JPH0740934B2

JPH0740934B2 - ウイルス増殖阻害方法

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Publication number: JPH0740934B2
Application number: JP58192350A
Authority: JP
Inventors: 昭梶
Original assignee: 昭梶
Priority date: 1983-10-17
Filing date: 1983-10-17
Publication date: 1995-05-10
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: JPS6083582A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ウイルス増殖阻害方法に関する。さらに、詳
しく言えば本発明は、ウイルスの増殖に際して発生する
メツセンジヤーRNAに対してハイブリツド形成しうるDNA
配列の部分構造に等しく、鎖長が９ヌクレオチド以上で
細胞膜を透過し得る長さのオリゴデオキシヌクレオチド
またはポリデオキシヌクレオチドをそのメツセンジヤー
RNAの存在箇所に供給することを特徴とするウイルス増
殖阻害方法に関するものである。本発明者は、細胞内の
蛋白合成の重要な因子であるリボゾームがメツセンジヤ
ーRNA上を移動し、核酸のコードを読む場合、その場に
メツセンジヤーRNAの塩基配列に対応するDNAが存在する
と、それがメツセンジヤーRANと二重鎖を形成し、リボ
ゾームの移動が停止し、蛋白合成が全く行われないか、
あるいは行われても不完全な蛋白の生成に留まるという
事実に着目し、ウイルス増殖阻害方法の実用化につき研
究を進めた結果、ウイルスの増殖に際して発生するメツ
センジヤーRNAに対してハイブリツド形成しうるDNA配列
の部分構造に等しく、鎖長が９ヌクレオチド以上で細胞
膜を透過し得る長さのオリゴデオキシヌクレオチドまた
はポリデオキシヌクレオチドをそのメツセンジヤーRNA
の存在箇所に供給することを特徴とするウイルス増殖阻
害方法を提供することに成功した。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明者は、まず、人工的に合成したRNAを用いてこのR
NAに対してハイブリツド形成しうるDNA配列の部分構造
に等しく、鎖長が９ヌクレオチド以上で細胞膜を透過し
得る長さのオリゴデオキシヌクレオチドを直接、無細胞
蛋白合成系に加えることにより、このRNAに基づいて合
成されるはずの蛋白が合成されなくなるという事実を発
見した（後記実験例１参照）。

また、この際、このRNAに対してハイブリツド形成しえ
ないDNA配列のオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、
同様の実験を行うと、このRNAに基づく蛋白の合成が行
われることが確認された。

次いで、本発明者は、真核細胞内に存在するαグロビン
メツセンジヤーRNAおよびβグロビンメツセンジヤーRNA
を用いて、生理条件下で、各種DNAを用いて、それらが
αグロビンおよびβグロビンの生成を阻害するか否かを
確かめる実験を行つた（後記実施例２参照）。

その結果、αグロビンメツセンジヤーRNAに対してハイ
ブリツド形成しうるDNAを直接、無細胞蛋白合成系に加
えることにより、αグロビンの生成が阻害されること、
およびβグロビンメツセンジヤーRNAに対してハイブリ
ツド形成しうるDNAを直接、無細胞蛋白合成系に加える
ことにより、βグロビンの生成が阻害されることが見出
された。また、αグロビンメツセンジヤーRNAに対して
ハイブリツド形成しえないDNAを用いたときには、αグ
ロビンの生成が阻害されず、βグロビンメツセンジヤー
RNAに対してハイブリツド形成しえないDNAを用いたとき
には、βグロビンの生成が阻害されないという事実も確
認された。

さらにまた、この実験系においては、使用するDNAがオ
リゴデオキシヌクレオチドである場合に、高い蛋白生成
阻害率を示していることが見出された。

これらの実験結果に基づき、ヘルペスシンプレツクスウ
イルスの感染初期に形成されるメツセンジヤーRNAと二
重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレオチドをヘルペス
シンプレツクスウイルス感染細胞に投与したところ、ヘ
ルペスシンプレツクスウイルスによる細胞のシンシチウ
ム（細胞融合により、プラツク状の穴が培養ペトリ皿上
の細胞群に形成すること）の形成が著しく阻害されるこ
とを確認した。

これにより、ヘルペスシンプレツクスウイルスのメツセ
ンジヤーRNAに対してハイブリツド形成しうるDNAをヘル
ペスシンプレツクスウイルス感染細胞に直接加えること
により、有効にヘルペスシンプレツクスウイルスの増殖
を阻害しうることが明らかにされた。

本発明は、かかる知見に基いてなされたものである。

すなわち本発明はウイルスのメツセンジヤーRNAに対し
てハイブリツド形成しうるDNA配列の部分構造に等しい
オリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレ
オチドをそのメツセンジヤーRNAの存在箇所に供給する
ことを特徴とするウイルス増殖阻害方法を提供するもの
である。

本発明の方法では、ウイルスに由来するメツセンジヤー
RNAの塩基配列に対応するDNA配列の部分構造に等しいオ
リゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオ
チドを用いるため、それは、他の遺伝子に由来するメツ
センジヤーRNAとは、ハイブリツド形成せず、したがつ
て、他の遺伝子による蛋白合成には影響を与えない。ウ
イルスによる蛋白合成において、前述したようにメツセ
ンジヤーRNA上でリボゾームの移動が途中で停止した場
合、ウイルスとしての機能のある蛋白がまつたく合成さ
れないか、またはウイルスとしての機能のない不完全な
蛋白が合成されウイルスの増殖が停止する。

ウイルスは、DNAウイルス（ヘルペスウイルス、アデノ
ウイルス、ワクシニアウイルス等）とRNAウイルス（イ
ソフルエンザウイルス、ライノウイルス、ポリオウイル
ス等）に分類されるところ、RNAウイルスには、二重鎖
のウイルスと単鎖のウイルスがあり、単鎖のウイルスに
は、さらにプラス鎖ウイルスとマイナス鎖ウイルスが存
在する。いづれにしても、ウイルスの蛋白合成は、メツ
センジヤーRNAとしてのプラス鎖RNAの存在なしには行わ
れない。すなわち、二重鎖DNAウイルスでは、マイナス
鎖DNAをもととして、プラス鎖RNAが作られて、メツセン
ジヤーRNAとなり、二重鎖RNAウイルスでは、またはマイ
ナス鎖RNAをもととして、プラス鎖RNAが作られて、それ
がメツセンジヤーRNAとなる。単鎖RNAウイルスのうち、
マイナス鎖RNAウイルスでは、そのマイナス鎖RNAをもと
として、プラス鎖RNAが作られて、メツセンジヤーRNAと
なり、プラス鎖RNAウイルスでは、それ自身がメツセン
ジヤーRNAとして働く。本発明方法においては、いづれ
のウイルスであつても、そのメツセンジヤーRNAとして
のプラス鎖RNAとハイブリツドを形成しうるDNAの部分構
造に等しいオリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオ
キシヌクレオチドを用いることによりウイルスの増殖を
阻害するものである。

本明細書においては、以下に、二重鎖DNAウイルスであ
るヘルペスシンプレツクスウイルスを例示して説明する
が、本発明方法は、ウイルスの種を問うことなくその適
用が可能であり、例えば、インフルエンザウイルス、ア
デノウイルス、白血病ウイルス、デング熱ウイルス、恐
犬病ウイルス、肝炎ウイルス、はしかウイルス、脳炎ウ
イルス、パラインフルエンザウイルス、ニユーキヤツス
ルウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、黄熱病
ウイルス等全ての病原ウイルスの増殖を阻害することが
できる。

したがつて、本発明は、広く動物、植物のウイルスに由
来する各種の疾病の治療、予防に利用することができる
ので、各種の分野において極めて有用なものである。

本発明の方法によれば、DNAウイルス、RNAウイルスを問
うことなく、そのウイルスが存在している生体の非感染
細胞に影響を与えることなく、ウイルスの増殖を停止さ
せ、非感染細胞への感染を防止することができる。

本発明方法において用いるオリゴデオキシヌクレオチド
またはポリデオキシヌクレオチドの正常細胞への影響に
ついては、本発明者がヘルペスシンプレツクスウイルス
のイミデイエートアーリー遺伝子のメツセンジヤーRNA
とハイブリツド形成しうる単鎖DNAの塩基配列を有する
デオキシヌクレオチドを用いて、ハムスター胎児腎細胞
に対する影響を調べたところ、該デオキシヌクレオチド
は、正常細胞の生存に影響を与えず、かつ、その増殖能
力にも影響を与えないことが判明している。

本発明方法に用いるオリゴデオキシヌクレオチドまたは
ポリデオキシヌクレオチドは、ウイルスのDNA単鎖の酵
素処理等により分解して得られるものか、あるいは、所
要のDNA配列の部分構造を合成して得られるものなど、
所望のDNA配列の部分構造を有するものであれば、その
由来はいずれでもよい。

本発明方法に用いるオリゴデオキシヌクレオチドまたは
ポリデオキシヌクレオチドを調製する方法としては、例
えば以下のような方法を例示することができる。すなわ
ち、一つの方法は、ウイルスの遺伝子をクローン化し、
そのDNAの単鎖をフラグメント化することである。

ウイルス遺伝子をクローン化するにあたり、RNAウイル
スの場合には、逆転写酵素を用いてDNAに変えるか、も
しくはそのウイルス感染細胞内に存在するウイルスDNA
をもととする。

ウイルスの遺伝子をクローン化する場合には、例えばλ
フアージ、あるいはpBR322等のプラスミドベクターを用
いて二重鎖DNAを得るか、またはM13フアージ等を用いて
単鎖DNAを直接得る方法を使用する。クローン化する遺
伝子は、ウイルスに含まれる遺伝子の核酸鎖のどの部分
でもよいが、増殖に際し、早期に発現するアーリー（ea
rly）遺伝子あるいはイミデイエートアーリー（immedia
teearly）遺伝子をクローン化することが好ましい。

クローン化したDNAを大量に複製するためには、例え
ば、ウイルスの遺伝子を組み込ませたフアージ、あるい
はプラスミドを保有する大腸菌を必要に応じて抗生物質
を加えた適当な容積の培養液中で常法により培養し、集
菌した後クローン化したウイルスの遺伝子を含むDNAを
分離する。この分離に際しては、フエノール、フエノー
ル−クロロホルム等の有機溶媒処理によりDNAを抽出す
ることができる。

分離したDNAからウイルスのDNAを取り出すには、制限酵
素で分解し、アガロースゲル電気泳動法、カラムクロマ
トグラフイー等を用いる。

得られたウイルスのDNAは、必要に応じてフラグメント
化する。このためには、例えばエンドヌクレアーゼ等の
制限酵素による処理あるいは超音波処理を行う。フラグ
メントの鎖長は、通常、100ヌクレオチドから、９ヌク
レオチド位までの範囲になるように考慮される。M13フ
アージを用いて調製する場合は、直接単鎖のフラグメン
トが得られるが、本発明方法の性質から考えてあらかじ
めウイルスの遺伝子のメツセンジヤーRNAと二重鎖を形
成し得る単鎖DNAを選び、クローン化しておかなければ
ならない。

pBR322、λフアージを用いて得られたウイルスのDNAの
フラグメントは、単鎖とするため、例えば、100℃で10
分間加熱後、急冷する。生成物には、所望のDNAフラグ
メントの単鎖が存在しているのでこれをそのまま本発明
方法に使用することができるが、また、この生成物中に
はウイルスの遺伝子のメツセンジヤーRNAに相補的でな
い単鎖フラグメントも存在しているので、これをアフイ
ニテイークロマトグラフイー等を用いて除くことが好ま
しい。

また、本発明方法に用いるオリゴデオキシヌクレオチド
または、ポリデオキシヌクレオチドは有機合成によつて
も製造することができる。この場合は、そのオリゴデオ
キシヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオチドの
塩基配列は、ウイルスの遺伝子のメツセンジヤーRNAの
塩基配列に対してハイブリツド形成しうる塩基配列でな
くてはならない。

例えば、ヘルペスシンプレツクスウイルスでは、イミデ
イエートアーリー（immediate early）DNAの一つが、プ
ラスDNA（５′−ATG・GCG・TCG・GAG……）とマイナスD
NA（３′−TAC・CGC・AGC・CTC……）の二重鎖を形成し
ているが、これらの内、メツセンジヤーRNAと二重鎖を
形成するTAC側（マイナス鎖DNA）のDNAの配列を選び合
成する。

また、例えば、インフルエンザウイルスの場合は、イン
フルエンザウイルスの遺伝子として、ヘマグルチン遺伝
子とNS（Non Structual）遺伝子があるが、ウイルスの
増殖を阻害するためには、DNAの塩基配列にバリエーシ
ヨンがあるヘマグルチン遺伝子よりも、NS遺伝子の発現
を停止させるのが好ましく、このNS遺伝子のメツセンジ
ヤーRNAに対して、ハイブリツド形成しうる単鎖DNAの塩
基配列を選ぶのがよい。例えば、NS1遺伝子（Lambら、C
ell 21 475（1980））を例にとつていえば、このNS1遺
伝子のメツセンジヤーRNAに対して、ハイブリツド形成
しうる単鎖DNAの塩基配列、例えば、５′−…ACT・TGA
・CAC・AGT・GTT・GGA・ATC・CAT……−３′の塩基配列
中の適当な長さの塩基配列を選び合成する。

さらに、畜産関係のウイルス、例えばラウスのトリ肉腫
ウイルスの場合についていえば、gag.pol.env.のいづれ
かの遺伝子の発現を阻害する。ここで、gag遺伝子の発
現を阻害する場合、例えばgag遺伝子の一部であるP19の
塩基配列から考えて、５′−…AAT・CAC・CTT・TAT・GA
C・GGC・TTC……−３′の塩基配列中の適当な長さの塩
基配列を選び合成する。

このようにして、他のいずれのウイルスの場合でも、増
殖を阻害しようとするウイルスのメツセンジヤーRNAに
対して、ハイブリツド形成しうる単鎖DNAの塩基配列中
の適当な長さの塩基配列を選び、その塩基配列のオリゴ
デオキシヌクレオチドまたは、ポリデオキシヌクレオチ
ドを合成し、そのオリゴ（またはポリ）デオキシヌクレ
オチドを用いてそのウイルスの増殖を阻害することがで
きる。

本発明方法において、ウイルスの増殖に際して発生する
メツセンジヤーRNAに対してハイブリツド形成しうるDNA
配列の構造を有するオリゴデオキシヌクレオチドまたは
ポリデオキシヌクレオチドをウイルスが感染している生
体の細胞内に供給しようとする場合に、そのオリゴデオ
キシヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドとと
もにリン酸カルシウム等のリン酸塩を合せて用いると細
胞内への取り込みが促進される。本発明方法において
は、前記のオリゴデオキシヌクレオチドまたはポリデオ
キシヌクレオチドを、必要に応じ、他の適当な添加剤を
用いて、注射用蒸留水等に溶解し、それをウイルスに感
染した生体組織に直接注入し、または血管内に投与して
還流させることができる。

次に、本発明方法で使用するオリゴデオキシヌクレオチ
ドまたはポリデオキシヌクレオチドの調製について説明
する。

具体例１ヘルペスシンプレツクスウイルスをクロロホルム−フエ
ノールの有機溶媒で処理して得られたDNAを制限酵素、B
amHIで切り、あらかじめ制限酵素、BamHIで切つておい
たベクターpBR322にT4フアージリガーゼを用いて組み込
んだ。得られたプラスミドを大腸菌に与え、アンピシリ
ンを含む寒天培地上でコロニーを形成させた。これらの
コロニーのうちからヘルペスシンプレツクスウイルスの
³²PでラベルしたDNAにハイブリダイズするものをフイル
ターハイブリダイゼイシヨン法で選び、50μg/mlの濃度
でアンピシリンを含む２のTSB（Tryptose Soy Brot
h）培地で培養する。この培地1mlに対し、上記プラスミ
ドを含む大腸菌を10⁶〜10⁷個加え、20mlの試験管中で37
℃、15時間振とう培養した。培養液の540nmにおける吸
光度が0.5になるまで培養したところで、100μg/mlのク
ロラムフエニコールを加え、更に15時間培養を続けた。

こうして得られた大腸菌培養液を遠心処理することによ
り得られたペレツトに25％シヨ糖を含む50mMトリス塩酸
（pH＝8.0）を加え、これを０℃以下で５分間放置し、4
mlのTriton−X100を加えて生成した粘稠な液を０℃、30
000gで30分間遠心分離した。この上清8mlにCsCl8g及びE
thidium Bromide（５μg/ml）1mlを加えて更に100000
g、48時間遠心分離することにより生成した粗プラスミ
ド分画を採取し、２倍量のイソプロピルアルコールを加
えて混和し、上清を除いた後、0.1Mトリス10mM EDTA（p
H＝8.0）で１液透析した。透析内液を濃縮し、DNA200μ
ｇ相当量を取り、過剰量の制限酵素（BamHI）を加えて
反応させた後、アガロース電気泳動法により、ヘルペス
シンプレツクスウイルスのDNAを分離した。このDNAを次
にDNAaseで部分分解した後、100℃で10分間加熱後、急
冷し、鎖長９〜100位のオリゴデオキシヌクレオチドな
いしポリデオキシヌクレオチドを得る。

具体例２クローン用のM13フアージの複製形二重鎖DNAをBamHIで
切断した。次に具体例１で分離したヘルペスシンプレツ
クスウイルスのDNAと、この切断されたM13フアージの複
製形二重鎖DNAをT4フアージリガーゼを用いて結合し
た。この結合されたDNAを常法により、CaCl₂の存在下、
lac（−）大腸菌内に入れ、フアージプラツクをＸ−gal
（インジケーター）の存在下で作らせた。ヘルペスシン
プレツクスウイルスDNAを含有するM13フアージは、24時
間後に、青色を示さないフアージプラツクを形成した。
これに³²Pでラベルしたヘルペスシンプレツクスウイル
スDNAのプラス鎖（鎖長20デオキシヌクレオチド以上）
とハイブリダイズするプラークを採取した。これは、青
色を示さないフアージプラツクにはヘルペスシンプレツ
クスウイルスの二重鎖DNAのそれぞれ片側のDNAどちらか
のみが含有されるためである。

このM13フアージをフエノール−クロロホルムで処理しD
NAを分離した。

上記で得られたDNAは、ヘルペスシンプレツクスウイル
ス単鎖DNAを含むが、さらに精製を行い、この中に含ま
れるM13フアージのDNAを除去してもよく、あるいはDNAa
se部分分解し、鎖長９〜100位のオリゴデオキシヌクレ
オチドないしポリデオキシヌクレオチドとすることがで
きる。

具体例３ DNA合成装置（Applied Biosystem社製）を用いてヘルペ
スシンプレツクスウイルスのイミデイエートアーリー
（immediate early）DNAのマイナスDNAの内、プラスDNA
と二重鎖を形成するオリゴデオキシヌクレオチド（３′
−…TAC・CGC・AGC・CTC・TTG・TTC・GTC・GCG…−
５′）の内の20デオキシヌクレオチド（３′−CGC・AGC
・CTC・TTG・TTC・GTC・GC−５′）を合成し、精製し
た。以下、この20デオキシヌクレオチドを20merと略記
する。

次に本発明を実施例により説明する。

実施例１（ａ）マイクロプレート（リンブロ社製、穴内径1.5c
m）に一穴あたり1.5×10⁵個のハムスター胎児腎細胞（B
HK cell）を入れ、５％CO₂インキユベーター中で、36℃
で47時間培養し、この細胞に１型ヘルペスシンプレツク
スウイルス（HSV−１）（7.6×10⁴PFU/ml）160μを加
え、36℃で３時間感染させた。この感染細胞に種々の量
の20merとこれに対応する量のリン酸カルシウム−塩化
カルシウムを、ラドルの方法（Loiterら、Proc.Nat.Aca
d.Sci.79 422（1982））に準拠して合せたものを加え、
８時間培養した。次に、この培養液を除き、さらに通常
の培養液を加えて13時間培養した。

（ｂ）別に、上記（ａ）の操作において、20merのみを
使用せずに他は、すべて同様にして、培養操作を行つ
た。

（ｃ）さらに、また別に、上記（ａ）の操作において、
20merおよびリン酸カルシウム−塩化カルシウムを使用
せずに他は、すべて同様にして、培養操作を行つた（ウ
イルスコントロール）。

上記（ａ）（ｂ）（ｃ）の培養細胞を固定し、染色し、
シンシチウムの数を計測した。この結果をウイルスコン
トロール（ｃ）のシンシチウム数を100％として、第１
図に示す。

第１図に示すごとく、20merを使用した場合は、ウイル
スの増殖が顕著に阻害された。リン酸カルシウム−塩化
カルシウムは、ウイルスの増殖に影響を与えなかつた。

実施例２（ａ）マイクロプレート（リンブロ社製、穴内径1.5c
m）に一穴あたり1.5×10⁵個のハムスター胎児腎細胞（B
HK cell）を入れ、５％CO₂インキユベーター中で、36℃
で47時間培養し、この細胞に１型ヘルペスシンプレツク
スウイルス（HSV−１）（7.6×10⁴PFU/ml）160μを加
え、36℃で３時間感染させた。この感染細胞に、種々の
量の20merをCaCl₂最終濃度4.55mMで８時間培養した後、
さらに14時間培養した。

（ｂ）別に、上記（ａ）の操作において、20merに代え
て、HSV−１とは無関係の塩基配列を持つたオリゴデオ
キシヌクレオチド（５′−CAC・GAC・AGA・GGG・CGA）
を用い、他は、すべて同様にして、培養操作を行つた。

（ｃ）さらに、また別に、上記（ａ）の操作において、
20merのみを使用しないで他は、すべて同様にして、培
養操作を行つた（ウイルスコントロール）。

上記（ａ）（ｂ）（ｃ）の培養細胞を固定し、染色し、
シンシチウムの数を計測した。この結果をウイルスコン
トロール（ｃ）のシンシチウム数を100％として、第２
図に示す。

第２図に示すごとく、20merは、ヘルペスシンプレツク
スウイルスの増殖に対して阻害作用を示した。この実験
では、20merは、4.55mM Caイオンの存在下、阻害作用を
示すことが認められた。ヘルペスシンプレツクスウイル
スのDNAと、二重鎖を形成しないDNAは、増殖阻害作用を
全く示さなかつた。このことから、阻害作用は、ヘルペ
スシンプレツクスウイルスのマイナス鎖DNAに特異的に
見られることが明らかである。

実施例３実施例１は、人工的に、合成した１型ヘルペスシンプレ
ツクスウイルスのイミデイエートアーリー（immediate
early）DNAのマイナス鎖の内の20ヌクレオチド鎖を用い
た例であるが、クローン化した１型ヘルペスシンプレツ
クスウイルス（HSV−１）DNAを用いても同様の効果が得
られた。本実施例では、pBR322（ベクター）に1.45メガ
ダルトンのHSV−１−DNAフラグメント（Bam H1で切つて
得られたもの）が含まれているものを阻害剤として用い
た。すなわち、プラスミドそのものをHSV−１−DNAを切
り出さずに、そのまま、0.16μg/wellを使用し、実施例
１に準拠した方法で実験を行なつた。その結果、実施例
１と同様に、シンシチウムの生成の阻害が見られた。こ
の際コントロールとしてpBR322のDNAを用いたが、pBR32
2のDNAそのものは、いずれの効果も示さなかつた。

以下に、本発明に関連してなされた実験例を掲げる。

実験例１メツセンジヤーRNAとしてポリウリジル酸を用いたポリ
フエニルアラニン合成反応のポリアデニル酸及びデオキ
シポリアデニル酸による阻害作用ポリウリジル酸（140μｇ）、¹⁴C−フエニルアラニン
（10⁵cpm、300μCi/μmole）、Nierenberg and Mathaei
の方法（Proc.Nat.Acad.Sci.47 1588（1961））により
作成した大腸菌抽出液、13mM酢酸マグネシウム塩、1mM
ATP、1mM燐酸クレアチン、クレアチンホスホキナーゼ
（１μｇ）を10mMトリス塩酸（pH7.5）に溶解して反応
液系を作つた。この反応液系に第一表に列記した阻害剤
を加え40μとし、1.5mlのエツペンドルフ管中で37
℃、30分間反応させ、反応により得られた溶液中のポリ
フエニルアラニンの量を10％トリクロール酢酸に95℃で
不溶の放射蛋白の量とし、液体シンチレーシヨンカウン
ターを用いて測定した。阻害度は、阻害剤を加えない時
のポリフエニルアラニンの放射能と加えた時の放射能を
比較して算出した。その結果を第一表に示す。

第一表に示すごとく、ポリウリジル酸（RNA）に対し
て、その塩基配列に対応するポリデオキシアデニル酸
（DNA）は、著しいポリフエニルアラニンの合成阻害活
性を示した。この実験においては、DNA鎖は９ヌクレオ
チド以上のオリゴデオキシアデニル酸（オリゴデオキシ
ヌクレオチド）まで強い阻害活性を示した。

実験例２ウサギの網状赤血球系におけるグロビン合成のグロビン
単鎖DNAによる特異的阻害作用この実験例は、真核細胞のメツセンジヤーRNAに対して
ハイブリツド形成するオリゴデオキシヌクレオチドまた
はポリデオキシヌクレオチドを用いて生理的な条件下
で、蛋白の合成を阻害することを確かめた実験例であ
る。

4.2mMリン酸カルシウム、2mMジメチルチオスレイトール
（DTT）、0.08mMアミノ酸（メチオニンを除く）、6mM酢
酸カリウム、8mM酢酸マグネシウム、スペルミジン4.5μ
ｇ、³⁵S−メチオニン（0.1μCi）、およびJacksonとPal
hamらの方法（Eur.J.Biochem.67.247−256（1976））に
より作成した無細胞網状赤血球蛋白合成系10μ、α及
びβグロビンメツセンジヤーRNA各75μｇを21mM HEPES
に溶解して第二表に列記した阻害剤を加え、総量30μ
とした後、1.5mlのエツペンドルフ管中で30℃、30分間
反応させた。

上記の反応により得られた溶液中の反応生成物は、Trit
on−Acid−Ureaゲルでαグロビン、βグロビン、その他
の蛋白に分け、ラジオオートグラフイーで各分画の放射
能を測定した。阻害度は、阻害剤を加えない時の放射能
と比較して算出した。その結果を第二表に示す。

第二表に示すごとく、αグロビンのゲノムDNAは、αグ
ロビンの合成のみを、βグロビンのゲノムDNAは、βグ
ロビンの合成のみを特異的に阻害する。ウシ胸線DNAは
殆ど阻害活性を示さなかつた。このことから真核細胞の
メツセンジヤーRNAの塩基配列に相当するDNAの存在によ
つてそのメツセンジヤーRNAに基づく蛋白合成が特異的
に阻害されることがわかる。さらに、αグロビンのＮ末
端アミノ酸に相当する15オリゴデオキシヌクレオチドが
αグロビンの合成のみを阻害すること及びM13フアージ
の15オリゴデオキシヌクレオチドがαグロビン並びにβ
グロビンの合成にほとんど影響を与えていないことか
ら、メツセンジヤーRNAの塩基配列に相当するDNA鎖が15
ヌクレオチドまで短かくなつた場合でも、その阻害活性
と特異性は失なわれないことがわかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例１におけるウイルスの増殖阻
害テストの結果を示すグラフである。グラフの横軸はμ
gDNA/well、縦軸は、ウイルスコントロール（ｃ）のシ
ンシチウム数を100％として算出したシンシチウム数の
％を示す。第２図は、本発明の実施例２におけるウイルスの増殖阻
害テストの結果を示すグラフである。グラフの横軸はμ
gDNA/well、縦軸は、ウイルスコントロール（ｃ）のシ
ンシチウム数を、100％として算出したシンシチウム数
の％を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウイルスの増殖に際して発生するメツセン
ジヤーRNAに対してハイブリツド形成しうるDNA配列の部
分構造に等しく、鎖長が９ヌクレオチド以上で細胞膜を
透過し得る長さのオリゴデオキシヌクレオチドまたはポ
リデオキシヌクレオチドをそのメツセンジヤーRNAの存
在箇所に供給することを特徴とするウイルス増殖阻害方
法。