CN116376921A - 一种用于治疗糖尿病的aav载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含编码GLP‑1受体激动剂的多核苷酸表达盒、质粒及AAV载体，有望为糖尿病的治疗提供一种安全、长效的基因治疗方案。

Description

一种用于治疗糖尿病的AAV载体及其用途
技术领域
本发明涉及基因治疗领域，具体涉及一种用于治疗糖尿病的腺相关病毒载体及其用途。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害和功能障碍。根据病理机制的不同，糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依赖)和II型糖尿病(非胰岛素依赖)。据估计，全世界有超过3.7亿的糖尿病患者，其中约90％患有2型糖尿病。患者特征为高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等，2型糖尿病患者仍产生胰岛素，但是胰岛素不能被身体细胞有效地使用，这与1型糖尿病中的绝对胰岛素缺乏大不相同，后者是因为胰岛细胞损坏所导致的。2型糖尿病的主要治疗方式为胰岛素及降糖药的使用，常见降糖药如双胍类、磺酰脲类(sulfonylureas)、噻唑烷二酮类(thiazolidinedione)、DPP-4受体抑制剂、SGLT-2受体抑制剂、GLP-1类似物等。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是来源于胰高血糖素原基因的31-氨基酸肽。它由肠道内的L细胞分泌并响应食物摄入而释放，从而诱导来自胰腺β细胞的胰岛素分泌。GLP-1可以促进葡萄糖浓度依赖性的胰岛素分泌、促进胰岛素合成；抑制胰高血糖素分泌；通过促进胰岛β细胞的分化及增殖、抑制其凋亡，而使胰岛β细胞数量增多；通过作用于摄食中枢产生饱胀感、作用于胃抑制胃排空，从而减少进食量及减轻体重。但是天然GLP-1由于在体内容易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)降解，在体内血浆中的半衰期很短(仅几分钟)，每天必须注射两次甚至更多，难以在临床上被广泛使用。为了提高天然GLP-1在体内的循环时间，目前临床上已开发和上市了长效然GLP-1的类似物，例如一天两次的皮下注射给药-艾塞那肽，一天一次皮下注射给药-利拉鲁肽、利司那肽，一周一次皮下注射给药的杜拉鲁肽、阿必鲁肽和索马鲁肽。除此之外，礼来开发了一种GLP-1和GIP的双重受体激动剂Tirzepatide(WO2016111971A)，通过在分子结构中进行脂肪链的修饰以增加半衰期，目前处于III期临床阶段。由于糖尿病患者一经诊断后必须长期持续给药，并且终生接受治疗，因此对于该类制剂的安全性、经济性和使用便利性的要求都是极其迫切的。尽管目前采用了许多努力来解决这个技术难题，但是目前上市或临床中的药物仍然需要频繁给药，给患者带来极大的不变。因此对于提供一种长效、安全、经济的糖尿病治疗方案仍然具有迫切需求。
发明内容
为解决现有技术糖尿病治疗方案中给药频繁，以及可能存在的毒副作用等问题，本发明提供了一种长效、安全的基因治疗方案。
本发明一方面在于提供一种多核苷酸表达盒，所述多核苷酸表达盒包含编码GLP-1受体激动剂的转基因，和位于转基因侧翼的反向末端重复序列(ITR)。
在一些实施方案中，本发明所述GLP-1受体激动剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或与其至少具有80％同源性的序列；在一些优选的实施方案中，所述GLP-1受体激动剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。
在一些实施方案中，本发明所述编码GLP-1受体激动剂的转基因序列如SEQ IDNO：8(DL0)。在一些优选的实施方案中，本发明所述编码GLP-1受体激动剂的转基因经过密码子优化，具有如SEQ ID NO：2(DL3)、SEQ ID NO：3(DLJ)、SEQ ID NO：4(DL2)、SEQ ID NO：5(DL4)、SEQ ID NO：6(DL5)、SEQ ID NO：7(DL6)或SEQ ID NO：9(DLS)所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明所述多核苷酸表达盒进一步包含启动子，所述启动子选自CBA启动子、CMV启动子、EF1A启动子、MHCK7启动子、tMCK启动子、MCK启动子、HSA启动子、CK8启动子或他们的组合。
在一些具体的实施方案中，所述CBA启动子具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；所述CMV启动子具有如SEQ ID NO：10(CMV-1)、SEQ ID NO：11(CMV-2)或SEQ IDNO：12(CMV-3)所示的核苷酸序列；所述EF1A启动子具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；所述MHCK7启动子具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；所述tMCK启动子具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；所述MCK启动子具有如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；所述HSA启动子具有如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；所述CK8启动子具有如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；或与上述核苷酸序列至少具有80％同源性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明所述多核苷酸表达盒进一步包含编码信号肽的序列，所述信号肽选自GLP-1受体激动剂天然信号肽(WT)、人含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(SPARC)、人乳铁运蛋白、人组织蛋白酶L1、人组织蛋白酶B、人补体C3、人光蛋白聚糖(lumican)或合成信号肽。
在一些具体的实施方案中，所述天然信号肽具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；所述人含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白信号肽具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；所述人乳铁运蛋白信号肽具有如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；所述人组织蛋白酶L1信号肽具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；所述人组织蛋白酶B信号肽具有如SEQ IDNO：23所示的氨基酸序列；所述人补体C3信号肽具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；所述人光蛋白聚糖信号肽具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；所述合成信号肽具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；或与上述氨基酸序列至少具有80％同源性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明所述多核苷酸表达盒进一步包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸选自HGH、SV40、BGH或兔β-珠蛋白。
在一些具体的实施方案中，所述HGH具有如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列；所述SV40具有如SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列；所述BGH具有如SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列；所述兔β-珠蛋白具有如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列；或与上述核苷酸序列至少具有80％同源性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述多核苷酸表达盒包含CBA启动子、天然信号肽、转基因DLJ、兔β-珠蛋白多聚腺苷酸。在一些具体的实施方案中，所述表达盒包含CBA启动子、天然信号肽、转基因DL2、兔β-珠蛋白多聚腺苷酸。在一些具体的实施方案中，所述表达盒包含CMV-1启动子、天然信号肽、转基因DLJ、HGH多聚腺苷酸。在一些具体的实施方案中，所述表达盒包含CMV-1启动子、天然信号肽、转基因DLJ、BGH多聚腺苷酸。在一些具体的实施方案中，所述表达盒包含CBA启动子、天然信号肽、转基因DL3、兔β-珠蛋白多聚腺苷酸。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸表达盒进一步包含转录后调节原件，在一些优选的实施方案中，所述转录后调节原件为土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)，其核酸序列如SEQ ID NO：32。
在一些实施方案中，本发明所述ITR是血清型的腺相关病毒ITR，选自AAV 1ITR，AAV2ITR，AAV 3ITR，AAV 4ITR，AAV 5ITR，AAV 6ITR，AAV 7ITR，AAV 8ITR，AAV 9ITR，AAV10ITR，AAV 11ITR和AAV 12ITR。
本发明另一方面在于提供一种质粒，所述质粒包括前述的多核苷酸表达盒。
本发明另一方面在于提供一种重组腺相关病毒载体，所述腺相关病毒病毒载体包括：
(a)腺相关病毒衣壳蛋白；
(b)包装进入衣壳蛋白的多核苷酸表达盒，所述多核苷酸表达盒包含编码GLP-1受体激动剂的转基因。
所述腺相关病毒病毒载体前述的多核苷酸表达盒和腺相关病毒衣壳蛋白。
在一些实施方案中，本发明所述的腺相关病毒病毒载体中，所述衣壳蛋白为血清型衣壳蛋白，选自AAV 1，AAV 2，AAV 3，AAV 4，AAV 5，AAV 6，AAV 7，AAV 8，AAV 9，AAV10，AAV 11，AAV 12或前述任一项衣壳蛋白的变体。在一些优选的实施方案中，所述衣壳蛋白选自AAV 1，AAV 5，AAV 8，AAV 9或AAV 10。在一些更优选的实施方案中，所述所述衣壳蛋白选自AAV 5或AAV 8。
在一些实施方案中，本发明所述的腺相关病毒病毒载体中，所述多核苷酸表达盒具有前述的多核苷酸表达盒。
本发明另一方面在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含前述的多核苷酸表达盒、质粒或重组腺相关病毒和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述药物组合物被制备成用于静脉注射、皮下注射、肌肉注射、唾液腺注射、脾脏注射的剂型。
本发明另一方面在于提供本发明前述的多核苷酸表达盒，质粒或者重组腺相关病毒载体在用于制备用于治疗糖尿病或者肥胖的药物中的用途。
本发明另一方面在于提供一种用于治疗糖尿病或肥胖的方法，包括给予治疗有效量的本发明前述的多核苷酸表达盒，质粒，或者重组腺相关病毒载体。
在一些实施方案中，所述治疗方法通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、唾液腺注射或脾脏注射给药。
在一些实施方案中，根据本发明前述的用途或者治疗方法，所述糖尿病为1型或2型糖尿病。
附图说明
图1为质粒构建示意图；
图2为AAV5衣壳血清型病毒载体肌肉注射体内GLP1-Fc持续表达情况；
图3为不同衣壳血清型病毒载体肌肉注射体内GLP1-Fc持续表达情况；
图4为病毒载体腮腺注射体内GLP1-Fc持续表达情况；
图5为病毒载体尾静脉注射体内GLP1-Fc持续表达情况；
图6A-6C为AAV5-KH13病毒载体肌肉注射表达、血糖及体重变化情况；
图7A-7C为AAV8-KH1病毒载体肌肉注射表达、血糖及体重变化情况；
图8A-8B为小鼠4h饥饿血糖情况；
图9A-9B为小鼠IPGTT测定结果。
本发明详述
在本发明中，下述术语具有如下定义。
本文所述“启动子”指引导RNA聚合酶结合并且由此促进RNA合成的DNA序列。启动子和对应的蛋白质表达可以是普适性的(意指在细胞、组织和物种中具有强活性)或具有细胞特异性、组织特异性或物种特异性。
术语“反向末端重复序列(ITR)”指用于复制、包装AAV病毒的ITR序列。
术语“可操作地连接”是指遗传元件以允许它们以预期方式操作的关系并置。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则将其可操作地连接至编码区域。只要维持该功能，在启动子和编码区之间可以存在中间残基。
术语“AAV”是腺相关病毒的缩写，用于指病毒本身或其衍生物。所述术语包括所有病毒亚型以及天然、重组形式存在的病毒。包含AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-7)、AAV8型(AAV-8)、9型(AAV-9)、10型(AAV-10)、11型(AAV-11)、12型(AAV-12)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV以及绵羊AAV。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类动物的AAV等。
术语“变体”指参考核苷酸或氨基酸的突变体，例如相对于天然核苷酸或氨基酸的序列具有至少具有一个核苷酸或氨基酸的差异(如氨基酸或核苷酸的插入、取代、删除)。
术语“包括”指除了主题中所必须的元素，还可以包括主题中未提及的元素。例如对于包括启动子的多核苷酸表达盒，可以包含除了启动子之外其他的元素(如ITR、增强子、内含子、编码基因、多腺苷酸序列等)。
术语“多腺苷酸化序列”、“多腺苷酸化区”、“聚腺苷酸化信号”包括核酸内切酶切割RNA转录物所需的识别区域，随后是聚腺苷酸化共有序列AATAAA。多腺苷酸化序列提供PolyA位点，即RNA转录物上的位点，通过转录后聚腺苷酸化将腺嘌呤残基添加到该位点。
术语“Kozak序列”指位于真核生物mRNA5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。在蛋白质起始翻译中起作用。
术语“同源性”指当两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列进行比对时，氨基酸序列或者碱基序列相似的程度，以百分比计，如85％、90％、95％、99％、100％。
术语“宿主细胞”指用载体转导、感染、转染或转化的细胞。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。应理解，术语“宿主细胞”是指原始转导、感染、转染或转化的细胞和其子代。
多核苷酸表达盒
本文所述的”核酸”或“核苷酸”指代的是DNA或RNA。
本文所述的“转基因”是指对体内或体外基因产物(例如抗体、蛋白、多肽等)进行编码的核苷酸序列。也就是说转基因可以对目标多肽或蛋白的氨基酸结构进行编码。
本文所述的”多核苷酸表达盒”是指包括两个或多个功能性编码序列并且彼此之间可操作性地连接。编码序列如调节元件、翻译起始序列、编码序列、终止序列等。通常编码序列由DNA构成。
本发明所述的多核苷酸表达盒，包含编码GLP-1受体激动剂的转基因。GLP-1受体激动剂与GLP-1受体结合后，可刺激胰岛β细胞分泌胰岛素和抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，发挥降血糖左右。本发明所述的GLP-1受体激动剂可以是天然的GLP-1，例如来自于人的GLP-1多肽(贝那鲁肽)，或来自于美洲毒蜥唾液中的Exendin-4(艾塞那肽)，也可以是天然GLP-1的类似物，例如利司那肽或者杜拉鲁肽等。在一个具体的实施方案中，本发明所述的GLP-1受体激动剂选自杜拉鲁肽，其为天然GLP-1类似物和人免疫球蛋白重链IgG4-Fc片段融合得到，记为GLP-1-Fc或GLP1-Fc。
本发明所述的编码GLP-1受体激动剂的转基因可以是对所期望的GLP-1受体激动剂的功能性片段或变体进行编码的任何核苷酸序列，所期望的GLP-1受体激动剂可以用于预防或治疗疾病或病症。
本发明术语“密码子优化”指对同一编码产物的核酸序列，用同义密码子序列进行修饰，例如采用在靶细胞或物种中高频表达的密码子替换低频表达的密码子，目的在于增强转基因在靶细胞、组织或物种中的表达水平。任意的能够有助于提高目的基因在靶细胞或物种中表达同一编码产物的核酸修饰，均属于本发明密码子优化的范畴。
在本发明的一些实施例中，可以使用密码子优化将编码序列设计用于更好地表达GLP-1受体激动剂。编码序列是对用于转录和翻译的氨基酸进行编码的mRNA序列的一部分。在转录和翻译过程中，61个核苷酸密码子中的每三个核苷酸密码子被转录和翻译成20个氨基酸中的任一个氨基酸。然而，不同的细胞类型和不同的动物物种对相同氨基酸进行编码的tRNA频率不同。当基因序列含有不频繁表达的密码子时，核糖体转录机制可能会减慢，从而阻碍有效转录。因此本领域技术人员可以通过“密码子优化”来改善转基因的表达水平，同时又不改变由所述转基因编码的蛋白质或多肽的氨基酸序列。密码子优化的编码序列可以通过各种不同的方法来设计。这种优化可以使用在线提供的方法、公开的方法或提供密码子优化服务的公司来进行。
本发明所述的多核苷酸表达盒，进一步包含信号肽编码序列。本发明所述“信号肽”是指能引导编码的多肽或蛋白质向分泌通路转移的短肽(长度5-30个氨基酸)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。信号肽位于编码的多肽或者蛋白的N端。信号肽的实例包括GLP-1天然信号肽(WT)、人含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(SPARC)、人乳铁运蛋白、人组织蛋白酶L1、人组织蛋白酶B、人补体C3、人光蛋白聚糖(lumican)或合成信号肽等。
本发明所述的多核苷酸表达盒，包含反向末端重复序列(ITR)。通常，ITR序列的长度约为145bp。优选地，分子中基本上使用了编码ITR的整个序列，以及本领域技术人员根据本领域的常规技术手段对这些ITR序列的修饰。在本申请中使用ITR分子的一个实例是包含转基因的“顺式”质粒，其中转基因序列和相关的调控元件侧接5'和3'AAV ITR序列。在一些实施方案中，编码转基因的序列在AAV ITR的侧面(例如，在方向5’-ITR-转基因-ITR-3’)。AAV ITR序列可以从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施例中，AAV ITR选自由AAV 1ITR，AAV 2ITR，AAV 3ITR，AAV 4ITV，AAV 5ITR、AAV 6ITR，AAV7ITR，AAV 8ITR，AAV 9ITV，AAV 10ITR，AAV 11ITR和AAV 12ITR组成的组。在优选的实施例中，AAV ITR选自AAV 2ITR。
本发明所述的多核苷酸表达盒进一步包含表达调控元件，所述表达调控元件可操作性地连接与所述编码GLP-1受体激动剂的转基因。术语“表达调控元件”是指调控与之可操作地相连的转基因的表达的一段核酸序列。当一段表达调控元件控制和调控一段转基因的转录和/或翻译时，所述表达调控元件就与所述转基因序列“可操作地连接”。因此，表达调控元件可包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号和终止密码子。术语“表达调控元件”在最低限度上意图包括一段为了影响表达而存在的序列，也可包括其他有利组件。该术语还可包括将框内外不想要的可能的起始密码子从所述序列中除去的核酸序列设计。其还可包括将不想要的可能的剪接位点除去的核酸序列设计。其还可包括指引添加多聚腺苷酸化或polyA的序列。
在一些实施方案中，本发明所述的表达调控元件包含启动子。所述启动子是广泛存在与细胞、组织或物种中具有活性的启动子。所述启动子促进体内或体外特定细胞或组织中转基因的表达。在一些实施方式中，启动子的实例包含鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)、巨细胞病毒启动子(CMV)、延伸因子1α启动子(EF1α)、MNT启动子、MHCK7启动子、tMCK启动子、MCK启动子、HSA启动子、CK8启动子、CAG启动子、RPE65启动子、视蛋白启动子或他们的组合。
在一些实施方案中，本发明所述的表达调控元件包含增强子。增强子是DNA上一小段可与蛋白质结合的区域，与蛋白质结合之后，基因的转录作用将会加强。其可位于转基因的上游也可位于转基因下游。适合的增强子的实例尤其包括(例如)甲型胎儿蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP(TH结合球蛋白启动子/α1微球蛋白/双库尼(bikunin)增强子)、巨细胞病毒(CMV)早期增强子等。增强子能够增强启动子的活性，在一些实例中，增强子与启动子配合以大大增强启动子活性，例如CMV早期增强子/CMV启动子，CMV早期增强子与鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)组成的CB7启动子。
在一些实施方案中，本发明所述的表达调控元件包含内含子。术语“内含子”包括整个内含子的任何部分，该部分足够大以能够被核剪接装置识别和剪接。通常，短的功能性的内含子序列是优选的。内含子可以位于编码序列的5'端，编码序列的3'端，或在该编码序列内。内含子位于编码序列的5'端的优点是使内含子干扰多腺苷酸化信号功能的机会最小化。内含子的非限制性实例为小鼠微小病毒(MVM)内含子、β-肌动蛋白内含子、兔β-珠蛋白内含子(betaIVS-II)、因子IX(FIX)内含子A、内含子A、嵌合内含子、猿猴病毒40(SV40)小t内含子或他们的组合。
在一些实施例中，术语“启动子”为启动子和/或增强子和/或内含子的组合或包括其他调节元件。例如在一个具体的实施例中，CMV-1启动子包含CMV增强子和CMV启动子。在另一个具体的实施例中，CMV-2启动子包含CMV增强子、CMV启动子、内含子和5’UTR。在另一个具体的实施例中，CMV-3启动子包含CMV增强子、CMV启动子和内含子。在另一个具体的实施例中，CBA启动子包含CMV早期增强子、CBA启动子和内含子。
在一些实施方案中，本发明所述的表达调控元件包含多聚腺苷酸化信号序列，术语“多聚腺苷酸化信号”、“多腺苷酸”或“多聚腺苷酸”包括核酸内切酶切割RNA转录物所需的识别区域，随后是聚腺苷酸化共有序列AATAAA。所述多腺苷酸化信号也被称为多腺苷酸化位点、多腺苷酸尾、Poly(A)位点、Poly(A)信号或Poly(A)尾。多腺苷酸化信号序列提供PolyA位点，即RNA转录物上的位点，通过转录后聚腺苷酸化将腺嘌呤残基添加到该位点。在蛋白质生物合成的过程中，这是产生准备作翻译的成熟mRNA的方式的一部分。在真核生物中，多聚腺苷酸化是一种机制，令mRNA分子于它们的3'端中断。多腺苷酸化信号保护mRNA，免受核酸外切酶攻击，并且对转录终结、将mRNA从细胞核输出及进行翻译都十分重要。多腺苷酸化信号包含多个连续的腺苷一磷酸，通常含有AAUAAA重复序列。一些示例性的多腺苷酸化信号包含猴空泡病毒40(SV40)、人生长激素(HGH)、牛生长激素(BGH)或β-珠蛋白。
本发明所述的多核苷酸表达盒进一步包括位于编码序列下游和多聚腺苷酸化位点上游的RNA输出信号。RNA输出信号是顺式作用的转录后调控元件，可增强RNA从细胞核中的输出。示例性的RNA输出序列包括但不限于来自乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)和土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)序列。
在一些实施方案中，本发明所述的多核苷酸表达盒包括一种或多种表达调控元件，例如但不限于启动子、增强子、内含子和/或多聚腺苷酸化序列。这些调控元件与翻译起始序列、转基因序列、终止序列等，多个功能性核苷酸序列彼此之间可操作性地连接，形成表达多肽或蛋白的多核苷酸表达盒。
本领域技术人员可以理解的是，本发明的多核苷酸表达盒可以任选包含其他元件，包括但不限于促进克隆的限制性位点，用于可操作性地连接各元件。实例如质粒载体的细菌序列、噬菌体整合酶载体的attp位点、attB位点、启动子接头、多腺苷酸化序列接头等。
在一些实施方案中，本发明中使用上述多核苷酸表达盒或多核苷酸表达盒的例子是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选的转基因和相关的调控元件的侧面是5'和3'AAV ITR序列。在一个具体的实施例中，所述的质粒从5'到3'顺序包含5'ITR、增强子和/或启动子和/或内含子、信号肽、转基因(GLP-1受体激动剂)、多腺苷酸化信号和3'ITR，可选择地，所述的质粒进一步包含其他表达调控元件或连接元件。
本发明所有的氨基酸或核苷酸序列，均包括其“变体”或“突变体”，例如相对于本发明所具体指代的亲本核苷酸或氨基酸的序列具有至少具有一个核苷酸或氨基酸的差异(如氨基酸或核苷酸的插入、取代、删除)。对于氨基酸或核苷酸突变体的序列，我们可以通过相对于亲本氨基酸或核苷酸的“同源性”进行描述。同源性指当两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列进行比对时，氨基酸序列或者碱基序列相似的程度，以百分比计。优选地，本发明所有氨基酸或核苷酸的序列包括与其具有至少85％、90％、95％、99％或100％的同源性。
表达载体
本发明的另一方面在于提供用于在特定细胞或组织中表达目的多肽或蛋白的基因递送载体，其中基因递送载体包括本发明所述的多核苷酸表达盒。在一个实施例中，基因递送载体为重组腺相关病毒(rAAV)。当本发明的基因递送载体为重组腺相关病毒，本发明的多核苷酸表达盒在5’和3’末端侧接有功能性的腺病毒反向末端重复序列(ITR)。功能性的腺病毒反向末端重复序列(ITR)是指如用于整合、复制和包装AAV病毒粒子的ITR序列。用于本发明的基因递送载体的AAV ITR不必须为野生型核苷酸序列，而是可以通过核苷酸的插入、缺失或取代而改变，或者AAV ITR可以源自于任何AAV血清型，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12。优选的AAV载体具有全部或部分缺失的野生型Rep基因和Cap基因，但是保留有功能性侧接ITR序列。在特定实施例中，AAV病毒载体为AAV2或其变体。
在一些实施例中，本发明的rAAV包含衣壳蛋白，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。rAAV包含三个衣壳蛋白，分别称为VP1，VP2和VP3，所有这些蛋白均通过替代剪接从单个cap基因转录而来。VP1，VP2和VP3的分子量分别为约87kDa，约72kDa和约62kDa。翻译后，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球形的60聚体蛋白壳。衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组，递送基因组并与宿主相互作用。
本发明所述的衣壳蛋白可以来自于任何腺相关病毒的血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV 3、AAV 4、AAV 5、AAV 6、AAV 7、AAV 8、AAV 9、AAV 10、AAV 11、AAV 12等，所述腺相关病毒血清型中的任何腺相关病毒血清型都可以充当基因递送载体。例如，AAV衣壳可以是野生型衣壳或天然衣壳。与ITR一样，衣壳不是必须为野生型衣壳，而是只要衣壳能够对特定细胞或组织进行转导，就可以通过核苷酸的插入、缺失或取代对野生型的VP1、VP2或VP3序列进行改变。换句话说，AAV衣壳可以是变体AAV衣壳，所述变体AAV衣壳包括相对于亲本衣壳蛋白或AAV衣壳蛋白的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。
在一些实施方案中，AAV衣壳变体与已知的亲本AAV衣壳相比，包含约1至约100个氨基酸(例如，1-10个氨基酸之间、1-20个氨基酸之间、1-30个氨基酸之间、20-50个氨基酸之间、20-60个氨基酸之间、50-80个氨基酸之间、50-100个氨基酸之间、60-100个氨基酸之间等)氨基酸的取代、插入或缺失。在一些实施例中，AAV衣壳变体相对于亲本衣壳包含超过100个氨基酸(例如，100-200个氨基酸之间、200-300个氨基酸之间、100-500个氨基酸之间、500-1000个氨基酸之间或更多)的取代、插入或缺失。
在一些实施例中，衣壳变体可以是嵌合衣壳变体。嵌合衣壳变体序列可包含两个或多个AAV衣壳血清型或其变体的部分。在一些实施例中，嵌合衣壳包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的壳蛋白血清型的部分。在一些实施例中，嵌合衣壳蛋白具有不同的特性，例如其来源的AAV壳蛋白具有组织取向性等。片段可通过任何适当的方法并入，例如重组DNA克隆。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白对腮腺、胰腺或肌肉组织具有趋向性。在一些实施方案中，具有期望的组织趋向性的AAV衣壳蛋白可以选自从哺乳动物(例如，来自受试者的组织)分离的AAV衣壳蛋白。
在一些实施方案中，本发明所述的rAAV是单链AAV(ssAAV)。其中ssAAV是指在分开的链上具有目的基因表达盒的编码序列和互补序列的rAAV，并且被包装在分开的病毒衣壳中。
将要在宿主细胞中培养以将rAAV载体封装在AAV衣壳中的组件反向提供给宿主细胞。所需组件中的任何一个或多个(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定的宿主细胞提供，该宿主细胞已被设计成使用本领域已知的方法来包含所需组分中的一个或多个。优选的，稳定的宿主细胞将在诱导启动子的控制下包含所需的组件。本发明在前面已经详细描述过本发明可选择的启动子类型。
本发明的另一方面，还提供包含本发明所述的多核苷酸表达盒或多核苷酸表达盒的宿主细胞。“宿主细胞”是指包含或能够包含目标物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞肌肉细胞，感光细胞，视网膜色素上皮细胞，角质形成细胞，角膜细胞和/或肿瘤细胞等。宿主细胞可用作AAV辅助构建体，AAV载体，辅助功能载体或与重组AAV的产生相关的其他转移DNA的受体。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。可理解的是，由于自然，偶然或故意的突变，单个亲本细胞的后代在形态或基因组或总DNA补体上不一定与原始亲本完全相同。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，酵母细胞，细菌细胞，昆虫细胞，植物细胞或真菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是神经元，感光细胞，有色素的视网膜上皮细胞或神经胶质细胞。产生本发明的rAAV所需的重组AAV载体，rep序列，cap序列和辅助功能可以使用任何适当的遗传元件(载体)递送至包装宿主细胞。所述的遗传元件可以通过任何本领域技术人员已知的并且合适的方法递送，如基因工程，重组工程和合成技术。
重组腺相关病毒(rAAV)的递送
本发明的另一方面在于提供包含rAAV的组合物，所述rAAV包含衣壳蛋白和目的多肽或蛋白的编码序列，所述编码序列为编码GLP-1受体激动剂的核苷酸序列。
本发明所述的多核苷酸表达盒、质粒、rAAV均可以根据本领域已知的任何合适方法以组合物的形式递送至受试者。例如，优选将悬浮于生理相容性载体中(例如，在组合物中)的rAAV施用于受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔子、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物(例如，猕猴)。在一些实施例中，宿主动物不包括人类。在一些实施例中，受试者是人类。
将rAAV递送至哺乳动物受试者可通过例如静脉注射、肌肉注射、脾脏住宿、腹腔注射等形式。在一些实施例中，通过肌肉注射施用本发明中所述的rAAV或组合物。
本发明的组合物可单独包含rAAV，或与一个或多个其他病毒(例如，具有一个或多个不同目的基因的第二个rAAV)。在一些实施例中，组合物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的rAAV，每个rAAV具有一个或多个不同的目的基因。
在一些实施例中，组合物还包括药学上可接受的载体，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可与多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲液)调配。其他示例性载体包括无菌生理盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。
除了rAAV和载体以外，本发明的组合物还可包含其他常规成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇，山梨酸钾，山梨酸，二氧化硫，没食子酸丙酯，对羟基苯甲酸酯，乙基香兰素，甘油，苯酚，对氯苯酚和泊洛沙姆(非离子表面活性剂)。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
期望通过施用足够量的rAAV或组合物以转染所需组织的细胞并提供足够水平的基因转染和表达，而不产生过度的不利影响。
实现特定治疗效果所需的rAAV病毒剂量，例如基因组拷贝数/ml(vg/ml)将根据以下几个因素而变化，包括但不限于：rAAV病毒给药途径、达到治疗效果所需的基因或RNA表达水平，正在治疗的特定疾病或疾病，以及基因或RNA产物的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及本领域公知的其他因素，容易地确定用于治疗具有特定疾病或病症的患者的rAAV病毒离子剂量范围。
有效量的rAAV或组合物是足以靶向感染动物，靶向所需组织(例如，肌肉组织，眼组织等)的量。在一些实施例中，有效量将主要取决于诸如受试者的物种、年龄、重量、健康状况和靶向的组织等因素，因此可以在动物和组织之间产生变化。例如，rAAV的有效量通常具有约106到1016个基因组拷贝(vg)(例如，从1x 106到1x 1016)。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x108和1x1015基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x108和1x1014基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x108和1x1013基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x108和1x1012基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x108和1x1011基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x108和1x1010基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x108和1x109基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x109和1x1015基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x109和1x1014基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x109和1x1013基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x109和1x1012基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x109和1x1011基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x109和1x1010基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x1010和1x1015基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x1010和1x1014基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x1010和1x1013基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x1010和1x1012基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x1010和1x1011基因组拷贝之间。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x1011和1x1015基因组拷贝之间。在某些情况下，剂量在1011到1014个rAAV基因组拷贝之间是合适的。在一些实施例中，rAAV的有效量在1011到1013基因组拷贝之间是合适的。在一些实施例中，rAAV的有效量在约1011到1012基因组拷贝之间是合适的。在一些实施例中，rAAV的有效量在1012到1015基因组拷贝是适当的。在一些实施例中，rAAV的有效量在1012到1014基因组拷贝是适当的。在一些实施例中，rAAV的有效量在1012到1013rAAV基因组拷贝是适当的。在一些实施例中，rAAV的有效量在1013到1015rAAV基因组拷贝是适当的。在一些实施例中，rAAV的有效量在1013到1014基因组拷贝的剂量是适当的。在一些实施例中，rAAV的有效量在1x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x108、1.9x 108、1x 109、1.1x 109、1.2x 109、1.3x 109、1.4x 109、1.5x 109、1.6x 109、1.7x109、1.8x 109、1.9x 109、1x 1010、1.1x 1010、1.2x 1010、1.3x1010、1.4x 1010、1.5x 1010、1.6x 1010、1.7x 1010、1.8x 1010、1.9x 1010、1x 1011、1.1x 1011、1.2x 1011、1.3x 1011、1.4x1011、1.5x 1011、1.6x 1011、1.7x 1011、1.8x 1011、1.9x 1011、1x1012、1.1x 1012、1.2x 1012、1.3x 1012、1.4x 1012、1.5x 1012、1.6x 1012、1.7x 1012、1.8x1012、1.9x 1012、1x 1013、1.1x1013、1.2x 1013、1.3x 1013、1.4x 1013、1.5x 1013、1.6x 1013，1.7×1013、约1.8×1013、约1.9×1013或约2.0×1014基因组贝数是合适的。在某些实施例中，108-109rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，肌肉)有效。在某些实施例中，109-1010rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，肌肉)有效。在某些实施例中，1010-1011rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，肌肉)有效。在某些实施例中，1011-1012rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，肌肉)有效。在某些实施例中，1012-1013rAAV基因组拷贝对靶组织(例如，肌肉)有效。在某些实施例中，1013-1014rAAV基因组拷贝对靶组织有效(例如，肌肉)。
在一些实施例中，编码GLP-1受体激动剂的rAAV给予受试者每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每6个月一次、每年一次或每2年一次、每5年一次、一生一次。
在一些实施例中，配制rAAV组合物以减少AAV粒子在组合物中的聚集，特别是在高rAAV浓度情况下(例如，～1013gc/mL或更高)。减少rAAV聚集的方法为本领域公知，包括例如添加表面活性剂、pH调节、盐浓度调节等。
为了给予可注射水溶液，可以根据需要适当地配制缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内，肌内，皮下，腮腺和腹膜内给药。
无菌注射溶液的制备方法是将所需量的活性rAAV与本发明所列举的各种其他成分混合在适当的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将各种已灭菌活性成分并入无菌载体中制备分散体，该载体包含分散介质和所需的其他成分。
本发明的rAAV组合物也可以以中性或盐形式配制。药学上可接受的盐，包括酸加成盐及由无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸)形成。由自由羧基形成的盐也可来自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，或者有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。配制完成后，溶液将以与剂型相容的方式给药，并且以治疗有效量施用。所述制剂易于以各种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。
如本文所用，“载体”包括任何的溶剂、分散介质、载体、涂料、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。
可以通过例如脂质体，纳米胶囊，微粒，微球，脂质颗粒，囊泡等递送载体将本发明的组合物递送至合适的宿主细胞中。除了上述递送方法外，还可能通过下述方式递送rAAV组合物，例如骨内注射，透皮制剂及缓控释制剂等。
本发明还在于将本发明所述的多核苷酸表达盒、质粒或rAAV在制备用于预防或治疗受试者中与糖尿病的药物中的用途，或者将本发明所述的多核苷酸表达盒，质粒，rAAV用于治疗或预防还有糖尿病的受试者。施用包含本发明所述的多核苷酸表达盒、质粒或rAAV药物的作用可以是预防病症发展、停止病症进展、逆转病症进展等。
具体实施方式
实施例1目的基因序列制备
通过将GLP-1受体激动剂蛋白氨基酸序列对应的编码核苷酸序列进行密码子优化以获得在人体细胞中表达。通过全基因合成(生工生物工程(上海)股份有限公司或者南京金斯瑞生物科技有限公司)的方式获得目的基因或密码子优化后的目的基因(DL0、DLJ、DLS、DL1-6)序列，基因合成时为方便后续载体构建，在目的基因序列的两侧，引入信号肽序列和合适的酶切位点。
实施例2目的基因质粒的构建
将目的基因或不同密码子优化合成的目的基因序列酶切回收，插入到相应酶切的AAV质粒骨架载体中，获得表达目的基因的AAV质粒。以KH11和KH13 AAV质粒构建为例，将含有天然信号肽的合成基因序列DLJ与含有CMV-1启动子的骨架载体质粒，分别用EcoRI和MluI双酶切，得到酶切片段及酶切载体。将含有目的基因酶切片段与酶切载体用SolutionI连接，连接条件：16℃,时间大于30min。连接产物取5-10μL加入化学感受态细胞中，冰浴15-30分钟，42℃热激45-60秒后快速放置冰上2-3分钟，加入2×YT培养基，37℃，220rpm恢复培养1小时，涂布于含适量卡那抗生素的平板上，37℃倒置培养过夜。挑取克隆送测序鉴定，获得测序正确的KH11和KH13质粒。
实施例3含不同信号肽目的基因质粒的构建
采用同源重组的构建方法构建含有不同信号肽的AAV表达载体。将不同信号肽序列分别设计于同源臂引物中，以合成的目的基因为模板进行PCR扩增，PCR产物通过DNA凝胶电泳切胶回收目的条带。将PCR片段与酶切AAV质粒载体利用同源重组酶相连接，连接条件：50℃，5-15分钟。连接产物取5-10μL加入化转感受态中，冰浴15-30分钟，42℃热激45-60秒后快速放置冰上2-3分钟，加入2×YT培养基，37℃，220rpm恢复培养1小时，涂布于含适量卡那抗生素的平板上，37℃倒置培养过夜。挑取克隆送测序鉴定，将测序正确的克隆用于后续实验研究。构建质粒主要组成如表1所示。
表1
Figure BDA0004020024220000151
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Figure BDA0004020024220000161
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Figure BDA0004020024220000181
实施例4病毒包装和纯化
细胞转染：以AAV5-KH11和AAV5-KH13 AAV载体制备为例，转染前将所需待转染悬浮细胞(HEK293F，Thermo)用新鲜培养基(LV-MAX,Gibco)调整至适当密度，待用。将KH11和KH13 AAV质粒分别同pHelper和pAAV2/5质粒(3质粒包装体系)按照摩尔比1:1:1进行混合，加入1/10包装体积的新鲜培养基，混匀。转染试剂选择PEI(40KD,1mg/ml)，用量为质粒质量的2-5倍。将PEI加入上述质粒混合液，混匀，室温孵育15分钟。将质粒、PEI混合液均匀缓慢的加入备用细胞悬液，37℃，8％CO2，125rpm培养48小时后，收集细胞悬液。重组腺相关病毒的收集，浓缩和纯化：细胞悬液按照4000rpm，离心20分钟，将细胞沉淀和上清分别收集，沉淀于-80℃反复冻融3次，再用上清重悬沉淀，10000rpm离心30分钟。收集上清。于收集上清中加入脱氧核糖核酸酶I(Dnase I，20U/ml)，37℃孵育1h。10000rpm离心30分钟，收集上清，用0.2μm滤器过滤，即为浓缩的AAV病毒，可用于后续纯化。使用AAVX亲和层析柱(thermo)进行亲和纯化，用50mM Tris-HCl+0.5M NaCl溶液进行系统平衡，当基线平稳，开始上样，流速0.5ml/min。上样完成后再用50mM Tris-HCl+0.5MNaCl进行系统平衡，待基线归零后，洗脱。用0.1M，pH＝3.0的柠檬酸溶液进行洗脱，流速0.5ml/min，收集纯化样品，并立即用Tris溶液(pH9.0)调至中性。
其他衣壳血清型(例如AAV1、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10)载体的包装同上述AAV5衣壳血清型载体的包装，区别仅在于其他衣壳血清型的AAV包装复制元件不同。
实施例5病毒载体肌肉注射后在小鼠体内的GLP1-Fc持续表达研究
实验动物
C57小鼠、5周龄，雄性，购自成都达硕。
注射方式
以AAV5-KH1、AAV5-KH2、AAV5-KH11、AAV5-KH13、AAV5-KH20为病毒载体，采用肌肉注射的方式，将注射针头以60度角迅速刺入小鼠大腿内侧肌肉，回抽无血，将病毒载体注入。注射剂量为1.0E+10vg/只，注射体积为50μl/腿，共2腿，100μl。
采血方法及检测
左手拇指与食指压迫小鼠颈部两侧，使眼眶静脉丛充血，将毛细管刺入小鼠后眼角处约2-3mm，当有阻力时，旋转毛细管即可出血。注射后，每间隔1周采用眼眶采血，约100μl，RT30min，4000rpm，10min，取上清(血清)，-80℃保存。采用酶联免疫吸附法(间接法)检测GLP1-Fc含量表达。结果如图2所示。
实施例6不同衣壳血清型病毒载体肌肉注射后在小鼠体内的GLP1-Fc持续表达研究
实验动物
C57小鼠、5周龄，雄性，购自成都达硕。
注射方式
以AAV1-KH11、AAV5-KH11、AAV7-KH11、AAV8-KH11、AAV9-KH11、AAV10-KH11为病毒载体，采用肌肉注射的方式，将注射针头以60度角迅速刺入小鼠大腿内侧肌肉，回抽无血，将病毒载体注入。注射剂量为1.0E+10vg/只，注射体积为50μl/腿，共2腿，100μl。
采血方法及检测
左手拇指与食指压迫小鼠颈部两侧，使眼眶静脉丛充血，将毛细管刺入小鼠后眼角处约2-3mm，当有阻力时，旋转毛细管即可出血。注射后，每间隔1周采用眼眶采血，约100μl，RT30min，4000rpm，10min，取上清(血清)，-80℃保存。采用酶联免疫吸附法(间接法)检测GLP1-Fc含量表达。结果如图3所示。
实施例7病毒载体腮腺注射后在小鼠体内的GLP1-Fc持续表达研究
实验动物
C57小鼠、5周龄，雄性，购自成都达硕。
注射方式
以AAV8-KH2为病毒载体，采用腮腺注射的方式，用勾牙器将小鼠的上门牙勾住，使其颈部裸露出来，用手触摸确定腮腺位置，用酒精棉球擦拭，针头斜面朝上，呈45度角刺入，缓慢将病毒样品注入，观察到注射部位鼓起小包，以确定成功注射，用棉球压住进针部位片刻，拔出针头。注射剂量为1.0E+10vg/只，注射体积为100μl。
采血方法及检测
左手拇指与食指压迫小鼠颈部两侧，使眼眶静脉丛充血，将毛细管刺入小鼠后眼角处约2-3mm，当有阻力时，旋转毛细管即可出血。注射后，每间隔1周采用眼眶采血，约100μl，RT30min，4000rpm，10min，取上清(血清)，-80℃保存。采用酶联免疫吸附法(间接法)检测GLP1-Fc含量表达。结果如图4所示。
实施例8病毒载体尾静脉注射后在小鼠体内的GLP1-Fc持续表达研究
实验动物
C57小鼠、5周龄，雄性，购自成都达硕。
注射方式
以AAV8-KH2为病毒载体，采用尾静脉注射的方式，将病毒载体注入。注射剂量为1.0E+10vg/只，注射体积为100μl。
采血方法及检测
左手拇指与食指压迫小鼠颈部两侧，使眼眶静脉丛充血，将毛细管刺入小鼠后眼角处约2-3mm，当有阻力时，旋转毛细管即可出血。注射后，每间隔1周采用眼眶采血，约100μl，RT30min，4000rpm，10min，取上清(血清)，-80℃保存。采用酶联免疫吸附法(间接法)检测GLP1-Fc含量表达。结果如图5所示。
实施例9病毒载体小鼠肌肉注射后药效研究
实验动物
C57小鼠、5周龄，雄性，购自成都达硕。
模型建立
高脂饮食(60％脂肪)诱导C57雄性小鼠21周，经检测已形成小鼠已形成Ⅱ型糖尿病。
样品分组
给药组：
AAV5-KH13分为三个浓度给小鼠注射，高剂量(AAV5-KH13-H)1.0*E+11vg/只；中剂量(AAV5-KH13-M)4.0*E+10vg/只；低剂量(AAV5-KH13-L)4.0*E+9vg/只。
AAV8-KH1分为两个浓度给小鼠注射，高剂量(AAV8-KH1-H)1.0*E+11vg/只，低剂量(AAV8-KH1-L)1.0*E+10vg/只。
阳性对照：用已上市药物杜拉糖肽作为阳性对照，每周给药一次，给药剂量为10nmol/kg。
阴性对照：用DMEM培养基作为阴性对照，给药体积100μl/只
注射方式
给药组：在21周时给小鼠肌肉注射给药组、阳性对照或阴性对照样品，将注射针头以60度角迅速刺入小鼠大腿内侧肌肉，回抽无血，将样品注入。
观测指标
注射AAV药物后继续检测小鼠体重、血糖及血清GLP1-Fc的表达量。
结果：
AAV5-KH13的GLP1-Fc表达、血糖及体重变化分别如图6A、6B、6C。
AAV8-KH1的GLP1-Fc表达、血糖及体重变化分别如图7A、7B、7C。
实施例10病毒载体小鼠肌肉注射后药效研究-IPGTT
实验目的
为了观察病毒载体进入小鼠体内表达GLP1-Fc后，小鼠对葡萄糖的耐受程度，进行了IPGTT实验。
实验动物
C57小鼠、5周龄，雄性，购自成都达硕。
给药组：
AAV5-KH13分为三个浓度给小鼠注射，高剂量(AAV5-KH13-H)1.0*E+11vg/只；中剂量(AAV5-KH13-M)4.0*E+10vg/只；低剂量(AAV5-KH13-L)4.0*E+9vg/只。
AAV8-KH1分为两个浓度给小鼠注射，高剂量(AAV8-KH1-H)1.0*E+11vg/只，低剂量(AAV8-KH1-L)1.0*E+10vg/只。
阳性对照：用已上市药物杜拉糖肽作为阳性对照，每周给药一次，给药剂量为10nmol/kg。
阴性对照：用DMEM培养基作为阴性对照，给药体积100μl/只
给药方案
给药组：在21周时给小鼠肌肉注射给药组、阳性对照或阴性对照样品，将注射针头以60度角迅速刺入小鼠大腿内侧肌肉，回抽无血，将样品注入。
观测指标
小鼠饥饿4小时，测定空腹血糖；按1g葡萄糖/Kg小鼠体重腹腔注射20％葡萄糖；随后按照30min、60min、90min、120min时间点测定小鼠血糖。
结果：
小鼠4h饥饿血糖如图8A-8B。从4h饥饿血糖可以看出，AAV5-H、AAV8-L、AAV8-H和GLP1-Fc组小鼠血糖都显著比CTR组低，说明GLP1-Fc在小鼠体内作用明显。
小鼠IPGTT测定结果如图9A-9B。从IPGTT测定可以看出，长期给度拉糖肽组(即阳性对照组)的小鼠可以保持对葡萄糖的敏感性，对葡萄糖耐受程度比较高，AAV5-H与AAV8-L组和阳性对照组比较相似，说明AAV在小鼠体内长期表达GLP1-Fc对于小鼠的二型糖尿病由很好的控制作用。

Claims (15)

1.一种多核苷酸表达盒，其特征在于所述多核苷酸表达盒包含编码GLP-1受体激动剂的转基因，和位于转基因侧翼的反向末端重复序列(ITR)。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸表达盒，其特征在于所述GLP-1受体激动剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或与其至少具有80％同源性的序列。
3.根据前述任一项所述的多核苷酸表达盒，其特征在于所述编码GLP-1受体激动剂的转基因经过密码子优化；优选的，所述转基因选自DL3、DLJ、DL2、DL4、DL5、DL6、DL0、DLS，且分别具有如SEQ ID NO：2-9所示的核苷酸序列。
4.根据前述任一项所述的多核苷酸表达盒，其特征在于所述表达盒进一步包含启动子，所述启动子选自CBA启动子、CMV启动子、EF1A启动子、MHCK7启动子、tMCK启动子、MCK启动子、HSA启动子、CK8启动子或他们的组合；优选的，
所述CBA启动子具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；
所述CMV启动子选自CMV-1、CMV-2或CMV-3，且分别具有如SEQ ID NO：10-12所示的核苷酸序列；
所述EF1A启动子具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；
所述MHCK7启动子具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；
所述tMCK启动子具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；
所述MCK启动子具有如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；
所述HSA启动子具有如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；
所述CK8启动子具有如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；
或与上述核苷酸序列至少具有80％同源性的核苷酸序列。
5.根据前述任一项所述的多核苷酸表达盒，其特征在于所述表达盒进一步包含信号肽，所述信号肽选自天然信号肽、人SPARC、人乳铁运蛋白、人组织蛋白酶L1、人组织蛋白酶B、人补体C3、人光蛋白聚糖或合成信号肽；优选的，
所述天然信号肽具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；
所述人SPARC信号肽具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；
所述人乳铁运蛋白信号肽具有如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；
所述人组织蛋白酶L1信号肽具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；
所述人组织蛋白酶B信号肽具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；
所述人补体C3信号肽具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；
所述人光蛋白聚糖信号肽具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；
所述合成信号肽具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；
或与上述氨基酸序列至少具有80％同源性的氨基酸序列。
6.根据前述任一项所述的多核苷酸表达盒，其特征在于，所述表达盒进一步包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸选自HGH、SV40、BGH或兔β-珠蛋白；优选的，
所述HGH具有如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列；
所述SV40具有如SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列；
所述BGH具有如SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列；
所述兔β-珠蛋白具有如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列；
或与上述核苷酸序列至少具有80％同源性的核苷酸序列。
7.根据前述任一项所述的多核苷酸表达盒，其特征在于，所述表达盒包含CBA启动子、天然信号肽、转基因DLJ、兔β-珠蛋白多聚腺苷酸；
或者所述表达盒包含CBA启动子、天然信号肽、转基因DL2、兔β-珠蛋白多聚腺苷酸；
或者所述表达盒包含CMV-1启动子、天然信号肽、转基因DLJ、HGH多聚腺苷酸；
或者所述表达盒包含CMV-1启动子、天然信号肽、转基因DLJ、BGH多聚腺苷酸；
或者所述表达盒包含CBA启动子、天然信号肽、转基因DL3、兔β-珠蛋白多聚腺苷酸。
8.根据前述任一项所述的多核苷酸表达盒，其特征在于，所述表达盒进一步包含转录后调节元件；优选的，所述转录后调节原件为土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)。
9.根据前述任一项所述的多核苷酸表达盒，其特征在于，所述ITR是血清型的腺相关病毒ITR，选自AAV1 ITR，AAV2 ITR，AAV3 ITR，AAV4 ITR，AAV5 ITR，AAV6 ITR，AAV7 ITR，AAV8ITR，AAV9 ITR，AAV10 ITR，AAV11 ITR和AAV12 ITR。
10.一种质粒，其特征在于所述质粒包括权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸表达盒。
11.一种重组腺相关病毒载体，其特在在于所述腺相关病毒病毒载体包括：
(a)腺相关病毒衣壳蛋白；
(b)包装进入衣壳蛋白的多核苷酸表达盒，所述多核苷酸表达盒包含编码GLP-1受体激动剂的转基因。
12.根据权利要求11所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于所述衣壳蛋白为血清型衣壳蛋白，选自AAV 1，AAV 2，AAV 3，AAV 4，AAV 5，AAV 6，AAV 7，AAV 8，AAV 9，AAV10，AAV11，AAV 12或前述任一项衣壳蛋白的变体；优选的，所述衣壳蛋白选自AAV 1，AAV 5，AAV 8，AAV 9或AAV 10；更优选的，所述所述衣壳蛋白选自AAV 5或AAV 8。
13.根据权利要求11或12所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于所述多核苷酸表达盒选自权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸表达盒。
14.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括根据权利要求1-9任一项所述的多核苷酸表达盒，或者权利要求10所述的质粒，或者权利要求11-13中任一项所述的重组腺相关病毒和药学上可接受的载体；优选的，所述药物组合物被制备成用于静脉注射、皮下注射、肌肉注射、唾液腺注射、脾脏注射的剂型。
15.权利要求1-9任一项所述的多核苷酸表达盒，或者权利要求10所述的质粒，或者权利要求11-13任一项所述的的重组腺相关病毒载体，或权利要求14所述的药物组合物在用于制备用于治疗糖尿病或者肥胖的药物中的用途；优选的，所述糖尿病为1型或2型糖尿病。
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