NL8403163A - Werkwijze voor het remmen van virus voortplanting, en een anti-viraal agents. - Google Patents

Description

-1- P HP/lh/1, Akira Kaji

Titel: Werkwijze voor het remmen van virus voortplanting, en een anti-viraal agents.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het remmen van virus voortplanting, omvattende het aanleveren van een of meer oligodesoxynucleotiden of poly-desoxynucleotiden op een plaats waar een bij voortplanting 5 van virus gevormde boodschapper RNA (mRNA) aanwezig is, welke wordt gekenmerkt doordat de DNA volgorde van de oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden identiek is met een deel van de DNA struktuur die hybridiseerbaar is met de boodschapper mRNA, waarbij de struktuur hybridiseer-10 baar is met de boodschapper mRNA. Voorts heeft de uitvinding betrekking op anti-viraal agents, omvattende een werkzame hoeveelheid van een of meer oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden met een gebruikelijke vloeistof-drager of vulmiddel, welk anti-viraal agents wordt gekenmerkt 15 door dat de DNA volgorde van de oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden identiek is met een deel van de struktuur van DNA dat hybridiseerbaar is met een bij de voortplanting van virus gevormd boodschapper mRNA, waarbij de struktuur hybridiseerbaar is met het boodschapper mRNA.

20 De werkwijze en het agents kunnen alom worden toegepast bij de behandeling van virusziekten,

De huidige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het remmen van de virus voortplanting en op een anti-viraal agents. In het bijzonder heeft de huidige uit-25 vinding betrekking op een werkwijze voor het remmen van de virus voortplanting, waarbij een specifiek oligo- of polydesoxynucleotide wordt gebruikt op de plaats die is geïnfecteerd door het virus, als ook op een anti-viraal agents dat een specifiek oligo- of polydesoxynucleotide 30 bevat.

£ i 7 i fi 7 f -2-

In een vroeg stadium bij de behandeling van ziekten die worden veroorzaakt door virus, werden chemisch gesynthetiseerde medicijnen en antibiotica gebruikt als anti-virale agents voor het remmen van de virus voortplanting.

5 In het geval van de chemisch gesynthetiseerde medicijnen is echter een anti-viraal spectrum tamelijk nauw en ontstaan schadelijke bijwerkingen als gevolg van dergelijke in aanmerking komende medicijnen.

In het geval van de antibiotica is er echter een 10 schadelijk nadeel, doordat de ontwikkeling van nieuwe type antibiotica altijd vereist is naast pogingen voor het verminderen van elke nadelige bijwerking die optreedt bij het gebruik van antibiotica, omdat virus resistent wordt tegen de gebruikte antibiotica en met verloop van tijd daartegen 15 immuun wordt.

Met de recente ontwikkeling van de biotechnologie, met name genetische manipulatie, is de identificatie van structurele genen van virus een belangrijk research onderwerp geworden bij degenen die betrokken zijn bij de studie 20 van micro-organismen. In 1977 beschreven S.C. Inglis et al. de in vitro translatie van cytoplasmatisch RNA dat is geëxtraheerd uit uit kippenembryo afkomstige fibroblasten die waren geïnfecteerd met influenza A virus, in een op tarwe-kiemen gebaseerd celvrij eiwit-synthetiserend systeem, met 25 als resultaat dat de synthese van het virus specifieke polypeptide dat overeenkomt met het gehybridiseerde v-RNA segment is verminderd (Virologie 78, 522-536 (1977)).

De experimenten, waarnaar in deze referentie is verwezen, worden uitgevoerd in een cel-vrij systeem en heeft geen 30 enkele relatie met de studie van geneesmiddelen. Een dergelijke structurele gen identificatie wordt ook beschreven door B.M. Paterson et al. in Proc. National Academy of Science, U.S.A., 74, 4370-4374 (1977)). De door Paterson et al. uitgevoerde experimenten worden ook uitgevoerd in een 35 cel-vrij systeem. In deze twee publicaties wordt voor het remmen van de eiwitsynthese gebruik gemaakt van een enorme genetische structuur, zoals RNA zelf, dat is geextraheerd uit het influenza-virus overeenkomstig de eerstgenoemde 640 3 1 S3 * i -3- publicatie, of konijnen β globine kloon PJBG1 in de als tweede genoemde publicatie. Van een dergelijke enorme structuur kan niet worden verwacht dat deze de intracellulaire synthese van eiwit remt.

5 In 1978 beschreven P.C. Zamecnik et al. dat een tridecameer oligodesoxynucleotide dat complementair is met de herhalende 3'- en 51-eindigende nucleotiden van Rous sarcoom virus (RSC) een effectieve remmer is van de eiwitsynthese als gevolg van viraal RNA in een op tarwe 10 gebaseerd celvrij systeem (Proc. National Academy of

Science/ U.S.A., 74/ 4370-4374 (1977)) en in een in vitro weefsel cultuur systeem (ibid. 75, 280-284 (1978)).

Met betrekking tot de eerste publicatie wordt nog steeds het cel-vrije systeem gebruikt als voorheen, maar met een aantal 15 verbeteringen met betrekking tot het gebruik van DNA met een kleinere moleculaire structuur voor het remmen van de translatie van eiwit. In de tweede publicatie worden experimenten uitgevoerd, waarbij het tridecameer wordt gebruikt in een weefsel cultuur systeem voor het remmen van 20 de virus replicatie en transformatie van cellen. Het in deze publicaties gebruikte DNA voor het remmen van de replicatie en transformatie is geselecteerd voor wat betreft een gebied dat anders is dan een specifiek coderend gebied, welke niet wenselijk is. In het zelfde jaar beschreven ook 25 N.D. Hastie et al. dat de hybridisatie van globine mRNA naar zijn corresponderend cDNA specifiek de translatie van mRNA blijkt te remmen in een cel-vrij systeem (ibid. 75, 1217-1221 (1978)). Nieuw in deze publicatie is slechts dat een bepaald coderend gebied van het DNA is gekozen voor het remmen van 30 de translatie door hybridisatie van mRNA. De hierin beschreven experimenten worden echter nog steeds uitgevoerd in een cel-vrij systeem. Er is echter een behoefte voor het ontwikkelen van op deze theorie gebaseerde medicijnen sinds de publicatie van deze publicaties in 1978. Tot nu 35 toe is er echter geen referentie verschenen met betrekking tot een inrichting voor het praktisch gebruik van deze theorie in in vivo experimenten.

8403153 -4- i. 2

In 1983 werd een PCT octrooi-aanvrage gepubliceerd met betrekking tot een oligonucleotide bevattend therapeutisch agents, en werkwijzen voor het maken daarvan (Molecular Biosystems INC., Inti. Publn. No. WO83/01451).

5 Wat in deze aanvrage wordt beschreven is echter een enkele bewering, dat (-)-keten DNA verkregen uit een bepaald coderend gebied SV 40 getransformeerde cellen remt.

Ofschoon de uitdrukking "in vivo" dikwijls wordt gebruikt in Voorbeeld 1 van deze referentie, zijn de daarin 10 gegeven beschrijvingen binnen het geheel van de context slechts suggestief voor experimenten met een in vitro cel cultuur systeem. Zelfs indien dergelijke in vitro experimenten worden geacht in vivo experimenten te zijn, ontbreken daarbij concrete condities daarvoor en zijn niets 15 anders dan een geuite verwachting van gewenste effecten.

Deze referentie suggereert voor de eerste keer de toepassing van RNA-DNA hybridisatie techniek als een medicijn maar geeft geen gedetailleerde beschrijving voor een wezenlijk gebruik als medicijnen en is niets anders dan een samen-20 brengen van op dat moment aanwezige kennis. Hetgeen in deze octrooiaanvrage wordt beschreven heeft geen betrekking op hetgeen verder gaat dan het technische niveau dat is beschreven in de hiervoor beschreven publicaties.

Onder de hierboven genoemde omstandigheden is er 25 een grote behoefte aan het verschaffen van een volledig nieuw type anti-viraal agents door het ontwikkelen van de theorie met betrekking tot het remmen van de mRNA virus translatie op basis van RNA-DNA hybridisatie technieken voor het in vivo realiseren van de remming van de virus voort-30 planting.

Daarom is het een doel van de huidige uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het remmen van de virus voortplanting, welke omvat het aanleveren van het specifieke oligo- of polydesoxynucleotide op de plaats die 35 is geïnfecteerd door het virus.

Het is een ander doel van de huidige uitvinding een nieuwe type anti-viraal agents te verschaffen, dat een '840 3 1 83 * » -5- specifiek oligo- of polydesoxynucleotide bevat.

Het is nog een ander doel van de huidige uitvinding het gebruik te verschaffen van een oligo- of polydesoxynucleotide waarvan de DNA volgorde identiek is met een deel 5 van de DNA struktuur die hybridiseerbaar is met mRNA dat door de voortplanting van virus is gevormd, waarbij de struktuur in staat is met mRNA te hybridiseren voor het remmen van de virus voortplanting.

Andere doelen, kenmerken en voordelen van de 10 huidige uitvinding zullen meer duidelijk worden door de volgende beschrijving.

De huidige uitvinding zal verder duidelijker worden begrepen uit de volgende beschrijving in samenhang met de begeleidende tekeningen, waarin: 15 Fig. 1 een grafiek is die het resultaat van experimenten weergeeft, welke het inhiberend effect van het oligodesoxynucleotide (het 20 A) demonstreert op het cytopatische effect van HSV-1.

Fig. 2 een grafiek is die het resultaat van de 20 experimenten toont, welke het inhiberende effect toont van het oligodesoxynucleotide (het 20 A) op virus voortplanting.

Fig. 3 een grafiek is, die het effect toont van een bepaalde combinatie van de oligodesoxynucleotiden op de remming van de vermeerdering van virus en het pathogenische 25 effect daarvan, in vergelijking met een enkelvoudig daarbij gebruikt oligodesoxynucleotide.

Fig. 4 een grafiek is die het resultaat van experimenten toont, welke zijn opgezet om de effectiviteit in vivo te tonen van het anti-virale agents volgens de 30 uitvinding.

De huidige uitvinder heeft gevonden, dat indien een oligodesoxynucleotide of polydesoxynucleotide, waarvan de DNA volgorde identiek is met een deel van de struktuur van DNA dat hybridiseerbaar is met mRNA dat wordt gevormd bij 35 de voortplanting van virus, wordt aangeleverd op de plaats waar het mRNA aanwezig is, deze struktuur die in staat is met mRNA te hybridiseren, de voortplanting van het virus daadwerkelijk kan remmen. Door het toedienen van de «4 0 3 1 6 3 4 * -6- oligo- en polydesoxynucleotiden aan dieren die zijn geïnfecteerd door een virus, is de uitvinder er in geslaagd een anti-viraal agents te verschaffen dat in staat is effectief in vivo de voortplanting van virus in een levend dier 5 te remmen. De huidige uitvinding heeft dit bereikt op basis van de volgende gegevens.

Zoals voorheen is beschreven, was de hybridisatie van viraal of globine RNA tot het corresponderende DNA voor de remming van eiwitsynthese bekend uit de hiervoor 10 genoemde publicaties. De meerderheid van de daar op betrekking hebbende experimenten was echter uitgevoerd in een cel-vrij systeem, met uitzondering van Zamecnik's tweede publicatie (Proc. National Academy of Science, U.S.A., 75, 280-284) en Molecular Biosystem Ine. publicatie 15 (PCT, International Publication No. WO83/01451) waarin de remming van de virus voortplanting in een in vitro cel cultuur systeem is beschreven. Bij de in vitro experimenten van Zamecnik is het DNA echter gekozen uit een gebied dat anders is dan een specifiek coderend gebied voor het virus.

20 Met de term "coderend gebied" wordt hier bedoeld, een gebied van virale genen die de aminozuurvolgorde van virale eiwitten bepalen en die een transcriptie door RNA-polymerase ondergaan voor de vorming van mRNA. Anderzijds ontbreken in de Molecular Biosystem Ine. publicatie uiteen-25 zettingen over de concrete condities voor deze experimenten. De huidige uitvinder heeft een uitgebreid onderzoek en experimenten met in vitro en in vivo systemen uitgevoerd, waarbij gebruik werd gemaakt van specifieke oligodesoxy-nucleotiden of polydesoxynucleotiden die gekozen zijn uit 30 een specifiek coderend gebied en heeft het voor de eerste keer mogelijk gemaakt de theorie met betrekking tot het remmen van de virus voortplanting te ontwikkelen op basis van de RNA-DNA hybridisatie techniek tot een praktisch bruikbaar therapeutisch niveau, waardoor het gebruik van de 35 oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden als een medicijn voor het remmen van de virus voortplanting mogelijk is geworden. De huidige uitvinding is dus geheel verschillend van de bekende techniek met betrekking tot twee 3403133 » £ -7- concepten: de keuze van DNA voor wat betreft een specifiek coderend gebied dat hybridiseerbaar is met virus mRNA, en het gebruik van een enkele desoxynucleotide keten met een korte keten lengte, als geselecteerd DNA met het specifieke 5 coderende gebied, en onderscheidt zich ook door het ontwikkelen van de bovengenoemde concepten tot een praktisch bruikbaar niveau met behulp van bestaande in vivo experimenten.

Overeenkomstig de huidige uitvinding wordt dus een 10 werkwijze verschaft voor het remmen van virus voortplanting, omvattende het aanleveren van een of meer oligodesoxy-nucleotiden of polydesoxynucleotiden op een plaats waar een bij voortplanting van virus gevormde boodschapper mRNA aanwezig is, welke wordt gekenmerk door dat de DNA volgorde 15 van de oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden identiek is met een deel van DNA struktuur die hybridiseerbaar is met de boodschapper mRNA, waarbij de struktuur hybridiseerbaar is met de boodschapper mRNA.

Overeenkomstig de huidige uitvinding wordt ook een 20 anti-viraal agents verschaft, dat omvat een werkzame hoeveelheid van een of meer oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden met een gebruikelijke vloeistofdrager of vulmiddel, welke gekenmerkt wordt door dat de DNA volgorde en de oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden identiek 25 is met een deel van de struktuur van DNA dat hybridiseerbaar is met een bij de voortplanting van virus gevormde boodschapper mRNA, waarbij de struktuur hybridiseerbaar is met de boodschapper mRNA.

De uitvinder ontdekte eerst, dat indien een 30 synthetisch RNA als mRNA werd getransleerd in een in vitro eiwit synthetiserend systeem, de eiwitsynthese werd geremd door een oligodesoxynucleotide dat hybridiseert met het synthetisch RNA (Zie het hieronder Voorbeeld 25}.

Oligodesoxynucleotiden die niet hybridiseren met 35 RNA inhiberen niet de eiwitsynthese in dit systeem.

Ten tweede ontdekte de uitvinder dat oligodesoxynucleotiden van de (-)-keten volgorde van cL-globine of J-globine DNA de translatie van 840 31 6 3 è. * -8- het corresponderende mRNA remmen (zie het hieronder beschreven Voorbeeld 26).

Als resultaat van dit experiment werd gevonden, dat ^-globine DNA specifiek de translatie van <t-globine 5 mRNA remt in het in vitro systeem. Bovendien werd gevonden, dat het £-globine DNA specifiek de translatie van p -globine mRNA in dit systeem remt. Bovendien werd de produktie van van P-globine niet geremd, indien DNA dat niet hybridiseert met het -globine mRNA, werd gebruikt. Op soortgelijke wijze 10 werd de £f-globine produktie niet geinhibeerd door DNA dat niet hybridiseert met <2-globine mRNA. Verder werd gevonden dat niet alleen DNA met een lange keten, maar ook oligo-desoxynucleotiden een sterk remmend effect als gevolg van hybridisatie hebben in dit systeem.

15 Op basis van deze experimenten werden verdere experimenten uitgevoerd met betrekking tot herpes-simplex-virus (HSV) infectie. Indien DNA of oligodesoxynucleotiden kunnen hybridiseren met het eerste mRNA van HSV, werd gegeven aan cellen die waren geïnfecteerd door dit virus, 20 werd gevonden dat het aantal syncytia (een gatvormige plaque werd gevormd door HSV als gevolg van de fusie van geïnfecteerde cellen) als gevolg van HSV aanmerkelijk was verminderd.

In de bovenstaande experimenten, werden CaC^ en 25 Ca fosfaat te zamen met DNA gebruikt voor het stimuleren van de penetratie van DNA tot in de cellen. In afzonderlijke experimenten werd echter gevonden, dat het oligodesoxy-nucleotide zelfs zonder deze calciumzouten kan worden opgenomen, en dus de voortplanting van HSV en zijn cytopathische 30 effecten remt (zie het hieronder beschreven Voorbeeld 7).

Uit deze experimenten werd duidelijk dat de minketen DNA, die hybridiseert met aan mRNA van HSV-1 de syn-cytiumvorming door dit virus remt. Gebaseerd op deze waarneming diende de uitvinder verder dergelijk DNA toe aan muizen die 35 waren geïnfecteerd met HSV,en toonde aan, dat dergelijk DNA kan worden gebruikt als een anti-viraal agents voor de , in vivo behandeling van virale ziekten.

840 3 1 8 3 * Λ -9-

Noemenswaardig is hier dat slechts de negatieve keten DNA die specifiek is voor het mRNA van het bepaalde virale gen wordt gebruikt als een werkzame component in het agents, en in de werkwijze volgens de huidige uitvinding.

5 Daarom zal de biosynthese van cellulair eiwit dat geprogrammeerd wordt door andere mRNA's, niet worden beïnvloed door het gebruik van het hierboven genoemde DNA.

Er zijn twee groepen virussen? DNA virussen (herpes-simples-virus, adeno-virus, vaccinia-virus, etc.) en 10 RNA virussen (influenza-virus, rhino-virus en polio-virus, etc.). RNA virussen dragen ofwel RNA met een enkelvoudige keten, ofwel RNA met een dubbele keten als een genoom.

Virussen met een uit een enkelvoudige keten opgebouwd RNA worden geclassificeerd als die welke als genoom plus-keten 15 RNA, en min-keten RNA dragen.

Virale eiwitten moeten altijd worden gesynthetiseerd

door de translatie van een viraal mRNA dat een plus-keten RNA

is. Virussen met een uit een dubbele keten bestaand DNA

genoom produceren mRNA (plus-keten) uit hun min-keten DNA

20 keten. Met betrekking tot de een dubbele keten bezittende RNA virussen, wordt mRNA (plus-teken), geproduceerd ' * uit een min-keten RNA. Het genoom van plus-keten RNA virussen zelf functioneert als een mRNA, terwijl de min-keten virussen hun RNA gebruiken als mal voor de productie van 25 plus-keten RNA (mRNA).

Overeenkomstig deze uitvinding wordt de translatie van een viraal mRNA en dus de synthese van virale eiwitten, onafhankelijk van het mRNA s^ntheseraedianisme geremd door een hybridiserend min-keten DNA. Ofschoon slechts voorbeelden 30 worden gegeven, waarin herpes-simplex-virus (dubbel keten DNA virus) en influenza virus (enkelvoudig keten RNA virus) hierin worden gegeven, kan de huidige uitvinding alom worden toegepast voor het in het algemeen remmen van de voortplanting van virussen. De voortplanting van virussen, 35 zoals influenza-virus, adeno-virus, leukaemie-virus, dengue-virus, rabiës-virus, hepatitis-virus, mazelen-virus, encephalitis-virus, para-influenza-virus, rhino-virus, 840 31 63 * 4 -10- gele koorts-virus en EB-virus, kunnen worden geremd door de werkwijze en het agents van deze uitvinding.

De huidige uitvinding kan dus alom worden gebruikt voor de preventie of de behandeling van verschillende dier-5 of plantenziekten/ veroorzaakt door virussen. De specifieke pharmaceutische preparaten zijn dus zeer bruikbaar in verschillende gebieden.

Volgens de werkwijze van de huidige uitvinding kan de voortplanting van RNA of DNA virussen en hun cytopathische 10 effecten worden gestopt zonder beïnvloeding van de gast- cellen. Bovendien kan door de werkwijze van deze uitvinding de infectie van niet-geinfecteerde gastcellen worden voorkomen. Door de uitvinder werd gevonden, dat oligodesoxy-nucleotiden slechts hybridiseren met het allereerste 15 mRNA van herpes-simplex-virus, en geen enkel effect hebben op normale, niet-geinfecteerde niercellen van hamster-jongen (BHK cellen) noch invloed hebben op muizen. Geconcludeerd werd dan ook dat de oligodesoxynucleotiden noch een schadelijk effect op normale cellen en dieren noch 20 enige invloed op de groei snelheid van deze cellen hebben.

De negatieve keten desoxynucleotiden die bij deze uitvinding worden gebruikt, kunnen worden verkregen door enzymatische hydrolyse van DNA, denaturatie en daarop volgende scheiding door affiniteit chromatografie. Sub-25 sidiair kan synthetisch verkregen negatieve keten oligodesoxynucleotiden worden gebruikt. Het zal dus duidelijk zijn dat de negatieve keten desoxynucleotiden die in de hierin beschreven experimenten worden gebruikt, volgens een verscheidenheid aan werkwijzen kunnen worden verkregen.

30 Bij het kloneren van het RNA virus gen, kan reverse transcriptase worden gebruikt. In een aantal gevallen kan in de geïnfecteerde cellen aanwezig, en van het RNA virus genoom afkomstig DNA worden gebruikt. Als een klonerings-drager kan bijvoorbeeld lambda faag (Charon faag) of 35 plasmide pBR 322 als vector worden gebruikt. Voor het verkrijgen van een enkelvoudige keten (-) DNA, wordt M 13 faag als vector gebruikt. Volgens de huidige uitvinding kan gekloneerd DNA van een coderend gebied S40 3 1 8 3 » * -11- van elk deel van het totale virale genoom worden gebruikt. Vroege , of direct vroege genen, waarvan de expressie wordt waargenomen in een vroeg stadium van de infectie zijn bijzonder wenselijk voor het voorkomen van 5 de virus voortplanting en de daarmee samenhangende cyto-pathische effecten.

Een recombinant M 13 faag dat een negatief keten viraal DNA bevat, of een recombinant DNA vector dat een dubbele keten viraal DNA bevat, kan worden bereid door het 10 laten groeien van grote hoeveelheden E. coli die deze vectoren herbergen, of E. coli die is geinfecteerd met de M 13 faag. Vectoren die de virale genen bevatten, werden geïsoleerd en onderworpen aan restrictieve endonuclease voor het opsplitsen van de virale genen. Het mengsel van de 15 opgesplitste virale genen en het vector DNA werd vervolgens onderworpen aan een electrophorese in agarose gel of sephadex kolom chromatografie voor de scheiding van het virus gen DNA van het vector DNA. De verkregen DNA moleculen wérden ingekort door gedeeltelijke afbraak met DNA 20 restrictie endonuclease, of ultrasone behandeling. De keten lengte van de virale DNA fragmenten werd ingesteld tot ergens tussen 9 en 100 nucleotiden door de scheiding van deze DNA ketens door gel electrophorese en Sephadex chromatografie.

25 Opgemerkt wordt, dat slechts de negatieve keten van viraal DNA werkzaam is voor de remming van de virale eiwitsynthese. DNA van vectoren, zoals pBR 322 of lambda faag, zoals de gerepliceerde vorm van M 13 faag, is DNA met een dubbele keten. Dit DNA met een dubbele keten moet 30 dus worden omgezet in DNA met een enkele keten, gevolgd door isolatie van DNA met de negatieve keten. Voor dit doel kunnen verschillende werkwijzen worden gebruikt. Bijvoorbeeld wordt DNA gedenatureerd door verwarming gedurende 10 minuten tot 100°C, en snel afkoelen.

35 Uit een mengsel van DNA met negatieve en positieve ketens, kan DNA met een negatieve keten worden geïsoleerd door bijvoorbeeld affinitexts chromatografie. Voor dit 840 31 63 -12- « * doel wordt positieve keten DNA eerst bereid door kloneren in M 13 faag. Dit wordt vervolgens geconjugeerd met een drager materiaal voor chromatografisch gebruik. Een mengsel van negatieve en positieve keten DNA wordt vervolgens ge-5 leid door de geconjugeerde positieve DNA kolom. De negatieve • keten DNA wordt aan deze kolom gebonden, terwijl het positieve keten DNA door de kolom heen loopt. Het negatieve keten DNA wordt vervolgens uit de kolom geelueerd.

In een alternatieve werkwijze voor het verkrijgen 10 van negatieve keten DNA, wordt het chemisch gesynthetiseerd in de vorm van oligo- of polydesoxynucleotiden door een geschikte synthetische werkwijze uit de organische chemie.

In het geval van herpes-simplex-virus, heeft bijvoorbeeld een van de allereerste DNA genen, Vmw 175 een 15 dubbele keten die bestaat uit een plus DNA (5'-ATG.GCG.TCG.

GAG.....) en een min DNA (3 '-TAC.CGC.AGC.CTC.....). Slechts het min DNA met de volgorde die begint met TAC kan worden gehybridiseerd met een mRNA van Vmw 175. Elk DNA dat dus identiek is aan een deelstructuur met de min DNA keten moet 20 worden geselecteerd en gesynthetiseerd als een oligo-desoxynucleotide. Het influenza virus genoom omvat het hemagglutine gen en NS (niet-structurele) genen. Omdat het hemagglutine gen van verschillende serotypen influenza virus, variëren in hun RNA volgorde, wordt de volgorde van een 25 enkelvoudige keten DNA dat hybridiseert met het mRNA van de NS genen geprefereerd voor het doel volgens de huidige uitvinding. (-)Keten DNA dat hybridiseert met het mRNA van de NS genen is meer wenselijk dan hetgeen hybridiseert met de mRNA van het hemagglutine gen, omdat het hemagglutine gen 30 zeer frequent muteert en de {-) keten DNA dat hybridiseert met het mRNA van het hemagglutine gen van een influenza virus met een enkelvoudige keten, niet kan crosshybridiseren met het mRNA van het hemagglutine gen van een ander serotype keten van het influenze virus.

35 Een nadere uitleg van het NS-1 gen van het influenza virus wordt bijvoorbeeld gegeven door Lamb et al. (Cell 21 47 (1980)). De DNA volgorde die hybridiseert met 8403163 I * -13- een mRNA van het NS-1 gen is 5f-.....ACT.TGA.CAC.AGT.GTT.

GGA.ATC.CAT.....-3*. Daarom kan het geheel of een deel van deze volgorde worden geselecteerd en gesynthetiseerd.

De huidige uitvinding kan ook worden toegepast 5 op virussen die belangrijk zijn in het gebied van pluimvee en veeteelt, zoals Rous Sarcoom Virus. Bijvoorbeeld zal de remming van de expressie van een van de genen gag., pol, en env. van dit virus de voortplanting van dit virus remmen.

Indien bijvoorbeeld de remming van de expressie van het gag.

10 gen door een hybridiserend DNA molecuul is gewenst, kan een oligo- of polydesoxynucleotide met een deel van de volgorde 5'-.....AAT.CAT.CTT.TAT.GAC.GGC.TTC......-3' worden geselecteerd en gesynthetiseerd, rekening houdend met het feit, dat de RNA volgorde van P 19 een deel is van het 15 gag, gen.

Het is duidelijk uit de vooraf gaande uitleg, dat in principe voor de remming van de virus voortplanting door effectieve een min-keten DNA met een/enkelvoudige keten, een DNA met een enkelvoudige keten die moet worden geselecteerd, die 20 hybridiseert met een mRNA van dit virus.

In het algemeen staat de term "oligodesoxynucleotide" voor een molecuul met een kleiner aantal desoxynucleotide-eenheden, terwijl de term "polydesoxynucleotide" staat voor' een molecuul met een groter a.antal desoxynucleotide-eenheden.

25 Volgens de uitvinding loopt bijvoorbeeld het aantal nucleotide-eenheden gewoonlijk tot 25. Desoxynucleotiden met meer dan 25 desoxynucleotide-eenheden, kunnen dus worden aangeduid als "polydesoxynucleotiden".

De anti-virale agents volgens de huidige uitvinding, 30 die de oligo- en/of polydesoxynucleotide met een geschikte vloeistof drager, of vulmiddel en eventueel een additionele toevoeging of toevoegingen bevatten, worden bereid in de vorm van vloeibare preparaten, injecties, zetpillen, enz. volgens bekende werkwijzen. Op voorschrift, kunnen de ge-35 wenste oligodesoxynucleotiden en polydesoxynucleotiden enkelvoudig of in combinatie worden gebruikt met andere pharmacologisch actieve bestanddelen. In dit geval is het 8403163 t \ -14- voor de hand liggend dat deze andere bestanddelen niet nadelig de anti-virale activiteit van de oligo-en polydesoxynucleotiden beïnvloeden.

De oligo- en polydesoxynucleotiden kunnen indien 5 gewenst worden verwerkt door externe toepassingspreparaten, zoals creme, tinctuur, vloeistof en pleister door het mengen van het oligo- en polydesoxynucleotide als een actief bestanddeel met een geschikte inerte drager of vulmiddel.

De vloeistofdragers of vulmiddelen, als ook de 10 eventuele additionele toevoegingen die in de anti-virale agents volgens de huidige uitvinding worden gebruikt, zijn bekend en commercieel verkrijgbaar.

Illustratieve vloeistofdragers, vulmiddelen en additionele toevoegingen die geschikt zijn voor de bereiding 15 van de anti-virale agents zijn bijvoorbeeld, gedestilleerd water te gebruiken bij injecties, fysiologisch zout, en waterige oplossing van dextrose, plantaardige oliën te gebruiken bij injecties, propyleen glycol, polyethyleen glycol en benzyl alcohol (voor injecties en vloeibare preparaten); 20 vaseline, plantaardige olie, dierlijk vet en polyethyleen glycol (voor uitwendig bruikbare preparaten); en isotone agents, oplossing bevorderende agents, stabilisatoren, kleurmiddelen, antiseptische agents, kalmerende agents en dergelijke toevoegingen (als gebruikelijke additionele 25 toevoegingen voor pharmaceutische preparaten). In het geval van voor injectie te gebruiken preparaten, kan het actieve bestanddeel indien gewenst worden opgelost in gesteriliseerde vloeibare dragers. Het is vanzelf sprekend, dat de hierboven genoemde verschillende vloeibare dragers, vulmiddelen en 30 additionele bestanddelen niet de anti-virale werking van het oligo- en polydesoxynucleotiden remmen of verstoren.

De oligo- en polydesoxynucleotiden volgens de huidige uitvinding worden verwerkt met de hiervoor bedoelde dragers of vulmiddelen en eventueel met de hiervoor bedoelde 35 additionele bestanddelen, volgens bekende werkwijzen. Te injecteren preparaten en zetpillen kunnen gewoonlijk 1-10 mg van het oligo- en polydesoxynucleotiden per ampul of capsule bevatten. Voor humane patiënten is de dagelijkse 840 3 1 63 \ i \ \ -15- dosis 0,1-1,000 mg, bij voorkeur 1-100 mg (vanaf 10-20v&g/kg tot 1000-2000 -tig/kg lichaamsgewicht). De bepaalde dosis voor elke patiënt is echter afhankelijk van een grote reeks factoren, bijvoorbeeld de effectiviteit van een bepaald, 5 gebruikt oligo- of polydesoxynucleotide tot de leeftijd, gewicht, de algemene gezondheidstoestand, geslacht, dieet, tijd en de wijze van toediening, snelheid van verwijdering, combinatie met andere medicijnen die te zamen worden gebruikt, de ernst van bepaalde ziekten, waartegen de therapie wordt 10 toegepast.

De anti-virale agents volgens de huidige uitvinding worden intraveneus toegediend of direct aangebracht op het deel van het lichaam van de patiënt dat door het virus is geïnfecteerd, zodat het oligo- of polydesoxynucleotide 15 effectief kan worden aangeleverd op het geïnfecteerde deel.

De huidige uitvinding zal nu meer in detail worden geïllustreerd met de volgende voorbeelden en vergelijkings-voorbeelden.

De voorbeelden 1-5 hebben betrekking op de be-20 reiding van de oligo- en polydesoxynucleotiden die bij de huidige uitvinding worden gebruikt.

VOORBEELD 1

Herpes-simples-virus DNA werd geïsoleerd door 25 fenol-chloroform extractie. Het geïsoleerde DNA werd afgebroken door het restrictie enzym BamHI.

Het afgebroken DNA werd vervolgens in aanwezigheid van T 4 faag ligase gemengd met pBR 3i22 plasmide DNA dat voordien met BamHI was behandeld.

30 Het verkregen mengsel dat verbonden plasmiden be vat werd aan E. coli aangeboden en de bacteriën die het recombinant plasmide bevatten werden geselecteerd door hen te incuberen op ampicilline bevattende agar platen voor het vormen van kolonies en het screenen daarvan voor tetracycline 35 gevoeligheid. Uit de tetracycline gevoelige kolonies werden de bacteriën met het herpes-simplex-virus DNA geselecteerd 32 door de filter hybridisatie werkwijze met gelabeld 840 31 6 3 -16- herpes viraal DNA als sonde. Voor het verkrijgen van het 6 7 recombinant plasmide DNA, werden 2 x 10-10 E. coli cellen die het recombinant plasmide bevatten, gebracht in 2 ml TSB (Tryptose Soja Kweekmedium).

5 Het geënte medium werd gedurende ongeveer 15 uur bij 37°C geschud in een 20 ml reageerbuis, totdat de optische absorptie (Optische dichtheid : OD) van het cultuur medium bij 540 nm 0,5 bereikte (ODj.^q= 0,5). Op dit punt werd chloramphenicol toegevoegd tot een uiteindelijke 10 concentratie van 100Ag/ml en werd de incubatie gedurende 15 uur voortgezet.

De bacterie suspensie werd vervolgens gecentrifugeerd en de pellet werd geresuspendeerd in een buffer die 25% sucrose en 50 nM tris-HCl (pH 8,0) bevat. De suspensie liet 15 men gedurende 5 minuten bij 0°C staan. Aan de suspensie werd 4 ml Triton X 100 toegevoegd en de verkregen visceuse oplossing werd gedurende 30 minuten bij 0°C en 30,000 g gecentrifugeerd. Aan de supernatant van deze oplossing (8 ml) werd 8 g CsCl, 1 ml van een oplossing van ethidium bromide 20 (5 Mg ethidium bromide/ml) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 48 uur bij 100,000 g gecentrifugeerd. De ruwe plasmide fractie werd na deze centrifugatie verkregen en gemengd met 2 volumina isopropylalcohol, en liet men gedurende enige minuten staan. De bovenste laag werd verwijderd en de 25 oplossing die DNA bevat, werd over de nacht gedyaliseerd tegen 0,1 M tris HC1 en 10 mM EDTA (pH 8,0).

De gedyaliseerde oplossing werd geconcentreerd en de oplossing die 200 Mg DNA bevat, werd behandeld met een overmaat restrictie enzym (BamHI). Het verteerde DNA werd 30 gescheiden door agarose electrophorese en het DNA herpes-simplex-virus werd geïsoleerd uit de gel door de electro-elutie werkwijze. Het DNA werd verder ten dele afgebroken door DNase en gedurende 10 minuten verwarmd tot 100°C, gevolgd door snel afkoelen. Zodoende werd DNA verkregen met 35 keten lengten van 9 tot 100 oligodesoxynucleotiden.

VOORBEELD 2

De replicatieve vorm van M 13 faag DNA (DNA met de 840 31 63 -17-

L

dubbele keten) werd opgesplitst met BamHI. Het verteerde M 13 DNA werd gemengd met herpes-simplex-virus DNA dat was afgebroken door BamHI en op de hierboven beschreven wijze geisoleerd. Zij werden verbonden met T 4 faag ligase. E. coli 5 werd getransfecteerd met het verbonden DNA in aanwezigheid van CaCl2· De getransfecteerde bacteria werden uitgezet op agar platen waarbij een bovenste laag agar werd gebruikt die IPTG bevatte (isopropyl-£-D-thio-galactopyranoside) en X-gal (een indicator). Recombinant M 13 fagen die herpes-10 simplex-virus DNA bevatten, vormen kleurloze faag plaques binnen 24 uur. M 13 fagen zonder tussenvoegingen, vormen blauwe plaques. Daarom werden de kleurloze faag plaques gekozen. Voor het selecteren van de recombinant M 13 faag die (-) keten HSV DNA bevat, werden de fagen gecontroleerd op 15 hun geschiktheid te hybridiseren met gelabeld (+) HSV DNA dat chemisch is gesynthetiseerd. Op deze wijze werden M 13 fagen geselecteerd, die een deel van de (-) keten van HSV DNA bevatten. De gewenste recombinant M 13 faag werd in kwantiteit vergroot en een DNA met een enkelvoudige keten 20 werd uit deze faag geisoleerd. Voor verdere zuivering van de HSV DNA moet met een enkelvoudige keten, kan M 13 faag DNA worden verwijderd uit dit mengsel door restrictieve enzym afbraak in aanwezigheid van bepaalde oligodesoxy-nucleotiden. Subsidiair kan het DNA mengsel zonder zuivering 25 gedeeltelijk worden afgebroken met DNase en kunnen oligodesoxynucleotiden met een keten lengte tussen 9 en 100 worden geisoleerd.

VOORBEELD 3 30 Een DNA synthese inrichting (Applied Biosystem

Company) werd gebruikt voor het synthetiseren van min keten DNA van het onmiddellijk-vroege gen (Vmw 175 of ICP 4) van herpes-simplex-virus. In dit voorbeeld werd de DNA volgorde 3'-CGC.AGC.CTC.TTG.TTC.GTC.GC-5 * gesynthetiseerd welke 35 hybridiseert met mRNA van Vmw 175. Dit desoxynucleotide is een eicosameer en wordt hierna eenvoudig aangeduid als het 20 A.

840 31 63 VOORBEELD 4 -18-

Een DNA synthese inrichting (Applied Biosystem Company) werd gebruikt voor het synthetiseren van min keten DNA van het onmiddellijk-vroege gen (Vmw 12) van herpes-simplex-virus. In dit voorbeeld werd de DNA volgorde 5 3'-GCA.CCC.GGG.ACC.TTT.ACC.GC-5' gesynthetiseerd, welke hybridiseert met mRNA van Vmw 12. Dit desoxynucleotide is een eicosameer en wordt hierna eenvoudigweg aangeduid als het 20 B.

10 VOORBEELD 5

Een DNA synthese inrichting (Applied Biosystem Company) werd gebruikt voor het synthetiseren van min keten DNA van het NS 1 gen van influenza virus. In dit voorbeeld werd de DNA volgorde 3'-CTA.AGT.TTG.TGA.CAC.AGT.TCA.-5' 15 gesynthetiseerd, welke hybridiseert met mRNA van NS 1. Dit desoxynucleotide is een heneicosameer en wordt hierna eenvoudigweg aangeduid als het 20 C.

VOORBEELD 6 20 Dit voorbeeld heeft betrekking op een experiment, waarmee wordt bevestigd dat het oligodesoxynucleotide de synthese van viruseiwit in vitro remt.

Tabel 1 toont het remmende effect van het 20 A op de Vmw 175 vorming en het corresponderende cytopathische 25 effect (Syncytium Vorming) van HSV l.

TABEL 1

Het 20 A/put Relatieve hoeveelheden Relatieve Cytopatische

Vmw 175 effecten (Syncytium) 30 - ---------- 1 1 33,6 g 0,48 0,35

BHK cellen (1,5 x 10^) werden in elke put 35 (1,5 cm in diameter) gebracht van een Limbro plaat en MEM

met 10% kalver serum werd toegevoegd. De cellen werden ver- 6403163 V » -19- volgens bij 36°C in een 5% C02 atmosfeer geincubeerd. Vervolgens werden de cellen geïnfecteerd met 5 moi HSV-1 in aanwezigheid of afwezigheid van het 20 A. Na 5 uur werd het medium verwijderd. De cellen werden vervolgens gedurende 5 1 uur in kontakt gebracht met S-methionine (1QQJICI/m.1) en het 20 A werd opgebroken, en de eiwitten werden geanalyseerd door polyacrylamide gel electrophorese gevolgd door autoradiografie. Voor de evaluatie van het relatieve cytopathische effect, waren de experimentele kondities 10 identiek aan hetgeen hierboven is vermeld, behalve dat het aantal syncytia 13 uur na infectie werd geteld. Onder deze condities werd geen vermindering van de cellulaire eiwitsynthese VOORBEELD 7 waargencrm.

Dit voorbeeld heeft betrekking op een experiment, 15 waarbij werd bevestigd dat het oligodesoxynucleotide wordt opgenomen door cellen.

Dit experiment geeft aan dat enkelvoudige keten oligodesoxynucleotide 20 A inderdaad doordringt tot in cultuur gehouden cellen. BHK cellen (niercellen van jonge 5 20 hamsters; 4,4 x 10 cellen) werden geïnfecteerd met 4 7,6 x 10 PFU van HSV-l/ml). Controle cellen werden niet geïnfecteerd maar kregen dezelfde hoeveelheid van het cultuur medium. De cellen werden in een C02 incubator gedurende 3 uur bij 37°C geincubeerd. Na de incubatie werden de cellen 32 25 blootgesteld aan 7,66 p mol van het P gelabelde 20 A.

Na de blootstelling aan het gelabelde 20 A, werd het cultuur medium verwijderd en werden de cellen tweemaal gewassen met 0,3 ml PBS.

Men liet de cellen bij 36°C gedurende 30 minuten 30 staan in een oplossing die 0,1 M NaCl, 33 .UM ZnCl2, 3360 eenheden nuclease SI en 33,3 mM natriumacetaat buffer (pH 4,5).

Vervolgens werden de cellen tweemaal gewassen met de hierboven beschreven buffer echter zonder nuclease SI.

35 De gewassen cellen liet men uiteenvallen in 0,3 ml die 10 mM EDTA, 0,6% natriumdodecylsulfaat, en 10 mM tris-HCl buffer (pH 7,5) bevat. Op dit punt werd TCA-onoplosbare, 8403163 -20- nuclease SI-gevoelige, radioactief 20 A gemeten. Gevonden werd, dat tenminste 4,68 x 10 moleculen 20 A per cel waren opgenomen tijdens een blootstellingsperiode van 8 uur. De werkelijke hoeveelheid is waarschijnlijk 10 maal hoger dan 5 deze waarde, vanwege de snelle hydrolyse van de eindstandige 32 P fosfaten.

Het volgende voorbeeld 8 toont, dat 20 A een remmend effect heeft op de virus voortplanting.

10 VOORBEELD 8 5

Ongeveer 1,5 x 10 BHK cellen werden per put (1,5 cm in diameter) van een Limbro plaat uitgezet. Deze cellen werden gedurende 48 uur bij 36°C in 5% C02 geincubeerd en geïnfecteerd met HSV-1 (7,6 x 104 PFÜ/ml) in 160-al MEM.

15 De infectie werd gedurende 3 uur bij 36°C in 5% C02 uitgevoerd. Na de infectie werd 20 A toegevoegd aan de geïnfecteerde cellen. Na 8 uur blootstelling werd het medium vervangen door normaal MEM met 10% kalverserum. 15 Uur na de infectie werd de cultuur vloeistof geoogst·en de virus 20 titer gemeten. De resultaten worden in de onderstaande tabel 2 getoond.

TABEL 2 25 Hoeveelheid 20 A per put Relatieve hoeveelheid virus 0 100 0,112 jug 45 0,224 ^tg 35 30

De voorbeelden 9-13 hebben betrekking op experimenten waarmee wordt bevestigd dat het oligodesoxynucleotide in vitro de vernietiging van dierlijke cellen door virus remt.

35 VOORBEELD 9 (a) Ongeveer 1,5 x 10^ BHK cellen werden voor elke cel cultuur geplaatst in elke put (1,5 cm in diameter) van 840 3 1 §3 -21- een Limbro plaat geplaatst. De cellen werden gedurende 47 uur bi'j 36°C in 5% C02 geincubeerd en vervolgens gedurende 3 uur bij 36°C geinfecteerd met 160 Jil HSV-1 (17,6 x 104PFU/ml) . Aan deze geïnfecteerde cellen werd een complex van calcium 5 fosfaat en 20 A in verschillende hoeveelheden toegevoegd.1 Het complex werd zoals beschreven door Ruddle's group (Loiter et al, Proc. Nat. Acad. Sci. 79 422, 1982) bereid.

De geïnfecteerde cellen werden gedurende 8 uur aan 20 A bloot gesteld. Het cultuur medium werd vervolgens verwijderd 10 en vervangen door een normaal cultuur medium zonder 20 A, en de cellen liet men gedurende een volgende 13 uur groeien.

(b) De controle cellen werden op identieke wijze be handeld, behalve met betrekking tot de toevoeging van het 20 A (Ca-fosfaat controle).

15 (c) Als een extra controle werd een geïnfecteerde cultuur bereid, die noch met Ca -fosfaat noch met 20 A was behandeld (virus controle). Dè cellen van de weefsel cultuur die waren bereid volgens (a), (b), (c), werden gefixeerd, gekleurd en het aantal syncytia werd geteld.

20 Het resultaat van dit experiment wordt getoond in Fig. 1, waarin de X as (abscissa) de hoeveelheid DNA weergeeft in termen van g toegevoegd per put (dat wil zeggen lag DNA/put"), en de Y as (ordinaat) geeft het aantal syncytia weer als percentage (dat wil zeggen 25 "percentage van het aantal syncytia") gevormd in een cel cultuur in vergelijking met de waarde verkregen in het geval experiment (c) voor "virus controle", de waarde van dit geval werd altijd gesteld op 100, terwijl de doorge-trokken lijn (a) (-.-) het resultaat toont dat is verkregen 30 met het experiment (a), terwijl de streeplijn (b) (—o—) het resultaat toont dat is verkregen met experiment (b).

Fig. 1 toont dat de syncytium vorming opmerkelijk wordt geremd door het 20 A. Calciumfosfaat of calciumchloride beïnvloeden niet het aantal syncytia.

8403163

De Ca-concentratie in het medium varieert, afhankelijk van de 20A concentratie van 1,36 tot 24,8 mmol.

5 * k -22- VOORBEELD 10 (a) Ongeveer 1,5 x 10 BHK cellen werden per put (1,5 cm in diameter) van een Limbro plaat uitgezet. Deze cellen werden gedurende 47 uur bij 36°C in 5% CO~ geincubeerd.

^ 4

Aan deze cellen werd vervolgens 160 Ml HSV-1 (7,6 x 10 PFU/ml) 5 toegevoegd, en de infecties werden gedurende 3 uur bij 36°C uitgevoerd. Aan deze geinfecteerde cellen werden verschillende hoeveelheden 20 A toegevoegd in de vorm van een calciumchloride complex met een uiteindelijke Ca-concentra-tie van 4,55 mM. De behandeling werd gedurende 8 u*ur voort-10 gezet. De cellen werden vervolgens gedurende 14 uur verder geincubeerd.

(b) Vervolgens werd een identieke, zoals hierboven onder (a) beschreven cultuur bereid, behalve dat een oligodesoxy-nucleotide dat geen relatie heeft met de HSV-1 volgorde 15 5'-CAC.GAC.AGA.GGG.CGA.-3' werd bereid en geincubeerd. Alle andere kondities waren identiek met het geval (a).

(c) Een soortgelijke cultuur, waarin 20 A ontbrak, werd bereid en geincubeerd onder dezelfde hierboven beschreven kondities. Hierna wordt verwezen als "virus controle".

20 De hierboven onder (a), (b) en (c) beschreven cellen werden gefixeerd, gekleurd en het aantal syncytia werd geteld. De resultaten van dit experiment worden getoond in Fig. 2, waarin de X as (abscissa) de hoeveelheid DNA in termen van toegevoegde g per put weergeeft (d.w.z.

25 "Mg DNA/put") en de Y as (ordinaat) het aantal syncytia weergeeft in termen van percentage (d.w.z. "percentage aantal syncytia") in een cel cultuur gevormd in vergelijking met de waarde verkregen in het geval van experiment (c) voor"virus controle", welke waarde in dit geval altijd wordt 30 gesteld op 100, en waarin een doorgetrokken lijn (a) (-.-) het resultaat toont dat is verkregen met experiment (a) terwijl de streeplijn (b) (—»—) het resultaat toont dat is verkregen met experiment (b).

Fig. 2 toont dat 20 A een remmend effekt heeft op 35 het aantal syncytia dat door HSV-1 wordt opgewekt. Uit dit experiment kan worden geconcludeerd, dat 20 A de syncytium 840 3163

V

-23- vorming in aanwezigheid van 4,55 mM calciumionen remt. Oligodesoxynucleotiden die geen relatie hebben met de bekende DNA volgorden van herpes-simplex-virus hebben geen remmend effekt. Het werd duidelijk uit dit experiment, dat 5 de min keten van herpes-simplex-virus DNA specifiek, het cytopathische effekt van herpes-simplex-virus remt.

VOORBEELD 11

In Voorbeeld 9 wordt het effekt getoond dat wordt 10 verkregen door gebruik te maken van het synthetische eicosameer 20 A dat samenhangt met de min keten van HSV-DNA. Dit experiment heeft betrekking op de effektiviteit van gekloneerd herpes-simplex DNA. Door gebruik te maken van pBR 322 vector die HSV-1 DNA bevat (1,45 megadalton, ver-15 kregen door de ontleding van HSV-i DNA met BamHI), was het mogelijk de syncytium vorming door HSV-1 te remmen. In dit experiment was HSV-1 DNA niet gesneden uit het recombinant plasmide. Het gedenatureerde, gedeeltelijk ontlede recombinant pBR 322, dat HSV-1 DNA bevatte (0,16 Xiq) werd in 20 elke put van de Limbro plaat, zoals in voorbeeld 9, gebracht. Het effekt werd zoals in voorbeeld 9 is beschreven, onderzocht, en een remming van de syncytium vorming werd waargenomen. Als een controle voor dit experiment werd DNA van pBR 322 alleen gebruikt. In dit controle experiment werd 25 geen remming gevonden.

VOORBEELD 12

Dit voorbeeld toont een synergisch effekt van een mengsel oligodesoxynucleotiden.

30 Ongeveer 1,5 x 10^ BHK cellen werden in elke put (1,5 cm in diameter) van een Limbro plaat gebracht. Deze cellen werden gedurende 47-48 uur bij 36°C in 5% CO2 ge-incubeerd, en geïnfecteerd met HSV-1 (7,6 x 10^ PFU/ml) in 160Λπι MEM. De infectie werd gedurende 3 uur bij 36°C in 35 5% CO2 uitgevoerd. Na de infectie werd 20 A op zich of in een mengsel met 20 B (224 : 1) opgelost in een oplosmiddel, en 0,3 ml van deze oplossing werd aan de cellen toegevoegd 840 31 63 -24- in aanwezigheid van 4,55 inM calcium·. De blootstelling van deze cellen aan 20 A en 20 B werd gedurende 8 uur uitgevoerd .

Anderzijds kregen cellen de hierboven beschreven 5 identieke behandeling, behalve dat 20 A en 20 B afwezig waren. Dit wordt hierna aangegeven als virus controle.

De cellen werden gefixeerd, gekleurd en het aantal syncytia werd geteld. De resultaten van deze experimenten worden getoond in Fig. 3, waarin de X as (abscissa) de 10 hoeveelheid DNA weergeeft in termen van toegevoegde Mg per put (d.w.z. "Mg DNA/put"), en de Y as (ordinaat) het aantal syncytia weergeeft in termen van percentage (d.w.z.

"% aantal syncytia") gevormd in een cel cultuur in vergelijking met de waarde verkregen in geval van de "virus 15 controle", welke waarde in dit geval altijd werd gesteld op 100, en waarin de volle lijn die is aangegeven als "20 A" (-o-) het resultaat toont dat is verkregen met het experiment waarin alleen 20 A wordt gebruikt, terwijl de volle lijn die is aangegeven als "20 A + 20 B (224 : 1)" (-'•-O het 20 resultaat toont, dat is verkregen met het experiment waarin een combinatie van 20 A en 20 B werd gebruikt in een verhouding van 224 : 1. Fig. 1 toont, dat indien het mengsel van 20 A en 20 B werd gebruikt, het in vitro waargenomen effekt sterker was in vergelijking met het geval waarin slechts 25 20 A werd gebruikt. Uit dit resultaat wordt afgeleid dat het gecombineerde gebruik van min keten DNA dat overeenkomt met een deel dat een afwijkende DNA volgorde heeft van de min keten DNA van herpes-simplex-virus in belangrijke mate de effektiviteit kan versterken van anti-virale agents.

30 VOORBEELD 13

Dit voorbeeld toont het effekt van (-) keten oligo-esoxynucleotiden van NS 1 op het cytopathische effekt van influenza virus. De resultaten van deze bepaling zijn 35 weergegeven in Tabel 3 en de werkwijze van deze bepaling wordt hieronder in detail beschreven.

8403183 -25- TABEL 3

Oligodesoxynucleotiden Relatieve waarde gerelateerd aan (M.g/ml) het aantal levensvatbare cellen 0 0,21 5 0,02 0,49 1,30 0,49 5,00 0,49

Kitazato niercellen van het zwijn (SKK) 10 (1,5 x 10^/0,1 ml) liet men groeien in MEM dat 5% fetal kalver serum bevat, en verder in elke put (0,5 cm in diameter) van een microplaat uitgezet. De cellen werden gedurende 24 uur bij 35,5°C in een 5% C02 atmosfeer in het hierboven beschreven medium geincubeerd. Het medium werd 15 vervolgens verwijderd en 100 JUX van een medium dat verschillende hoeveelheden van het oligodesoxynucleotide (20 C) bevat, werd aan elke put toegevoegd en de cellen werden gedurende 24 uur in een 5 % C02 atmosfeer geincubeerd. De oplossing werd vervolgens verwijderd en 50 jul van een medium 20 dat 10 TCID50 eenheden Influenza A virus bevat, werd aan elke put toegevoegd. Bovendien werd 50 JUq van het cultuur medium dat verschillende hoeveelheden 20 C bevatte aan elke put toegevoegd. De cellen werden gedurende 48 uur verder geincubeerd. Het medium werd vervolgens verwijderd en 25 100 1 Hank's oplossing die 0,1 % neutraal rood bevat werd aan elke put toegevoegd, en de cellen werden gedurende 1 uur bij 35,5°C in een 5 % C02 incubator geincubeerd. De oplossing werd vervolgens verwijderd en de cellen werden met 10 Ml 80% ethanol gewassen gevolgd door de toevoeging van 50 JU1 30 0,1 N HC1. Het relatieve aantal levensvatbare cellen werd door optische absorptie gemeten bij 577 nm met ELISA. De levensvatbare cellen nemen neutraal rood op, terwijl niet levensvatbare cellen dit niet doen. Naarmate de optische dichtheid groter is is het aantal levensvatbare cellen groter. 35 De volgende Voorbeelden 14-20 tonen de in vivo effektiviteit van de gebruikte oligodesoxynucleotiden als een anti-viraal agents.

8403163 VOORBEELD 14 -26-

Ongeveer 1 x 10^ PFÜ van HSV-1 (F lijn) in 30 Al MEM suspensie werden in de intracerebrale holten van drie weken oude BALB/C muizen geïnjecteerd. De virus suspensie bevatte verschillende hoeveelheden 20 A. Bovendien werd 5 200 Ml van een MEM oplossing die 1% penicilline/ streptomycine, en 2 mM glutaminezuur, en verschillende hoeveelheden 20 A bevat, dagelijks gedurende 3 dagen geinjecteerd in de intra-peritoneale holten, waarbij werd gestart op de eerste dag na de injectie met HSV-1. Het percentage van de mortaliteit 10 snelheid op de zevende dag werd berekend. Het resultaat van dit experiment wordt getoond in Fig. 4, waarbij de X as (abscissa) de hoeveelheid DNA in termen van geïnjecteerde Ag per muis weergeeft (d.w.z. " Mg DNA/muis") en de Y as (ordinaat) de mortaliteit snelheid in termen van percentage 15 weergeeft, in vergelijking met het percentage dat is verkregen in het geval van "controle", waarbij de muizen een injectie zonder 20A kregen, waarbij de mortaliteit snelheid in geval van "controle" altijd werd gesteld op 100. Zoals getoond in Fig. 4, was de mortaliteit snelheid verminderd, 20 in afhankelijk van de hoeveelheid toegediend 20 A.

De grafiek geeft de mortaliteit snelheid, uitgedrukt in percentage, aan in vergelijking met de groep controle muizen die geen 20 A kregen.

25 VOORBEELD 15

Ongeveer 1 x 10^ PFÜ van HSV-1 (F lijn) in 30 Ml MEM oplossing die verschillende hoeveelheden 20 A bevat, werd in de intracerebrale holten geinjecteerd van 3 weken oude BALB/C muizen. Bovendien werd 200//1 van een oplossing 30 die verschillende hoeveelheden 20 A, 1 % penicilline en streptomycine, en 2 mM glutamine zuur bevatten, intra-peritoneaal eens per dag geinjecteerd, waarbij een dag na de injectie met HSV-1 werd begonnen.

De behandeling werd gedurende 6 opeenvolgende dagen 35 voortgezet. De mortaliteit van de muizen bij 64-68 uur na de injectie van HSV-1 werd bepaald. De resultaten worden 840 3 1 6 3 -27- getoond in Tabel 4.

TABEL 4 5 Dosis Mortaliteit van de muizen - 5/19 0/224 .Kg/muis 0/9 2/240 -&g/muis 0/10 10

Zoals getoond in deze tabel gingen in de controle groep 5 van de in totaal 19 muizen dood zonder toediening van 20 A. Anderzijds gingen thans muizen dood die ofwel 0/224 Mg 20 A of 2,240 Mg 20 A kregen (in de twee gevallen 15 werden 19 muizen in totaal behandeld).

VOORBEELD 16

Ongeveer 5 x 104 PFU van HSV-1 (F lijn) in 30 Ml MEM oplossing die verschillende hoeveelheden 20 A bevat, 20 werd in de intracerebrale holten geïnjecteerd van 3 weken oude BALB/C muizen. De mortaliteit van de muizen werd op 64-68 uur of 71-78 uur na de injectie bepaald. De resultaten worden getoond in tabel 5.

25 TABEL 5

Dosis Mortaliteit tussen Mortaliteit tussen 64 en 68 uur .7.1 en 78 uur — 3/10 3/10 30 1,12-tfg/muis 0/10 2/10 ll,2^g/muis 0/10 0/10

Zoals getoond in deze tabel gingen in de controle groep die geen 20 A kreeg, drie van de in totaal 10 muizen 35 dood. Anderzijds was de mortaliteit van de muizen in de groep die het virus in aanwezigheid van 20 A kreeg, in sterke mate verminderd.

8403163 VOORBEELD 17 -28-

Ongeveer 5 x 10^ PFU van HSV-1 (F lijn) in 30^W1 MEM oplossing die verschillende hoeveelheden 20 A bevat, werden geïnjecteerd in de intracerebrale holten van 3 weken oude BALB/C muizen. Bovendien werd vanaf de dag na de 5 injectie 3QM1 MEM oplossing die bepaalde hoeveelheden 20 A, 1 % penicilline en streptomycine, en 2 mM glutamine-zuur bevatte, geinjecteerd in de intracerebrale holten.

De behandeling werd gedurende 2 dagen voortgezet en de mortaliteit van de muizen werd op verschillende tijd-10 stippen na de injectie met het virus bepaald.

De resultaten worden getoond in Tabel 6.

TABEL 6 . _ Mortaliteit 15

Dosis tussen tussen tussen __64 en 68 uur 71 en 78 uur 88 en 92 uur 1/10 3/10 7/10 1,12-tfg/muis 0/20 2/20 5/20 20

Zoals getoond in deze tabel was de mortaliteit onder de controle muizen die geen 20 A kregen, significant hoger dan onder de muizen die 20 A kregen. Ofschoon de 25 effektiviteit van 20 A schijnbaar afneemt bij 88-92 uur na injectie, was de mortaliteit nog steeds hoger onder de controle muizen zelfs onder deze kondities.

VOORBEELD 18 30 Ongeveer 1 x 10^ PFÜ van HSV-1 (F lijn) in 200 Ml MEM oplossing die 1,12 Mg 20 A bevat, werd in de intra-peritoneale holten van 3 weken oude BALB/C muizen geinjecteerd.

Bovendien werd 3 of 2 uur voorafgaande aan de HSV-1 injectie, en 1 dag na de HSV-1 injectie, 200 Ml MEM oplossing 35 die verschillende hoeveelheden 20 A bevat, intraperitoneaal geinjecteerd in de geïnfecteerde muizen. De intraperitoneale injectie met 20 A werd gedurende 2 dagen voortgezet. De 8403163 -29- mortal it ext op 211 en 259 uur na de injectie met HSV-l werd bepaald. De resultaten worden getoond in tabel 7.

TABEL 7 5

Dosis Mortaliteit bij Mortaliteit bij 211 uur 259 uur — 1/10 2/10 0,224^g/muis 0/10 0/10 10

Zoals getoond in deze tabel gaat een van de in totaal 10 (bij 211 uur na de injectie) of 2 van de in totaal 10 (bij 259 uur na de injectie) muizen dood, indien 20 A niet werd toegediend. Anderzijds gingen geen muizen dood 15 die onder de identieke kondities 0,224 Mg 20 A kregen.

VOORBEELD 19

De cornea van 3 weken oude BALB/C muizen werd verwond door daarin 5 maal te krassen met een scherpe injectie-20 naald. Op deze verwonde corneas werd 30 Ml MEM oplossing die 1 % penicilline, streptomycine, en 2 iM glutaminezuur, 5% 4 kalverserum en 3 x 10 PFü van HSV-l (F lijn) bevat, aangebracht. De behandelde muizen werden in 4 groepen (A), (B), (C) en (D) verdeeld, zoals hieronder is aangegeven, en de 25 ogen van deze muizen werden bekeken en de resultaten werden middels fotografie vastgelegd.

(A) Op het corneale membraan van deze muizen werd 10 Ml MEM oplossing die 22,4 Mg 20 A/ml bevat, gedruppeld 2 uur voorafgaande aan de toediening van HSV-l (F lijn). Bovendien 30 werd deze behandeling om de andere dag gegeven, terwijl werd gestart op de dag na de toediening van HSV-l (F lijn).

Bovendien kregen deze muizen druppels van een oplossing die cortisonacetaat bevat ( 2 mg/kg lichaamsgewicht van de muis), 5 uur voorafgaande aan de injectie met 35 HSV-l (F lijn). De cortison behandeling werd ook om de andere dag uitgevoerd.

(B) De muizen kregen in hun ogen 10 Ml MEM oplossing 6403163 { -30- die 22,4 Mg 20 A/ml bevat, 2 uur voorafgaande aan de toediening van HSV-1 (P lijn). De behandeling met 20 A werd om de andere dag uitgevoerd.

(C) De muizen kregen 30 M.1 van een in (A) beschreven 5 oplossing die cortisonacetaat bevat (2 mg/kg lichaamsgewicht).

(D) De muizen kregen op hun corneaal membraan 10^1 MEM oplossing 2 uur voorafgaande aan de HSV-1 (F lijn) behandeling. Bovendien kregen zij om de andere dag na de HSV-1 (F lijn) behandeling een soortgelijke behandeling met 10 MEM oplossing.

De toestand van de ogen en het gebied rond de ogen van elke muis werd bekeken met bijzondere belangstelling voor ontsteking en sluiting van de ogen met pathologische symptomen. De waarneming werd op de 4e, 7e of 12e dag na de 15 behandeling uitgevoerd. De muizen die behoren tot de groep (A) en (B) hadden veel minder pathologische symptomen in de ogen en het omgevende gebied, in vergelijking met de muizen die behoren tot de groep (C) en (D) die geen 20 A kregen.

Verder wordt geconcludeerd dat de effektiviteit 20 van 20 A niet werd beïnvloed door de toediening van cortison.

De volgende voorbeelden 20-22 tonen de bereiding van verschillende typen anti-virale agents volgens de huidige uitvinding.

25 VOORBEELD 20

Een oligodesoxynucleotide dat identiek is met het 20 A verkregen in voorbeeld 3, wordt gesynthetiseerd overeenkomstig de triester werkwijze (waarbij een triester van de corresponderende nucleotiden in vloeistoffase wordt ge-30 bruikt). Aan 2 g van het aldus gesynthetiseerde 20 A wordt een isotone MEM oplossing toegevoegd tot een uiteindelijk volume van 1 liter injectie-oplossing, en de oplossing werd afgevuld in ampullen voor het bereiden van injectie-preparaten. Dit injectiepreparaat bevat 2 mg 20 A per ml 35 en wordt subcutaan toegediend in een dosis van 1-5 ml, indien een symptoom wordt waargenomen zo dicht mogelijk bij het geinfecteerde deel.

8403163 VOORBEELD 21 -31-

Een oligodesoxynucleotide die identiek is met het 20 B verkregen in voorbeeld 4, wordt gesynthetiseerd overeenkomstig de triester werkwijze. Aan 10 g van het aldus gesynthetiseerde 20 B wordt een isotone MEM oplossing tot 5 een volume van 1 liter toegevoegd, hetgeen een stock oplossing is voor een 1 % oogdruppelpreparaat. Dit oog-druppelpreparaat wordt verschillende malen per dag toegediend in een dosis van 2-3 druppels, indien een symptoom wordt waargenomen.

10 VOORBEELD 22

Een oligodesoxynucleotide dat identiek is met 20 A verkregen volgens voorbeeld 3, wordt gesynthetiseerd overeenkomstig de triester werkwijze. Een gram van het aldus ge-15 synthetiseerde 20 A wordt gemalen tot een fijn poeder en 999 g gezuiverde cacaoboter wordt vervolgens aan het fijne poeder toegevoegd. Het mengsel wordt gekneed in een waterbad bij 60°C en gevormd tot zetpillen die elk 2 g wegen.

Elke zetpil bevat 2 mg 20. A en wordt in overeen-20 stemming met het symptoom gebruikt.

De volgende voorbeelden 23 en 24 tonen de veiligheid van het anti-virale agents volgens de huidige uitvinding.

VOORBEELD 23 25 Indien 20 A in een hoeveelheid van 100 //g/kg intra- peritoneaal werd toegediend aan BALB/C muizen, werd geen verandering in het proefdier waargenomen.

VOORBEELD 24 30 Als een test voor de bevestiging van het in het voorgaande voorbeeld beschreven effekt, wordt dezelfde als in voorbeeld 19 beschreven test uitgevoerd, behalve dat geen HSV-1 werd gebruikt. In deze test wordt geen verschil gevonden tussen de groep proefdieren waaraan 20 A was toege-35 diend en die waaraan geen 20 A was toegediend.

840 31 S3 ( .

-32-

Met het oog op de voorgaande experimenten is het evident, dat de anti-virale agents volgens de huidige uitvinding veilig zijn in een effektieve dosis van het oligo-en polydesoxynucleotiden.

5 De volgende voorbeelden zijn hierin opgenomen ten einde aan te geven dat het in vitro eiwitsynthesesysteem inderdaad wordt geremd door hybridisatie van mRNA met (-) keten oligodesoxynucleotide. Deze resultaten staven de theoretische basis van de uitvinding.

10 VOORBEELD 25 (Vergelijkingsvoorbeeld 1)

Dit voorbeeld toont de remming van de polyfenyl-alaninesynthese in afhankelijkheid van poly U door oligo-desoxyadenylzuur.

^ Het reaktiemengsel (40 microliter) bevatte 140 14 5 .

microgram poly Uf C fenylalanine (10 cpm, 300 microcurie/ micromol), E. coli extract (bereid volgens Nirenberg en

Mathaei, Proc. Nat. Acad. Sci., Ü.S.A. 47 1588 (1961)), 13 mM Mg acetaat, 1 mM ATP, 1 mM creatinefosfaat, 1 micro- 20 gram creatinefosfokinase, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), en verschillende hoeveelheden oligodesoxyadenylzuur. De reaktie-mengsels werden in 1,5 ml Eppendorf buizen gebracht en ge-incubeerd gedurende 30 minuten bij 37°C. De hoeveelheid gesynthetiseerd polyfenylalanine werd gemeten door het tellen ^ van de radioactiviteit die onoplosbaar is in heet (95°C) 10 % trichloorazijnzuur. De telling werd uitgevoerd met een vloeistof scintillatie teller. Het percentage remming werd berekend in vergelijking met de waarde van de polyfenyl-alaninesynthese in afwezigheid van het oligodesoxyadenyl-30 zuur. De resultaten worden getoond in tabel 8.

8403163 -33- TABEL 8

Inhibitor Dosis Remming van (microgrammen) polyfenylalanine- synthese (%) controle — 0

5 poly-desoxyadenyl- 5Q

zuur oligodesoxyadenyl- zuur 100 88 (10 nucleotiden) oligodesoxyadenyl- zuur 100 89 10 (9 nucleotiden) oligodesoxyadenyl- zuur 100 15 (8 nucleotiden) oligodesoxyadenyl- zuur 100 0 15 (7 nucleotiden)

Zoals getoond in tabel 8, is polydesoxyadenylzuur dat hybridiseert met polyuridylzuur een opmerkelijk sterke inhibitor van de polyfenylalaninesynthese. üit deze tabel 20 kan worden opgemaakt dat oligodesoxyadenylzuur met een keten lengte van meer dan 9 nucleotiden een sterk remmend effekt heeft.

VOORBEELD 26 (Vergelijkingsvoorbeeld 2) 25 Het hieronder beschreven experiment is een

demonstratie, dat oligodesoxynucleotiden eucaryotische mRNA

aktiviteit kunnen remmen door het vormen van hybriden met dat mRNA. Het reaktiemengsel (30 Ml) bevat 4,2 mM calcium- fosfaat, 2 mM dimethylthiothreitol (DTT), 0,08 mM van elk 30 aminozuur (behalve van methionine), 6 mM calciumacetaat, 8 mM magnesiumacetaat, 4,5 Mg spermidine, 0,1//Ci 35 S-methionine en 10 Ml konijnenreticulocytextract, bereid volgens Jackson en Pelham (Europ. J. Biochem. 67, 247-256, 1976). De inhibitor werd opgelost in 21 mM HEPES oplossing 35 zoals beschreven in tabel 9 toegevoegd aan het reaktiemengsel .

840 31 63 -34- TABEL 9

Inhibitor Dosis % Remming van % Remming van {Mq) öt-globine- /3 -globine-synthese synthese

Controle — 0 0 5 yno?“ van 0,06 60 0 « -globme genoom DNA van 65 B -globme ' kalverthymus DNA 0,06 10 10 15 oligodesoxy- 10 nucleotide van 0i06 88 0 d -globme '

genoom DNA

15 oligodesoxy- nucleotide van 0,06 5 2 M 13 15 Zoals getoond in tabel 9, remt (-) keten DNA van -globine specifiek de<3-globinesynthese, terwijl (-) keten DNA van -globine specifiek de -globinesynthese remt. Geen belangwekkende remming werd waargenomen met kalverthymus

DNA. Uit deze waarnemingen kan worden geconcludeerd dat DNA

20 van een eucaryotisch gen (-) keten specifiek de synthese remt van het eiwit dat dit rem codeert. Het oligodesoxynucleotide met een keten lengte van 15 die correspondeert met het de NH2-terminale aminozuur volgorde van G. -globine, de synthese van öi-globine remt. Deze waarneming geeft aan dat DNA met een enkelvoudige keten (-keten) en met de 25 keten lengte tot 15 kort voldoende is voor de specifieke remming van de synthese van dit respektieve eiwit. Het controle oligonucleotide (M 13 faag DNA met een keten lengte van 15 nucleotiden) toonde geen enkel significant remmend effekt.

30 Het zal duidelijk zijn dat de voorafgaande, getoonde voorbeelden binnen het kader van de huidige aanvrage kunnen worden gevarieerd zowel met betrekking tot de soort virus en het coderend gebied door de deskundige voor het bereiken van in essentie dezelfde resultaten.

35 Talrijke verschillende uitvoeringsvormen van deze uitvinding kunnen worden gemaakt zonder de geest en het kader 840 3 1 63 -35- daarvan te verlaten? het moet duidelijk zijn, dat deze uitvinding niet beperkt is tot de specifieke uitvoeringsvoor-beelden daarvan behalve voorzover gedefinieerd in de bijgevoegde conclusies.

5 1. Met betrekking tot de uitdrukkingen zoals gebruikt in de conclusies zij het volgende opgemerkt: (1) De eigenschap en struktuur van DNA:

Het bij de onderhavige uitvinding in aanmerking komende DNA moet hybridiseerbaar zijn met mRNA dat wordt ge-10 vormd bij virusvoortplanting.

In figuur 5 heeft DNA (a) een segment dat volledig hybridiseerbaar is met mRNA en DNA (b) heeft een segment dat ten dele hybridiseerbaar is met mRNA, welke beiden in aanmerking komen bij de onderhavige uitvinding. Dit kenmerk wordt 15 weergegeven door de uitdrukking "DNA hybridiseerbaar met mRNA”.

(2) Het DNA deel dat voor hybridisatie met mRNA wordt geselecteerd:

Het geselecteerde DNA deel voor de hybridisatie met mRNA moet geheel of gedeeltelijk aanwezig zijn binnen het 20 segment dat hybridiseerbaar is met mRNA.

Figuur 6 toont dat in geval (c) een deel (i) of (ii) dat gekozen is voor hybridisatie, aanwezig is binnen het met mRNA hybridiseerbare segment, en deze beide voldoen aan het vereiste. In het geval (d) ligt echter het deel (iii) dat voor 25 hybridisatie is gekozen volledig buiten het segment dat geheel of ten dele hybridiseerbaar is met mRNA, en voldoet dus niet aan het vereiste. Dit kenmerk wordt weergegeven in de uitdrukking "een deel van de struktuur van het DNA ..., welke struktuur in staat is te hybridiseren met het mRNA'.' 30 2. Het oligo- of polydesoxynucleotide (A) of (B) dat dus bij de onderhavige uitvinding wordt gebruikt met het doel te hybridiseren met mRNA, en daarmee de translatie van mRNA te remmen (d.w.z. de eiwitsynthese) moet identiek zijn met de DNA volgorde (zoals 5'+...ACT.TGA.CAC .....ATC.CAT...-31) 35 welk deel van de DNA(c) struktuur hybridiseerbaar is met mRNA.

Figuur 7 toont het desoxynucleotide (A) of (B) dat een zo kort mogelijke keten lengte heeft, omdat de synthese van 8403163 • * -36- een desoxynucleotide met een korte keten gemakkelijk en economisch is. Het gebruik van bepaalde eicosameren (d.w.z. de oligonucleotide dat 20 nucleotide-eenheden bevat) wordt in de voorbeelden van de onderhavige aanvrage getoond voor 5 het bereiken van een goede hybridisatie met mRNA.

840 316 3

Claims (16)

1. Werkwijze voor het remmen van virus voortplanting, omvattende het aanleveren van een of meer oligodesoxy-nucleotiden of polydesoxynucleotiden op een plaats waar een bij voortplanting van virus gevormde boodschapper RNA 5 aanwezig is, met het kenmerk dat de DNA volgorde van de oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden identiek is met een deel van de DNA struktuur die hybridiseerbaar is met het boodschapper RNA, waarbij de struktuur hybridiseerbaar is met de boodschapper RNA.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat het virus RNA virus is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat het RNA virus influenza-virus is.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk 15 dat het virus DNA virus is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met hef kenmerk dat het DNA virus herpes-simplex-virus is.

6. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat een mengsel van oligodesoxy- 20 nucleotiden of polydesoxynucleotiden wordt gebruikt.

7. Anti-viraal agents, omvattende een werkzame hoeveelheid van een of meer oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden met een gebruikelijke vloeistofdrager of vulmiddel, met het kenmerk dat de DNA volgorde van de 25 oligodesoxynucleotiden of polydesoxynucleotiden identiek is met een deel van de struktuur van DNA dat hybridiseerbaar is met een bij de voortplanting van virus gevormd boodschapper RNA, waarbij de struktuur hybridiseerbaar is met het boodschapper RNA.

8. Anti-viraal agents volgens conclusie 7, met het kenmerk dat het virus RNA virus is.

9. Anti-viraal agents volgens conclusie 8, met het kenmerk dat het RNA virus influenza-virus is.

10. Anti-viraal agents volgens conclusie 7, met het 35 kenmerk dat het virus DNA virus is. 8.40 31 63 s .>t, -38-

11. Anti-viraal agents volgens conclusie 10, met het kenmerk dat het DNA virus herpes-simplex-virus is.

12. Anti-viraal agents volgens conclusie 7-11, met het kenmerk dat een mengsel van oligodesoxynucleotiden 5 of polydesoxynucleotiden wordt gebruikt.

13. Anti-viraal agents volgens conclusie 9, met het kenmerk dat de werkzame hoeveelheid 1-20000 ^g/kg/dag is.

14. Anti-viraal agents volgens conclusie 7-13, met het kenmerk dat het agents aanwezig is in de vorm van een 10 injectievloeistof.

15. Anti-viraal agents volgens conclusie 7-13, met het kenmerk dat het agents aanwezig is in de vorm van een in het oog te druppelen oplossing.

16. Anti-viraal agents volgens conclusie 7-13, 15 met het kenmerk dat het agents aanwezig is in de vorm van een zetpil. 840 31 63