CN113398269B

CN113398269B - Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗肝癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN113398269B
Application number: CN202110808543.6A
Authority: CN
Inventors: 张严冬; 李相鲁
Original assignee: Shenzhen Keye Health Co ltd
Current assignee: Shenzhen Keye Health Co ltd
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-07-16
Also published as: CN113398269A

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。本发明确立了DHX33蛋白在肝癌发生发展中的重要作用，提供的小分子化合物具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而抑制由DHX33调控的甲羟戊酸合成。该小分子化合物可以在体外和体内显著抑制肝癌细胞的生长，具有重要的医药开发价值。

Description

RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗肝癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。

背景技术

中国是肝癌发病率较高的国家之一。据世界卫生组织统计，在2020年度，中国共有41万人确诊为肝癌，而由肝癌导致的死亡病例达到39万之多，发生率与致死率几乎持平。在全国范围内，超过70％肝癌发生与病毒感染，特别是乙肝病毒(HBV)的感染有关。

肝癌的治疗手段多样，有手术和靶向治疗，但目前以肝切除术为代表的外科治疗仍然是肝癌的首选治疗方法。在肝癌的分子靶向治疗中，索拉非尼是目前晚期肝细胞癌的标准治疗手段。索拉非尼是一种多靶标抑制剂。它主要抑制RAS通路下游的Raf/MEK/MAP途径，还可以抑制肿瘤细胞的其他靶点如c-Kit、FLT-3和肿瘤血管生成的重要调控因子VEGFR，PDGFR-β。这些激酶对肿瘤细胞信号通路、血管生成和逃避凋亡起到很重要的作用。索拉非尼与安慰剂对照组相比，使得患者的总体生存率提高了2-3个月，死亡率降低31％。继索拉非尼之后涌现其他新的靶向药物研究中，其主要治疗终点患者的总体生存率均未优于索拉非尼。原因在于肝细胞癌并不像肺癌一样，具备明确的驱动基因或生物标记物，这就给人肝癌的新药研发靶点增加了很大困难。除了免疫检查点抑制剂外，针对多种癌症靶点的多种抑制剂如各种生长因子受体、C-MET等抑制剂都在进行中，但整体在肝癌的治疗领域依然缺乏行之有效的靶点和抑制剂。

发明内容

本发明的目的是提供RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗肝癌的药物或组合物中的应用。本发明中，所述RNA解旋酶DHX33抑制剂 (即DHX33蛋白抑制剂)选自化合物A、B、C或它们药学上可接受的盐或者前药中的至少一种：

优选地，所述肝癌为RNA解旋酶DHX33过表达的肝癌(人类肝癌)，所述肝癌可以是原发肝癌或者转移性肝癌。

本发明首次公开了DHX33蛋白质可以作为靶点进行肝癌治疗。

第二方面，本发明提供所述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的甲羟戊酸合成途径抑制剂中的应用。

第三方面，本发明提供所述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的胆固醇代谢途径抑制剂中的应用。

DHX33基因在NCBI上的参考序列编号为NM_020162.4。

甲羟戊酸途径是胆固醇代谢中的重要途径，在异常增生的癌细胞中，这一途径呈现异常激活的状态，对癌症的发生发展有重要促进作用。实验结果表明，DHX33 蛋白是调控癌细胞胆固醇代谢的重要调控因子之一，这一过程依赖于DHX33的RNA 解旋酶活力，如果抑制DHX33的酶活力，则肝癌的发生发展会受到显著抑制。本发明证明了DHX33是肝癌治疗上的一个靶向位点。本发明提供的小分子化合物可以有效抑制DHX33的解旋酶活力，进而抑制肝癌的发生发展。

第四方面，本发明提供一种用于治疗肝癌的靶向药物，其中所述药物的靶点是RNA解旋酶DHX33，该靶向药物可以抑制DHX33解旋酶的活力，进而抑制由DHX33 蛋白所调控的细胞生长必须的胆固醇合成过程。该靶向药物的有效成分为化合物A、B、C或它们药学上可接受的盐或者前药。

所述癌症为人类肝癌，尤其是DHX33蛋白表达量升高的一类人类肝癌。

第五方面，本发明提供所述RNA解旋酶DHX33抑制剂在治疗肝癌中的应用。

第六方面，本发明提供RNA解旋酶DHX33作为新型肝癌治疗靶点的应用。

第七方面，本发明提供用于治疗肝癌的DHX33抑制剂，所述抑制剂选自shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体、DHX33 基因打靶载体等中的至少一种。

在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入频率范围可以是一天一次到三次。在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入剂量，在小鼠中，口服以25mg-300mg/kg一次，静脉注射一次为5mg-50mg/kg。针对人的药物摄入，以体表面积换算成人的等效剂量。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服摄入剂量可以为35mg-290mg/一次，45mg-280mg/kg一次， 55mg-270mg/kg一次，65mg-260mg/kg一次，75mg-250mg/kg一次，85mg-240mg/kg 一次，95mg-230mg/kg一次，105mg-220mg/kg一次，115mg-210mg/kg一次，125 mg-200mg/kg一次，135mg-190mg/kg一次，145mg-180mg/kg一次，或155mg-170 mg/kg一次。当通过静脉注射施用时，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂注射一次的剂量可以为3.0mg-24.5mg/kg、3.5mg-24mg/kg、4.0mg-23.5mg/kg、4.5mg-23 mg/kg、5.0mg-22.5mg/kg、5.5mg-22mg/kg、6.0mg-21.5mg/kg、6.5mg-21mg/kg、 7.0mg-20.5mg/kg、7.5mg-20mg/kg、8.0mg-19.5mg/kg、8.5mg-19mg/kg、9.0mg-18.5 mg/kg、9.5mg-18mg/kg、10.0mg-17.5mg/kg、10.5mg-17.0mg/kg、11.0mg-16.5mg/kg、 11.5mg-16mg/kg、12.0mg-15.5mg/kg、12.5mg-15.0mg/kg或13.0mg-14.5mg/kg。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明确立了DHX33蛋白在肝癌发生发展中的重要作用，提供的小分子化合物具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而抑制由DHX33调控的甲羟戊酸代谢活力。该小分子化合物可以在体外和体内显著抑制肝癌细胞的生长，具有重要的医药开发价值，从而达到治疗肝癌的目的。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中分析代表性的人类肝癌组织相比于正常肝组织的DHX33蛋白表达量明显偏高。

图2为本发明较佳实施例中肝癌细胞系HuH7细胞中的DHX33蛋白敲低效率分析。

图3为本发明较佳实施例中DHX33蛋白敲低后肝癌细胞的生长曲线分析。

图4为本发明较佳实施例中DHX33蛋白敲低后肝癌细胞的二维培养基生长体系中的极低密度癌细胞增值生长分析。

图5为本发明较佳实施例中DHX33蛋白敲低后肝癌细胞的三维培养基生长体系中的癌细胞悬浮独立生长分析。

图6为本发明较佳实施例中DHX33蛋白敲低后肝癌细胞悬浮独立生长指数的统计分析。

图7为本发明实施例中DHX33蛋白敲低后人肝癌细胞在免疫缺陷小鼠体内的肿瘤生长分析。

图8为图7中的各组肿瘤重量终点分析图。

图9为本发明较佳实施例中DHX33敲低后RNA测序分析的肝癌细胞基因转录组变化的统计，主要受DHX33敲低影响的KEGG基因表达通路分析。

图10为本发明较佳实施例中DHX33敲低后引起的肝癌细胞胆固醇代谢通路中重要基因的转录水平分析。

图11为本发明较佳实施例中DHX33基因敲除对正常细胞的胆固醇代谢通路基因表达的影响。

图12为本发明较佳实施例中DHX33的小分子抑制剂处理肝癌细胞后分析的胆固醇代谢通路中重要基因的转录水平变化。

图13为本发明较佳实施例中分析的DHX33敲低后细胞中胆固醇表达水平的分析图。

图14为本发明较佳实施例中DHX33的小分子抑制剂在肝癌细胞的IC₅₀以及对正常细胞和肝癌细胞抑制性的差异分析。

图15为本发明较佳实施例中分析正常细胞用DHX33的小分子抑制剂处理后的流式细胞点状图。

图16为本发明较佳实施例中分析正常细胞用DHX33小分子抑制剂处理后的用Annexin V(膜联蛋白V)染色的流式细胞凋亡比率图。

图17为本发明较佳实施例中分析肝癌细胞HUH7用DHX33小分子抑制剂处理后的流式细胞点状图。

图18为本发明较佳实施例中分析肝癌细胞HUH7用DHX33小分子抑制剂处理后的用Annexin V染色的流式细胞凋亡比率图。

图19为本发明较佳实施例中分析肝癌细胞SKHEP1用DHX33小分子抑制剂处理后的流式细胞点状图。

图20为本发明较佳实施例中分析肝癌细胞SKHEP1用DHX33小分子抑制剂处理后的Annexin V染色的流式细胞凋亡比率图。

图21为本发明实施例中小分子化合物的通过静脉注射和灌胃后的大鼠体内药物代谢分析图。

图22为本发明较佳实施例中小分子化合物的血浆稳定性分析图。

图23为本发明实施例中DHX33小分子抑制剂对人肝癌荷瘤的大小抑制性分析。

图24为本发明实施例中DHX33小分子抑制剂对人肝癌荷瘤的终点分析重量增长指数的抑制性比较图。

图25为本发明实施例中DHX33小分子抑制剂对小鼠处理后的体重监测分析。

图26为本发明实施例中分析的DHX33小分子抑制剂对人肝癌类器官的抑制性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中涉及的实验方法：

1、慢病毒生产

为了研究DHX33在肝癌中的作用，本发明使用慢病毒介导的shRNA以沉默DHX33 信使RNA。本发明采用质粒pLKO.1用于构建慢病毒载体，所述shRNA序列的基因通过限制酶切位点AgeI/EcoRI克隆到pLKO.1载体中。在sh-DHX33添加限制酶切位点 AgeI/EcoRI，通过华大基因公司合成以下DNA序列：

sh-DHX33-前寡核苷酸：5’-CCGGGCTATCGCAAAGTGATCATTT CTCGAGAAATGATCACTTTGCGATAGCTTTTTG-3’，

sh-DHX33-后寡核苷酸：5’-AATTCAAAAAGCTATCGCAAA GTGATCATTTCTCGAGAAATGATCACTTTGCGATAGC-3’。

然后，将上述序列的RNA序列克隆到pLKO.1载体的限制酶切位点AgeI/EcoR中。得到具有敲低DHX33蛋白表达水平作用的慢病毒，所述慢病毒中含有上述慢病毒质粒。对照组：作为对照的小RNA(shScrambled)序列为： 5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3’。

本发明还提供所述慢病毒的制备方法，包括以下步骤：

用Lipofectamine 2000(Life Technologies)脂质体导入法在293T细胞中转染质粒混合物：具体操作方法是采用直径为10cm的细胞培养皿做转染，待293T细胞生长到90％的融合度时，将下述质粒混合，包括pLKO.1-shRNA(即上述慢病毒质粒)、pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr，质粒混合的比例为9:8:1，使总DNA量达到每个培养皿12μg。其中，载体pLKO.1、pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr购自Biovector Inc公司。

经过16-18h更换成含有抗生素(盘尼西林和链霉素)的培养基，再过24h或48h，用无菌移液管收集细胞培养基，1000rpm离心两分钟，病毒再经过分装于5mL的无菌离心管中，存放于-80℃冰箱。

2、免疫组化分析

组织芯片购自US Biomax公司。将芯片中的组织在二甲苯中脱石蜡并在一系列乙醇浓度逐渐降低的溶液中再水合。在蒸汽器中用Tris缓冲液(pH 9.0)呈现抗原。然后将组织在含有1％H₂O₂的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用10％FBS 封闭1h后，将组织与第一抗体在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒按照说明书进行。使用的抗体如下：anti-DHX33(购自SantaCruz生物技术公司)。

3、细胞培养

分离小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)并培养在含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和链霉素和青霉素的DMEM培养基中，具体方法可参照论文(Identification of DHX33as a mediator in rRNA synthesis and cell growth.Zhang,Y.,Forys,JT.,Miceli,A.,Gwinn,A.,Weber,JD.Molecular Cellular Biology 2011,31(23),4676-4691)。HuH7和SK-HEP-1肝癌细胞系购自中科院细胞库。将这些细胞系维持在含有10％胎牛血清 (FBS)、2mM L-谷氨酰胺、添加非必须氨基酸和链霉素、青霉素的MEM培养基中。 HEK293T细胞购自ATCC并保持在含有10％FBS和链霉素/青霉素的DMEM培养基中。

4、蛋白质印迹分析

用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher)的RIPA缓冲液裂解细胞。在冰上孵育10分钟后，通过超声处理进一步破坏细胞裂解物。然后将全细胞提取物进行 SDS-PAGE凝胶，每个样品的加载量为50μg蛋白质。然后将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。将膜在5％脱脂奶中封闭，将其在1×TBST缓冲液中在室温下培育1h。在5％FBS中稀释一抗(用1×TBST稀释)，使之与膜在4℃孵育过夜。然后将膜用1×TBST 缓冲液冲洗多次，并在室温下与5％FBS(用1×TBST稀释)中的HRP(辣根过氧化物酶) 标记的二抗一起孵育2h。用ECL试剂盒(Thermo Fisher)显示印迹。抗体如下：抗GAPDH， Absin(abs830030)；抗DHX33，Santa Cruz生物技术公司(B4)。

5、细胞生长曲线分析

将细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮于细胞培养基中以产生单细胞悬浮液，进行细胞计数，然后在6孔板上以每孔5万个细胞接种，从铺板开始每天计算细胞的数量。

6、软琼脂试验

将1.0×10⁴个细胞用4.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的DMEM培养基混合，并加在基础琼脂上(4.0mL凝固的含0.6％琼脂和10％FBS的DMEM培养基)。将平板在37℃温育，每3天检查一次，每周加入2.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的DMEM培养基。观察菌落生长情况，2-3周后计数。

7、小鼠异种移植模型

所有小鼠实验均遵循标准指南。NUDE雌性小鼠购自北京维多利华实验动物有限公司并接受标准的机构护理。将细胞用胰蛋白酶消化并用PBS重悬至终浓度为每毫升 1×10⁸个细胞。对8周龄裸鼠(Balb/c)小鼠的侧翼皮下注射1×10⁷个细胞，每个处理组4只小鼠。当肿瘤直径达到0.5～1cm时，处死小鼠并解剖肿瘤拍照。

8、RNA测序

RNA测序参见Yuan B,WangX,Fan C,You J,Liu Y,Weber JD,Zhong H,and ZhangY. DHX33 Transcriptionally Controls Genes Involved in the CellCycle.Molecular and cellular biology.2016；36(23):2903-17。用编码shScrambled或shDHX33的慢病毒感染HuH7细胞。处理后3天，收获细胞，用Nucleospin RNA II试剂盒提取总RNA。然后在变性后用磁性 oligo-dT珠进一步纯化RNA样品。将纯化的mRNA样品逆转录成第一链cDNA，并进一步合成第二互补DNA。片段化的DNA样品是平端的并且在3'末端腺苷酸化。用适配子连接然后构建文库。通过Qubit(Invitrogen)定量DNA。在cBot簇生成后，然后通过来自 Genergy Bio(晶能生物技术(上海)有限公司)的Ilumina HiSeq2500 SBS对DNA样品进行测序。原始数据转换为Fastq格式。每个样品中的转录物的量基于FPKM-片段每千碱基转录物的每百万个片段计算，使用Cuffnorm软件计算每个样品的FPKM值并应用log2值。Cuffdiff软件用于计算不同样品之间的差异基因转录物。对于KEGG通路分析，使用整个转录本作为背景列表，使用差异转录本作为候选列表，计算P值。基于基因功能对重要基因进行分类。

9、实时定量PCR

引物均由IDT(http://sg.idtdna.com/site)在线“Realtime PCR Tool”设计，购自BGI(深圳)公司。通过High Pure RNA分离试剂盒(Roche)提取总RNA，然后使用PrimeScript混合试剂盒(Takara)转录成cDNA。使用ABI One step plus cycler进行实时PCR，使用相应的软件进行管理。为了分析mRNA水平，使用SYBR green Supermix(Bio-Rad)，并且在归一化为GAPDH值之后通过^△△CT值计算转录物定量。熔解曲线用于确认单一产物的扩增。

针对小鼠中参与甲羟戊酸途径的代谢酶基因的引物序列如下(所有引物都从5'-3')：

针对人类细胞中参与甲羟戊酸途径的代谢酶基因的引物序列如下(所有引物都从5'-3')：

10、腺病毒感染

腺病毒购自山东维真生物科技有限公司(Vigene)，adeno-LacZ或adeno-Cre的滴度为 1.0×10¹¹PFU(colony forming unit，集落形成单位)/mL。将100万个MEF悬浮于3mL的完全培养基中，并接种于直径为10cm的细胞培养皿上，加入1×10⁸PFU的表达重组酶CRE 的腺病毒，孵育4h后，补充培养基到10mL，继续培养过夜，然后更换培养基。

11、细胞凋亡分析

根据制造商的方案用Vybrant凋亡试剂盒#2(Molecular Probes)进行凋亡测定。将细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮于细胞培养基中以产生单细胞悬浮液，进行细胞计数。每个样本计数100万个细胞，沉淀细胞并用磷酸缓冲液洗涤两次，然后用试剂盒中的结合液重悬。然后重悬于含有Annexin V的工作溶液中，避光培育15分钟，然后用低速离心 (1000rpm离心5分钟)，用磷酸缓冲液清洗一次。将细胞通过35μm过滤膜(Becton Dickinson)过滤，然后进行流式细胞分选仪(FACS)分析。

12、细胞半抑制浓度IC₅₀值测试

将DHX33过表达的癌症细胞株HUH7细胞以1×10⁴个细胞/100μL/孔铺到96孔板上。等待细胞贴壁完全，将化合物以10nM、25nM、50nM、100nM、250nM、500 nM、1000nM、2500nM、5000nM、10000nM、20000nM的浓度添加到细胞培养基中，用多通道排枪混合均匀。待化合物和细胞温育时间达到48h后，用CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司)按照标准流程添加到96孔板的培养基中，温育2h后，用酶标仪读板(OD_450nm)，将实验重复三次，并绘制化合物在不同浓度下的抑制曲线，计算化合物的细胞半抑制浓度(IC₅₀)。

13、胆固醇的质谱分析流动相条件

采用HPLC系统(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)偶联Q Exactive质谱分析仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)。HPLC柱子类型：ACQUITY HSST3色谱柱(2.1×150mm,1.8μm粒径(Waters,MA,USA)。

水相(A)：25％乙腈及5mM乙酸铵；

流动相(B)：50％异丙醇，45％乙腈及5mM乙酸铵。

样本洗脱条件：

0–1min 25％B，0.3mL/min，

1–2min 25％–50％B，0.3mL/min，

2–8min 50％–90％B，0.3mL/min，

8–10min 90％–99％B，0.3mL/min，

10–14min 99％B，0.3mL/min，

14–14.1min 99％–25％B，0.3mL/min，

14.1–16.9min 25％B，0.4mL/min，

16.9–17min 25％B，0.3mL/min。

其他分析条件遵从一般质谱分析方法。

14、统计分析

数据表示为平均值±SD。使用Student's t检验确定统计学显著性，P值<0.05表示差异显著。

本发明化合物A、B、C的制备方法如下：

(一)化合物A(AB24288)的合成及其鉴定：

合成路线如下：

其中，R为

合成方法：

1、化合物2(6-甲氧基吡啶-3,4-二胺)的制备

将化合物1(2-甲氧基-5-硝基吡啶-4-胺)(3.0g,17.74mmol,1.0eq)溶解于甲醇(30 mL)中，加入碳负载钯催化剂(300mg,0.1wt％)。混合物在氢气存在的条件下室温搅拌16h。固体物过滤后浓缩得到化合物2(6-甲氧基吡啶-3,4-二胺)(2.6g，产率：100％)，为棕色固体。MS(ESI)m/z:140[M+H]+；TLC:DCM:MeOH(10:1)；R_f:(化合物1)＝0.7； R_f:(化合物3)＝0.5。

2、化合物4(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)的制备

将化合物2(6-甲氧基吡啶-3,4-二胺)(1.5g,10.2mmol,1.0eq)和化合物3(氰基乙酸乙酯)(3.5g,30.6mmol,3.0eq)溶解于二甲基甲酰胺(6mL)中，在180℃搅拌5h。冷却后去除溶剂。剩余物通过快速柱色谱纯化(二甲基甲酰胺:甲醇＝200:1至50:1)，得到化合物 4(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(500mg,产率:26.0％)，为棕色固体粉末。MS(ESI)m/z:188[M+H]+；TLC:石油醚/乙酸乙酯(1:1)；Rf:(化合物1)＝0.5；Rf:(化合物3)＝0.2。

3、(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H- 吡咯-1-基)-甲基噻吩-3-腈(化合物A)的合成

将化合物4(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(80mg,0.42mmol,1.0 eq)溶解于1mL乙醇中，加入化合物5(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-甲基噻吩 -3-甲腈)(103mg,0.42mmol,1.0eq)和哌啶(36mg,0.42mmol,1.0eq)。混合物加热回流后搅拌1h。反应完成后，反应物冷却到室温过滤。收集固体干燥后得到化合物A (AB24288)((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-甲基噻吩-3-腈)(95mg，产率：13.6％)，为黄色粉末。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.53(s,1H),8.16(s,1H),7.31(s,1H),6.96(s,1H),6.89(s,1H),3.89(s,3H),2.51(s,3H),2.30(s,3H),2.08(s,3H).

(二)化合物B(AB24351)的合成

合成路线如下：

合成方法：

1、化合物3((E)乙基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)的制备

向溶解于2mL乙醇的化合物1(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基))-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(160mg,0.548mmol,1eq)中加入化合物2(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(103mg,0.548mmol,1eq)和哌啶(46mg,0.548mmol,1 eq)。混合物加热回流搅拌2h。待反应完成后，将混合物冷却到室温并过滤。收集固体物，然后干燥得到黄色固体化合物3((E)乙基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)(130 mg，产率：51.3％)。MS(ESI)m/z:463[M+H⁺]。

2、(E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基 -1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酰胺(化合物B)的合成

将化合物3((E)乙基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)(50mg,0.108mmol,1.0eq)溶解于NH₃-MeOH(2mL)中，在80℃搅拌16h。将反应物冷却到室温并浓缩，残余物用制备型高压液相纯化得到黄色固体化合物B(AB24351)((E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4- 羧酰胺)(61mg，产率：85.9％)。MS(ESI)m/z:434[M+H⁺]。¹H NMR(400MHz, DMSO-d₆)δ8.46(s,1H),8.12(s,1H),7.82(s,1H),7.64(s,1H),6.88(s,1H),6.78(s, 1H),3.85(s,3H),2.72(s,3H),2.23(s,3H),2.01(s,3H).

(三)化合物C(AB24314)的合成

合成路线如下：

合成方法：

1、化合物3(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)的制备

将化合物1(5-氨基-2-甲基-1,3-噻唑-4-羧酸乙酯)(0.5g,2.7mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(THF)(5mL)，并加入2,5-己二酮(456mg，4mmol，1.5eq)，对甲苯磺酸一水合物(TsOH-H₂O)(186mg，1.04mmol，0.4eq)和3A分子筛(1g)。将混合物回流加热并搅拌过夜。将固体过滤出并将滤液浓缩。使用快速柱色谱(FCC)(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化剩余物质并得到黄色固体，即化合物3(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1- 基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(462mg，产率64.8％)。MS(ESI)m/z:265[M+H]+；TLC: PE/EA(5/1)；R_f:(化合物1)＝0.2；R_f:(化合物3)＝0.5。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 5.89(s,2H),4.22(q,J＝7.1Hz,2H),2.75(s,3H),2.01(s,6H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H).

2、化合物4(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)的制备

在0℃氮气条件下，将三氯氧磷(POCl₃)(690mg，4.51mmol，1.0eq)逐滴加入二甲基甲酰胺(DMF)(5mL)。将混合物在0℃搅拌30分钟后回温至室温，然后将溶解于二甲基甲酰胺(DMF)(5mL)的化合物3(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(1.19g，4.51mmol，1.0eq)加入上述混合物中。将混合物加热至100℃并在氮气环境中搅拌5h。待冷却后，将混合物倒入冰水中并使用Na₂CO₃溶液调pH 值为9。使用乙酸乙酯萃取混合物并用盐水清洗。使用Na₂SO₄干燥有机相并过滤和浓缩。使用快速柱色谱(FCC)(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)纯化剩余物质并得到黄色固体，即化合物4(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(285 mg，产率78.5％)。MS(ESI)m/z:293[M+H]+；TLC:石油醚/乙酸乙酯(2/1)；R_f:(化合物3)＝0.7；R_f:(化合物4)＝0.3。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.87(s,1H),6.40(d, J＝0.9Hz,1H),4.23(q,J＝7.1Hz,2H),2.80(s,3H),2.32(s,3H),2.02(d,J＝0.5Hz, 3H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H).

3、(E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基 -1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯(化合物C)的合成

将化合物4(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(77.6mg,0.266mmol,1.0eq)溶于乙醇(1mL)，并加入化合物5(2-(6-甲氧基-3H-咪唑 [4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(50mg,0.266mmol,1.0eq)和2滴哌啶。将混合物回流加热并搅拌2h。待混合物冷却至室温并过滤。使用制备型高效液相色谱仪(Prep-HPLC)纯化剩余物质并得到黄色固体，即化合物C(AB24314)(10mg，产率8.15％)。MS(ESI) m/z:463.0[M+H]+；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.59(s,1H),8.21(s,1H),6.96(d, J＝7.0Hz,2H),4.11(q,J＝6.6Hz,2H),3.94(s,3H),2.75(s,3H),2.27(s,3H),2.03(s, 3H),1.06(t,J＝6.8Hz,3H).

使用一系列浓度的化合物(浓度范围设定为1nM、5nM、10nM、20nM、50nM、 100nM、250nM、500nM、1000nM)进行体外的DHX33蛋白的解旋酶活力测定。DHX33 蛋白的提取、解旋酶活力分析具体方法参见Wang X,Ge W,and Zhang Y.Recombinant DHX33 ProteinPossesses Dual DNA/RNA Helicase Activity.Biochemistry. 2019；58(4):250-8。使用上述方法进一步分析化合物针对DHX33解旋酶活力的抑制性。

本发明的化合物对DHX33蛋白的解旋酶活力的半抑制浓度如表1所示。从表1可以看出，本发明的化合物对DHX33蛋白的解旋酶活力具有显著的抑制作用。

表1：化合物A、化合物B、化合物C对DHX33蛋白的解旋酶活力抑制性分析

*代表半抑制浓度≥400nM；

**代表200nM≤半抑制浓度＜400nM；

***代表50nM≤半抑制浓度＜200nM；

****代表半抑制浓度＜50nM。

实施例1 DHX33蛋白在肝癌细胞中起重要作用，对DHX33的基因沉默显著抑制了人肝癌细胞在体外和体内的生长

1、免疫组织化学分析DHX33蛋白在人肝癌组织中的表达

从US BIOMAX公司购买了人肝癌组织的石蜡组织切片的微列阵，一共包括40种不同的肝癌组织，用三例正常的肝脏组织作为正常组织对照。将石蜡包埋的组织芯片首先在60℃烘箱中培育30分钟，然后迅速在二甲苯中脱石蜡，并在一系列乙醇浓度(100％、95％、70％、50％和25％)逐渐降低的溶液中逐渐水合(每次轻轻摇动5分钟，每个浓度的乙醇溶液重复处理一次)，最在蒸馏水中继续水合10分钟。然后在蒸汽器中用50mM的Tris盐酸缓冲液(pH9.0)呈现抗原，蒸汽加热40分钟，随后冷却到室温。然后将组织在含1％H₂O₂的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用 10％FBS封闭1h后，将组织与一抗在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用 DAKO试剂盒进行标准方案。使用的抗体来源如下：anti-DHX33，Santa Cruz。实验结果(图1中显示染色的暗色圆形区域)显示DHX33蛋白在多种人类肝癌组织(尤其在细胞核中)发生高表达。

2、敲低DHX33引起人肝癌细胞在体外和体内生长的抑制

癌细胞系HuH7从中科院细胞库获得。这种细胞分别被编码小发夹RNA的慢病毒侵染，72h后收集细胞并提取总蛋白。具体提取蛋白的方法是将细胞悬于细胞裂解液中(20mMTris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton-X-100，1％SDS，并补加蛋白酶和磷酸酶的抑制剂)。构建得到DHX33稳定缺失及稳定表达细胞系。用免疫印迹技术分析DHX33蛋白在各个样品中的表达量，用抗-GAPDH的抗体分析总蛋白上样量。

结果如图2所示，对照组DHX33稳定表达体系shSCR-HuH7，能检测到DHX33蛋白；实验组DHX33稳定缺失体系shDHX33-HuH7几乎检测不到DHX33蛋白。

为了分析癌细胞缺失DHX33后的表型，HuH7癌细胞中缺失了DHX33后，经对照组和DHX33缺失组的细胞按照同等细胞数铺在6孔板上，分别在每天计数每孔细胞数目，一共计数6天。

结果如图3所示，对照组shSCR的细胞生长旺盛，融合度高；而缺失DHX33的细胞shDHX33-HuH7表现非常明显的停滞生长现象。说明在人类肝癌细胞中缺失 DHX33会严重抑制细胞生长。

癌细胞有一个特征，即可以在极低的密度条件下扩增，而正常细胞在密度很低的条件下出现生长停滞现象。上述DHX33敲低的细胞和对照组的细胞分别以5000个细胞的密度铺在直径为10cm的细胞培养皿上面。2个星期后,发现对照组的细胞形成多个扩增生长的克隆,而DHX33敲低的细胞则没有发生同样的生长现象，如图4所示。

进一步地，癌细胞具有在三维培养体系中悬浮生长的能力，为了检测DHX33缺失对癌细胞这一能力的影响，上述DHX33敲低的细胞和对照组细胞以同样的细胞数悬浮在软琼脂培养基中，2周后，对照组的细胞已经形成了数个扩大增值的三维克隆，而DHX33缺失的细胞则很少形成克隆，如图5所示。对克隆的计数和统计分析如图6 所示，对照组和实验组有显著差异。

最后，进一步分析了肝癌细胞在敲低DHX33后的体内生长的变化。为了构建肝癌细胞的小鼠体内肿瘤模型，SKHEP-1细胞用上述编码敲低DHX33的小发夹RNA侵染，对照组用编码shSCR的小发夹RNA侵染，3天后，用同等数量的成功感染慢病毒的细胞注射于免疫缺陷小鼠皮下，细胞数量约每只小鼠500万个。为了提高肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤率，将等体积的细胞与等体积的基质胶混合，然后快速注射到小鼠皮下。8周后，小鼠被处死，肿瘤生长情况通过拍照和称重分析。图7显示各组小鼠处死后的肿瘤部位照片，以及各组小鼠的肿瘤取出后的照片；图8分析了肿瘤在终点的重量对比。DHX33基因敲低的肿瘤与对照组相比有显著降低。

以上实验结果首次证明了DHX33在人类肝癌细胞中的重要作用，DHX33缺少的肝癌细胞在体内和体外严重抑制了其生长，降低了在小鼠体内的肿瘤形成能力。

实施例2 DHX33通过调控甲羟戊酸通路的多种基因转录进而调控人肝癌细胞的胆固醇从头生成

细胞生长离不开细胞膜的合成，尤其在癌细胞中，膜生成效率显著提高。研究表明，在肝癌细胞中，甲羟戊酸途径异常活跃，甲羟戊酸途径是生成胆固醇的重要生物合成路线，不仅提供了重要的膜成分-胆固醇，而且可以通过合成多种中间产物如法内基脂类分子等，促进多种癌基因的激活，如RAS蛋白的法内基化，一种脂类偶联反应可以将RAS在内膜激活。所以甲羟戊酸途径是促进癌症发生发展的重要因素，如果抑制了这一通路的重要基因，研究表明癌症的发生发展会受到显著抑制。

为了分析DHX33蛋白促进肝癌细胞生长的分子机理，我们对DHX33基因敲除的细胞进行了转录组的RNA测序分析。如图9所示，在DHX33缺失的肝癌细胞内，受到显著影响的信号通路包括细胞周期、DNA复制及多种参与癌症发生发展的信号通路，排在前面的还包括胆固醇代谢通路。这一信号通路在现在技术中是没有报道过的。胆固醇的生成有两种途径，其中之一是利用环境中提供的胆固醇，在细胞的培养环境或者在机体的血浆中都含有从食物或环境摄取的胆固醇分子，如果在细胞饥饿或者环境不利的条件下，细胞会迅速启动胆固醇的从头合成，后一种途径称为甲羟戊酸途径。这一途径包含了多种基因，其中的HMGCR是这一途径的限速酶。为了确定 DHX33蛋白的缺失是影响了胆固醇代谢基因的转录，在DHX33缺失的人肝癌细胞系 HuH7细胞中，利用实时定量PCR技术，分析甲羟戊酸途径的多种基因的转录本水平。如图10所示，人肝癌细胞在无血清培养基中(即无外来胆固醇的条件下)，分析DHX33 的缺失对基因转录的影响，发现DHX33的缺失显著抑制了多种参与胆固醇从头合成的重要基因的转录，包括其中的限速酶基因HMGCR。

为了分析正常细胞是否也在DHX33缺失产生同样的现象。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为一个正常细胞的参照，在这个细胞中，DHX33基因可以通过加入CRE重组蛋白产生定向的基因敲除现象。细胞的提取和培养方法参考Identification of DHX33 as amediator in rRNA synthesis and cell growth.Zhang,Y.,Forys,JT.,Miceli,A.,Gwinn, A.,Weber,JD.Molecular Cellular Biology 2011,31(23),4676-4691。如图11所示，细胞在经受CRE重组酶处理之后，发生了DHX33的敲除现象，DHX33的信使RNA含量显著下调。但其他分析的基因，主要是甲羟戊酸途径中的多种基因都没有发生转录本下降的现象。这说明DHX33在肝癌细胞中对甲羟戊酸途径生成胆固醇起到了重要的调控作用，但在正常细胞中，DHX33不是这一通路的重要调控因子。

实施例3 DHX33小分子抑制剂可以抑制癌细胞中的甲羟戊酸途径重要基因的转录

上述实验数据显示DHX33的遗传缺失或基因沉默可以显著抑制参与甲羟戊酸途径胆固醇代谢重要酶的转录，为了分析DHX33小分子抑制剂处理的细胞是否也发生同样的基因下调情况。肝癌细胞HuH7细胞用DHX33小分子抑制剂(化合物C)处理6h，从细胞中提取总RNA后，用逆转录酶转换成其互补DNA分子，然后用这些DNA作为模板分析上述各种基因的转录本水平。如图12所示，小分子抑制剂处理的细胞发生了显著的甲羟戊酸途径多种基因下调的现象。其中的AURORA激酶B是作为一个阳性对照，在DHX33缺失或抑制的细胞中，AURKB是一个显著下调的基因。

在DHX33基因缺失的细胞中，提取细胞裂解液，并通过质谱分析了细胞中含有的胆固醇的含量，结果如图13所示，DHX33缺失的细胞出现显著的胆固醇水平下降的现象，上述数据表明细胞中的DHX33蛋白对胆固醇的合成非常重要，抑制DHX33 会引起多种参与甲羟戊酸途径的基因转录下调，并导致胆固醇水平降低的现象。

实施例4 DHX33小分子抑制剂不杀死正常细胞，却会快速杀伤癌细胞

用同样浓度范围的DHX33小分子抑制剂(化合物A)处理的癌细胞和正常细胞，发现癌细胞的活度降低显著，化合物A在较低浓度下(小于100nM)就可以达到有效的细胞抑制，而正常细胞的活度没有发生显著的变化(图14)。分析另外两个化合物B和化合物C，在肝癌细胞HuH7中，细胞半抑制浓度均在140nM左右(图14)。为了研究 DHX33小分子抑制剂对正常细胞系的影响，我们进一步分析了抑制剂对MEF细胞(原代小鼠胚胎成纤维细胞)的影响。如图15和图16所示，我们发现抑制剂处理后的MEF 细胞，没有细胞凋亡。

我们进一步分析了DHX33小分子抑制剂A对肝癌细胞系的影响。用标示的一系列浓度的DHX33小分子抑制剂A处理肝癌细胞系SK-HEP-1和HuH7，15h后，对细胞进一步的膜联蛋白V/PI染色，然后进行流式细胞分析细胞凋亡率，结果如图17～图20所示。许多癌细胞系在DHX33抑制剂处理之后发生癌细胞凋亡。

实施例5 DHX33小分子抑制剂的动物体内药代学分析

静脉注射用的化合物样本制备：每只大鼠平均体重300g，用100μL DMSO溶解0.3mg化合物B，然后加入400μL聚乙二醇400，最后加入1mL的无菌磷酸缓冲液配成澄清的溶液，用于大鼠的尾静脉注射。

灌胃化合物的样品制备：对每只300g的大鼠，将2.4mg的化合物A(KEYE-2020-3)或化合物B(KEYE-2021-21(化合物A只用于灌胃实验)溶解于100μL DMSO中，加入1.4mLphorsal 50PG(购自上海新睿生物科技有限公司)，用于大鼠的灌胃。大鼠在灌胃之前，禁食10h，在灌胃之后的4h解禁。

大鼠来源：中英SIPPR/BK实验动物公司，上海，中国。

大鼠数量，共6只，3只用于静脉注射，3只用于口服灌胃。

血浆样本收集：

静脉注射：注射后0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24h。

口服灌胃：口服后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和24h。

血浆样品收集及操作步骤：大鼠给药后进行静脉取血，每个时间点取血0.2mL。血液样本放置于冰上含有EDTA的小管中，直至离心。血液样品在取血后的1h内用离心机离心，6800g离心6分钟，然后迅速置于-80℃冰箱内，剩余的血液处理掉。

样本分析和数据处理：

分析结果通过质量检验后确定。大于66.7％的质量检验的样本的准确度应该保持在已知数据的80-120％范围内。

标准参数包括曲线下面积(AUC(0-t)和AUC(0-∞))，清除半衰期(T1/2)，最大血浆浓度(Cmax)，达峰时间(Tmax)通过FDA认证的药代程序Phoenix WinNonlin 7.0(Pharsight,USA)进行分析。从图21和图22可见，DHX33小分子抑制剂B在大鼠给药后的各种药代学参数。

血浆稳定性实验方法具体如下：

1.将100mM KCl缓冲液(含有5mM MgCl₂，pH 7.41)预热到37℃。

2.将人血浆迅速融化到37℃。

3.测试化合物和内参化合物的制备：

1)将化合物B(KEYE-2021-9)和化合物C(KEYE-10-6)用DMSO溶解，配制成10 mM的母液。然后配置0.5mM化合物溶液A：将10μL的10mM化合物母液加入到190 μL乙腈中，得溶液A；

2)0.01mM化合物溶液B：将20μL溶液A加入到980μL的100mM KCl缓冲液，得溶液B。

4.预热血浆和溶液B，37℃孵育5分钟。

5.向孔内加入90μL预热的血浆样本，时间点如下：0、5、15、30、60、120分钟。

6.在0分钟时间点，将含有内参的400μL乙腈加入到0-分钟的孔内，然后加入10 μL溶液B。

7.对于其他时间点，将10μL事先预热的溶液B加入到设定的孔内，时间点如下： 5、15、30、60、120分钟，然后计时。

8.在下面的几个时间点：5、15、30、60、120分钟，将400μL含有内参的乙腈加入到每个孔内，用来终止反应。

9.淬灭后，将板摇晃5分钟(600rpm)并保存于-20℃(必要时)直至用LC/MS/MS 分析。

10.在用液质联机LC/MS/MS进行分析前，将样本融化到室温，然后6000rpm离心20分钟。

11.将100μL上清液转移到96孔板的孔中，事先每孔已经加入了100μL的水进行LC/MS测试。

实验结果如图22所示，化合物B和化合物C非常稳定，不易在血浆中被修饰。

实施例6 DHX33小分子抑制剂可以抑制人肝癌细胞在小鼠体内的生长

1、动物信息

种属及品系：Balb/c Nude小鼠。

性别及周龄：雌性，6-8周龄。

体重：20-22g，偏差约为体重均值的±20％。

接种动物数：10只。

动物来源：北京/上海/浙江维通利华实验动物技术有限公司。

2、动物饲养

居住条件：SPF环境，IVC小鼠笼，每笼4只。

温度：20-26℃。

湿度：40-70％。

光照：12h昼夜交替。

饲料：辐照大小鼠饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司，自由进食。

饮用水：城市自来水，经过滤、高压灭菌后饮用。

垫料：玉米芯，购自北京科澳协力饲料有限公司，经高压灭菌后使用，每周更换一次。

适应性饲养：实验前给予小鼠不低于7天的适应性饲养期。

动物识别：每个鼠笼均挂有实验信息标示卡，其中包括小鼠信息、细胞接种信息、动物实验信息及实验人员信息等，小鼠用耳标法进行标记。

所有实验动物的操作和管理均严格遵守实验动物使用和管理指导原则。

3、溶媒处方及给药溶液储存条件

(1)受试物2020-1(化合物A)

2020-1配置：称取适量粉末状态药物，先用DMSO在常温下溶解，然后按照 DMSO:phorsal 50PG＝1:20的体积比在常温下加入phorsal 50PG赋形剂即可。

2020-1给药溶液保存条件：4℃保存(一次配置两天的药物，14天的实验周期内一共配制7次药物。需要分装好，放置在4℃冰箱。配置好的药物不可放置于-20℃或-80℃冰箱内)。

(2)细胞株

人肝癌Huh-7购自中科院细胞库。

(3)培养基

DMEM培养基和胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司(Grand Island,NY,USA)，基质胶(Matrigel)购自BD公司(Franklin lake,NJ,USA)。

4、实验设计

实验设计如表1所示：

表1.受试物对人肝癌Huh-7 Balb/c裸鼠异种移植瘤生长抑制作用研究方案

注：NA表示不适用，PO表示灌胃，BID表示一天两次灌胃，Vehicle表示溶媒对照组。

5、实验方法

(1)模型建立

Huh-7细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基，维持在含5％CO₂的37℃饱和湿度培养箱中。

收集对数生长期Huh-7细胞，重悬于含50％Matrigel的DMEM基础培养基中，调整细胞浓度至每毫升5×10⁷个细胞。在无菌条件下，接种0.1mL细胞悬液至小鼠右侧背部皮下，接种浓度为5×10⁶个细胞/0.1mL/小鼠。

(2)分组及给药观察

在肿瘤平均体积达到150～200mm³时，将动物按肿瘤体积随机分组,使各组肿瘤体积差异小于均值的10％，分组当日记为Day0,并按照动物体重开始给药。给药期间，每周2次测定动物体重，每日观察记录动物临床症状。个别动物体重如果与Day0相比下降超过15％(BWL≥15％)，将做停药处理，直至动物体重恢复后(BWL<15％)，恢复给药。

实验终点说明：

实验终点最后一次称量结束后，用CO₂安乐死处死剩余动物，取瘤称重并拍照记录。

从图23～图25可见，DHX33小分子抑制剂处理后的小鼠肿瘤，与对照组相比，有明显的抑制现象。对照组和实验组小鼠在起始时间点(即开始分组，化合物处理之前) 的肿瘤平均体积都是170mm³左右，但在14天药物处理之后，肿瘤的增长指数对照组明显大于给药组小鼠。值得一提的是，本实验中使用化合物A其体内的药物代谢数据不是三个化合物中最优选的，化合物A的药代数据本身也不是在最佳条件下获得的。针对该化合物的机体摄入频率和剂量没有进行最佳组合分析。化合物A相比于化合物 B，在类似条件下显示生物利用度偏低，但依然可以检测到化合物A在体内对肿瘤的抑制性。

用较高剂量(50mg/kg，一天两次)的DHX33抑制剂(化合物A)处理小鼠14天的过程中，也对各组小鼠的体重进行跟踪监测。检测结果显示(图25)，小鼠没有明显的体重减低现象。与对照组相比，小鼠的行为和体重正常。以上实验数据表明，本发明中DHX33小分子抑制剂对小鼠没有明显毒副作用。

实施例7 DHX33小分子抑制剂可以抑制人类肝癌类器官的生长

1、肿瘤类器官复苏培养

人类肝癌类器官购自北京科图医学科技有限公司。从液氮中取出冻存的2株肿瘤类器官(编号为KOLV-H123---人原发肝癌，编号为KOLV-H324X以及KOLV-H325X--- 人转移性肝癌，三者均为甲胎蛋白含量较高)，在37℃快速溶解，加入5mL含有10％ FBS的AdvanceDMEM培养基，300g离心5分钟，收集沉淀，用GAS-Ad-ES(X)培养基重悬后，加入预冷稀释的基质胶，充分混合后，加入24孔细胞培养板中，37℃孵育 30分钟，加入GAS-Ad-ES培养基继续培养1周，每3天补加一次培养基，直至传代。

2、类器官接种

待肿瘤类器官可以传代，在4℃使基质胶溶化备用。用巴氏滴管收集培养的肿瘤类器官，加入TrypLE酶解肿瘤类器官，以形成单细胞悬液。细胞计数后，用GAS-Ad-ES 培养基调整细胞浓度到每毫升1.6×10⁵个细胞，取2mL细胞悬液至于冰上备用。制备基质胶混合液在冰上备用，混合细胞悬液和基质胶，在96孔板中加入50μL混合液，置于37℃孵育30分钟，加入GAS-Ad-ES培养基，在37℃细胞培养箱中培养2天后，观察肿瘤类器官开始形成和生长。

3、化合物配制和稀释

当类器官在凝胶相+水相(培养基)中培养2天后，制备化合物梯度稀释液并加入培养体系。

将溶解于DMSO中的储液在室温充分溶解，如果有不溶物，超声加热5分钟再观察，直至溶解。

在96孔V形化合物稀释板中的2-9号孔分别加入20μL DMSO，在1孔中加入40μL 储液(KEYE-2021-1-1，化合物B，50mM)，将化合物稀释板至于震荡混匀器上，从1 号孔转移20μL液体加入2号孔，吹打震荡混匀后，从2号孔转移20μL液体到3号孔，震荡吹大混匀，依次类推…直至从8号孔转移20μL液体到9号孔，吹打震荡混匀。制备1000×梯度稀释储液完成。注意：DMSO容易吸收空气中的水分，操作完后，立即加封口膜封闭化合物稀释板，储存于4℃，1周后丢弃。再次使用时，温度达到室温后再开封口膜，避免吸湿造成浓度不准确。

取96孔无菌细胞培养板，于超净工作台中，在1-9号孔加入198μL培养基，用微量加样器从1000×储液中，对应1-9号孔转移2μL储液到96孔无菌细胞培养板对应的 1-9号孔，震荡吹打混匀，制备10×储液完成。本储液需要当天配制使用。

在类器官在凝胶相+水相(培养基)中加入10μL当天制备好的10×储液。

下文的表2显示了受试物对人肝癌类器官生长抑制作用研究中的化合物稀释具体方案。

表2：受试物对人肝癌类器官生长抑制作用研究中的化合物稀释具体方案

4、加待测药物

待观察肿瘤类器官开始形成和生长后，对应Plate map依此加入10μL相应浓度的化合物，当天制备好的10×储液。置于37℃，5％CO₂条件下分别孵育120h。

5、化学发光测定

采用化学发光法测定细胞ATP水平，进而评价细胞活力。按照说明书操作进行，培养结束后加入50μLCTG溶液，混匀后，裂解混合物转移到酶标板中，5-10分钟后，在酶标仪中采集化学发光数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7 软件，根据化学发光数据的拟合药效计量曲线，计算IC₅₀值。

6、对照和质控

本试验用Z factor作为质控指标。Z’factor由4个参数来定义：阳性对照(positive,p) 和阴性对照(negative,n)的平均值(μ)和标准差(σ)。计算公式如下：

Z’factor＝1-(3×(σp+σn)/|(μp-μn)|)

阴性对照组为加入溶剂(DMSO)的未处理组；阳性对照用加入2.5μM的BEZ235。

一般细胞水平的功能性检测Z’factor要求>0.3；本试验质控通过值Z’factor设定为>0.5。

数据分析如下：剂量反应曲线及IC₅₀计算方法：用GraphPad Prism 7软件计算存活率为50％时对应的化合物浓度，即为该化合物在这些细胞上的IC₅₀值。实验结果见图26。

综上，本发明明确了DHX33在癌症的发生发展中起至关重要的作用，DHX33是引发肝癌发生发展的重要因子，抑制DHX33可以成为治疗肝癌的一个靶向位点。DHX33 小分子抑制剂可以有效抑制肝癌细胞的生长，其分子机理是可以有效抑制肝癌中胆固醇生成。DHX33小分子抑制剂对正常细胞不具有杀伤性，但可以快速诱导肝癌细胞的凋亡。可以快速诱导肝癌包括人肝癌肿瘤细胞系和人肝癌异质性类器官的生长。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但本领域技术人此基础上显然可以对之做一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗肝癌的药物或组合物中的应用，其中，所述RNA解旋酶DHX33抑制剂选自化合物A、B、C或它们药学上可接受的盐中的至少一种，

化合物A、

化合物B和

化合物C。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌为RNA解旋酶DHX33过表达的肝癌，所述肝癌为原发肝癌或者转移性肝癌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33调控的甲羟戊酸合成途径的抑制剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33调控的胆固醇代谢途径的抑制剂。