１，５００細胞／直径３．５ｃｍの皿）した。次に、皿は、組織培養インキュ
ベーターで１４日間インキュベートし、１４日目の時点で、ＬＰＰ−ＣＦＣコロ
ニーは、倒立顕微鏡下で数えた。図２５に表されたデータは、それぞれの条件で
２連でアッセイした数個の異なる実験からプールする。
【０８７５】 その結果は、調製物Ｋ０８７１およびＨＧ００３００−Ｂ７の場合、最大阻害
の５０％に必要な有効濃度は、野生型の有効濃度より２０から１００倍低く、そ
して変異体−６の場合は、２から１０倍低いことを実証する。（図２５を参照の
こと）。このように、ＭＰＩＦ−１タンパク質のＮ末端アミノ酸が欠失するとそ
の分子の効力が増加するという結果になる。
【０８７６】 （実施例１２） （ＭＰＩＦ−１により誘導されるインビボでの幹細胞の動員） ＭＰＩＦ−１がインビボで幹細胞の可動化を刺激することを証明するために、
以下の実験を行なった。各処置グループに、６匹のマウスを使用した（Ｃ５７Ｂ
ｌａｃｋ ６／Ｊ、メス、生後約６週間）。これらのマウスに、生理食塩水（ビ
ヒクルコントロール）またはＭＰＩＦ−１のいずれかをマウス１匹につき５mｇ
注射（腹腔内）した。３０分後、マウスから採血し、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター
によりＷＢＣについて分析した。次いで、各グループの６匹すべてからの血液を
プールし、ＦＡＣＳｃａｎにより、Ｇｒ．１＋細胞およびＣＤ３４．Ｓｃａ−ｌ
＋二重陽性細胞について分析した。ＷＢＣの数は、平均±Ｓ．Ｄ．として表され
、そして、ＦＡＣＳｃａｎデータは、細胞総数の％として表される。ＣＤ３４．
Ｓｃａ−１＋二重陽性細胞は、造血幹細胞に期待される特性を示すと考えられる
ため、図２６に示される結果は、ＭＰＩＦ−１が、幹細胞可動化剤として使用さ
れ得ることを示す。
【０８７７】 （実施例１３） （５−Ｆｕ処置の間のＭＰＩＦ−１処置は、血小板および顆粒球のより速い回
復を生じる。） 化学的治療法から得られる２つの主要な合併症は、好中球減少症（減少した血
中好中球カウント）および血小板減少症（減少した血小板カウント）である。顆
粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、現在、好中球減少症を緩和するため
に臨床で用いられている。Ｇ−ＣＳＦは、インビトロでコロニー形成性単位−顆
粒球（ＣＦＵ−Ｇ）によるコロニー形成を刺激し、そして動物モデルにおいて顆
粒球産生を刺激することが知られている。トロンボポエチン（Ｔｐｏ）は、血小
板減少症を軽減する目的のために臨床試行にある。Ｔｐｏは、インビトロでコロ
ニー形成性単位−巨核球（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）によるコロニー形成を刺激し、そし
て動物中で実験的に誘導された血小板減少症において血小板産生を刺激すること
が知られている。臨床におけるＧ−ＣＳＦの主要な制限の１つは、それは、化学
的治療法の複数サイクルを受けている患者における好中球減少症を軽減するには
有効ではことである。これは、Ｇ−ＣＳＦが作用する、骨髄、標的細胞中のＧ−
ＣＳＦの枯渇に起因するらしい。Ｔｐｏもまた、初期の臨床試行結果により示さ
れるのと同じ運命を受け得る。化学的治療法の間に、Ｇ−ＣＳＦおよびＴｐｏ標
的細胞の枯渇を防ぎ得る任意の薬剤は、大きな臨床的価値を有し得る。以下に示
すデータは、ＭＰＩＦ−１がこの臨床必要性を満たし得ることを示唆する。
【０８７８】 先の実施例において、ＭＰＩＦ−１が、インビトロで、両能性の、顆粒球／単
球骨髄前駆体により、コロニー形成を阻害することが示されている。特に、実施
例９および１０は、ＭＰＩＦ−１が、初期の、多能骨髄前駆体を、５−Ｆｕ誘導
イントロおよびインビボ細胞障害性から保護することを示すデータを提供する。
これらの多能前駆体は、ＣＦＵ−ＧおよびＣＦＵ−Ｍｅｇを含むすべての骨髄系
統のより関係する前駆体になると期待される。以下の実験は、５−Ｆｕ処置の２
または３サイクルの間のＭＰＩＦ−１処置が、血小板および顆粒球のより速い回
復を生じることを示すために実施された。
【０８７９】 （材料および方法：）平均体重１９．４ｇ（±１．１ Ｓ．Ｄ．、ｎ＝１５０
）のＣ５７ＢＬ６雌マウス（７−１０週齢）を用いた。すべてのマウスを、実験
の経過を通じて、標準的な食餌ならびに暗／光サイクルおよび温度の飼育条件下
で飼育した。ＭＰＩＦ−１調製物（ＨＧ００３０４−Ｅ６）をＥ．ｃｏｌｉ中で
作成し、そして成熟タンパク質の２３のＮ末端アミノ酸を欠くＭＰＩＦ−１の短
縮型（すなわち、図１９中のＭＰＩＦ−１ Ｍｕｔａｎｔ−３であって、それに
Ｎ末端 Ｍｅｔが付加されている）を代表する。臨床グレードのＧ−ＣＳＦ（Ｎ
ｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））を、Ｓｈａｄｙ Ｇｒｏｖｅ Ｐｈａｒｍａｃｙ
，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５０から購入した（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登
録商標）は、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ａｍｇｅｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｏｕｓａ
ｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ ９１３２０により製造されている）。５−フルオロウラ
シル（５−Ｆｕ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入し、そしてそれは
使用直前に温水中に溶解することにより新たに調製した。ＭＰＩＦ−１溶液は、
通常の生理食塩水中に希釈することにより新たに調製した。同様に、Ｇ−ＣＳＦ
は、１０ ｍＭ酢酸ナトリウム、５％（ｗｔ／ｖ）マンニトール、０．００４％
（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ４．０からなる緩衝液中に希釈した。マウスＣ
Ｄ４１ａ、Ｇｒａ．１、およびＭａｃ．１抗原に対する、適切な蛍光色素を結合
したラットモノクローナル抗体を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。
【０８８０】 ５つの群のマウス（１群あたり３０匹のマウス）を以下のように処理した： グループ１は、通常のコントロールとして供するために−２、−１、０、６、
７、および８日に通常の生理食塩水０．１ ｍｌをＩ．Ｐ．注射した。
【０８８１】 グループ２は、０および８日に、５−Ｆｕ溶液の０．２ ｍｌを（１００ ｍ
ｇ／ｋｇ体重で）Ｉ．Ｐ．注射した。
【０８８２】 グループ３は、グループ２におけるように５−Ｆｕを注射し、そしてさらに−
２、−１、０、６、７、および８日にＭＰＩＦ−１溶液の０．１ ｍｌを（１．
０ ｍｇ／ｋｇ体重で）Ｉ．Ｐ．注射した。
【０８８３】 グループ４は、グループ２におけるように５−Ｆｕを注射し、そしてさらに１
、２、３、９、１０、および１１日にＧ−ＣＳＦ溶液の０．１ ｍｌを（０．５
ｍｇ／ｋｇ体重で）Ｉ．Ｐ．注射した。
【０８８４】 グループ５は、グループ２におけるように５−Ｆｕを、グループ３におけるよ
うにＭＰＩＦ−１を、そしてグループ４におけるようにＧ−ＣＳＦを注射した。
【０８８５】 次いで、各群から６匹の動物を、示された日に、末梢血および骨髄のレベルで
血小板および顆粒球回復をモニターするために分析した。最初の５−Ｆｕ後６お
よび８日目に分析されたマウスは、ＭＰＩＦ−１または５−Ｆｕを用いた第２番
目の処置を受けていなかったことに注目すべきである。
【０８８６】 末梢血は、後方眼窩洞からＥＤＴＡでコートされたチューブに採集され、そし
て直ちにＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅにより分析し、血小板（ＣＤ４１ａ陽性事象
）および顆粒球（Ｇｒａ．１およびＭａｃ．１二重陽性細胞）カウントを測定し
た。ここで採用された分析方法および動物種は、絶対的なカウントを得ることを
可能にしないことに注意すべきである。その代わりに、顆粒球は、総白血球細胞
のパーセンテージとして表され、そして血小板は、ソーター上１５秒あたりのＣ
Ｄ４１ａ陽性事象として評価された。次いでマウスを屠殺し、標準的な方法を用
いて骨髄細胞を得た。骨髄細胞はまた、ＦＡＣＳにより分析し、骨髄中のＧｒａ
．１およびＭａｃ．１二重陽性細胞集団のパーセンテージをモニターした。顆粒
球系統中で、これらの抗原が発現され始めるステージは正確には知られていない
ので、骨髄中のＧｒａ．１およびＭａｃ．１二重陽性細胞は、それらの発達およ
び成熟能力のステージに関して不均質であると期待される。
【０８８７】 骨髄はまた、インビトロクローン原性アッセイを用いてクローン原性前駆体の
頻度を測定するために分析された。簡単に述べれば、高増殖能コロニー形成性細
胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）および低増殖能コロニー形成性細胞（ＬＰＰ−ＣＦＣ）ア
ッセイを、２層寒天培養系中で実施した。下層を、２０％ ＦＢＳ、０．５％
Ｄｉｆｃｏ寒天、７．５ｎｇ／ｍｌ ｍＩＬ−３、７５ｎｇ／ｍｌ ｍＳＣＦ、
７．５ｎｇ／ｍｌ ｈＭ−ＣＳＦおよび１５ ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−１αを補填
した１ｍｌのＭＥＭ培地で、３．５ｃｍ直径の組織培養皿中に調製した。次いで
この層を、２０％ＦＢＳおよび０．３％の寒天を含むＭＥＭ中の２，０００細胞
／皿を有するマウス骨髄細胞懸濁液の０．５ｍｌで重層した。上層寒天は、室温
で約１５分間固化させた。次いで、この皿を、１４日間、組織培養インキュベー
ター中でインキュベートし（３７℃、８８％Ｎ2、５％ＣＯ2、および７％Ｏ2）
、そしてコロニーを倒立顕微鏡下で計数した。この実験では、総コロニーカウン
トを報告する。
【０８８８】 ＦＡＣＳデータを、時点あたり各群の３匹の動物から得た材料を分析すること
により生成し、その一方、クローン原性アッセイを、時点あたり各群から６匹の
動物から得た細胞を用いて実施した。最後に、１日目の群の実験に対するデータ
点は、生理食塩水を注射した通常マウス（グループ１）から得た値を表す。
【０８８９】 （結果：）末梢血における血小板の回復をモニターするために、ＣＤ４１ａ陽
性細胞の定常状態レベルを、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅにより測定した。図２７
に示されるように、５−Ｆｕの前のＭＰＩＦ−１処置（グループ３）は、５−Ｆ
ｕ＋生理食塩水で処理されたマウス（グループ２）において観察されたそれより
も、かなり速くかつ強い血小板の回復を生じた。予期されるように、Ｇ−ＣＳＦ
で処理されたマウス（グループ４）における血小板回復の動力学は、５−Ｆ＋生
理食塩水処理マウスで観察されたそれと区別し得なかった。また、５−Ｆｕ処置
マウスにＧ−ＣＳＦプラスＭＰＩＦ−１を投与することは（グループ５）、ＭＰ
ＩＦ−１単独で処理されたマウス（グループ３）中で観察されたそれと比較した
とき、血小板の全体の定常状態レベルに対してほとんど影響を有さなかった。従
って、５−Ｆｕ処置の前のマウスのＭＰＩＦ前処理は、末梢血における血小板の
急速な回復を生じた。
【０８９０】 末梢血における顆粒球の回復を、血液中のＧｒａ．１およびＭａｃ．１二重陽
性細胞の定常状態レベルを定量することによりモニターした。図２８に例示され
るように、マウスの５−Ｆｕ処置は、第１のおよび第２の５−Ｆｕ処置後６日目
に血中のＧｒａ．１およびＭａｃ．１二重陽性細胞の定常状態において鋭い減少
を生じた。ＭＰＩＦ−１前処理は、２つの有益な効果を有していた；５−Ｆｕ＋
生理食塩水で処理したマウス（グループ２）において観察されたそれに比較して
、好中球減少症の程度（Ｇｒａ．１およびＭａｃ．１二重陽性細胞の枯渇の程度
）がかなり小さく、かつ回復速度がかなり速かった。予期されるように、５−Ｆ
ｕ処理後のＧ−ＣＳＦの投与（グループ４）は、血液中のＧｒａ．１およびＭａ
ｃ．１二重陽性細胞の迅速な回復を生じた。しかし、Ｇ−ＣＳＦ処理されたマウ
スにおける好中球減少症からの回復の程度は、８日目にＭＰＩＦ−１処理された
マウス（グループ３）において観察されたそれより著しく小さかった。顆粒球枯
渇および回復に対するＭＰＩＦ−１プラスＧ−ＣＳＦを投与する（グループ５）
ことの効果は、これらのマウスが、ＭＰＩＦ−１またはＧ−ＣＳＦいずれか単独
で処理されたマウス中で観察されたそれより血液中のＧｒａ．１およびＭａｃ．
１二重陽性細胞のかなり高い定常状態レベルを示したという点で極めて劇的であ
った。従って、図２８に示されるように、ＭＰＩＦ−１およびＧ−ＣＳＦは、そ
れらが同時投与されるとき、付加的な効果を奏し得るようである。
【０８９１】 上記で示されたように、骨髄レベルでの回復が、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ法
およびクローン原性アッセイによりモニターされた。ＦＡＣＳで得た結果を図２
９に示す。予期されるように、５−Ｆｕ処理骨髄（グループ２）中のＧｒａ．１
およびＭａｃ．１二重陽性細胞集団のレベルは、６日から１４日を通じて顕著に
低下したままで、次いで１６日までに通常レベルに回復した。このＧｒａ．１お
よびＭａｃ．１二重陽性細胞の５−Ｆｕ介在枯渇の影響は、マウスが、５−Ｆｕ
前にＭＰＩＦ−１処理されたとき（グループ３）、完全に廃止された。驚くべき
ことに、Ｇ−ＣＳＦ（グループ４）は、最初の５−Ｆｕ用量に応答して、Ｇｒａ
．１およびＭａｃ．１二重陽性細胞の枯渇を防ぎ得たが、第２のそれに対しては
防ぎ得なかった。これは、Ｇ−ＣＳＦ標的細胞の利用可能性およびＧ−ＣＳＦ投
与のタイミングに起因し得るようである。同様の応答が、最初の５−Ｆｕ後８日
目に回復の程度はＭＰＩＦ−１またはＧ−ＣＳＦいずれか単独で処理したマウス
中で観察されたそれよりかなり高かったが、ＭＰＩＦ−１プラスＧ−ＣＳＦで処
理されたマウス（グループ５）で明らかであった。
【０８９２】 クローン原性アッセイからのデータを図３０に示す。骨髄における前駆体の頻
度は、１６日目の回復の暗示をともなって実験期間の１４日を通じて５−Ｆｕに
応答して低下したままであった。前駆体の頻度におけるこの減少は、５−Ｆｕの
前にＭＰＩＦ−１で処理されたマウス中で廃止された。対照的に、マウスのＧ−
ＣＳＦ処理は、通常またはＭＰＩＦ−１処置骨髄のいずれかにおいて見出される
前駆体の頻度を持続することにおいて有効ではなかった。骨髄中の前駆体頻度に
対するＧ−ＣＳＦプラスＭＰＩＦ−１を投与することの影響は複雑なようである
。
【０８９３】 （前臨床的薬理学の表の要約） 以下の表（表２、３、および４）は、インビトロおよびインビボでの一次およ
び二次薬理学的研究を要約する。
【０８９４】 （表２、３、および４に参照される一群のための重要な表。）ＭＰＩＦ−１の
一群を、タンパク質が発現された生物体および発現産物の形態（例えば、成熟、
全長、または改変体）を示す複数成分コードにより称する。名称の後ろのハイフ
ン後の文字は、タンパク質が発現された生物体または発現に用いたベクター（す
なわち、Ｂ＝バキュロウイルス、Ｃ＝ＣＨＯ細胞、Ｅ＝Ｅ．ｃｏｌｉ）のいずれ
かを示す。ハイフンの前の最後の３文字のアラビア数字は、発現されたタンパク
質の形態または改変体を示す（すなわち、３００＝全長ＭＰＩＦ−１、３０１＝
ＭＰＩＦ−１Δ１７改変体、３０２＝成熟アミノ酸配列のアミノ末端に付加され
たメチオニン残基を有する成熟ＭＰＩＦ−１、３０４＝ＭＰＩＦ−１Δ２３改変
体、３１１＝全長ＭＰＩＦ−１）。従って、一群の名称は、発現ＭＰＩＦ−１タ
ンパク質の形態タンパク質が宿主細胞から分泌されるか否か、および分泌タンパ
ク質の形態（分泌する場合）を示す。例えば、ＨＧ００３００−Ｂ５は、バキュ
ロウイルスベクターを用いて全長ＭＰＩＦ−１タンパク質が発現されたことを示
す。さらに、この系を用いて発現されるＭＰＩＦ−１は、昆虫宿主細胞によりプ
ロセスされるので、このタンパク質の分泌型は、成熟ＭＰＩＦ−１である。
【０８９５】 上記の命名法は、一群のＨＧ００３００−Ｂ７については除外する。この一群
は、４つの異なるＭＰＩＦ−１ポリペプチドの混合物を含む。本発明者らは、こ
れらのポリペプチドが、精製プロセスの間に生じるＭＰＩＦ−１のタンパク質分
解切断の結果として産生されたことを考える。一群のＨＧ００３００−Ｂ７に存
在するＭＰＩＦ−１改変体は、実施例１１において議論する。
【０８９６】
【表２】
【０８９７】
【表３】
【０８９８】
【表４】 （実施例１４） （ｐＨＥ４−５発現ベクターを用いるＭＰＩＦ−１Δ２３の産生、回収、およ
び精製） ＭＰＩＦ−１は、新規なヒトβ−ケモカインである。ＭＰＩＦ−１の成熟型は
、１１．２ｋＤａの分子量を有する９９アミノ酸ペプチドとして分泌される。７
６アミノ酸長の短縮型（ＭＰＩＦ−１Δ２３）はまた、ＭＰＩＦ−１の初期発現
研究の間に同定された。バキュロウイルス発現系において、ＭＰＩＦ−１Δ２３
を、次いで単離およびサブクローン化した。生物学的アッセイは、短縮型が、全
長対応物よりも活性であることを示す。
【０８９９】 （クローニングおよび発現） 本来、大動脈内皮相補的デオキシリボ核酸ライブラリーから単離されたＭＰＩ
Ｆ−１Δ２３遺伝子を、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８の単一の制限酵素切断部位
で、発現ベクターｐＨＥ４にサブクローニングし（図３１）、そしてＫ１２誘導
Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧ１３００９株（Ｓｕｓａｎ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍ
Ｄから入手可能）に形質転換した。ｐＨＥ４を用いるタンパク質発現に適切な宿
主として作用し得るＥ．ｃｏｌｉのさらなる株には、ＤＨ５αおよびＷ３１１０
（ＡＴＣＣ受託番号２７３２５）が含まれる。ｐＨＥ４ベクターは、２つのｌａ
ｃオペレーターを有する強力な合成プロモーターを含む。このプロモーターから
の発現は、ｌａｃリプレッサーの存在により調節され、そしてイソプロピルβ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）またはラクトースを用いて誘導される
。プラスミドはまた、効果的なリボソーム結合部位およびＭＰＩＦ−１Δ２３遺
伝子の下流の合成転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、ｐＵＣプラ
スミドの複製領域および形質転換細菌中でカナマイシン耐性を生じるネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。
【０９００】 （製造方法） （発酵プロセスの概要）ＭＰＩＦ−１Δ２３の発酵プロセスを、以下の段階に
概要し、そして図３２に示す。
【０９０１】 （マスター播種バンク）プラスミド発現ＭＰＩＦ−１Δ２３を用いて形質転換
したＥ．ｃｏｌｉのマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を、現在の優良医薬品製造基
準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）の下で、調
製した。このバンクを、凍結保存物としてグリセロールを含む培地中で調製し、
そして−８０℃で凍結した。調製後、ＭＣＢを、ファージまたは他の微生物によ
る夾雑物の非存在を確認するために試験した。
【０９０２】 （第１の播種段階）第１のシード段階培養物を、種菌調製培地を含有するバッ
フル付き震盪フラスコ中で調製する。震盪フラスコを、凍結シードストックで１
：２０００希釈で播種し、そして２２５ｒｐｍ、３７℃に維持した震盪機に１２
時間配置する。
【０９０３】 （生成相）生成相培養物を、ＤＯ2、ｐＨ、温度、および栄養食餌コントロー
ルを備えた１００リットルのＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ発酵槽中で調製する。生成培地
（３７℃）を、第１の播種培養物で播種し、６００ｎｍで０．２０ユニット／ｍ
ｌの吸光度（ＯＤ）を提供する。培養物が、６００ｎｍで１０±２ユニット／ｍ
ｌのＯＤに達したとき、ＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘導する（最終
濃度２０ｍＭ）。誘導４時間後、細胞を回収する。
【０９０４】 （細胞回収相）継続的なフロー遠心機を用いて、１８，０００ｇでの遠心分離
により細菌を回収する。得られた細胞ペーストを、−８０℃で貯蔵する。
【０９０５】 （ＭＰＩＦ−１Δ２３の回収） ＭＰＩＦ−１Δ２３の回収を、図３３に概要する。
【０９０６】 （細胞溶解物）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペーストを解凍し、そして１０容量の再懸濁
緩衝液に再懸濁する。次いで、細胞を、ホモジナイザーによる７０００ｐｓｉで
の通過（２回）に続いて破壊する。
【０９０７】 （封入体洗浄）細胞溶解物に、０．５Ｍの終濃度までＮａＣｌを添加し、次い
で０．４５−μｍ膜を用いて接線流動濾過により２倍濃縮する。残留物（ｒｅｍ
ａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、３容量の洗浄−２緩衝液（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、および２５ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ 2 ）、続いて１容量の洗浄−１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ−Ｎａ2）に対してダイアフィルトレートする。残留物を洗浄−１緩衝液
で２倍希釈し、そして不溶性画分を継続的な遠心分離により回収する。あるいは
、封入体を遠心分離により洗浄し得る。
【０９０８】 （封入体可溶化）遠心分離後に得られたペレットを、等価量の９パックの封入
体容量の可溶化緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．７５Ｍグアニジン
−ＨＣｌ、および２５ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ2）中に再懸濁する。懸濁液を、最
初室温で２〜４時間、次いで２℃〜１０℃で１２〜１８時間撹拌する。
【０９０９】 （再折り畳み）懸濁液を遠心分離し、そして上清液を回収し、そして９容量の
再折り畳み緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１２５ ｍＭ ＮａＣｌ、およ
び２ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ2）と混合する。希釈された物質を約２時間の間保持
し（２〜１０℃）、沈殿物を沈降させる。この物質を濾過し、次いで直ちに処理
するか、または７２時間まで貯蔵し次いで処理する。
【０９１０】 （精製） （ＨＳ−５０カチオン交換クロマトグラフィー）ＭＰＩＦ−１Δ２３の精製の
概略を図３４に示す。濾過液を、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
、ｐＨ５．８〜６．２で平衡化したＰＯＲＯＳ ＨＳ−５０カラム上にロードす
る。タンパク質を、ＮａＣｌ（３００〜１５００ｍＭ）を用いてステップワイズ
様式で溶出する。５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出する画分をプールし、そして注入
のために水で２倍希釈する。
【０９１１】 （ＨＱ−５０／ＣＭ−２０アニオン／カチオンイオン交換クロマトグラフィー
）ＨＳ−５０クロマトグラフィー後に得たプールされた画分を、ＣＭ−１緩衝液
で平衡化されたタンデムセットのカラム（ＨＱ−５０カラムの次にＣＭ−２０カ
ラム）上にロードする。ＭＰＩＦ−１Δ２３を、ＣＭ−２０カラムから、ＮａＣ
ｌ（１００〜９００ｍＭ）で溶出する。溶出した画分を、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、ＭＰＩＦ−１Δ２３を含む画分
をプールし、そして限外濾過またはさらなるＨＳ−５０を通す通過により濃縮す
る。
【０９１２】 （サイズ排除クロマトグラフィー）ＣＭ−２０溶出液を、Ｓ−１００緩衝液で
平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ−１００ ＨＲ上にロードする。画分を回収し、
そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣにより分析する。ＭＰＩＦ−１Δ２
３を含む画分をプールし、０．２μｍフィルターを用いて濾過滅菌し、そして２
゜〜１０℃で保存する。
【０９１３】 （バルク物質のための仕様） 表５に列挙する以下の使用が、バルクＭＰＩＦ−１Δ２３について確立された
。
【０９１４】
【表５】 （薬物産物のための仕様） 完成した薬物産物は、表５中のバルク物質について記載されたような仕様のす
べてに合致し、そしてまた滅菌度について試験される（２１ＣＲＦ６１０．１２
）。
【０９１５】 （実施例１５） （ＭＰＩＦ−１Δ２３が仲介するコロニー形成の阻害は、単球中の細胞内Ｃａ 2+ を可動化するＭＰＩＦ−１の能力と相関する） ＭＰＩＦ−１Δ２３は、インビトロ軟寒天アッセイにおけるＬＰＰ−ＣＦＣコ
ロニー形成を阻害し、そしてＴＨＰ−１細胞（ヒト骨髄単球細胞株）を含む単球
内の細胞内カルシウムの可動化を誘導する。両方のアッセイを用いて、精製およ
び安定性研究におけるＭＰＩＦ−１Δ２３の生物学的活性を評価した。ＬＰＰ−
ＣＦＣアッセイでは、新たに単離されたマウス骨髄細胞を、複数のサイトカイン
の存在下（５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬ
Ｍ−ＣＳＦ、および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１α）、軟寒天中のプレートとする
。培養を１４日間インキュベートし、その後、コロニーを倒立顕微鏡を用いて計
数する。
【０９１６】 カルシウム可動化アッセイは、Ｆｕｒａ−２ととも（１００万あたり０．２ｎ
Ｍ）にロードされた新たに単離されたヒト単球またはＴＨＰ−１細胞を用いる。
細胞がＭＰＩＦ−１Δ２３で刺激される場合、Ｃａ2+可動化は蛍光計により評価
される。このＣａ2+可動化アッセイは、ＭＰＩＦ−１Δ２３調製物の活性に関す
る迅速な指標を提供する（表６）。
【０９１７】
【表６】 （処方および貯蔵） バルクＭＰＩＦ−１Δ２３を無菌的に製造し、そして液体処方物は、滅菌、単
回用途の産物である。タンパク質を、５ｍＬのＷｈｅａｔｏｎ Ｔｙｐｅ１ガラ
スバイアル中に満たした５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ
５．８中に緩衝化し、そして２゜〜８℃で貯蔵する。
【０９１８】 （安定性） 安定性研究を、ｐＨ５、６、および７で酢酸ナトリウムを用いて緩衝化した１
．０¸ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を用いて、−８０℃、２゜〜８℃、２
０゜〜２５℃、および２゜〜８℃の温度で実施した。ＭＰＩＦ−１Δ２３は、ｐ
Ｈ５〜７で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭのＮａＣｌの溶液中、２゜
〜８℃でまたはそれ以下で貯蔵されたとき、少なくとも６ケ月間安定であること
が見出された。現在進行中の研究では、サンプルは、先に概観された仕様に合致
するために、外観、タンパク質濃度、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元または非還
元）；逆相およびサイズ排除ＨＰＬＣ）、および活性（Ｃａ2+可動化バイオアッ
セイ）についてアッセイされ得る。
【０９１９】 臨床前毒物学研究で用いられるＭＰＩＦ−１Δ２３バッチ（ＨＧ００３０４−
Ｅ１０）に対する安定性研究が開始された。これらの研究で用いられるＭＰＩＦ
−１Δ２３バッチは、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．
９中、４．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で処方された。貯蔵条件は、６０％の
相対湿度で、−８０℃、２゜〜８℃、２５℃、および３７℃、ならびに７５％の
相対湿度で、４５℃である。安定性研究の継続期間は、２５℃までの温度につい
ては１２ケ月、３７℃で６ケ月、そして４５℃で１ケ月である。安定性は、外観
、ｐＨ、タンパク質濃度、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元または非還元）；逆相
およびサイズ排除ＨＰＬＣ）、および活性（Ｃａ2+可動化バイオアッセイ）につ
いてアッセイされ得る。エンドトキシンアッセイおよび生体負荷試験が選択され
た時点で実施され得る。
【０９２０】 （実施例１６） （ＭＰＩＦ−１は、タキソール誘導細胞傷害性から胃腸管を保護する） ０．３ｍｇ／ｋｇのＭＰＩＦ−１Δ２３（皮下）および１０．５ｍｇ／ｋｇの
タキソール（腹腔内）の、０、１および２日目の同時投与は、ラットを、消化管
の毒性に関連する体重の損失から保護する。０．３ｍｇ／ｋｇのＭＰＩＦ−１Δ
２３で処置したラットは、０、５日目で体重を維持し、そして事実上９日目まで
体重が増えた。
【０９２１】 ０．１ｍｇ／ｋｇのＭＰＩＦ−１Δ２３を受けたラットまたはＭＰＩＦ−１Δ
２３を受けなかったマウスは、０日目と５日目との間で約４５グラム体重が減っ
た。
【０９２２】 パクリタキソール（Ｔａｘｏｌ（登録商標））およびＭＰＩＦ−１Δ２３の両
方を、上記のように０、１および２日目に投与した。−２日目（すなわち、パク
リタキソールおよびＭＰＩＦ−１の最初の投与の２日前）での各グループのラッ
トの個々の体重は、約１８５ｇであった。５日目までに、２つの試験グループ（
パクリタキソールおよびＭＰＩＦΔ２３なしまたは０．１ｍｇ／ｋｇのＭＰＩＦ
Δ２３のいずれかを受けたグループ）における個体は、約１５５ｇの重さであっ
た。対照的に、０．３ｍｇ／ｋｇのＭＰＩＦΔ２３を受けた個体は、約１７５ｇ
の重さであった。コントロールグループ（パクリタキソールもＭＰＩＦΔ２３も
受けていないラット）における個体は、５日目までに約１９５ｇの重さに達した
。パクリタキソールの急性毒性効果から動物を保護するＭＰＩＦ−１の能力は、
この能力が、造血幹細胞に加えて、胃腸管細胞のような多くの細胞型を、毒性因
子から保護することを実証する。
【０９２３】 （実施例１７） （胃腸保護の亜致死性モデル） Ｃ５７Ｂ１／６メスマウス（１２週齢）を、０日目に、４時間離して４．５Ｇ
ｙの等しい２用量で送達した合計９Ｇｙ137セシウム亜致死性照射（用量速度：
２５．５４ｃＧｙ／分）に曝露した。「ＭＰＩＦ−１（前）」と指定されたマウ
スのグループに、ＭＰＩＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤｉ．ｐ．）を連続した４
日にわたって与えた（−２日目〜＋１日目）。「ＭＰＩＦ−１（後）」と指定さ
れたグループに、ＭＰＩＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤｉ．ｐ）を、照射の１日
後（１日目）で始まる連続した７日にわたって与えた。コントロール群は、希釈
剤（ＨＢＳＳ＋０．１％正常マウス血清）のみを受けさせた。全てのマウスを、
照射の７日前に酸性の水に置いた。照射の３日前に、アモキシシリンをこの酸性
の水に加え（０．５ｍｇ／ｍｌ）、そして照射後７日目まで毎日続けた。マウス
を、生存、状態、および体重の変化についてモニターした。データは、実験の開
始の体重のパーセンテージとして示される日の各個々のマウスの体重に基づいて
、各グループの体重の変化のパーセントとして示す。（図３７〜３８を参照のこ
と）。動物を、照射の急性毒性効果から保護するＭＰＩＦ−１の能力は、この能
力が、造血幹細胞に加えて、胃腸管細胞のような多くの細胞型を、細胞傷害性（
ｃｙｔｏｘｉｃ）因子から保護することを実証する。
【０９２４】 （実施例１８） （胃腸保護の致死モデル） Ｃ５７Ｂ１／６メスマウス（１２週齢）を、０日目に、４時間離して５．５Ｇ
ｙの等しい２用量で送達した合計１１Ｇｙ137セシウム致死性照射（用量速度：
２５．５４ｃＧｙ／分）に曝露した。「ＭＰＩＦ−１（前）」と指定されたマウ
スのグループに、ＭＰＩＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤｉ．ｐ．）を連続した４
日にわたって与えた（−２日目〜＋１日目）。「ＭＰＩＦ−１（後）」と指定さ
れたグループに、ＭＰＩＦ−１（１ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤｉ．ｐ）を、照射の１日
後（１日目）で始まる連続した７日にわたって与えた。コントロール群は、希釈
剤（ＨＢＳＳ＋０．１％正常マウス血清）のみを受けさせた。全てのマウスを、
照射の７日前に酸性の水に置いた。照射の３日前に、アモキシシリンをこの酸性
の水に加え（０．５ｍｇ／ｍｌ）、そして照射後７日目まで毎日続けた。マウス
を、生存、状態、および体重の変化についてモニターした。データは、実験の開
始の体重のパーセンテージとして示される日の各個々のマウスの体重に基づいて
、各グループの体重の変化のパーセントとして示す。（図３９〜４０を参照のこ
と）。
【０９２５】 コントロールグループ（ＭＰＩＦ−１を受けない）の全ては、照射の２０日後
に死んだ。対照的に、ＭＰＩＦ−１（後）グループの２５％、およびＭＰＩＦ−
１（前）グループの５７％は、照射の３８日後で生存した。動物を、致死照射か
ら保護するＭＰＩＦ−１の能力は、この能力が、胃腸管細胞のような多くの細胞
型を、細胞傷害性因子から保護することを実証する。
【０９２６】 （実施例１９：細胞保護を決定する方法） 特定の細胞傷害性薬剤を用いてＭＰＩＦ−１の相対的保護能力を決定するため
の１つの方法は、用量減少因子（Ｄｏｓｅ−Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ
）または用量改変因子（Ｄｏｓｅ−Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）（ＤＭ
Ｆ）を評価することである（Ｗｅｉｓｓ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅ
ｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ １０５：１４７３−１４７８（１９９７）．； Ｂｒｏ
ｗｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．３９：１５７−１６８（１９８８）；
Ｙｕｈａｓら、Ｉｎｔ．Ｊ Ｒａｄｉａｔ．ＢｉｏＬ １５：２３３−２３７（
１９７３）； Ｗｅｉｓｓら、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ，Ｄｕｂｏｉｓら編、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１８３−１９９頁（１９９５））。
【０９２７】 例えば、マウスを、ＭＰＩＦ−１と伴ってかまたは伴わないで、ある用量の範
囲で照射する。ＭＰＩＦ−１による胃腸管の保護は、比較的高用量の全身照射の
後の６〜７日間の生存についてＤＭＦによって測定する。３０日間の生存につい
てのＤＭＦは、造血系のＭＰＩＦ−１による保護を測定する。
【０９２８】 （実施例２０：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的なアプローチを使用して、Ｎ末端またはＣ末端欠失ＭＰＩＦ−１
欠失変異体をクローニングし得る。一般には、約１５〜２５ヌクレオチドの２つ
のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１または６のポリヌクレオチドの
所望の５’位および３’位に由来する。プライマーの５’位および３’位は、所
望のＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドフラグメントに基づいて決定される。必要な
場合は、開始コドンおよび終止コドンを５’プライマーおよび３’プライマーに
それぞれ付加し、ポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるＭＰＩＦ
−１ポリペプチドフラグメントを発現する。好ましいＭＰＩＦ−１ポリヌクレオ
チドフラグメントは、明細書の「MPIF-1ポリペプチド」の節において上記にで開
示されるＮ末端およびＣ末端欠失変異体をコードするフラグメントである。
【０９２９】 所望のベクターにおけるＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドフラグメントのクロー
ニングを促進するための制限部位を含むさらなるヌクレオチドもまた、５’およ
び３’プライマー配列に付加され得る。ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドフラグメ
ントは、本明細書中で議論されるかまたは当該分野において公知の適切なＰＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマーおよび条件を用いて、ゲノムＤＮＡから、または
寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅される。本発明のＭＰＩＦ−１ポリヌクレ
オチドフラグメントによってコードされるＭＰＩＦ−１ポリペプチドフラグメン
トは、全長ポリペプチドと同じ一般的な様式で発現および精製され得るが、慣用
的な改変が、特定のフラグメントと全長ポリペプチドとの間の化学的特性および
物理的特性における差異に起因して必要であり得る。
【０９３０】 本発明の限定ではなく例示の手段として、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドフラグメ
ントＲ−４６〜Ｎ−１２０をコードするポリヌクレオチドは、以下のように増幅
およびクローニングされる：Ｒ−４６で開始するポリペプチドフラグメントのＮ
末端部分をコードするポリヌクレオチド配列をインフレームに、制限酵素部位、
続いて開始コドンを含む５’プライマーを生成する。Ｎ−１２０で終結するＭＰ
ＩＦ−１ポリペプチドフラグメントのＣ末端部分をコードするポリヌクレオチド
配列をインフレームに、制限酵素部位、続いて終止コドンを含む相補的３’プラ
イマーを生成する。
【０９３１】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、プライマー中
の部位を認識する制限酵素で消化する。次いで、消化したポリヌクレオチドをと
もに連結する。ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドフラグメントを、制限発現ベクタ
ーに、好ましくはＭＰＩＦ−１ポリペプチドフラグメントコード領域をプロモー
ターから下流に配置する様式で挿入する。連結混合物を、標準的な手順を用いて
、本明細書中の実施例に記載されるように、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形
質転換する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローニング
されたＤＮＡのアイデンティティを制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によ
って確認する。
【０９３２】 （実施例２１：ＭＰＩＦ−１のタンパク質融合物） ＭＰＩＦ−１ポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。こ
れらの融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例えば、ＭＰＩＦ
−１ポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、
およびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参
照のこと；ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３３１：８４−８６（１９８８）もまた参照のこと）。同様に、ＩｇＧ−１、
ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。
ＭＰＩＦ−１ポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の
細胞内局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマー
は、融合タンパク質の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、
１つより多い機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は
、非融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性
を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分
子への融合を概説する以下のプロトコル、または実施例２に記載されるプロトコ
ルを改変することによって作製され得る。
【０９３３】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および３’
末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニングを
容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０９３４】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）が使用される場合、ヒトＦｃ部
分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが
、ＢａｍＨＩによって再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記
載するＰＣＲプロトコルによって単離されたＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドが、
このＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドは、終止コドンなしに
クローン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意す
ること。
【０９３５】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、このベクターは、異種シグナル配列を含
むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０９３６】
【化２９】 さらに、ＭＰＩＦ−１の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、
フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、
部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施態様におい
て、この異種分子は、ケモカインファミリーのメンバーである。さらに好ましい
実施態様において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）
、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ
）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β
、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｂ
ＭＰ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａ
ｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄｏｒ
ｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒ
ビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および
神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０９３７】 （実施例２２：抗体の産生） ハイブリドーマ技術 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例は、ＭＰＩ
Ｆ−１を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するため
に動物に投与される。好ましい方法において、ＭＰＩＦ−１タンパク質の調製物
が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる
。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、このよ
うな調製物は、動物に導入される。
【０９３８】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような
手順は、動物（好ましくは、マウス）をＭＰＩＦ−１ポリぺプチドで免疫するこ
と、またはより好ましくは、分泌ＭＰＩＦ−１ポリぺプチド発現細胞で免疫する
ことを含む。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得
る；しかし、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約
１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１
００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地に
おいて細胞を培養することが好ましい。
【０９３９】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２（１９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、次いでＭＰＩＦ−
１ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイ
される。
【０９４０】 あるいは、ＭＰＩＦ−１ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディ
オタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法
は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ること
が可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体
を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物
の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリド
ーマ細胞は、ＭＰＩＦ−１タンパク質特異的抗体に結合する能力がＭＰＩＦ−１
によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニ
ングされる。このような抗体は、ＭＰＩＦ−１タンパク質特異的抗体に対する抗
イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＭＰＩＦ−１タンパ
ク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【０９４１】 本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌型ＭＰＩ
Ｆ−１タンパク質結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用により、または
合成化学により産生され得る。
【０９４２】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（
１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；
Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、
ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１
；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０９４３】 （ｓｃＦｖｓのライブラリーからのＭＰＩＦ−１に対する抗体フラグメントの
単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝露されていて
もよいし、曝露されていなくてもよいＭＰＩＦ−１に対する反応性を含む抗体フ
ラグメントの大きいライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，
７９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０９４４】 （ライブラリーのレスキュー） ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓ
のライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキュー
するため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍ
ｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．
Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ
−ＧＬＵを接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）し、２×１０8ＴＵのΔ遺伝子３ヘル
パー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、
そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しな
がら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．
ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／
ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し
、そして一晩増殖させる。ファージをＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製
する。
【０９４５】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４０００
ｒｅｖｓ／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ
）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファ
ージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培
地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフ
ィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１
０13形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０９４６】 （ライブラリーパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し、
そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさ
らに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で
１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン
を添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを溶
出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４
で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間
インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースお
よび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレートする
。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファ
ージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、この
プロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目および４回目
にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、そしてＰＢＳ
で２０回に増加する。
【０９４７】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ピコグラム／ｍｌのいずれかで被膜したマイ
クロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クロ
ーンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照
のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。
【０９４８】 （実施例２３：ＭＰＩＦ−１のレベルの低下を処置する方法） 本発明は、本発明のアゴニスト（本発明のポリペプチドを含む）の治療的有効
量を含む組成物を、体内において増加したレベルの本発明のポリペプチドを必要
とする個体に投与する工程を包含する、このような個体を処置する方法に関する
。さらに、個体におけるＭＰＩＦ−１の標準的な発現レベルまたは正常な発現レ
ベルの低下により引き起こされる状態は、好ましくは、分泌形態で、ＭＰＩＦ−
１を投与することによって処置され得ることが理解される。従って、本発明はま
た、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドのレベルの増加の必要な個体の処置方法を提供し
、これは、このような個体におけるＭＰＩＦ−１の活性レベルを増加させるため
のＭＰＩＦ−１の量を含む治療薬をこのような個体に投与する工程を包含する。
【０９４９】 例えば、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドのレベルの低下を有する患者は、連続６日
間、０．１〜１００ μｇ／ｋｇ用量のこのポリペプチドを毎日受ける。好まし
くは、このポリペプチドは、分泌形態で存在する。投与および処方に基づいた、
投与スキームの正確な詳細を、本明細書中の節「薬学的組成物」に提供する。
【０９５０】 （実施例２４：ＭＰＩＦ−１のレベルの上昇を処置するための方法） 本発明は、本発明のアンタゴニスト（本発明のポリペプチドを含む）の治療的
有効量を含む組成物を、体内において増加したレベルの本発明のポリペプチドを
必要とする個体に投与する工程を包含する、このような個体を処置する方法に関
する。
【０９５１】 １つの例では、アンチセンス技術をＭＰＩＦ−１の産生を阻害するために使用
する。この技術は、種々の病因に起因する、ＭＰＩＦ−１ポリペプチド（好まし
くは分泌形態）のレベルの低下させる方法の１つの例である。
【０９５２】 例えば、ＭＰＩＦ−１の異常なレベル上昇を有すると診断された患者にアンチ
センスポリヌクレオチドを０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／
ｋｇ 日で２１日間、静脈投与する。この処置が十分に寛容な場合、この処置を
残り７日間の休薬期間の後、繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチドの処方を
、本明細書中の節「薬学的組成物」に提供する。。
【０９５３】 （実施例２５：遺伝子治療を使用した処置方法−エキソビボ） 本発明は、本発明のアゴニスト（本発明のポリペプチドを含む）の治療的有効
量を含む組成物を、体内において増加したレベルの本発明のポリペプチドを必要
とする個体に投与する工程を包含する、このような個体を処置する方法に関する
。
【０９５４】 遺伝子治療の１つの方法は、線維芽細胞を患者に移植し、これは、ＭＰＩＦ−
１ポリペプチドを発現し得る。一般に、線維芽細胞を皮膚生検によって被験体か
ら得る。得た組織を組織培養培地に置床し、そして小片に分離する。この組織の
小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に置き、約１０個の小片を各フラスコに置
床する。このフラスコを倒置し、きつく栓をし、そして室温で一晩放置する。室
温で２４時間後、このフラスコを反転し、そして組織塊をこのフラスコの底に固
着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％ ＦＢＳ、ペニシリンおよ
びストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２ 培地）を加える。次いでフラ
スコを３７℃で約１週間、インキュベートする。この時点で、新鮮培地を添加し
、引き続いて数日毎に交換する。さらなる２週間の培養の後、線維芽細胞の単層
が出現する。この単層をトリプシン処理し、そしてより大きいフラスコに拡大す
る。
【０９５５】 モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接する、ｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓ
ｃｈｍｅｉｅｒ、Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ ７：２１９−２５（１９８８））をＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、引き続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処
理する。この直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズ
を用いて精製する。
【０９５６】 ＭＰＩＦ−１をコードするｃＤＮＡをＰＣＲプライマーを用いて増幅し得、こ
のプライマーは、実施例１に示されるように、５’および３’末端配列にそれぞ
れ対応する。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３
’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイル
スの直鎖状骨格ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で共に加える。生じた混合物を２つのフラグメ
ントの連結に適切な条件下で維持する。次いで、この連結物混合物を細菌ＨＢ１
０１を形質転換するために使用し、次いでこの細菌をベクターが適切に挿入され
たＭＰＩＦ−１を含むことを確認する目的で、カナマイシンを含有する寒天上に
プレーティングする。
【０９５７】 両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を１０％ 仔ウ
シ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）においてコンフルエントな密度まで組織培養物中で増
殖させる。次いで、ＭＰＩＦ−１遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、
そしてパッケージング細胞をこのベクターで形質導入する。このパッケージング
細胞は、現在、ＭＰＩＦ−１遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（この
パッケージング細胞を現在プロデューサー細胞という）。
【０９５８】 新鮮な培地を形質導入したプロデューサー細胞に添加し、引き続いて培地をコ
ンフルエントなプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから収穫する。感染性ウ
イルス粒子含む使用済み培地をミリポアーフィルターを通してろ過し、付着した
プロデューサー細胞を除去する。次いで、この培地を使用し、線維芽細胞を感染
させる。培地をサブコンフルエントな線維芽細胞プレートから除去し、そしてプ
ロデューサー細胞からの培地に迅速に置換する。この培地を除去し、そして新鮮
な培地に置換する。ウイルスの力価が高い場合、次いで実質的に、全ての線維芽
細胞は感染され、選択は全く必要ない。力価が大変低い場合、次いで選択マーカ
ー（例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用する
必要がある。一旦、線維芽細胞を効率的に感染させると、この線維芽細胞を分析
し、ＭＰＩＦ−１タンパク質を産生しているかどうか決定する。
【０９５９】 次いで、操作された線維芽細胞を単独またはサイトデックス３ミクロキャリア
ビーズ上でコンフルエントまで増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する。
【０９６０】 （実施例２６：内因性ＭＰＩＦ−１遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性ＭＰＩＦ−１配列を、例えば、
米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日発行）；国際公開第Ｗ
Ｏ ９６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；国際公開第ＷＯ ９４
／１２６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；お
よびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）
に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結合する工
程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中で発現さ
れないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を包
含する。
【０９６１】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ＭＰＩＦ−１の５’非コード配
列と相同である。この標的化配列は、ＭＰＩＦ−１の５’末端に十分に近く、そ
の結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連
結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る
。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に異な
る制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅した
プロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の
５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限酵素部位を含む。
【０９６２】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。
【０９６３】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともにも投与し得る。送達のためのこのよ
うな方法は、当該分野で公知である。
【０９６４】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが、このプロモーターで生
じて、この内因性ＭＰＩＦ−１配列に作動可能に連結される。これは、この細胞
中におけるＭＰＩＦ−１の発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野
で公知の他の任意の方法により、検出され得る。
【０９６５】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。
【０９６６】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ＭＰＩＦ−１遺
伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８
（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消
化する。５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を有するＣＭ
Ｖプロモーターを、ＰＣＲにより増幅する。２つのＭＰＩＦ−１非コード配列を
ＰＣＲを介して増幅する：５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂ
ａＩ部位を有する一方のＭＰＩＦ−１非コード配列（ＭＰＩＦ−１フラグメント
１）を、増幅する；５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ
部位を有する他方のＭＰＩＦ−１非コード配列（ＭＰＩＦ−１フラグメント２）
を、増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびＭＰＩＦ−１フラグメント（１お
よび２）を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；Ｍ
ＰＩＦ−１フラグメント１−ＸｂａＩ；ＭＰＩＦ−１フラグメント２−ＢａｍＨ
Ｉ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
【０９６７】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合は劇的に増加する。これらのパラメーターを考慮すると、パルス時間約１４〜
２０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【０９６８】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。
【０９６９】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。
【０９７０】 （実施例２７：遺伝子治療を使用した処置の方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置するためにインビボで遺伝
子治療方法を使用する工程である。遺伝子治療方法は、ＭＰＩＦ−１ポリペプチ
ドの発現を増加または減少させるための、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアン
チセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）ＭＰＩＦ−１配列の動物への導入に
関する。ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドを標的組織によるＭＰＩＦ−１ポリペプ
チドの発現に必要なプロモーターまたは他の任意の遺伝的エレメントと作動可能
に連結し得る。このような遺伝子治療および送達技術ならびに方法は、当該分野
で公知である（例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特
許第５，６９３，６２２号、同第５，７０５，１５１号、同第５，５８０，８５
９号；Ｔａｂａｔａ Ｈら、（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５
（３）：４７０−４７９、Ｃｈａｏ、Ｊら、（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２、Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅ
ｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒ
ｔｚ、Ｂ．ら、（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１、
Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）
：３２８１−３２９０を参照のこと（本明細書中に参考として援用される））。
【０９７１】 ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド構築物は、動物の細胞に注入物質を送達する任
意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間へ
の注入）によって送達され得る。ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド構築物を薬学的
に受容可能な液体または水性キャリアにおいて送達し得る。
【０９７２】 用語「裸の」ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とは、ウイルス性の配
列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチンまたは沈降剤などを含む
、細胞中への侵入を補助、促進または容易にするために作用する任意の送達ビヒ
クルから遊離した配列のことをいう。しかし、ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドも
また、リポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａ
ｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａ
ｈ Ｂ．ら、（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（１）：１−７において教
示される処方物）で送達し得、これは、当業者に周知の方法によって調製され得
る。
【０９７３】 遺伝子治療方法において使用されるＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドベクター構
築物は、好ましくは、宿主ゲノム内に組み込まれもしないし、それらが複製を可
能とする配列を含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモータ
ーをＤＮＡの発現を駆動するために使用し得る。他の遺伝子治療技術とは異なり
、標的細胞に裸の核酸配列を導入する１つの大きな利点は、細胞におけるポリヌ
クレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞
内に導入され、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ること
が示されている。 ＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド構築物を動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織を含む）の間隙
空間に送達し得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維間のムコ
多糖類マトリックス、管または室の壁における弾性線維、線維組織のコラーゲン
線維あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔におけるその同じマトリッ
クスを含む。組織の間隙空間は同様に、循環中の血漿およびリンパチャネルのリ
ンパ液で占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に議論さ
れる理由のため好ましい。ポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織
中への注入によって都合よく送達され得る。ポリヌクレオチド構築物は、好まし
くは分化した非分割細胞に送達され、そして持続して発現されるが、送達および
発現は、例えば血液幹細胞または皮膚線維芽細胞のような非分化細胞または完全
には分化していない細胞中で達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポリヌク
レオチドを吸収し、そして発現するそれらの能力において特に適している。 裸のＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチド注入のために、有効なＤＮＡまたはＲＮＡの
投与量は、約０．０５ｇ/ｋｇ体重〜約５０ｍｇ/ｋｇ体重の範囲に存在する。好
ましくは、この投与量は、約０．００５ｍｇ/ｋｇ〜約２０ｍｇ/ｋｇであり、そ
してより好ましくは約０．０５ｍｇ/ｋｇ〜約５ｍｇ/ｋｇである。もちろん、当
業者が理解するように、この投与量は、注入する組織部位によって異なる。適切
かつ有効な核酸配列の投与量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置
されている条件および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙
空間中への非経口の注入経路によってである。しかし、他の非経口経路（例えば
、特に肺組織または気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾ
ル処方物の吸入）もまた使用され得る。さらに裸のＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチ
ド構築物をその手順で使用されるカテーテルによる血管形成中の動脈に送達し得
る。 インビボで筋肉中に注入したＭＰＩＦ−１ポリヌクレオチドの用量応答効果を以
下のように決定する。ＭＰＩＦ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成の
ための適切なＭＰＩＦ−１鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って
調製する。この鋳型ＤＮＡ（これは、環状かもしくは直鎖状のいずれかであり得
る）を、裸のＤＮＡまたはリポソームで複合体化したＤＮＡのいずれかとして使
用する。次いで、マウスの四頭筋に種々の量の鋳型ＤＮＡを注射する。 ５〜６週令の雌および雄Ｂａｌｂ/Ｃマウスを０．３ｍｌの２．５％アベルチン
（Ａｖｅｒｉｎ）で腹腔内注射によって麻酔する。１．５ｃｍの切開を前大腿（
ａｎｔｅｒｉｏｒ ｔｈｉｇｈ）上に作製し、そして四頭筋を直接可視化する。
ＭＰＩＦ−１鋳型ＤＮＡを０．１ｍｌのキャリア中で、膝中の筋肉の遠位（末端
）の挿入部位から約０．５ｃｍおよび深さ約０．２ｃｍにおいて、１分間にわた
って２７番径の針を通して１ｃｃのシリンジで注入する。縫合を将来の局在化の
ための注入部位にわたって配置し、そしてその皮膚をステンレススティールクリ
ップでふさぐ。 適切なインキュベーション時間（例えば、７日間）後、筋肉抽出物を完全な四頭
筋を切除することによって調製する。個々の四頭筋の１５μｍの断面を、５断面
ごとにＭＰＩＦ−１タンパク質発現のために組織学的に染色する。ＭＰＩＦ−１
タンパク質発現の時間経過を、異なったマウス由来の四頭筋を異なった時間に収
穫することを除いて、同様の様式で行い得る。注入後の筋肉中でのＭＰＩＦ−１
ＤＮＡの持続性を、全細胞ＤＮＡならびに注入されたマウスおよびコントロー
ルマウス由来のＨＩＲＴ上清を調製後、サザンブロット分析によって決定し得る
。マウスにおける上記の実験の結果を使用し、ＭＰＩＦ−１の裸のＤＮＡを使用
する、ヒトおよび他の動物における適切な投与量ならびに他の処置パラメーター
を推定し得る。
【０９７４】 （実施例２８：ＭＰＩＦ−１トランスジェニック動物） ＭＰＩＦ−１ポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され
得る。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍ
ｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒ
ヒ、サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は
、トランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態にお
いて、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺
伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現の
ために用いられる。当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本
発明のポリヌクレオチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の
創始系統（ｆｏｕｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核
マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３
）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４
（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８
９））；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔ
ｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−
６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（
Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞ま
たは胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌ
クレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５
（１９９３）を参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞
への核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに精子媒介
遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８
９））；などを含むがこれらに限定されない。このような技術の総説については
、本明細書中にその全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７
１−２２９（１９８９）を参照のこと。
【０９７５】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。
【０９７６】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。
【０９７７】 手短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同
ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換え
を介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列
の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞
型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型にお
いてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要と
される調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明ら
かである。この節に列挙されている文献の各々の内容は、本明細書中でその全体
が参考として援用される。
【０９７８】 同様に、全長ＭＰＩＦ−１タンパク質をコードするＤＮＡはまた、以下のプラ
イマーを用いて組織特異的発現のためのベクターに挿入され得る。
【０９７９】 トランスジェニック動物において遍在的な様式または組織特異的様式での本発
明のペプチドを発現することに加えて、このポリペプチドの発現を種々の他の方
法によって調節する（例えば、発生的に調節された発現または化学的に調節され
た発現）構築物を産生することもまた、当業者にとって慣用的である。
【０９８０】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【０９８１】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。
【０９８２】 本発明のトランスジェニック動物は、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドの生物学的機
能の詳述、異常なＭＰＩＦ−１発現に関連する状態および／または障害の研究、
ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのス
クリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する
。
【０９８３】 （実施例２９：ＭＰＩＦ−１ ノックアウト動物） 内因性ＭＰＩＦ−１遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用してＭ
ＰＩＦ−１遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノック
アウトする」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃ
ｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃ
ｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明
細書中でその全体が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド
配列（この遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに
隣接される、本発明の変異体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連
のないＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを
用いてまたは用いずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞
をトランスフェクトし得る。別の実施態様において、当該分野で公知の技術を、
目的の遺伝子を含むが、発現しない細胞中でノックアウトを生じるために使用す
る。標的化された相同組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化され
た遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改
変が不活性な標的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され
得る研究および農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃ
ｃｈｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。し
かし、このアプローチは、当業者に明白な、適切なウイルスベクターを使用して
、組換えＤＮＡ構築物がインビボで要求された部位に直接投与され、または標的
化される場合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。
【０９８４】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作される細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドの発
現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ま
しくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者
中へ全身的に導入し得る。
【０９８５】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る；遺伝
子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る（
例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕｌ
ｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと
。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される））。
【０９８６】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞を被包性の形態で導入し得、構成成分と隣接した細胞外
環境との交換が可能である間は、導入細胞が宿主免疫系によって認識され得ない
。
【０９８７】 本発明のノックアウト動物は、ＭＰＩＦ−１ポリペプチドの生物学的機能の詳
述、異常なＭＰＩＦ−１発現に関連する状態および／または障害の研究、ならび
にこのような状態および／または障害を寛解させる場合に有効な化合物のスクリ
ーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それらに限定されない用途を有
する。
【０９８８】 （実施例３０） （抗体の産生） （ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、本
発明のポリぺプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、本発明のポリぺプチ
ドの調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよ
うにされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するため
に、このような調製物は、動物に導入される。
【０９８９】 本発明のポリぺプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９
５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（
１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９
７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ
．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は、
本発明のポリペプチドで、またはより好ましくは分泌ポリペプチド発現細胞で免
疫される。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な組織培養培地にお
いて、好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そし
て約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および
約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培
地において培養される。
【０９９０】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、本発明のポリぺプ
チドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０９９１】 あるいは、本発明のポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、
抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可
能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使
用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾
細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ
細胞は、抗体のタンパク質特異的抗体に結合する能力が本発明のポリぺプチドに
よってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニン
グされる。このような抗体は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ
抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導
するために使用される。
【０９９２】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして本明細書中に議論
される（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０
２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６
）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６
７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと
）。
【０９９３】 （ｓｃＦｖｓのライブラリーからのポリぺプチドに対して指向される抗体フラ
グメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかま
たは曝され得なかった本発明のポリぺプチドに対する反応性を含む抗体フラグメ
ントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（そ
の全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０９９４】 （ライブラリーのレスキュー） ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡから
ｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージを
レスキューするため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用い
て、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に接種し、そして振盪しながら０
．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×Ｔ
Ｙ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）し、２×１０8ＴＵのΔ遺
伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参
照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベー
トし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を
１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２
×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含
有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２
／０１０４７に記載のように調製する。
【０９９５】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ
．ｐ．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３
００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ
粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地か
ら精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィル
ター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13 形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０９９６】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し、
そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間インキュベート
し、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエ
チルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりフ
ァージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃
で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数
増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グ
ルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプ
レートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘ
ルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次
いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目お
よび４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、そ
してＰＢＳで２０回に増加させた。
【０９９７】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタ
イタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンを
ＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０１０４７を
参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。これらのＥＬＩ
ＳＡ陽性クローンはまた、当該分野において公知の技術（例えば、エピトープマ
ッピング、結合親和性、レセプターシグナル伝達、抗体／抗原結合をブロックす
るかまたは拮抗的に阻害する能力、および競合的アゴニスト活性または拮抗的ア
ンタゴニスト活性など）によりさらに特徴付けられ得る。
【０９９８】 （実施例３１） （致死照射モデル） 実施例１８における実験プロトコールの略図を、図４１に示す。図４２に示さ
れるように、ＭＰＩＦ−１（Δ２３）は、致死的に照射されたマウスの生存を増
強する。生存を増強するＭＰＩＦの能力は、実験条件によって変化する。
【０９９９】 本実施例で示される研究は、ＭＰＩＦ−１（Δ２３）の活性を試験した。しか
し、当業者は、全長ＭＰＩＦ−１、またはそのフラグメント、ならびにＭＰＩＦ
−１のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療を介して）、アゴニスト、および
／またはアンタゴニストの活性を試験するために例示された研究を容易に改変し
得る。
【１０００】 （実施例３２） （照射からのインビボ骨髄保護） ＭＰＩＦ−１が致死的照射後にマウスの生存を増加することを示す実験（実施
例１８を参照のこと）は、このケモカインが照射保護因子として作用することを
示唆する。この活性をさらに調査するために、骨髄前駆体レベルにおける変化を
、ほとんど致死的に照射されたマウスにおいて試験し、ＭＰＩＦ−１が照射後に
これらの前駆体の回復を改善するか否かを決定した。
【１００１】 実験プロトコールの模式図を、図４３に示す。これは、実施例１７のプロトコ
ールの改変である。使用したＭＰＩＦ−１は、ＭＰＩＦ−１（Δ２３）バッチＨ
Ｇ００３０４−Ｅ１１であった。ネガティブコントロール群（ＩＲＲ）は、マウ
スが照射の前後に２４時間睡眠をとった以外は、−３日〜＋３日にビヒクルのみ
（ＨＢＳＳ＋０．１％正常マウス血清、腹腔内）をうけた。骨髄分析における比
較のために、コントロール群（正常）マウスは、照射を受けなかった。
【１００２】 （骨髄細胞の分析） 各群からのマウスを、４、１４、２１、および３８日目に屠殺し、そして骨髄
（ＢＭ）サンプルを採った。軟寒天におけるコロニー形成アッセイを使用して、
骨髄前駆体の数（骨髄からのコロニー形成単位（ＣＦＵ）−ｃおよびＣＦＵ−顆
粒球赤芽球巨核球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ））を決定した。例えば、
Ｇｒｚｅｇｏｒｚｅｗｓｋｉら、Ｂｌｏｏｄ １８３：３７７（１９９４）；お
よびＭｅｔｃａｌｆ、Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓ
ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔ
ｈｅｒｌａｎｄｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８４）２７頁を参照のこと。細胞を
、組換えヒトエリスロポイエチン（ｒｈＥｐｏ）（８Ｕ／ｍｌ）および組換えマ
ウスインターロイキン−３（ｒｍＩＬ−３）（１００Ｕ／ｍｌ）と共に単層寒天
ベースのアッセイ系を用いて培養した。顆粒球系統、赤芽球系統、巨核球系統、
およびマクロファージ系統を含む多能性コロニーを、ＣＦＵ−ＧＥＭＭとしてス
コア付けし、一方、単球（ＣＦＵ−Ｍ）前駆細胞、顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ）前駆細
胞、赤血球（ＣＦＵ−Ｅおよびバースト形成単位（ＢＦＵ）−Ｅの両方）前駆細
胞または顆粒球／単球（ＣＦＵ−ＧＭ）前駆細胞を含む単一系統コロニーを、Ｃ
ＦＵ−ｃと呼ぶ。ＣＦＵ−ＧＥＭＭアッセイによって、骨髄中の多能性前駆細胞
の回復に関する情報が提供され、一方、ＣＦＵ−ｃアッセイによって、各骨髄系
統のより運命付けられた前駆体の回復に関する情報を提供する。図４４〜４５に
示されるように、ＭＰＩＦ−１投与は、成熟および未成熟な骨髄前駆体のレベル
に有意な増加を引き起こした。
【１００３】 本実施例で記載される研究は、ＭＰＩＦ−１（Δ２３）の活性を試験した。し
かし、当業者は、全長ＭＰＩＦ−１、またはそのフラグメント、ならびにＭＰＩ
Ｆ−１のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療を介して）、アゴニスト、およ
び／またはアンタゴニストの活性を試験するために例示された研究を容易に改変
し得る。
【１００４】 （実施例３３） （ＭＰＩＦの物理的特徴、化学特徴、および薬学的特徴） （投薬量形態、薬理学的クラス、および投与） 骨髄前駆体阻害因子は、短縮型（８．８５ｋＤａ）組換えヒトタンパク質β−
ケモカインである。ＭＰＩＦを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そして均質に精製
した。
【１００５】 ＭＰＩＦを、注射が意図される滅菌の無色溶液として提供する。ＭＰＩＦを、
酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを用いてｐＨ６．０±０．２に緩衝化され
た変動する濃度（２〜８ｍｇ／ｍＬ）のＭＰＩＦを含む滅菌溶液として処方する
。この溶液を、１型の単一使用のガラスバイアルに満たす。生物活性の保持は、
２°〜８℃で少なくとも１年間示されている。ＭＰＩＦは、静脈内投与される。
【１００６】 ＭＰＩＦタンパク質は、７７アミノ酸からなる（Δ２３およびＮ末端メチオニ
ン残基）そして、８．８５ｋＤａの分子量を有する。
【１００７】 （製造仕様の一般的な説明） ＭＰＩＦを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現させ、そこから精製
する。このＭＰＩＦタンパク質は、封入体と通常呼ばれるタンパク質構造内に存
在する。これらの封入体の天然の不溶性は、タンパク質の可溶化の前に、夾雑す
るＥ．ｃｏｌｉ成分を除去する精製プロセスを可能にする。
【１００８】 クロマトグラフィー方法およおび濾過方法を使用して、ＭＰＩＦタンパク質を
単離、精製する。この単離工程および精製工程を以下のようにモニターする： −クロマトグラフィーカラムから溶出された中間体産物の分解プロファイルを、
２８０ｎｍの紫外線吸収によって連続的にモニターする。 −異なる段階の精製においてＭＰＩＦタンパク質の純度および内容を、分析ＲＰ
−ＨＰＬＣによって決定する。
【１００９】 分析方法を使用して、ＭＰＩＦの濃度、純度、および同一性を決定し、そして
潜在的な夾雑物（例えば、ＤＮＡ、エンドトキシン、および微生物的生物荷重（
ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ））を検出する。
【１０１０】 （品質管理（クオリティコントロール） ＭＰＩＦ薬品は、清澄な無色の溶液である。単一バンドを、還元状態および非
還元状態の両方の下でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、続く、クマシーブルー染色において観察する。単一
ピークを、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）におい
て溶出する。２つのマイナーなピークを伴う主要なピーク（≧９０％）を、逆相
高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって観察する。マイナー
なピークの両方は、同じ分子量を有し、そしてＭＰＩＦの主要なピークに対して
同じＮ末端配列（エドマン分解）を有する。種々のロットのＭＩＰＦからのトリ
プシン消化によるペプチドマッピングによって、さらに特徴付けられるプロセス
中のペプチドが同じ数であることを一貫して示す。質量分析計によって決定され
たＭＰＩＦの分子量は、８．８５ｋＤａである。
【１０１１】 ２つのバイオアッセイを使用して、ＭＰＩＦの活性を決定する。ＴＨＰ−１ヒ
ト骨髄腫瘍細胞におけるカルシウム流動アッセイは、ＭＰＩＦのその公知のレセ
プター（ＣＣＲ１）のみへの結合のすぐの結果を測定する。化学保護アッセイは
、５−ＦＵの細胞傷害性効果からマウス骨髄前駆体を保護するための化合物の能
力を評価するための手段を提供する。
【１０１２】 本実施例で記載される研究は、ＭＰＩＦ−１（Δ２３）の活性を試験した。し
かし、当業者は、全長ＭＰＩＦ−１、またはそのフラグメント、ならびにＭＰＩ
Ｆ−１のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療を介して）、アゴニスト、およ
び／またはアンタゴニストの活性を試験するために例示された研究を容易に改変
し得る。
【１０１３】 （実施例３４） （非臨床研究） （序文および要旨） 骨髄抑制は、細胞傷害性化学療法の最も一般的な用量制限毒性のうちの１つで
ある。この抑制は、骨髄中の骨髄前駆体の損失から生じ、そして重篤な場合、出
血性合併症および感染性合併症の危険性を増加する。骨髄前駆体阻害因子（ＭＰ
ＩＦ）は、化学保護剤として開発されている。ＭＰＩＦは、ヒトβケモカインと
して特徴付けられている。ケモカイン（走化性サイトカイン）は、損傷、感染、
または免疫系の活性化に応答して種々の細胞型によって分泌される可溶性タンパ
ク質である。これらのタンパク質は、配列相同性によって構造的に関連し、そし
て白血球集団の間で走化性応答を誘導するその能力によって機能的に関連付けら
れる。
【１０１４】 骨髄前駆細胞に対するＭＰＩＦの生物学的効果によって、このケモカインを全
ての公知のケモカインおよびサイトカインと区別する（Ｐｒｅｍａｃｋ，Ｂ．Ａ
．およびＳｃｈａｌｌ，Ｕ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ２（１１）：１１７４−
１１７８（１９９６）；Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｊ．、Ｂｌｏｏｄ ９０（３）：
９０９−９２８（１９９７））。非臨床研究によって、この新規ケモカインが前
駆細胞の増殖および／または分化を制限し、それによって、これらの細胞を化学
治療剤の細胞傷害性効果から保護することが示される（Ｐａｔｅｌら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ Ｍｅｄ １８５：１１６３（１９９７））。ＭＰＩＦは、骨髄からの低い増
殖ポテンシャルのコロニー形成細胞（ＬＰＰ−ＣＦＣ）の強力なインビトロ阻害
を示す。ＬＰＰ−ＣＦＣは、多能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）造血前駆体であ
り、これは、顆粒球系統および単球系統を生じる。ＭＰＩＦはまた、マウス幹細
胞に誘導される顆粒球コロニー形成細胞および単球コロニー形成細胞によるコロ
ニー形成を可逆性に阻害する。化学保護実験によって、ＭＰＩＦが、代謝拮抗物
質（５−ＦＵ、ＡＲＡ−Ｃ）、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼＩインヒビタ
ー、およびタキサン（ｔａｘａｎｅ）の細胞傷害性効果からこれらの造血前駆体
を保護することがインビトロで示されている。
【１０１５】 ＭＰＩＦは、化学療法の各サイクルの直前に投与される場合、インビボで骨髄
前駆細胞を保護する。ＭＰＩＦを用いた処理はまた、インビボ化学治療モデルに
おいて、コントロールよりも、骨髄前駆細胞ならびに好中球および血小板の末梢
細胞集団の両方のより速い回復を引き起こす。インビトロ研究からの結果と組み
合わせて、これらの結果は、化学療法に誘導される骨髄抑制からの造血前駆細胞
の保護物質としての、ＭＰＩＦの潜在的な臨床適用を示す。
【１０１６】 前駆体プールが最も大きい場合、化学療法の最初にＭＰＩＦを用いた治療の開
始は、化学療法の後のサイクルの間に前駆体プールの保存を引き起こし得る。臨
床で一旦確認されると、この結果は、化学療法の繰り返した単位後の前駆細胞貯
蔵の進行性損失を回避し得ない増殖因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ
−ＣＳＦ）または顆粒球および単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））を用い
て達成され得ることに対する進歩を示す。さらに、複数サイクルの化学療法後の
ＭＰＩＦを用いた介入は、減少した前駆細胞貯蔵の徴候を有する患者でさえ、好
中球減少症および血小板減少症からの回復を補助する際に有用である。
【１０１７】 フェーズＩプラシーボ制御された、用量エスカレーション研究を、反復した用
量をうける（ｎ＝６）健康なボランティア（ｎ＝２５）に実行した。投薬は、マ
ウスにおいて最適な保護用量よりも２ｌｏｇ下であると算出されたレベルで開始
し、１００μｇ／ｋｇの用量に上昇させ、これは、末梢毒性研究における検出可
能な有害効果を産生しない最も高い用量の１より大きいｌｏｇ下である。健康な
ボランティアを、６日間、毎日０．１、１、１０、３０、および１００μｇ／ｋ
ｇで処置した。６人の患者のコホート（５人は、ＭＰＩＦをうけ、そして１人は
プラシーボをうける）を、各用量レベルに入れた。ＭＰＩＦ投与に関すると考え
られる重篤な有害事象は観察されなかった。一般的に、報告された有害事象は、
温和かつ一過性であり、そして最初に温和な頭痛、筋肉痛、および疲労からなっ
た。この研究因子に対する関係が未知の、唯一の重篤な有害事象（可能性のある
ＴＩＡ）は、７１歳の女性、最終注入後５２時間で記載される。患者の徴候は、
投与のすぐ後に消滅した。抗体発生のような免疫応答は、観察されなかった。フ
ローサイトメトリーデータの分析によって、ＭＰＩＦ投与の日の間にＣＤ１４陽
性単球に一過性の用量依存的減少が示された。しかし、明白な単球数または好中
球数における減少は、観察されなかった。正常な造血を有するこれらの健康なボ
ランティアにおいて、血球数における主要な変化または造血阻害の証拠は、観察
されなかった。薬物動態学研究によって、ピーク濃度（ＣMAX）および濃度時間
曲線下の領域（ＡＵＣ）イニシャルが、処置の６日後に薬物蓄積の証拠を伴わず
に、用量関連であることが明らかになった。（実施例３４）。
【１０１８】 （薬理学クラスおよび原理） ＭＰＩＦ（組換えヒトタンパク質）は、短縮形態のヒトβケモカインの、骨髄
前駆体阻害タンパク質−１（ＭＰＩＦ−１）である。ＭＰＩＦに関する１つの推
定された指標は、骨髄抑制化学療法をうける患者中の骨髄前駆細胞の保護である
。
【１０１９】 細胞傷害性薬剤を用いた全身治療は、播種性癌の最も効果的な治療に関する基
礎である。さらに、アジュバント化学療法が、手術または放射線治療を用いた局
在した疾患の処置の後に、しばしば使用される。
【１０２０】 骨髄抑制は、化学療法と関連した最も一般的な重篤な毒性のうちの１つである
ので、骨髄抑制治療を受けている患者の支持治療の進歩に対する重要な臨床の必
要性がある。非臨床研究によって、ＭＰＩＦが化学療法剤の細胞傷害性効果から
の造血前駆細胞の保護に関して重大な可能性を有することが示される。
【１０２１】 造血幹細胞および多能性前駆細胞は、全ての造血系統の回復を担う。正常な固
体において、これらの細胞は、あまり頻繁には分裂せず、従って、単一単位の化
学療法剤に対して比較的耐性である。しかし、複数サイクルの化学療法後、骨髄
前駆細胞は、増加した増殖と応答し、そして引続く用量および単位の化学療法剤
からの毒性効果に対して、よりさらに感受性になる。複数単位の細胞傷害性化学
療法は、骨髄前駆細胞の進行性損失を導き、これは、好中球および血小板に対す
る遅延した回復および悪化した最下点を引き起こす。
【１０２２】 このような保護の臨床的価値は、発病率の低下および／または化学療法誘導の
血球減少症の持続期間に対して可能性があり、これらによって、高い用量または
連続したサイクルの化学療法後の、感染および出血の徴候を減少する。さらに、
ＭＰＩＦは、用量強度、タイミングの良い集中的な化学療法の適用に関する支持
的測定を提供する。
【１０２３】 （現在利用可能な治療） コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、ほぼ１０年間、化学療法の標準的な用量およ
び強化された用量を支持するために使用されている。上昇した化学療法の用量は
腫瘍細胞破壊を実質的に増加し、そして選択された悪性腫瘍における生存を改善
し得ることを示唆する非臨床的な証拠が利用可能であるが、し得るが、この概念
の臨床的な確認は、欠けている。ＣＳＦ（これは、顆粒球、マクロファージ、お
よび血小板の産生を刺激する）は、好中球減少症または血小板減少症の持続期間
を短くするために化学療法後に使用される。対照的に、ＭＰＩＦは、化学療法へ
の曝露の前またはその間に、骨髄前駆細胞の増殖を一過的に制限することによっ
て、この骨髄前駆細胞を保護する。この異なる作用様式は、ＣＳＦ投与と共にで
さえ、反復用量の化学療法の後に生じる前駆細胞の保存の進行性損失を回避する
。従って、ＭＰＩＦの使用は、化学療法の用量強度における増加を可能にする。
【１０２４】 （非臨床研究） ＭＰＩＦは、運命付けられた骨髄前駆細胞に対する化学保護剤として機能する
。インビトロおよび／または動物モデルにおいて効果が示されている他の化学保
護剤と比較して、ＭＰＩＦは、ＣＤ３４+前駆細胞増殖を阻害するその能力なら
びにコロニー形成単位−顆粒球および単球（ＣＦＵ−ＧＭ）およびコロニー形成
単位−混合（ＣＦＵ−ｍｉｘ）細胞の両方によるコロニー形成に基づいて、特有
の生物学的プロフィールを示す。ヒト前駆体ＭＰＩＦの間では、ＣＦＵ−ＧＭコ
ロニー形成およびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー形成に対して類似した阻害活性を示
す。従って、ＭＰＩＦは、ＣＤ３４+多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）
前駆体、多能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）前駆体、および運命付けられた前駆
体を阻害する。
【１０２５】 ＭＰＩＦはまた、マウスの低い増殖ポテンシャルのコロニー形成細胞（ＬＰＰ
−ＣＦＣ）の強力な可逆的インヒビターとして機能し、この細胞としては、末梢
単球および顆粒球を最終的に生じる多くの運命付けられた骨髄前駆体が挙げられ
る。ＭＰＩＦはまた、より初期の高い増殖ポテンシャルのコロニー形成細胞（Ｈ
ＰＰ−ＣＦＣ）を阻害することが見出され、この細胞は、多能性（ｐｌｕｒｉｐ
ｏｔｅｎｔｉａｌ）造血幹細胞の多くの特性を示す。
【１０２６】 （ＭＰＩＦの組織発現） ＭＰＩＦのｍＲＮＡ発現パターンは、複雑であり、本来は、肺、肝臓、骨髄、
活性化単球および骨髄単球性細胞株ＨＬ−６０およびＴＨＰ−１でメッセージが
検出される。より最近では、異なる転写物が、膵臓、心臓、骨格筋で同定され、
そしてより少ない程度で骨髄で同定されている。
【１０２７】 （非臨床薬理学） ２７０個にわたるのインビトロ実験からの結果は、ＭＰＩＦが抗癌剤のスクリ
ーニングに使用されるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの
腫瘍パネルにおける腫瘍細胞株に対して検出可能な効果を有さず、５２個のさら
なる腫瘍細胞株のいずれに対してもこの効果を有さないことを示す。さらに、７
５個より多くの細胞ベースのアッセイが、ＭＰＩＦ活性を研究するために開発さ
れている。正常な細胞型の間では、ＭＰＩＦの生物学的活性は、末梢免疫系内お
よび造血前駆細胞コンパートメントの特定の細胞に制限される（表７）。特に、
ＭＰＩＦは、以下で達成されることが見出されている： −休止Ｔ細胞および単球において走化性応答を誘導する −単球、単球由来の樹状細胞、および好酸球においてＣａ2+流動を誘導する −０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度においてマウスの多能性かつ運命
付けられた前駆体のコロニー形成を阻害する −０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度においてヒトＣＤ３４+細胞の増
殖を阻害する。
【１０２８】
【表７】 （ＭＰＩＦの走化性活性） ＭＰＩＦは、休止Ｔリンパ球に対する強力な走化性因子であり、顕著な最大の
応答は１０ｎｇ／ｍＬにおいてである。ＭＰＩＦは、広い範囲（０．１〜１００
０ｎｇ／ｍＬ）で抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞における走化性を刺激しなかった。新鮮
に単離された単球は、ＭＰＩＦに対して走化性応答を示した。最大の移動を、１
００ｎｇ／ｍＬ（休止Ｔ細胞間で比較可能な応答を誘発するために必要な濃度よ
りも１０倍高い濃度）において観察した。弱い走化性応答は、好中球で生じた。
ＭＰＩＦは、Ｂリンパ球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、または血小板で走化性
を誘導しなかった。
【１０２９】 （ヒト血球に対するＭＰＩＦの効果） ＭＰＩＦは、ヒト血球に対して以下のインビトロ効果を有する。
【１０３０】 （単球および単球由来マクロファージ） リソソーム酵素放出に対するＭＰＩＦの効果を、新鮮に単離さた単球中で決定
した。低いが可変性のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコシダーゼの放出を、０．５
〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲にわたって観察した。検出可能であるが、この放出は
、ＭＩＰ−ｌβ、ＭＩＰ−ｌα、ＲＡＮＴＥＳ、またはＭＣＰ−１によって誘導
される放出よりも非常に低かった。別の研究において、ＭＰＩＦ（１〜１０００
ｎｇ／ｍＬ）は、リソソーム酵素のエラスターゼ、グルコウロキナーゼ（ｇｌｕ
ｃｏｕｒｏｎｉｄａｓｅ）およびミエロペルオキシダーゼの放出に効果を有さな
かった。ＭＰＩＦ（０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ）は、ＩＬ−１β、腫瘍壊死因子
α（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−１０、またはＩＬ−２を分泌するために単球を誘導し
なかった。さらに、酸化的バーストまたは活性化マクロファージの細胞傷害性活
性に対する効果は、検出されなかった。
【１０３１】 （好塩基球） 末梢血から精製された好塩基球を、１０分間、ＭＰＩＦ（１〜１０００ｎｇ／
ｍＬ）を用いてインキュベートし、そして生じる上清を、ヒスタミン放出に関し
てアッセイした。ＭＰＩＦは、ヒスタミン放出を誘導しなかった。
【１０３２】 （ＮＫ細胞） 精製ＰＢＭＣを、ＮＫ媒介細胞のＫ５６２細胞の殺傷に対するＭＰＩＦの効果
を決定するための供給元として使用した。ＭＰＩＦ（１〜１００ｎｇ／ｍＬ）は
、ＩＬ−２刺激の、ＮＫ媒介のＫ５６２細胞殺傷に対して効果を有さなかった。
【１０３３】 （血小板） ０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度におけるＭＰＩＦは、血小板活性化または血
小板蓄積を誘導または調節しなかった。
【１０３４】 （ＭＰＩＦは、ヒトＣＤ３４+前駆体の増殖を阻害する） ヒト造血前駆細胞増殖に対するＭＰＩＦの効果を評価するために、ＣＤ３４+
細胞を、臍帯血から単離し、５×１０4細胞／ｍＬで再懸濁し、そしてＩＬ−３
およびＳＣＦの存在下で４日間培養した。次いで、生じる骨髄前駆体の集団を洗
浄し、４つの条件下で培養した：培地単独；培地およびＭＰＩＦ；培地ならびに
ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）のサイトカイン
カクテル；そして培地およびサイトカインカクテルおよびＭＰＩＦ。さらに６日
後、各培養物中の可視細胞の数を決定した。図４６に示されるように、骨髄前駆
体は、培地単独または培地およびＭＰＩＦ中で増殖した場合、生存しなかった。
対照的に、サイトカインカクテルは。前駆体生存を劇的に改善した。ＭＰＩＦの
添加（１〜１０００ｎｇ／ｍＬ）は、細胞増殖の有意な阻害（２０〜４０％）を
引き起こした。（これらの結果は、３つの独立した実験に典型的である。値は、
３連のウェルの平均吸光度±ＳＤとして報告する。）（図４６）。
【１０３５】 （ヒトＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−ＭｉｘのＭＰＩＦによる阻害） ＭＰＩＦの阻害効果が特定の前駆体を標的化するか否かを決定するために、Ｃ
Ｄ３４+由来前駆細胞を、培地中（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯお
よびＴＰＯを含むＭｅｔｈｏｃｕｌｔ ＴＭ 半固体培地）で培養し、この培地
は、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍｅｇおよ
びＣＦＵ−Ｍｉｘコロニーの発達を支持する。１４日後の培養物において、ＭＰ
ＩＦの存在下で生じるコロニーの数および表現型を、培地単独またはコントロー
ルサイトカインのＭＩＰ−１αもしくは単球化学誘引物質タンパク質−４（ＭＣ
Ｐ−４）で生じるものと比較した。
【１０３６】 ２つの典型的な実験の結果は、ＭＰＩＦが、ＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−Ｍｉ
ｘ両方の形成を阻害（５０〜６４％）することを示す。ＭＩＰ−ｌαおよびＭＣ
Ｐ−４は、いずれの前駆体集団のコロニー形成に対しても効果を有さなかった。
これらの結果は、ＭＰＩＦの骨髄前駆体発達に対する阻害効果を確認し、そして
ＭＰＩＦをヒト顆粒球および単球前駆細胞のインヒビターとして規定する。（表
８）。
【１０３７】
【表８】 （インビトロ化学的保護） ＭＰＩＦの保護的ポテンシャルをさらに評価するために、系統劣化（ｌｉｎｅ
ａｇｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）細胞（Ｌｉｎ−ｃｅｌｌ）をマウス骨髄から単離し
、そして標準的なサイトカインカクテル（ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（
５０ｎｇ／ｍＬ）、Ｍ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−１α（１０ｎｇ
／ｍＬ）からなる）の存在下で、ＭＰＩＦありまたはなしでインキュベートした
。６０〜７０時間後、培養物を化学療法薬物で処理し、そしてインキュベーショ
ンをさらに３〜２４時間続け、この時点で、生存ＬＰＰ−ＣＦＣの数を、標準的
なクローン原性アッセイによって決定した。図４７に示すように、細胞周期特異
的因子５−ＦＵ、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセルおよびダウノルビシンの細胞傷害
性効果は、ＭＰＩＦによって有意に低下された。対照的に、ＭＰＩＦは、アルキ
ル化剤メルファランおよびチオテパから前駆細胞を保護し得なかった。これらの
結果は、ＭＰＩＦの、多能性骨髄性前駆細胞の増殖のインヒビターとしての役割
を支持し、そしてケモカインが効果的であり得る化学療法剤のスペクトルに関す
る洞察を提供する。
【１０３８】 別の実験において、ＭＰＩＦの５−ＦＵ誘導毒性に対する保護的効果を、０．
１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＭＰＩＦを使用して測定し、２つの製造ロットの
ＭＰＩＦ（Ｌｏｔ ＃１１およびＬｏｔ ＃１９）の使用を示す。データは、Ｍ
ＰＩＦの投与によるコロニー保護の割合に換算した用量応答曲線を示す。これら
のデータは、０．１ｎｇ／ｍｌのＭＰＩＦが約３０％の化学的保護を与え、そし
て１，０００ｎｇ／ｍｌのＭＰＩＦが８０％を超える化学的保護を与えることを
示す（データは示さない）。
【１０３９】 （インビボ研究の要約） 図４８に示すように、ＭＰＩＦのインビボ分析を、主としてマウスにおいて、
ウサギおよびラットにおける化合物の安全性の支持的研究を伴って、実施した。
これらの研究からの結果は、以下のことを示す： ・ ＭＰＩＦは、造血前駆細胞に対する強力な骨髄保護物質である。このような
保護の結果は、骨髄前駆細胞および末梢細胞集団の、コントロールと比較した治
療後のより迅速な回復である。 ・ ＭＰＩＦは、有意な毒性なしに、１４日間までの期間にわたって毎日（静脈
内に）投与され得る。 ・ ＭＰＩＦは、心臓血管系に対して効果を有さない。 ・ ＭＰＩＦは、発熱性ではない。 ・ ＭＰＩＦは、循環から迅速に除去される。
【１０４０】 （骨髄前駆細胞のインビボ保護） ＭＩＰＦが骨髄前駆細胞をインビボにおいて化学療法剤の効果に対して保護す
るか否かを決定するために、実験を行った。マウスに、ＭＰＩＦ（１．０ｍｇ／
ｋｇ、腹腔内）を３日間、２４時間の間隔で毎日注射し、次いで３日目に、５−
ＦＵ（１５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を一回注射した。マウスを、５−ＦＵ処置の
後の種々の時点において屠殺し、そして骨髄コロニーの数を、標準的なＨＰＰ−
ＣＦＣアッセイまたはＬＰＰ−ＣＦＣアッセイにおいてスコア付けした。コント
ロール群は、生理食塩水のみおよび５−ＦＵのみを受容したマウスを含んだ。図
４９Ａに示すように、ＭＰＩＦで処理したマウスにおいてにおいて検出される骨
髄コロニーの数は、５−ＦＵの投与の７日以内に正常レベルに戻った。対照的に
、５−ＦＵ単独で処置したマウスからの骨髄コロニー形成は、この時点において
回復を示さなかった。これらの結果は、化学療法の前のＭＰＩＦでの予備処置は
、恐らくＭＰＩＦが骨髄前駆細胞を保護する能力によって、コロニー形成細胞の
より迅速な回復を可能にすることを示す。
【１０４１】 ＭＰＩＦにより媒介される前駆細胞の保護の結果を、末梢において明らかにし
た。ここで、全白血球（ＷＢＣ）計数は、コロニー回復が骨髄において観察され
た後に、ゆっくりと増加した。図４９Ｂに示すデータは、８つの独立した実験を
要約する。示される値は、平均ＷＢＣ計数±平均の標準誤差で表される。６日目
と８日目とにおいて観察された差異は、それぞれ０．００１および０．０００１
未満の関連ｐ値を有する。
【１０４２】 （複数サイクルの治療に対するＭＰＩＦの化学的保護効果） 示される結果は、ここまでは、ＭＰＩＦの骨髄前駆細胞の保護物質としての役
割を支持するが、複数サイクルの治療による保護は、ＭＰＩＦに関して臨床的に
関連する用途である。ＭＰＩＦの化学的保護効果が３サイクルの治療の間に決定
された実験の結果を、図５０に示す。正常マウス、５−ＦＵ単独（１００ｍｇ／
ｋｇ、腹腔内）で処置したマウス、または５−ＦＵおよびＭＰＩＦ（１．０ｍｇ
／ｋｇ、腹腔内）で処置したマウスから得られた骨髄を使用しての、骨髄コロニ
ー形成分析は、ＭＰＩＦが、５−ＦＵ処置の全３サイクルを通して、前駆細胞を
保護したことを示す（Ｇｒｚｅｇｏｒｚｅｗｓｋｉ，Ｋ．Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ（
要旨：補遺）（刊行が受諾された））。
【１０４３】 （ＭＰＩＦの用量範囲および用量スケジュール） ＭＰＩＦの非臨床的用量応答は広範であり、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲
であった。この広範な応答は、臨床試験のために３ｌｏｇの範囲の用量を選択す
ることに対して合理的であった。
【１０４４】 試験した異なる非臨床的投薬スケジュールを、図５１に示す。化学療法投与に
対して−２日目、−１日目および０日目のヒト投薬スケジュールを選択すること
に関する合理性は、この処置レジメンが、マウスにおいて試験した多くのスケジ
ュールの最も一貫した再現性のある保護を提供したという観察に基づいた。さら
に、ＭＰＩＦのインビボでの比較的短い血清半減期および幹細胞前駆細胞の長い
細胞周期の時間を考慮すると（ＭｃＮｉｅｃｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ８：１４６−１６０（１９９０）；Ｂｅｒｔｏｎｃｅｌｌｏら、Ｅ
ｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９：１７４−１７８（１９９１））、前駆細胞の曝露
および従って保護の尤度を最大にするために、複数用量のＭＰＩＦを患者に投与
することは、理論的に有利である。
【１０４５】 一緒になって、インビボおよびインビトロでの結果は、ＭＰＩＦがその生物学
的プロフィールにおいて独自であることを示す。このタンパク質が強力な骨髄保
護試薬として機能する能力は、このタンパク質が化学的保護薬剤としての応用を
見出し、そして初期の骨髄前駆細胞を通常使用される化学療法薬剤の効果から救
うことを示唆する。このような薬剤の臨床的価値は、それが化学療法によって誘
導される血球減少症の発生数および重篤度を低下させ、これによって感染および
出血の尤度を低下させる可能性において、明らかである。
【１０４６】 （非臨床的毒物学） ３つの非臨床的毒物学研究を、Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅガイドラインのもとで実施した（７日目の用量範囲の研究、１４日目の亜
慢性（ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ）研究、および２５日目の亜慢性研究）。２０ｍｇ
／ｋｇまでの用量は、有意な毒性を生じなかった。複数用量研究の一般的な要約
（図５２）および非臨床的研究に関する臨床的観察の要約（図５３）を示す。さ
らに、１０ｍｇ／ｋｇまでの用量では、自律神経の効果も心臓血管の効果も観察
されなかった。
【１０４７】 （非臨床的な吸収、分布、代謝、および排泄） ＭＰＩＦの薬物速度論的研究を、単一の静脈内または皮下のＭＰＩＦのボーラ
スを２０ｍｇ／ｋｇの用量で与えたＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスにおいて実施した。
各処置群からの３匹のマウスを屠殺し、そして各時点で採血し、そしてＭＰＩＦ
の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイによって決定した。図５４に示すように、
ＭＰＩＦの静脈内投与は、注射後２４時間にまで続く、低いが検出可能なレベル
での急速なクリアランスを生じる。皮下投与は、類似のプロフィールを与え、こ
こで主要な相違点は、ピーク血清レベルの出現が３０分遅いことである。この時
点の後は、クリアランスは、静脈内で処置されたマウスの間で観察されたものと
は識別不可能である。ＭＰＩＦのクリアランスは、小タンパク質に関して予測さ
れるクリアランスと一致する。
【１０４８】 ＭＰＩＦの第二の薬物速度論的研究を、２０ｍｇ／ｋｇの単一の静脈内ボーラ
スを与えたマウスにおいて実施した。ＭＰＩＦは、血清から迅速に除供された。
ＭＰＩＦは、投与される用量の０．１％のレベルで投与された８時間後に、検出
され得る。
【１０４９】 この実施例に記載される研究は、化学療法の間の使用に関するＭＰＩＦ−１（
Δ２３）の活性を試験する。これらのプロトコルの多くは、放射線治療の間のＭ
ＰＩＦ−１の使用の研究に対して等しく適用可能である。さらに、当業者は、例
示的な研究を容易に改変して、全長ＭＰＩＦ−１またはそのフラグメント、なら
びにＭＰＩＦ−１のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療を介する）、アゴニ
スト、および／またはアナログの活性を研究し得る。
【１０５０】 （実施例３５） （前臨床研究および臨床研究） （以前のヒトの経験） （００３０４−ＣＲＸ−ＨＶ−０１の臨床研究。）第Ｉ相試験を実施して、健
常なボランティアにおける安全性、薬物速度論的（ＰＫ）効果および薬力学的効
果を評価した（Ｌｏｕｉｅら、Ｂｌｏｏｄ ９０：１５６９Ａ（要旨；補遺）（
１９９７））。３０の被験体（１４Ｍ、１６Ｆ、中央年齢４６、範囲：２１〜７
３歳）を無作為化して、６用量のＭＰＩＦまたはプラシーボを、連続した６日間
の約１分間にわたって、盲検のプラシーボコントロールの連続的な用量増加（０
．１、１、１０、３０、１００μｇ／ｋｇ）の試験において、投与した。６の被
験体からなる各用量コホートを、５：１の活性対プラシーボの比に無作為化した
。有害事象（ＡＥ）を、４週間にわたって評価した。２週間後、予備的な安全性
データを再検討し、そして次のコホートを開始することを決定した。血液サンプ
ルを、血液学、化学、ＰＫ、抗原性およびフローサイトメトリーのために得て、
末梢血液細胞集団を評価した。
【１０５１】 これは、健常なボランティアにおける第Ｉ相の安全性試験であり、そしてそれ
自体は、効力を確立することは主要な目的ではなかった。しかし、以下の実験室
パラメータの発展を評価した： ・ 白血球（ＷＢＣ）計数 ・ 絶対的な好中球計数（ＡＮＣ） ・ 赤血球（ＲＢＣ）計数 ・ 血小板計数 ・ フローサイトメトリーによる末梢血液細胞の組成。
【１０５２】 絶対的計数または割合変化によって測定した場合に、絶対的な好中球計数の観
点から、活性処理した群とプラシーボで処理した群との間に、差異は観察されな
かった。これらの結果は、正常動物における前臨床研究の結果と一致する。同様
に、ベースラインからの有意な変化は、白血球、赤血球、または血小板に関して
、観察されなかった。
【１０５３】 系列的なフローサイトメトリーによる観察を得て、末梢白血球亜集団に対する
ＭＰＩＦの効果をさらに描写した。末梢血液単核細胞（顆粒球、単球、Ｔリンパ
球およびＢリンパ球）の割合を、用量および研究日の関数として、グラフによっ
て図５５に示す。
【１０５４】 ベースラインからの有意な変化は、顆粒球、Ｔリンパ球、またはＢリンパ球に
おいて、試験中のいかなる時点においても観察されなかった。健常なボランティ
アにおける顆粒球計数に対する効果の欠如は、前臨床試験における健常な動物に
おいて観察された効果の欠如と一致した。
【１０５５】 ＣＤ１４保有末梢単球の割合における、一過性の用量依存性の減少が、１０〜
１００μｇ／ｋｇ／日を受容したコホートにおいて、ＭＰＩＦ投与の６日間の間
に観察された。
【１０５６】 ベースラインからの相対的変化の分析を行って、処置期間の間の単球ＣＤ１４
阻害の有意性を評価した。ゲートされたＣＤ１４＋事象に対するベースラインか
らの変化の相対的割合を計算した。ベースライン値を、各患者に対するコントロ
ールとみなした。ベースラインレベルは、処置アーム間で比較可能であり、最も
低い対の比較に関して、ｐ値＝０．１８であった（処置とプラシーボとの間の比
較）。
【１０５７】 分散モデルの全体的な分析は、全ての時点において有意であった。ベースライ
ンからの変化は、より高い容量の群である１０、３０、および１００μｇ／Ｋｇ
に対しては、０とは有意に異なった（ｐ＝０．０００１）。プラシーボとこれら
３つの処置アームとの間にもまた、有意な差異が存在した。１００μｇ／Ｋｇと
３０μｇ／Ｋｇと１０μｇ／Ｋｇとの間には、有意な差異が存在し、このことは
、用量応答を示す。
【１０５８】 単球の提示に対する治験薬物の効果をさらに試験するために、絶対的な単球計
数（ＡＭＣ）を計算した。これを、以下の式を使用して、絶対的な好中球を計算
すると同じ様式で、行った： ＡＭＣ＝ＷＢＣ計数×（差示的計数からの）単球（％）×１０００。
【１０５９】 これらの結果を、図５６に示す。ＡＭＣの予測された減少は、単球が多型手段
によって定量される場合には、ＭＰＩＦ処置の間に観察されなかった。実際に、
処置の期間中に、わずかな増加が見られ、これは、１μｇ／ｋｇ以上のＭＰＩＦ
用量において起こり、そして最後の用量の２〜３日後以内に、ベースライン計数
に戻る。
【１０６０】 単球のデータの最も単純な解釈は、ＭＰＩＦが単球の走化性において用量依存
性の変化を引き起こし、非ＣＤ１４保有単球の流入を生じるということである。
このことは、フローサイトメトリーによって観察される、適度な絶対的な単球計
数の増加、およびＣＤ１４保有単球の減少を考慮する。いずれかの方法によって
、一時的かまたは可逆的な生物学的活性の明白な証拠が存在した。
【１０６１】 （安全性。）ＭＩＰＦに関して意図された１つの指標は、骨髄抑制性化学療法
を受容する患者における、骨髄前駆体細胞の保護である。用量の範囲が変化する
、プラシーボコントロールのこの薬剤の臨床試験において、最も頻繁に報告され
るＡＥは、骨髄抑制、ならびに随伴する化学療法投与に関連するその感染性およ
び出血性の合併症であると予測される。前臨床研究および臨床研究において、Ｍ
ＰＩＦの効果は一時的であり、可逆的であり、そして、骨髄系列の細胞に制限さ
れていた。ＭＰＩＦは、化学療法により誘導される血球減少症の頻度、重篤度、
および持続時間を減少させると予測されたが、予測に反して、延長した作用は、
潜在的に、血球減少症を悪化させ得る。
【１０６２】 第Ｉ相の健常なボランティア試験００３０４−ＣＲＸ−ＨＶ−０１において、
１８の被験体（１４が活性、４がプラシーボ）が、全部で３２の有害事象を被っ
た（２５が活性、７がプラシーボ）。
【１０６３】 有害事象を、「治験薬物の投与に関連する」、「治験薬物の投与に関連しない
」、または「治験薬物の投与との関連が未知」のいずれかとして、治験担当医 によってコードした。因果関係の観点で報告する有害事象を標準化する目的で、
治験担当医によって「治験薬物の投与との関連が未知」とコードされる有害事象
は、後援者によって可能な因果関係を有するとみなされ、従って、「関連するＡ
Ｅ」と報告された。
【１０６４】 これらの基準に基づいて、２５のＭＰＩＦ処置した被験体のうちの１１が、Ｍ
ＩＰＦ投与に関連すると考えられる少なくとも１つの有害事象を経験した。プラ
シーボを受けた５の被験体のうちの３が、薬物投与に関連すると考えられる少な
くとも１つの有害事象を経験した。活性処置された被験体およびプラシーボ処置
された被験体の間での有害事象の発生数（それぞれ４４％対６０％）は、匹敵す
る。
【１０６５】 ３２の報告された有害事象のうちの２９は、ＮＣＩ ＣＴＣ等級で１または２
の重篤度のものであった。２つは、未知の重篤度であった。最も頻繁に報告され
た有害事象は、頭痛（５の被験体、４の活性／１のプラシーボ）、頃眠（３の被
験体、２の活性／１のプラシーボ）、および白血球減少症（３の被験体、２の活
性／１のプラシーボ）であった。第Ｉ相試験に関して報告された全てのＡＥの要
約を、表９に示す。
【１０６６】 １つの有害事象が、重大かつ重篤であると報告された。７２歳の白人女性は、
眩暈感、悪心および嘔吐、ならびにＭＰＩＦ（３０μｇ／ｋｇ）の最後の投与の
約５６時間後の歩行不安定性によって顕在される眩暈を経験した。この被験体を
、観察および評価のために、一晩入院させた。実験室、頭部ＣＴおよび頚動脈の
超音波試験では、明らかにならなかった。この被験体は、遠い過去に、類似のエ
ピソードを有した。症状をすばやく解析し、そして被験体を翌朝に病院から出し
、このときこの治験の後遺症および合併症の証拠はなかった。この有害事象と治
験投薬法との関係は、治験担当医によって「未知」として報告された。
【１０６７】
【表９】 （薬物速度論的パラメータ。）薬物速度論的パラメータを、治験００３０４−
ＣＲＸ−ＨＶ−０１において評価した。血漿サンプルを、ベースラインにおいて
、ならびに５分、１０分、１５分、および３０分の最初の投薬の１時間後、２時
間後、４時間後および２４時間後に、得た。さらなるサンプルを得、その後、最
後の投薬の後に、薬物の蓄積を評価した。
【１０６８】 これらのデータを図５７に要約する。循環している血液のレベルは、０．１μ
ｇ／ｋｇおよび１．０μｇ／ｋｇのコホートにおいて、それぞれ３０分および１
時間までにわたって、容易に検出された。より高い用量は、注入後２４時間まで
にわたって、検出可能なレベルを生じた。ＡＵＣおよびＣMAXは、投与された用
量に対して比例した。最も高い用量レベル（３０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／
ｋｇ）を受けた被験体の間で、Ｔ1/2は、約０．８時間であった。６日目の治験
薬物の最後の投与の前の血漿レベルは、薬物蓄積の証拠を示さなかった。
【１０６９】 これらの研究は、ＭＰＩＦ−１が、Ｇ−ＣＳＦに関連する副作用（例えば、骨
格の疼痛、脱毛症、下痢、好中球減少性熱、粘膜炎、熱、疲労、食欲不振など）
を引き起こすことを示す。
【１０７０】 この実施例に記載する研究は、ＭＰＩＦ−１（Δ２３）の活性を試験する。し
かし、当業者は、例示された治験を容易に改変して、全長ＭＰＩＦ−１、または
そのフラグメント、ならびにＭＰＩＦ−１のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子
治療を介して）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得
る。
【１０７１】 （実施例３６） （データの要約および治験担当医のための指針） （前臨床データの要約。）インビボ研究は、ＭＰＩＦが造血前駆細胞の強力な
保護物質であることを示す。マウスの多機能かつ方向付けられた前駆細胞コロニ
ーの阻害を、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で観察した。インビトロでの
実験は、ＭＰＩＦが、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼインヒ
ビター、およびタキサンの効果からの細胞保護を与えることを示した。インビボ
の試験においては、このような保護の結果は、細胞傷害性化学療法に続く、骨髄
前駆細胞および末梢細胞集団のより迅速な回復である。
【１０７２】 ＭＰＩＦは、毎日（静脈内に）、１４日間の期間にわたって、有意な毒性なし
に、投与され得る。ヒトと当量の用量である１．６７ｍｇ／ｋｇまで、動物にお
いて有害な効果が観察されなかった。２０ｍｇ／ｋｇの用量まで、２８日間の反
復用量毒物学研究において、動物において有害な効果が観察されなかった。
【１０７３】 ＭＰＩＦは、２７０を超えるインビトロの実験において、腫瘍細胞株において
検出可能な増殖促進効果を有さなかった。
【１０７４】 （臨床データの要約。）ＭＰＩＦは、安全に投与され、そして第Ｉ相プラシー
ボコントロールの用量増加試験（用量範囲：０．１〜１００μｇ／ｋｇ）におい
て反復用量を受容する健全なボランティア（ｎ＝２５）において、十分に許容さ
れた： ＭＰＩＦの投与に関連すると考えられる重大な有害事象は、健全なボランティ
アにおいて観察されなかった。
【１０７５】 ＣＤ１４発現の一時的な用量依存性の減少が、フローサイトメトリー分析によ
って、末梢血液単球において観察された。絶対的な単球および好中球の計数は、
差示的係数によって決定される場合に、影響を受けなかった。
【１０７６】 ＭＰＩＦは、処置後２４時間まで検出可能であった。
【１０７７】 ＭＰＩＦは、健全なボランティアに投与される場合に、免疫原性ではなかった
。
【１０７８】 （潜在的な危険および副作用。）ＭＰＩＦの効果は、前臨床試験および臨床試
験において、一過性であり、可逆的であり、そして骨髄系の細胞に限定されてい
た。ＭＰＩＦは、化学療法によって誘導される血球減少症の頻度、重篤度および
持続時間を減少させると予測されるが、予測に反して、延長した作用は、潜在的
に血球減少症を悪化させ得る。
【１０７９】 プラシーボに匹敵する頻度および重篤度を有する、一時的な有害事象は、１０
０μｇ／ｋｇまでの用量のＭＰＩＦを複数回静脈内に受容する健全なボランティ
アの最初の臨床的研究において、観察された。ＭＰＩＦの投与に関連すると考え
られる急性の反応は、観察されなかった。ＭＰＩＦは、健全なボランティアにお
いては、非免疫原性であった。
【１０８０】 いくつかの有害事象が、ＭＰＩＦの投与に関連したが、外因性タンパク質の導
入は、潜在的に、免疫原性により媒介される局所性かまたは全身性の反応を生じ
得る。被験体は、急性のアレルギー性反応（例えば、熱、じんま疹、高血圧症ま
たは低血圧症、および気管支痙攣）、または他の反応（例えば、脈管炎、または
血清病）を経験し得る。腎臓の機能不全、肝臓の機能不全、免疫抑制、凝固障害
およびニューロパシーの可能性は、間接的であるが、排除され得ない。
【１０８１】 被験体は、急性の有害な反応の任意の兆候に関して、投与中および投与後に綿
密にモニタリングされるべきである。突発的な供給（エピネフリン、コルチコス
テロイド、昇圧剤、および心臓除細動装備を含む）は、急性の反応が起こる場合
に、使用のために容易に利用可能であるべきである。
【１０８２】 （禁忌。）妊娠中または授乳中の母親においての使用のための、この製品の安
全性は、臨床試験において実証されていない。
【１０８３】 （予防措置） （患者のための情報。）ＭＰＩＦは、全ての治験製品と同様に、この製品を熟
知している臨床試験外科医または治験担当医の支持のもとでのみ、使用されるべ
きである。
【１０８４】 妊娠中または授乳中の母親においての使用のための、この製品の安全性は、臨
床試験によっては実証されていない。胚または胎児の発生、妊娠の経過、ならび
に周産期および出生後の発達に関する安全性を評価するための、例示的な動物研
究は、行われていない。月経周期を失ったいずれの女性も、そうではないと示さ
れるまで、妊娠と仮定されるべきである。従って、あり得る利点が母体および胎
児が被る危険を上回る場合に、強制的な調査のみが、妊娠中には実施されるべき
である。
【１０８５】 ＭＰＩＦが乳中に分布しているか否かは、未知である。治験薬物の投与が必要
であることがわかった場合には、母乳で育てることは、中断されるべきである。
【１０８６】 （実験室試験。）末梢血液計数は、ＭＰＩＦで処置された患者において綿密に
モニターされるべきである。実験室試験は、付随する臨床プロトコルに従って実
施されるべきである。
【１０８７】 （製品の相互作用。）ＭＰＩＦは、他の薬物といかなる重篤な相互作用をも引
き起こさないと予測される。
【１０８８】 （発癌、変異誘発、受胎能の欠陥。）発癌性および変異誘発性の可能性を試験
するための動物研究は、ＭＰＩＦを用いては行われていない。インビトロでの試
験は、ＭＰＩＦが、腫瘍細胞株に対して検出可能な効果を有さないことを示す。
【１０８９】 （製品の乱用および依存性。）ＭＰＩＦの製品の乱用および依存性の可能性は
、非臨床研究においても臨床研究においても試験されていないが、無視できると
予測される。
【１０９０】 （過剰の投薬量。）ＭＰＩＦの過剰投薬量に関する臨床的な経験は存在しない
。２０ｍｇ／ｋｇまでの用量が連続１４日間にわたって与えられた場合に、動物
において毒性が観察されなかった。これは、ヒトにおける１．６７ｍｇ／ｋｇの
用量と等価である。
【１０９１】 （投薬量および投与。）ＭＰＩＦに関する最適な用量および投与レジメンは、
決定されていない。最初の研究は、６日間までにわたって、０．１〜１００μｇ
／ｋｇのＭＰＩＦの毎日の静脈内投与の安全性を評価した。生物学的活性および
優先的な効力を決定するための第２Ａ相試験は、１〜１００μｇ／ｋｇの範囲の
用量を評価する。引き続く用量および投与レジメンは、これらの初期の効力の研
究の結果から、決定される。
【１０９２】 （供給および貯蔵。）ＭＰＩＦは、滅菌液体処方物として供給される。この製
品は、２℃と８℃との間で、認証された人物にのみアクセス可能な領域に貯蔵さ
れなければならない。患者への投与のための希釈された薬物は、製品の分解なし
で、室温で１２時間まで安定であることが示された。
【１０９３】 この実施例に記載される研究は、ＭＰＩＦ−１（Δ２３）の活性を試験する
。しかし、当業者は、例示的な研究を容易に改変して、全長ＭＰＩＦ−１または
そのフラグメント、ならびにＭＰＩＦ−１のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子
治療を介する）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を研究し得
る。
【１０９４】 （実施例３７） （ＭＰＩＦ−１の溶液構造および力学） （要約） 骨髄前駆細胞インヒビター因子−１（ＭＰＩＦ−１）は、前駆細胞のインヒビ
ターであり、そして単球のアクチベーターである。ＭＰＩＦ−１の溶液構造は、
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって決定されている。多くのＣＣケモカインと
は異なり、ＭＰＩＦ−１の構造は、これがモノマーであることを示す。この構造
は、末端残基以外には十分に規定されており、そして３つのβ鎖および重なって
いるαヘリックスの特徴的なケモカイン折り畳みを呈する。大部分のケモカイン
を特徴付ける４つのシステインに加えて、ＭＰＩＦ−１は、さらなる２つのシス
テインを含み、これらはジスルフィド結合を形成する。骨格の力学は、機能的に
重要なＮ末端残基、Ｎ末端ループの残基、およびジスルフィド結合に隣接する残
基が、タンパク質のコアと比較して、有意な力学を示すことを示す。ＭＰＩＦ−
１は、９９アミノ酸タンパク質からＮ末端においてプロセスされ、そして後者も
また機能的であるが、活性が減少しており、そして種々の溶液条件下でモノマー
である。従って、ＭＰＩＦ−１は、関連する他の全てのケモカインのより長いプ
レタンパク質として、独自である。これらの研究は、白血球上の７−ＴＭレセプ
ターを活性化するために十分なモノマーであるという概念と一致する。
【１０９５】 （導入） ケモカイン（走化性サイトカイン）は、様々な生物学的プロセス（白血球のや
り取り（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、造血、および新脈管形成が挙げられる）を
媒介し、そして感染に対する宿主の防御において、基礎的な役割を果たす（Ｂａ
ｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：６７５
−７０５（１９９７）；Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｊ．，Ｂｌｏｏｄ ９０：９０９
−９２８（１９９７）；Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
３３８：４３６−４４５（１９９８））。約４０のケモカインが、現在までに同
定されている；全てが、７０〜１００アミノ酸長であり、そして４つの保存的シ
ステインによって特徴付けられる。ケモカインは、最初の２つのシステインが隣
接している（ＣＣ）か、またはアミノ酸によって分離されている（ＣＸＣ）かに
基づいて、ＣＣおよびＣＸＣのファミリーに大まかに分類される。ＣＸＣケモカ
インは、さらに２つのサブグループに分割され得る（「ＥＬＲ」および「非ＥＬ
Ｒ」）。全てのＥＬＲ ＣＸＣケモカインは、好塩基球を活性化させ、一方で非
ＥＬＲ ＣＸＣケモカインは、リンパ球の異なるサブセットを活性化する。ＣＣ
ケモカインは、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、Ｔ細胞を活性化させ
るが、好中球を活性化させない。さらに、Ｃファミリーの単一のメンバー（これ
は、２つのみのシステインを含む）、およびＣＸ3Ｃファミリーの単一のメンバ
ーもまた、同定された。
【１０９６】 骨髄前駆細胞阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）（ＣＫβ８としても公知）（ＣＣ
ファミリーのメンバー）は、大規模連続試行において最初に同定され、そして肝
臓、肺、膵臓、および骨髄において、構成的に発現される（Ｐａｔｅｌ，Ｖ．Ｐ
．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１６３−１１７２（１９９７））。顆粒
球および単球の系列を生じさせる骨髄細胞のコロニー形成の阻害に加えて、ＭＰ
ＩＦ−１は、単球および好酸球に対してもまた走化性である（Ｐａｔｅｌ，Ｖ．
Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１６３−１１７２（１９９７）；Ｙｏ
ｕｎ，Ｂ．−Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９１：３１１８−３１２６（１９９８））。
選択的スプライシングは、２つの形態のタンパク質（ＣＫβ８およびＣＫβ８−
１と命名される）を生じ、これらはそれぞれ９９および１１６アミノ酸長である
（Ｙｏｕｎ，Ｂ．−Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９１：３１１８−３１２６（１９９８
））。興味深いことに、９９アミノ酸タンパク質の短縮型形態（Δ２４−９９）
（本明細書中以下においてＭＰＩＦ−１と称する）は、実質的により活性である
ことが観察された（Ｎａｒｄｅｌｌｉ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：
４３５−４４４（１９９９）；Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｔ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９：５９１−５９６（２０００））。単球および好酸
球における交差脱感作の実験は、ＭＰＩＦ−１が優先的にＣＣＲ１レセプターに
結合することを示すが、両方の場合において脱感作が不完全であることは、さら
なるレセプターが関与し得ることを示唆する（Ｎａｒｄｅｌｌｉ，Ｂ．ら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４３５−４４４（１９９９））。ＭＰＩＦ−１は、単
球からの［3Ｈ］アラキドン酸の迅速な用量依存性の放出を誘導し、これは、細
胞外カルシウムに依存し、そしてホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）インヒビターに
よってブロックされる。さらに、ＰＬＡ2の活性化は、単球における糸状のアク
チン形成のために必要であることが示される。
【１０９７】 いくつかのＣＸＣおよびＣＣケモカインの構造は、ＮＭＲ分光法およびＸ線結
晶構造学によって、解析されている（Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ２９：１６８９−１６９６（１９９０）；Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ
，Ｗ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：２５２−２７０（１９９４）；
Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２９０９−３２９１
５（１９９４）；Ｍａｌｋｏｗｓｋｉ，Ｍ Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７０：７０７７（１９９５）；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，３３：８３６１−８３６６（１９９４）；Ｌｏｄｉ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６３：１７６２−１７６７（１９９４）；Ｓｋｅｌｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：５３２９−５３４２（１９９５）；Ｈａ
ｎｄｅｌ，Ｔ．Ｍ．、およびＤｏｍａｉｌｌｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ３５：６５６９−６５８４（１９９６）；Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．ら、ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．３９５：２７７−２８２（１９９６）；Ｃｒｕｍｐ，Ｍ．Ｐ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１−２２４７９（１９９８）；Ｓ
ｔｉｃｈｔ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：５９９５−６００２（
１９９９））。最初に特徴付けられたケモカインの大部分は、ダイマーであり、
そしてＣＸＣおよびＣＣケモカインが、タンパク質の異なる領域を使用して二量
化することが、さらに観察された。ＣＸＣケモカインにおいては、最初のβ鎖が
ダイマーの界面を構成し、一方でＣＣケモカインにおいては、Ｎ末端残基がダイ
マーの界面を構成する。これらの観察およびＣＸＣケモカインが好中球のみを活
性化し、そしてＣＣケモカインが他の白血球を活性化するという観察は、簡単に
述べれば、ダイマー形成が白血球７−ＴＭレセプター結合のために必須であると
いうことである。
【１０９８】 サイトカインの引き続く発見および特徴付け（例えば、ＳＤＦ−１（ＣＸＣケ
モカイン）、ＭＣＰ−３、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＨＣＣ−２、およ
びＩ−３０９（ＣＣケモカイン））は、これらのケモカインが優先的にモノマー
であるとして、差異を取り除いた（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
３９５：２７７−２８２（１９９６）；Ｃｒｕｍｐ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１−２２４７９（１９９８）；Ｓｔｉｃｈｔ，Ｈ
．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：５９９５−６００２（１９９９）；Ｃ
ｒｕｍｐ，Ｍ．Ｐ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ １６：６９９６−７００７（１９９７）
）。溶液研究はまた、会合がイオン強度、緩衝液条件およびｐＨに対して感受性
であることを示した（Ｍａｙｏ，Ｋ．Ｈ．、およびＣｈｅｎ，Ｍ．−Ｊ．，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：９４６９−９４７８（１９８９）；Ｙａｎｇ，Ｙ
．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０１１０−２０１１８（１９９４）
；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：５９８−６０８（
１９９７））。変異研究（Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ，Ｌ Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７４：１６０７７−１６０８４（１９９９）；Ｌａｕｒｅｎｃｅ，
Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：３４０１−３４０９（２０００
）；Ｐａａｖｏｌａ，Ｃ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３３１５
７−３３１６５（１９９８））およびケモカインをモノマー状態でトラップする
こと（Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９０−９２
（１９９４）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２：１７２５−１７２９（１９９７）は、モノマーが白血球上の７−ＴＭレセ
プターの結合および活性化に十分であることを示した。最近の研究は、ダイマー
形成が、プロテオグリカンへの結合および濃度勾配の形成（指向された白血球の
やり取りのために必須のプロセス）において役割を果たし得ることを示唆する（
Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１３５７
０−１３５７８（１９９７）；Ｋｏｏｐｍａｎｎ，Ｗ．、およびＫｒａｎｇｅｌ
，Ｍ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０１０３−１０１０９（１９
９７））。
【１０９９】 本研究において、ＭＰＩＦ−１の溶液構造および骨格の力学を、ＮＭＲ分光法
によって特徴付けた。さらに、ＭＰＩＦ−１および全長ＭＰＩＦ−１タンパク質
の会合特性を、種々の溶媒条件下で、沈降超遠心分離測定によって研究した。構
造および力学、ならびに会合特性の意味合いを、その機能の観点から議論する。
この研究からのデータは、変異研究、および免疫関連疾患のための構造により補
助される治療剤のための、構造の基礎を形成する。
【１１００】 （実験手順） （タンパク質の発現および精製。）ＭＰＩＦ−１遺伝子配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ
における発現のために最適化したコドンを用いて、化学的に合成した。次いで、
この遺伝子を、２つのｌａｃオペレーターを有する強力な合成プロモーター、効
果的なリボソーム結合部位および挿入遺伝子の下流の合成転写ターミネーターを
含む、発現ベクターｐＨＥ４にサブクローニングした。発現プラスミドをＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２由来の株ＳＧ１３００９に形質転換した。ＩＰＴＧの導入の後に
、ＭＰＩＦ−１を不溶性タンパク質として生成し、そしてこれを抽出し、そして
５ｍＭのシステインの存在下で１．７５ＭのグアニジンＨＣＬ中でリフォールデ
ィングした。発現されたタンパク質は、外部Ｍｅｔ（開始コドン）をＮ末端に有
し、そして単純化のために、ＭＰＩＦ−１の第一の残基とみなされる。このタン
パク質を、強力なカチオン交換カラム（多孔質ＨＳ−５０）、アニオン交換カラ
ム（多孔質ＨＱ−５０）およびカチオン交換カラム（多孔質ＣＭ−２０）に連続
的に通すことによって均一に精製し、そして最後に、サイズ排除（Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ−１００）カラムに通した。全長の９９アミノ酸の成熟ＭＰＩＦ−１
を、ＭＰＩＦ−１タンパク質に関して概説したように、クローニングし、発現さ
せ、そして精製した。
【１１０１】 （沈降平衡。）分析用超遠心分離実験を、ＢｅｃｋｍａｎモデルＸＬ−Ａ超遠
心機において、２０℃、回転速度２３，０００ｒｐｍ、２８，０００ｒｐｍおよ
び４０，０００ｒｐｍで実施した。実験を、異なる緩衝液中およびイオン強度の
２つの異なる出発濃度において実施して、これらの二量化に対する効果を研究し
た（表１０）。吸光度を２８０ｎｍで測定し、そしてデータを、０．００３ｃｍ
のステップサイズを用いる５つの連続した放射状走査の平均として収集した。デ
ータを以下の式に当てはめた： Ｃr＝Ｃ0ｅｘｐ（ＭＨδ）＋Ｃ0 2Ｋaｅｘｐ（２ＭＨδ）＋Ｅ ここで、δは、（ｒ2−ｒ0 2）であり、Ｈ＝（１−νρ）（ω2／２ＲＴ）であり
、ＣrおよびＣ0は、それぞれ半径ｒおよびｒ0における濃度であり、Ｍは、モノ
マーの分子量であり、νは、部分比容積であり、ρは、溶媒の密度であり、ωは
、ローターの角速度であり、Ｋaは、モノマー−ダイマー平衡における会合計数
であり、そしてＥは、ベースラインオフセットである。部分比容量を、個々のア
ミノ酸の部分比容量の重量平均から計算した。データを、ＸＬ−Ａに関してＢｅ
ｃｋｍａｎにより提供されるＭｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ４．１ソフトウ
ェアを使用して、非線形最小二乗法によって、式に当てはめた。当てはめの質は
、χ2（残差の自乗の合計）、および系統的偏差に関する残差の試験によって特
徴付けられる。これらのデータを、単一の種またはモノマー−ダイマーのモデル
に対して当てはめた。ＭＰＩＦ−１およびＭＰＩＦ−１（１〜９９）の理論的分
子量は、それぞれ８８５４．６および１１３６７．６であり、そしてこれらのデ
ータを、全ての溶液条件下の両方のタンパク質に対して、モノマーに当てはめ得
る（表１０）。
【１１０２】
【表１０】 1３つのロータ速度；２３，０００ｒｐｍ、２８，０００ｒｐｍおよび４０，０
００ｒｐｍにおけるデータの当てはめから計算した分子量。
【１１０３】 （ＮＭＲ分光法。）全てのスペクトルを、３５℃で、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔ
ｙ Ｐｌｕｓ ６００またはＩＮＯＶＡ ５００−ＭＨｚ分光計（両方が場勾配
アクセサリーを備える）で、収集した。タンパク質濃度は、９０％Ｈ2Ｏ／１０
％2Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ）または９９．９９％2Ｈ2Ｏ中２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍ
Ｍアジ化ナトリウム（ｐＨ５．２）の中で、２ｍＭであった。化学シフトは、Ｗ
ｉｓｈａｒｔらの方法（Ｗｉｓｈａｒｔ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭ
Ｒ ６：１３５−１４０（１９９５））を使用して、ＤＳＳを参照した。主鎖の
ＮＨ、Ｎ、Ｃα、およびＣβの共鳴の帰属を、ＨＮＣＡＣＢおよびＣＢＣＡ（Ｃ
Ｏ）ＮＨ実験に基づいて、行った（Ｍｕｈａｎｄｉｒａｍ，Ｄ．Ｒ．およびＫａ
ｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１０３：２０３−２１６（１９９４
））。側鎖の原子の化学シフトを、15Ｎ編集した全関連分光学（15Ｎ−ｅｄｉｔ
ｅｄ ｔｏｔａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（Ｔ
ＯＣＳＹ）（Ｚｈａｎｇ，Ｏ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ ＮＭＲ ４：８４５−８
５８（１９９４））およびＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ（Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｍ
ａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｂ １０１：３３３（１９９３））の実験から帰属した。
高分解能二次元1Ｈ−1Ｈ核オーバーハウザー増強分光法（ＮＯＥＳＹ）、ＴＯＣ
ＳＹおよびＤＱＦ−ＣＯＳＹの実験を使用して、芳香族部分を帰属した。プロト
ン間距離を、15Ｎ編集したＮＯＥＳＹ（混合時間５０ｍｓおよび１５０ｍｓ）お
よび15Ｎ／13Ｃ編集したＮＯＥＳＹ（混合時間７５０ｍｓ）の実験（Ｐａｓｃａ
ｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｂ １０３：１９７−２０１（１
９９４））から誘導した。ＮＯＥクロスピーク強度を、それぞれ２．８Å、３．
５Å、４．０Å、および５．０Åの上側距離拘束に対応して、強、中程度、弱、
または非常に弱に分類した。立体非特異的に帰属されたメチルプロトンおよびメ
チレンプロトンの上限を、中央平均によって適切に補正した。さらに、０．５Å
をこの上境界に加算して、メチルプロトンを含む距離に関するより高い強度に対
して補正した。φ拘束を、ＨＮＨＡ実験（Ｋｕｂｏｎｉｗａ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．
Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：７６８（１９９５））から得、そしてβプロトン
の立体特異的帰属を、ＨＡＣＡＨＢ実験から誘導される3Ｊカップリング定数（
Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５３１２−
５３１５（１９９５））ならびにＮＯＥＳＹスペクトルにおけるＮＨおよびＣα
ＨからＣβＨプロトンへのＮＯＥの相対強度から得た。Ｌｅｕ２５および６６の
メチルプロトンの立体特異的な帰属を、χ１の角度を確立した後に、ＣαＨ対Ｃ
Ｈ3プロトンの相対ＮＯＥ強度に基づいて、行った。
【１１０４】 （水素結合拘束） 水素結合するための可能な候補は、最初、2Ｈ2Ｏ中にタン
パク質を溶解することの２４時間以内に記録される一連の２Ｄ1Ｈ−15ＮＨＳＱ
Ｃスペクトルからのゆっくりと交換するアミドプロトンを観察することを基礎に
同定された。各水素結合について、２つの距離の拘束を用いた（ｒNH-O、１．８
−２．３ÅおよびｒN-O、２．４−３．３Å）。水素結合することの拘束は、最
初のセットの構造が算出された後にのみ用いられた。水素結合アクセプターとの
距離および角度の拘束を満足したアミドプロトンのみを構造算出に用いた。
【１１０５】 （データプロセッシングおよび構造算出） すべてのＮＭＲスペクトルは、ｎ
ｍｒＰｉｐｅプログラムパッケージソフト（Ｄｅｌａｇｌｉｏ、Ｆら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｍｏｌ．ＮＭＲ ６：２７７−２９３（１９９５））を用いてプロセッシング
した。構造は、プログラムＸＰＬＯＲを用いるハイブリッド距離幾何学的動力学
的シミュレーションアニーリング方法により算出した（Ｂｒｕｅｎｇｅｒ、Ａ．
Ｔ．、ＸＰＬＯＲ 第３．１版、マニュアル、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ（１９９３））。合計７１３の非冗長ＮＯＥ距離拘
束（３２０内部残基、１７８連続、８４中程度範囲および１３２長範囲ＮＯＥ）
を用いた。さらに、８２二面角（５３φおよび２９χ1）および３６水素拘束（
１８水素結合から）を最終構造算出に用いた。最初の構造は，ＮＯＥ拘束のみで
生成し、そして次の構造算出には、二面角および水素結合拘束を含めた。このシ
ミュレーションアニーリング算出は、ＸＰＬＯＲ第３．１版中の標準の力場パラ
メーターセットおよびトポロジーファイルを用いて実施した。合計５０構造を生
成し、そして最良の３０構造を最低エネルギーおよび良好な立体化学性質を基に
選択した。
【１１０６】 （動力学） 15Ｎ−Ｔ1、Ｔ2および［1Ｈ］−15Ｎ ＮＯＥ実験は、パルスシ
ークエンスのグラジエントバージョンを用いて均一に標識された15Ｎ ＭＰＩＦ
−１に対して３５℃で記録した。すべてのスペクトルは、５４４（ｔ2）および
１２８（ｔ1）リアルポイントで獲得し、そして３秒のサイクル遅延をＴ2につい
て、および１．２秒をＴ1実験に用いた。［1Ｈ］−15Ｎ ＮＯＥを、プロトン飽
和ありまたなしでＨＳＱＣスペクトルを記録することにより測定した。ＮＯＥな
しのスペクトルを、５秒の遅延でそしてＮＯＥありのスペクトルを２秒の遅延お
よび３秒のプロトン飽和で記録し、遷移間で５秒の同じ遅延を与えた。スペクト
ルは、ＮＭＲＰｉｐｅおよび最初の二次元15ＮＴ1を用いてプロセッシングし、
そしてＴ2スペクトルをプログラムＰＩＰＰを用いて手動で割り当てた。次のス
ペクトルは、プログラムＣＡＰＰを用いて自動的に釣った。Ｔ1およびＴ2値を、
２パラメーター指数遅延に対する交差ピークの非線形最小自乗適合により得た。
Ｔ1およびＴ2値における不確実さは、適合の標準的偏差として捕らえた。ＮＯＥ
値は、プロトン飽和ありおよびなしで記録されたピーク強度の比から得た。ＮＯ
Ｅ値における不確実さは、Ｆａｒｒｏｗら、１９９４（Ｆａｒｒｏｗ、Ｎ．Ａ．
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：５９８４−６００３（１９９４））により
規定されるスペクトルのベースラインから推定された。
【１１０７】 （結果） （沈降平衡） 会合するケモカインの能力は、ｐＨおよびイオン強度のような
溶液条件に依存している。ＭＰＩＦ−１の会合性質および完全長ＭＰＩＦ−１は
、異なるｐＨおよびイオン強度で超遠心分離法を用いて調べた。結果の要約は表
１０に示される。このデータは、両方のタンパク質が実験条件下ではモノマーで
あり、そして会合する傾向がないことを示す。ＭＰＩＦ−１のモノマー状態は、
ＮＭＲ構造と一致し、そしてまた15Ｎ動力学からの相関時間の算出からである。
【１１０８】 （ＭＰＩＦ−１の構造的統計学） ３０の最終シミュレーションアニーリング（ＳＡ）構造の統計学を表１１に示
し、そして平均構造の個々の構造の重ね合わせを図５８Ａに示す。このタンパク
質の構造は、末端残基１−１０および６７−７７を除き良く規定されている。
【１１０９】 一般化された構造の性質は、立体化学、水素結合、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ
プロット中の占領の領域、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓコンタクト、包埋荷電残
基、包埋残基の数およびパッキング欠陥のような種々の基準について、プログラ
ムＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ、Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙ
ｓｔａｌｌｏｇｒ．２６：２８３−２９１（１９９３）およびＶＡＤＡＲ（ＶＡ
ＤＡＲ−タンパク質構造の構造分析。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｎｃｅ．ｕａ
ｌｂｅｒｔａ．ｃａから入手可能）を用いて試験した。すべての３０の構造は、
高改造構造であると予期される上記の規準に合致した。
【１１１０】
【表１１】 ａ ＮＯＥおよびねじれ角度に対する値は、それぞれ５０ｋｃａｌ．モル-1Å2
および２００ｋｃａｌモル-1ｒａｄ-2の力定数を用いて井戸型ポテンシャルから
算出した。 ｂ 結合、角度および不規則（ｉｍｐｒｏｐｅｒ）の値は、完全立体化学を基に
理想値からの偏差を示す。 ｃ 平均構造上に重ね合わせた３０の最終構造のｒ．ｍ．ｓ．相違 すべての構造およびエネルギー最小化平均構造は、良好な共有結合幾何学（表
１１）および最小ＮＭＲ拘束妨害を示した。３０のＳＡ構造のいずれも０．２Å
より大きいＮＯＥ妨害および２゜より大きい二面角を有さなかった。すべての３
０構造と平均構造との間の残基１１〜６６についてのｒ．ｍ．ｓ．分布は、骨格
原子について０．５７Å、そして重原子について１．０９Åである（図５９Ａ、
Ｂ）。ねじれ角度の正確さは、順序パラメータＳに関して評価される。構造化さ
れた残基１１〜６６についてのΦおよびΨねじれ角に対する順序パラメータは＞
０．９５であり、構造の骨格が良く規定されていることを示す（図５９Ｃ、Ｄ）
。χ１についての順序パラメータは図５９Ｅに示す。図６０Ｆは、溶媒接近可能
な領域を示し、そして低い値は、側鎖が包埋され、そしてバルク溶媒に接近不能
であることを示す。これらの残基は、疎水性である傾向にあり、そして一般に高
順序パラメータχ１が＞０．９であることによって証明されるように高度に構造
化されている。低いＳを示す大きな疎水性物質の１つの例外はＩｌｅ−１３であ
る。それは、溶媒に晒され、そしていくつかのＣＸＣおよびＣＣケモカインで保
存され、そして構造−機能研究は、レセプター結合におけるこの残基の本質的役
割を示した。すべての３０構造におけるすべてのねじれ角度がＲａｍａｃｈａｎ
ｄｒａｎプロットの好ましい領域に入ることが観察される。残基の７２％がコア
（最も好ましい）領域に、２３％が許可領域に入り、そして１％が寛大領域に入
る。
【１１１１】 （ＭＰＩＦ−１の溶液構造） ＭＰＩＦ−１の構造は、代表的なケモカイン折
り畳みを採用し、そしてＮ末端における伸長されたループからなり、３つのβス
トランドおよびＣ末端αヘリックスが続く（図５８Ｂ）。ＣＣモチーフに先行す
る最初の１０残基は、ＮＯＦがないかまたは連続的ＮＯＥのみを示し、Φおよび
Ψの低順序パラメータを有し、そしてそれ故規定された構造を欠いている。これ
には、３10ヘリックス（残基２１〜２４）中に至る一連のターン（残基１３〜２
０）を含むＮ末端ループが続く。最初のβストランド（残基２７〜３１）は、Ｉ
ＩＩ型ターンにより、第３のβストランド（残基４８〜５２）にＩ型ターンによ
り連結される第２のβストランド（残基３９〜４４）に連結される。第３のスト
ランドは、ＩＩＩ型ターンを経由してヘリックス（残基５６〜６６）中に至る。
残基６７〜７７は、長い範囲のＮＯＥ、２〜３の中程度ＮＯＥ、および低順序パ
ラメータの欠如と一致して大部分は構造化されていない。それぞれ第１のストラ
ンドおよび第２のストランドの末端に位置するＴｈｒ−３１とＴｈｒ−４４のヒ
ドロキシルプロトンは、ストランドを横切って骨格カルボニルにＨ結合し、そし
てそれ故構造的役割を演じる。６つのシステインのうち、４つのシステインがす
べてのＣＣケモカインの特徴である：Ｃｙｓ−１１はＣｙｓ−３５とジスルフィ
ドを形成し、第１および第２のストランドを連結するターンの一部であり、そし
てＣｙｓ−１２は、第３のβストランド中のＣｙｓ−５１とジスルフィド結合を
形成する。ＭＰＩＦ−１は、３10ヘリックス中のＣｙｓ−２２およびαヘリック
ス中のＣｙｓ−６２である、２つの付加的なシステインを有していた。システイ
ンの化学的シフトのデータベースを作成し、そしてＣβシフトが、フリーおよび
ジスルフィド結合した形態で特有に異なることが観察された（未公開データ）。
Ｃｙｓ−２２およびＣｙｓ−６２のシフトは、それらがジスルフィド結合形成に
関与することを示す。構造は、これらのシステインが近接してジスルフィド結合
を形成することを示し、そしてこれはまた、らせん残基の特徴である、Ｃｙｓ−
６２についての小カップリング定数、遅延交換アミドプロトンおよびＮＯＥパタ
ーンのようなＮＭＲ性質からもまた明白である。Ｃｙｓ−１２−Ｃｙｓ−５１ジ
スルフィド結合は、構造の大体において左利きよじれ（ｔｗｉｓｔ）を採用し、
その一方その他の２つのジスルフィド結合は構造化されていない。この構造のコ
アは、αヘリックスの残基とβストランドの残基との間の多くの長い範囲の疎水
性接触（Ｉｌｅ−２０、Ｌｅｕ−２５、Ｔｙｒ−２８、Ｐｈｅ−２９、Ｖａｌ−
４０、Ｐｈｅ−４２、Ｐｈｅ−５０、Ａｌａ−５２、Ｖａｌ−５９、Ｍｅｔ−６
３、およびＬｅｕ−６６）によって良好に規定されている。ジスルフィド結合の
他に、コア構造に関してＮ末端ループに適応するＴｈｒ−３１、Ｇｌｙ−３９、
Ｔｙｒ−１５、Ｃｙｓ−１１、Ｃｙｓ−１２およびＣｙｓ−５１とＮ末端との間
の長い範囲のＮＯＥが、それらの機能に必須であり得た。
【１１１２】 （動力学） 15ＮＴ1、Ｔ2およびＮＯＥ緩和データは、７３の予期された共鳴
のうち６０について得ることができた（図６０Ａ〜Ｃ）。データは、４つのプロ
リンについて利用可能ではなく、そして残りの残基Ｍｅｔ−１、Ａｓｐ−２、Ｈ
ｉｓ−５、Ａｌａ−６、Ｓｅｒ−８、Ｉｌｅ−１３、Ｓｅｒ−１９、Ｓｅｒ−３
３、Ｇｌｕ−３４、Ｓｅｒ−３６、Ｌｙｓ−４６、Ｌｅｕ−６６およびＬｙｓ−
６７については、化学的シフト重複か、または信号が信頼し得る強度の適格には
弱すぎるためのいずれかに起因して得られなかった。この15ＮＴ1、Ｔ2およびＮ
ＯＥ緩和データは分析され、Ｌｉｐａｒｉ−Ｓｚａｂｏ（Ｌｉｐａｒｉ、Ｇ．、
およびＳｚａｂｏ、Ａ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：４５４６−４
５５９（１９８２ａ）；Ｌｉｐａｒｉ、Ｇ．、およびＳｚａｂｏ、Ａ．、Ｊ．Ａ
ｍ．Ｓｏｃ．１０４：４５５９−４５７０（１９８２ｂ））の形式論とは独立の
モデルを用いて、ＭＰＩＦ−１の内部動力学を記載する。各残基についての緩和
データは、２つの別個の時間スケールで生じる内部の動きを可能にするＳ2−τc （モデル１）、Ｓ2−τc−τe（モデル２）、Ｓ2−τc−τex（モデル３）、Ｓ2 −τc−−τex（モデル４）および２−時間スケールモデル（モデル５）を含む
異なるモデルに適合させた（Ｃｌｏｒｅ、Ｇ．、ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．１１２：４９８９−４９９１（１９９０））。適切なモデルを、各残基につ
いて適合の質を評価することによって選択した。最適τcを、最初、残基あたり
を基礎に、等方的スペクトル密度関数を用いて実験的および算出されたＴ1、Ｔ2 、およびＮＯＥ値を最小にすることによって算出した。内部の動きが１００ｐｓ
より遅く、そしてＴ2が立体配座交換に起因して有意に短縮されない条件下で、
Ｔ1／Ｔ2比（図６０Ｄ）は、順序バラメータまたは内部動きとは独立していると
考えられ、そして全体相関時間τcの推定を提供する。これらの残基は、15Ｎ［1 Ｈ］ＮＯＥ値＜０．６５を有するものとして同定され、そしてそれに対するＴ1
／Ｔ2比は平均から１ＳＤ外であった。この基礎を基に、２６残基が排除され、
そして残りの３４残基を基礎にτcが４．６±０．２ｎｓであると算出された。
一般化された秩序パラメータ（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｏｒｄｅｒ ｐａｒａ
ｍｅｔｅｒ：Ｓ2）、化学交換（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅ：Ｒex）
、およびアミノ酸配列の関数としての局所相関時間（ｌｏｃａｌ ｃｏｒｒｅｌ
ａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ：τe）を図６０Ｅ〜Ｇに示す。一般化秩序パラメータは
、内部運動の大きさの尺度を提供する。ここで、Ｓ2＝１は所定のＮ−Ｈ結合ベ
クターが剛直であることを意味し、Ｓ2＝０はその運動が制限されていないこと
を示す。Ｃ末端中の残基６７〜７７およびＮ末端中の最初のシステインの前の残
基１〜１０は、低い秩序パラメータ（Ｓ2＜０.７）を示す。両末端はＮＭＲ構造
において十分に定義されておらず、そしてこれらの動力学データは、これらの残
基は元来移動可能であること、および構造の欠如が実験的拘束（ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）の欠如に起因しないことを確証する。末端を
除き、残基１１〜６６の平均Ｓ2値は０.８４±０.０６である。低い秩序パラメ
ータを示す他の残基は、Ｎ末端ループの部分である、Ａｒｇ−１８およびＩｌｅ
−２０（０.７）である。残基Ｔｙｒ−１５、Ｃｙｓ−２２、Ｔｈｒ−４４、Ｃ
ｙｓ−５１、Ａｌａ−５２、Ａｓｎ−７７の緩和データ（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ
ｄａｔａ）は、交換項（ｅｘｃｈａｎｇｅ）を必要とし（モデル３および４）
（図６０Ｇ）、末端残基６９〜７３の緩和データは２時間スケールモデル（ｔｗ
ｏ ｔｉｍｅ ｓｃａｌｅ ｍｏｄｅｌ）を必要とした。残基Ａｒｇ−３、Ｐｈ
ｅ−４およびＴｈｒ−７４はいかなるモデルにも適合し得なかった。他のすべて
の残基は単純モデルに適合し得た。
【１１１３】 （考察） ＭＰＩＦ−１は溶液中でモノマーである。ＮＭＲ構造決定および15Ｎ動力学か
らの回転相関時間の計算は、ＭＰＩＦ−１が実験条件（５０ｍＭアセテート、ｐ
Ｈ５.２）下でモノマーとして存在することを示す。種々の溶液条件下での超遠
心研究もまた、ＭＰＩＦ−１がモノマーとして存在することを示す（表１０）。
【１１１４】 構造研究および溶液研究は、ケモカインにおける会合特性にいくつかの洞察を
提供したが、相互作用の特異性に寄与する分子的特徴は捉えどころのないままで
ある。ＣＣケモカインは会合能力において最も大きな差異を示し、非常に高次元
のポリマーからモノマーまで存在し得る。ＲＡＮＴＥＳ（Ｓｋｅｌｔｏｎ，Ｊ．
Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：５３２９−５３４２（１９９５））
、ＭＩＰ−１α（Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７４：１６０７７−１６０８４（１９９９））、ＭＩＰ−１β（Ｌｏｄｉ，
Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１７６２−１７６７（１９９４））は、
天然のｐＨで高度に会合している（＞１００ｋＤａ）が、より低いｐＨではダイ
マーに可逆的に解離するが、Ｉ−３０９、ＨＣＣ−２およびＭＣＰ−３はモノマ
ーである（Ｐａｏｌｉｎｉ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：２７０
４−２７１７（１９９４）；Ｓｔｉｃｈｔ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３８：５９９５−６００２（１９９９）；Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．ら、ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．３９５：２７７−２８２（１９９６））。
【１１１５】 他方、ＣＸＣケモカインは、その会合挙動がより剛直であり、ダイマーおよび
テトラマーのみを形成する（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏ
ｃｙｔｅ Ｂｉｏ．５７：７０３−７１１（１９９５））。その構造に基づく二
量体化に重要であると考えられた残基のいくつかは、ほとんどもしくは全く効果
を有さず、逆にダイマー界面から離れた残基の変異は、モノマーを生じた（Ｃｚ
ａｐｌｅｗｓｋｉ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１６０７７
−１６０８４（１９９９）；Ｌａｕｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３９：３４０１−３４０９（２０００）；Ｐａａｖｏｌａ，Ｃ．Ｄ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３３１５７−３３１６５（１９９８））
。明らかに、一次配列で遠く離れた残基による種々の安定化力が、ダイマーおよ
びテトラマー会合の促進に役割を果たす。
【１１１６】 しかし、ＣＸＣおよびＣＣケモカインの両方について、モノマーが、白血球上
の７−ＴＭレセプターに結合しそしてこれを活性化するに十分であるという説得
力あるデータが存在する。３つの好中球活性化ケモカイン（ＩＬ−８、ＮＡＰ−
２、およびＭＧＳＡ）をモノマー状態に捕捉してそれらが二量体化し得ないよう
することにより、モノマーが、インビトロ機能アッセイにおいて、ネイティブの
タンパク質と同程度に活性であることが以前に示された（Ｒａｊａｒａｔｈｎａ
ｍ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９０−９２（１９９４）；Ｒａｊａｒａ
ｔｈｎａｍ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１７２５−１７２９（
１９９７））。同様に、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、およびＭＩ
Ｐ−１βにおける変異研究もまた、モノマーがレセプター結合性種であることを
示した（Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４
：１６０７７−１６０８４（１９９９）；Ｌａｕｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：３４０１−３４０９（２０００）；Ｐａａｖｏｌ
ａ，Ｃ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３３１５７−３３１６５（
１９９８））。
【１１１７】 ダイマーおよびより高次のオリゴマーの役割（もしあれば）は正確には何かと
いう疑問が生じる。最近の研究は、この役割はプロテオグリカンへの結合および
濃度勾配の確立（白血球を輸送するために必須であるプロセス）におけるもので
あり得ることを示唆する（Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３６：１３５７０−１３５７８（１９９７）；Ｋｏｏｐｍａｎｎ，Ｗ
．およびＫｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０１
０３−１０１０９（１９９７））。プロテオグリカン結合に重要な残基は、ＣＸ
ＣおよびＣＣケモカインの両方において塩基性残基（例えば、アルギニン、リジ
ン、およびヒスチジン）であり、クラスター化しそして７−ＴＭレセプターへの
結合に重要な領域から離れて局在する傾向にある。この研究において、ＭＰＩＦ
−１は、溶液中でダイマーを形成するいかなる性向も示さなかった。ＭＰＩＦ−
１および他のモノマーケモカインＩ−３０９およびＨＣＣ−２が、細胞表面プロ
テオグリカンの存在下で二量体化するかどうかは、研究中である。
【１１１８】 ケモカインの興味をそそる特性は、ＮまたはＣ末端のいずれかで異なってプロ
セシングされた複数種の存在である。いくつかのケモカインは、ＭＰＩＦ−１と
同様に、ＮまたはＣ末端のいずれかでタンパク質分解的にプロセシングされて機
能的なタンパク質を生じる大きな前駆体として分泌される。ＮＡＰ−２、β−ト
ロンボグロブリン（βＴＧ）および結合組織活性化タンパク質ＩＩＩ（ＣＴＡＰ
−ＩＩＩ）は、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）のＮ末端産物であり、ＮＡＰ
−２のみが好中球の強力なアクチベータであるがその他は不活化前駆体と考えら
れる。４つすべてがダイマーおよびテトラマーを形成し（Ｙａｎｇ，Ｙ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０１１０−２０１１８（１９９４））、さら
にＮＡＰ−２およびＣＴＡＰ−ＩＩＩ（Ｃ末端で異なってプロセシングされる）
もまた細胞培養物から単離された（Ｅｈｌｅｒｔ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１６１：４９７５−４９８２（１９９８））。
【１１１９】 機能的ケモカインのＮ末端領域は、最初の保存されたシステインの前の１０ア
ミノ酸程度からなり、そして変異研究により、レセプター結合および活性化につ
いてのこれら残基の本質的役割が示された。短縮化ＣＣケモカインは、高度に異
なり通常でない特性を示す（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏ
ｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．５７：７０３−７１１（１９９５））。例えば、ＭＣＰ−
１において、最初の４残基の欠失は活性の損失を生じるが、最初の５残基の欠失
は活性の実質的な回復を生じる。さらなる欠失は機能の損失を生じるが、レセプ
ターへ結合する能力およびアンタゴニストとして機能する能力は保持される（Ｇ
ｏｎｇ，Ｊ．−Ｈ．およびＣｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１８１：６３１−６４０（１９９５））。ＩＬ−８（ＣＸＣケモカイン）のＮ
末端における連続欠失は、活性増大、活性喪失、次いでアンタゴニストへの転換
を生じる（Ｍｏｓｅｒ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７１２５−
７１２８（１９９３））。ＣＣケモカインにおける最初のシステインの前のＮ末
端残基の短縮化はモノマー形成に好都合であることもまた観察されており、そし
てＮ末端残基の長さが二量体化において役割を果たすことが示唆されている。
【１１２０】 ＭＰＩＦ−１遺伝子のオールタナティブスプライシングは、それぞれ９９アミ
ノ酸および１１６アミノ酸である２つの形態のタンパク質を生じる（それぞれＣ
Ｋβ８およびＣＫβ８−１と呼ぶ）（Ｙｏｕｎ，Ｂ．−Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９
１：３１１８−３１２６（１９９８））。この観察はＣＣケモカインの間で例外
である。なぜなら、この長さの差異はＮ末端領域に存在するからである（それぞ
れ、最初のシステインの前の３２および４９アミノ酸）。両方の形態のタンパク
質が、骨髄始原細胞阻害および単球化学走性において同様の活性を有することが
示された。バキュロウイルスにおける９９アミノ酸タンパク質の発現は、３つの
形態のタンパク質（全長および２つの短縮化形態）を生じた。短縮化形態は、単
球化学走性および骨髄始原細胞阻害アッセイの両方において、より強力であるこ
とが見出された。種々の溶液条件下でのＭＰＩＦ−１および完全長ＭＰＩＦ−１
のデータ（表１）は、それらがモノマーであり、Ｎ末端残基の長さとダイマーを
形成する能力との間に相関がないことを示す。ＭＰＩＦ−１の改変体の効力の差
異は、他のケモカインと同様に、インビボで役割を果たす。なぜなら、白血球の
動員および活性化は空間的にも時間的にも調節されるからである。白血球活性化
の１つの局面は、ケモカインに作用ししたがってその活性および機能を調整する
ペプチダーゼおよびプロテアーゼの放出である。
【１１２１】 構造の説明および他のケモカインとの比較。ＭＰＩＦ−１は、３つのβ鎖およ
びその上に横たわるαヘリックスからなる代表的なケモカイン折り畳みをとる。
構造のコアは十分に規定されており、骨格および重い原子についての最低のｒｍ
ｓｄ、Φ、Ψおよびχ１の高秩序パラメータ、緩慢変換アミドのほとんどが、鎖
間にＨ結合を形成するもの、およびαヘリックス中のものであることを示す。い
くつかのＣＣケモカイン構造（ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ，ＭＣＰ−１、ＭＣ
Ｐ−３、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）、およびＨＣＣ−１の構造を含む）が
解明された（Ｌｏｄｉ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１７６２−１７
６７（１９９４）；Ｓｋｅｌｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３４：５３２９−５３４２（１９９５）；Ｈａｎｄｅｌ，Ｔ．Ｍ．およびＤｏｍ
ａｉｌｌｅ，Ｐ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：６５６９−６５８４
（１９９６）；Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３９５：２７７−２
８２（１９９６）；Ｃｒｕｍｐ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３
：２２４７１−２２４７９（１９９８）；Ｓｔｉｃｈｔ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ３８：５９９５−６００２（１９９９））。ＭＰＩＦ−１の二次
および三次の構造的要素は、他のＣＣケモカインにおいて観察されたものと類似
する（図６１）が、ＭＰＩＦ−１と他のＣＣケモカインとの間の配列同一性は約
２５から６０％まで変化する（図６２）。ＭＰＩＦ−１および他のＣＣケモカイ
ンの構造化領域（残基１１〜６６）の骨格の重ね合わせは、１.５から２.０Åま
でのｒｍｓｄを示す。最低のｒｍｓｄは構造化領域（鎖およびヘリックス）につ
いて観察され、より高いｒｍｓｄはＮ末端残基、Ｎ末端ループ、および３０ｓタ
ーンについて観察される。最も大きな配列の差異は、タンパク質のこれらの領域
について観察され、そしてこれらはまた、比較的十分に規定されていない領域で
あり、移動可能であり、そして機能的に重要である。
【１１２２】 ４つのシステイン（Ｃｙｓ−１１、Ｃｙｓ−１２、Ｃｙｓ−３５、Ｃｙｓ−５
１）の他に、残基Ｉｌｅ−１３、Ｔｙｒ−１５、Ｉｌｅ−２０（Ｎ末端ループ）
、Ｌｅｕ−２５、Ｔｙｒ−２８、Ｐｈｅ−２９、Ｔｈｒ−３１（第１β鎖）、Ｖ
ａｌ−４０、Ｉｌｅ−４１、Ｐｈｅ−４２、Ｔｈｒ−４４（第２β鎖）、Ｐｈｅ
−５０、Ａｌａ−５２（第３β鎖）、Ｖａｌ−５９、Ｍｅｔ−６３およびＬｅｕ
−６６（αヘリックス）（ＭＰＩＦ−１配列に従う番号付け）が保存されている
か、または保存的に置換されている（図６２）。ほとんどが、鎖またはヘリック
スのいずれかに位置する嵩高い疎水基であり、そして異なる構造において同じ側
鎖コンホメーションをとり、そして構造足場を構成する。Ｔｈｒ−３１およびＴ
ｈｒ−４４は完全に埋没した極性残基であり、その構造は、ヒドロキシルの陽子
が、鎖を横切る骨格カルボニルにＨ結合しており、したがって構造的役割を果た
すことを明らかにする。
【１１２３】 構造は、Ｃｙｓ１２−Ｃｙｓ５１ジスルフィド結合が優勢に左巻き螺旋コンホ
メーションをとることを明らかにする。15Ｎ動力学データは、システインおよび
３つすべてのジスルフィド結合の近傍の残基のいくつかが、コンホメーション変
化を示すことを示す。これは、タンパク質のこれらの領域が移動可能であり、コ
ンホメーション変化を受けることを示す。Ｃｙｓ１１−Ｃｙｓ３５ジスルフィド
結合は、最も大きな分節動（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｍｏｔｉｏｎ）を示し、そし
て例えばＩＬ−８において、ジスルフィド結合に対するかすかな摂動は、構造変
化を伴わずに、機能の有意な損失を生じることが示された（Ｒａｊａｒａｔｈｎ
ａｍ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：７６５３−７６５８（１９９
９））。Ｎ末端領域、ジスルフィド結合および３０ｓターンの動力学は、特異結
合および活性化において欠くことのできない役割を果たす（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗ
ｉｓ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．５７：７０３−７１１（１
９９５））。ＭＰＩＦ−１は、ＨＣＣに対して最も高い配列相同性を示し、ＨＣ
Ｃはまた６つのシステインを有し、ＣＣＲ１に結合し、そして幹細胞増殖のイン
ヒビターである。ＭＰＩＦ−１、ＨＣＣ−２および他のＣＣケモカインの間の１
つの差異は、ＭＰＩＦ−１（Ｇｌｎを有する）およびＨＣＣ−２（Ｇｌｙを有す
る）の他に、すべてのＣＣケモカインにおける５８位のＴｒｐ残基である。ＭＰ
ＩＦ−１およびＨＣＣ−２構造は、インドール側鎖の立体的な嵩が、ジスルフィ
ド結合に有利であることを明らかにする。
【１１２４】 保存された疎水性物質に加えて、荷電した残基のいくつかもまた、保存されて
いる；Ｎ末端ループのＡｒｇ−１８および４０ｓターンのＬｙｓ−４５およびＡ
ｒｇ４８は、溶媒に露出しており、そして負に荷電したプロテオグリカンに結合
することに関係している（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７３：２９６４１−２９６４７（１９９８）；Ｋｏｏｐｍａｎｎ，Ｗ
．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２１２０−２１２７（１９９９）。しかし
、プロテオグリカン結合ドメインの位置および結合に関与する荷電残基の相対的
重要性は、ケモカインごとに様々である。ＩＬ−８（Ｋｕｓｃｈｅｒ，Ｇ．Ｓ．
Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１１１９３（１９９８））、ＰＦ−
４（Ｍａｙｏ，Ｋ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：３５７−３６５（１
９９５））およびＭＣＰ−１（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７３：２９６４１−２９６４７（１９９８））のＣ末端へリック
スにおける荷電残基、ＳＤＦ−１における第一鎖β鎖の残基（Ａｍａｒａ，Ａ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２３９１６−２５（１９９９））、なら
びにＭＩＰ−１α（Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｗ．およびＫｖａｎｇｅｌ．Ｍ．Ｓ．，Ｊ
．Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０１０３−１０１０９（１９９７））および
ＭＩＰ−１β（Ｋｏｏｐｍａｎｎ、Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２１
２０−２１２７（１９９９））における４０ｓターンおよびＮ末端ループの残基
は、プロテオグリカン結合に関係している。ＭＰＩＦ−１は、高度に塩基性のタ
ンパク質であり、そして４０ｓループに（Ｌｙｓ−４６）およびαへリックスに
（Ｌｙｓ−５７、Ａｒｇ−６４、およびＬｙｓ−６７）さらなる塩基性の残基を
有し、これは、それがプロテオグリカンにより強固に結合することを示す（図６
３）。
【１１２５】 （構造−機能） 単球の活性化：ＭＰＩＦ−１は、ＣＣＲ１に高い親和性で結合し、そして単球
の強力なアクチベーターであることが示されている（Ｎａｒｄｅｌｌｉ，Ｂ．ら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４３５−４４４（１９９９）；Ｂｅｒｋｈｏｕ
ｔ，Ｔ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９：５９１−５９６
（２０００））。ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、およびＨＣＣ−２
はまた、ＣＣＲ１に結合して活性化する。変異誘発研究は、第一のシステインに
先行するＮ末端残基とＮ末端ループの残基（第二のシステインと先行する３10へ
リックスとの間）が、ＣＸＣおよびＣＣケモカインの両方に対するレセプター結
合において重要な役割を果たすことを示している（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ
．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．５７：７０３−７１１（１９９５）
；Ｇｏｎｇ，Ｊ．−Ｈ．およびＣｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１８１：６３１−６４０（１９９５）；Ｍｏｓｅｒ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７１２５−７１２８（１９９３）；Ｐａｋｉａｎａｔｈ
ａｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６；９６４２−９６４８（１
９９７））。ケモカインリガンドのＮ末端ループ残基は、最初の結合部位を構成
するレセプターのＮ末端残基と相互作用することが示唆されている；この相互作
用は、必要に応じて、リガンドＮ末端残基をレセプター残基との相互作用に対し
て指向させ、コンホメーションの変化および機能的応答を誘発する（Ｃｒｕｍｐ
，Ｍ．Ｐ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６９９６−７００７（１９９７）；Ｃｌａ
ｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．５７：７０３
−７１１（１９９５））。
【１１２６】 ＭＩＰＩＦ−１構造において、Ｎ末端ループ残基は、十分に規定されており（
φ、ψについてＳ＞０．９５）、そして独特のコンホメーションに適合する。一
方、15Ｎ動力学データは、そのタンパク質のこの領域が、相対的に可動性であり
、そしてナノ秒以下での変動およびより遅いミリ秒スケールでコンホメーション
交換を示すことを示す。同様の観察を、エオタキシン（Ｃｒｕｍｐ，Ｍ．Ｐ．ら
、Ｐｒｏｔｅｎ Ｓｃｉ．８：２０４１−２０５４（１９９９）；Ｙｅ，Ｊ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ １５：１１５−１２４（１９９９）、ｖＭＩＰＩ
Ｉ（複数のＣＸＣおよびＣＣケモカインレセプターに結合するウイルスモノマー
ＣＣケモカイン）（ＬｉＷａｎｇ、Ａ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
８：４４２−４５３（１９９９））において、およびフラクタルカイン（ｆｒａ
ｃｔａｌｋｉｎｅ）（モノマーＣＸ3Ｃケモカイン）（Ｍｉｚｏｕｅ，Ｌ．Ｓ．
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１４０２−１４１４（１９９９））にお
いてなされている。Ｎ末端ループドメインは、３つ全てのジスルフィド結合に隣
接しており近位である。配列分析はまた、Ｉｌｅ−１３、Ｔｙｒ−１５、Ａｒｇ
−１８、およびＩｌｅ−２０（ＭＰＩＦ−１に従う番号付け）に対応する残基が
、他のＣＣケモカインにおいて保存されているかまたは同様に置換されており、
そしてこれらの残基の変異誘発が、それらのそれぞれのレセプターへの結合を減
少させることを明らかにする。Ｉｌｅ−１３は、二番目のシステインの後の最初
の残基であるが、すべてのＣＸＣおよびＣＣケモカインにおいて溶媒に露出して
おり、レセプターの活性化において直接的な役割を果たす可能性が非常に高い。
ＲＡＮＴＥＳにおいて、Ｎ末端ループ残基の重要性は、レセプター特異的である
ことが観察された：Ａｒｇ−１７は、ＣＣＲ１に対する結合にとって、Ｐｈｅ−
１２は、ＣＣＲ３に対する結合にとって、Ｐｈｅ−１２およびＩｌｅ−１５は、
ＣＣＲ５に対する結合にとって必須であった（Ｐａｋｉａｎａｔｈａｎ，Ｄ．Ｒ
．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：９６４２−９６４８（１９９７））。
ほとんどの構造において、Ｔｙｒ−１５およびＩｌｅ−２０は、包埋されており
、そして類似のコンホメーションに適合し、そして他の疎水性残基に対してパッ
ケージングされ、構造的役割を示す。これらの観察は、ＭＰＩＦ−１において、
Ｉｌｅ−１３およびＡｒｇ−１８が機能的役割を果たし、そしてレセプター結合
に直接関与しており、そしてＴｙｒ−１５およびＩｌｅ−２０が構造的足場の一
部として機能していることを示す。
【１１２７】 ＮＭＲ構造およびＭＰＩＦ−１の動力学データは、最初のシステインに先行す
るＮ末端残基が（明確な）構造を有していないことを示す。同様の観察が、モノ
マーＮＭＲ構造およびダイマーＣＸＣ構造の全てにおいてなされており、これは
、これらの残基の可動性が、レセプターとの最適な相互作用にとって必須である
ことを示す。好中球を活性化する全てのＣＸＣケモカインは、結合および活性化
にとって必須である最初のシステインに先行する特徴的な「ＥＬＲ」配列を有す
る（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．５
７：７０３−７１１（１９９５））。このようなサイン配列（ｓｉｇｎａｔｕｒ
ｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＣＣケモカインには存在せず、そして配列分析によ
ってはレセプター特異性についてのいかなる洞察も提供されない。さらに、ＣＣ
ケモカインは、複雑なリガンド−レセプタープロフィールを示す。単球、マクロ
ファージ、好酸球、およびＴ細胞を活性化するほとんどのＣＣケモカインは、複
数のレセプターに結合し、そしてほとんどのレセプターは、複数のケモカインに
結合する。一方、１つのみのレセプターへのリガンド結合の例が公知である（Ｌ
ＡＲＣおよびＣＣＲ６）。ＭＰＩＦ−１のＮ末端残基は、非常に少ないか、また
はＣＣＲ１に結合する他のＣＣケモカイン（ＨＣＣ−２、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴ
ＥＳおよびＭＩＰ−１α）との類似性は全くない。ＨＣＣ−２は、ＭＰＩＦ−１
に対する最も高い全体的配列相同性（約６０％）を示すが、しかし、Ｎ末端にお
いては全く相同性がない。ＣＣＲ１に加えて複数のレセプターに結合するＲＡＮ
ＴＥＳにおける最近の構造−機能研究は、特定のＮ末端残基を変異させることに
対するレセプター特異的応答を示した：Ｐｒｏ−２、Ａｓｐ−６、およびＴｈｒ
−７は、ＣＣＲ１に対する結合にとって；Ｐｒｏ−２およびＴｙｒ−３は、ＣＣ
Ｒ３に対する結合にとって；およびＴｙｒ−３およびＡｓｐ−６は、ＣＣＲ５に
対する結合にとって、必須であった。いずれのＮ末端残基も、ＭＰＩＦ−１とＲ
ＡＮＴＥＳとの間において同一ではなく、そして１つの残基のみが保存的に置換
されているにすぎない（ＲＡＮＴＥＳにおいてＴｙｒ−３そしてＭＰＩＦ−１に
おいてＰｈｅ−４）。Ｔｙｒ−３は、ＲＡＮＴＥＳにおいてＣＣＲ３に対する結
合について必須の役割を果たすことが示されており、そしてＭＰＩＦ−１がＣＣ
Ｒ３に結合し得るか否かは、依然として試験されるべきままである。興味深いこ
とに、Ｎ末端残基の長さ（側鎖の性質ではない）が、ＣＣＲ２に対するＭＣＰ−
１の結合にとって重要であることが最近示されている（Ｊａｒｎａｇｉｎら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１６１６７−１６１７７（１９９９））。
【１１２８】 （前駆細胞増殖の抑制） ＭＰＩＦ−１のすべての型（ｖｅｒｓｉｏｎ）が、前駆細胞の増殖を抑制する
ことが示されており、そして短縮型が、プロタンパク質よりもそれらの阻害にお
いてより強力であることが観察された。顕著なことに、ＣＣおよびＣＸＣケモカ
イン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−８、ＧＲＯ−β、ＰＦ−４、ＩＰ−１０お
よびＭＣＰ−１）は、前駆細胞の増殖を抑制することが示されているが、一方で
、関連するケモカイン（例えば、ＧＲＯ−α、ＮＡＰ−２、ＭＩＰ−１β、およ
びＲＡＮＴＥＳ）は、抑制性ではない。ケモカインのプロフィールは、前駆細胞
増殖を調整する能力は、それらの同族のケモカインレセプターの活性に関連して
いないことを示す。さらに、モノマー形態のＭＩＰ−１αは、天然のタンパク質
の凝集型よりも有意により強力であり（Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１６０７７−１６０８４（１９９９）、そして
ＭＰＩＦ−１は、モノマー形態で作用し得る。ＭＰＩＦ−１機能の分子的基礎の
これらの研究は、種々の疾患を有する患者（例えば、化学療法を受けている患者
）にとって、臨床に重要な意味を有する。
【１１２９】 本発明は、前述の説明および実施例に具体的に記載されるものとは異なるよう
に実施され得ることが明らかである。
【１１３０】 本発明の多数の改変および変更が、上記の教示に照らして可能であり、そして
それゆえ添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【１１３１】 本明細書において引用された全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、
本明細書において参考として援用される。米国特許出願第０８／９４１，０２０
号（１９９７年９月３０日出願）の開示は、その全体が本明細書において参考と
して援用される。
【１１３２】
【表１２】
【１１３３】
【表１３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＭＰＩＦ−１（配列番号１）をコードするｃＤＮＡ配列および対応す
る推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。最初の２１アミノ酸は、推定リーダ
ー配列を表す。すべてのシグナル配列は、バキュロウイルス発現タンパク質のＮ
末端ペプチド配列決定により決定された。
【図２】 図２は、ＭＰＩＦ−１（上部）（配列番号２）とヒトＭＩＰ−１α（下部）（
配列番号３６）との間のアミノ酸相同性を示す。すべてのケモカインの４つのシ
ステイン特性を示す。
【図３】 図３は、バキュロウイルス発現系におけるＭＰＩＦ−１の発現および３工程の
精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図４】 図４Ａ〜４Ｂ。ＭＰＩＦ−１の化学誘引剤活性は、４８ウェルのマイクロチャ
ンバーデバイス（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ．）を用いて走化性アッセ
イで決定した。実験手順は、製造者の手引きに記載される通りであった。試験し
たＭＰＩＦ−１の各濃度について、５つの高電力場における移動度を試験した。
示される結果は、２つの独立の実験から得られた平均値を表す。ＴＨＰ−Ｉ（Ａ
）細胞およびヒトＰＢＭＣ（Ｂ）における化学誘因剤の活性を示す。
【図５】 図５。ＭＰＩＦ−１に応答する細胞内カルシウム濃度の変化を、Ｈｉｔａｃｈ
ｉ Ｆ−２０００蛍光分光測定器を使用して決定した。細菌発現したＭＰＩＦ−
１を、Ｉｎｄｏ−１負荷ＴＨＰ−１細胞へ、最終濃度５０ｎＭで添加し、そして
カルシウム濃度の細胞内レベルをモニターした。
【図６】 図６。低密度集団のマウス骨髄細胞を、指示されたケモカイン（１００ｎｇ／
ｍｌ）を含むかまたは含まない寒天含有培地に、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｓ
ＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＭ−ＣＳＦ
（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、プレートした（１，５００細胞／ディッシュ）。
示されるデータは、２つの独立の実験（各二連で実施した）から得られた平均を
表す。プレーティングの１４日後にコロニーを計数した。ケモカインの存在下で
生成されたコロニー数を、いずれの添加されたケモカインの非存在下で生成され
る数の平均の割合として表す。
【図７】 図７Ａ〜７Ｂは、ＨＰＰ−ＣＦＣ（Ａ）およびＬＰＰ−ＣＦＣ（Ｂ）によるマ
ウス骨髄コロニー形成におけるＭＰＩＦ−１およびＭ−ＣＩＦの影響を示す。
【図８】 図８は、新鮮に単離された骨髄細胞のＭ−ＣＦＳおよびＳＣＦ刺激コロニー
形成に対するバキュロウイルス発現ＭＰＩＦ−１およびＭ−ＣＩＦの影響を示す
。
【図９】 図９は、骨髄細胞のｌｉｎ-集団のＩＬ３およびＳＣＦ刺激の増殖および分化
に対するＭＰＩＦ−１およびＭ−ＣＩＦの影響を示す。
【図１０】 図１０Ａ〜Ｂは、骨髄細胞の系統枯渇集団由来のＧｒ．１およびＭａｃ−１（
表面マーカー）ポジティブ集団の生成に対するＭＰＩＦ−１およびＭ−ＣＩＦの
影響を示す。ｌｉｎ-細胞を、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１００
ｎｇ／ｍｌ）のみ（ａ）、ＭＩＰＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）を補充（ｂ）、また
はＭ−ＣＩＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を補充（ｃ）した、増殖培地中でインキュベー
トした。次いで、細胞を骨髄腫分化Ｇｒ．１、Ｍａｃ−１、Ｓｃａ−１、および
ＣＤ４５Ｒ表面抗原に対するモノクローナル抗体で染色し、そしてＦＡＣＳｃａ
ｎにより分析した。データを、大きな（図１０Ａ）および小さな（図１０Ｂ）細
胞集団の両方におけるポジティブ細胞の百分率として示される。
【図１１】 図１１は、ＭＰＩＦ−１タンパク質の存在が、ＩＬ３、Ｍ−ＳＣＦ、およびＧ
Ｍ−ＣＳＦに応答して骨髄細胞コロニー形成を阻害することを示す。
【図１２】 図１２。ＭＰＩＦ−１の用量応答は、骨髄細胞コロニー形成を阻害する。細胞
を単離し、そして図１３におけるように処置した。処置された細胞を、ＩＬ−３
、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＭＰＩＦ−１
を１、１０、５０または１００ｎｇ／ｍｌを伴うか伴わないで、寒天ベースのコ
ロニー形成アッセイにおいて１，０００細胞／ディッシュの密度でプレートした
。データを、特異的な因子のみで形成されるコロニー数の百分率としてのコロニ
ー形成として示す。データを、標準偏差を示すエラーバーとともに二連のディッ
シュの平均として示す。
【図１３】 図１３。ヒト単球におけるＭＰＩＦ−１をコードするＲＮＡの発現。新鮮な洗
浄単球由来の総ＲＮＡを単離し、そして１００Ｕ／ｍｌのｈｕ ｒＩＦＮ−ｇ、
１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳまたは両方で処理した。各処理からのＲＮＡ（８μｇ
）を１．２％アガロースゲル上で電気泳動により分離し、そしてナイロンメンブ
レンに移した。ＭＰＩＦ−１ ｍＲＮＡを32Ｐ−標識ｃＤＮＡでプローブするこ
とにより定量し、そして得られたオートラジオグラフのバンドを濃度測定的に定
量した。
【図１４】 図１４。図１４は、ＭＰＩＦ−１アミノ酸配列（配列番号２）の分析を示す。
α、β、ターン、およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓
性領域；抗原性指標および表面確率を示す。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗ
ｏｌｆ」グラフにおいて、図１（配列番号２）におけるアミノ酸残基２１〜３０
、３１〜４４、４９〜５５、５９〜６７、７２〜８３、８６〜１０３、および１
１０〜１２０、または、図１（配列番号２）においてそこにおける任意の範囲も
しくは数値は、ＭＰＩＦ−１タンパク質の示された高度に抗原性の領域に対応す
る。
【図１５Ａ】 図１５Ａ〜Ｂ。図１５Ａは、ＭＰＩＦ−１の５−Ｆｕ誘発性のＬＰＰ−ＣＦＣ
細胞の殺傷への骨髄保護性効果を示す。図１５Ｂは、ＭＰＩＦ−１のＡｒａ−Ｃ
誘発性のＬＰＰ−ＣＦＣ細胞の殺傷への骨髄保護性効果を示す。
【図１５Ｂ】 図１５Ａ〜Ｂ。図１５Ａは、ＭＰＩＦ−１の５−Ｆｕ誘発性のＬＰＰ−ＣＦＣ
細胞の殺傷への骨髄保護性効果を示す。図１５Ｂは、ＭＰＩＦ−１のＡｒａ−Ｃ
誘発性のＬＰＰ−ＣＦＣ細胞の殺傷への骨髄保護性効果を示す。
【図１６】 図１６は、５−Ｆｕ−誘発性の循環ＷＢＣ数の減少のマウスのＭＰＩＦ−１前
処理の影響を示す。
【図１７】 図１７は、３群のマウス（１群あたり６匹）を含む実験設計を示す。これらの
マウスは、以下のように処置した。群１（１、２、および３日目に生理食塩水を
注射した）；群２（０日目および３日目に５−Ｆｕを注射した）；および群３（
０日目および３日目に５−Ｆｕを注射し、そしてＭＰＩＦ−１を１、２、および
３日目に注射した）。骨髄を、６日目および９日目に採集してクローン原性アッ
セイを用いてＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣ頻度を決定した。
【図１８】 図１８は、第２の用量の５−Ｆｕの前のＭＰＩＦ−１の投与の、骨髄における
ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣ頻度における効果を示す。
【図１９】 図１９は、ＭＰＩＦ−１改変体を示す。ＭＰＩＦ−１の１２０アミノ酸配列の
最初の８０アミノ酸配列（図１（配列番号２））を、一文字アミノ酸コードで示
す。ここで最初の２１残基は、切断されて成熟型野生型タンパク質を生じるシグ
ナル配列の特徴を示す。変異体−１および変異体−６は、野生型には存在しない
Ｎ末端のメチオニンを含む。あるいは、変異体−９の最初の４アミノ酸（ＨＡＡ
Ｇ）は、野生型ＭＰＩＦ−１タンパク質には存在しない。変異体−１、−６、お
よび−９は、それぞれ配列番号３、４、および５に対応する。変異体−２は、配
列番号２におけるアミノ酸残基４６〜１２０に対応する。変異体−３は、配列番
号２におけるアミノ酸残基４５〜１２０に対応する。変異体−４は、配列番号２
におけるアミノ酸配列４８〜１２０に対応する。変異体−５は、配列番号２のア
ミノ酸残基４９〜１２０に対応する。変異体−７は、配列番号２のアミノ酸残基
３９〜１２０に対応する。変異体−８は、配列番号２のアミノ酸残基４４〜１２
０に対応する。
【図２０】 図２０Ａ〜Ｂ。図２０Ａは、ヒトＭＰＩＦ−１スプライシング改変体ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列を示す（配列番号６）。このｃＤＮＡ配列を、一文字アミノ
酸コードを用いて１３７アミノ酸のタンパク質（配列番号７）をコードするオー
プンリーディングフレームとともに示す。下線を示したＮ末端２１アミノ酸は、
推定リーダー配列を示す。ＭＰＩＦ−１配列には表されないがスプライス改変体
に独特な１８アミノ酸配列の挿入は、イタリック体で強調される。図２０Ｂは、
ＭＰＩＦ−１改変体（配列番号７）と野生型ＭＰＩＦ−１分子（配列番号２）と
のアミノ酸配列の比較を示す。
【図２１】 図２１は、ヒト単球におけるＭＰＩ−１αによって誘導される最大のカルシウ
ム動員応答の５０％に要求されるＭＰＩＦ−１変異体タンパク質の濃度を示す。
【図２２】 図２２Ａ〜２２Ｂ。細胞内遊離カルシウム濃度における変化を、図２１の凡例
に記載されるように、１００ｎｇ／ｍｌでの示されたタンパク質に対して応答す
るヒト単球において測定した。
【図２３】 図２３は、ヒト単球におけるＭＩＰ−１α刺激カルシウム動員を脱感作するＭ
ＰＩＦ−１変異体の能力を示す（要約）。
【図２４】 図２４は、ＭＰＩＦ−１変異体に対するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の走
化性応答を示す。括弧内の数字は、示された濃度範囲で観察されたバックグラウ
ンドを超える走化性の刺激の倍数を反映する。
【図２５】 図２５は、インビトロでの低増殖能力コロニー形成細胞（ＬＰＰ−ＣＦＣ）の
増殖および分化におけるＭＰＩＦ−１改変体の影響を示す。
【図２６】 図２６は、ＭＰＩＦ−１の投与に対する応答での正常マウスの幹細胞動員を示
す。
【図２７】 図２７は、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ方法によって決定されるとおり、２サイ
クルの５−Ｆｕ処置の後の血小板の回復に対するＭＰＩＦ−１とＧ−ＣＳＦとの
効果の比較を示す。
【図２８】 図２８は、２サイクルの５−Ｆｕ処置の後の血液中のＧｒａ．１およびＭａｃ
Ｉ二重陽性細胞の回復に対するＭＰＩＦ−１とＧ−ＣＳＦとの効果の比較を示す
。
【図２９】 図２９は、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ方法によって決定されるとおり、２サイ
クルの５−Ｆｕ処置の後の骨髄中のＧｒａ．１およびＭａｃＩ二重陽性細胞の回
復に対するＭＰＩＦ−１とＧ−ＣＳＦとの効果の比較を示す。
【図３０】 図３０は、２サイクルの５−Ｆｕ処置の後の骨髄中の造血前駆体の回復に対す
るＭＰＩＦ−１とＧ−ＣＳＦとの効果の比較を示す。
【図３１】 図３１は、ｐＨＥ４−５発現ベクター（配列番号３７）およびサブクローン化
したＭＰＩＦ−１Δ２３ ｃＤＮＡコード配列の模式図を示す。カナマイシン耐
性マーカー遺伝子、ＭＰＩＦ−１Δ２３コード配列、ｏｒｉＣ配列、およびｌａ
ｃＩｑコード配列の位置を示す。
【図３２】 図３２は、ＭＰＩＦ−１Δ２３の産生のための発酵プロセスの概観を示す。
【図３３】 図３３は、図３２似示されるプロセスによって産生されるＭＰＩＦ−１Δ２３
を回収するために使用される方法の流れ図を示す。
【図３４】 図３４は、図３２および３３に示されるプロセスによって産生されそして回収
されるＭＰＩＦ−１Δ２３の精製のためのプロセスを示す。
【図３５】 図３５は、ｐＨＥプロモーター（配列番号３８）の調節エレメントのヌクレオ
チド配列を示す。２つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎ
ｏ配列（Ｓ／Ｄ）、および末端のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位（イタ
リック体）を示す。
【図３６Ａ】 図３６Ａ〜３６Ｅは、ｐＨＥベクター（配列番号３７）の完全ヌクレオチド配
列を示す。
【図３６Ｂ】 図３６Ａ〜３６Ｅは、ｐＨＥベクター（配列番号３７）の完全ヌクレオチド配
列を示す。
【図３６Ｃ】 図３６Ａ〜３６Ｅは、ｐＨＥベクター（配列番号３７）の完全ヌクレオチド配
列を示す。
【図３６Ｄ】 図３６Ａ〜３６Ｅは、ｐＨＥベクター（配列番号３７）の完全ヌクレオチド配
列を示す。
【図３６Ｅ】 図３６Ａ〜３６Ｅは、ｐＨＥベクター（配列番号３７）の完全ヌクレオチド配
列を示す。
【図３７】 図３７は、短期間のモニタリングの間の、照射誘導性損傷からの胃腸管のＭＰ
ＩＦ−１保護を示す。Ｃ５７Ｂ１／６雌性マウスを、致死量以下の照射（137Ｃ
ｓ源から２×４．５ｇｙ（４時間間隔））を与える前後で処置した。マウスを、
示された日に、生存、状態および体重についてモニターした。データは、実験の
開始時の体重のパーセンテージとして、示された日の各々個々のマウスの体重に
基づく各グループについての体重の変化（％）を示す。
【図３８】 図３８は、長期間のモニタリングの間の、照射誘導性損傷からの胃腸管のＭＰ
ＩＦ−１保護を示す。Ｃ５７Ｂ１／６雌性マウスを、致死量以下の照射（137Ｃ
ｓ源から２×４．５ｇｙ（４時間間隔））を与える前後で処置した。マウスを、
示された日に、生存、状態および体重についてモニターした。データは、実験の
開始時の体重のパーセンテージとして、示された日の各々個々のマウスの体重に
基づく各グループについての体重の変化（％）を示す。曲線は、２つのセグメン
トで表される。左のセグメントは、最初の１８日間の変化を表し、そして右のセ
グメントは、終了日での全てのグループにおける体重を表す。
【図３９】 図３９は、短期間のモニタリングの間の、照射誘導性損傷からの胃腸管のＭＰ
ＩＦ−１保護を示す。Ｃ５７Ｂ１／６雌性マウスを、致死量以下の照射（137Ｃ
ｓ源から２×５．５ｇｙ（４時間間隔））を与える前後で処置した。マウスを、
示された日に、生存、状態および体重についてモニターした。データは、実験の
開始時の体重のパーセンテージとして、示された日の各々個々のマウスの体重に
基づく各グループについての体重の変化（％）を示す。
【図４０】 図４０は、長期間のモニタリングの間の、照射誘導性損傷からの胃腸管のＭＰ
ＩＦ−１保護を示す。Ｃ５７Ｂ１／６雌性マウスを、致死量以下の照射（137Ｃ
ｓ源から２×５．５ｇｙ（４時間間隔））を与える前後で処置した。マウスを、
示された日に、生存、状態および体重についてモニターした。データは、実験の
開始時の体重のパーセンテージとして、示された日の各々個々のマウスの体重に
基づく各グループについての体重の変化（％）を示す。
【図４１】 図４１は、マウスにおける致死照射に対する保護のインビボモデルについての
、処置スケジュールの模式図を示す。
【図４２】 図４２は、ＭＰＩＦ−１が、致死量照射したマウスにおける生存を増強するこ
とを示す。統計学的分析を、ｌｏｇランクノンパラメトリック（ｌｏｇ−ｒａｎ
ｋ ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ）を使用して行い、そしてデータを、Ｋａｐｌ
ａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線として表す。この実験は、照射後５４日目に終了した
。
【図４３】 図４３は、マウスにおける致死量以下の照射に対する保護のインビボモデルに
ついての、処置スケジュールの模式図を示す。
【図４４】 図４４は、ＭＰＩＦが、致死量以下で照射したマウスにおいて、系統が決定付
けられた骨髄前駆細胞の回復を増強することを示す。
【図４５】 図４５は、ＭＰＩＦが、致死量以下で照射したマウスにおいて、多能性骨髄前
駆細胞の回復を増強することを示す。
【図４６】 図４６は、インビトロにおけるヒトＣＤ３４＋前駆細胞の増殖に対する、ＭＰ
ＩＦの効果を示す。
【図４７】 図４７は、インビトロでの細胞傷害性薬剤誘導性の殺傷に対する、ＭＰＩＦの
効果を示す。
【図４８】 図４８は、ＭＰＩＦに対するインビボ研究の概要を示す。
【図４９】 図４９Ａ〜Ｂは、インビボでの、骨髄前駆細胞における５−ＦＵ誘導性毒性に
対する、ＭＰＩＦでの前処置の効果を示す。（Ａ）総コロニー形成に対するＭＰ
ＩＦの効果。（Ｂ）ＷＢＣの回復に対するＭＰＩＦの効果。これらの結果は、８
回の実験の平均である。
【図５０】 図５０は、複数回サイクルの治療に対する、ＭＰＩＦの化学保護効果を示す。
【図５１】 図５１は、５−ＦＵでの処置後の骨髄回復の動態に対する、このＭＰＩＦ投薬
スケジュールの効果を示す。
【図５２】 図５２は、複数回用量の毒性研究の概要を示す。
【図５３】 図５３は、非臨床的毒性学的研究についての観察の概要を示す。
【図５４】 図５４Ａ〜５４Ｂは、静脈内投薬後または皮下投薬後のＭＰＩＦの薬物動態学
の比較（ｐｆ）を示す。（Ａ）０〜２４時間の薬物動態学プロフィール。（Ｂ）
〜４時間のプロフィール。ＭＰＩＦ用量は、２０ｍｇ／ｋｇであった。
【図５５】 図５５は、ヒト被験体における末梢血細胞組成の評価を示す。
【図５６】 図５６は、処置グループによる、健常なヒトボランティアにおける平均絶対単
球数の評価を示す。
【図５７】 図５７は、健常なボランティアにおけるＭＰＩＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図５８】 図５８Ａ〜５８Ｅは、ＭＰＩＦ−１の構造を示す。（Ａ）および（Ｂ）ＭＰＩ
Ｆ−１、残基１〜７７の平均構造についての、３０個のシミュレートしたアニー
リング（ＳＡ）構造の重ね合わせ。（Ｃ）ＡおよびＢと同じであるが、ただし、
Ｎ末端（１〜１０）およびＣ末端（６７〜７７）残基は、明確化のために排除し
た。（Ｄ）および（Ｅ）プログラムＭＯＬＮＯＬ（Ｋｏｒａｄｉ，Ｒ．，ら、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．１４：２９−４２（１９９６））を使用して作成した、
パネルＣにおいて示されるのと同じ向きにあるＭＰＩＦ−１の略図。
【図５９】 図５９Ａ〜５９Ｆは、骨格原子（Ａ）および全ての重原子（Ｂ）についての、
残基１１〜６６に対して最適に適合した、平均構造についてのそれらの３０個の
シミュレートしたアニーリング構造の原子ｒｍｓ分布を示す。φ（Ｃ）、ψ（Ｄ
）およびχ１（Ｅ）についての平均秩序パラメーター、ならびに機能的溶媒接触
可能領域（Ｆ）もまた示す。
【図６０】 図６０Ａ〜図６０Ｇは、残基の関数としてのＭＰＩＦ−１の15Ｎ動力学データ
を示す。15ＮのＴ1、Ｔ2、Ｔ1／Ｔ2比、およびＮＯＥを、それぞれ、パネルＡ、
Ｂ、ＣおよびＤに示す。15ＮのＴ1、Ｔ2、ＮＯＥデータの適合から計算した動力
学パラメーターを、残りのパネルにおいて示す：秩序パラメーター、Ｓ2（Ｅ）
；内部相関時間、Ｔｅ（Ｆ）；およびコンフォメーション変換速度（Ｇ）。
【図６１】 図６１Ａ〜図６１Ｄは、ＭＰＩＦ−１と他のＣＣケモカイン構造（ＭＩＰ−１
β、ＨＣＣ−２、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１）の比較を示す。ＭＰＩＦ−１
の残基１１〜６６を、ＭＩＰ−１βの残基１１〜６６、ＨＣＣ２の残基６〜６１
、ＲＡＮＴＥＳの残基１０〜６５およびＭＣＰ−３の残基１１〜６７に対して重
ね合わせる。明確化のために、Ｎ末端残基およびＣ末端残基を提示しない。
【図６２】 図６２は、ＭＰＩＦ−１および他の関連するＣＣケモカインのアミノ酸配列の
アライメントを示す。保存されたシステインを、太字で示す。保存された疎水性
残基および保存された荷電残基は、実施例３６で説明される。
【図６３】 図６３Ａ〜６３Ｄは、プログラムＭＯＬＭＯＬ（Ｋｏｒａｄｉ，Ｒ．ら、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．１４：２９−４２（１９９６））を使用する、ＭＰＩＦ−
１の表面電荷分布を示す。正および負に荷電した領域を、それぞれ、青および赤
で示す。明確化のために、残基１〜１０および６９〜７７は、示さない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/02 Ａ６１Ｐ 39/00 39/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ １２１ １２１ Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／１７２，０６３ (32)優先日 平成11年12月23日(1999．12．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１８９，０４８ (32)優先日 平成12年３月14日(2000．3．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１９９，１４２ (32)優先日 平成12年４月24日(2000．4．24) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，４５８ (32)優先日 平成12年６月13日(2000．6．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１２，６５８ (32)優先日 平成12年６月19日(2000．6．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 グルゼゴルゼフスキー， クルジストフ ジェイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20879， モンゴメリー ビレッジ， ホブ ヒル ウェイ 20040 (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 パテル， ヴィクラム アメリカ合衆国 メリーランド 20876， ジャーマンタウン， セプター リッジ テラス 11117 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 4C084 AA01 AA12 AA14 AA16 DA01 DC50 NA06 NA14 ZA51 ZB07 ZB11 ZB21 ZB26 ZB27 ZC37 ZC75

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞に対する細胞傷害性薬剤誘導性損傷を処置または予防す
    る方法であって、配列番号２のポリペプチド、またはその活性な改変体もしくは
    フラグメントの有効量を個体に投与する工程、 を包含し、ここで該細胞は以下： （ａ）骨髄幹細胞、造血細胞、および多能性前駆細胞以外の、結合組織の細胞
    ； （ｂ）上皮細胞； （ｃ）筋細胞；および （ｄ）神経系の細胞、 からなる群より選択される、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで結合組織の前記細胞
    が、以下：骨格系細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨
    膜細胞、骨内膜細胞、象牙芽細胞、血球、赤血球、白血球、好酸球、好塩基球、
    好中球、リンパ球、単球、血小板、組織マクロファージ、器官特異的食細胞、Ｂ
    リンパ球、Ｔリンパ球、巨大赤芽球、単芽球、骨髄芽球、リンパ芽球、前赤芽球
    、巨核芽球、前単球、前骨髄球、前リンパ球、初期正赤芽球、巨核球、中期正赤
    芽球、後骨髄球、および後期後骨髄球、からなる群より選択される、方法。
  3. 【請求項３】 前記個体が、分裂している細胞を殺傷する治療を受けている
    、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記治療が、化学療法、放射線療法、または標的化学療法か
    ら選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記個体が、細胞傷害性薬剤に対する職業的または偶発的な
    曝露を受けている、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ポリペプチドが、前記治療の前に投与される、請求項４
    に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記ポリペプチドが、前記治療の間に投与される、請求項４
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ポリペプチドが、前記治療の後に投与される、請求項４
    に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ポリペプチドが、前記曝露の前に投与される、請求項５
    に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ポリペプチドが、前記曝露の間に投与される、請求項
    ５に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ポリペプチドが、前記曝露の後に投与される、請求項
    ５に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記治療が、標的化学療法である、請求項４に記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】 前記標的化学療法が、放射免疫療法である、請求項１２に
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記個体が、細胞傷害性薬剤に対する意図的な曝露を受け
    ている、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記細胞傷害性薬剤が、放射線である、請求項１４に記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】前記ポリペプチドが、前記曝露の前に投与される、請求項１
    ５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが、前記曝露の間に投与される、請求項
    １５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ポリペプチドが、前記曝露の後に投与される、請求項
    １５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記放射線が、核爆発に起因する、請求項１５に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 前記個体が、放射線傷害もしくは放射線熱傷から防御する
    必要を有するか、または放射線傷害もしくは放射線熱傷を処置する必要を有する
    、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 白血病細胞の増殖を阻害する方法であって、配列番号２の
    ポリペプチド、またはその活性な改変体もしくはフラグメントの有効量を投与す
    る工程、を包含し、ここで該ポリペプチド、改変体またはフラグメントは、治療
    用部分に結合体化されている、方法。
  22. 【請求項２２】 前記治療用部分が放射性同位体である、請求項２１に記載
    の方法。
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