JP2022513127A - 線維芽細胞増殖因子２１（ｆｇｆ２１）遺伝子療法 - Google Patents

線維芽細胞増殖因子２１（ｆｇｆ２１）遺伝子療法 Download PDF

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Abstract

代謝障害の治療および／または予防に使用するための、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物であって、療法が、中枢神経系（ＣＮＳ）内の遺伝子構築物の発現を含む遺伝子構築物が本明細書に記載される。

Description

糖尿病の有病率は、驚くべき速度で増加しており、世界的に大きな健康問題である。肥満は、インスリン抵抗性および２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と強く関連している（Ｍｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，１９９１．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：９３８－９４８）。Ｔ２Ｄおよび肥満はともに、死亡のリスクを高めるほか（Ｐｅｅｔｅｒｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００３．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３８：２４－３２）、心血管疾患、高血圧および特定のタイプの癌を含む高度に病的な慢性疾患のリスクを高める（Ｈａｓｌａｍ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｌａｎｃｅｔ．３６６，１１９７－１２０９；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６１，３０１－３１６）。インスリン抵抗性および肥満関連疾患は、続いて、平均余命の短縮および生活の質の低下に関連している。
脂肪組織、肝臓または骨格筋などの末梢組織には、肥満中に、インスリン抵抗性の発生を含む代謝機能障害の原因となり得る慢性の低悪性度炎症があることが現在広く認められている（Ｖａｌｄｅａｒｃｏｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７７，１３１－１６０；Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ．５４２，１７７－１８５）。近年では、肥満およびインスリン抵抗性が脳内の炎症とも関連していることを実証する文献が増えてきている（Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ－Ｌｅｇｒｉｓ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４０，２３７－２５３；Ｂｅｉｌｈａｒｚ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３０６，１－７）。さらに、動物モデルおよびヒトでは、肥満およびインスリン抵抗性は、神経炎症だけでなく、認知機能の欠陥とも関連している（Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ－Ｌｅｇｒｉｓ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４０，２３７－２５３）。
主に肝臓によって分泌されるが、脂肪組織および膵臓によっても分泌される増殖因子である線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）（Ｍｕｉｓｅ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７４：４０３－４１２）は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の増殖、ならびにＢＡＴおよび白色脂肪組織（ＷＡＴ）内の熱産生遺伝子の発現を増加させ、エネルギー消費を刺激することが示されている（Ｃｏｓｋｕｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４９：６０１８－６０２７；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２６：２７１－２８１；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １１５：１６２７－１６３５；Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２１１９－１２１２２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３：１７４１－１７４７；Ｘｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５８：２５０－２５９）。
天然のＦＧＦ２１タンパク質は、不良な薬物動態学的特徴を示す。これは短い半減期を有し、インビボタンパク質分解およびインビトロ凝集に感受性である（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．３４６（２）：２７０－８０；Ｓｏ，Ｗ．Ｙ．ａｎｄ Ｌｅｕｎｇ，Ｐ．Ｓ．２０１６．Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．３６（４）：６７２－７０４；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｙ．２０１５．Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）．６：１６８）。半減期を延長し、ＦＧＦ２１の安定性および溶解性を改善するための様々な工学的手法が開発されている。現在、ヒトを対象に、２つの操作されたＦＧＦ２１模倣物（ＬＹ２４０５３１９およびＰＦ－０５２３１０２３）が試験されている。それでもなお、ＦＧＦ２１模倣物は複数回の投与を必要とし、これにより、患者に大きな負担を課す。さらに、操作されたＦＧＦ２１模倣物／類似体は、天然のＦＧＦ２１よりも高い免疫原性のリスクを示し得、例えば、ＬＹ２４０５３１９を用いて治療された患者は、注射部位反応、抗薬物抗体および重篤な過敏反応を発現した（Ｇａｉｃｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１８（３）：３３３－４０）。したがって、本発明のベクターの単回投与によってもたらされる長期的かつ効果的な発現は、他の療法を超える顕著な利点を表す。
神経炎症が、糖尿病および肥満に観察される認知低下ならびに全身エネルギーおよびグルコース代謝に何らかの役割を果たすと思われるという重要性を考慮すると、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症に対処する新しい治療手法は、切実に重要である可能性がある。近年の試験は、ＣＮＳ、特に全身エネルギー代謝を調節する脳の主要部位である視床下部では、ＦＧＦ２１末梢代謝効果が、実際に、ＦＧＦ２１シグナル伝達によって媒介され得ることを示している（Ｄ．Ａ．Ｓａｒｒｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５９，１８１７－１８２４（２０１０）；Ａ．Ｌ．Ｂｏｏｋｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９，１１４７－１１５２（２０１３）；Ｂ．Ｍ．Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０，６７０－６７７（２０１４）；Ｎ．Ｄｏｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１５６，２４７０－２４８１（２０１５）。
Ｍｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，１９９１．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：９３８－９４８ Ｐｅｅｔｅｒｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００３．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３８：２４－３２ Ｈａｓｌａｍ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｌａｎｃｅｔ．３６６，１１９７－１２０９ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６１，３０１－３１６ Ｖａｌｄｅａｒｃｏｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７７，１３１－１６０ Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ．５４２，１７７－１８５ Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ－Ｌｅｇｒｉｓ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４０，２３７－２５３ Ｂｅｉｌｈａｒｚ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３０６，１－７ Ｍｕｉｓｅ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７４：４０３－４１２ Ｃｏｓｋｕｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４９：６０１８－６０２７ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２６：２７１－２８１ Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １１５：１６２７－１６３５ Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２１１９－１２１２２ Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３：１７４１－１７４７ Ｘｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５８：２５０－２５９ Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．３４６（２）：２７０－８０ Ｓｏ，Ｗ．Ｙ．ａｎｄ Ｌｅｕｎｇ，Ｐ．Ｓ．２０１６．Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．３６（４）：６７２－７０４ Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｙ．２０１５．Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）．６：１６８ Ｇａｉｃｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１８（３）：３３３－４０ Ｄ．Ａ．Ｓａｒｒｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５９，１８１７－１８２４（２０１０） Ａ．Ｌ．Ｂｏｏｋｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９，１１４７－１１５２（２０１３） Ｂ．Ｍ．Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０，６７０－６７７（２０１４） Ｎ．Ｄｏｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１５６，２４７０－２４８１（２０１５）
本明細書の態様は、哺乳動物、特にヒトの代謝障害の治療に使用するための遺伝子療法組成物を含む医療分野に関する。
第１の態様では、療法に使用するための、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物であって、療法が、中枢神経系（ＣＮＳ）、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む遺伝子構築物が提供される。いくつかの実施形態では、代謝障害の治療に使用するための、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物であって、療法が、中枢神経系（ＣＮＳ）、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む遺伝子構築物が提供される。
好ましくは、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている。好ましい実施形態では、ユビキタスプロモーターは、ＣＡＧプロモーターおよびＣＭＶプロモーターからなる群から選択され、好ましくはユビキタスプロモーターはＣＡＧプロモーターである。好ましくは、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、ユビキタスプロモーターに、およびＦＧＦ２１の発現が防止されることが望まれる組織に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列に作動可能に連結されている。
好ましくは、マイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列は、哺乳動物の心臓および／または肝臓に発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列から選択される。
さらに好ましくは、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、ユビキタスプロモーターに、ならびに肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列に、および心臓に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列に作動可能に連結されている。
好ましくは、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は配列番号１３および２１～２５から選択され、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は配列番号１２および１４～２０から選択される。
さらに好ましくは、遺伝子構築物は、マイクロＲＮＡ－１２２ａの標的配列と、マイクロＲＮＡ－１の標的配列とを含む。
好ましくは、ユビキタスプロモーターは、ＣＡＧプロモーターおよびＣＭＶプロモーターからなる群から選択され、好ましくはユビキタスプロモーターはＣＡＧプロモーターである。
好ましくは、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群から選択される：
（ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；および
（ｃ）遺伝暗号の縮重に起因して配列が（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列。
第２の態様では、療法に使用するための、第１の態様に記載の遺伝子構築物を含む発現ベクターであって、療法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、代謝障害の治療に使用するための、第１の態様に記載の遺伝子構築物を含む発現ベクターであって、療法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む発現ベクターが提供される。好ましくは、発現ベクターはウイルスベクターである。
好ましくは、発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択され、好ましくは、発現ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。
好ましくは、発現ベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ１０、ｒｈ８、Ｃｂ４、ｒｈ７４、ＤＪ、２／５、２／１、１／２またはＡｎｃ８０のアデノ随伴ウイルスベクターであり、さらに好ましくは、発現ベクターは、血清型１、２または９のアデノ随伴ウイルスベクターである。
第３の態様では、療法に使用するための、１つ以上の薬学的に許容される成分とともに第１の態様に記載の遺伝子構築物および／または第２の態様に記載の発現ベクターを含む医薬組成物であって、療法が、ＣＮＳおよび／または脳内の遺伝子構築物の発現を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、代謝障害の治療に使用するための、１つ以上の薬学的に許容される成分とともに第１の態様に記載の遺伝子構築物および／または第２の態様に記載の発現ベクターを含む医薬組成物であって、療法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む医薬組成物が提供される。
第４の態様では、遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物がＣＳＦ内投与によって投与される、第１の態様に記載の使用のための遺伝子構築物および／または第２の態様に記載の使用のための発現ベクターおよび／または第３の態様に記載の使用のための医薬組成物が提供される。
第５の態様では、好ましくは、代謝障害が糖尿病および／または肥満である、代謝障害の治療および／または予防に使用するための、第１の態様に記載の使用のための遺伝子構築物および／または第２の態様に記載の使用のための発現ベクターおよび／または第３の態様に記載の使用のための医薬組成物が提供される。
概要
本発明者らは、肥満および／または糖尿病を抑制するために、中枢神経系（ＣＮＳ）に向けられた、ＦＧＦ２１遺伝子療法に基づく改善された遺伝子療法戦略を開発した。特に、実験部分で詳述するように、本発明者らは、脳に向けられたＦＧＦ２１遺伝子療法の以下の予想外の利点を見出した：
・本明細書に記載の遺伝子構築物およびベクターは、脳内で強力かつ広く拡散した過剰発現を得ることができる（実施例１、２、３および４）。
・本明細書に記載の遺伝子構築物およびベクターは、脂肪細胞サイズを縮小し、褐色脂肪細胞内の脂肪蓄積を減少させ、熱産生を増加させ、循環トリグリセリドおよび遊離脂肪酸を減少させ、膵臓の健康状態を改善させ（膵島の数を増加させ、β細胞量を改善する）、全身性炎症を減少させる（減少、またはＦ４／８０、ＩＬ－６、ＴＮＦαなどの炎症性サイトカイン）（実施例１．１）。
・肥満および糖尿病の広く使用されているマウスモデルでは、脳内のＦＧＦ２１の発現が、体重増加、体脂肪蓄積および肝臓重量を明らかに減少させ、摂食時の血糖を完全に正常化し（実施例１）、インスリン抵抗性を改善し、耐糖能を改善し、糖新生を減少させた（実施例４）。
・加齢性脳病変を有する広く使用されている老化マウスモデルでは、脳内のＦＧＦ２１の発現が、体重増加および肝臓重量を明らかに減少させた（実施例２）。
・いずれのマウスモデルでも、視床下部の炎症は減少する（実施例１、２）。
したがって、本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、本明細書中で説明される問題および必要性の少なくとも一部を解決する。
遺伝子構築物
第１の態様では、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供される。
本明細書に記載の「遺伝子構築物」は、本開示を考慮して当業者によって理解されるその慣習的かつ通常の意味を有する。「遺伝子構築物」は、「発現カセット」または「発現構築物」とも呼ばれ、その発現を制御するプロモーターに作動可能に連結されている、目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子または遺伝子群を指す。「一般情報」と題する本出願の部分は、「遺伝子構築物」に関してさらに詳細を含む。本明細書中で使用される「作動可能に連結されている」は、「一般情報」と題する本出願の部分でさらに説明される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子構築物は、哺乳動物における発現に適している。本明細書中で使用される場合、「哺乳動物における発現に適している」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結されている遺伝子構築物が、発現に使用される哺乳動物宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味し得る。好ましくは、発現に使用される上記哺乳動物宿主細胞は、ヒト、マウスまたはイヌ細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子構築物は、療法に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本明細書に記載の遺伝子構築物は、代謝障害の治療および／または予防に使用するためのものである。好ましい実施形態では、療法は、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む。いくつかの実施形態では、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。したがって、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球からなる群から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは全部の脳領域内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。好ましい実施形態では、療法は、視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む。いくつかの実施形態では、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の発現とは、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の特異的発現を意味し得る。一実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および／または心臓内の発現を含まない。いくつかの実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および心臓からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは全部の器官内の発現を含まない。ＣＮＳ特異的発現および／または脳特異的発現および／または視床下部特異的発現および／または皮質特異的発現および／または海馬特異的発現および／または小脳特異的発現および／または嗅球特異的発現の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
発現は、「一般情報」と題する項に記載されているように評価され得る。「ＣＮＳ」、「脳」および「視床下部」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子構築物は療法に使用するためのものであり、遺伝子構築物は、ＣＳＦ（脳脊髄液）内投与（大槽、髄腔内または脳室内送達を介して）、実質内投与または鼻腔内投与によって投与される。好ましい投与はＣＳＦ内投与である。
本明細書中で使用される「ＣＳＦ内投与」、「鼻腔内投与」、「実質内投与」、「大槽内投与」、「髄腔内投与」および「脳室内投与」は、「一般情報」と題する本出願の部分に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子構築物は、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部に発現されるＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子構築物は、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部内の発現に適している。いくつかの実施形態では、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。したがって、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球からなる群から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは全部の脳領域内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。視床下部内の発現が最も好ましい。発現は、「一般情報」と題する項に記載されているように評価され得る。
本発明の実施形態の文脈では、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球に発現されるＦＧＦ２１；およびＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の発現に適した遺伝子構築物とは、他の器官または組織と比較して、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内のＦＧＦ２１の優先的または優勢な（少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも３０％高い、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも１５０％高い、少なくとも２００％高い、またはそれ以上）発現を指す。他の器官または組織は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃、精巣などであり得る。好ましくは、他の器官は、肝臓および／または心臓である。一実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および／または心臓では検出できない。いくつかの実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃および精巣からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは全部の器官では検出できない。発現は、「一般情報」と題する項に記載されているように評価され得る。
本発明による遺伝子構築物中に存在する、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、任意のＦＧＦ２１遺伝子もしくはＦＧＦ２１コード配列、好ましくはヒト、マウスもしくはイヌ由来のＦＧＦ２１遺伝子もしくはＦＧＦ２１コード配列；または好ましくはヒト、マウスもしくはイヌ由来の変異ＦＧＦ２１遺伝子もしくはＦＧＦ２１コード配列；または好ましくはヒト、マウスもしくはイヌ由来のコドン最適化ＦＧＦ２１遺伝子もしくはＦＧＦ２１コード配列に由来し得る。
したがって、いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１をコードする好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１、２または３と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。配列番号１は、ヒトＦＧＦ２１のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、マウスＦＧＦ２１のアミノ酸配列を表す。配列番号３は、イヌＦＧＦ２１のアミノ酸配列を表す。いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１からなる群から選択される任意の配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。
「同一性」または「配列同一性」および「類似性」または「配列類似性」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、ヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、５、６または７と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。配列番号４は、ヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列である。配列番号５は、ヒトＦＧＦ２１、変異体１をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列である。配列番号６は、ヒトＦＧＦ２１、変異体２をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列である。配列番号７は、ヒトＦＧＦ２１、変異体３をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列である。変異体１、変異体２および変異体３は、同じヒトＦＧＦ２１タンパク質をコードするものであり、コドン最適化の異なるアルゴリズムによって得られた。「コドン最適化」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、マウスＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８または９と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。配列番号８は、マウスＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列である。配列番号９は、マウスＦＧＦ２１をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、イヌＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０または１１と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。配列番号１０は、イヌＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列である。配列番号１１は、イヌＦＧＦ２１をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列が以下からなる群から選択される、本明細書に記載の遺伝子構築物が提供される：
（ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
（ｂ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列。
（ｃ）遺伝暗号の縮重に起因して配列が（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列。
好ましい実施形態では、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化ヌクレオチド配列、好ましくは配列番号５、６および７の配列から選択される好ましくはコドン最適化ヒト配列である。
本明細書に記載のヌクレオチド配列によってコードされるＦＧＦ２１は、当業者に知られているように、ＦＧＦ２１の少なくとも検出可能なレベルの活性を発揮する。ＦＧＦ２１の活性とは、本明細書中で後にさらに詳細に記載されるように、抗肥満および／または抗糖尿病作用を示すことであり得る。ＦＧＦ２１の活性とはまた、インスリン感受性を増加させることであり得る。この活性は、当業者に公知の方法によって、例えば、インスリン負荷試験またはブドウ糖負荷試験を使用することによって評価することができる。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている。好ましいユビキタスプロモーターは、ＣＭＶプロモーターおよびＣＡＧプロモーター、好ましくはＣＡＧプロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、ユビキタスプロモーターに、およびＦＧＦ２１の発現が防止されることが望まれる組織に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列に作動可能に連結されている。
「ユビキタスプロモーター」、「作動可能に連結されている」および「マイクロＲＮＡ」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。本明細書中で使用される「組織に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列」または「組織に発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列」または「組織に発現されるマイクロＲＮＡの結合部位」は、本明細書の他の箇所に記載されるように、上記組織に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも一部に相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列は、哺乳動物の心臓および／または肝臓に発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列から選択される。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、ユビキタスプロモーターに、ならびに肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列に、および心臓に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列に作動可能に連結されている。
本明細書中で使用される「肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列」または「肝臓に発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列」または「肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの結合部位」は、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも一部に相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す。同様に、本明細書中で使用される「心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列」または「心臓に発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列」または「心臓に発現されるマイクロＲＮＡの結合部位」は、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも一部に相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す。
本明細書に記載されるように、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの一部、または心臓に発現されるマイクロＲＮＡの一部とは、上記マイクロＲＮＡの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６または少なくとも７の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を意味する。結合部位配列は、発現されたマイクロＲＮＡの少なくとも一部に対して完全な相補性を有することができ、これは、この配列がミスマッチを生じることなく完全に一致することを意味する。あるいは、結合部位配列は、発現されたマイクロＲＮＡの少なくとも一部に部分的に相補的であり得、これは、４、５、６または７の連続したヌクレオチド中に１つのミスマッチが生じ得ることを意味する。部分的に相補的な結合部位は、好ましくは、マイクロＲＮＡのシード領域に対して完全またはほぼ完全な相補性を含み、これは、マイクロＲＮＡのシード領域とその結合部位との間に、ミスマッチが生じ得ない（完全な相補性）こと、または４、５、６もしくは７の連続したヌクレオチド当たり１つのミスマッチが生じ得ること（ほぼ完全な相補性）を意味する。マイクロＲＮＡのシード領域は、マイクロＲＮＡの約ヌクレオチド２から約ヌクレオチド８までの、マイクロＲＮＡの５’領域からなる。本明細書に記載の部分は、好ましくは上記マイクロＲＮＡのシード領域である。肝臓に発現されるマイクロＲＮＡまたは心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解は、ＲＮＡ干渉経路によるものであっても、ｍＲＮＡの直接翻訳制御（阻害）によるものであってもよい。本発明は、導入遺伝子またはコードされるタンパク質の発現を阻害する際にｍｉＲＮＡによって最終的に利用される経路に決して限定されない。
本発明の文脈では、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列は、配列番号１２または１４～２０と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置換され得る。
好ましい実施形態では、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は、配列番号１２と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置換され得る。さらなる実施形態では、配列番号１２または１４～２０に記載の、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも１コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。さらなる実施形態では、配列番号１２または１４～２０に記載の、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。好ましい実施形態では、配列ｍｉＲＴ－１２２ａ（配列番号１２）の１、２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の好ましいコピー数は４である。
本明細書中で使用される場合、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は、当業者に知られているように、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも検出可能なレベルの活性を発揮する。肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の活性とは、肝臓に発現されるその同起源のマイクロＲＮＡに結合すること、および導入遺伝子に作動可能に連結されていると、肝臓内の導入遺伝子発現の標的解除（ｄｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を媒介することである。この活性は、当業者に公知の標準的なアッセイ、例えば、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡによって、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで肝臓内の導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価され得る。
本発明の文脈では、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は、配列番号１３または２１～２５と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置換され得る。
好ましい実施形態では、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は、配列番号１３と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置換され得る。さらなる実施形態では、配列番号１３または２１～２５に記載の、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも１コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。さらなる実施形態では、配列番号１３または２１～２５に記載の、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。好ましい実施形態では、ｍｉＲＴ－１（配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の好ましいコピー数は４である。
本明細書中で使用される場合、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は、当業者に知られているように、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも検出可能なレベルの活性を発揮する。心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の活性とは、心臓に発現されるその同起源のマイクロＲＮＡに結合すること、および導入遺伝子に作動可能に連結されていると、心臓内の導入遺伝子発現の標的解除を媒介することである。この活性は、当業者に公知の標準的なアッセイ、例えば、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡによって、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで心臓内の導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価され得る。
いくつかの実施形態では、配列番号１２または１４～２０に記載の、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも１コピーと、配列番号１３または２１～２５に記載の、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも１コピーとが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。さらなる実施形態では、配列番号１２または１４～２０に記載の、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の２、３、４、５、６、７または８コピーと、配列番号１３または２１～２５に記載の、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の２、３、４、５、６、７または８コピーとが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。さらなる実施形態では、ｍｉＲＴ－１２２ａ（配列番号１２）をコードするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７または８コピーと、ｍｉＲＴ－１（配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７または８コピーとが、本発明の遺伝子構築物中で組み合わされる。さらなる実施形態では、ｍｉＲＴ－１２２ａ（配列番号１２）をコードするヌクレオチド配列の４コピーと、ｍｉＲＴ－１（配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列の４コピーとが、本発明の遺伝子構築物中で組み合わされる。
いくつかの実施形態では、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列と、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列とが、配列番号１２～２５の配列および／またはそれらの組合せからなる群から選択される、上記の遺伝子構築物が提供される。いくつかの実施形態では、心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号１３および２１～２５から選択され、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号１２および１４～２０から選択される、上記の遺伝子構築物が提供される。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ－１２２ａの標的配列とマイクロＲＮＡ－１の標的配列とを含む、上記の遺伝子構築物が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のユビキタスプロモーターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｍｉｎｉ－ＣＭＶプロモーター、β－アクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、初期増殖応答因子－１（Ｅｇｒ－１）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ（ｅｌＦ４Ａ）プロモーター、フェリチン重鎖コード遺伝子（ＦｅｒＨ）プロモーター、フェリチン軽鎖コード遺伝子（ＦｅｒＬ）プロモーター、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＧＲＰ９４プロモーター、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）プロモーター、ユビキチンＢプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、βキネシンプロモーター、ＲＯＳＡ２６およびＰＧＫ－１プロモーターからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、ユビキタスプロモーターはＣＡＧプロモーターである。実施例では、ＣＡＧプロモーターが、本発明による遺伝子構築物に使用するのに適していることが実証されている。いくつかの実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号２７と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいユビキタスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、配列番号２８と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。好ましくは、上記ＣＭＶプロモーターは、イントロン配列とともに使用される。いくつかの実施形態では、イントロン配列は、配列番号２６と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいユビキタスプロモーターは、ｍｉｎｉ－ＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ｍｉｎｉ－ＣＭＶプロモーターは、配列番号３６と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいユビキタスプロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＥＦ１αプロモーターは、配列番号３７と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいユビキタスプロモーターは、ＲＳＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＲＳＶプロモーターは、配列番号３８と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている。好ましい実施形態では、組織特異的プロモーターは、ＣＮＳ特異的プロモーター、さらに好ましくは脳特異的プロモーター、最も好ましくは視床下部特異的プロモーターである。
「組織特異的プロモーター」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＮＳ特異的プロモーターは、シナプシン１プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター、フォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）プロモーター、α－インターネキシン（ＩＮＡ）プロモーター、ネスチン（ＮＥＳ）プロモーター、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＬ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）プロモーター、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）プロモーター、ホメオボックスタンパク質９（ＨＢ９）プロモーターおよびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脳特異的プロモーターは、シナプシン１プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター、フォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）プロモーター、α－インターネキシン（ＩＮＡ）プロモーター、ネスチン（ＮＥＳ）プロモーター、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＬ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）プロモーター、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）プロモーターおよびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、視床下部特異的プロモーターは、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）プロモーターであり得る。
好ましい実施形態では、ＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターはシナプシン１プロモーターである。いくつかの実施形態では、シナプシン１プロモーターは、配列番号３９と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーターは、配列番号４０と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、配列番号４１と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、ネスチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、ネスチンプロモーターは、配列番号４２と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターは、ホメオボックスタンパク質９（ＨＢ９）プロモーターである。いくつかの実施形態では、ホメオボックスタンパク質９（ＨＢ９）プロモーターは、配列番号４３と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーターは、配列番号４４と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターは、配列番号４５と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＮＳ特異的プロモーター、脳特異的プロモーターおよび／または視床下部特異的プロモーターは、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部の少なくとも１つの細胞内の上記ヌクレオチド配列の発現を導く。好ましくは、上記プロモーターは、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％に発現を導く。また、ＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、本明細書中で使用される場合、ＣＮＳおよび／または脳の特異的な領域または細胞サブセット内の発現を導くプロモーターを包含する。したがって、本明細書に記載のＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターはまた、海馬、小脳、皮質、視床下部および／または嗅球の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％に発現を導き得る。発現は、「一般情報」と題する項に記載されているように評価され得る。
本明細書中で使用されるプロモーター（特に、プロモーター配列が所与の配列番号と最小の同一性パーセンテージを有すると記載される場合）は、当業者に公知のプロモーターの活性を少なくとも発揮すべきである。好ましくは、所与の配列番号と最小の同一性パーセンテージを有すると記載されるプロモーターは、当業者に公知のアッセイで評価された場合、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列（すなわち、少なくともＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列）の転写を制御すべきである。例えば、そのようなアッセイは、導入遺伝子の発現を測定することを含み得る。発現は、「一般情報」と題する項に記載されているように評価され得る。
本発明の遺伝子構築物中には追加の配列が存在し得る。本明細書中で好適な例示的な追加の配列には、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号３２）、ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（配列番号３３）、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２９）が含まれる。本発明の文脈内では、「ＩＴＲ」は、それぞれＡＡＶのゲノムに由来する１つの５’ＩＴＲおよび１つの３’ＩＴＲを包含することが意図される。好ましいＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し、配列番号３０（５’ＩＴＲ）および配列番号３１（３’ＩＴＲ）によって表される。本発明の文脈内では、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２９）およびＣＭＶプロモーター配列（配列番号２８）を２つの別個の配列として、または単一の配列（配列番号３４）として使用することが包含される。これらの追加の配列の各々は、本発明による遺伝子構築物中に存在し得る。
シグナル配列、核局在化シグナル、発現エンハンサーなどをコードするヌクレオチド配列などの追加のヌクレオチド配列が、ＦＧＦ２１をコードする（１または複数の）ヌクレオチド配列に作動可能に連結されていてもよい。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物であって、ＦＧＦ２１の発現が防止されることが望まれる組織に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列を含まなくてもよい遺伝子構築物が提供される。
発現ベクター
本明細書に記載の遺伝子構築物は、発現ベクターに配置することができる。したがって、別の態様では、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む発現ベクターが提供される。「発現ベクター」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターは、療法に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターは、代謝障害の治療および／または予防に使用するためのものである。好ましい実施形態では、療法は、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部内の、発現ベクターに含まれる遺伝子構築物の発現を含む。いくつかの実施形態では、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。したがって、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球からなる群から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは全部の脳領域内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。好ましい実施形態では、療法は、視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む。いくつかの実施形態では、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の発現とは、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の特異的発現を意味し得る。一実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および／または心臓内の発現を含まない。いくつかの実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および心臓からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは全部の器官内の発現を含まない。ＣＮＳ特異的発現および／または脳特異的発現および／または視床下部特異的発現および／または皮質特異的発現および／または海馬特異的発現および／または小脳特異的発現および／または嗅球特異的発現の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
発現は、「一般情報」と題する項に記載されているように評価され得る。「ＣＮＳ」、「脳」および「視床下部」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターは療法に使用するためのものであり、発現ベクターは、ＣＳＦ（脳脊髄液）内投与（大槽、髄腔内または脳室内送達を介して）、実質内投与または鼻腔内投与によって投与される。好ましい投与はＣＳＦ内投与である。
本明細書中で使用される「ＣＳＦ内投与」、「鼻腔内投与」、「実質内投与」、「大槽内投与」、「髄腔内投与」および「脳室内投与」は、「一般情報」と題する本出願の部分に記載されている。
いくつかの実施形態では、発現ベクターはウイルス発現ベクターである。「ウイルス発現ベクター」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターであり得る。アデノウイルスベクターはアデノウイルス由来ベクターとしても知られており、アデノ随伴ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス由来ベクターとしても知られており、レトロウイルスベクターはレトロウイルス由来ベクターとしても知られており、レンチウイルスベクターはレンチウイルス由来ベクターとしても知られている。好ましいウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。「アデノ随伴ウイルスベクター」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
いくつかの実施形態では、ベクターは、血清型１のＡＡＶ（ＡＡＶ１）、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）、血清型３のＡＡＶ（ＡＡＶ３）、血清型４のＡＡＶ（ＡＡＶ４）、血清型５のＡＡＶ（ＡＡＶ５）、血清型６のＡＡＶ（ＡＡＶ６）、血清型７のＡＡＶ（ＡＡＶ７）、血清型８のＡＡＶ（ＡＡＶ８）、血清型９のＡＡＶ（ＡＡＶ９）、血清型ｒｈ１０のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ８のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ８）、血清型Ｃｂ４のＡＡＶ（ＡＡＶＣｂ４）、血清型ｒｈ７４のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ＤＪのＡＡＶ（ＡＡＶＤＪ）、血清型２／５のＡＡＶ（ＡＡＶ２／５）、血清型２／１のＡＡＶ（ＡＡＶ２／１）、血清型１／２のＡＡＶ（ＡＡＶ１／２）、血清型Ａｎｃ８０のＡＡＶ（ＡＡＶＡｎｃ８０）からなる群から選択されるアデノ随伴ベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス由来ベクター（ＡＡＶ）である。
好ましい実施形態では、ベクターは、血清型１、２または９のＡＡＶ（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２またはＡＡＶ９）である。実施例では、これらのＡＡＶ血清型が、本発明による発現ベクターとして使用するのに適していることが実証されている。
好ましい実施形態では、発現ベクターは、ＡＡＶ１またはＡＡＶ２またはＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ９であり、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む。さらに好ましくは、そのような遺伝子構築物は、配列番号２７と少なくとも６０％を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなるＣＡＧプロモーターを含む。さらに好ましくは、そのような遺伝子構築物は、本明細書に記載されているようにＦＧＦ２１の発現が防止されることが望まれる組織に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含む。
別の好ましい実施形態では、発現ベクターは、ＡＡＶ１であり、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含み、遺伝子構築物は、マイクロＲＮＡの標的配列を含まなくてもよい。一実施形態では、遺伝子構築物は、ＦＧＦ２１の発現が防止されることが望まれる組織に発現されるｍｉＲＮＡの標的配列を含まない。さらに好ましくは、そのような遺伝子構築物は、配列番号２７と少なくとも６０％を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、それからなるＣＡＧプロモーターを含む。
組成物
さらなる態様では、１つ以上の薬学的に許容される成分とともに、上記の遺伝子構築物および／または上記のウイルスベクターを含む組成物が提供される。
そのような組成物は、遺伝子療法組成物と呼ばれ得る。好ましくは、組成物は医薬組成物である。
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される成分」には、薬学的に許容される担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤および／または賦形剤が含まれる。したがって、１つ以上の薬学的に許容される成分は、薬学的に許容される担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤および／または賦形剤からなる群から選択され得る。そのような薬学的に許容される担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤および／または賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）に見出され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、療法に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、代謝障害の治療および／または予防に使用するためのものである。好ましい実施形態では、療法は、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部内の、組成物に含まれる遺伝子構築物の発現を含む。いくつかの実施形態では、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。したがって、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球からなる群から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは全部の脳領域内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。好ましい実施形態では、療法は、視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む。いくつかの実施形態では、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の発現とは、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の特異的発現を意味し得る。一実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および／または心臓内の発現を含まない。いくつかの実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および心臓からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは全部の器官内の発現を含まない。ＣＮＳ特異的発現および／または脳特異的発現および／または視床下部特異的発現および／または皮質特異的発現および／または海馬特異的発現および／または小脳特異的発現および／または嗅球特異的発現の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
発現は、「一般情報」と題する項に記載されているように評価され得る。「ＣＮＳ」、「脳」および「視床下部」の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は療法に使用するためのものであり、組成物は、ＣＳＦ（脳脊髄液）内投与（大槽、髄腔内または脳室内送達を介して）、実質内投与または鼻腔内投与によって投与される。好ましい投与はＣＳＦ内投与である。
本明細書中で使用される「ＣＳＦ内投与」、「鼻腔内投与」、「実質内投与」、「大槽内投与」、「髄腔内投与」および「脳室内投与」は、「一般情報」と題する本出願の部分に記載されている。
追加の化合物が本発明の組成物中に存在してもよい。上記化合物は、組成物の送達に役立ち得る。これに関連して好適な化合物は、本明細書に記載の各成分を送達し、細胞膜を介して小胞またはリポソームに複合体化または捕捉された複合体、ナノ粒子、ミセルおよび／またはリポソームを形成することができる化合物である。これらの化合物の多くは当技術分野で公知である。好適な化合物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む同様のカチオン性ポリマー；合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ－１８）；リポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰを含む。当業者であれば、いずれのタイプの製剤が本明細書に記載の組成物に最も適しているかを知っているであろう。
方法および使用
さらなる態様では、療法に使用するための、本明細書に記載の遺伝子構築物であって、療法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む遺伝子構築物が提供される。
療法に使用するための、本明細書に記載の発現ベクターであって、療法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の、発現ベクターに含まれる遺伝子構築物の発現を含む発現ベクターがさらに提供される。
療法に使用するための、本明細書に記載の医薬組成物であって、療法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の、医薬組成物に含まれる遺伝子構築物の発現を含む医薬組成物がさらに提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子構築物および／または本明細書に記載の発現ベクターおよび／または本明細書に記載の医薬組成物は、代謝障害、好ましくは肥満および／または糖尿病の治療および／または予防に使用するためのものであり、療法は、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む。
さらなる態様では、本明細書に記載の遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物を投与することを含む治療方法であって、該方法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の、本明細書に記載の遺伝子構築物の発現を含む治療方法が提供される。
いくつかの実施形態では、遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物を投与することは、それを必要とする対象に治療有効量の遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物を投与することを意味する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物を投与することを含む治療方法であって、該方法が、代謝障害を治療および／または予防するためのものであり、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の、本明細書に記載の遺伝子構築物の発現を含む治療方法が提供される。
さらなる態様では、医薬品の製造のための、本明細書に記載の遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物の使用であって、上記医薬品が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の、本明細書に記載の遺伝子構築物の発現を含む使用が提供される。
いくつかの実施形態では、医薬品の製造のための、本明細書に記載の遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物の使用であって、上記医薬品が、代謝障害の治療および／または予防のためのものであり、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の、本明細書に記載の遺伝子構築物の発現を含む使用が提供される。
さらなる態様では、医学的治療のための、本明細書に記載の遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物の使用であって、上記医学的治療が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の、本明細書に記載の遺伝子構築物の発現を含む使用が提供される。
いくつかの実施形態では、医学的治療のための、本明細書に記載の遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物の使用であって、上記医学的治療が、代謝障害の治療および／または予防のためのものであり、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の、本明細書に記載の遺伝子構築物の発現を含む使用が提供される。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、「遺伝子構築物の発現を含む」は、「遺伝子構築物の発現を引き起こす」または「遺伝子構築物の発現を誘導する」に置き換えられ得る。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、療法および／または治療および／または医薬品は、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を含み得る。いくつかの実施形態では、脳内の遺伝子構築物の発現は、視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、好ましくは視床下部内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。したがって、脳内の遺伝子構築物の発現とは、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球からなる群から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは全部の脳領域内の遺伝子構築物の発現を意味し得る。好ましい実施形態では、療法は、視床下部内の遺伝子構築物の発現を含む。いくつかの実施形態では、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の発現とは、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内の特異的発現を意味し得る。一実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および／または心臓内の発現を含まない。いくつかの実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および心臓からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは全部の器官内の発現を含まない。ＣＮＳ特異的発現および／または脳特異的発現および／または視床下部特異的発現および／または皮質特異的発現および／または海馬特異的発現および／または小脳特異的発現および／または嗅球特異的発現の説明は、「一般情報」と題する項に提供されている。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、ＣＳＦ（脳脊髄液）内投与によって（大槽、髄腔内または脳室内送達を介して）投与され得る。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、実質内投与によって投与され得る。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、鼻腔内投与によって投与され得る。
本明細書中で使用される「ＣＳＦ内投与」、「鼻腔内投与」、「実質内投与」、「大槽内投与」、「髄腔内投与」および「脳室内投与」は、「一般情報」と題する本出願の部分に記載されている。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、療法および／または治療および／または医薬品は、代謝障害、好ましくは肥満および／または糖尿病の治療および／または予防に使用するためのものであり得る。代謝障害の合併症も包含され得る。
代謝障害には、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、肥満関連併存症、糖尿病関連併存症、高血糖症、インスリン抵抗性、耐糖能障害、脂肪肝、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、内分泌疾患、オステオサルコペニア性肥満症候群（ＯＳＯ）、糖尿病性腎症、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、心肥大、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパシー、関節炎、敗血症、眼血管新生、神経変性、認知症が含まれ得、鬱病、腺腫、癌腫も含まれ得る。
糖尿病には、糖尿病前症、高血糖症、１型糖尿病、２型糖尿病、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、単一遺伝子糖尿病、新生児糖尿病、妊娠糖尿病、不安定型糖尿病、特発性糖尿病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、薬物または化学物質誘導性糖尿病、スティフマン症候群、脂肪萎縮性糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）が含まれ得る。
肥満には、過体重、中心性／上半身肥満、末梢／下半身肥満、病的肥満、オステオサルコペニア性肥満症候群（ＯＳＯ）、小児肥満、メンデル型（単一遺伝子）症候性肥満（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ（ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ）ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｏｂｅｓｉｔｙ）、メンデル型非症候性肥満（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｎｏｎ－ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｏｂｅｓｉｔｙ）、ポリジーン肥満（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｏｂｅｓｉｔｙ）が含まれ得る。
好ましい代謝障害は、肥満および／または糖尿病である。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の治療もしくは療法、または医薬品の使用もしくは投与は繰り返される必要はない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療もしくは療法、または医薬品の使用もしくは投与は、列挙された値、年のうちの任意の２つの間の間隔を含め、毎年または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年ごとに繰り返され得る。
治療される対象は、高等哺乳動物、例えば、ネコ、齧歯類、（好ましくはマウス、ラット、アレチネズミおよびモルモット、さらに好ましくはマウスおよびラット）、イヌまたはヒトであり得る。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、本明細書に記載の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、好ましくは抗糖尿病作用および／または抗肥満作用を示す。
血中のブドウ糖処理が増加した場合、および／または耐糖能が改善した場合、および／またはインスリン感受性が増加した場合、抗糖尿病作用が達成され得る。これは、例えば、実験部分で行われるように、糖血症、インスリン血症の測定、および／またはインスリン負荷試験および／またはブドウ糖負荷試験の成績など、当業者に公知の技術を使用して評価することができる。これに関連して、「増加」（または「改善」）は、当業者に公知のアッセイを使用して、少なくとも検出可能な増加（または検出可能な改善）を意味する。増加は、糖血症、インスリン血症の測定、および／またはインスリン負荷試験および／もしくはブドウ糖負荷試験の成績などのアッセイを使用して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の増加であり得る。
体重、体重増加および／または体脂肪率が低下した場合、抗肥満作用が達成され得る。肥満度指数（ＢＭＩ）、胴囲、ウエスト・ヒップ比（ＷＨＲ）および／またはウエスト・身長比（ＷＨｔＲ）が減少した場合も、抗肥満作用が達成され得る。肝臓などの組織の重量が減少した場合も、抗肥満作用が達成され得る。これは、例えば、実験部分で行われるように、当業者に公知の技術を使用して評価することができる。これに関連して、「減少」（または「改善」）は、当業者に公知のアッセイ、例えば、実験部分で行われるアッセイを使用して、少なくとも検出可能な減少（または検出可能な改善）を意味する。抗肥満作用には、肥満の予防および肥満の回復の両方が含まれる。
典型的な症状（例えば、膵島炎、β細胞喪失、β細胞量減少、体重増加）の進行が医師によって評価されるように遅延した場合も、抗糖尿病作用および／または抗肥満作用が観察され得る。典型的な症状の減少とは、症状発現の進行の遅延、または症状の完全な消失を意味し得る。症状、ひいては症状の減少もまた、様々な方法を使用して、臨床検査および常用的実験室試験を含め、糖尿病および／または肥満の診断に使用されるのとほぼ同じ方法を使用して評価することができる。そのような方法には、巨視的方法および顕微鏡的方法の両方、ならびに分子的方法、Ｘ線などの放射線学的方法、生化学的方法、免疫組織化学的方法などが含まれる。β細胞喪失および／またはβ細胞量減少は、好ましくは実験部分で行われるように、免疫組織化学的方法を使用して評価され得る。
抗糖尿病作用および／または抗肥満作用はまた、全身性炎症の減少（Ｆ４／８０、ＩＬ－６、ＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの減少）が評価された場合にも観察され得る。これに関連して、「減少」は、当業者に公知のアッセイを使用して少なくとも検出可能な減少を意味する。減少は、当業者に公知の技術、好ましくは実験部分で使用される技術（すなわち、ＲＴＰＣＲ）を使用したＦ４／８０、ＩＬ－６および／またはＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインの測定などのアッセイを使用した、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の減少であり得る。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、本明細書に記載の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、好ましくは、個体、上記個体の細胞、組織または器官における糖尿病および／または肥満などの代謝障害の１つ以上の（１または複数の）症状を緩和するか、上記個体の細胞、組織または器官の１つ以上の（１または複数の）特徴または（１または複数の）症状を緩和する。
本明細書に記載の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、好ましくは、本明細書に記載されているように、本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物を使用した治療の少なくとも１週間、１カ月、６カ月、１年またはそれ以上後に、上記症状または特徴が減少した（例えば、もはや検出可能でないか、遅延している）場合、患者または上記患者の細胞、組織もしくは器官の症状または特徴を緩和することができる。
本明細書に記載の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、糖尿病および／または肥満などの代謝障害に罹患しているか、それを発症するリスクがある個体のインビボでの細胞、組織および／または器官への投与に適している場合があり、インビボ、エクスビボまたはインビトロで投与され得る。上記遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、糖尿病および／または肥満などの代謝障害に罹患しているか、それを発症するリスクがある個体のインビボで細胞、組織および／または器官に直接または間接的に投与され得、インビボ、エクスビボまたはインビトロで直接または間接的に投与され得る。
投与様式は、静脈内、筋肉内、髄腔内、脳室内、腹腔内、吸入による、鼻腔内、眼内および／または実質内投与であり得る。好ましい投与様式は、鼻腔内、実質内およびＣＳＦ内（大槽、髄腔内または脳室内送達を介して）投与である。ＣＳＦ内投与が最も好ましい。
本発明のウイルス発現構築物および／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、当技術分野で公知の好適な手段を使用して直接または間接的に投与され得る。これまでに達成された進歩を考慮して、本発明のウイルス発現構築物および／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物を個体または上記個体の細胞、組織、器官に提供するための手段の改善が予測される。当然ながら、そのような今後の改善が、本発明の上述の作用を達成するために組み込まれてもよい。ウイルス発現構築物および／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、個体、上記個体の細胞、組織または器官にそのまま送達することができる。疾患または状態に応じて、上記個体の細胞、組織または器官は、本明細書中で前述した通りであり得る。本発明のウイルス発現構築物および／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物を投与する場合、そのようなウイルス発現構築物および／またはベクターおよび／または核酸および／または組成物は、送達方法に適合する溶液に溶解されることが好ましい。
本明細書に包含されるように、上記のウイルス発現構築物、ベクター、核酸分子および／または組成物の治療有効用量が、好ましくは単一の固有の用量で投与され、ひいては反復周期的投与を回避する。
一般情報
特に明記しない限り、本明細書中で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって習慣的におよび通常理解されるのと同じ意味を有し、本開示を考慮して読まれる。
配列同一性／類似性
本発明の文脈では、ＦＧＦ２１をコードする核酸分子などの核酸分子は、タンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドをコードする核酸またはヌクレオチド配列によって表される。本発明の文脈では、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）としてのＦＧＦ２１タンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドは、アミノ酸配列によって表される。
所与の配列同一性番号（配列番号）によって本明細書中で同定される各核酸分子またはタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドまたは構築物は、開示されるこの特定の配列に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で同定される各コード配列は、所与のタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドまたは構築物をコードするか、それ自体がタンパク質断片またはポリペプチドまたは構築物またはペプチドまたは誘導ペプチドである。本出願を通して、所与のタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列配列番号（例えば、配列番号Ｘをとる）を指すたびに、それを以下によって置き換えてもよい：
ｉ．配列番号Ｘと少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉ．遺伝暗号の縮重に起因して配列が（ｉ）の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列；または、
ｉｉｉ．ヌクレオチド配列配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
本出願を通して、特定のアミノ酸配列配列番号（例えば、配列番号Ｙをとる）を指すたびに、それを以下によって置き換えてもよい：アミノ酸配列配列番号Ｙと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
それぞれ所与のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列とのその同一性または類似性パーセンテージ（少なくとも６０％）に基づいて本明細書に記載される各ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、さらなる好ましい実施形態では、それぞれ所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性または類似性を有する。
各非コードヌクレオチド配列（すなわち、プロモーターの、または別の調節領域の）は、特定のヌクレオチド配列配列番号（例えば、配列番号Ａをとる）と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置換することができる。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号Ａと少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。好ましい実施形態では、プロモーターなどのそのような非コードヌクレオチド配列は、そのような非コードヌクレオチド配列の活性、例えば、当業者に公知のプロモーターの活性を少なくとも示すか発揮する。
用語「相同性」、「配列同一性」、「同一性」などは、本明細書では区別なく使用される。配列同一性は、本明細書では、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として記載される。２つのアミノ酸配列間の「類似性」または「配列類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換と第２のポリペプチドの配列とを比較することによって決定される。「同一性」および「類似性」は、限定するものではないが、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ：Ｍｏｄｅｒｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ，Ｘｉａ Ｘ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１８；およびＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍｏｕｎｔ Ｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００４に記載されているものを含む公知の方法によって容易に計算することができる。
配列同一性または類似性は、２つの所与の配列番号の全長またはその一部に基づいて計算することができる。いくつかの実施形態では、その一部とは、両配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を意味する。好ましい実施形態では、配列同一性または類似性は、本明細書中で同定される配列の全長を比較することによって決定される。本明細書中で別段の指定がない限り、所与の配列番号との同一性または類似性とは、上記配列の全長（すなわち、その長さ全体にわたって、または全体として）に基づく同一性または類似性を意味する。当技術分野では、「同一性」はまた、そのような配列のストリング間の一致によって決定され得る場合のように、アミノ酸または核酸配列間の配列関連性の程度を指す。
配列同一性または類似性は、２つの配列の長さに応じて、グローバルまたはローカルアライメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチドまたは２つのヌクレオチド配列のアライメントによって決定することができる。類似した長さの配列は、好ましくは、配列を長さ全体にわたって最適にアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）を使用してアライメントされるのに対して、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用してアライメントされる。次いで、配列は、それらが（例えば、デフォルトパラメーターを使用してプログラムＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅまたはＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒによって最適にアライメントされた場合に）少なくとも特定の最小パーセンテージの配列同一性または類似性を共有する場合（後述されるように）、「実質的に同一の」または「本質的に類似した」と称され得る。
２つの配列が類似した長さを有する場合、配列同一性または類似性を決定するために、グローバルアライメントが好適に使用される。配列が実質的に異なる全長を有する場合、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するものなどのローカルアライメントが好ましい。ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をそれらの長さ全体（全長）にわたってアライメントし、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。ＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒは、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎローカルアライメントアルゴリズムを使用する。一般に、ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒデフォルトパラメーターが使用され、ギャップオープンペナルティ＝１０（ヌクレオチド配列）／１０（タンパク質）およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチド配列）／０．５（タンパク質）である。ヌクレオチド配列では、使用されるデフォルトのスコアリング行列はＤＮＡｆｕｌｌであり、タンパク質では、デフォルトのスコアリング行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９１５－９１９）。
あるいは、類似性または同一性のパーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公開データベースに対して検索することによって決定され得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態の核酸およびタンパク質配列は、公開データベースに対して検索を行って、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するための「クエリ配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。比較目的のためにギャップのあるアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＢＬＡＳＴｘおよびＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のワールドワイドウェブ上でアクセス可能な国立バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照されたい。
アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者であれば、いわゆる保存的アミノ酸置換も考慮に入れていてもよい。
本明細書中で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。保存的置換のためのアミノ酸残基のクラスの例を以下の表に示す。
Figure 2022513127000001
Figure 2022513127000002
Figure 2022513127000003
例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリンおよびアスパラギン－グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示される配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれに対する好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕまたはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅ；およびＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕ。
遺伝子またはコード配列
用語「遺伝子」は、細胞内でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写され、好適な調節領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結されている領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、通常、いくつかの作動可能に連結されている断片、例えば、ポリアデニル化終結部位および／または転写終結部位を含む、例えば、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域および３’非翻訳配列（３’末端）を含む。キメラ遺伝子または組換え遺伝子（ＦＧＦ２１遺伝子など）は、例えば、プロモーターが、転写されたＤＮＡ領域の一部または全部と自然界では関連していない遺伝子など、自然界では通常見られない遺伝子である。「遺伝子の発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ領域が、生物学的に活性な、すなわち、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドに翻訳され得るＲＮＡに転写されるプロセスを指す。
「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞に新たに導入された遺伝子またはコード配列または核酸分子（すなわち、ＦＧＦ２１をコードする分子）、すなわち、存在し得るが、通常は細胞内で発現されないか不十分なレベルで発現され得る遺伝子として記載されている。これに関連して、「不十分」は、上記ＦＧＦ２１が細胞内で発現されるが、本明細書に記載の状態および／または疾患が依然として発症し得ることを意味する。この場合、本発明は、ＦＧＦ２１の過剰発現を可能にする。導入遺伝子は、細胞に天然の配列、細胞内に天然に存在しない配列を含み得、両方の組合せを含み得る。導入遺伝子は、細胞内で、ＦＧＦ２１をコードする配列を発現させるための適切な調節配列に作動可能に連結されていてもよい、本明細書中で先に同定されたＦＧＦ２１および／または追加のタンパク質をコードする配列を含み得る。好ましくは、導入遺伝子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれない。
プロモーター
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」または「転写調節配列」は、１つ以上のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、限定するものではないが、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写量を直接または間接的に調節するように作用するための当業者に公知の任意の他のヌクレオチドの配列を含む、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位および任意の他のＤＮＡ配列に対する結合部位の存在によって構造的に同定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的および発生的条件下で、ほとんどの組織内で活性なプロモーターである。「誘導可能」プロモーターは、例えば、化学的誘導因子の適用によって生理学的または発生的に調節されるプロモーターである。
「ユビキタスプロモーター」は、生物の実質的にあらゆる組織、器官および細胞内で活性である。
「器官特異的」または「組織特異的」プロモーターは、それぞれ特異的なタイプの器官または組織内で活性なプロモーターである。器官特異的プロモーターおよび組織特異的プロモーターは、主に１つの器官または組織内で１つ以上の遺伝子（またはコード配列）の発現を調節するが、他の器官または組織内でも検出可能なレベル（「漏出」）の発現を可能にすることができる。他の器官または組織内の漏出発現とは、当業者に公知の標準的なアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ）によってｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで評価した場合に、器官特異的発現または組織特異的発現と比較して、少なくとも１分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１または少なくとも５分の１であるが依然として検出可能な発現を意味する。漏出発現が検出され得る器官または組織の最大数は、５、６、７または８である。
「ＣＮＳ特異的プロモーターまたは脳特異的プロモーターまたは視床下部特異的プロモーター」は、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部内で転写を開始することができるが、他の（最大５、６、７または８の）器官、および身体の一部での何らかの漏出発現を依然として可能にするプロモーターである。ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部内の転写は、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球などの関連領域、ならびにニューロンおよび／またはグリア細胞などの細胞内で検出することができる。
本発明の文脈では、ＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターおよび／または視床下部特異的プロモーターおよび／または皮質特異的プロモーターおよび／または海馬特異的プロモーターおよび／または小脳特異的プロモーターおよび／または嗅球特異的プロモーターは、他の器官または組織と比較して、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内でＦＧＦ２１の優先的または優勢な（少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも３０％高い、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも１５０％高い、少なくとも２００％高い、またはそれ以上）発現を促進することができるプロモーターであり得る。他の器官または組織は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃、精巣などであり得る。好ましくは、他の器官は肝臓および心臓である。発現は、「一般情報」と題する項の他の箇所に記載されているように評価され得る。
本出願を通して、ＣＮＳ特異的および／または脳特異的および／または視床下部特異的および／または皮質特異的および／または海馬特異的および／または小脳特異的および／または嗅球特異的が発現の文脈で言及される場合、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球を構成する（１または複数の）細胞型の細胞型特異的発現もそれぞれ想定される。
作動可能に連結されている
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結されている」は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的関係にある場合、「作動可能に連結されている」。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。連結は、好都合な制限部位もしくはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションによって、または遺伝子合成によって達成することができる。
マイクロＲＮＡ
本明細書中で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」は、本開示を考慮して当業者によって理解されるその慣習的かつ通常の意味を有する。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡサイレンシング、および遺伝子発現の転写後調節において機能し得る、植物、動物およびいくつかのウイルスに見られる小さな非コードＲＮＡ分子である。マイクロＲＮＡの標的配列は、「ｍｉＲＴ」と表示され得る。例えば、マイクロＲＮＡ－１またはｍｉＲＮＡ－１またはｍｉＲ－１の標的配列は、ｍｉＲＴ－１と表示され得る。
タンパク質およびアミノ酸
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」または「アミノ酸配列」は、区別なく使用され、特定の作用機序、サイズ、三次元構造または起源を参照せずに、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。本明細書に記載のアミノ酸配列では、アミノ酸または「残基」は３文字記号によって表示される。これらの３文字記号および対応する１文字記号は、当業者に周知であり、以下の意味を有する：Ａ（Ａｌａ）はアラニン、Ｃ（Ｃｙｓ）はシステイン、Ｄ（Ａｓｐ）はアスパラギン酸、Ｅ（Ｇｌｕ）はグルタミン酸、Ｆ（Ｐｈｅ）はフェニルアラニン、Ｇ（Ｇｌｙ）はグリシン、Ｈ（Ｈｉｓ）はヒスチジン、Ｉ（Ｉｌｅ）はイソロイシン、Ｋ（Ｌｙｓ）はリジン、Ｌ（Ｌｅｕ）はロイシン、Ｍ（Ｍｅｔ）はメチオニン、Ｎ（Ａｓｎ）はアスパラギン、Ｐ（Ｐｒｏ）はプロリン、Ｑ（Ｇｌｎ）はグルタミン、Ｒ（Ａｒｇ）はアルギニン、Ｓ（Ｓｅｒ）はセリン、Ｔ（Ｔｈｒ）はトレオニン、Ｖ（Ｖａｌ）はバリン、Ｗ（Ｔｒｐ）はトリプトファン、Ｙ（Ｔｙｒ）はチロシンである。残基は、任意のタンパク質原性アミノ酸であり得るが、任意の非タンパク質原性アミノ酸、例えば、Ｄ－アミノ酸、および翻訳後修飾によって形成された修飾アミノ酸、ならびに任意の非天然アミノ酸でもあり得る。
ＣＮＳおよび脳
本明細書中で使用される場合、「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、脳および脊髄を含み、そこに知覚インパルスが伝達され、運動インパルスがそこから出て、これにより、神経系全体の活動を調整する神経系の部分を指す。
本明細書中で使用される場合、「脳」は、神経系の中枢器官を指し、大脳、脳幹および小脳からなる。脳は、身体の活動の大部分を制御し、感覚器官から受け取った情報を処理、統合および調整し、身体の残りの部分に送られる命令に関する決定を行う。
特に、本明細書中で使用される場合、「視床下部」は、自律神経系と脳下垂体の活動とを調整し、体温、口渇、空腹および他の恒常性系を制御し、睡眠および情動活動に関与する視床下部の前脳の領域を指す。
遺伝子構築物
本明細書に記載の遺伝子構築物は、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）およびＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１、上記）に記載されているような、上記ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列が、好適な細胞、例えば、培養細胞、または多細胞生物の細胞に発現される、当業者に公知の任意のクローニングおよび／または組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４８８（部位特異的変異誘発を記載）およびＲｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１－７３４またはＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４：３１５（カセット変異誘発を記載）も参照されたい。
発現ベクター
「発現ベクター」または「ベクター」という語句は、一般に、そのような配列と適合する宿主において遺伝子またはコード配列の発現を行うことができるヌクレオチド配列を指す。発現ベクターは、細胞内で安定化し、エピソームのままであり得るゲノムを保有する。本発明の文脈内では、細胞とは、構築物を作製するために使用される細胞、または構築物が投与される細胞を包含することを意味し得る。あるいは、ベクターは、例えば、相同組換えなどによって細胞のゲノムに組み込むことができる。
これらの発現ベクターは、典型的には少なくとも好適なプロモーター配列を含み、転写終結シグナルを含んでいてもよい。発現を行うのに必要または有用な追加の因子も、本明細書に記載されているように使用することができる。ＦＧＦ２１をコードする核酸またはＤＮＡまたはヌクレオチド配列は、インビトロ細胞培養物への導入およびインビトロ細胞培養物での発現が可能なＤＮＡ構築物に組み込まれる。具体的には、ＤＮＡ構築物は、原核生物宿主、例えば、細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製に適しているか、培養された哺乳動物、植物、昆虫、（例えば、Ｓｆ９）、酵母、真菌または他の真核細胞株に導入することができる。
特定の宿主への導入のために調製されたＤＮＡ構築物は、宿主によって認識される複製系、所望のポリペプチドをコードする意図されたＤＮＡセグメント、ならびにポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結されている転写および翻訳開始および終結調節配列を含み得る。用語「作動可能に連結されている」は、本明細書に既に記載されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写を刺激する場合、コード配列に作動可能に連結されている。シグナル配列のためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されているＤＮＡ配列は連続しており、シグナル配列の場合、連続しており、リーディングフレーム内にある。ただし、エンハンサーは、それらが転写を制御するコード配列と連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位もしくはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションによって、または遺伝子合成によって達成される。
適切なプロモーター配列の選択は、一般に、ＤＮＡセグメントの発現のために選択される宿主細胞に依存する。好適なプロモーター配列の例には、当技術分野で周知の原核生物プロモーターおよび真核生物プロモーターが挙げられる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１を参照）。転写調節配列は、典型的には、宿主によって認識される異種エンハンサーまたはプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は宿主に依存するが、ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターならびに解糖酵素プロモーターなどのプロモーターは公知であり、入手可能である（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１を参照）。発現ベクターは、ポリペプチドをコードするセグメントの挿入部位とともに、複製系ならびに転写および翻訳調節配列を含む。ほとんどの場合、複製系は、ベクターを作製するために使用される細胞内でのみ機能的である（大腸菌としての細菌細胞）。ほとんどのプラスミドおよびベクターは、ベクターに感染した細胞では複製しない。細胞株と発現ベクターとの作業可能な組合せの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１、上記）およびＭｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３１－３６に記載されている。例えば、好適な発現ベクターは、酵母、例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、例えば昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞および細菌細胞、例えば大腸菌内で発現させることができる。したがって、細胞は、原核生物または真核生物の宿主細胞であり得る。細胞は、液体中または固体培地上での培養に適した細胞であり得る。
あるいは、宿主細胞は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック動物などの多細胞生物の一部である細胞である。
適切なプロモーター配列の選択は、一般に、ＤＮＡセグメントの発現のために選択される宿主細胞に依存する。好適なプロモーター配列の例には、当技術分野で周知の原核生物プロモーターおよび真核生物プロモーターが挙げられる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１を参照）。転写調節配列は、典型的には、宿主によって認識される異種エンハンサーまたはプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は宿主に依存するが、ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターならびに解糖酵素プロモーターなどのプロモーターは公知であり、入手可能である（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１を参照）。発現ベクターは、ポリペプチドをコードするセグメントの挿入部位とともに、複製系ならびに転写および翻訳調節配列を含む。ほとんどの場合、複製系は、ベクターを作製するために使用される細胞内でのみ機能的である（大腸菌としての細菌細胞）。ほとんどのプラスミドおよびベクターは、ベクターに感染した細胞では複製しない。細胞株と発現ベクターとの作業可能な組合せの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１、上記）およびＭｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３１－３６に記載されている。例えば、好適な発現ベクターは、酵母、例えば出芽酵母、例えば昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞および細菌細胞、例えば大腸菌内で発現させることができる。したがって、細胞は、原核生物または真核生物の宿主細胞であり得る。細胞は、液体中または固体培地上での培養に適した細胞であり得る。
あるいは、宿主細胞は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック動物などの多細胞生物の一部である細胞である。
ウイルスベクター
ウイルスベクターまたはウイルス発現ベクターウイルス遺伝子療法ベクターは、本明細書に記載の遺伝子構築物を含むベクターである。
ウイルスベクターまたはウイルス遺伝子療法ベクターは、遺伝子療法に適したベクターである。遺伝子療法に適したベクターは、Ａｎｄｅｒｓｏｎ １９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５－３０；Ｗａｌｔｈｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ，２０００，Ｄｒｕｇｓ ６０：２４９－７１；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：３３－４０；Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３－６０４；Ａｍａｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：６７４－６；Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４４８－５３；Ｖｉｇｎａ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２：３０８－１６；Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ３：３９６－４０３；Ｐｅｎｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４５４－７；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ，１９９９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：３０４９－６４；Ｒｅｉｓｅｒ，２０００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：９１０－３；およびそこに引用されている参考文献に記載されている。
特に好適な遺伝子療法ベクターには、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる。これらのベクターは、滑膜細胞および肝細胞を含む多数の分裂細胞型および非分裂細胞型に感染する。細胞侵入後のアデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターのエピソーム性により、これらのベクターは、上記のように（Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３－２６０４；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，２００５，Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２（１）：４３）、治療用途に適したものになる。ＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現の非常に安定な長期発現をもたらすことが知られているため（イヌでは最大９年（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００９ Ｊａｎ ２２；１１３（４）：７９７－８０６）、ヒトでは約１０年（Ｂｕｃｈｌｉｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２ Ｍａｒ ２９；１１９（１３）：３０３８－４１）、さらになお好ましい。好ましいアデノウイルスベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００、上記）によって概説されているように、宿主応答を低下させるように修飾される。ＡＡＶベクターを使用する遺伝子療法のための方法は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．Ｍａｒｃｈ ９（Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）、Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．６（５）：４８２－９０、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｙｅ １８（１１）：１０４９－５５、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１ Ｄｅｃ ２２；３６５（２５）：２３５７－６５、Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５ Ａｐｒ；１６（４）：４２６－３４によって記載されている。
別の好適な遺伝子療法ベクターには、レトロウイルスベクターが含まれる。本発明では、適用のための好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスに基づく発現構築物である。レンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞のゲノムに感染し、安定に組み込まれる能力を有する（Ａｍａｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：６７４－６）。レンチウイルスに基づく発現構築物の構築および使用のための方法は、米国特許第６，１６５，７８２号、米国特許第６，２０７，４５５号、米国特許第６，２１８，１８１号、米国特許第６，２７７，６３３号および米国特許第６，３２３，０３１号ならびにＦｅｄｅｒｉｃｏ（１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０：４４８－５３）およびＶｉｇｎａ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２０００；２：３０８－１６）に記載されている。
他の好適な遺伝子療法ベクターには、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターが含まれる。
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）
本明細書中で同義語として使用される用語「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」および「ＡＡＶ粒子」は、ＡＡＶの少なくとも１つのキャプシドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型のあらゆるキャプシドタンパク質から構成される）と、ＡＡＶゲノムのカプセル化ポリヌクレオチドとから構成されるウイルス粒子を指す。粒子がＡＡＶ逆位末端反復配列に隣接する異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノムとは異なるポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子）を含む場合、それらは、典型的には「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」として知られている。ＡＡＶとは、パルボウイルス科のディペンドウイルス属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは、長さが約４．７Ｋｂであり、陽性または陰性で検出され得る一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。本発明はまた、ｄｓＡＡＶまたはｓｃＡＡＶとも呼ばれる二本鎖ＡＡＶの使用も包含する。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端にある逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐとを含む。フレームｒｅｐは、ＡＡＶ生活環に必要なタンパク質Ｒｅｐをコードする４つの重複遺伝子から構成される。フレームキャップは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と重複するヌクレオチド配列を含み、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、相互作用して正二十面体対称のキャプシドを形成する（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ．，２０００、およびＧａｏ ｅｔ ａｌ，２００４を参照）。
好ましいウイルスベクターまたは好ましい遺伝子療法ベクターはＡＡＶベクターである。本明細書中で使用されるＡＡＶベクターは、好ましくは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）を含む。本明細書中で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書中で説明されるＡＡＶ血清型に由来するキャプシドタンパク質のタンパク質シェルにキャプシド化されたＡＡＶゲノムの一部を含む組換えベクターを指す。ＡＡＶゲノムの一部は、アデノ随伴ウイルス血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５などに由来する逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含み得る。好ましいＩＴＲは、配列番号３０（５’ＩＴＲ）および配列番号３１（３’ＩＴＲ）を含むか、それらから本質的になるか、それらからなる配列によって表されるＡＡＶ２のＩＴＲである。本発明はまた、好ましくは、５’ＩＴＲとして配列番号３０と少なくとも８０％（または少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％）の同一性を有する配列、および３’ＩＴＲとして配列番号３１と少なくとも８０％（または少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％）の同一性を有する配列の使用を包含する。
キャプシドタンパク質から構成されるタンパク質シェルは、任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。タンパク質シェルは、キャプシドタンパク質シェルとも呼ばれ得る。ｒＡＡＶベクターは、１つまたは好ましくはあらゆる野生型ＡＡＶ遺伝子が欠失していてもよいが、依然として機能的ＩＴＲ核酸配列を含み得る。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、救済およびパッケージ化に必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であり得るか、野生型配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有し得るか、それらが機能的なままである限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、変異、欠失または置換によって変化し得る。これに関連して、機能性とは、ゲノムをキャプシドシェルに直接パッケージ化し、次いで、感染細胞または標的細胞が宿主細胞に発現するのを可能にする能力を指す。本発明の文脈では、キャプシドタンパク質シェルは、ｒＡＡＶベクターゲノムＩＴＲとは異なる血清型のものであり得る。
選択される核酸配列によって表される核酸分子は、好ましくは、上記で同定されたｒＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列、例えば、コード配列および３’終結配列に作動可能に連結されている発現調節エレメントを含む発現構築物の間に挿入される。上記核酸分子は、導入遺伝子とも呼ばれ得る。
「ＡＡＶヘルパー機能」は、一般に、トランスでｒＡＡＶベクターに供給されるｒＡＡＶの複製およびパッケージ化に必要な対応するＡＡＶ機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ｒＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶ機能を補完するが、ＡＡＶ ＩＴＲ（ｒＡＡＶベクターゲノムによって提供される）を欠く。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域、またはそれらの機能的に実質的に同一の配列を含む。ＲｅｐおよびＣａｐ領域は当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ７３（２）：１３０９－１３１９）または米国特許第５，１３９，９４１号を参照されたい。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー構築物に供給することができる。宿主細胞へのヘルパー構築物の導入は、例えば、本明細書中で同定されるｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムの導入前または導入と同時に、形質転換、トランスフェクションまたは形質導入によって起こり得る。したがって、本発明のＡＡＶヘルパー構築物は、一方ではｒＡＡＶベクターのキャプシドタンパク質シェルについて、他方では上記ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージ化に存在するｒＡＡＶゲノムについて、血清型の所望の組合せをもたらすように選択され得る。
「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶの複製およびパッケージ化に必要な追加の機能を提供する。好適なＡＡＶヘルパーウイルスには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型および２型など）およびワクシニアウイルスが含まれる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３１，４５６号に記載されているように、プラスミドを介して、ヘルパーウイルスによって提供される追加の機能を宿主細胞に導入することもできる。
「形質導入」は、ウイルスベクターによるレシピエント宿主細胞へのＦＧＦ２１の送達を指す。例えば、本発明のｒＡＡＶベクターによる標的細胞の形質導入は、そのベクターに含まれるｒＡＡＶゲノムを形質導入細胞に移入する。「宿主細胞」または「標的細胞」は、対象の筋細胞など、ＤＮＡ送達が行われる細胞を指す。ＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入することができる。
ＡＡＶベクターの作製
導入遺伝子をベクター化するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の作製は、以前に記載されている。Ａｙｕｓｏ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；１０：４２３－４３６、Ｏｋａｄａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；２０：１０１３－１０２１、Ｚｈａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；２０：９２２－９２９、およびＶｉｒａｇ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；２０：８０７－８１７を参照されたい。これらのプロトコルは、本発明のＡＡＶを生成するために使用または適合させることができる。一実施形態では、産生細胞株は、本発明のポリヌクレオチド（ＩＴＲに隣接する発現カセットを含む）により、ならびにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードし、ヘルパー機能を提供する（１または複数の）構築物により一過性にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株は、ヘルパー機能を安定に供給し、本発明のポリヌクレオチド（ＩＴＲに隣接する発現カセットを含む）により、ならびにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする（１または複数の）構築物により一過性にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質ならびにヘルパー機能を安定に供給し、本発明のポリヌクレオチドにより一過性にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を安定に供給し、本発明のポリヌクレオチド、およびヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドにより一過性にトランスフェクトされる。さらに別の実施形態では、細胞株は、本発明のポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質ならびにヘルパー機能を安定に供給する。これらおよび他のＡＡＶ作製系を作製および使用する方法は、当技術分野に記載されている。Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，１３９，９４１号、Ｚｈｏｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，７４１，６８３号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，０５７，１５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，２０４，０５９号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，２６８，２１３号、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，４９１，９０７号、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，６６０，５１４号、Ｓｈｅｎｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，９５１，７５３号、Ｓｎｙｄｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，０９４，６０４号、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，１７２，８９３号、Ｍｏｎａｈａｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，２０１，８９８号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，２２９，８２３号、およびＦｅｒｒａｒｉ Ｆ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，４３９，０６５号を参照されたい。
ｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ血清型の１つ（好ましくは本明細書中で先に開示された血清型ＡＡＶ２のもの）の逆位末端反復配列領域（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一のヌクレオチド配列もしくはそれと少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、および２つのＩＴＲの間に挿入された（好適な調節エレメントの制御下で）ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む。ベクターゲノムは、ｒＡＡＶキャプシドへのベクターゲノムの効率的なパッケージ化を可能にするために、隣接する５’および３’ＩＴＲ配列の使用を必要とする。
いくつかのＡＡＶ血清型および対応するＩＴＲの完全なゲノムが配列決定されている（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２，ｐ１３０９－１３１９）。それらは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）などによって供給されるオリゴヌクレオチド合成機を使用して当技術分野で公知の化学合成によって、または標準的な分子生物学技術によって、クローニングまたは作製することができる。ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスゲノムからクローニングするか、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターから切除することができる。標準的な分子生物学技術を使用して、１つ以上の治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列にいずれかの末端でＩＴＲヌクレオチド配列をライゲーションすることができるか、ＩＴＲ間のＡＡＶ配列を所望のヌクレオチド配列に置換することができる。
好ましくは、ｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムは、ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列、例えば、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）またはｃａｐ（キャプシド）遺伝子を含まない。このｒＡＡＶゲノムは、マーカーまたはレポーター遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えばｇｆｐ）をコードする遺伝子、または当技術分野で公知の化学的、酵素的もしくは他の方法で検出可能なおよび／または選択可能な生成物（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）をコードする遺伝子などをさらに含み得る。
上記ｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムは、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーター配列をさらに含む。
また、好適な３’非翻訳配列が、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されていてもよい。好適な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列に天然に関連するものであり得るか、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号３２）およびウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（配列番号３３）などの様々な遺伝子に由来し得る。
発現
発現は、当業者に公知の任意の方法によって評価され得る。例えば、発現は、当業者に公知の標準的なアッセイ、例えば、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡによって、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで肝臓内の導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価され得る。
発現は、本明細書に記載の遺伝子構築物、発現ベクターまたは組成物の投与後の任意の時点で評価され得る。本明細書のいくつかの実施形態では、発現は、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１４週間後、１６週間後、１８週間後、２０週間後、２２週間後、２４週間後、２８週間後、３２週間後、３６週間後、４０週間後またはそれ以上後に評価され得る。
本発明の文脈では、ＣＮＳ特異的発現および／または脳特異的発現および／または視床下部特異的発現および／または皮質特異的発現および／または海馬特異的発現および／または小脳特異的発現および／または嗅球特異的発現とは、他の器官または組織と比較して、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球内のＦＧＦ２１の優先的または優勢な（少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも３０％高い、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも１５０％高い、少なくとも２００％高い、またはそれ以上）発現を指す。他の器官または組織は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃、精巣などであり得る。好ましくは、他の器官は、肝臓および／または心臓である。一実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および／または心臓では検出できない。いくつかの実施形態では、発現は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃および精巣からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは全部の器官では検出できない。発現は、上記のように評価され得る。
本出願を通して、ＣＮＳ特異的および／または脳特異的および／または視床下部特異的および／または皮質特異的および／または海馬特異的および／または小脳特異的および／または嗅球特異的が発現の文脈で言及される場合、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球を構成する（１または複数の）細胞型の細胞型特異的発現もそれぞれ想定される。
投与
本明細書中で使用される場合、「ＣＳＦ内投与」は、脳を取り囲む髄膜のくも膜層と軟膜層との間のくも膜下腔内に位置するＣＳＦへの直接投与を意味する。ＣＳＦ内投与は、大槽内、脳室内または髄腔内投与によって行うことができる。本明細書中で使用される場合、「大槽内投与」は、小脳と延髄の背面との間に位置するくも膜下腔の開口部である大槽内への投与を意味する。本明細書中で使用される場合、「脳室内投与」は、脳の両側脳室のいずれかへの投与を意味する。本明細書中で使用される場合、「髄腔内投与」は、脊柱の髄腔内のＣＳＦへの直接投与を含む。本明細書中で使用される場合、「実質内投与」は、脳実質の任意の領域への直接局所投与を意味する。本明細書中で使用される場合、「鼻腔内投与」は、鼻構造による投与を意味する。
コドン最適化
本明細書中で使用される「コドン最適化」は、既存のコード配列を修飾するため、またはコード配列を設計するため、例えば、コード配列から転写された転写ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するため、またはコード配列の転写を改善するために使用されるプロセスを指す。コドン最適化には、限定するものではないが、発現宿主生物のコドン優先に適合するようにコード配列のコドンを選択することを含むプロセスが含まれる。例えば、哺乳動物、好ましくはマウス、イヌまたはヒト発現宿主のコドン優先に適合するように。コドン最適化はまた、ＲＮＡ安定性および／または翻訳に悪影響を及ぼす可能性がある要素（例えば、終結配列、ＴＡＴＡボックス、スプライス部位、リボソーム進入部位、反復および／またはＧＣリッチ配列およびＲＮＡ二次構造または不安定性モチーフ））を排除する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、転写、ＲＮＡ安定性および／または翻訳の少なくとも３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上の増加を示す。
本明細書およびその特許請求の範囲では、動詞「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用形は、その語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は除外されないことを意味するために、その非限定的な意味で使用される。さらに、動詞「からなる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド模倣物、培地または組成物が、具体的に特定されたもの以外の追加の（１または複数の）成分を含み得ることを意味する「から本質的になる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に置き換えられてもよく、上記追加の（１または複数の）成分は、本発明の固有の特徴を変化させない。加えて、動詞「からなる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書に記載の方法が具体的に特定されたもの以外の追加の（１または複数の）工程を含み得ることを意味する「から本質的になる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に置き換えられてもよく、上記追加の（１または複数の）工程は、本発明の固有の特性を変化させない。
不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、文脈が唯一の要素のみが存在することを明確に要求しない限り、１つよりも多くの要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
本明細書中で使用される場合、「少なくとも」特定の値とは、その特定の値以上を意味する。例えば、「少なくとも２つ」は、「２以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、．．．などと同じであると理解される。
個々の数値は、値の前に「約」または「およそ」という語が先行しているかのように近似値として記載されている。同様に、本出願中で指定された様々な範囲内の数値は、別段明示的に指定されない限り、記載された範囲内の最小値および最大値の両方の前に「約」または「およそ」という語が先行しているかのように近似値として記載されている。本明細書中で使用される場合、数値に言及する際の用語「約」および「およそ」は、開示された主題が最も密接に関連する当業者、または当該の範囲もしくは要素に関連する当業者にとって明白かつ通常の意味を有するものとする。厳密な数値境界から広がる量は、多くの要因に依存する。例えば、考慮され得る要因のいくつかには、要素の臨界性および／または所与の量の変動が特許請求される主題の性能に及ぼす影響、ならびに当業者に公知の他の考慮事項が含まれる。反対の考慮事項が存在しない場合、数値（例えば約１０）に関連して使用される場合の「約」または「およそ」という語は、好ましくは、その値がその値の１％以上または以下の（１０という）所与の値であり得ることを意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「および／または」は、記載された事例のうちの１つ以上が、単独で、または記載された事例のうちの少なくとも１つと組み合わせて、記載された事例のすべてまで発生し得ることを示す。
本明細書中で特定される各実施形態は、別段の指定がない限り、一緒に組み合わせることができる。
本明細書中で引用されるすべての特許出願、特許および印刷された刊行物は、任意の定義、主題の放棄または否認を除いて、および組み込まれた資料が本明細書中の明示的な開示と矛盾する（この場合、本開示中の文言が支配する）範囲を除いて、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されたものと類似または同等の多くの方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載された方法および材料に決して限定されない。
本発明は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。
ｄｂ／ｄｂマウスの脳内のｍｏＦＧＦ２１の発現。ＲＴｑＰＣＲによってｄｂ／ｄｂマウスの視床下部、皮質、海馬および小脳内のマウスコドン最適化ＦＧＦ２１（ｍｏＦｇｆ２１）コード配列の発現レベルを測定し、Ｒｐｌｐ０値により正規化した。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。ＮＤ、検出されず。 ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターを用いて処置した後のｄｂ／ｄｂマウスの体重および組織重量の減少。（Ａ）体重変化。ＡＡＶ投与後、体重を毎週測定した。（Ｂ）体重増加。体重増加は、増加した体重をＡＡＶ投与時の体重で割った百分率として計算した。（Ｃ）非処置およびＡＡＶ９－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂのｉＷＡＴ、ｅＷＡＴ、ｍＷＡＴ、ＢＡＴおよび肝臓の重量。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。非処置マウスに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。ｉＷＡＴ、鼠径部白色脂肪組織；ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織；ｍＷＡＴ、腸間膜白色脂肪組織；ＢＡＴ、肩甲骨間褐色脂肪組織；Ｌ、肝臓。 ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターのＣＳＦ内投与によるｄｂ／ｄｂマウスの糖尿病の回復。ＣＳＦ内ベクター投与後の非処置およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ処置ｄｂ／ｄｂマウスの食後血糖値の変化。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。非処置マウスに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターを用いて処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける脳炎症の低減。ＲＴｑＰＣＲによってｄｂ／ｄｂマウスの視床下部内のアストロサイトマーカー（ＧｆａｐおよびＳ１００ｂ）、ミクログリアマーカー（Ａｉｆ１）および炎症性分子（Ｎｆｋｂ、Ｉｌ１ｂおよびＩｌ６）の発現レベルを測定し、Ｒｐｌｐ０値により正規化した。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。非処置マウスに対して＊ｐ＜０．０５。Ｇｆａｐ、グリア線維酸性タンパク質；Ｓ１００ｂ、カルシウム結合タンパク質Ｂ；Ａｉｆ１、同種移植炎症因子１；Ｎｆｋｂ、核因子κＢ；Ｉｌ１ｂ、インターロイキン１β；Ｉｌ６、インターロイキン６。 ＳＡＭＰ８マウスの脳内のｍｏＦＧＦ２１の発現。ＲＴｑＰＣＲによってＳＡＭＰ８マウスの視床下部、皮質、海馬および小脳内のマウスコドン最適化ＦＧＦ２１（ｍｏＦＧＦ２１）コード配列の発現レベルを測定し、Ｒｐｌｐ０値により正規化した。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１４週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。ＮＤ、検出されず。 ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターを用いて処置した後のＳＡＭＰ８マウスの体重および組織重量の減少。（Ａ）体重変化。ＡＡＶ投与後、体重を毎週測定した。（Ｂ）体重増加。体重増加は、増加した体重をＡＡＶ投与時の体重で割った百分率として計算した。（Ｃ）非処置およびＡＡＶ９－ＦＧＦ２１処置ＳＡＭＰ８のｉＷＡＴ、ｅＷＡＴ、ｍＷＡＴ、ＢＡＴおよび肝臓の重量。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１４週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。非処置マウスに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。ｉＷＡＴ、鼠径部白色脂肪組織；ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織；ｍＷＡＴ、腸間膜白色脂肪組織；ＢＡＴ、肩甲骨間褐色脂肪組織；Ｌ、肝臓。 ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１を用いて処置したＳＡＭＰ８マウスにおける脳炎症の低減。ＲＴｑＰＣＲによってＳＡＭＰ８マウスの視床下部内のアストロサイトマーカー（ＧｆａｐおよびＳ１００ｂ）、ミクログリアマーカー（Ａｉｆ１）および炎症性分子（Ｎｆｋｂ、Ｉｌ１ｂおよびＩｌ６）の発現レベルを測定し、Ｒｐｌｐ０値により正規化した。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターの５×１０１０ｖｇ／マウスのＣＳＦ内投与の１４週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。非処置マウスに対して＊＊ｐ＜０．０１。Ｇｆａｐ、グリア線維酸性タンパク質；Ｓ１００ｂ、カルシウム結合タンパク質Ｂ；Ａｉｆ１、同種移植炎症因子１；Ｎｆｋｂ、核因子κＢ；Ｉｌ１ｂ、インターロイキン１β；Ｉｌ６、インターロイキン６。 ＡＡＶ１－ＦＧＦ２１、ＡＡＶ２－ＦＧＦ２１およびＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターのＣＳＦ内投与後の脳内のｍｏＦＧＦ２１の発現。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ、ＡＡＶ２－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴまたはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の３週間後に、ＲＴｑＰＣＲによって野生型マウスの視床下部、皮質、海馬および小脳内のマウスコドン最適化ＦＧＦ２１（ｍｏＦＧＦ２１）コード配列の発現レベルを測定した。結果をＲｐｌｐ０値により正規化し、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝５匹／群）。ＮＤ、検出されず。 脳内のＦＧＦ２１タンパク質レベル。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ、ＡＡＶ２－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴまたはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターの投与の３週間後に、ＥＬＩＳＡによって、野生型マウスの脳ホモジネート内のＦＧＦ２１タンパク質含有量を決定した。結果を総タンパク質レベルにより正規化し、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝５匹／群）。ＮＤ、検出されず。 ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターを用いて処置した後の体脂肪蓄積の減少および熱産生の増加。ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した、ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１処置および非処置ｄｂ／ｄｂマウスの（Ａ）ｅＷＡＴおよび（Ｂ）ＢＡＴの切片の代表的な画像。元の倍率ｘ２００（Ｃ）ＲＴｑＰＣＲによってｄｂ／ｄｂマウスのＢＡＴ内の熱生成マーカー（Ｕｃｐ１およびＣｉｄｅａ）の発現レベルを測定し、Ｒｐｌｐ０値により正規化した。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。非処置マウスに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｕｃｐ１、脱共役タンパク質１；Ｃｉｄｅａ、細胞死誘導ＤＮＡ断片化因子、αサブユニット様エフェクターＡ；ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織；ＢＡＴ、褐色脂肪組織。 ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１処置マウスにおける肝臓トリグリセリド含有量の減少。（Ａ）肝臓トリグリセリド含有量。（Ｂ）血清トリグリセリドおよび（Ｃ）血清ＦＦＡレベル。ベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。非処置マウスに対して＊ｐ＜０．０５。ＦＦＡ、遊離脂肪酸。 ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂマウスにおけるβ細胞量の改善。抗インスリン抗体により染色した膵臓切片の免疫組織化学的分析の後、非処置およびＡＡＶ９－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂマウスの（Ａ）膵島の数および（Ｂ）β細胞量を計算した。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝３匹／群）。非処置マウスに対して＊ｐ＜０．０５。 ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターを用いて処置した後のｄｂ／ｄｂマウスの脂肪組織および肝臓における炎症の減少。（Ａ）非処置およびＡＡＶ９－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂマウス由来のｅＷＡＴのＭＡＣ－２免疫組織化学的検査の代表的な画像（ｎ＝６匹／群）（Ｂ）ＲＴｑＰＣＲによってｄｂ／ｄｂマウスのｅＷＡＴ内の炎症マーカーＦ４／８０の発現レベルを測定し、Ｒｐｌｐ０値により正規化した。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に分析を行った。（Ｃ～Ｄ）ＲＴｑＰＣＲによってｄｂ／ｄｂマウスのＢＡＴ（Ｃ）および肝臓（Ｄ）内の炎症マーカーＦ４／８０、Ｉｌ６およびＴｎｆａの発現レベルを測定し、Ｒｐｌｐ０値により正規化した。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９匹／群）。非処置マウスに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｆ４／８０、接着性Ｇタンパク質共役受容体Ｅ１；Ｉｌ６、インターロイキン６；Ｔｎｆａ、腫瘍壊死因子α；ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織；ＢＡＴ、褐色脂肪組織。ＭＡＣ－２、レクチン、ガラクトース結合、可溶性３；矢印はＭＡＣ－２シグナル伝達を示す。 ＡＡＶ１－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂマウスの脳内のＦＧＦ２１の発現。ＲＴｑＰＣＲによってｄｂ／ｄｂマウスの視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球内のマウスコドン最適化ＦＧＦ２１（ｍｏＦｇｆ２１）コード配列の発現レベルを測定し、Ｒｐｌｐ０値により正規化した。５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１ベクターのＣＳＦ内投与の１６週間後に分析を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝７匹／群）。ＮＤ、検出されず。 ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ＦＧＦ２１ベクターを用いて処置した後のｄｂ／ｄｂマウスの体重減少。ＡＡＶ投与後、非処置ｄｂ／＋（非肥満）、非処置ｄｂ／ｄｂおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂマウスの体重を毎週測定した。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝７匹／群）。ｄｂ／＋マウスに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。ｄｂ／ｄｂ非処置マウスに対して＄＄＄ｐ＜０．００１。 ＡＡＶ１－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂにおける糖尿病の回復。（Ａ）ＣＳＦ内ベクター投与後の非肥満（ｄｂ／＋）、非処置およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ処置ｄｂ／ｄｂマウスの食後血糖値の変化。（Ｂ）ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ＦＧＦ２１ベクター投与の１１週間後に空腹時血糖値を測定した。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝７匹／群）。ｄｂ／＋マウスに対して＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。ｄｂ／ｄｂ非処置マウスに対して＄＄＄ｐ＜０．００１。 ＡＡＶ１－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂマウスにおけるインスリン感受性の増加。腹腔内インスリン負荷試験。非肥満（ｄｂ／＋）、非処置およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ処置ｄｂ／ｄｂマウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重を腹腔内注射し、示した時点で血糖値を測定した。ＡＡＶ投与の１４週間後に試験を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝７匹／群）。ｄｂ／＋マウスに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。ｄｂ／ｄｂ非処置マウスに対して＄ｐ＜０．０５および＄＄ｐ＜０．０１。 ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ＦＧＦ２１を用いた処置は耐糖能を改善する。グルコース（１ｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射後の非処置ｄｂ／＋（非肥満）、非処置ｄｂ／ｄｂおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂマウスに対してＡＡＶを投与した１１週間後に耐糖能を試験した。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝７匹／群）。ｄｂ／＋マウスに対して＊ｐ＜０．０５および＊＊＊ｐ＜０．００１。ｄｂ／ｄｂ非処置マウスに対して＄＄＄ｐ＜０．００１。 ＡＡＶ１－ＦＧＦ２１投与後のｄｂ／ｄｂマウスにおける糖新生の減少。非肥満（ｄｂ／＋）、非処置およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ処置ｄｂ／ｄｂマウスを対象に、ピルビン酸負荷試験を行った。全群にピルビン酸（１ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射し、示した時点で血糖値を測定した。ＡＡＶ投与の１２週間後に試験を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝７匹／群）。非処置マウスに対して＊＊＊ｐ＜０．００１。ｄｂ／ｄｂ非処置マウスに対して＄＄＄ｐ＜０．００１。
［実施例］
ＡＡＶベクターを使用することにより、脳内に過剰発現させた場合のこの器官内のＦＧＦ２１の作用を試験する。３つの異なる実験を行った：
・ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴを用いたｄｂ／ｄｂマウスの処置。使用用量：５×１０１０ｖｇ／マウス（実施例１）。
・ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴを用いたＳＡＭＰ８マウスの処置。使用用量：５×１０１０ｖｇ／マウス（実施例２）。
・ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１を用いたｄｂ／ｄｂマウスの処置。使用用量：５×１０１０ｖｇ／マウス（実施例４）。
さらに、本発明者らは、野生型マウスのＣＳＦ内投与後のＡＡＶ１－ＦＧＦ２１、ＡＡＶ２－ＦＧＦ２１およびＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターによる脳形質導入効率も検討した（実施例３）。
ｄｍｉＲＴとは、４コピーのｍｉＲＴ－１２２ａおよび４コピーのｍｉＲＴ－１配列を指す。
ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ遺伝子構築物配列は、配列番号３５の配列に含まれる。ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１遺伝子構築物配列は、配列番号４６の配列に含まれる。
実施例に対する一般的な手順
対象特性
雄のＢＫＳ．Ｃｇ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ ＯｌａＨｓｄ（ｄｂ／ｄｂ）、ＢＫＳ．Ｃｇ－ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／ＯｌａＨｓｄ（ｄｂ／＋、非肥満）ＳＡＭＰ８／ＴａＨｓｄ（ＳＡＭＰ８）およびＣ５７Ｂｌ／６Ｊ（野生型）マウスを使用した。マウスは、標準飼料を自由に摂取させ（２０１８Ｓ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔｓ（登録商標）、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ、１２時間の明暗サイクル（午前８：００に点灯）および安定した温度（２２℃±２）下で飼育した。組織サンプリングのために、マウスを吸入麻酔薬イソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ，ＵＳ）によって麻酔し、断頭した。目的の組織を切除し、分析まで－８０℃に保った。実験手順はいずれも、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ａｕｔｏｎｏｍａ ｄｅ ＢａｒｃｅｌｏｎａのＥｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎによって承認された。
組換えＡＡＶベクター
標準的な方法（Ａｙｕｓｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：４２３－３６）に従ってＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによって、血清型１、２および９の一本鎖ＡＡＶベクターを作製した。細胞を８０％コンフルエンスまで、ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ中、１０本のローラーボトル（８５０ｃｍ２、平坦；Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）内で培養し、リン酸カルシウム法によって、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号３５）に隣接する発現カセットを保有するプラスミド、それぞれ血清型１、２または９ ｃａｐ遺伝子のＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶを保有するヘルパープラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパー機能を保有するプラスミドにより同時トランスフェクトした。使用した導入遺伝子は、初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター（配列番号２７）によって駆動されるマウスコドン最適化ＦＧＦ２１コード配列（配列番号９）であった。実施例１、２および３では、導入遺伝子に、発現カセットの３’非翻訳領域にクローニングされたｍｉＲＴ－１２２ａ配列の４つのタンデムリピート（５’ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ３’、配列番号１２）およびｍｉＲＴ－１配列の４つのタンデムリピート（５’ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ３’、配列番号１３）の付加も含めた。実施例４では、カセットはｍｉＲＴ－１２２ａおよびｍｉＲＴ－１を保有していなかった。ポリエチレングリコール沈殿工程と、２つの連続する塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配とに基づく最適化された方法を用いて、ＡＡＶを精製した。この第２世代ＣｓＣｌベースのプロトコルは、空のＡＡＶキャプシドならびにＤＮＡおよびタンパク質不純物を劇的に減少させた（Ａｙｕｓｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：４２３－３６）。精製したＡＡＶベクターをＰＢＳに対して透析し、濾過し、－８０℃で保存した。標準曲線として線形化プラスミドＤＮＡを使用して、ＡＡＶ２参照標準物質について記載されたプロトコルに従って、定量ＰＣＲによって、ウイルスゲノムの力価を決定した（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１：１２７３－１２８５）。当技術分野で周知の分子生物学技術に従ってベクターを構築した。
ＡＡＶベクターのインビボＣＳＦ内投与
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりマウスを麻酔し、耳の後ろからほぼ肩甲骨間まで後頭部の皮膚を剃毛し、エタノールによりすすいだ。マウスを腹臥位で保持し、頭部をわずかに下方に傾けた。２ｍｍの吻側－尾側切開（ｒｏｓｔｒｏ－ｃａｕｄａｌ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を行って、ハミルトン注射器を４５～５５°の角度で大槽内に、後頭部とＣ１椎骨との間に導入し、５μｌのベクター希釈物を投与した。ＣＮＳがベクター送達のための主な標的区画であることを考慮して、体重に関係なく同じ数のベクターゲノム／マウス（５×１０１０ｖｇ／マウス）でマウスに投与した。
免疫組織化学的および形態計測的分析
組織をホルマリン（Ｐａｎｒｅａｃ Ｑｕｉｍｉｃａ）中で２４時間固定し、パラフィンに包埋し、切片にした。組織試料をヘマトキシリン－エオシンにより染色し、画像解析ソフトウェア（ａｎａｌｙＳＩＳ ３．０；Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＥＥＵＵ）を備えたモニターを備えたビデオカメラに接続されたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて画像を取得した。
免疫組織化学的検査
組織を１０％ホルマリン中で１２～２４時間固定し、パラフィンに包埋し、切片にした。免疫組織化学的検出のために、切片を脱パラフィンし、ラット抗ＭＡＣ２（１：５０；ＣＬ８９４２ＡＰ；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）およびモルモット抗インスリン（１：１００；Ｉ－８５１０；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化ウサギ抗ラット（１：３００；Ｅ０４６７；Ｄａｋｏ）と、ペルオキシダーゼにカップリングされたウサギ抗モルモット（１：３００；Ｐ０１４１；Ｄａｋｏ）とを二次抗体として使用した。ＡＢＣペルオキシダーゼキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を免疫検出に使用し、切片をＭａｙｅｒのヘマトキシリン中で対比染色した。２００μｍ離れた２つのインスリン染色切片を対象として、一切片内の全インスリン陽性細胞の面積をその切片の総膵臓面積で割ることによって、膵臓内のβ細胞面積の割合を分析した。以前に記載されているように（Ｃａｓｅｌｌａｓ ｅｔ ａｌ，２００６）、膵臓重量にβ細胞面積の割合を掛けることによってβ細胞量を計算した。
ＲＮＡ分析
Ｔｒｉｐｕｒｅ単離試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳ）を使用して視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球から、ならびにＱｉａｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ，ＮＬ）と、海馬試料用のＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉキットまたはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ，ＮＬ）とを使用して白色脂肪組織、褐色脂肪組織および肝臓から、全ＲＮＡを得た。残留ウイルスゲノムを排除するために、ＤＮＡｓｅＩ（Ｑｉａｇｅｎ ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ，ＮＬ）を用いて全ＲＮＡを処理した。ＲＴ－ＰＣＲ分析のために、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（０４３７９０１２００１、Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して、１μｇのＲＮＡ試料を逆転写した。ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒＩＩ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＵＳＡ）でリアルタイム定量ＰＣＲを行った。データをＲｐｌｐ０値により正規化し、以前に記載されているように（Ｐｆａｆｆｌ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１；２９（９）：ｅ４５）分析した。
使用したプライマーの概要を以下に示す：
ｍｏＦｇｆ２１－Ｆｗ：５’－ＣＣＴＡＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡＣＡＡＧ－３’（配列番号４７）
ｍｏＦｇｆ２１－Ｒｖ：５’－ＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧＧ－３’（配列番号４８）
Ｇｆａｐ－Ｆｗ：５’－ＡＣＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧ－３’（配列番号４９）
Ｇｆａｐ－Ｒｖ：５’－ＣＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ－３’（配列番号５０）
Ｓ１００ｂ－Ｆｗ：５’－ＡＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＣＣ－３’（配列番号５１）
Ｓ１００ｂ－Ｒｖ：５’－ＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡ－３’（配列番号５２）
Ａｉｆ１－Ｆｗ：５’－ＴＧＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴＧ－３’（配列番号５３）
Ａｉｆ１－Ｒｖ：５’－ＴＣＡＡＧＴＴＴＧＧＡＣＧＧＣＡＧＡＴＣ－３’（配列番号５４）
Ｎｆｋｂ－Ｆｗ：５’－ＧＡＣＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＴ－３’（配列番号５５）
Ｎｆｋｂ－Ｒｖ：５’－ＴＧＴＣＡＣＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧＴＴＣＡ－３’（配列番号５６）
Ｉｌ１ｂ－Ｆｗ：５’－ＡＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＡＡＣ－３’（配列番号５７）
Ｉｌ１ｂ－Ｒｖ：５’－ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＴＴＧ－３’（配列番号５８）
Ｉｌ６－Ｆｗ：５’－ＴＣＧＣＴＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡ－３’（配列番号５９）
Ｉｌ６－Ｒｖ：５’－ＣＡＴＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣ－３’（配列番号６０）
Ｕｃｐ１－Ｆｗ：５’－ＧＧＣＣＴＣＴＡＣＧＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡ－３’（配列番号６１）
Ｕｃｐ１－Ｒｖ：５’－ＴＡＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴ－３’（配列番号６２）
Ｃｉｄｅａ－Ｆｗ：５’－ＡＡＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＡＧＣＣ－３’（配列番号６３）
Ｃｉｄｅａ－Ｒｖ：５’－ＡＧＧＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＡＣ－３’（配列番号６４）
Ｔｎｆａ－Ｆｗ：５’－ＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣ－３’（配列番号６５）
Ｔｎｆａ－Ｒｖ：５’－ＡＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣＧＧＣＴＧＡＣＧ－３’（配列番号６６）
Ｆ４／８０－Ｆｗ：５’－ＣＴＴＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣ－３’（配列番号６７）
Ｆ４／８０－Ｒｖ：５’－ＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＴＡＴＣ－３’（配列番号６８）
Ｒｐｌｐ０－Ｆｗ：５’－ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＡＡ－３’（配列番号６９）
Ｒｐｌｐ０－Ｆｗ：５’－ＴＣＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＴＣＴ－３’（配列番号７０）
ホルモンおよび代謝産物アッセイ
Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ Ｅｌｉｔｅ（商標）分析器（Ｂａｙｅｒ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて血糖値を測定した。ＦＧＦ２１タンパク質の脳レベルを、定量サンドイッチ酵素イムノアッセイマウス／ラットＦＧＦ－２１ ＥＬＩＳＡキット（ＭＦ２１００、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）によって決定し、全脳ホモジネート中のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した総タンパク質含有量によって正規化した。肝臓から脂質を抽出するために、Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．によって記載されているように、約１００ｍｇの凍結試料を秤量し、クロロホルム：メタノール（２：１）中でホモジナイズした。酵素アッセイキット（Ｈｏｒｉｂａ－ＡＢＸ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して分光光度法で肝臓トリグリセリドおよび血清トリグリセリドを定量した。アシル－ＣｏＡシンターゼおよびアシル－ＣｏＡオキシダーゼ法（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ、Ｎｅｕｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって血清遊離脂肪酸を測定した。生化学的パラメーターはいずれも、Ｐｅｎｔｒａ ４００分析器（Ｈｏｒｉｂａ－ＡＢＸ）を使用して決定した。
インスリン負荷試験
インスリン負荷試験のために、インスリン（０．７５ＩＵ／ｋｇ体重；Ｈｕｍｕｌｉｎ Ｒｅｇｕｌａｒ；Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を覚醒給餌マウス（ａｗａｋｅ ｆｅｄ ｍｉｃｅ）に腹腔内注射した。インスリン注射後の示した時点で尾静脈から得られた血液試料中のグルコース濃度を決定した。
ブドウ糖負荷試験
覚醒マウスを一晩（１６時間）絶食させ、グルコース（１ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射により投与した。示した時点で尾静脈血液試料中の血糖を測定した。
ピルビン酸負荷試験
覚醒マウスを一晩（１６時間）絶食させ、ピルビン酸（１ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射により投与した。示した時点で尾静脈血液試料中の血糖を測定した。
［実施例１］
ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉｒＴベクターのＣＳＦ内投与による肥満および糖尿病の回復
本発明者らは、レプチンシグナル伝達が欠損しており、肥満および糖尿病の広く使用されている遺伝子モデルである７週齢のｄｂ／ｄｂ雄マウスを対象に、ＦＧＦ２１を用いた脳のＡＡＶ媒介遺伝子工学の抗糖尿病誘発性および抗肥満誘発性治療可能性を評価した。この目的のために、ｄｂ／ｄｂマウスに対して、肝臓特異的ｍｉＲ－１２２ａおよび心臓特異的ｍｉＲ－１（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ）の標的部位を含めたＣＡＧユビキタスプロモーターの制御下でマウスコドン最適化ＦＧＦ２１コード配列をコードする、５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９ベクターを大槽を介して脳脊髄液（ＣＳＦ）内に局所投与した。対照として、非処置ｄｂ／ｄｂ動物を使用した。
ＡＡＶ投与の１２週間後の視床下部、皮質、海馬および小脳などの脳の様々な領域内で因子の発現レベルが増加したことによって証明されるように、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与は、脳内でＦＧＦ２１の広範囲な過剰発現を媒介した（図１）。
非処置ｄｂ／ｄｂマウスは１２週間の追跡期間中に体重を増加させ続けたが（約５０％の体重増加）、ＦＧＦ２１をコードするベクターを用いて処置したコホートでは体重増加が明らかに減少した（約２０％の体重増加）（図２Ａおよび図２Ｂ）。これと一致して、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターを用いて処置した動物は、体脂肪蓄積の減少と、肝臓の重量の６０％の減少とを示した（図２Ｃ）。注目すべきことに、ＦＧＦ２１遺伝子移入を脳に標的化したｄｂ／ｄｂマウスもまた、摂食時の血糖の完全な正常化を示し、これらの動物では糖尿病の抑制が実証された（図３）。
肥満は脳炎症に関連する（Ｏ．Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ－Ｌｅｇｒｉｓ，Ｇ．Ｇ．Ｍｕｃｃｉｏｌｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４０，２３７－２５３（２０１７）。この器官内の炎症をアストロサイトマーカーであるＧｆａｐおよびＳ１００ｂ、ミクログリアマーカーであるＡｉｆ１、ならびに炎症性分子、例えば、Ｎｆｋｂ、Ｉｌ１ｂおよびＩｌ６の発現によって分析した。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターを用いてＣＳＦ内処置したｄｂ／ｄｂマウスは、視床下部内のＧｆａｐ、Ｓ１００ｂ、Ａｉｆ１、Ｎｆｋｂ、Ｉｌ１ｂおよびＩｌ６の発現低下を示した（図４）。
［実施例１．１］
ヘマトキシリン－エオシン染色による白色脂肪組織の組織学的分析により、ｅＷＡＴ内の白色脂肪細胞サイズの減少が明らかにされた（図１０Ａ）。ＢＡＴでは、組織学的分析は、比較的低い脂質蓄積および比較的多くの多房性褐色脂肪細胞を示した（図１０Ｂ）。これらの結果によれば、Ｕｃｐ１およびＣｉｄｅａの発現レベルは、ＦＧＦ２１処置マウスのＢＡＴでは高度に増加し（図１０Ｃ）、ＡＡＶ－ＦＧＦ２１ ＣＮＳ投与後の熱産生の増加が示唆された。ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１処置ｄｂ／ｄｂマウスでは、肝臓トリグリセリド含有量が減少した（図１１Ａ）。並行して、これらのマウスでは、トリグリセリドおよび血清遊離脂肪酸の循環レベルも低下した（図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。膵臓の免疫組織化学的分析により、ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１ベクターを用いた処置後のｄｂ／ｄｂマウスでは、膵島の数が増加し（図１２Ａ）、β細胞量が改善される（図１２Ｂ）ことが明らかにされた。
肥満および糖尿病は、全身性炎症に関連する。白色脂肪組織では、ＭＡＣ－２炎症性マーカーに対する免疫組織化学的分析は、ＡＡＶ９－ＦＧＦ２１処置マウスにおけるマクロファージ浸潤の減少を示し（図１３Ａ）、これは、Ｆ４／８０ ｍＲＮＡ発現レベルの減少と関連していた（図１３Ｂ）。ＦＧＦ２１処置動物でも、褐色脂肪組織および肝臓内の炎症性サイトカインＦ４／８０、Ｉｌ６およびＴｎｆαの発現レベルが低下し（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）、ＦＧＦ２１遺伝子療法後の全身性炎症の減少が示された。
［実施例２］
ＳＡＭＰ８マウスにおけるＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉｒＴベクターのＣＳＦ内投与による体重増加の減少
加齢性脳病変を有する広く使用されている老化マウスモデルである７週齢の老化促進マウスｐｒｏｎｅ ８（ＳＡＭＰ８）の雄マウスに対して、５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターを大槽を介してＣＳＦ内に局所投与した。対照として、非処置ＳＡＭＰ８動物を使用した。
ｄｂ／ｄｂマウスに対して得られた観察結果と同様に、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与は、ＡＡＶ投与の１４週間後に、ＳＡＭＰ８マウスの視床下部、皮質、海馬および小脳内でＦＧＦ２１の強力な過剰発現を媒介した（図５）。ＦＧＦ２１処置マウスは、非処置コホートよりも低い体重増加を示し（図６Ａおよび図６Ｂ）、これは、肝臓の重量減少と並行していた（図６Ｃ）。さらに、脳内でＦＧＦ２１を過剰発現するＳＡＭＰ８マウスの視床下部では、炎症性サイトカインＩｌ１ｂおよびＩｌ６の発現が減少した（図７）。
［実施例３］
ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉｒＴ、ＡＡＶ２－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉｒＴおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉｒＴベクターのＣＳＦ内投与後の脳形質導入。
いくつかのＡＡＶ血清型が、大槽を介した直接ＣＳＦ投与後に脳に効率的に形質導入することができるかどうかを検討するために、肝臓特異的ｍｉＲ－１２２ａおよび心臓特異的ｍｉＲ－１の標的部位を含めたＣＡＧユビキタスプロモーターの制御下でマウスコドン最適化ＦＧＦ２１コード配列をコードする、５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９ベクター（それぞれＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ、ＡＡＶ２－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ）を用いて、野生型マウスを処置した。対照として、非処置野生型マウスを使用した。
ＡＡＶベクターのＣＳＦ内投与の３週間後、脳試料を得、ＲＴ－ＰＣＲ分析から、視床下部、皮質、海馬および小脳などの様々な脳領域内のｍｏＦＧＦ２１発現の増加が示された（図８）。さらに、ｍｏＦＧＦ２１の過剰発現は、脳全体にＦＧＦ２１タンパク質含有量の増加をもたらした（図９）。
［実施例４］
ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１ベクターのＣＳＦ内投与による肥満および糖尿病の回復。
ＣＡＧユビキタスプロモーターの制御下でマウスコドン最適化ＦＧＦ２１コード配列をコードする、５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ１ベクター（ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１）を大槽を介して脳脊髄液内（ＣＳＦ）に局所投与された７週齢のｄｂ／ｄｂ雄マウスを対象に、ＦＧＦ２１遺伝子療法による脳のＡＡＶ媒介遺伝子工学の抗糖尿病誘発性および抗肥満誘発性治療可能性も評価した。対照として、非処置ｄｂ／ｄｂおよび非処置ｄｂ／＋（非肥満）マウスを使用した。
ＡＡＶ投与の１６週間後の視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球などの脳の様々な領域内で因子の発現レベルが増加したことによって証明されるように、ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１ベクターのＣＳＦ内投与は、脳内でＦＧＦ２１の広範囲な過剰発現を媒介した（図１４）。
非処置ｄｂ／ｄｂマウスは１４週間の追跡期間中に体重を増加させ続けたが、ＡＡＶ１－ＦＧＦ２１をコードするベクターを用いて処置したコホートの体重は増加しなかった（図１５）。注目すべきことに、ＦＧＦ２１遺伝子移入を脳に標的化したｄｂ／ｄｂマウスもまた、摂食時および絶食時の血糖の完全な正常化を示し（図１６Ａおよび図１６Ｂ）、これらの動物では糖尿病の抑制が実証された。
インスリン負荷試験は、ＡＡＶ１－ＦＧＦ２１ウイルスベクターを用いた処置後にｄｂ／ｄｂではインスリン抵抗性が改善されたことを示し（図１７）、一晩絶食させたマウスに対する腹腔内ブドウ糖負荷試験は、ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１を用いて処置したｄｂ／ｄｂマウスの方がｄｂ／ｄｂ非処置マウスよりも耐糖能が高いことを示した（図１８）。肝臓の糖新生の指標として、腹腔内ピルビン酸負荷試験を行った。ピルビン酸負荷後、ｄｂ／ｄｂ非処置マウスでは血糖値は６００ｍｇ／ｄｌまで上昇し、試験中上昇したままであったが、ＦＧＦ２１ ｄｂ／ｄｂ処置マウスおよび処置した非肥満マウスの血糖値は、最大で１５０ｍｇ／ｄｌまで上昇し、したがって、ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ＦＧＦ２１処置後の糖新生の減少が示された（図１９）。
Figure 2022513127000004
Figure 2022513127000005
ホモサピエンスＦＧＦ２１のアミノ酸配列（配列番号１）
ＭＤＳＤＥＴＧＦＥＨＳＧＬＷＶＳＶＬＡＧＬＬＬＧＡＣＱＡＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
ホモサピエンスＦＧＦ２１のヌクレオチド配列（配列番号４）
ＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＣＧＧＴＧＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＡＡＡＴＣＴＴＧＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣＣＣＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＡ
ホモサピエンスＦＧＦ２１－変異体１のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号５）
ＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＣＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡ
ホモサピエンスＦＧＦ２１－変異体２のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号６）
ＡＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＧＧＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＣＡＴＴＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＴＧＣＣＣＧＡＡＣＣＣＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＧＧＴＴＣＧＴＣＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＧＴＣＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＧＴＣＣＴＡＣＧＣＡＴＣＣＴＧＡ
ホモサピエンスＦＧＦ２１－変異体３のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号７）
ＡＴＧＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＴＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＣＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＴＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＡＧＴＣＣＴＴＣＡＴＡＣＧＣＡＴＣＡＴＡＡ
マウスコドン最適化ＦＧＦ２１のヌクレオチド配列（配列番号９）
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＧＣＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＴＡＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡ
ＣＡＧプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２７）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧ
ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２８）
ＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ
ＣＭＶエンハンサーのヌクレオチド配列（配列番号２９）
ＧＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧ
ＣＭＶプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー配列（配列番号３４）
ＧＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ
ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（配列番号３０）
ＧＣＧＣＧＣＴＣ ＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣ ＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣ ＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣ
ＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧ ＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴ ＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧ ＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧ ＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧ
ＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧ ＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴ ＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ（配列番号３１）
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴ ＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧ
ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧ ＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧ ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣ ＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣ ＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ ＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧ ＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡ ＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣ ＧＡＧＣＧＣＧＣ
ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（ポリＡシグナルを含む、ウサギβ－グロビンの３’ＵＴＲおよび隣接領域）（配列番号３３）
ＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＡＧＡＴＣ
ｍｉＲＴ配列
ｍｉＲＴ－１２２ａ（配列番号１２）：５’ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ３’、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡ－１２２ａに対する標的（ｍｉＲＢａｓｅデータベースへのアクセッション番号、ＭＩ００００４４２）。
ｍｉＲＴ－１５２（配列番号１４）：５’ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＡ３’、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡ－１５２に対する標的（ＭＩ００００４６２）。
ｍｉＲＴ－１９９ａ－５ｐ（配列番号１５）：５’ＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＧＧ３’、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡ １９９ａに対する標的（ＭＩ００００２４２）。
ｍｉＲＴ－１９９ａ－３ｐ（配列番号１６）：５’ＴＡＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＧＴ３’、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡ－１９９ａに対する標的（ＭＩ００００２４２）。
ｍｉＲＴ－２１５（配列番号１７）：５’ＧＴＣＴＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＧＧＴＣＡＴ３’、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡ－２１５に対する標的（ＭＩ００００２９１）。
ｍｉＲＴ－１９２（配列番号１８）：５’ＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧ３’、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡ－１９２に対する標的（ＭＩ００００２３４）。
ｍｉＲＴ－１４８ａ（配列番号１９）：５’ＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＧＴＧＣＡＣＴＧＡ３’、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡ－１４８ａに対する標的（ＭＩ００００２５３）。
ｍｉＲＴ－１９４（配列番号２０）：５’ＴＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＡＣＡ３’、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡ－１９４に対する標的（ＭＩ００００４８８）。
ｍｉＲＴ－１３３ａ（配列番号２１）：５’ＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡ３’、心臓に発現されるマイクロＲＮＡ－１３３ａに対する標的（ＭＩ００００４５０）。
ｍｉＲＴ－２０６（配列番号２２）：５’ＣＣＡＣＡＣＡＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ３’、心臓に発現されるマイクロＲＮＡ－２０６に対する標的（ＭＩ００００４９０）。
ｍｉＲＴ－１（配列番号１３）：５’ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ３’、心臓に発現されるマイクロＲＮＡ－１に対する標的（ＭＩ００００６５１）。
ｍｉＲＴ－２０８ａ－５ｐ（配列番号２３）：５’ＧＴＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＣ３’、心臓に発現されるマイクロＲＮＡ－２０８ａに対する標的（ＭＩ００００２５１）。
ｍｉＲＴ－２０８ａ－３ｐ（配列番号２４）：５’ＡＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡＴ３’、心臓に発現されるマイクロＲＮＡ－２０８ａに対する標的（ＭＩ００００２５１）。
ｍｉＲＴ－４９９－５ｐ（配列番号２５）：５’ＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＴＡＡ３’、心臓に発現されるマイクロＲＮＡ－４９９に対する標的（ＭＩ０００３１８３）。
ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１－ｄｍｉＲＴ（配列番号３５）
１ ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡ ＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡ ＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣ ＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧ
５１ ＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴ ＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧ ＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣ ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧ ＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴ
１０１ ＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣ ＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧ ＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣ ＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧ
１５１ ＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣ ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧ ＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴ
２０１ ＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡ ＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡ ＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧ ＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣ
２５１ ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴ ＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣ ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧ ＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡ ＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡ
３０１ ＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣ ＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧ ＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡ ＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡ ＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣ
３５１ ＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴ ＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣ ＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣ ＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧ ＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣ
４０１ ＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡ ＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣ ＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴ ＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴ
４５１ ＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣ ＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡ ＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧ ＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧ ＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡ
５０１ ＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴ ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣ ＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡ ＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣ ＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴ
５５１ ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡ ＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧ ＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧ ＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡ ＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡ
６０１ ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧ ＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡ ＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣ ＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴ ＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧ
６５１ ＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧ ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴ ＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡ ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣ ＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡ
７０１ ＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧ ＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴ ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣ ＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴ ＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡ
７５１ ＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴ ＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧ ＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣ ＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡ ＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴ
８０１ ＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣ ＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡ ＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧ ＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ ＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧ
８５１ ＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴ ＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧ ＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧ ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ ＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡ
９０１ ＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡ ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ ＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡ ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴ
９５１ ＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴ ＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡ ＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣ ＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴ ＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴ
１００１ ＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣ ＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣ ＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡ ＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣ ＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡ
１０５１ ＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣ ＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣ ＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴ ＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣ ＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡ
１１０１ ＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧ ＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧ ＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣ ＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴ ＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡ
１１５１ ＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡ ＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡ ＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧ ＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣ ＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧ
１２０１ ＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡ ＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧ ＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴ ＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴ ＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣ
１２５１ ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴ ＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣ ＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴ ＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧ
１３０１ ＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴ ＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴ ＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧ ＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴ ＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡ
１３５１ ＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴ ＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣ ＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣ ＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧ
１４０１ ＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡ ＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡ ＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡ ＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴ ＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧ
１４５１ ＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴ ＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡ ＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧ ＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴ ＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧ
１５０１ ＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧ ＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡ ＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴ ＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴ ＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧ
１５５１ ＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧ ＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴ ＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡ ＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡ ＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡ
１６０１ ＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣ ＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴ ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴ ＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡ ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧ
１６５１ ＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡ ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡ ＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣ ＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣ ＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧ
１７０１ ＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣ ＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴ ＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴ ＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣ
１７５１ ＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡ ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴ ＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴ ＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴ
１８０１ ＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧ ＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧ ＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴ ＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡ ＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧ
１８５１ ＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧ ＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴ ＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴ ＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴ
１９０１ ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡ ＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴ ＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡ ＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴ ＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴ
１９５１ ＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡ ＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴ ＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧ ＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣ ＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴ
２００１ ＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣ ＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡ ＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴ ＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡ ＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡ
２０５１ ＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴ ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧ ＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧ ＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴ
２１０１ ＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡ ＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧ ＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧ ＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡ
２１５１ ＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣ ＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣ ＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡ ＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡ ＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧ
２２０１ ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧ ＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴ ＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡ ＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧ
２２５１ ＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣ ＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧ ＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧ ＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡ
２３０１ ＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣ ＡＧＧＣＧＡＴＴＣＣ ＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴ ＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡ ＧＧＣＡＡＧＧＣＡＡ
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３００１ ＴＧＧＣＣＣＡＣＴＡ ＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴ ＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣ ＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧ ＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴ
３０５１ ＧＣＣＧＴＡＡＡＧＣ ＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧ ＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧ ＡＴＴＴＡＧＡＧＣＴ
３１０１ ＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡ ＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡ ＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡ ＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡ ＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡ
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３２５１ ＴＧＣＴＴＴＧＡＣＧ ＡＧＣＡＣＧＴＡＴＡ ＡＣＧＴＧＣＴＴＴＣ ＣＴＣＧＴＴＡＧＡＡ ＴＣＡＧＡＧＣＧＧＧ
３３０１ ＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧ ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴ ＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴ ＴＡＧＡＣＡＧＧＡＡ ＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡ
３３５１ ＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧ ＡＡＧＴＧＴＴＴＴＴ ＡＴＡＡＴＣＡＧＴＧ ＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡ ＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴ
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３７５１ ＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣ ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡ ＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴ ＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴ ＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ
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４０５１ ＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡ ＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡ ＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣ ＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧ ＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴ
４１０１ ＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧ ＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡ ＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡ ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡ ＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧ
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４２５１ ＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧ ＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧ ＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧ
４３０１ ＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧ ＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡ ＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧ ＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡ
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４５０１ ＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣ ＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴ ＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧ ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣ
４５５１ ＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧ ＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴ ＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧ ＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴ
４６０１ ＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴ ＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣ ＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣ ＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧ ＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣ
４６５１ ＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧ ＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧ ＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧ ＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧ ＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣ
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４８５１ ＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴ ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡ ＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧ ＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣ ＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧ
４９０１ ＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣ ＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣ ＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴ ＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧ ＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣ
４９５１ ＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧ ＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧ ＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣ ＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ
５００１ ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧ ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ ＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣ ＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣ
５０５１ ＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴ ＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧ ＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣ ＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ
５１０１ ＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧ ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡ ＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴ ＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡ ＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡ
５１５１ ＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧ ＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧ ＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴ ＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣ ＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧ
５２０１ ＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣ ＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣ ＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣ
５２５１ ＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧ ＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧ ＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴ ＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧ ＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣ
５３０１ ＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧ ＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴ ＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧ ＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣ
５３５１ ＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧ ＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧ ＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣ ＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣ ＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧ
５４０１ ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡ ＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡ ＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡ ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣ ＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣ
５４５１ ＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧ ＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧ ＧＴＴＡＴＴＧＴＧＣ ＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡ ＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡ
５５０１ ＧＡＡＴＴＧＡＴＴＡ ＡＴＴＣＧＡＧＣＧＡ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＧ ＴＣＧＣＴＣＧＧＴＡ ＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴ
５５５１ ＴＧＡＡＴＴＧＧＣＣ ＴＣＧＡＧＣＧＣＡＡ ＧＣＴＴＧＡＧＣＴＡ ＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴ ＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧ
５６０１ ＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧ ＴＧＧＧＣＡＣＣＣＴ ＧＧＧＣＣＴＧＴＧＧ ＧＴＧＣＧＡＣＴＧＣ ＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴ
５６５１ ＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧ ＧＧＣＧＴＧＴＡＣＣ ＡＧＧＣＣＴＡＣＣＣ ＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣ ＴＣＴＡＧＣＣＣＣＣ
５７０１ ＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴ ＴＧＧＣＧＧＡＣＡＡ ＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡ ＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡ ＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣ
５７５１ ＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡ ＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡ ＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣ ＣＧＣＧＡＧＧＡＴＧ ＧＣＡＣＡＧＴＣＧＴ
５８０１ ＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴ ＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣ ＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴ ＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧ ＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡ
５８５１ ＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴ ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣ ＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡ ＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧ ＡＴＴＣＣＴＧＴＧＣ
５９０１ ＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧ ＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴ ＧＴＡＣＧＧＣＴＣＴ ＣＣＴＣＡＣＴＴＣＧ ＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣ
５９５１ ＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣ ＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣ ＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡ ＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣ ＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴ
６００１ ＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡ ＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣ ＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣ ＣＴＣＡＧＡＡＧＧＡ ＣＡＧＣＣＣＴＡＡＣ
６０５１ ＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡ ＣＡＡＧＣＴＧＧＧＧ ＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧ ＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡ ＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴ
６１０１ ＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧ ＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣ ＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴ ＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴ ＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧ
６１５１ ＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧ ＣＡＧＣＧＡＣＣＣＴ ＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧ ＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴ ＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡ
６２０１ ＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴ ＡＣＧＣＣＴＣＴＴＧ ＡＧＡＡＴＧＣＧＧＧ ＣＣＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣ
６２５１ ＣＧＣＴＡＡＴＴＣＴ ＡＧＡＴＣＧＣＧＡＡ ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴ ＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ ＣＡＧＴＡＴＡＣＡＣ
６３０１ ＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴ ＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ ＡＧＡＴＡＴＣＡＣＡ ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧ ＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ
６３５１ ＡＧＧＣＧＡＡＣＡＡ ＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴ ＣＡＣＡＣＴＣＣＡＡ ＧＧＣＴＡＴＴＣＴＡ ＧＡＴＣＧＣＧＡＡＴ
６４０１ ＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣ ＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣ ＡＧＴＡＴＡＣＡＴＴ ＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴ ＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ
６４５１ ＧＡＴＡＴＣＡＴＴＡ ＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴ ＴＡＣＡＴＴＣＣＡＡ ＧＧＣＧＡＡＴＴＡＣ ＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴ
６５０１ ＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧ ＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧ ＧＣＣＣＧＧＧＧＧＴ ＡＣＣＴＣＴＴＡＡＴ ＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴ
６５５１ ＣＡＴＧＧＧＣＣＴＴ ＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧ ＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣ ＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡ ＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣ
６６０１ ＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ ＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴ ＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴ ＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴ ＧＴＧＧＣＣＡＡＴＧ
６６５１ ＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡ ＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣ ＴＧＡＧＡＴＣＴＴＴ ＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣ ＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴ
６７０１ ＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡ ＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴ ＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧ ＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴ ＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡ
６７５１ ＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣ ＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧ ＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡ ＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴ ＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧ
６８０１ ＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡ ＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡ ＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡ ＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡ ＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧ
６８５１ ＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴ ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡ ＴＧＣＣＣＡＴＡＴＧ ＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡ ＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧ
６９０１ ＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡ ＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣ ＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡ ＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴ ＧＣＴＧＴＣＣＡＴＴ
６９５１ ＣＣＴＴＡＴＴＣＣＡ ＴＡＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧ ＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴ ＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴ
７００１ ＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴ ＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣ ＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣ ＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴ ＣＣＴＴＡＣＡＴＧＴ
７０５１ ＴＴＴＡＣＴＡＧＣＣ ＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣ ＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧ ＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡ ＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧ
７１０１ ＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴ ＣＴＴＡＴＧＧＡＧＡ ＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣ ＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡ ＧＣＴＧＴＡＧＡＴＡ
７１５１ ＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧ ＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣ ＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡ ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴ ＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ
７２０１ ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧ ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧ ＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧ ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣ
７２５１ ＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣ ＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ ＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧ ＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡ ＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣ
７３０１ ＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ ＣＴＧＧＣＧＴＡＡ
ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ：３６１５～３７４２ｂｐ
ＣＡＧプロモーター：３７８２～５４５２ｂｐ
ハツカネズミコドン最適化ＦＧＦ２１（ｍｏＦＧＦ２１）：５５８９～６２２１ｂｐ
ｄｍｉＲＴ（４コピーのｍｉＲＴ－１２２ａおよび４コピーのｍｉＲＴ－１）：６２５４～６５１４ｂｐ
ウサギβグロビンポリＡシグナル（ポリＡシグナルを含む、ウサギβ－グロビンの３’ＵＴＲおよび３’隣接領域）：６６７４～６７６４ｂｐ
ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ：７１８１～７３０８ｂｐ
ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｍｏＦＧＦ２１（配列番号４６）
１ ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡ ＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡ ＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣ ＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧ ＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴ
６１ ＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧ ＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣ ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧ ＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴ ＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣ ＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧ
１２１ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧ ＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣ ＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧ ＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣ ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧ
１８１ ＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴ ＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡ ＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡ ＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧ
２４１ ＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣ ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴ ＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣ ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧ ＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡ ＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡ
３０１ ＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣ ＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧ ＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡ ＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡ ＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣ ＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴ
３６１ ＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣ ＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣ ＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧ ＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣ ＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡ ＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣ
４２１ ＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴ ＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴ ＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣ ＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡ ＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧ
４８１ ＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧ ＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡ ＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴ ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣ ＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡ ＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣ
５４１ ＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴ ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡ ＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧ ＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧ ＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡ ＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡ
６０１ ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧ ＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡ ＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣ ＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴ ＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧ ＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧ
６６１ ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴ ＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡ ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣ ＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡ ＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧ ＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴ
７２１ ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣ ＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴ ＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡ ＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴ ＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧ ＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣ
７８１ ＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡ ＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴ ＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣ ＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡ ＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧ ＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ
８４１ ＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧ ＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴ ＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧ ＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧ ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ ＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡ
９０１ ＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡ ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ ＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡ ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴ ＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴ
９６１ ＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡ ＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣ ＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴ ＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴ ＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣ ＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣ
１０２１ ＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡ ＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣ ＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡ ＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣ ＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣ ＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴ
１０８１ ＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣ ＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡ ＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧ ＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧ ＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣ ＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴ
１１４１ ＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡ ＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡ ＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡ ＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧ ＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣ ＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧ
１２０１ ＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡ ＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧ ＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴ ＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴ ＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣ ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴ
１２６１ ＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣ ＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴ ＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧ ＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴ ＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴ
１３２１ ＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧ ＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴ ＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡ ＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴ ＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣ ＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣ
１３８１ ＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧ ＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡ ＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡ ＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡ ＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴ
１４４１ ＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧ ＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴ ＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡ ＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧ ＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴ ＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧ
１５０１ ＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧ ＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡ ＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴ ＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴ ＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧ ＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧ
１５６１ ＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴ ＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡ ＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡ ＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡ ＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣ ＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴ
１６２１ ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴ ＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡ ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧ ＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡ ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡ ＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣ
１６８１ ＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣ ＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧ ＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣ ＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴ ＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴ
１７４１ ＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣ ＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡ ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴ ＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴ ＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴ
１８０１ ＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧ ＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧ ＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴ ＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡ ＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧ ＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧ
１８６１ ＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴ ＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴ ＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴ ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡ ＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴ
１９２１ ＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡ ＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴ ＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴ ＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡ ＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴ ＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧ
１９８１ ＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣ ＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴ ＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣ ＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡ ＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴ ＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡ
２０４１ ＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡ ＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴ ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧ ＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧ ＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴ
２１０１ ＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡ ＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧ ＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧ ＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡ ＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣ
２１６１ ＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣ ＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡ ＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡ ＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧ ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧ ＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴ
２２２１ ＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡ ＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧ ＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣ ＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧ ＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧ
２２８１ ＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡ ＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣ ＡＧＧＣＧＡＴＴＣＣ ＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴ ＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡ
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２５２１ ＧＴＡＡＡＧＡＴＴＣ ＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡ ＧＡＡＡＧＧＣＣＧＧ ＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡ ＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡ ＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴ
２５８１ ＣＡＡＣＣＧＴＴＣＴ ＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡ ＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧ ＡＧＡＧＧＧＴＡＧＣ ＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧ ＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣ
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２７６１ ＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴ ＧＴＡＴＡＡＧＣＡＡ ＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴ ＴＧＴＡＡＧＣＧＴＴ ＡＡＴＡＴＴＴＴＧＴ ＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣ
２８２１ ＧＴＴＡＡＡＴＴＴＴ ＴＧＴＴＡＡＡＴＣＡ ＧＣＴＣＡＴＴＴＴＴ ＴＡＡＣＣＡＡＴＡＧ ＧＣＣＧＡＡＡＴＣＧ ＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣ
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３０６１ ＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧ ＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧ ＡＴＴＴＡＧＡＧＣＴ ＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡ ＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡ
３１２１ ＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡ ＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡ ＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡ ＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣ ＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴ
３１８１ ＡＧＣＧＧＴＣＡＣＧ ＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡ ＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴ ＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣ ＴＡＣＡＧＧＧＣＧＣ
３２４１ ＧＴＡＣＴＡＴＧＧＴ ＴＧＣＴＴＴＧＡＣＧ ＡＧＣＡＣＧＴＡＴＡ ＡＣＧＴＧＣＴＴＴＣ ＣＴＣＧＴＴＡＧＡＡ ＴＣＡＧＡＧＣＧＧＧ
３３０１ ＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧ ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴ ＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴ ＴＡＧＡＣＡＧＧＡＡ ＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡ ＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧ
３３６１ ＡＡＧＴＧＴＴＴＴＴ ＡＴＡＡＴＣＡＧＴＧ ＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡ ＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴ ＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡ ＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡ
３４２１ ＣＣＧＴＴＧＴＣＧＣ ＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴ ＴＧＡＴＴＡＧＴＡＡ ＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴ ＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡ ＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡ
３４８１ ＡＡＣＴＡＴＣＧＧＣ ＣＴＴＧＣＴＧＧＴＡ ＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡ ＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣ ＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴ ＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴ
３５４１ ＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣ ＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴ ＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴ ＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣ ＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ ＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣ
３６０１ ＡＣＴＧＡＧＧＣＣＣ ＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣ ＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧ ＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡ ＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴ
３６６１ ＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴ ＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣ ＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧ ＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡ ＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣ
３７２１ ＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡ ＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣ ＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡ ＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣ ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡ ＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴ
３７８１ ＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴ ＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ ＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧ ＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡ ＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴ ＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣ
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３９６１ ＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴ ＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧ ＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴ ＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡ ＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴ ＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴ
４０２１ ＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣ ＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧ ＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴ ＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡ ＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡ ＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣ
４０８１ ＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧ ＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴ ＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧ ＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡ ＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡ ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡ
４１４１ ＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧ ＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴ ＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧ ＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴ ＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣ ＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣ
４２０１ ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴ ＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣ ＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴ ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴ ＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴ ＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧ
４２６１ ＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧ ＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧ
４３２１ ＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡ ＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧ ＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡ ＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡ ＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴ ＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴ
４３８１ ＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧ ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧ ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ ＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡ ＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣ ＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
４４４１ ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧ ＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣ ＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣ ＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧ ＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧ ＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣ
４５０１ ＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣ ＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴ ＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧ ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣ ＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧ
４５６１ ＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴ ＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧ ＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴ ＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴ ＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣ
４６２１ ＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣ ＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧ ＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣ ＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧ ＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧ ＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧ
４６８１ ＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧ ＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣ ＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣ ＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ ＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣ
４７４１ ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧ ＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣ ＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧ ＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣ ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣ
４８０１ ＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧ ＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧ ＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣ ＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧ ＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴ
４８６１ ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡ ＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧ ＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣ ＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧ ＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣ ＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣ
４９２１ ＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴ ＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧ ＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣ ＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧ ＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧ ＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣ
４９８１ ＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧ ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ ＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣ
５０４１ ＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣ ＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴ ＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧ ＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣ ＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ
５１０１ ＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧ ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡ ＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴ ＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡ ＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡ ＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧ
５１６１ ＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧ ＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴ ＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣ ＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧ ＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣ
５２２１ ＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣ ＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣ ＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧ ＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧ ＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴ
５２８１ ＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧ ＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧ ＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴ ＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧ
５３４１ ＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣ ＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧ ＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧ ＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣ ＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣ ＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧ
５４０１ ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡ ＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡ ＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡ ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣ ＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣ ＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧ
５４６１ ＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧ ＧＴＴＡＴＴＧＴＧＣ ＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡ ＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡ ＧＡＡＴＴＧＡＴＴＡ ＡＴＴＣＧＡＧＣＧＡ
５５２１ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＧ ＴＣＧＣＴＣＧＧＴＡ ＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴ ＴＧＡＡＴＴＧＧＣＣ ＴＣＧＡＧＣＧＣＡＡ ＧＣＴＴＧＡＧＣＴＡ
５５８１ ＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴ ＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧ ＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧ ＴＧＧＧＣＡＣＣＣＴ ＧＧＧＣＣＴＧＴＧＧ ＧＴＧＣＧＡＣＴＧＣ
５６４１ ＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴ ＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧ ＧＧＣＧＴＧＴＡＣＣ ＡＧＧＣＣＴＡＣＣＣ ＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣ ＴＣＴＡＧＣＣＣＣＣ
５７０１ ＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴ ＴＧＧＣＧＧＡＣＡＡ ＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡ ＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡ ＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣ ＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡ
５７６１ ＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡ ＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣ ＣＧＣＧＡＧＧＡＴＧ ＧＣＡＣＡＧＴＣＧＴ ＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴ ＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣ
５８２１ ＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴ ＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧ ＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡ ＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴ ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣ ＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡ
５８８１ ＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧ ＡＴＴＣＣＴＧＴＧＣ ＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧ ＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴ ＧＴＡＣＧＧＣＴＣＴ ＣＣＴＣＡＣＴＴＣＧ
５９４１ ＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣ ＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣ ＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣ ＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡ ＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣ ＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴ
６００１ ＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡ ＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣ ＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣ ＣＴＣＡＧＡＡＧＧＡ ＣＡＧＣＣＣＴＡＡＣ ＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡ
６０６１ ＣＡＡＧＣＴＧＧＧＧ ＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧ ＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡ ＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴ ＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧ ＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣ
６１２１ ＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴ ＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴ ＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧ ＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧ ＣＡＧＣＧＡＣＣＣＴ ＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧ
６１８１ ＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴ ＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡ ＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴ ＡＣＧＣＣＴＣＴＴＧ ＡＧＡＡＴＧＣＧＧＧ ＣＣＣＧＧＴＡＣＣＣ
６２４１ ＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣ ＣＴＡＡＣＴＧＧＣＣ ＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴ ＴＣＣＧＣＴＣＡＣＴ ＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣ ＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡ
６３０１ ＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧ ＣＣＡＧＴＣＡＧＧＴ ＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣ ＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧ ＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧ ＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴ
６３６１ ＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣ ＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡ ＣＴＧＡＧＡＴＣＴＴ ＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧ ＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡ ＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣ
６４２１ ＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣ ＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴ ＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣ ＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡ ＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴ ＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡ
６４８１ ＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡ ＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧ ＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣ ＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴ ＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣ ＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡ
６５４１ ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡ ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴ ＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴ ＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴ ＡＴＧＣＣＣＡＴＡＴ ＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣ
６６０１ ＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧ ＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡ ＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴ ＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡ ＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣ ＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴ
６６６１ ＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣ ＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣ ＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡ ＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴ ＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴ ＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧ
６７２１ ＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴ ＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣ ＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴ ＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧ ＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣ ＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣ
６７８１ ＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴ ＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣ ＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴ ＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣ ＴＣＴＴＡＴＧＧＡＧ ＡＴＣＣＣＴＣＧＡＣ
６８４１ ＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡ ＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴ ＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧ ＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴ ＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣ ＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣ
６９０１ ＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡ ＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣ ＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣ ＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧ ＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣ
６９６１ ＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣ ＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧ ＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣ ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣ ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡ
７０２１ ＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡ
ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ：３６０１～３７４２ｂｐ
ＣＡＧプロモーター：３７７９～５４２３ｂｐ
ハツカネズミコドン最適化ＦＧＦ２１（ｍｏＦＧＦ２１）：５５８８～６２２１ｂｐ
ウサギβグロビンポリＡシグナル（ポリＡシグナルを含む、ウサギβ－グロビンの３’ＵＴＲおよび３’隣接領域）：６３１５～６８３３ｂｐ
ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ：６８９２～７０２４ｂｐ
Ｍｉｎｉ－ＣＭＶ：ｃｍｖ中間初期プロモーター（配列番号３６）
ＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴ
ＥＦ１αプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号３７）
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ＲＳＶプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号３８）
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シナプシン１プロモーター（配列番号３９）
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カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター（配列番号４０）
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グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（配列番号４１）
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ネスチンプロモーター（配列番号４２）
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ホメオボックスタンパク質９プロモーター（ＨＢ９）プロモーター（配列番号４３）
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チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター（配列番号４４）
ＣＴＧＣＴＡＧＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＴＴＡＡＡＧＣＣＴＣＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＡＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＡＧＡＡＣＡＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＣＴＴＡＡＧＧＧＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＣＴＡＡＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＴＴＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧＣＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡＴＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＣＴＴＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＣＧＡＡＴＴＡＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＡＡＴＣＣＡＣＡＴＴＣＧＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＴＴＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＣＧＴＣＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＴＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＴＴＧＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＡＣＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＴＧＧＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＧＡＧＡＣＡＧＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＡＴＡＧＴＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＧＴＴＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＧＴＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＴＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＧＧＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＴＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＴＧＧＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＡＧＴＧＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＧＧＧＣＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＴＡＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＡＧＣＡＴＡＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴＡＧＴＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＡＧＡＣＣＴＴＧＧＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＧＡＴＣＡＣＴＧＡＧＴＧＣＧＣＣＣＴＴＡＣＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＡＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＴＡＣＴＣＴＴＡＡＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＴＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＣＴＴＡＧＡＴＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＴＡＧＴＡＴＡＣＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＧＡＧＡＧＧＧＣＴＣＣＴＡＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＴＡＴＡＴＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＧＣＴＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＴＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＧＴＧＴＣＴＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＧＣＣＴＣＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＣＧＣＡＧＧＡＧＧＴＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＣＡＣＴ
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター（配列番号４５）
ｃａｃｃｇｔｇｇｃｔｔｔａａｃａｃｔｔａｇａｇａａａａｔｇｃａｔｃｃｃｃｔｃｔａａｔｃａａｔａａｇｔｃａｔｃｇａｃａｇｔｇｇｇｔａｇａｔｇｇａｇｇａａｃｇｇｃａｇｔｇｃｇｔａｇｔａｇｇａｔｇｃｇｔｇｃａａｇｃａｔａｇｔｃｔｃｇｔｇｃａｔｇｇｇｔｇｃａｔａｇａｔｃｇｃｔｇｇｇｃａｇｇｔｇｇａｃａａｇｇｔｇｇｇｇｇｔｇｇａｔａａａｇａａｇｔｇｇｇｔａｇａｔｇａｔｔｇａｔｇｔｔａｇｇｔａａａｔａｔｃａｃｔｇｇｇｔｇｇａｃａｇａｔｇｇｇｔｇｇｔａｇｇｔｇｇａｔｇｇａｔｇｇｔｔａｇａａｔａｇｔｃａｇａａｇａｇｇｇａｔｇｇａｔｔｇａｔａａｇｇｔｇａａｃａｇａｔｇａｔａａａｔｇｇｇｔｇａｔａｇａｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔｃａａａａｇａｇｇａｔａａｇｇｇａａｇｔｇｔｇａｇｃｔａｇｃｃｇｔａｔｔｔｃｔａａｇｇｔｃａｇｔａａｔａｇａｇｔｔｇｇｇａｇａａｇａｇｇｔｔａａｇｔｔａｃａｔｃｃａｔｔｔａａａｃｃｔｃａｃａｃｇａａｇｃｔｇａｇａｇｇｇａａｔｇｇａｃｔｔｇｃｔｇｃｃｇｔｔｇｇｔｇａｇｇａａａｇｃｇｔｔｇｃａｔｔｔｃｃｃｇｔｇｔｇｃｔｔｇｇｔｔｇｔｇａａｇｔｇｃｔｃａｇｇｔｃｃｃａｃａｔｇａａｇｃａｇｔｃａｇｇｔｔａｃｔｇｃｇｇｃｔｔａｃａｇａｇｇａｇｃｃａｇａｔｃｃａａａｔｇｃｃｃｃｇａｇｔａａｇｃａｃｇｔｃｃｃｃｇａｇｃｃａｇａｇｇｃｃｔｃｃａｇｃｇｇａａｔｃｃｇｇｇａｇａｇｇｇａｔｔｇｃｔｃａｇｔｇｃｃｃｔｇｃｔｔｃｃｃｔｇｇａｃｔｇｔａａｇｃｔｇｃａｇａａａｇａｔｇｔｇｇｇａａｇｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃｃａｃｔｇａｇａａｃａｃｔａａａａｇｃａｃｃｔｔｔｔｇｔｃａａａｃｇａｃｃｇｃｔｔｃａｃａｔｃｔｇｇｇｇｃｔｔｇｔｇｃａｃｔｇｇｔｇｇｃｃｔｔｔｔａａａｃｃａｇａｇａｃａａｃｃｃａｃａａｇａｔａｃｃｔａａｃｃｔｇｃｇｇｇｇｃｔｃｔｃｔｇｇｔａｃａｇｔｇａｇｃａａｃｔｃａｇｇａａａｔｇｃｔｔｔｇｇｃｔｔｇａｔｔｇｃｔｇｔｇｇｇｃｔｃｔｃａｇｇｃｃａｔｃｇｃｃｃｔｃｔｇｇａｇｔｇｇｔｔｃｔｔｔｔａａｔｇａｇａａｃｃｔｇａａｇａｔｔｇｇｃｃｃｃｔｇａｇｃｃａｔｇｔａｔａｃｃａａｇｃａａｇｃｔｃａａｔｃｃａｇｇｔｔａｇｃｔｃｃｃｔｃｔｇｇｔｔｇｇｇｇｃａａｇｃｔａａｃｇｔｇｃｔｃｃｔｔｇｇｇｃｃｃｃｇｃｇｃｇｔａａｃｔｇｔｇｃｇｔｔｔｔａｔａｇｇａｇａｃａｇｃｔａｇｔｔｃａａｇａｃｃｃｃａｇｇａａｇａａａｇｃｇｇｃｔｔｔｇｔｃｃｃｃｃｔｃｔａｇｇｃｃｔｃｇｔａｃａｇｇｃｃｃａｃａｔｔｃａｔａｔｃｔｃａｔｔｇｔｔｇｔｔｇｃａｇｇｇｇａｇｇｃａｇａｔｇｃｇａｔｃｃａｇａａｃａａｔｇｇｇａｃｃｔｃｇｇｃｔｇａｇｇａｃａｃｇｇｃｇｇｔｇａｃａｇａｃｔｃｃａａｇｃａｃａｃａｇｃａｇａｃｃｃａａａｇａａｔａａｃｔｇｇｃａａｇｇｃｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｔｇａｃｃｃａｇｇｇａａｃｃｇｃｃｃｃｃａｃｔｔｇａｔｃｃｇｃｃｔｃｔｔｔｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｃｃｃｇｇｇａａｇｇｇａｇｇａｃａａｃａｃｃｔｔｃａａａｇａｃａｇｇｃｃｃｔｃａｇａｇｔｃｃｇａｃｇａｇｃｔｔｃａｇａｃｃａｔｃｃａａｇａａｇａｔｃｃｃａｃａｇｃａｇｃｔｔｃｃｇａａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇｔｃｇａｃｇｇｔａｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃｇｇｇａｔｃ

Claims (16)

  1. 代謝障害の治療および／または予防に使用するための、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物であって、前記療法が、中枢神経系（ＣＮＳ）、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の前記遺伝子構築物の発現を含む遺伝子構築物。
  2. ＦＧＦ２１をコードする前記ヌクレオチド配列が、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の使用のための遺伝子構築物。
  3. 前記ユビキタスプロモーターが、ＣＡＧプロモーターおよびＣＭＶプロモーターからなる群から選択され、好ましくは前記ユビキタスプロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項１または請求項２に記載の使用のための遺伝子構築物。
  4. ＦＧＦ２１の発現が防止されることが望まれる組織に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  5. マイクロＲＮＡの前記少なくとも１つの標的配列が、哺乳動物の心臓および／または肝臓に発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  6. ＦＧＦ２１をコードする前記ヌクレオチド配列が、ユビキタスプロモーターに、ならびに肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列に、および心臓に発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列に作動可能に連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  7. 心臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が、配列番号１３および２１～２５から選択され、肝臓に発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が、配列番号１２および１４～２０から選択される、請求項５または６に記載の使用のための遺伝子構築物。
  8. マイクロＲＮＡ－１２２ａの標的配列とマイクロＲＮＡ－１の標的配列とを含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  9. ＦＧＦ２１をコードする前記ヌクレオチド配列が、以下からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物：
    （ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；および
    （ｃ）遺伝暗号の縮重に起因して配列が（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列。
  10. 代謝障害の治療および／または予防に使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む発現ベクターであって、前記療法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の前記遺伝子構築物の発現を含む発現ベクター。
  11. 前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１０に記載の使用のための発現ベクター。
  12. 前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択され、好ましくは、前記発現ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１０または１１に記載の使用のための発現ベクター。
  13. 前記発現ベクターが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ１０、ｒｈ８、Ｃｂ４、ｒｈ７４、ＤＪ、２／５、２／１、１／２またはＡｎｃ８０のアデノ随伴ウイルスベクターであり、好ましくは、前記発現ベクターが、血清型１、２または９のアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
  14. 代謝障害の治療および／または予防に使用するための、１つ以上の薬学的に許容される成分とともに、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物および／または請求項１０～１３のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む医薬組成物であって、前記療法が、ＣＮＳ、好ましくは脳、さらに好ましくは視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球、最も好ましくは視床下部内の前記遺伝子構築物の発現を含む医薬組成物。
  15. 前記遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物がＣＳＦ内投与によって投与される、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物および／または請求項１０～１３のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクターおよび／または請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
  16. 前記代謝障害が糖尿病および／または肥満である、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物および／または請求項１０～１３のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクターおよび／または請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
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