DE69012379T2

DE69012379T2 - Verpackungsdefizientes HIV-Provirus, Zellinien und deren Verwendung.

Info

Publication number: DE69012379T2
Application number: DE69012379T
Authority: DE
Inventors: Heinrich Gottlinger; William A Haseltine; Andrew Lever; Joseph Sodroski
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1989-02-06
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 1995-03-09
Anticipated expiration: 2010-02-07
Also published as: CA2009403C; ES2063914T3; DE69012379D1; EP0386882A1; JPH0361492A; ATE111529T1; CA2009403A1; EP0386882B1; DK0386882T3; JP3140757B2

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf Vektoren gerichtet, die ein HIV-Provirus mit einem Verpackungsdefekt umfassen, und die Verwendung dieser Vektoren zur Schaffung von Zellinien mit einem HIV-Verpackungsdefekt sowie deren Verwendung. Bevorzugt ist das HIV-Provirus ein HIV-1-Provirus.
Das menschliche Immundefizienzvirus (HIV-1, auch als HTLV- III, LAV oder HTLV-III/LAV bezeichnet) ist das äthiologische Agens des erworbenen Immundefizienzsyndroms (AIDS) und verwandter Störungen [Barre-Sinoussi, et al., Science 220: 868- 871 (1983); Gallo et al, Science 224: 500-503 (1984); Levy et al., Science 225: 340-842 (1984); Popovic et al., Science 224: 497-500 (1984); Sarngadharan et al., Science 224: 506- 508 (1984); Siegal et al., N. Engl. J. Med. 305: 1439-1444 (1981)]. Die Krankheit ist durch eine lange asymptomatische Periode gekennzeichnet, gefolgt von einer progressiven Degeneration des Immunsystems und des zentralen Nervensystems. Untersuchungen des Virus zeigen, daß die Replikation hoch reguliert ist und sowohl eine latente als auch eine lytische Infektion der CD4-positiven Helfer-Subpopulation der T- Lymphozyten in Gewebekulturen auftreten [Zagury et al., Science 231: 850-853 (1986)]. Die Expression des Virus in infizierten Patienten scheint auch so reguliert zu sein, daß eine Vermeidung der Immunantwort ermöglicht wird. Molekulare Untersuchungen der Regulation und Genomorganisation von HIV-I zeigen, daß es für eine Anzahl von Genen codiert [Ratner et al., Nature 313: 277-284 (1985); Sanchez-Pescador et al., Science 227: 484-492 (1985); Muesing et al., Nature 313: 450- 457 (1985); Wain-Hobson et al., Cell 40: 9-17 (1985)].
Retroviren werden typischerweise als einer von drei Unterfamilien zugehörig klassifiziert, nämlich Onkoviren, Spumaviren und Lentiviren. Eine Infektion durch Onkoviren geht typischerweise mit malignen Störungen einher. Diese Viren enthalten typischerweise ein einzelsträngiges, plus-Strang RNA-Genom von annähernd 8000 bis 10000 Nukleotiden, die das gag-, pol- und env-Gen umfassen, sowie lange endständige Wiederholungs-(LTR)-Sequenzen. Einige dieser Onkoviren enthalten Onkogene. Es wird allgemein angenommen, daß Spumaviren in vivo nicht pathogen sind, obgleich sie schaumige zytopathische Veränderungen in Gewebekulturen induzieren. Eine Infektion durch Lentiviren ist im allgemeinen langsam und verursacht chronische schwächende Krankheiten nach einer langen Latenzperiode. Diese Viren besitzen zusätzlich zu den gag-, pol- und env-Genen eine Anzahl von zusätzlichen Genen mit regulatorischen Funktionen.
Die menschlichen Immundefizienzviren (HIV) wurden als Lentivirus klassifiziert, da auch sie eine langsame Infektion verursachen und mit derartigen Viren strukturelle Eigenschaften gemeinsam haben. [Siehe Haase, A.T., Nature 322: 130-136 (1986)].
HIV-1 hat das gag-, pro-, pol- und env-Gen jeweils mit anderen Viren gemein [Haseltine, W.A., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome, 1: 217-240 (1988)). HIV-1 besitzt auch zusätzliche Gene, die die virale Replikation modulieren. Das HIV-1 Genom codiert für vif-, vpr-, tat-, rev-, vpu- und nef- Proteine [Haseltine, W.A., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome, siehe oben]. Zusätzlich enthalten die langen endständigen Wiederholungssequenzen (LTRs) von HIV cis-wirkende Sequenzen, die für die Integration, Transskription und Polyadenylation wichtig sind. Zusätzliche cis-wirkende Signale erlauben die Regulation der HIV-Sequenzen durch einige der neuen HIV-Genprodukte (Haseltine, W.A., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome, siehe oben). Sodroski et al., Science 231: 1549-1553 (1986); Arya et al., Science 229: 69-73 (1985); Sodroski et al., Science 227: 171-173 (1985); Sodroski et al., Nature 321: 412-417 (1986); Feinberg et al., Cell 46: 807-817 (1986) Wong-staal et al, AIDS Res. and Human Retroviruses 3: 33-39 (1987), die alle hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind]. Die Region zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und dem gag-Gen Initiationscodon wird in verschiedenen HIV-1-Stäminen, die bis heute sequenziert wurden, in hohem Maße aufrechterhalten [Myers, G., et al, Theoretical Biology and Biophysics, 1988)].
Die meisten dieser Gene codieren für Produkte, die für den viralen Lebenszyklus erforderlich sind. Beispielsweise codiert das tat-Gen für ein 14kD Protein, das für die HIV-Replikation und -Genexpression wesentlich ist [Rosen C.A., et al., Nature 319: 555-559 (1986); Sodroski, J. et al., Science 227: 171-173 (1985); Arya et al, Science 229: siehe oben, Sodroski, et al., Science 229, siehe oben, und Dayton, A., et al., Cell 44: 941-947 (1986), die alle hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind]. Ein weiteres für die Replikation erforderliches Gen ist das rev-Gen. [Sodroski, et al., Nature 321: 412-417 (1986), die beide hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
In einigen Onkoviren wurden cis-wirkende Sequenzen, die zwischen der 5' LTR und dem gag-Gen Initiationscodon angeordnet sind, lokalisiert, die für die effiziente Verpackung der viralen RNA in Virionen erforderlich sind [Bender, M.A., et al, J. Virol 61: 1639-1646 (1987), Katz, R.A., et al, J. Virol 59: 163-167 (1986), Mann, R., et al, Cell 33: 153-159 (1983), Pugatsch, T., et al, Viroloay 128: 505-511 (1983), Watanabe, S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 5986-5990 (1983) Eglitis, M.A., et al, Bio Techniques 6: 608-614 (1988), die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind]. Zusätzlich zu diesen Sequenzen wurde festgestellt, daß das gag-Gen überlappende Sequenzen zur Effizienz der viralen RNA- Verkapselung durch das Moloney Maus Leukämievirus beitragen [Adam, M.A., et al, J. Virol. 62: 3802-3806 (1988)]. Die zur Verpackung der RNA von Lentiviren (wie z.B. HIV-RNA) in Virionpartikel erforderlichen Signale wurden nicht identifiziert.
Obgleich ein beträchtlicher Forschungsaufwand auf das Verständnis von HIV-1 verwendet wurde, wird der Lebenszyklus dieses Retrovirus nicht vollständig verstanden.
Zusätzlich wurde ein hoher Forschungsaufwand auf die Entwicklung eines Impfstoffes gegen das Virus gerichtet, aber bis heute wurde nicht von Erfolg berichtet. Dies liegt zum Teil in dem Mangel der Konservierung in den antigenisch wirksamen Teilen des Virus begründet und zum Teil darin, daß die funktionell wichtigen Regionen der viralen Proteine und/oder inaktivierten viralen Partikel schwach immunogen sind.
Demgemäß wäre es äußerst nützlich, ein Provirus zu haben, daß HIV-Proteine erzeugt, das jedoch nicht tödlich wäre, da die virale RNA nicht in Virionen verpackt werden könnte. Unter Verwendung dieses verpackungsdefekten Provirusvektors wäre es möglich, Zellinien mit Verpackungsdefekt zu schaffen, die zur Untersuchung des Verpackungsmechanismus des Virus und zur Entwicklung von Strategien zur Störung dieses Verpackungsmechanismus verwendet werden könnten. Insbesondere könnten die durch derartige verpackungsnegative Proviren erzeugten Virionen für Impfstoffe und als ein System zur effizienten Einführung eines gewünschten Gens in eine Säugetierzelle verwendet werden

Kurzbeschreibung der Erfindung

Wir haben nun einen Vektor entdeckt, umfassend
(a) einem für HIV gag-, env- und pol-Proteine codierenden HIV-Genom entsprechende Nucleotide, als das HIV-Segment bezeichnet, wobei die von dem Vektor in Kombination exprimierten HIV gag-, env- und pol-Proteine in der Lage sind, ein HIV-Virion zu bilden und der Vektor eine Deletion des HIV- Verpackungssegments enthält, das zur Verpackung der HIV-RNA notwendig ist, die zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und dem Initiationscodon des gag-Gens angeordnet ist; und
(b) einen mit dem HIV-Segment wirkverbundenen Promoter; wobei die von dem Vektor exprimierten HIV-Proteine in der Lage sind, HIV-Virionen zu bilden, die nicht ausreichend HIV-RNA enthalten, um in einem replikationsfähigen HIV-Virus zu resultieren. Vorzugsweise entspricht das HIV-Verpackungssegment einem Segment unmittelbar stromabwärts des 5' Hauptspleißdonors und etwa 14 Basen stromaufwärts des gag-Initiationscodons. In einer Ausführungsform ist es ein 19-Basen-Segment mit der Sequenz AAAAATTTTGACTAGCGGA.
Dieser Vektor kann verwendet werden, um eine vorausgewählte Zellinie zu transformieren, so daß sie in einer Zellinie mit HIV-Verpackungsdefekt resultiert. Vorzugsweise würde man eine Zellinie unter Verwendung von wenigstens zwei Vektoren transformieren, die gemeinsam die HIV-Nukleotide enthalten, die zur Expression von HIV gag-, pol- und env-Produkten erforderlich sind, wobei jedoch jeder Vektor selbst nicht die HIV-Nukleotide enthält, die zur Expression aller drei Produkte erforderlich sind. Zusätzlich hat jeder Vektor nicht eine ausreichende Anzahl von Nukleotiden, die den Nukleotiden des HIV-Genoms zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und dem gag-Gen zur Verpackung von HIV-RNA entsprechen. Vorzugsweise würde jeder Vektor ein unterschiedliches Markergen enthalten. Die transformierte Zellinie würde HIV-Virionen exprimieren, wäre aber nicht in der Lage, HIV-RNA in diese Virionen zu verpacken. Somit könnten diese Virionen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, als ein Impfstoff oder als ein Verfahren zum Übertragen eines gewünschten Genproduktes auf eine unterschiedliche Zellinie, die zur Infektion durch HIV fähig ist.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine schematische Darstellung des HIV-1-Genoms von der 5' LTR zu dem gag-Initiationscodon, das den 5' Hauptspleißdonor (SD) und die Position der Deletion in einem Vektor pHXBΔP1 zeigt, der eine Ausführungsform der Erfindung darstellt.
Figur 2a ist ein Autoradiogramm der Immunpräzipitation von ³&sup5;S-gekennzeichnetem viralen Protein aus COS-1-Zellen mit AIDS-Patientenserum.
Figur 2b ist ein Elektronenmikrogramm von COS-1-Zellen, die mit pHXBΔP1 transfiziert sind, das Virionenpartikel von normaler HIV-1 Morphologie zeigt.
Figur 3 ist ein Autoradiogramm einer Immunpräzipitation von gekennzeichneten viralen Proteinen aus Jurkat T-Zell-Lysaten oder Überständen, die Überständen von COS-1-Zellen ausgesetzt wurden, die transfiziert wurden oder scheinbar transfiziert wurden.
Figur 4 ist ein RNA Dot-Blot-Test.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wir haben nun entdeckt, daß es möglich ist, HIV-verpackungsdefekte Vektoren und Zellinien herzustellen. Wir haben herausgefunden, daß der Bereich zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und dem gag-Gen-Initiationscodon in HIV-Viren Sequenzen enthält, die zur Verpackung von HIV-RNA in Virionen erforderlich sind. Man kann einen Vektor herstellen, der ein verpackungs defektes HIV-Provirus enthält, wobei der Vektor eine Nukleotidsequenz enthält, die einer ausreichenden Anzahl von Nukleotiden von einem HIV-Genom enspricht, um gewünschte HIV- Produkte zu exprimieren, aber eine Deletion des HIV-Verpackungssegments enthält, das zur Verpackung von HIV-RNA erforderlich ist, das im Bereich zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und dem gag-Gen-Initiationscodon angeordnet ist.
Diese Sequenzen entsprechen vorzugsweise dem Genom von HIV-1, HIV-2 und Simian Immundefizienzvirus (SIV). [Siehe Ratner, et al, Nature 313, siehe oben, Sanchez-Pescador et al, Science 227, siehe oben, Muesing, et al, Nature 313, siehe oben, Wain-Hobson et al, Cell 40, siehe oben, Guyader, M. et al, Nature 326: 662-669 (1987); Chakrabarti et al, Nature 328: 543-547 (1987) und Hirsch, V., et al, Cell 49: 307-319 (1987), die alle hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind].
Vorzugsweise enthält der Vektor eine Deletion der HIV-Verpackungssequenz, die dem Segement unmittelbar stromabwärts des 5' Hauptspleißdonors und unmittelbar stromaufwärts des gag-Initiationscodons entspricht. Typischerweise könnte der Vektor Nukleotide enthalten, die in dem Bereich von etwa 14 Basen bis 2 Basen stromaufwärts des gag-Initiationscodons liegen; beispielsweise entweder die 14 Basen stromaufwärts oder die 5 Basen stromabwärts, und immer noch verpackungsdefizient sein. In einer Ausführungsform enthält der Vektor eine Deletion einer Nukleotidsequenz, die etwa 9 Basen stromabwärts des 5' Hauptspleißdonors beginnt und bis etwa 14 Basen stromaufwärts des gag-Initiationscodons weiterführt. Die Anzahl der Basen, die ausgelassen werden müssen, kann stark variieren, beispielsweise ist die 19-Basenpaar-Deletion AAAAATTTTGACTAGCGGA Deletion in HIV-1 ausreichend, um einen Verlust der Verpackungsfähigkeit zur Folge zu haben (siehe Figur 1). Sogar kleinere Deletionen in diesem Bereich sollten jedoch ebenfalls einen Verlust der Verpackungseffizienzen zur Folge haben. In der Tat wird erwartet, daß eine Deletion, die nur etwa 5 Basenpaare klein ist, in dieser Region die Verpackungsfähigkeit entfernen sollte. Somit kann die Größe einer bestimmten Deletion basierend auf der vorliegenden Offenbarung durch einen Durchschnittsfachmann ohne weiteres bestimmt werden.
Der Vektor sollte ein HIV-Nukleotidsegment enthalten, das eine ausreichende Anzahl von Nukleotiden enthält, die Nukleotiden des HIV-Genoms entsprechen, um funktionelle HIV-Genprodukte zu exprimieren, sollte jedoch, wie vorstehend erwähnt, nicht eine ausreichende Anzahl von Nukleotiden enthalten, die dem Bereich zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und dem gag-Gen-Initiationscodon entsprechen, um eine effiziente Verpackung der viralen RNA in Virionen zu erlauben. Bei der Verwendung dieser Vektoren zur Schaffung von HIV-verpackungsdefekten Zellinien ist es bevorzugt, daß derartige Zellinien keinen infektiösen HIV erzeugen. Obgleich eine durch diese verpackungsdefizienten Vektoren transformierte Zellinie eine geringe Infektivität haben würde, da die Zellen verpackungsdefekt sind, kann ein gewisser RNA-Anteil immer noch in das Virion verpackt werden. Demgemäß ist es bevorzugt, daß das HIV- Nukleotidsegment nicht dem gesamten HIV-Genom entspricht, so daß dann, wenn ein Teil der viralen RNA in das Virion verpackt wird, das, was verpackt wird, nicht ein replikationsfähiges Virus ist.
Vorzugsweise würde man wünschen, wenigstens zwei verschiedene Vektoren zu haben, von denen jeder einen unterschiedlichen Abschnitt des HIV-Genoms enthält und ebenfalls nicht die zur viralen Verpackung erforderliche Sequenz enthält. Dann würde durch eine Co-Transfektion einer Zelle mit jedem Vektor die Zelle immer noch in der Lage sein, alle HIV-Strukturproteine zu exprimieren und Virionen zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform würde der Vektor nicht Sequenzen enthalten, die einer HIV-LTR entsprechen, sondern würde Sequenzen enthalten, die einer Promoterregion und/oder den Polyadenylationssequenzen eines anderen Genoms entsprechen. Die Selektion von bestimmten Promotern und Polyadenylationssequenzen kann ohne weiteres basierend auf der bestimmten Wirtszelle bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform würde ein Vektor Sequenzen einschließen, die die Expression von HIV-Proteinen stromaufwärts von env erlauben, und der zweite Vektor würde die Expression der verbleibenden Proteine erlauben. Beispielsweise würde ein Vektor ein HIV-Nukleotidsegment enthalten, das einer ausreichenden Anzahl von Nukleotiden stromaufwärts des gag-Initiationscodons zu der env-Gensequenz entspricht, um die 5'-nächsten Genprodukte zu exprimieren. Der andere Vektor würde ein HIV-Nukleotidsegment enthalten, das einer ausreichenden Anzahl von Nukleotiden stromabwärts der gag- Gensequenz entspricht und eine funktionelle env-Gensequenz einschließt. Derartige Vektoren können chemisch aus den berichteten Sequenzen des HIV-Genoms synthetisiert werden oder aus vielen verfügbaren HIV-Proviren abgeleitet werden, indem die bekannten Restriktionsendonukleasstellen in diesen Viren durch einen Fachmann auf der Basis der vorliegenden Offenbarung ausgenutzt werden. Vorzugsweise würde man auch jedem Vektor ein unterschiedliches Markergen hinzufügen, das heißt eine vorausgewählte Zellinie mit diesen verschiedenen Vektoren co-transfizieren und durch Suchen nach einer Zelle, die beide Marker enthält, würde man eine Zellinie haben, die mit den beiden Vektoren co-transfiziert wurde. Eine derartige Zelle ware in der Lage, alle HIV-Proteine zu erzeugen. Obgleich jedoch Virionen erzeugt würden, würde die den gesamten viralen Sequenzen entsprechende RNA nicht in diese Virionen verpackt. Man kann mehr als zwei Vektoren verwenden, falls erwünscht, zum Beispiel einen gag-pol-Vektor, einen env-Vektor und einen vif/vpu-Vektor.
Praktisch jede Zellinie kann verwendet werden. Vorzugsweise würde man eine Säugetierzellinie verwenden, zum Beispiel CV- 1, Hela, Raji, RD, SW480 oder CHO Zellinien.
Um die Produktion der viralen zellulären Produkte zu erhöhen, könnte man einen von der 5' LTR verschiedenen Promoter verwenden, das heißt die 5, LTR durch einen Promoter ersetzen, der vorzugsweise Gene unter seiner Kontrolle in einer bestimmten Zellinie exprimiert. Beispielsweise wird der CMV- Promoter vorzugsweise Gene in CV-1- oder Hela-Zellen exprimieren. Der bestimmte verwendete Promoter kann ohne weiteres durch den Durchschnittsfachmann basierend auf der bestimmten zu verwendenden Wirtszellinie bestimmt werden.
Um den Spiegel von viralen zellulären Produkten zu erhöhen, kann man ferner Enhancer-Sequenzen dem Vektor hinzufügen, um eine Verbesserung der HTV-LTR und/oder des Promoters zu erzielen. Bestimmte Enhancer-Sequenzen können ohne weiteres durch den Durchschnittsfachmenn in Abhängigkeit von der Wirtszellinie bestimmt werden.
Man kann auch Vektoren hinzufügen, die virale Enhancer-Proteine exprimieren, wie etwa diejenigen des Herpesvirus, Hepatitis-B-Virus, die auf HIV-LTRs wirken, um den Spiegel der Virusprodukte zu verbessern, oder zelluläre Transaktivatorproteine. Zelluläre Transaktivierungsproteine schließen NFχ- B, auf UV-Licht ansprechende Faktoren und andere T-Zell- Aktivierungsfaktoren ein, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
Unter Verwendung einer Reihe von Vektoren, die gemeinsam das vollständige HIV-Genom enthalten würden, kann man Zellinien schaffen, die ein Virion erzeugen, daß dem HIV-Virion identisch ist, mit der Ausnahme, daß das Virion nicht die HIV-RNA enthält. Die Virionen können ohne weiteres aus diesen Zellen erhalten werden. Beispielsweise würden die Zellen kultiviert und der Überstand gesammelt. In Abhängigkeit von der gewünschten Verwendung kann der die Virionen enthaltende Überstand verwendet werden oder die Virionen können vom Überstand durch Standardtechniken getrennt werden. Typischerweise würde dies Gradienten-Zentrifugation, Filtrieren etc. einschließen.
Diese geschwächten Virionen wären bei der Herstellung eines Impfstoffes äußerst nützlich. Die Virionen können zur Erzeugung einer Antigen-Antwort auf die HIV-Virionen verwendet werden, und da diese Virionen mit den tatsächlichen HIV- Virionen identisch sind, mit der Ausnahme, daß das Innere dieser Virionen nicht die virale RNA enthält, sollte der geschaffene Impfstoff besonders nützlich sein.
Diese Virionen können auch verwendet werden, um Antikörper gegen das Virion zu züchten, die dann für eine Reihe von Zwecken verwendet werden können, z.B. Screening nach dem Virion, Entwicklung eines Targetsystems für die Virionen etc.
Zusätzlich können diese HIV-verpackungsdefizienten Zellinien als Mittel zur Einführung eines gewünschten Gens, beispielsweise eines heterologen Gens in Säugetierzellen, äußerst nützlich sein.
Diese Virionen könnten als äußerst wirksamer Weg zur Verpackung gewünschter genetischer Sequenzen in Zielzellen, die durch HIV infizierbar sind, verwendet werden. Dies würde durch Herstellung eines Vektors geschehen, der ein Nukleotidsegment enthält, das den Verpackungsnukleotiden des HIV-Virus (HIV-Verpackungsregion) entsprechende Nukleotide enthält, ein vorbestimmtes Gen, und Flankieren der Verpackungssequenz und des vorbestimmten Gens mit Sequenzen, die einer ausreichenden Anzahl von Sequenzen von HIV-LTRs zur Verpackung, reversen Transkription, Integration und Genexpression entsprechen. Die verwendete Verpackungsregion würde vorzugsweise wenigstens der Region zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und unmittelbar stromaufwärts des gag-Initiationscodons entsprechen, bevorzugter der Region zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und der Bal I-Position im gag-Gen. Wenn dieser Vektor verwendet wird, um eine der HIV-verpackungsdefizienten Zellen zu transfizieren, wird die Nukleotidsequenz aus diesem Vektor in die Virionen verpackt. Diese "HIV-verpackten" Gene könnten anschließend auf Zellen gerichtet werden, die durch HIV infizierbar sind. Es wird erwartet, daß dieses Verfahren der Transformation wesentlich effizienter als gegenwärtige Verfahren ist. Ferner kann durch eine geeignete Auswahl von Genen auch das Verfahren der HIV-Infektion überwacht werden.
Zusätzlich können diese HIV-verpackungsdefekten Zellinien verwendet werden, um verschiedene Stufen des HIV-Lebenszyklus sowohl in vivo- als auch in vitro-Systemen durch ein System zu untersuchen, da die Zellen HIV-zelluläre Proteine exprimieren, jedoch nicht die RNA verpacken.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Diese Beispiele werden gegeben, um das Verständnis der Erfindung zu unterstützen und sind nicht als Einschränkung derselben auszulegen.
Die Region zwischen der HIV-1 5' LTR und dem gag-Gen ist in Fig. 1 dargestellt, die den 5, Hauptspleißdonor (SD) und die Stelle der Deletion in einem nachstehend beschriebenen Vektor, pHXBΔP1 zeigt. Eine 19-Basenpaar-Deletion in dieser Region wurde in einem infektiösen HIV-1 proviralen Klon geschaffen, der auf dem Plasmid pHXBc2 von Fisher, A.G., et al, Nature 316: 262-265 (1985) enthalten ist. Dieses Plasmid enthält ebenfalls einen SV40 Replikationsursprung, um eine effiziente Genexpression in COS-1-Zellen zu erlauben. Die Mutation wurde durch die positionsgerichtete Mutagenese erzeugt, wie in Kunkel, T.A., et al, Methods of Enzymology 154: 367- 382 (1987), beschrieben, und die Sequenz wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt (Sanger, F., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463-5467 (1977). Das mutierte Plasmid wurde mit pHXB P1 bezeichnet.
Um den Effekt der Mutation auf die virale Proteinexpression und Virionproduktion zu bewerten, wurden COS-1-Zellen mit dem pHXBc2 und pHXBΔP1 Plasmiden durch das DEAE-Dextranverfahren transfiziert [Lopata et al, Nucl. Acids Res. 12: 5707-5717 (1984); Queen and Baltimore, Cell 33: 741-748 (1983); (Sodroski, J., et al, Science 231: 1549-1553 (1986), die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind]. COS-1 Zell-Lysate und Überstände, die mit ³&sup5;S-Cystein Sodroski, J., et al, Science 231, siehe oben) 48 Stunden nach Transfektion radiomarkiert waren, wurden mit 19501 AIDS-Patientenserum ausgefällt. Der Gesamtspiegel von viralem Protein, das in den Zell-Lysaten erfaßt wurde, war-verpackungsdefekte HXBΔP1 enthalten. Siehe Figur 2A, die die Immunpräzipitation von ³&sup5;S- markierten viralen Proteinen aus COS-1 Zell-Lysaten (Spuren 1-3) oder Überständen (Spuren 4-6) mit 19501 Patientenserum nach Transfektion ohne DNA (Spuren 1 und 4), 10ug pHXBc2 (Spuren 2 und 5) oder 10ug pHXBΔP1 (Spuren 3 und 6) zeigt. Der Gesamtspiegel von viralem Protein, daß in den Zell- Lysaten erfaßt wurde, war vergleichbar für Zellen, die entweder durch HXBc2 oder HXBΔP1 transfiziert wurden. Der Spiegel von viralen Proteinen, die aus Überständen von COS-1- Zellen ausgefällt wurden, war geringfügig niedriger mit HXBΔP1 als mit HXBc2. Die Menge von Reverse-Transkriptase- (RT)-Aktivität, die in den Überständen von COS-1-Zellen gemessen wurde, die durch pHXB P1 transifizert wurden, betrug 60% derjenigen, die in Zellen gemessen wurde, die mit dem HXBc2 Vektor transfiziert wurden (Daten nicht dargestellt). Mit pHXBΔP1 transfizierte COS-1 Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion fixiert und elektronenmikroskopisch untersucht. Virale Partikel einschließlich keimenden Formen von normaler HIV-1 Morphologie wurden beobachtet. Figur 2B ist ein Elektronenmikrogramm von COS-1-Zellen, die mit pHXBΔP1 transfiziert wurden, das Viruspartikel von normaler HIV-1 Morphologie zeigt.
Um den Effekt der HXBΔP2-Mutation auf die HIV-1-Replikation zu bewerten, wurden Überstände von COS-1-Zellen, die mit pHXBc2 und pHXBΔP1 transfiziert waren, filtriert (0,2u) und RT-gemessen. Überstände, die gleiche Mengen von RT-Aktivität von Mutanten- und Wildtyp-Viren enthielten, wurden zu Jurkat Human-T-Lyinphozyten hinzugegeben. Die Jurkat-Kulturen zusammen mit einer pseudoinfizierten Kultur wurden unter dreitägigem Mediumwechsel gehalten. In Intervallen wurden Aliquoten von Jurkat-Zellen gekennzeichnet und auf die Expression von HIV-1-Proteinen durch Immunpräzipitation mit 19501 AIDS-Patientenserum untersucht. Figur 3 zeigt die Immunpräzipitation von gekennzeichneten viralen Proteinen aus Jurkat T-Zell-Lysaten (Spuren 1-3, 7-9 und 13-15) oder Überständen (Spuren 4-6, 10-12 und 16-18), die Überständen von COS-1-Zellen aüsgesetzt waren, die pseudotransfiziert wurden (Spuren 1, 4, 7, 10, 13 und 16), mit pHXBc2 (Spuren 2, 5, 8, 11, 14 und 17) oder mit pHXB P1 (Spuren 3, 6, 9, 12, 15 und 18) transfiziert wurden. Die Jurkat-Zellen wurden am Tag 7 (Spuren 1-6), Tag 14 (Spuren 7-12) und Tag 21 (13-18) nach der Infektion untersucht. Die Jurkat-Kulturen, die HXBΔP1 ausgesetzt waren, zeigten deutliche Verzögerungen und niedrigere Spiegel der viralen Proteinproduktion bezüglich denjenigen, die pHXBc2, dem Wildtyp-Virus ausgesetzt waren. Die Virusreplikation in menschlichen T-Lymphozyten, die mit HXBΔP1 transfiziert wurden, zeigte sich somit beträchtlich abgeschwächt im Vergleich zu Zellen, die durch HXBc2 transfiziert wurden.
Überstände der vorstehenden Kulturen wurden 0,2u-filtriert und äquivalente mengen von Reverse-Transkriptase-Aktivität durch Zentrifugation bei 12000xg über eine Stunde bei 20ºC pelletiert. Virale Pellets wurden durch NP40 in der Anwesenheit von Vanadyl Ribonukleotiden lysiert und Verdünnungen des Virus auf Nitrozellulosefilter als Dot-Blots aufgebracht. Einige Proben wurden mit Natriumhydroxid (5M bei 60ºC für 15 Minuten) vor der Dot-Blot-Behandlung behandelt. Die Filter wurden mit einer DNA-Sonde hybridisiert, die aus HIV-1 gag- und env-Gensequenzen bestand, gewaschen und durch Autoradiographie untersucht, wie bereits in Maniatis, T., et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) beschrieben. Für das Wildtyp-HXBc2-Virus konnte ein für RNA spezifisches Signal nach dem Blotten von 1000 Reverse-Transkriptase-Einheiten des gefilterten Überstandes (nicht dargestellt) erfaßt werden. Für HXBΔP1 ergaben sogar 5 x 10&sup4; Reverse-Transkriptase-Einheiten des Überstandes kein erfaßbares Signal. Figur 4 ist ein RNA-Dot-Blot ohne (Säule 1) und mit (Säule 2) Natriumhydroxidbehandlung nach dem Blotten der gefilterten Überstände von Jurkat-Kulturen. Die Überstände enthielten eine Reverse-Transkriptase-Aktivität von 5 x 10&sup4; cpm von HXBΔP1 (Reihe A), 5 x 10&sup4; cpm von HXBc2 (Riehe B) oder 1 x 10&sup5; cpm von HXBc2 (ReiheC). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Effizienz der Verpackung von virusspezifischer RNA in Virionen bei Zellen, die mit einem verpackungsdefekten viralen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transfiziert wurden, weniger als 2% des Wildtyp-Virus beträgt.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Region zwischen der 5' LTR und dem gag-Gen von HIV-1 wichtig für die Verpackung viraler RNA in Virionen ist. Eine Mutation in dieser Region zeigt minimale Effekte auf die Fähigkeit des Provirus, Proteine und Virionpartikel nach der Transfektion zu erzeugen, verringert jedoch deutlich den Spiegel von Virion-RNA und dämpft die Virusreplikation in einer menschlichen CD4-positiven Lymphozyten-Linie. HIV-1 repliziert in kultivierten CD4-positiven Zellen über zellfreie Transmission und Zelle-zu-Zelle-Transmission, wobei letztere mit dem Kontakt von infizierten und nicht infizierten Zellen verbunden ist [Fisher, A.G., et al, Nature 316: 262-265 (1985), Sodroski, J., et al, Science 231: 1549-1553 (1986), Strebel, K., et al, Nature 328: 728-730 (1987)].

Claims

1. Vektor, umfassend

(a) einem für HIV gag-, env- und Dol-Proteine codierenden HIV-Genom entsprechende Nucleotide, als das HIV-Segment bezeichnet, wobei die von dem Vektor in Kombination exprimierten HIV gag-, env- und pol-Proteine in der Lage sind, ein HTV-Virion zu bilden und der Vektor eine Deletion des Verpackungssegments enthält, das zur Verpackung der HIV-RNA notwendig ist, die zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und dem Initiationscodon des gag-Gens angeordnet ist; und

(b) einen mit dem HIV-Segment wirkverbundenen Promoter; wobei die von dem Vektor exprimierten HIV-Proteine in der Lage sind, HIV-Virionen zu bilden, die nicht ausreichend HIV- RNA enthalten, um in einem replikationsfähigen HIV-Virus zu resultieren.

2. Vektorsystem, umfassend wenigstens zwei Vektoren, die als erster Vektor und als zweiter Vektor bezeichnet werden, wobei die Vektoren des Systems

(a) einem für HIV gag-, env- und pol-Proteine codierenden HIV-Genom entsprechende Nucleotide, als das HIV-Segment bezeichnet, wobei die von den Vektoren in Kombination exprimierten HIV gag-, env- und pol-Proteine in der Lage sind, ein HIV-Virion zu bilden, die Vektoren eine Deletion des Verpackungssegments enthalten, das zur wirksamen Verpackung der HIV-RNA notwendig ist, die zwischen dem 5' Hauptspleißdonor und dem Initiationscodon des gag-Gens angeordnet ist, und die Vektoren eine Deletion enthalten, wodurch die HIV gag-, env- und pol-Proteine nicht durch einen einzelnen Vektor codiert werden können; und

einen mit dem HIV-Segment wirkverbundenen Promoter umfassen; wobei das Vektorsystem in der Lage ist, Virionen zu bilden, die nicht ausreichend HIV-RNA enthalten, um in einem replikationsfähigen HIV-Virus zu resultieren.

3. Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Promoter eine HIV LTR ist.

4. Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Promoter ein Promoter ist, der bevorzugt Genprodukte in bestimmten Zellen exprimiert.

5. Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Promoter ein CMV-Promoter ist.

6. Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Deletion des HIV-Verpackungssegments eine Nukleotidsequenz stromabwärts des 5' Hauptspleißdonors bis etwa 5 Basen stromaufwärts des gag-Gen Initiationscodons ist.

7. Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Deletion des HIV-Verpackungssegments eine Nukleotidsequenz ist, die etwa 9 Basen stromabwärts des 5' Hauptspleißdonors bis etwa 14 Basen stromaufwärts des gag-Gen Initiationscodons beginnt.

8. Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Deletion des HIV-Verpackungssegments die Sequenz AAAAATTTTGACTAGCGGA ist.

9. Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das HIV-Genom aus der aus HIV-1, HIV-2 und SIV bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

10. Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das HIV-Genom das HIV-1-Genom ist.

11. Vektor gemäß Anspruch 8, wobei das HIV-Genom das HIV-1- Genom ist.

12. Zellinie mit einem HIV-Verpackungsdefekt, die eine durch die Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2 transformierte, vorausgewählte Zellinie umfaßt.

13. Verfahren zur Herstellung einer Zellinie mit einem HIV- Verpackungsdefekt, das

(a) die Transformation einer vorausgewählten Zellinie mit den Vektoren gemäß Anspruch 1 oder 2

umfaßt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die vorausgewählte Zelle eine Säugetierzelle ist.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Zelle von den beiden Vektoren transformiert wird, die gemeinsam in der Lage sind, HIV-Proteine zur Bildung des Virions zu exprimieren.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Zelle durch zwei Vektoren transformiert wird und ein Vektor eine Nukleotidsequenz von unmittelbar stromaufwärts des gag-Initiationscodons bis unmittelbar Stromaufwärts der env-Gensequenz enthält und der zweite Vektor eine Nukleotidsequenz stromabwärts der gag- Gensequenz enthält und eine funktionelle env-Gensequenz einschließt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei jeder Vektor eine unterschiedliche Marker-Gensequenz enthält.

18. Stabile Zellinie, transforiniert durch das Verfahren gemäß Anspruch 15.

19. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes für HIV, das das Züchten der Zellinie gemäß Anspruch 18 und das Sammeln von von der Zellinie produzierten Virionen zur Verwendung als Impfstoff umfaßt.

20. Verfahren zur Übertragung von Genen auf Säugetierzellen, umfassend:

(a) Transfizieren der Zellinie gemäß Anspruch 18 mit einem Vektor, der eine Nukleotidsequenz enthält, die einem vorausgewählten Gen stromabwärts einer einer HIV- Verpackungssequenz zur Verpackung von HIV-RNA entsprechenden Nukleotidsequenz entspricht, und wobei das vorausgewählte Gen und die HIV-Verpackungssequenz auf beiden Seiten von einer Sequenz flankiert sind, die einer ausreichenden Anzahl von HIV LTRs entsprechenden Nukleotiden entspricht, um von der HIV-Verpackungssequenz verpackt zu werden, wobei die HIV- Verpackungssequenz und die HIV LTR-Sequenzen demselben HIV- Genom wie die HIV-Nukleotide entsprechen;

(b) Züchten der in Schritt (a) transformierten Zellinie;

(c) Sammeln von von der Zellinie gemäß Schritt (b) produzierten Virionen; und

(d) Kontaktieren der Virionen gemäß Schritt (c) mit einer vorbestimmten Zielsäugetierzelle in vitro.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Nukleotide der HIV-Verpackungssequenz die Nukleotide von 5' Hauptspleißdonor zur Bal I Stelle im gag-Gen sind und die HIV LTR-Sequenzen den gesamten HIV LTRs entsprechen.